JP2003177126A - Ｃｃｎファミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法 - Google Patents
Ｃｃｎファミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、CTGF活性制御剤、および／ま
たは、Notch活性制御剤のスクリーニング方法を提供す
ることにある。 【解決手段】被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合
的に、Notchの活性を制御するか否かを測定することを
特徴とする、CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および
／または、Notch活性制御剤のスクリーニング方法。ま
たは、被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合的にNot
chに結合するか否かを測定することを特徴とする、CCN
ファミリー蛋白質活性制御剤、および／または、Notch
活性制御剤のスクリーニング方法。
たは、Notch活性制御剤のスクリーニング方法を提供す
ることにある。 【解決手段】被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合
的に、Notchの活性を制御するか否かを測定することを
特徴とする、CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および
／または、Notch活性制御剤のスクリーニング方法。ま
たは、被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合的にNot
chに結合するか否かを測定することを特徴とする、CCN
ファミリー蛋白質活性制御剤、および／または、Notch
活性制御剤のスクリーニング方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、CCNファミリー蛋
白質の受容体蛋白質を見出したことに基づく、該CCNフ
ァミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法に関す
るものである。
白質の受容体蛋白質を見出したことに基づく、該CCNフ
ァミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】ＣＣＮファミリー蛋白質は、結合組織増
殖因子(connective tissue growthfactor : CTGF)、シ
ステイン・リッチタンパク質（Cysteine-Rich protei
n：Cyr61）、腎芽細胞腫過剰発現遺伝子(nephroblastom
a overexpressed gene: Nov)、Elm-1/WIAP-1、Cop-1/WI
SP-2、WISP3等からなる一群の蛋白質である。CCNファミ
リー蛋白質の大きな特徴は、インシュリン様成長因子
結合蛋白(insulin-likegrowth factor binding protei
n)、von Willebrand factor type C リピート、thr
ombospondin type1 リピート、growth factor cystei
ne knotsの4つの保存されたモジュラードメイン構造を
有することである。WISP-2以外のCCNファミリー蛋白質
は上記の4つの保存されたドメインを全て持っている。C
CNファミリー蛋白質は、相互に約60％或いはそれ以上の
アミノ酸配列上の相同性を有しており、何れも成長因子
としての活性を有している事が知られている。
殖因子(connective tissue growthfactor : CTGF)、シ
ステイン・リッチタンパク質（Cysteine-Rich protei
n：Cyr61）、腎芽細胞腫過剰発現遺伝子(nephroblastom
a overexpressed gene: Nov)、Elm-1/WIAP-1、Cop-1/WI
SP-2、WISP3等からなる一群の蛋白質である。CCNファミ
リー蛋白質の大きな特徴は、インシュリン様成長因子
結合蛋白(insulin-likegrowth factor binding protei
n)、von Willebrand factor type C リピート、thr
ombospondin type1 リピート、growth factor cystei
ne knotsの4つの保存されたモジュラードメイン構造を
有することである。WISP-2以外のCCNファミリー蛋白質
は上記の4つの保存されたドメインを全て持っている。C
CNファミリー蛋白質は、相互に約60％或いはそれ以上の
アミノ酸配列上の相同性を有しており、何れも成長因子
としての活性を有している事が知られている。
【０００３】結合組織増殖因子(connective tissue gro
wth factor : CTGF)は単量体として存在する分子量36-3
8kDaの蛋白質で、システインを豊富に含むCCNファミリ
ー(CTGF, Cyr61, Nov)に属する(Oemar, B.S. and Lusch
er, T.F. (1997) Arteriosclerosis, Trombosis and Va
scular Biology 17(8):1483-1489)。CTGFは4つのドメイ
ン(IGF結合ドメイン、von Willebrand因子タイプCリピ
ート、トロンボスポンジンタイプ1リピート、C末端ドメ
イン)からなるが、近年の報告ではCTGFの特定の断片で
もCTGF全体と同様の活性を有することが示唆されている
(Brigstock et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(32):20
275-20282)。ヒト、マウス、ラットのCTGFはアミノ酸配
列で90％以上の高い相同性を持ち(Bork (1993) FEBS Le
tt. 327:125-130)、いずれも分子量は約38kDaである(Br
adham et al. (1991) J. Cell.Biol. 114:1285-1294)。
またCTGF遺伝子のプロモーター領域にはTGFβ反応性エ
レメントが含まれていることが明らかになっており(Gro
tendorst et al. (1996)Cell Growth & Differentiatio
n 7:469-480)、CTGFはTGFβの刺激により発現誘導さ
れ、TGFβの生理機能の一部を担っていると考えられて
いる。
wth factor : CTGF)は単量体として存在する分子量36-3
8kDaの蛋白質で、システインを豊富に含むCCNファミリ
ー(CTGF, Cyr61, Nov)に属する(Oemar, B.S. and Lusch
er, T.F. (1997) Arteriosclerosis, Trombosis and Va
scular Biology 17(8):1483-1489)。CTGFは4つのドメイ
ン(IGF結合ドメイン、von Willebrand因子タイプCリピ
ート、トロンボスポンジンタイプ1リピート、C末端ドメ
イン)からなるが、近年の報告ではCTGFの特定の断片で
もCTGF全体と同様の活性を有することが示唆されている
(Brigstock et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(32):20
275-20282)。ヒト、マウス、ラットのCTGFはアミノ酸配
列で90％以上の高い相同性を持ち(Bork (1993) FEBS Le
tt. 327:125-130)、いずれも分子量は約38kDaである(Br
adham et al. (1991) J. Cell.Biol. 114:1285-1294)。
またCTGF遺伝子のプロモーター領域にはTGFβ反応性エ
レメントが含まれていることが明らかになっており(Gro
tendorst et al. (1996)Cell Growth & Differentiatio
n 7:469-480)、CTGFはTGFβの刺激により発現誘導さ
れ、TGFβの生理機能の一部を担っていると考えられて
いる。
【０００４】CTGFは線維芽細胞のような結合組織系の細
胞に作用し、コラーゲンや細胞外基質の産生、増殖誘導
や走化性因子として働くことが知られている。従って、
CTGFは、線維症、癌、癌に伴う血管新生、アテローム性
動脈硬化のような増殖異常や過剰な細胞外基質の蓄積に
関係した疾患の増悪因子ではないかと考えられている。
例えば、CTGFの過剰発現が、強皮症やケロイド状態の線
維芽細胞(Igarashiet al. (1996) J. Invest. Dermato
l. 106:729-733)、腎線維症の糸球体間質細胞(Riser et
al. (2000) J. Am. Soc. Nephrol. 11:25-38)、膵炎(d
i Mola et al. (1999) Ann. Surg. 230:63-71) 、ブレ
オマイシン誘導肺線維症 (Lasky et al. (1998) Am. J.
Physiol. 275:L365-371) 、乳癌 (Frazier and Groten
dorst(1997) Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29:153-16
1) 、動脈硬化症 (Oemar et al. (1997) Circulation 9
5:831-839) 、心筋梗塞の梗塞領域 (Ohnishi et al. (1
998) J. Mol. Cell. Cardiol. 30:2411-2422)、炎症性
腸疾患 (Dammeier et al. (1998) Int. J. Biochem. Ce
ll. Biol. 30:909-922) 、結合組織性の悪性メラノーマ
(Kubo et al. (1998) Br. J. Dermatol. 139:192-197)
の病態組織において認められる。また、CTGFは強皮症
や動脈硬化の原因因子であることが明らかになっている
(Igarashi et al. (1995) J. Invest. Dermatol. 105:
280- 284;Igarashi et al. (1996) J. Invest. Dermat
ol. 106:729-733; and Oemar et al. (1997) Circulati
on 95:831-839) 他、CTGFの発現レベルが、腎線維症も
しくは肺線維症の重症度と高い正の相関性を示す事が知
られている (Ito et al. (1998) Kidney Int. 53:853-8
61; Paradis et al. (1999) Hepatology 30:968-976)。
一方、CTGFは骨や軟骨の成長を促進し、損傷部の癒合な
どの組織再生を誘導する事も知られている(Nakanishi
T. et al. (1997) Biochemical & Biophysical Researc
h Communications. 234(1):206-10; Nakanishi T. et
al. (2000) Endocrinology. 141(1):264-73; Igarashi
A. et al. (1993) Molecular Biologyof the Cell. 4
(6):637-45)。
胞に作用し、コラーゲンや細胞外基質の産生、増殖誘導
や走化性因子として働くことが知られている。従って、
CTGFは、線維症、癌、癌に伴う血管新生、アテローム性
動脈硬化のような増殖異常や過剰な細胞外基質の蓄積に
関係した疾患の増悪因子ではないかと考えられている。
例えば、CTGFの過剰発現が、強皮症やケロイド状態の線
維芽細胞(Igarashiet al. (1996) J. Invest. Dermato
l. 106:729-733)、腎線維症の糸球体間質細胞(Riser et
al. (2000) J. Am. Soc. Nephrol. 11:25-38)、膵炎(d
i Mola et al. (1999) Ann. Surg. 230:63-71) 、ブレ
オマイシン誘導肺線維症 (Lasky et al. (1998) Am. J.
Physiol. 275:L365-371) 、乳癌 (Frazier and Groten
dorst(1997) Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29:153-16
1) 、動脈硬化症 (Oemar et al. (1997) Circulation 9
5:831-839) 、心筋梗塞の梗塞領域 (Ohnishi et al. (1
998) J. Mol. Cell. Cardiol. 30:2411-2422)、炎症性
腸疾患 (Dammeier et al. (1998) Int. J. Biochem. Ce
ll. Biol. 30:909-922) 、結合組織性の悪性メラノーマ
(Kubo et al. (1998) Br. J. Dermatol. 139:192-197)
の病態組織において認められる。また、CTGFは強皮症
や動脈硬化の原因因子であることが明らかになっている
(Igarashi et al. (1995) J. Invest. Dermatol. 105:
280- 284;Igarashi et al. (1996) J. Invest. Dermat
ol. 106:729-733; and Oemar et al. (1997) Circulati
on 95:831-839) 他、CTGFの発現レベルが、腎線維症も
しくは肺線維症の重症度と高い正の相関性を示す事が知
られている (Ito et al. (1998) Kidney Int. 53:853-8
61; Paradis et al. (1999) Hepatology 30:968-976)。
一方、CTGFは骨や軟骨の成長を促進し、損傷部の癒合な
どの組織再生を誘導する事も知られている(Nakanishi
T. et al. (1997) Biochemical & Biophysical Researc
h Communications. 234(1):206-10; Nakanishi T. et
al. (2000) Endocrinology. 141(1):264-73; Igarashi
A. et al. (1993) Molecular Biologyof the Cell. 4
(6):637-45)。
【０００５】上記のことから、CTGFの発現もしくは活性
を制御する薬剤は、組織線維化を伴う疾患や増殖性疾患
において、結合組織や細胞外マトリクスの過形成を抑制
したり、骨や軟骨などの組織を再生したりするのに有効
であると考えられる。実際に、CTGF阻害剤としてペプチ
ド化合物、または抗CTGF抗体が知られており、臓器線維
症の動物モデルに対して有効である旨報告されている。
を制御する薬剤は、組織線維化を伴う疾患や増殖性疾患
において、結合組織や細胞外マトリクスの過形成を抑制
したり、骨や軟骨などの組織を再生したりするのに有効
であると考えられる。実際に、CTGF阻害剤としてペプチ
ド化合物、または抗CTGF抗体が知られており、臓器線維
症の動物モデルに対して有効である旨報告されている。
【０００６】腎芽細胞腫過剰発現遺伝子（Nov）はCCNフ
ァミリーに属する蛋白質であり、CTGFと同様にシステイ
ンに富んだアミノ酸構成を有する。Novは骨髄芽球症関
連ウイルス１型により誘導された腎芽細胞腫において過
剰発現されることが見出され、成体腎臓細胞においては
通常、その発現は抑制されている事が知られている。更
に、ニワトリ胚線維芽細胞においてアミノ末端が切断さ
れたNovを強制発現させると、形質転換が誘導される事
も報告されている(Joliot,V. et al., Mol.Cell.Biol.,
12:10-21(1992))。また、Balb/c 3T3細胞の培養系にNov
蛋白質を添加すると、細胞内のチロシンリン酸化レベル
の亢進と共に濃度依存的な増殖応答の促進作用が認めら
れている(Changlu Liu et al., Gene, 238:471-478(199
9))。これらの知見からNovは、初期発生や細胞の増殖制
御に深く関与すると考えられている(Joliot,V.et al, M
ol.Cell.Biol.,12:10-21(1992); Chevalier et al.,Am.
J. Pathol., 152:1563-1575 (1998))。しかしながらNo
vの生体内での作用については不明な点が多い。システ
インリッチ蛋白質61（Cyr61）はCCNファミリーに属する
蛋白質であり、その名のとおりシステインに富んだ蛋白
質である。血管形成促進作用を有し、細胞外マトリクス
に付着した形で存在することが知られている（Lau,L.
F. andLam, S. C. Exp.Cell Res.248:44-57 (1999); Br
igstock, D. R. Endocr.Rev.20:189-206 (1999)）。線
維芽細胞や内皮細胞に対しては細胞接着の誘導、細胞遊
走の促進、増殖因子によるDNA合成誘導の促進作用を有
することが知られている(Kireeva,M.L. et al. Mol. Ce
ll. Biol.16, 1326-1334 (1996); Kireeva,M.L. et al.
Exp.Cell Res. 233, 63-77 (1997))。マウスの肢芽の
間葉細胞に対してはCyr61は軟骨細胞への分化を誘導/促
進する(Wong, M. et al. Dev Biol. 192, 492-508 (199
7))。また、in vivoにおいてCyr61は血管形成を促すこ
とが明らかになっており、免疫不全マウスに移植された
ヒトの腫瘍細胞のサイズと血管新生とを増大させること
により腫瘍形成能を増幅させることが知られている(Bab
ic, A.M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95,
6355-6360 (1998))。更にはCyr61は血管形成や創傷治
癒の際に細胞外マトリクスの再形成を促進する酵素であ
るマトリックスメタロプロテアーゼ-1、-3の発現を増強
させることも知られている(Chen, C.-C. et al. J. Bio
l. Chem. 276, 10443-10452 (2001))。Cyr61活性に関す
るこれらの知見は、Cyr61の発現が軟骨形成部位、発生
過程での血管形成に関わる細胞、皮下の創傷治癒過程の
肉芽組織で認められることと良く一致する。
ァミリーに属する蛋白質であり、CTGFと同様にシステイ
ンに富んだアミノ酸構成を有する。Novは骨髄芽球症関
連ウイルス１型により誘導された腎芽細胞腫において過
剰発現されることが見出され、成体腎臓細胞においては
通常、その発現は抑制されている事が知られている。更
に、ニワトリ胚線維芽細胞においてアミノ末端が切断さ
れたNovを強制発現させると、形質転換が誘導される事
も報告されている(Joliot,V. et al., Mol.Cell.Biol.,
12:10-21(1992))。また、Balb/c 3T3細胞の培養系にNov
蛋白質を添加すると、細胞内のチロシンリン酸化レベル
の亢進と共に濃度依存的な増殖応答の促進作用が認めら
れている(Changlu Liu et al., Gene, 238:471-478(199
9))。これらの知見からNovは、初期発生や細胞の増殖制
御に深く関与すると考えられている(Joliot,V.et al, M
ol.Cell.Biol.,12:10-21(1992); Chevalier et al.,Am.
J. Pathol., 152:1563-1575 (1998))。しかしながらNo
vの生体内での作用については不明な点が多い。システ
インリッチ蛋白質61（Cyr61）はCCNファミリーに属する
蛋白質であり、その名のとおりシステインに富んだ蛋白
質である。血管形成促進作用を有し、細胞外マトリクス
に付着した形で存在することが知られている（Lau,L.
F. andLam, S. C. Exp.Cell Res.248:44-57 (1999); Br
igstock, D. R. Endocr.Rev.20:189-206 (1999)）。線
維芽細胞や内皮細胞に対しては細胞接着の誘導、細胞遊
走の促進、増殖因子によるDNA合成誘導の促進作用を有
することが知られている(Kireeva,M.L. et al. Mol. Ce
ll. Biol.16, 1326-1334 (1996); Kireeva,M.L. et al.
Exp.Cell Res. 233, 63-77 (1997))。マウスの肢芽の
間葉細胞に対してはCyr61は軟骨細胞への分化を誘導/促
進する(Wong, M. et al. Dev Biol. 192, 492-508 (199
7))。また、in vivoにおいてCyr61は血管形成を促すこ
とが明らかになっており、免疫不全マウスに移植された
ヒトの腫瘍細胞のサイズと血管新生とを増大させること
により腫瘍形成能を増幅させることが知られている(Bab
ic, A.M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95,
6355-6360 (1998))。更にはCyr61は血管形成や創傷治
癒の際に細胞外マトリクスの再形成を促進する酵素であ
るマトリックスメタロプロテアーゼ-1、-3の発現を増強
させることも知られている(Chen, C.-C. et al. J. Bio
l. Chem. 276, 10443-10452 (2001))。Cyr61活性に関す
るこれらの知見は、Cyr61の発現が軟骨形成部位、発生
過程での血管形成に関わる細胞、皮下の創傷治癒過程の
肉芽組織で認められることと良く一致する。
【０００７】一方、Notch（別名：Lin12）は膜貫通型受
容体であり、細胞の分化を制御することによって、個体
発生に対して中心的な役割を果たすと考えられている(S
impson, P. 1994. Austin, TX: R.G.Landes Compan
y.)。現在のところ、哺乳類においてはNotch1〜Notch4
の4つのNotch相同体が同定されている。Notch遺伝子は
胎児、成熟個体共に様々な組織において発現しており、
個体発生以外にも様々なシグナル伝達経路に関与してい
ることが示唆されている(Swiatek, P. J. et al.(1994)
Genes and Dev. 8:707-719; Weinmaster, G. et al.
(1992) Development 116:931-941; Kopan, R. and Wein
traub, H. (1993) J. Cell. Biol. 121:631-641; and U
yttendaele, H. et al. (1996) Development 122:2251-
2259)。また、ヒトT細胞の腫瘍において、Notch蛋白質
が過剰発現していことが分かっており、Notchが腫瘍の
形成に関与している点が示唆されている(Girard, L. et
al.(1996) Genes and Dev. 10:1930-1944)。Notchは、
Notchリガンドが結合すること等により活性化され、Not
ch IC領域（Eric H. Schroeter. Et al. Nature 393: 3
82-386 (1998)）が切断されることが知られており、該N
otch IC領域は、細胞核内に移行し、種々の転写因子を
制御している。
容体であり、細胞の分化を制御することによって、個体
発生に対して中心的な役割を果たすと考えられている(S
impson, P. 1994. Austin, TX: R.G.Landes Compan
y.)。現在のところ、哺乳類においてはNotch1〜Notch4
の4つのNotch相同体が同定されている。Notch遺伝子は
胎児、成熟個体共に様々な組織において発現しており、
個体発生以外にも様々なシグナル伝達経路に関与してい
ることが示唆されている(Swiatek, P. J. et al.(1994)
Genes and Dev. 8:707-719; Weinmaster, G. et al.
(1992) Development 116:931-941; Kopan, R. and Wein
traub, H. (1993) J. Cell. Biol. 121:631-641; and U
yttendaele, H. et al. (1996) Development 122:2251-
2259)。また、ヒトT細胞の腫瘍において、Notch蛋白質
が過剰発現していことが分かっており、Notchが腫瘍の
形成に関与している点が示唆されている(Girard, L. et
al.(1996) Genes and Dev. 10:1930-1944)。Notchは、
Notchリガンドが結合すること等により活性化され、Not
ch IC領域（Eric H. Schroeter. Et al. Nature 393: 3
82-386 (1998)）が切断されることが知られており、該N
otch IC領域は、細胞核内に移行し、種々の転写因子を
制御している。
【０００８】前記Notchのリガンドとしては、Jagged、J
agged2、およびDeltaが知られている(Lindsell, C. E.
et al. (1995) Cell 80:909-917; Valsecchi, C. et a
l.(1997) Mech. Dev. 69:203-207; and Laborda, J. et
al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3817-3820)。しかし
ながら、Notchと、前記CTGFおよびNovとの関係は何ら知
られていなかった。また、Notchと、組織線維化、血管
系細胞の増殖、線維芽細胞（Fibloblast)の分化等のCCN
ファミリー蛋白質が関与する疾患との関係は知られてい
なかった。一方、Notchが関与することが示唆されてい
た、T細胞癌等の異常な細胞増殖機能と、CCNファミリー
蛋白質の関係も知られていなかった。
agged2、およびDeltaが知られている(Lindsell, C. E.
et al. (1995) Cell 80:909-917; Valsecchi, C. et a
l.(1997) Mech. Dev. 69:203-207; and Laborda, J. et
al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3817-3820)。しかし
ながら、Notchと、前記CTGFおよびNovとの関係は何ら知
られていなかった。また、Notchと、組織線維化、血管
系細胞の増殖、線維芽細胞（Fibloblast)の分化等のCCN
ファミリー蛋白質が関与する疾患との関係は知られてい
なかった。一方、Notchが関与することが示唆されてい
た、T細胞癌等の異常な細胞増殖機能と、CCNファミリー
蛋白質の関係も知られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、CCN
ファミリー蛋白質の受容体蛋白質を同定し、CCNファミ
リー蛋白質、または該受容体蛋白質が関与する疾患の治
療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
ファミリー蛋白質の受容体蛋白質を同定し、CCNファミ
リー蛋白質、または該受容体蛋白質が関与する疾患の治
療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、CCNファ
ミリー蛋白質の受容体を特定すべく鋭意検討を行った結
果、NovおよびCTGFが、Notch1に特異的に結合すること
を見出した。すなわち、Mammalian2-hybrid法を用い
て、CTGFとマウスNotch１（以下mNotch１）の相互作用
を測定した。Mammalian2-hybrid法は細胞核内に蛋白を
発現させた上で相互作用を検討するシステムであるが、
細胞核内で起こる転写イベントを利用する方法であるの
で、膜蛋白や分泌蛋白には不適当とされている。従って
分泌性因子であるCTGFと膜蛋白であるNotchの組み合わ
せでは、アッセイできない可能性があった。そこで、CT
GFとmNotch１のシグナルペプチドを欠いた成熟蛋白の部
分で、なおかつmNotch１については細胞外領域のみの部
分を2-hybrid用ベクターにクローニングして相互作用の
検討を行った。その結果、pMベクター（クロンテック
社）にmNotch１を、pVP16ベクター（クロンテック社）
にCTGFを、それぞれクローニングしたベクターを用いた
際に、相互作用の存在が見出された。一方、Novについ
ても、免疫沈降法で検討した結果、Notch１とNovが結合
した複合体が沈降することが判明した。更にレポーター
ジーンアッセイを用いて検討した結果、NovによってNot
ch１由来のシグナル伝達が生じることが確認できた。す
なわち、Notch１の存在下もしくは非存在下に、Nov、お
よびNovによって活性化される転写因子HES5を転写因子
として組み込んだルシフェラーゼの発現ベクター（HES5
-luciferase）を、C2/4細胞に共導入し、Notch1の有無
およびNovの発現レベルによって、luciferase活性が変
動するか否かを検討した結果、Notch１を共発現させた
場合にのみ、Novの発現レベルに依存的にluciferase活
性が増大した。上記より、CCNファミリー蛋白質とNotch
の相互作用を制御する化合物を探索することによって、
CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および／または、Not
ch活性制御剤をスクリーニングすることが可能である。
本発明は上記の知見に基づき完成するに至ったものであ
る。
ミリー蛋白質の受容体を特定すべく鋭意検討を行った結
果、NovおよびCTGFが、Notch1に特異的に結合すること
を見出した。すなわち、Mammalian2-hybrid法を用い
て、CTGFとマウスNotch１（以下mNotch１）の相互作用
を測定した。Mammalian2-hybrid法は細胞核内に蛋白を
発現させた上で相互作用を検討するシステムであるが、
細胞核内で起こる転写イベントを利用する方法であるの
で、膜蛋白や分泌蛋白には不適当とされている。従って
分泌性因子であるCTGFと膜蛋白であるNotchの組み合わ
せでは、アッセイできない可能性があった。そこで、CT
GFとmNotch１のシグナルペプチドを欠いた成熟蛋白の部
分で、なおかつmNotch１については細胞外領域のみの部
分を2-hybrid用ベクターにクローニングして相互作用の
検討を行った。その結果、pMベクター（クロンテック
社）にmNotch１を、pVP16ベクター（クロンテック社）
にCTGFを、それぞれクローニングしたベクターを用いた
際に、相互作用の存在が見出された。一方、Novについ
ても、免疫沈降法で検討した結果、Notch１とNovが結合
した複合体が沈降することが判明した。更にレポーター
ジーンアッセイを用いて検討した結果、NovによってNot
ch１由来のシグナル伝達が生じることが確認できた。す
なわち、Notch１の存在下もしくは非存在下に、Nov、お
よびNovによって活性化される転写因子HES5を転写因子
として組み込んだルシフェラーゼの発現ベクター（HES5
-luciferase）を、C2/4細胞に共導入し、Notch1の有無
およびNovの発現レベルによって、luciferase活性が変
動するか否かを検討した結果、Notch１を共発現させた
場合にのみ、Novの発現レベルに依存的にluciferase活
性が増大した。上記より、CCNファミリー蛋白質とNotch
の相互作用を制御する化合物を探索することによって、
CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および／または、Not
ch活性制御剤をスクリーニングすることが可能である。
本発明は上記の知見に基づき完成するに至ったものであ
る。
【００１１】すなわち本発明は、
［１］ 被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合的
に、Notchの活性を制御するか否かを測定することを特
徴とする、CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および／
またはNotch活性制御剤のスクリーニング方法； ［２］ 以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴
とする、［１］記載のスクリーニング方法： （１）Notch、CCNファミリー蛋白質、および被験物質を
接触させる工程、（２）Notchの活性を検出する工程、
（３）被験物質非存在下におけるNotchの活性と、前記
（２）におけるNotchの活性とを比較する工程； ［３］ 被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合的にN
otchと結合するか否かを測定することを特徴とする、CC
Nファミリー蛋白質活性制御剤、および／またはNotchの
活性制御剤のスクリーニング方法； ［４］ CCNファミリー蛋白質が、NovまたはCTGFである
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載のスク
リーニング方法； ［５］ ［１］〜［４］のいずれか記載のスクリーニン
グ方法により得られるCCNファミリー蛋白質活性制御
剤、および／またはNotch活性制御剤； ［６］ ［５］記載のCCNファミリー蛋白質活性制御剤
を有効成分として含有する、組織線維化を伴う疾患の治
療または予防剤； ［７］ ［５］記載のCCNファミリー蛋白質活性制御剤
を有効成分として含有する、CCNファミリー蛋白質が関
与する疾患の治療または予防剤； ［８］ ［５］記載のNotch活性制御剤を有効成分とし
て含有する、Notchが関与する疾患の治療剤または予防
剤；に関するものである。
に、Notchの活性を制御するか否かを測定することを特
徴とする、CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および／
またはNotch活性制御剤のスクリーニング方法； ［２］ 以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴
とする、［１］記載のスクリーニング方法： （１）Notch、CCNファミリー蛋白質、および被験物質を
接触させる工程、（２）Notchの活性を検出する工程、
（３）被験物質非存在下におけるNotchの活性と、前記
（２）におけるNotchの活性とを比較する工程； ［３］ 被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競合的にN
otchと結合するか否かを測定することを特徴とする、CC
Nファミリー蛋白質活性制御剤、および／またはNotchの
活性制御剤のスクリーニング方法； ［４］ CCNファミリー蛋白質が、NovまたはCTGFである
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載のスク
リーニング方法； ［５］ ［１］〜［４］のいずれか記載のスクリーニン
グ方法により得られるCCNファミリー蛋白質活性制御
剤、および／またはNotch活性制御剤； ［６］ ［５］記載のCCNファミリー蛋白質活性制御剤
を有効成分として含有する、組織線維化を伴う疾患の治
療または予防剤； ［７］ ［５］記載のCCNファミリー蛋白質活性制御剤
を有効成分として含有する、CCNファミリー蛋白質が関
与する疾患の治療または予防剤； ［８］ ［５］記載のNotch活性制御剤を有効成分とし
て含有する、Notchが関与する疾患の治療剤または予防
剤；に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明における「Notch」は、そ
のサブタイプ、およびホモログも含んでいる。すなわ
ち、Notch１〜４のすべてを含む概念である。Notchのア
ミノ酸配列、およびその遺伝子の塩基配列については、
ジーンバンクに記載されている。以下にジーンバンク、
アクセッションナンバーを、例示する。ヒトNotch１：
AF308602, ヒトNotch2: XM_034671, ヒトNotch3: XM_00
9303, ヒトNotch4: XM_042469,マウス Notch1: NM_0087
14。本発明における「CCNファミリー蛋白質」は、
（１）インシュリン様成長因子結合蛋白(insulin-like
growth factor binding protein)、（２）von Willebra
nd factor type C repeat、（３）thrombospondin type
1 repeat、（４）growyh factor cysteine knotsの4つ
の保存されたmodular domain構造を含む蛋白質であり、
具体的には、CTGF、Nov、Cyr61等が挙げられる。「CTG
F」は、そのホモログも含んでおり、そのアミノ酸配
列、およびその遺伝子の塩基配列については、例えばヒ
トCTGFは、ジーンバンク（アクセションナンバー： NM_
001901）に記載されている。「Nov」は、そのホモログ
も含んでおり、そのアミノ酸配列、およびその遺伝子の
塩基配列については、例えばヒトNovは、ジーンバンク
（アクセションナンバー：NM002514）に記載されてい
る。「Cyr61」は、そのホモログも含んでおり、そのア
ミノ酸配列、およびその遺伝子の塩基配列については、
例えばヒトCyr61は、ジーンバンク（アクセションナン
バー：AF307860）に記載されている。
のサブタイプ、およびホモログも含んでいる。すなわ
ち、Notch１〜４のすべてを含む概念である。Notchのア
ミノ酸配列、およびその遺伝子の塩基配列については、
ジーンバンクに記載されている。以下にジーンバンク、
アクセッションナンバーを、例示する。ヒトNotch１：
AF308602, ヒトNotch2: XM_034671, ヒトNotch3: XM_00
9303, ヒトNotch4: XM_042469,マウス Notch1: NM_0087
14。本発明における「CCNファミリー蛋白質」は、
（１）インシュリン様成長因子結合蛋白(insulin-like
growth factor binding protein)、（２）von Willebra
nd factor type C repeat、（３）thrombospondin type
1 repeat、（４）growyh factor cysteine knotsの4つ
の保存されたmodular domain構造を含む蛋白質であり、
具体的には、CTGF、Nov、Cyr61等が挙げられる。「CTG
F」は、そのホモログも含んでおり、そのアミノ酸配
列、およびその遺伝子の塩基配列については、例えばヒ
トCTGFは、ジーンバンク（アクセションナンバー： NM_
001901）に記載されている。「Nov」は、そのホモログ
も含んでおり、そのアミノ酸配列、およびその遺伝子の
塩基配列については、例えばヒトNovは、ジーンバンク
（アクセションナンバー：NM002514）に記載されてい
る。「Cyr61」は、そのホモログも含んでおり、そのア
ミノ酸配列、およびその遺伝子の塩基配列については、
例えばヒトCyr61は、ジーンバンク（アクセションナン
バー：AF307860）に記載されている。
【００１３】本発明における「CCNファミリー蛋白質の
活性」としては、CCNファミリー蛋白質が有する生理活
性であれば特に限定されないが、好ましくは、線維芽細
胞の増殖誘導、細胞外マトリクスの産生、血管形成誘
導、軟骨形成誘導等が挙げられる。中でも、CTGF活性と
しては、線維芽細胞の増殖誘導、細胞外マトリクスの産
生等が挙げられる。Nov活性としては、細胞増殖誘導、
チロシンリン酸化誘導等が挙げられる。本発明における
「Notchの活性」としては、NotchがCCNファミリー蛋白
質と結合することにより生ずる、Notchにより制御され
るSuppressor of Hairless、NF-κB2、E47等の転写因子
や転写抑制因子の活性化が挙げられる。また、NotchがC
CNファミリー蛋白質と結合することによる、Notchの活
性化もまた、「Notchの活性」の範疇に含まれる。該Not
chの活性化とは、NotchのIC領域が切断され、細胞核内
に移行する現象を表す。該NotchのIC領域とは、1744番
目のバリン（V）以降のC末端部分を表す。
活性」としては、CCNファミリー蛋白質が有する生理活
性であれば特に限定されないが、好ましくは、線維芽細
胞の増殖誘導、細胞外マトリクスの産生、血管形成誘
導、軟骨形成誘導等が挙げられる。中でも、CTGF活性と
しては、線維芽細胞の増殖誘導、細胞外マトリクスの産
生等が挙げられる。Nov活性としては、細胞増殖誘導、
チロシンリン酸化誘導等が挙げられる。本発明における
「Notchの活性」としては、NotchがCCNファミリー蛋白
質と結合することにより生ずる、Notchにより制御され
るSuppressor of Hairless、NF-κB2、E47等の転写因子
や転写抑制因子の活性化が挙げられる。また、NotchがC
CNファミリー蛋白質と結合することによる、Notchの活
性化もまた、「Notchの活性」の範疇に含まれる。該Not
chの活性化とは、NotchのIC領域が切断され、細胞核内
に移行する現象を表す。該NotchのIC領域とは、1744番
目のバリン（V）以降のC末端部分を表す。
【００１４】本発明における「CCNファミリー蛋白質活
性制御剤」とは、CCNファミリー蛋白質の活性を亢進す
る「CCNファミリー蛋白質活性促進剤」、およびCCNファ
ミリー蛋白質の活性を阻害する「CCNファミリー蛋白質
活性阻害剤」を共に含む概念を表し、CCNファミリー蛋
白質と、その受容体であるNotchとの結合を阻害するこ
とによりCCNファミリー蛋白質の活性を制御する物質等
が挙げられる。
性制御剤」とは、CCNファミリー蛋白質の活性を亢進す
る「CCNファミリー蛋白質活性促進剤」、およびCCNファ
ミリー蛋白質の活性を阻害する「CCNファミリー蛋白質
活性阻害剤」を共に含む概念を表し、CCNファミリー蛋
白質と、その受容体であるNotchとの結合を阻害するこ
とによりCCNファミリー蛋白質の活性を制御する物質等
が挙げられる。
【００１５】「NotchとCCNファミリー蛋白質の間の結合
を阻害する物質」としては、Notch、あるいはCCNファミ
リー蛋白質と疎水結合、水素結合、イオン結合、または
静電相互作用等を介して相互作用し、NotchとCCNファミ
リー蛋白質との結合を阻害する物質であれば特に限定さ
れるものではなく、蛋白質、ペプチド、天然物、または
合成有機化合物などが挙げられる。
を阻害する物質」としては、Notch、あるいはCCNファミ
リー蛋白質と疎水結合、水素結合、イオン結合、または
静電相互作用等を介して相互作用し、NotchとCCNファミ
リー蛋白質との結合を阻害する物質であれば特に限定さ
れるものではなく、蛋白質、ペプチド、天然物、または
合成有機化合物などが挙げられる。
【００１６】本発明において「Notchの活性制御剤」と
は、Notchの活性を亢進する「Notch活性促進剤」、およ
びNotchの活性を阻害する「Notch活性阻害剤」を共に含
む概念を表し、Notchと、そのリガンドであるCCNファミ
リー蛋白質との結合を阻害することによりNotchの活性
を制御する物質が挙げられる。該物質としては、CCNフ
ァミリー蛋白質あるいはNotchと、疎水結合、水素結
合、イオン結合、または静電相互作用等を介して相互作
用し、NotchとCCNファミリー蛋白質との結合を阻害する
物質であれば特に限定されるものではなく、蛋白質、ペ
プチド、天然物、または合成有機化合物などが挙げられ
る。
は、Notchの活性を亢進する「Notch活性促進剤」、およ
びNotchの活性を阻害する「Notch活性阻害剤」を共に含
む概念を表し、Notchと、そのリガンドであるCCNファミ
リー蛋白質との結合を阻害することによりNotchの活性
を制御する物質が挙げられる。該物質としては、CCNフ
ァミリー蛋白質あるいはNotchと、疎水結合、水素結
合、イオン結合、または静電相互作用等を介して相互作
用し、NotchとCCNファミリー蛋白質との結合を阻害する
物質であれば特に限定されるものではなく、蛋白質、ペ
プチド、天然物、または合成有機化合物などが挙げられ
る。
【００１７】本発明における「CCNファミリー蛋白質活
性制御剤のスクリーニング方法」としては、（１）被験
物質が、標識されたCCNファミリー蛋白質とNotchの結合
を阻害するか否かを調べる方法、または、（２）Notch
とCCNファミリー蛋白質が結合したことに起因するCCNフ
ァミリー蛋白質あるいはNotchの活性を測定・評価する
方法等の、NotchとCCNファミリー蛋白質の間の結合を阻
害する物質を、スクリーニングする方法等が挙げられ
る。本発明における「Notch活性制御剤のスクリーニン
グ方法」としては、前記の方法が挙げられる。すなわ
ち、被験物質が、標識されたCCNファミリー蛋白質とNot
chの結合を阻害するか否かを調べる方法、またはNotch
とCCNファミリー蛋白質が結合したことに起因するCCNフ
ァミリー蛋白質あるいはNotchの活性を測定・評価する
方法等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法にお
ける「被験物質」としては、有機化合物（好ましくは、
分子量2000以下、更に好ましくは分子量1000以下の有機
化合物等が挙げられる。）、蛋白質、核酸、ペプチド、
天然物などが挙げられる。
性制御剤のスクリーニング方法」としては、（１）被験
物質が、標識されたCCNファミリー蛋白質とNotchの結合
を阻害するか否かを調べる方法、または、（２）Notch
とCCNファミリー蛋白質が結合したことに起因するCCNフ
ァミリー蛋白質あるいはNotchの活性を測定・評価する
方法等の、NotchとCCNファミリー蛋白質の間の結合を阻
害する物質を、スクリーニングする方法等が挙げられ
る。本発明における「Notch活性制御剤のスクリーニン
グ方法」としては、前記の方法が挙げられる。すなわ
ち、被験物質が、標識されたCCNファミリー蛋白質とNot
chの結合を阻害するか否かを調べる方法、またはNotch
とCCNファミリー蛋白質が結合したことに起因するCCNフ
ァミリー蛋白質あるいはNotchの活性を測定・評価する
方法等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法にお
ける「被験物質」としては、有機化合物（好ましくは、
分子量2000以下、更に好ましくは分子量1000以下の有機
化合物等が挙げられる。）、蛋白質、核酸、ペプチド、
天然物などが挙げられる。
【００１８】以下に、本発明の実施の態様について具体
的に述べる。本発明の第１の態様は、本発明の「CCNフ
ァミリー蛋白質の活性制御剤」および／または「Notch
の活性制御剤」のスクリーニング方法に関する。該スク
リーニングとしては、（１）NotchおよびCCNファミリー
蛋白質の共存下に、スクリーニングの対象となる被験物
質が、NotchとCCNファミリー蛋白質の相互作用を増強も
しくは阻害するか否かを、任意の検出方法でもって検出
する方法、（２）スクリーニングの対象となる被験物質
を、CCNファミリー蛋白質とともに、Notchが発現を制御
している転写因子の発現調節領域を有する遺伝子を含む
細胞培養系に共存させ、任意の検出方法でもって、該転
写因子の発現調節領域の下流に結合したルシフェラーゼ
等のレポーター遺伝子の、発現量の変動を調べることに
よりNotchの発現を阻害もしくは亢進する物質を探索す
る方法（レポータージーンアッセイ）等が挙げられる。
的に述べる。本発明の第１の態様は、本発明の「CCNフ
ァミリー蛋白質の活性制御剤」および／または「Notch
の活性制御剤」のスクリーニング方法に関する。該スク
リーニングとしては、（１）NotchおよびCCNファミリー
蛋白質の共存下に、スクリーニングの対象となる被験物
質が、NotchとCCNファミリー蛋白質の相互作用を増強も
しくは阻害するか否かを、任意の検出方法でもって検出
する方法、（２）スクリーニングの対象となる被験物質
を、CCNファミリー蛋白質とともに、Notchが発現を制御
している転写因子の発現調節領域を有する遺伝子を含む
細胞培養系に共存させ、任意の検出方法でもって、該転
写因子の発現調節領域の下流に結合したルシフェラーゼ
等のレポーター遺伝子の、発現量の変動を調べることに
よりNotchの発現を阻害もしくは亢進する物質を探索す
る方法（レポータージーンアッセイ）等が挙げられる。
【００１９】Notchと相互作用することにより、CCNファ
ミリー蛋白質とNotchとの結合を阻害する物質をスクリ
ーニングする方法としては、以下の方法が挙げられる。
ここで用いられるNotchは、天然物であっても組み換え
体であってもよい。また、マウス型が好ましいが、ヒト
型（ジーンバンク、アクセッションナンバー： AF30860
2）など、他の種由来の受容体も利用できる。すなわ
ち、上記DNA配列を元に適当なＤＮＡ部分をハイブリダ
イゼーションのプローブ、ＰＣＲのプライマーとして用
い、例えばヒトまたは動物由来のｃＤＮＡライブラリー
などからクローニングすることができる。これらのクロ
ーニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に
従い、当業者であれば容易に行うことができる。また、
そのアミノ酸配列の一部が置換、欠失、および／または
付加されるものであっても、CCNファミリー蛋白質と結
合する能力が保たれている限り、本発明のスクリーニン
グ方法に使用することができる。当該置換等の改変も前
述のMolecular Cloning等に基づき、容易に行うことが
できる。以上のようにして得られたNotchのDNAからタン
パクを発現させる手法としては、以下のような方法が挙
げられる。すなわちまず、先に調製したNotchのｃＤＮ
ＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ 108, 193-199（１９９
１））、pcDNA1.1、pcDNA3.1誘導体（インビトロジェン
社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、適
当な宿主に導入し、培養することにより、導入したNotc
hのＤＮＡに対応する蛋白質を発現させた形質転換細胞
を作製することができる。宿主としては、一般的に広く
普及している、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１
細胞、ＣＯＳ細胞などを用いることができるが、これに
限定されることなく、酵母、細菌、昆虫細胞などを用い
ることもできる。前記Notch発現ベクターの宿主細胞へ
の導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞へ
の導入方法であれば、どのような方法でもよく、例えば
リン酸カルシウム法（J. Virol., 52, 456-467(197
3))、LT-1（Panvera社製）を用いる方法、遺伝子導入用
リピッド（Lipofectamine、Lipofectin；Gibco−BRL社
製）を用いる方法などが挙げられる。
ミリー蛋白質とNotchとの結合を阻害する物質をスクリ
ーニングする方法としては、以下の方法が挙げられる。
ここで用いられるNotchは、天然物であっても組み換え
体であってもよい。また、マウス型が好ましいが、ヒト
型（ジーンバンク、アクセッションナンバー： AF30860
2）など、他の種由来の受容体も利用できる。すなわ
ち、上記DNA配列を元に適当なＤＮＡ部分をハイブリダ
イゼーションのプローブ、ＰＣＲのプライマーとして用
い、例えばヒトまたは動物由来のｃＤＮＡライブラリー
などからクローニングすることができる。これらのクロ
ーニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に
従い、当業者であれば容易に行うことができる。また、
そのアミノ酸配列の一部が置換、欠失、および／または
付加されるものであっても、CCNファミリー蛋白質と結
合する能力が保たれている限り、本発明のスクリーニン
グ方法に使用することができる。当該置換等の改変も前
述のMolecular Cloning等に基づき、容易に行うことが
できる。以上のようにして得られたNotchのDNAからタン
パクを発現させる手法としては、以下のような方法が挙
げられる。すなわちまず、先に調製したNotchのｃＤＮ
ＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ 108, 193-199（１９９
１））、pcDNA1.1、pcDNA3.1誘導体（インビトロジェン
社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、適
当な宿主に導入し、培養することにより、導入したNotc
hのＤＮＡに対応する蛋白質を発現させた形質転換細胞
を作製することができる。宿主としては、一般的に広く
普及している、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１
細胞、ＣＯＳ細胞などを用いることができるが、これに
限定されることなく、酵母、細菌、昆虫細胞などを用い
ることもできる。前記Notch発現ベクターの宿主細胞へ
の導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞へ
の導入方法であれば、どのような方法でもよく、例えば
リン酸カルシウム法（J. Virol., 52, 456-467(197
3))、LT-1（Panvera社製）を用いる方法、遺伝子導入用
リピッド（Lipofectamine、Lipofectin；Gibco−BRL社
製）を用いる方法などが挙げられる。
【００２０】以上のようにして得られたNotch発現形質
転換細胞は、そのままスクリーニングに用いることがで
きるが、細胞膜をスクリーニングに用いる場合は、例え
ば以下のようにして細胞膜画分を得ることができる。す
なわちまず細胞に低張バッファー（１０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ
もしくは１ｍＭのＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌのアプロチ
ニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン；ｐＨ７．４）を添
加し、4℃で３０分間程度静置して細胞を低張破壊した
後、ピペッティングでホモジナイズし、4℃で５０００
０ｘｇ、30分間遠心分離することにより細胞膜画分の沈
殿物を得る。そしてこの沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理
食塩水（トリス−塩酸緩衝液、１５４ｍＭの塩化ナトリ
ウム；ｐＨ７．４）に懸濁することにより、Notchを含
む膜画分を得ることができる。また、結合アッセイに用
いる部分は細胞外領域であるので、Notchの細胞外領域
のみを発現させるベクターを作製し、形質転換細胞を作
製することにより細胞培養の培養培地中に分泌させるこ
ともできる。得られたNotchは、抗体を結合させたカラ
ム等により当業者にとって良く知られた方法で精製する
こともできる。上記Notchの調製については、例えばタ
ンパク質実験ノート（1996年、羊土社刊）に記載された
方法を用いることもできる。細胞外に分泌される蛋白質
であるCCNファミリー蛋白質についても上記と同様の方
法で調製することができる。
転換細胞は、そのままスクリーニングに用いることがで
きるが、細胞膜をスクリーニングに用いる場合は、例え
ば以下のようにして細胞膜画分を得ることができる。す
なわちまず細胞に低張バッファー（１０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ
もしくは１ｍＭのＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌのアプロチ
ニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン；ｐＨ７．４）を添
加し、4℃で３０分間程度静置して細胞を低張破壊した
後、ピペッティングでホモジナイズし、4℃で５０００
０ｘｇ、30分間遠心分離することにより細胞膜画分の沈
殿物を得る。そしてこの沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理
食塩水（トリス−塩酸緩衝液、１５４ｍＭの塩化ナトリ
ウム；ｐＨ７．４）に懸濁することにより、Notchを含
む膜画分を得ることができる。また、結合アッセイに用
いる部分は細胞外領域であるので、Notchの細胞外領域
のみを発現させるベクターを作製し、形質転換細胞を作
製することにより細胞培養の培養培地中に分泌させるこ
ともできる。得られたNotchは、抗体を結合させたカラ
ム等により当業者にとって良く知られた方法で精製する
こともできる。上記Notchの調製については、例えばタ
ンパク質実験ノート（1996年、羊土社刊）に記載された
方法を用いることもできる。細胞外に分泌される蛋白質
であるCCNファミリー蛋白質についても上記と同様の方
法で調製することができる。
【００２１】CCNファミリー蛋白質と上記Notchの結合阻
害活性を測定する系は、当業者の常識の範囲で適宜選択
されるが、一例としては、（ｉ）NotchにCCNファミリー
蛋白質を接触させた場合と、（ｉｉ）NotchにCCNファミ
リー蛋白質および被験物質を接触させた場合とを比較評
価することを含むスクリーニング方法が挙げられる。そ
の具体的な態様として、以下の（１）〜（３）の方法を
例示することができる。 （１）受容体を発現させた細胞を用いる方法 Notchを発現させた細胞を用いて、本発明のスクリーニ
ングを行うことができる。ここで細胞とは、天然の細胞
であっても前述の形質転換細胞であってもよい。具体的
には、まず、リガンドであるCCNファミリー蛋白質を何
らかの方法により標識する。例えば、35SなどのRIによ
って標識する方法、アルカリホスファターゼ、Horserad
ish Peroxidase等の酵素等で標識する方法、Rhodamine,
Fluoresceinなどの蛍光試薬で標識する方法、または、
GST、ポリヒスチジンなどのタグと融合させて発現させ
る方法などが挙げられる（Current Protocols in molec
ular Biology (1998年 Cuurent Protocols刊）。他
方、Notchを発現させた細胞を調製する。次にこの細胞
に対して、(ｉ)標識CCNファミリー蛋白質を添加した場
合、および、（ｉｉ）標識CCNファミリー蛋白質および
被験物質を添加した場合の標識CCNファミリー蛋白質の
細胞への結合性を比較・検出する。（ｉ）の場合と比し
て、（ｉｉ）の場合の方が、結合活性が低い若しくは無
い場合は、その被験物質がNotchとCCNファミリー蛋白質
の結合を阻害する物質の候補であることが示される。
害活性を測定する系は、当業者の常識の範囲で適宜選択
されるが、一例としては、（ｉ）NotchにCCNファミリー
蛋白質を接触させた場合と、（ｉｉ）NotchにCCNファミ
リー蛋白質および被験物質を接触させた場合とを比較評
価することを含むスクリーニング方法が挙げられる。そ
の具体的な態様として、以下の（１）〜（３）の方法を
例示することができる。 （１）受容体を発現させた細胞を用いる方法 Notchを発現させた細胞を用いて、本発明のスクリーニ
ングを行うことができる。ここで細胞とは、天然の細胞
であっても前述の形質転換細胞であってもよい。具体的
には、まず、リガンドであるCCNファミリー蛋白質を何
らかの方法により標識する。例えば、35SなどのRIによ
って標識する方法、アルカリホスファターゼ、Horserad
ish Peroxidase等の酵素等で標識する方法、Rhodamine,
Fluoresceinなどの蛍光試薬で標識する方法、または、
GST、ポリヒスチジンなどのタグと融合させて発現させ
る方法などが挙げられる（Current Protocols in molec
ular Biology (1998年 Cuurent Protocols刊）。他
方、Notchを発現させた細胞を調製する。次にこの細胞
に対して、(ｉ)標識CCNファミリー蛋白質を添加した場
合、および、（ｉｉ）標識CCNファミリー蛋白質および
被験物質を添加した場合の標識CCNファミリー蛋白質の
細胞への結合性を比較・検出する。（ｉ）の場合と比し
て、（ｉｉ）の場合の方が、結合活性が低い若しくは無
い場合は、その被験物質がNotchとCCNファミリー蛋白質
の結合を阻害する物質の候補であることが示される。
【００２２】（２）Notchを発現させた細胞膜を用いる
方法 （１）における細胞のかわりに、その細胞より調製され
た細胞膜画分を用いることにより、（１）と同様に本発
明のスクリーニングを行うことができる。 （３）単離精製されたNotchを用いる方法 単離精製されたNotchを用いても、本発明のスクリーニ
ングを行うことができる。CCNファミリー蛋白質と結合
する領域は細胞外領域であるので、この場合は、Notch
の細胞外領域のみを用いることが好ましい。尚、上記
（１）から（３）のスクリーニングにおいては、Notch
に結合するものであれば、CCNファミリー蛋白質活性の
促進剤・抑制剤ともに選択されるため、これらを区別す
るためには、さらに別のスクリーニングを実施すること
が望ましい。
方法 （１）における細胞のかわりに、その細胞より調製され
た細胞膜画分を用いることにより、（１）と同様に本発
明のスクリーニングを行うことができる。 （３）単離精製されたNotchを用いる方法 単離精製されたNotchを用いても、本発明のスクリーニ
ングを行うことができる。CCNファミリー蛋白質と結合
する領域は細胞外領域であるので、この場合は、Notch
の細胞外領域のみを用いることが好ましい。尚、上記
（１）から（３）のスクリーニングにおいては、Notch
に結合するものであれば、CCNファミリー蛋白質活性の
促進剤・抑制剤ともに選択されるため、これらを区別す
るためには、さらに別のスクリーニングを実施すること
が望ましい。
【００２３】また、CCNファミリー蛋白質がNotchに結合
することによって惹起される、NotchIC領域の核内移行
の有無を調べる方法、または生理活性を測定する方法を
用いて、CCNファミリー蛋白質とNotchとの結合を阻害す
る物質をスクリーニングする方法としては、Notchの活
性化によって制御される転写因子の活性を、レポーター
ジーンアッセイ等を用いて検出する方法や、該転写因子
によって発現誘導される遺伝子の発現量などを調べる方
法等が挙げられる。該方法としては、Notchシグナルの
下流にあたる転写因子であるCBF-1/Su(H)、またはE47の
転写活性化調節をレポータージーンアッセイ等で検討す
る方法、NFκB2等Notchの標的遺伝子発現のmRNA発現変
動をRT-PCRやノーザンハイブリダイゼーション等の常法
で検討する方法、NFκB2等Notchの標的遺伝子発現の蛋
白発現変動をウエスタンブロットで検討する方法等が挙
げられる。具体的には、本明細書実施例に記載された、
HES5等のNotchによって制御されている転写因子をルシ
フェラーゼ、CAT等の蛋白質のプロモーターとして発現
ベクターに組み込んだレポータージーンアッセイ、また
は、NFκB2、CBF-1/Su(H)(Suppressor of Hairless)、
もしくはE47等の転写因子の活性をゲルシフトアッセイ
等で調べる方法等が挙げられる。
することによって惹起される、NotchIC領域の核内移行
の有無を調べる方法、または生理活性を測定する方法を
用いて、CCNファミリー蛋白質とNotchとの結合を阻害す
る物質をスクリーニングする方法としては、Notchの活
性化によって制御される転写因子の活性を、レポーター
ジーンアッセイ等を用いて検出する方法や、該転写因子
によって発現誘導される遺伝子の発現量などを調べる方
法等が挙げられる。該方法としては、Notchシグナルの
下流にあたる転写因子であるCBF-1/Su(H)、またはE47の
転写活性化調節をレポータージーンアッセイ等で検討す
る方法、NFκB2等Notchの標的遺伝子発現のmRNA発現変
動をRT-PCRやノーザンハイブリダイゼーション等の常法
で検討する方法、NFκB2等Notchの標的遺伝子発現の蛋
白発現変動をウエスタンブロットで検討する方法等が挙
げられる。具体的には、本明細書実施例に記載された、
HES5等のNotchによって制御されている転写因子をルシ
フェラーゼ、CAT等の蛋白質のプロモーターとして発現
ベクターに組み込んだレポータージーンアッセイ、また
は、NFκB2、CBF-1/Su(H)(Suppressor of Hairless)、
もしくはE47等の転写因子の活性をゲルシフトアッセイ
等で調べる方法等が挙げられる。
【００２４】また、NotchIC領域の核内移行の有無を調
べる方法としては、Notch細胞内領域あるいはNotchの細
胞内領域に結合するSu(H)(Suppressor of Hairless)の
細胞核への移行の増減をウエスタンブロットで検出する
方法等が挙げられる。
べる方法としては、Notch細胞内領域あるいはNotchの細
胞内領域に結合するSu(H)(Suppressor of Hairless)の
細胞核への移行の増減をウエスタンブロットで検出する
方法等が挙げられる。
【００２５】上記のスクリーニング方法により選別され
た被験物質を、必要に応じて別のスクリーニング系に供
したり、in vivo評価系に供したりすることにより、CC
Nファミリー蛋白質活性を制御する薬剤、またはNotch活
性を制御する薬剤を見出すことができる。
た被験物質を、必要に応じて別のスクリーニング系に供
したり、in vivo評価系に供したりすることにより、CC
Nファミリー蛋白質活性を制御する薬剤、またはNotch活
性を制御する薬剤を見出すことができる。
【００２６】本発明の第３の態様は、前記スクリーニン
グ方法によって得られる、CCNファミリー蛋白質活性制
御剤、Notch活性制御剤に関する。該CCNファミリー蛋白
質活性制御剤、および／または、Notch活性制御剤とし
ては、CCNファミリー蛋白質あるいはNotchと、疎水結
合、水素結合、イオン結合、または静電相互作用等を介
して相互作用し、NotchとCCNファミリー蛋白質との結合
を阻害する物質であれば特に限定されるものではなく、
蛋白質、ペプチド、天然物、または合成有機化合物など
が挙げられる。好ましくは、分子量2000以下、更に好ま
しくは、分子量1000以下のペプチド、天然物、もしくは
合成有機化合物である。本発明のスクリーニング方法に
より得られる「CCNファミリー蛋白質活性制御剤」は、C
CNファミリー蛋白質が関与する疾患の治療剤もしくは予
防剤として有用である。該CCNファミリー蛋白質が関与
する疾患としては、組織線維化を伴う疾患、細胞増殖を
伴う疾患、血管新生を伴う疾患等が挙げられる。好まし
くは、組織線維化を伴う疾患、または細胞増殖を伴う疾
患が挙げられる。「組織線維化を伴う疾患」とは、組織
の修復・再生の際、線維芽細胞の過剰な増殖による結合
組織の過形成により、実質細胞が再生されず、組織の機
能不全をきたす疾患を表し、例えば、肺線維症、腎線維
症、強皮症、動脈硬化症または炎症性疾患等が挙げられ
る。前記、炎症性疾患としては、慢性関節リウマチ、変
形性関節炎、潰瘍性大腸炎、または多発性硬化症等が挙
げられる。好ましくは、炎症性疾患は、慢性関節リウマ
チが挙げられる。細胞増殖を伴う疾患としては、手術時
の臓器癒着、癌、子宮内膜症、または肉芽腫等が挙げら
れる。前記疾患の治療剤もしくは予防剤としては、CCN
ファミリー蛋白質活性抑制剤が好ましい。また、「CCN
ファミリー蛋白質活性促進剤」は、創傷治癒促進薬等と
して有用である。本発明のスクリーニング方法により得
られる「Notch活性制御剤」は、Notchが関与する疾患の
治療剤もしくは予防剤として有用である。該Notchが関
与する疾患としては、細胞の異常増殖を伴う疾患を伴う
疾患等が挙げられる。該細胞の異常増殖を伴う疾患とし
ては、癌、慢性関節リウマチ等の免疫系疾患等が挙げら
れる。また、Notchが関与する疾患として、CADASIL、Al
agille症候群、常染色体優性遺伝性脳動脈症等の神経系
疾患が挙げられる。前記疾患の治療剤もしくは予防剤と
しては、Notch活性抑制剤が好ましい。
グ方法によって得られる、CCNファミリー蛋白質活性制
御剤、Notch活性制御剤に関する。該CCNファミリー蛋白
質活性制御剤、および／または、Notch活性制御剤とし
ては、CCNファミリー蛋白質あるいはNotchと、疎水結
合、水素結合、イオン結合、または静電相互作用等を介
して相互作用し、NotchとCCNファミリー蛋白質との結合
を阻害する物質であれば特に限定されるものではなく、
蛋白質、ペプチド、天然物、または合成有機化合物など
が挙げられる。好ましくは、分子量2000以下、更に好ま
しくは、分子量1000以下のペプチド、天然物、もしくは
合成有機化合物である。本発明のスクリーニング方法に
より得られる「CCNファミリー蛋白質活性制御剤」は、C
CNファミリー蛋白質が関与する疾患の治療剤もしくは予
防剤として有用である。該CCNファミリー蛋白質が関与
する疾患としては、組織線維化を伴う疾患、細胞増殖を
伴う疾患、血管新生を伴う疾患等が挙げられる。好まし
くは、組織線維化を伴う疾患、または細胞増殖を伴う疾
患が挙げられる。「組織線維化を伴う疾患」とは、組織
の修復・再生の際、線維芽細胞の過剰な増殖による結合
組織の過形成により、実質細胞が再生されず、組織の機
能不全をきたす疾患を表し、例えば、肺線維症、腎線維
症、強皮症、動脈硬化症または炎症性疾患等が挙げられ
る。前記、炎症性疾患としては、慢性関節リウマチ、変
形性関節炎、潰瘍性大腸炎、または多発性硬化症等が挙
げられる。好ましくは、炎症性疾患は、慢性関節リウマ
チが挙げられる。細胞増殖を伴う疾患としては、手術時
の臓器癒着、癌、子宮内膜症、または肉芽腫等が挙げら
れる。前記疾患の治療剤もしくは予防剤としては、CCN
ファミリー蛋白質活性抑制剤が好ましい。また、「CCN
ファミリー蛋白質活性促進剤」は、創傷治癒促進薬等と
して有用である。本発明のスクリーニング方法により得
られる「Notch活性制御剤」は、Notchが関与する疾患の
治療剤もしくは予防剤として有用である。該Notchが関
与する疾患としては、細胞の異常増殖を伴う疾患を伴う
疾患等が挙げられる。該細胞の異常増殖を伴う疾患とし
ては、癌、慢性関節リウマチ等の免疫系疾患等が挙げら
れる。また、Notchが関与する疾患として、CADASIL、Al
agille症候群、常染色体優性遺伝性脳動脈症等の神経系
疾患が挙げられる。前記疾患の治療剤もしくは予防剤と
しては、Notch活性抑制剤が好ましい。
【００２７】以下、本発明のCCNファミリー蛋白質活性
制御剤、および／または、Notch活性制御剤を医薬品と
して用いる場合の投与量および投与形態などにつき記述
する。本発明のCCNファミリー蛋白質活性制御剤、およ
び／または、Notch活性制御剤は、経口または非経口投
与、好ましくは経口投与することができ、薬剤としてそ
れぞれ経口または非経口投与に適した種々の剤型で、ヒ
トおよびヒト以外の動物に使用される。例えば、経口的
に投与する場合、通常用いられる投与形態、例えば錠
剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などで投与するこ
とができる。非経口的に投与する場合、溶液、乳剤、懸
濁液などの液剤を注射剤として投与すること、坐剤の型
で直腸投与すること等ができる。このような投与剤型
は、通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤などの助剤と
有効成分を配合することにより一般的方法に従って製造
することができる。注射剤型で用いる場合は、緩衝剤、
溶解補助剤、等張剤などを添加することもできる。投与
量、投与回数は、対象とする疾患、患者の症状、年齢、
体重等、および投与形態などによって異なるが、経口投
与する場合、有効成分は通常は成人に対し１日あたり約
１〜１０００ｍｇの範囲、好ましくは、約１０〜５００
ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することがで
きる。注射剤として投与する場合、有効成分は約０．１
〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約３〜約１００ｍｇ
の範囲を１回または数回に分けて投与することができ
る。
制御剤、および／または、Notch活性制御剤を医薬品と
して用いる場合の投与量および投与形態などにつき記述
する。本発明のCCNファミリー蛋白質活性制御剤、およ
び／または、Notch活性制御剤は、経口または非経口投
与、好ましくは経口投与することができ、薬剤としてそ
れぞれ経口または非経口投与に適した種々の剤型で、ヒ
トおよびヒト以外の動物に使用される。例えば、経口的
に投与する場合、通常用いられる投与形態、例えば錠
剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などで投与するこ
とができる。非経口的に投与する場合、溶液、乳剤、懸
濁液などの液剤を注射剤として投与すること、坐剤の型
で直腸投与すること等ができる。このような投与剤型
は、通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤などの助剤と
有効成分を配合することにより一般的方法に従って製造
することができる。注射剤型で用いる場合は、緩衝剤、
溶解補助剤、等張剤などを添加することもできる。投与
量、投与回数は、対象とする疾患、患者の症状、年齢、
体重等、および投与形態などによって異なるが、経口投
与する場合、有効成分は通常は成人に対し１日あたり約
１〜１０００ｍｇの範囲、好ましくは、約１０〜５００
ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することがで
きる。注射剤として投与する場合、有効成分は約０．１
〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約３〜約１００ｍｇ
の範囲を１回または数回に分けて投与することができ
る。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例によって説明するが本
発明はこれらに限定されるものではない。尚、特に明記
しない限り、以下の実施例は、Sambrook, J.ら著、Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, New York, 1989年発
行等に記載の方法で行うことができる。
発明はこれらに限定されるものではない。尚、特に明記
しない限り、以下の実施例は、Sambrook, J.ら著、Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold S
pring Harbor Laboratory Press, New York, 1989年発
行等に記載の方法で行うことができる。
【００２９】実施例１：発現ベクターの作製
（合成DNA配列の製造）CTGF蛋白質はGenBank NM_00190
1、mNotch1は GenBank NM_008714に従い、オリゴDNAを
合成した。使用したプライマーは以下の通りである。 CTGF1M: 5’-CGAATTCATGACCGCCGCCAGTATGGGCCC-3’（配
列番号１） （下線部：核酸配列146-148番目のスタートコドンに対
応） CTGFMat: 5’-CGAATTCCAGAACTGCAGCGGGCCGTGCCG-3’(配
列番号２） （下線部：核酸配列224-226番目の成熟ペプチドの開始
アミノ酸であるグルタミンに対応） CTGFR: 5’-CGAATTCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC-3’（配
列番号３） （下線部：核酸配列1193-1195番目の終止コドンに対
応） CTGFnEND: 5’-CGAATTCTGCCATGTCTCCGTACATCTTCC-3’
（配列番号４） （CTGFRの終止コドンをつぶしたオリゴ） hCTGFEcoKozak: 5’-CGGAATTCCACCATGACCGCCGCCAGTATGG
GCCC-3’（配列番号５） （下線部：核酸配列146-148番目のスタートコドンに対
応） CTGF1: 5’-CAAGGACCAAACCGTGGTTG-3’（配列番号６） （652-671のセンス配列） CTGF2: 5’- CAACCACGGTTTGGTCCTTG-3’（配列番号７） （652-671のアンチセンス配列） mNotch1:5’-GCACGTTCCAGCATTCTTAC-3’（配列番号８） （281-300のアンチセンス配列） NotchSPK: 5’- CGGA ATTCCACCATGCCACGGCTC CTGACGCCC
C TTCTCTGCCT-3’（配列番号９） （下線部：核酸配列79-81番目のスタートコドンに対
応） NotchSP: 5’- CGGAATTC ATGCCACGGCTC CTGACGCCCC TTC
TCTGCCT-3’（配列番号１０） （下線部：核酸配列79-81番目のスタートコドンに対
応） mNotchEcoMTHF: 5’-CGGAATTCTGCTCCCAGCCAAGTGGGACCTG
CCTGAAT-3’（配列番号１１） （下線部：核酸配列148-150番目のシステインに対応） mNotchEcoMTHR: 5’- CGGAATTCCTGCGAGGGCAGCGGAGGCTCC
ACCGGCTCA-3’（配列番号１２） （下線部：核酸配列5245-5247番目のグルタミンに対
応） VP16S: 5’-GATATGGCCGACTTCGAGTTTGAG-3’（配列番号
１３） （pVP16ベクターのマルチクローニングサイト上流配
列） pMF: 5’-GAATAAGTGCGACATCATCATCGG-3’（配列番号１
４） （pMベクターのマルチクローニングサイト上流配列）
1、mNotch1は GenBank NM_008714に従い、オリゴDNAを
合成した。使用したプライマーは以下の通りである。 CTGF1M: 5’-CGAATTCATGACCGCCGCCAGTATGGGCCC-3’（配
列番号１） （下線部：核酸配列146-148番目のスタートコドンに対
応） CTGFMat: 5’-CGAATTCCAGAACTGCAGCGGGCCGTGCCG-3’(配
列番号２） （下線部：核酸配列224-226番目の成熟ペプチドの開始
アミノ酸であるグルタミンに対応） CTGFR: 5’-CGAATTCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC-3’（配
列番号３） （下線部：核酸配列1193-1195番目の終止コドンに対
応） CTGFnEND: 5’-CGAATTCTGCCATGTCTCCGTACATCTTCC-3’
（配列番号４） （CTGFRの終止コドンをつぶしたオリゴ） hCTGFEcoKozak: 5’-CGGAATTCCACCATGACCGCCGCCAGTATGG
GCCC-3’（配列番号５） （下線部：核酸配列146-148番目のスタートコドンに対
応） CTGF1: 5’-CAAGGACCAAACCGTGGTTG-3’（配列番号６） （652-671のセンス配列） CTGF2: 5’- CAACCACGGTTTGGTCCTTG-3’（配列番号７） （652-671のアンチセンス配列） mNotch1:5’-GCACGTTCCAGCATTCTTAC-3’（配列番号８） （281-300のアンチセンス配列） NotchSPK: 5’- CGGA ATTCCACCATGCCACGGCTC CTGACGCCC
C TTCTCTGCCT-3’（配列番号９） （下線部：核酸配列79-81番目のスタートコドンに対
応） NotchSP: 5’- CGGAATTC ATGCCACGGCTC CTGACGCCCC TTC
TCTGCCT-3’（配列番号１０） （下線部：核酸配列79-81番目のスタートコドンに対
応） mNotchEcoMTHF: 5’-CGGAATTCTGCTCCCAGCCAAGTGGGACCTG
CCTGAAT-3’（配列番号１１） （下線部：核酸配列148-150番目のシステインに対応） mNotchEcoMTHR: 5’- CGGAATTCCTGCGAGGGCAGCGGAGGCTCC
ACCGGCTCA-3’（配列番号１２） （下線部：核酸配列5245-5247番目のグルタミンに対
応） VP16S: 5’-GATATGGCCGACTTCGAGTTTGAG-3’（配列番号
１３） （pVP16ベクターのマルチクローニングサイト上流配
列） pMF: 5’-GAATAAGTGCGACATCATCATCGG-3’（配列番号１
４） （pMベクターのマルチクローニングサイト上流配列）
【００３０】常法により調製したHuman CTGF蛋白コード
領域全長cDNA（GeneBankアクセッションNo NM 00190
1）が挿入されたVector DNA(pRC/CMV/CTGF)(0.1 mg/ml)
1μl, 10X PCR buffer 5 μl, 2.5 mM dNTP Mix 4 μ
l, 10 μM Forward Primer(CTGF1M) 2 μl, 10 μM Rev
erse Primer (CTGFR)2 μl, DW 35.75 μl, Enzyme0.25
μl の計50 μlの系で反応を行った。98 ℃ 10 secの
後、98 ℃ 10 sec,65 ℃ 75 secを15サイクル反応した
後、72 ℃ 5分反応させて反応を終了した。PCR精製キッ
ト（キアゲン社製）にて増幅断片を精製した後、EcoRI
で制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動にて精製断
片を分離した。アガロースゲルから精製断片を切り出
し、ゲル精製キット（キアゲン社製）にて増幅断片を精
製した。発現ベクターpcDNA3.1/HisC（Invitrogen社
製）をEcoRIで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳
動にて精製断片を分離した。アガロースゲルから精製断
片を切り出し、ゲル精製キット（キアゲン社製）にて増
幅断片を精製した。精製断片をアルカリホスファターゼ
（東洋紡社製）にて酵素処理した後、PCR精製キット
（キアゲン社製）にて増幅断片を精製した。精製したCT
GFcDNA断片とpcDNA3.1/HisCをライゲーションハイ（東
洋紡社製）にてライゲーションし、DH5α（東洋紡社
製）でトランスホームした。インサートが正しく挿入さ
れたコロニーの選択は、T7プライマーとCTGF2をPCRプラ
イマーに用いて選択した。挿入の方向および配列はシー
クエンスすることで確認した。
領域全長cDNA（GeneBankアクセッションNo NM 00190
1）が挿入されたVector DNA(pRC/CMV/CTGF)(0.1 mg/ml)
1μl, 10X PCR buffer 5 μl, 2.5 mM dNTP Mix 4 μ
l, 10 μM Forward Primer(CTGF1M) 2 μl, 10 μM Rev
erse Primer (CTGFR)2 μl, DW 35.75 μl, Enzyme0.25
μl の計50 μlの系で反応を行った。98 ℃ 10 secの
後、98 ℃ 10 sec,65 ℃ 75 secを15サイクル反応した
後、72 ℃ 5分反応させて反応を終了した。PCR精製キッ
ト（キアゲン社製）にて増幅断片を精製した後、EcoRI
で制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動にて精製断
片を分離した。アガロースゲルから精製断片を切り出
し、ゲル精製キット（キアゲン社製）にて増幅断片を精
製した。発現ベクターpcDNA3.1/HisC（Invitrogen社
製）をEcoRIで制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳
動にて精製断片を分離した。アガロースゲルから精製断
片を切り出し、ゲル精製キット（キアゲン社製）にて増
幅断片を精製した。精製断片をアルカリホスファターゼ
（東洋紡社製）にて酵素処理した後、PCR精製キット
（キアゲン社製）にて増幅断片を精製した。精製したCT
GFcDNA断片とpcDNA3.1/HisCをライゲーションハイ（東
洋紡社製）にてライゲーションし、DH5α（東洋紡社
製）でトランスホームした。インサートが正しく挿入さ
れたコロニーの選択は、T7プライマーとCTGF2をPCRプラ
イマーに用いて選択した。挿入の方向および配列はシー
クエンスすることで確認した。
【００３１】（pM/matCTGF, pM/ecNotch1, pVP/ ecNotc
h1, pVP/ matCTGFの構築） matCTGF(シグナルペプチドを欠いた蛋白コード領域全長
部分のCTGFcDNA；GeneBank アクセッションNo NM 001
901) については上記と同様に増幅した断片をMammalia
n 2 hybrid用のベクターであるpM, pVP16（クロンテッ
ク社製）にサブクローニングした。ecNotch1(シグナル
ペプチドを欠いた蛋白コード領域で細胞外領域全長のマ
ウスNotch１cDNA)については、テンプレートとしてpTag
HA/mNotch1（マウスNotch1全長のcDNA（GenBank NM_008
714）より公知の方法で調製した発現ベクター）をプラ
イマーとしてmNotchEcoMTHFとmNotchEcoMTHRを用いたPC
Rで増幅される約5.5 kbの領域をpM, pVP16にサブクロー
ニングした。matCTGFについてはシークエンスにより塩
基配列を確認したが、ecNotch1については約5.5kbと長
いため塩基配列の確認はせず、独立した３クローンを取
得し、実験に用いた。（ただしいずれも下記にしめすよ
うにウエスタンブロットで発現の確認を行った）
h1, pVP/ matCTGFの構築） matCTGF(シグナルペプチドを欠いた蛋白コード領域全長
部分のCTGFcDNA；GeneBank アクセッションNo NM 001
901) については上記と同様に増幅した断片をMammalia
n 2 hybrid用のベクターであるpM, pVP16（クロンテッ
ク社製）にサブクローニングした。ecNotch1(シグナル
ペプチドを欠いた蛋白コード領域で細胞外領域全長のマ
ウスNotch１cDNA)については、テンプレートとしてpTag
HA/mNotch1（マウスNotch1全長のcDNA（GenBank NM_008
714）より公知の方法で調製した発現ベクター）をプラ
イマーとしてmNotchEcoMTHFとmNotchEcoMTHRを用いたPC
Rで増幅される約5.5 kbの領域をpM, pVP16にサブクロー
ニングした。matCTGFについてはシークエンスにより塩
基配列を確認したが、ecNotch1については約5.5kbと長
いため塩基配列の確認はせず、独立した３クローンを取
得し、実験に用いた。（ただしいずれも下記にしめすよ
うにウエスタンブロットで発現の確認を行った）
【００３２】実施例２：蛋白質間相互作用
（Mammalian 2 hybridアッセイ）酵母転写因子GAL4の応
答配列とウサギβグロビンプロモーターをpGL3Basic
（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し
たベクターであるpGAL4Luc 0.2 μgとpM/ ecNotch1, pV
P/ matCTGF各0.2 μg、さらに遺伝子導入効率補正用と
してpCH110 0.15 μgの合計0.75 μgの混合物を1.5 ml
エッペンチューブに作製した。（上記のように、matCTG
Fについては塩基配列を確認した１クローン、ecNotch1
については独立した３クローン（NotchA, NotchB, Notc
hC）を実験に用いた）この混合物を、遺伝子導入試薬Fu
Gene6（ベーリンガー社製）を用いてCOS1細胞に導入し
た。48時間後、培地を吸引・洗浄した後、細胞溶解液LC
β（ニッポンジーン社製）180 μlで細胞を溶解し細胞
抽出液を作製した。そのうち17.5 μlをルシフェラーゼ
アッセイ試薬（プロメガ社製）を用いMicrolumat96(ワ
ラックベルトールド社製)によりルシフェラーゼ活性を
測定した。遺伝子導入効率の測定は細胞抽出液35 μlを
用い、pCH110から発現されるβガラクトシダーゼを測定
することで行った。相互作用の強さは、ルシフェラーゼ
活性をβガラクトシダーゼ活性で割算し、相対値として
算出した。結果を表１に示した。表１より、 matCTGF
とNotchA、NotchB、またはNotchCが共発現することによ
ってルシフェラーゼ活性の相対倍率が大きく1を上回っ
たことから、matCTGFとNotchA、NotchB、またはNotchC
が相互作用していることがわかった。
答配列とウサギβグロビンプロモーターをpGL3Basic
（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し
たベクターであるpGAL4Luc 0.2 μgとpM/ ecNotch1, pV
P/ matCTGF各0.2 μg、さらに遺伝子導入効率補正用と
してpCH110 0.15 μgの合計0.75 μgの混合物を1.5 ml
エッペンチューブに作製した。（上記のように、matCTG
Fについては塩基配列を確認した１クローン、ecNotch1
については独立した３クローン（NotchA, NotchB, Notc
hC）を実験に用いた）この混合物を、遺伝子導入試薬Fu
Gene6（ベーリンガー社製）を用いてCOS1細胞に導入し
た。48時間後、培地を吸引・洗浄した後、細胞溶解液LC
β（ニッポンジーン社製）180 μlで細胞を溶解し細胞
抽出液を作製した。そのうち17.5 μlをルシフェラーゼ
アッセイ試薬（プロメガ社製）を用いMicrolumat96(ワ
ラックベルトールド社製)によりルシフェラーゼ活性を
測定した。遺伝子導入効率の測定は細胞抽出液35 μlを
用い、pCH110から発現されるβガラクトシダーゼを測定
することで行った。相互作用の強さは、ルシフェラーゼ
活性をβガラクトシダーゼ活性で割算し、相対値として
算出した。結果を表１に示した。表１より、 matCTGF
とNotchA、NotchB、またはNotchCが共発現することによ
ってルシフェラーゼ活性の相対倍率が大きく1を上回っ
たことから、matCTGFとNotchA、NotchB、またはNotchC
が相互作用していることがわかった。
【表１】
【００３３】実施例３：pM/ ecNotch1, pVP/ matCTGFか
ら蛋白が発現され細胞核に移行していることの確認 （１）遺伝子の導入：10 cm培養皿にまきこんだCOS1細
胞に対して、実施例２で用いたベクター、すなわちpM/
ecNotch1, pVP/ matCTGFを単独で4 μgあるいはそれぞ
れ4 μgの合計8 μgを遺伝子導入試薬FuGene6（ベーリ
ンガー社製）を用いて導入した。 （２）細胞核の調製：48時間後、PBS(-)12 mlで洗浄
し、氷冷したバッファーA（10 mM Tris(pH.7.9), 10 mM
KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mMPMS
F, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 5 μg/ml leupeptin）1
mlでエッペンチューブに回収した。冷却遠心機にて5000
回転、4℃で3分遠心し、上清を除いた。0.5mlの氷冷し
たバッファーAを添加し、P1000, P200のチップで順次細
胞塊をほぐし、15分間 氷上に静置した。13 μlの10％N
P-40を添加して15秒間激しくボルテクスしたのち、冷却
遠心機にて7000回転、4℃で2分遠心し、上清を除いた。
沈殿に25 μlのバッファーC（20 mM Tris(pH.7.9), 400
mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20％ Glycerol, 1 mM
DTT, 1 mM PMSF, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 5 μg/ml
leupeptin）を添加して-80℃に終夜保存した。氷上にて
融解後、冷却遠心機にて14000回転、4℃で10分遠心し、
上清を核画分とした。 （３）ウエスタンブロット：（２）で調製した核画分25
μlに等量の2XSDS-PAGEバッファーを添加し、95℃で5
分間ボイルした後、１０％ゲル（旭テクノグラス社製）
を用いて140Ｖで９０分SDS-PAGEを行った。電気泳動終
了後、PVDF膜に100Ｖで1時間トランスファーした。転写
した膜は室温にて30分間1％BSA-TBST（BSA:Albumin,Bov
ine SIGMA社製、CatNo.A-7030LotNo.109H1072, TBST:Tr
is 2.42g/l, NaCl 8g/l, Tween20 1ml/l）でブロッキン
グした後、TBSTにて10分3回室温にて洗浄した。1次抗体
として、CTGFはRabbit anti mCTGF (Torrey Pines Bio
labs, Cat No.TP243 Lot No.112919 ,1μg/μl)をPBS
(-) （PBS：Phosphat Buffered Saline 7.2（ギブコ ,C
at No.20012-027、Lot No.1094151））にて1:1000の希
釈倍率で、NotchはAnti Notch 1 extracellular domain
rabbit polyclonal IgG（up state,Cat No.07-218 Lot
No.20442 ,1ug/ul）をPBS(-)にて1:250の希釈倍率で、
室温にて1時間反応させた。TBSTにて10分3回室温で洗浄
したのち、2次抗体としてanti-rabbit IgG horse radis
h peroxidase Linked whole antibode(from donky)(Ame
rsham,Cat No.ＮＡ934 Lot No.123450) をPBS(-)にて1:
2000の希釈倍率で、室温にて1時間反応させた。TBSTに
て10分3回室温で洗浄した後、スーパーシグナル発光試
薬（PIERCE社）にて５分間反応させた。X線フィルム
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に感光させ
た後、現像した。結果は図１に示した。pM/ecNotch, pV
P/matCTGFを共発現させた細胞は両方のシグナルが、い
ずれか片方を発現させた細胞では発現させた蛋白がそれ
ぞれ発現していることが明らかとなった。従って、Mamm
alian 2 hybridアッセイにおいて導入されたベクターは
目的の蛋白を発現していることから。このアッセイで認
められた相互作用は目的の蛋白同士の相互作用である可
能性が高いと確認された。
ら蛋白が発現され細胞核に移行していることの確認 （１）遺伝子の導入：10 cm培養皿にまきこんだCOS1細
胞に対して、実施例２で用いたベクター、すなわちpM/
ecNotch1, pVP/ matCTGFを単独で4 μgあるいはそれぞ
れ4 μgの合計8 μgを遺伝子導入試薬FuGene6（ベーリ
ンガー社製）を用いて導入した。 （２）細胞核の調製：48時間後、PBS(-)12 mlで洗浄
し、氷冷したバッファーA（10 mM Tris(pH.7.9), 10 mM
KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mMPMS
F, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 5 μg/ml leupeptin）1
mlでエッペンチューブに回収した。冷却遠心機にて5000
回転、4℃で3分遠心し、上清を除いた。0.5mlの氷冷し
たバッファーAを添加し、P1000, P200のチップで順次細
胞塊をほぐし、15分間 氷上に静置した。13 μlの10％N
P-40を添加して15秒間激しくボルテクスしたのち、冷却
遠心機にて7000回転、4℃で2分遠心し、上清を除いた。
沈殿に25 μlのバッファーC（20 mM Tris(pH.7.9), 400
mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20％ Glycerol, 1 mM
DTT, 1 mM PMSF, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 5 μg/ml
leupeptin）を添加して-80℃に終夜保存した。氷上にて
融解後、冷却遠心機にて14000回転、4℃で10分遠心し、
上清を核画分とした。 （３）ウエスタンブロット：（２）で調製した核画分25
μlに等量の2XSDS-PAGEバッファーを添加し、95℃で5
分間ボイルした後、１０％ゲル（旭テクノグラス社製）
を用いて140Ｖで９０分SDS-PAGEを行った。電気泳動終
了後、PVDF膜に100Ｖで1時間トランスファーした。転写
した膜は室温にて30分間1％BSA-TBST（BSA:Albumin,Bov
ine SIGMA社製、CatNo.A-7030LotNo.109H1072, TBST:Tr
is 2.42g/l, NaCl 8g/l, Tween20 1ml/l）でブロッキン
グした後、TBSTにて10分3回室温にて洗浄した。1次抗体
として、CTGFはRabbit anti mCTGF (Torrey Pines Bio
labs, Cat No.TP243 Lot No.112919 ,1μg/μl)をPBS
(-) （PBS：Phosphat Buffered Saline 7.2（ギブコ ,C
at No.20012-027、Lot No.1094151））にて1:1000の希
釈倍率で、NotchはAnti Notch 1 extracellular domain
rabbit polyclonal IgG（up state,Cat No.07-218 Lot
No.20442 ,1ug/ul）をPBS(-)にて1:250の希釈倍率で、
室温にて1時間反応させた。TBSTにて10分3回室温で洗浄
したのち、2次抗体としてanti-rabbit IgG horse radis
h peroxidase Linked whole antibode(from donky)(Ame
rsham,Cat No.ＮＡ934 Lot No.123450) をPBS(-)にて1:
2000の希釈倍率で、室温にて1時間反応させた。TBSTに
て10分3回室温で洗浄した後、スーパーシグナル発光試
薬（PIERCE社）にて５分間反応させた。X線フィルム
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に感光させ
た後、現像した。結果は図１に示した。pM/ecNotch, pV
P/matCTGFを共発現させた細胞は両方のシグナルが、い
ずれか片方を発現させた細胞では発現させた蛋白がそれ
ぞれ発現していることが明らかとなった。従って、Mamm
alian 2 hybridアッセイにおいて導入されたベクターは
目的の蛋白を発現していることから。このアッセイで認
められた相互作用は目的の蛋白同士の相互作用である可
能性が高いと確認された。
【００３４】実施例４：NotchがCTGF受容体であるか否
かの検討 NotchとCTGFを両方COS細胞に過剰発現させ、Notchシグ
ナルが活性化されるか否かを、NotchIC領域の核移行の
有無で検討することができる。 （１）ベクターの構築：（pcDNA3.1/HisC/1MCTGFの構
築） Vector DNA(pRC/CMV/CTGF)( (0.1 mg/ml) 1 μl, 10X P
CR buffer 5μl, 2.5 mMdNTP Mix 4μl, 10 mM Forward
Primer (CTGF1M) 2μl, 10μM Reverse Primer(CTGFR)
2μl, DW 35.75μl, Enzyme 0.25μl の計50 μlの系
で反応を行った。98℃ 10 secの後、98℃ 10 sec, 65℃
75 secを15サイクル反応した後、72℃5分反応させて反
応を終了した。PCR精製キット（キアゲン社製）にて増
幅断片を精製した後、EcoRIで制限酵素処理し、アガロ
ースゲル電気泳動にて精製断片を分離した。アガロース
ゲルから精製断片を切り出し、ゲル精製キット（キアゲ
ン社製）にて増幅断片を精製した。発現ベクターpcDNA
3.1/HisCをEcoRIで制限酵素処理し、アガロースゲル電
気泳動にて精製断片を分離した。アガロースゲルから精
製断片を切り出し、ゲル精製キット（キアゲン社製）に
て増幅断片を精製した。精製断片をアルカリホスファタ
ーゼ（東洋紡社製）にて酵素処理した後、PCR精製キッ
ト（キアゲン社製）にて増幅断片を精製、精製したCTGF
cDNA断片とpcDNA3.1/HisCをライゲーションハイ（東洋
紡社製）にてライゲーションし、DH5α（東洋紡社製）
でトランスホームした。インサートが正しく挿入された
コロニーの選択は、T7プライマーとCTGF2をPCRプライマ
ーに用いて行った。挿入の方向および配列はシークエン
スすることで確認した。マウスNotch全長発現ベクター
であるpTagHA/mNotch1、あるいはpCMV/mNotch1（pTagHA
/mNotch1からタグであるHAを除いた発現ベクター）と上
記pcDNA3.1/HisC/1MCTGFはいずれも常法に従い大量調製
した。 （２）遺伝子の導入：上記実施例３と同様の手法で行う
（mNotch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch1あるいはpCM
V/mNotch1）、およびpcDNA3.1/HisC/1MCTGFのどちらか
一方のみ導入するかもしくは両方とも同時に導入す
る。）。あるいは、あらかじめCTGFを導入した細胞培養
上清、pcDNA3.1/HisCを導入した細胞培養上清を用意し
ておき、mNotch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch1ある
いはpCMV/mNotch1）を導入した細胞にこれらの上清を作
用させ、培養する。 （３）細胞核の調製：上記実施例３と同様の手法で行
う。 （４）ウエスタンブロット：上記実施例３と同様の手法
で行う。ただしNotch抗体は細胞内領域を認識するもの
を用いる。mNotch1の発現ベクターを導入した細胞に対
してpcDNA3.1/HisC/1MCTGFを同時に過剰発現させた場
合、またはmNotch1の発現ベクターを導入した細胞に対
してCTGFを含む培養上清を作用させた場合に核移行が認
められるか否かを検出することができる。
かの検討 NotchとCTGFを両方COS細胞に過剰発現させ、Notchシグ
ナルが活性化されるか否かを、NotchIC領域の核移行の
有無で検討することができる。 （１）ベクターの構築：（pcDNA3.1/HisC/1MCTGFの構
築） Vector DNA(pRC/CMV/CTGF)( (0.1 mg/ml) 1 μl, 10X P
CR buffer 5μl, 2.5 mMdNTP Mix 4μl, 10 mM Forward
Primer (CTGF1M) 2μl, 10μM Reverse Primer(CTGFR)
2μl, DW 35.75μl, Enzyme 0.25μl の計50 μlの系
で反応を行った。98℃ 10 secの後、98℃ 10 sec, 65℃
75 secを15サイクル反応した後、72℃5分反応させて反
応を終了した。PCR精製キット（キアゲン社製）にて増
幅断片を精製した後、EcoRIで制限酵素処理し、アガロ
ースゲル電気泳動にて精製断片を分離した。アガロース
ゲルから精製断片を切り出し、ゲル精製キット（キアゲ
ン社製）にて増幅断片を精製した。発現ベクターpcDNA
3.1/HisCをEcoRIで制限酵素処理し、アガロースゲル電
気泳動にて精製断片を分離した。アガロースゲルから精
製断片を切り出し、ゲル精製キット（キアゲン社製）に
て増幅断片を精製した。精製断片をアルカリホスファタ
ーゼ（東洋紡社製）にて酵素処理した後、PCR精製キッ
ト（キアゲン社製）にて増幅断片を精製、精製したCTGF
cDNA断片とpcDNA3.1/HisCをライゲーションハイ（東洋
紡社製）にてライゲーションし、DH5α（東洋紡社製）
でトランスホームした。インサートが正しく挿入された
コロニーの選択は、T7プライマーとCTGF2をPCRプライマ
ーに用いて行った。挿入の方向および配列はシークエン
スすることで確認した。マウスNotch全長発現ベクター
であるpTagHA/mNotch1、あるいはpCMV/mNotch1（pTagHA
/mNotch1からタグであるHAを除いた発現ベクター）と上
記pcDNA3.1/HisC/1MCTGFはいずれも常法に従い大量調製
した。 （２）遺伝子の導入：上記実施例３と同様の手法で行う
（mNotch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch1あるいはpCM
V/mNotch1）、およびpcDNA3.1/HisC/1MCTGFのどちらか
一方のみ導入するかもしくは両方とも同時に導入す
る。）。あるいは、あらかじめCTGFを導入した細胞培養
上清、pcDNA3.1/HisCを導入した細胞培養上清を用意し
ておき、mNotch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch1ある
いはpCMV/mNotch1）を導入した細胞にこれらの上清を作
用させ、培養する。 （３）細胞核の調製：上記実施例３と同様の手法で行
う。 （４）ウエスタンブロット：上記実施例３と同様の手法
で行う。ただしNotch抗体は細胞内領域を認識するもの
を用いる。mNotch1の発現ベクターを導入した細胞に対
してpcDNA3.1/HisC/1MCTGFを同時に過剰発現させた場
合、またはmNotch1の発現ベクターを導入した細胞に対
してCTGFを含む培養上清を作用させた場合に核移行が認
められるか否かを検出することができる。
【００３５】実施例５：CTGFがNotchシグナルを活性化
するか否かの検討 （１）E-boxを介する転写抑制に対する検討：Notchシグ
ナルは、いわゆるE-boxを認識配列とする転写因子であ
るE47などのbHLHタイプの転写因子による転写活性化を
抑制することが知られている（Mol.Cell.Biol.18:2230-
2239,1998）。CTGFがNotchシグナルを活性化するのであ
れば、E-boxを介する転写を抑制する可能性がある。そ
こでE-boxを介する転写抑制に対する検討を行った。E-b
oxのコンセンサス配列（CAGGTG）（Cell 56:777-783,19
89）を4つタンデムに結合した配列にKpnI,BglIIの制限
酵素サイトを5’および3’端に結合したDNAを合成し、
ルスフェラーゼレポーターベクターであるpGL3-Promote
rベクター（プロメガ社）のKpnI, BglIIサイトに挿入し
てpGL3/4xEbox/SV40pを構築した。COS1細胞に一過性にm
Notch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch1およびpCMV/mNo
tch1でそれぞれ実施した。）、pGL3/4xEbox/SV40pを強
制発現させ、同時にpcDNA3.1/HisC/1MCTGFを共発現させ
る場合とさせない場合を比較した。また、pcDNA3.1/His
C/1MCTGFを共発現させる代わりに、あらかじめ調製した
CTGFを含む培養上清を用いて実験を行った。 （２）CBF-1/Su(H)を介する転写活性化に対する検討：N
otchレセプターが活性化されると細胞内領域が核移行し
て転写因子CBF-1/Su(H)を活性化することが知られてい
る（Mol.Cell.Biol.20:6913-6922,2000）。CTGFがNotch
シグナルを活性化するのであれば、CBF-1/Su(H)の転写
活性を上昇させる可能性がある。そこで転写因子CBF-1/
Su(H)の転写活性への影響を検討した。CBF-1/Su(H)の結
合配列のコンセンサス配列(CGTGGGAA) （Mol.Cell.Bio
l.17:2679-87,1997） を4つタンデムに結合した配列にK
pnI,BglIIの制限酵素サイトを5’および3’端に結合し
たDNAを合成し、ルスフェラーゼレポーターベクターで
あるpGL3-Promoterベクター（プロメガ社）のKpnI,BglI
Iサイトに挿入してpGL3/4xCBF/SV40pを構築した。COS1
細胞に一過性にmNotch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch
1あるいはpCMV/mNotch1でそれぞれ実施した。）, pGL3/
4xCBF/SV40pを強制発現させ、同時にpcDNA3.1/HisC/1MC
TGFを共発現させる場合とさせない場合を比較した。も
しくはpcDNA3.1/HisC/1MCTGFを共発現させる代わりに、
あらかじめ調製したCTGFを含む培養上清を用いて実験を
行った。これら（１）および（２）の実験の結果、CTGF
によりNotchシグナル下流の転写因子の転写活性が調節
されることがわかった。
するか否かの検討 （１）E-boxを介する転写抑制に対する検討：Notchシグ
ナルは、いわゆるE-boxを認識配列とする転写因子であ
るE47などのbHLHタイプの転写因子による転写活性化を
抑制することが知られている（Mol.Cell.Biol.18:2230-
2239,1998）。CTGFがNotchシグナルを活性化するのであ
れば、E-boxを介する転写を抑制する可能性がある。そ
こでE-boxを介する転写抑制に対する検討を行った。E-b
oxのコンセンサス配列（CAGGTG）（Cell 56:777-783,19
89）を4つタンデムに結合した配列にKpnI,BglIIの制限
酵素サイトを5’および3’端に結合したDNAを合成し、
ルスフェラーゼレポーターベクターであるpGL3-Promote
rベクター（プロメガ社）のKpnI, BglIIサイトに挿入し
てpGL3/4xEbox/SV40pを構築した。COS1細胞に一過性にm
Notch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch1およびpCMV/mNo
tch1でそれぞれ実施した。）、pGL3/4xEbox/SV40pを強
制発現させ、同時にpcDNA3.1/HisC/1MCTGFを共発現させ
る場合とさせない場合を比較した。また、pcDNA3.1/His
C/1MCTGFを共発現させる代わりに、あらかじめ調製した
CTGFを含む培養上清を用いて実験を行った。 （２）CBF-1/Su(H)を介する転写活性化に対する検討：N
otchレセプターが活性化されると細胞内領域が核移行し
て転写因子CBF-1/Su(H)を活性化することが知られてい
る（Mol.Cell.Biol.20:6913-6922,2000）。CTGFがNotch
シグナルを活性化するのであれば、CBF-1/Su(H)の転写
活性を上昇させる可能性がある。そこで転写因子CBF-1/
Su(H)の転写活性への影響を検討した。CBF-1/Su(H)の結
合配列のコンセンサス配列(CGTGGGAA) （Mol.Cell.Bio
l.17:2679-87,1997） を4つタンデムに結合した配列にK
pnI,BglIIの制限酵素サイトを5’および3’端に結合し
たDNAを合成し、ルスフェラーゼレポーターベクターで
あるpGL3-Promoterベクター（プロメガ社）のKpnI,BglI
Iサイトに挿入してpGL3/4xCBF/SV40pを構築した。COS1
細胞に一過性にmNotch1の発現ベクター（pTagHA/mNotch
1あるいはpCMV/mNotch1でそれぞれ実施した。）, pGL3/
4xCBF/SV40pを強制発現させ、同時にpcDNA3.1/HisC/1MC
TGFを共発現させる場合とさせない場合を比較した。も
しくはpcDNA3.1/HisC/1MCTGFを共発現させる代わりに、
あらかじめ調製したCTGFを含む培養上清を用いて実験を
行った。これら（１）および（２）の実験の結果、CTGF
によりNotchシグナル下流の転写因子の転写活性が調節
されることがわかった。
【００３６】実施例７：NovとNotch、及びCTGFとNotch
の結合 （HAタグを付けたCTGF（CTGF-HA）の作製）cDNAライブ
ラリスクリーニングによってクローニングしたマウスCT
GFクローンにPCRでXba1サイトを付加してPCRで増幅し
(プライマ配列：CATGAGGGGCAACCCACTGA（配列番号１
５）, CCTCTAGAGAAGGCACTGTTCCATG（配列番号１６）)、
pTagHAに入れたものである。このpTagHAはpCMVTag4(Sta
ratagene)にHAエピトープを入れたものをPCRで増幅して
得たものである（Flag前にstop codonをいれてあるので
Flagは発現しない。；PCRプライマ配列：GGCCCAAGCTTTC
TAGATATCCGTATGATGTTCCTGAT（配列番号１７）、GTGCGGT
CGACCTAGAGGCTAGCATAATCAGGAACATC(配列番号１８））。
の結合 （HAタグを付けたCTGF（CTGF-HA）の作製）cDNAライブ
ラリスクリーニングによってクローニングしたマウスCT
GFクローンにPCRでXba1サイトを付加してPCRで増幅し
(プライマ配列：CATGAGGGGCAACCCACTGA（配列番号１
５）, CCTCTAGAGAAGGCACTGTTCCATG（配列番号１６）)、
pTagHAに入れたものである。このpTagHAはpCMVTag4(Sta
ratagene)にHAエピトープを入れたものをPCRで増幅して
得たものである（Flag前にstop codonをいれてあるので
Flagは発現しない。；PCRプライマ配列：GGCCCAAGCTTTC
TAGATATCCGTATGATGTTCCTGAT（配列番号１７）、GTGCGGT
CGACCTAGAGGCTAGCATAATCAGGAACATC(配列番号１８））。
【００３７】（HAタグを付けたNov(Nov-HA)の作製）B.P
erbalから供与されたNovをEcoR1-Stu1で切り出し、pTag
HAのR1-RVサイトに入れた。 （Flagタグを付けたNotch(Notch-Flag)の作製）J.Nyeか
ら供与されたNotchをR1-HindIIIで切り出し、pCMVTag4
(Stratagene)のR1-HindIIIサイトに入れた。
erbalから供与されたNovをEcoR1-Stu1で切り出し、pTag
HAのR1-RVサイトに入れた。 （Flagタグを付けたNotch(Notch-Flag)の作製）J.Nyeか
ら供与されたNotchをR1-HindIIIで切り出し、pCMVTag4
(Stratagene)のR1-HindIIIサイトに入れた。
【００３８】（Flagタグを付けたSerrate(Serrate-Fla
g)の作製）SerrateはcDNAライブラリスクリーニングに
よってクローニングした(Sakamoto et al., Biochem. B
iophys. Res. Com. 1998)。その後、ORFの3’端の部分
でPCRを行い、HindIIIサイトを付加した（プライマ配
列：GTACAAAGGCGACCAGTTAAG（配列番号1９）, CAAGCTTC
TCTACAATGTACTCCATTC(配列番号２０））。このフラグメ
ントをwild typeの部分と置換し、pCMVTag4に入れた。 （FLAGタグを付けたDelta(Delta-FLAG)の作製）D.Henri
queより供与されたDeltaはORF3’が欠如していたので、
Flagエピトープ付きのプライマーでORF3’部分のみのPC
Rを行い（プライマ配列：TGGGTTATTCTGGGTTCAACTGTG
（配列番号２１）,CCATTCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCACC
TCAGTTGCTATGATGCAC（配列番号２２））、これを供与さ
れたクローンの3’部分と置換してpBK-CMV-EX2に入れ
た。この発現ベクターはpBK-CMVのNhe1-Spe1部分（blue
-whiteセレクションのためのLacp部分）を除去したもの
である。
g)の作製）SerrateはcDNAライブラリスクリーニングに
よってクローニングした(Sakamoto et al., Biochem. B
iophys. Res. Com. 1998)。その後、ORFの3’端の部分
でPCRを行い、HindIIIサイトを付加した（プライマ配
列：GTACAAAGGCGACCAGTTAAG（配列番号1９）, CAAGCTTC
TCTACAATGTACTCCATTC(配列番号２０））。このフラグメ
ントをwild typeの部分と置換し、pCMVTag4に入れた。 （FLAGタグを付けたDelta(Delta-FLAG)の作製）D.Henri
queより供与されたDeltaはORF3’が欠如していたので、
Flagエピトープ付きのプライマーでORF3’部分のみのPC
Rを行い（プライマ配列：TGGGTTATTCTGGGTTCAACTGTG
（配列番号２１）,CCATTCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCACC
TCAGTTGCTATGATGCAC（配列番号２２））、これを供与さ
れたクローンの3’部分と置換してpBK-CMV-EX2に入れ
た。この発現ベクターはpBK-CMVのNhe1-Spe1部分（blue
-whiteセレクションのためのLacp部分）を除去したもの
である。
【００３９】上記のPCRは全てクロンテックのAdvantage
polymeraseとプライマー各々50pmolを使った。94℃ 30
sec, 55℃ 30sec, 72℃ 90secを25サイクル行った。イ
ンサートの確認は制限酵素消化と実際にトランスフェク
ションで行った。遺伝子導入法はlipofectamine 2000(i
n vitrogen) 2ulを12穴ウェルのプレートで使用し
た。使用した細胞はHEK293及びCOSで、導入効率は概ね2
0％〜40%であることを、β-galactosidaseのトランスフ
ェクションで確認した。蛋白抽出はTNTCバッファを使用
した。免疫沈降はanti-Flag M2 affinity gel(Sigma)を
使い通法に従った。SDS-PAGEとウエスタンブロットの
後、検出はanti-HAhigh affinity, peroxidase conjuga
ted (Roche)を使用し、ルミノールを使用した化学発光
法によった。図２、図３に結果を示した。これらの結果
から、CTGF-HAとNotch-Flag、あるいはNov-HAとNotch-F
lagを共導入した場合に多量のCTGFあるいはNovがNotch
と共沈降する結果が得られた。すなわちCTGF、NovとNot
chが結合していることが確認された。
polymeraseとプライマー各々50pmolを使った。94℃ 30
sec, 55℃ 30sec, 72℃ 90secを25サイクル行った。イ
ンサートの確認は制限酵素消化と実際にトランスフェク
ションで行った。遺伝子導入法はlipofectamine 2000(i
n vitrogen) 2ulを12穴ウェルのプレートで使用し
た。使用した細胞はHEK293及びCOSで、導入効率は概ね2
0％〜40%であることを、β-galactosidaseのトランスフ
ェクションで確認した。蛋白抽出はTNTCバッファを使用
した。免疫沈降はanti-Flag M2 affinity gel(Sigma)を
使い通法に従った。SDS-PAGEとウエスタンブロットの
後、検出はanti-HAhigh affinity, peroxidase conjuga
ted (Roche)を使用し、ルミノールを使用した化学発光
法によった。図２、図３に結果を示した。これらの結果
から、CTGF-HAとNotch-Flag、あるいはNov-HAとNotch-F
lagを共導入した場合に多量のCTGFあるいはNovがNotch
と共沈降する結果が得られた。すなわちCTGF、NovとNot
chが結合していることが確認された。
【００４０】実施例８：NovによるNotch由来シグナルの
活性化 C2/4細胞にNotch、 Nov 、 HES5プロモーター（Notch-1
: GenBank NM_008714, Nov : GenBank NM 002514, HES
5 : Takebayashi,K., Akazawa,C., Nakanishi,S. and K
ageyama,R. J. Biol. Chem. 270 (3), 1342-1349 (199
5)）下流に繋いだルシフェラーゼ遺伝子をDC-Chol法（G
ao, X.,and Huang, L.(1991) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 179, 280-285）にて共導入した。約48時間後
に、細胞を回収し、Dual luciferase reporter assay s
ystem (Promega) を用いて細胞溶解液中のluciferase活
性を測定した。結果を図４に示す。ルシフェラーゼ活性
は、遺伝子導入効率を示す対照群として、Renillaのル
シフェラーゼ遺伝子をC2/4に導入した場合のルシフェラ
ーゼ活性を１とした場合の相対値を示している。Notch
の存在下でのみ、Novの濃度依存的にルシフェラーゼ活
性が増大していることがわかる。この結果からNovによ
ってNotchを介したシグナルが細胞内に伝達されている
ことが確認された。
活性化 C2/4細胞にNotch、 Nov 、 HES5プロモーター（Notch-1
: GenBank NM_008714, Nov : GenBank NM 002514, HES
5 : Takebayashi,K., Akazawa,C., Nakanishi,S. and K
ageyama,R. J. Biol. Chem. 270 (3), 1342-1349 (199
5)）下流に繋いだルシフェラーゼ遺伝子をDC-Chol法（G
ao, X.,and Huang, L.(1991) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 179, 280-285）にて共導入した。約48時間後
に、細胞を回収し、Dual luciferase reporter assay s
ystem (Promega) を用いて細胞溶解液中のluciferase活
性を測定した。結果を図４に示す。ルシフェラーゼ活性
は、遺伝子導入効率を示す対照群として、Renillaのル
シフェラーゼ遺伝子をC2/4に導入した場合のルシフェラ
ーゼ活性を１とした場合の相対値を示している。Notch
の存在下でのみ、Novの濃度依存的にルシフェラーゼ活
性が増大していることがわかる。この結果からNovによ
ってNotchを介したシグナルが細胞内に伝達されている
ことが確認された。
【００４１】実施例９：スクリーニング方法
（１）被験物質の存在下及び非存在下にCTGFとNotchと
を接触させて一定時間インキュベートした後、CTGF-Not
ch複合体、遊離CTGF及び遊離Notchを電気泳動により分
離し、標識抗CTGF抗体及び標識抗Notch抗体を用いてCTG
F-Notch複合体に相当するバンド強度を測定する。例え
ば、CTGFをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとNotc
h細胞外領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターの
両方が導入された培養上清、あるいはCTGFをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクターが導入された培養上清とNotc
hをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとが導入され
た宿主細胞の膜画分の混合物に、被験物質を添加してあ
るいは添加しないでインキュベートした後、各反応液を
非変性ゲル電気泳動にかけ、RIもしくは非RI（酵素、蛍
光等）標識した各抗体でウェスタンブロッティングを行
い、両方の抗体と交叉反応するバンドの強度を比較す
る。また、CTGF及び／又はNotchをウサギ網状赤血球系
などの無細胞翻訳系を用いて合成する場合、CTGF又はNo
tchのいずれか一方を35S-Met等を用いて標識しておけ
ば、標識抗体をプローブとしたウェスタンブロッティン
グを行う代わりに、泳動ゲルのオートラジオグラフィー
を行い、より高分子量の側の、バンドの強度を比較す
る。 （２）あるいは、上記（１）において、反応液に抗CTGF
抗体又は抗Notch抗体を加えて免疫沈降させた後で、沈
降物を電気泳動して、RIもしくは非RI（酵素、蛍光等）
標識した抗Notch抗体又は抗CTGF抗体を用いてウェスタ
ンブロッティングを行い、検出されるバンドの強度を比
較することもできる。免疫沈降は、好ましくは、プラス
チックビーズやセファデックス等の不溶性担体に固相化
した抗体を用いて行うことができる。また、CTGF及び／
又はNotchを上述のように無細胞翻訳系を用いて合成す
る場合、CTGF又はNotchのいずれか一方を、35S-Met等を
用いて標識し、他方に対する抗体を反応液に加えて免疫
沈降させた後で、沈降物を電気泳動して泳動ゲルのオー
トラジオグラフィーを行い、検出されるバンドの強度を
比較する。 （３）CTGF-Notch複合体の測定は、慣用のイムノアッセ
イ系を用いて行うこともできる。例えば、反応液に抗CT
GF抗体又は抗Notch抗体を加えて免疫沈降させ、液相を
除去した後、RIもしくは非RI（酵素、蛍光等）標識した
抗Notch抗体又は抗CTGF抗体を用いてRIA、EIA、FIA等を
行い、検出されるシグナル強度を比較してもよい。ま
た、CTGF及び／又はNotchを上述のように無細胞翻訳系
を用いて合成する場合、CTGF又はNotchのいずれか一方
を35S-Met等を用いて標識しておけば、他方に対する抗
体を反応液に加えて免疫沈降させ、液相を除去した後に
RIAを行うことによってもCTGF-Notch複合体を測定する
ことができる。 （４）あるいは、表面プラズモン共鳴、蛍光偏光イムノ
アッセイ、蛍光消光イムノアッセイ、蛍光エネルギー転
移イムノアッセイ等のB/F分離を要しない均一系イムノ
アッセイを用いれば、反応液から直接的にCTGF-Notch複
合体を測定することができる。
を接触させて一定時間インキュベートした後、CTGF-Not
ch複合体、遊離CTGF及び遊離Notchを電気泳動により分
離し、標識抗CTGF抗体及び標識抗Notch抗体を用いてCTG
F-Notch複合体に相当するバンド強度を測定する。例え
ば、CTGFをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとNotc
h細胞外領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターの
両方が導入された培養上清、あるいはCTGFをコードする
ＤＮＡを含む発現ベクターが導入された培養上清とNotc
hをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとが導入され
た宿主細胞の膜画分の混合物に、被験物質を添加してあ
るいは添加しないでインキュベートした後、各反応液を
非変性ゲル電気泳動にかけ、RIもしくは非RI（酵素、蛍
光等）標識した各抗体でウェスタンブロッティングを行
い、両方の抗体と交叉反応するバンドの強度を比較す
る。また、CTGF及び／又はNotchをウサギ網状赤血球系
などの無細胞翻訳系を用いて合成する場合、CTGF又はNo
tchのいずれか一方を35S-Met等を用いて標識しておけ
ば、標識抗体をプローブとしたウェスタンブロッティン
グを行う代わりに、泳動ゲルのオートラジオグラフィー
を行い、より高分子量の側の、バンドの強度を比較す
る。 （２）あるいは、上記（１）において、反応液に抗CTGF
抗体又は抗Notch抗体を加えて免疫沈降させた後で、沈
降物を電気泳動して、RIもしくは非RI（酵素、蛍光等）
標識した抗Notch抗体又は抗CTGF抗体を用いてウェスタ
ンブロッティングを行い、検出されるバンドの強度を比
較することもできる。免疫沈降は、好ましくは、プラス
チックビーズやセファデックス等の不溶性担体に固相化
した抗体を用いて行うことができる。また、CTGF及び／
又はNotchを上述のように無細胞翻訳系を用いて合成す
る場合、CTGF又はNotchのいずれか一方を、35S-Met等を
用いて標識し、他方に対する抗体を反応液に加えて免疫
沈降させた後で、沈降物を電気泳動して泳動ゲルのオー
トラジオグラフィーを行い、検出されるバンドの強度を
比較する。 （３）CTGF-Notch複合体の測定は、慣用のイムノアッセ
イ系を用いて行うこともできる。例えば、反応液に抗CT
GF抗体又は抗Notch抗体を加えて免疫沈降させ、液相を
除去した後、RIもしくは非RI（酵素、蛍光等）標識した
抗Notch抗体又は抗CTGF抗体を用いてRIA、EIA、FIA等を
行い、検出されるシグナル強度を比較してもよい。ま
た、CTGF及び／又はNotchを上述のように無細胞翻訳系
を用いて合成する場合、CTGF又はNotchのいずれか一方
を35S-Met等を用いて標識しておけば、他方に対する抗
体を反応液に加えて免疫沈降させ、液相を除去した後に
RIAを行うことによってもCTGF-Notch複合体を測定する
ことができる。 （４）あるいは、表面プラズモン共鳴、蛍光偏光イムノ
アッセイ、蛍光消光イムノアッセイ、蛍光エネルギー転
移イムノアッセイ等のB/F分離を要しない均一系イムノ
アッセイを用いれば、反応液から直接的にCTGF-Notch複
合体を測定することができる。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、組織の線維化あるいは細
胞増殖を伴う、肺線維症、腎線維症、強皮症、慢性関節
リウマチ、癌等の疾患の治療または予防剤を探索するた
めに有用なスクリーニング方法を提供することが可能に
なった。
胞増殖を伴う、肺線維症、腎線維症、強皮症、慢性関節
リウマチ、癌等の疾患の治療または予防剤を探索するた
めに有用なスクリーニング方法を提供することが可能に
なった。
【００４３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Sumitomo Pharmaceuticals Co.,Ltd.
<120> The method for screening the agents which regulate the activity of
CCN family protein
<130> 132888
<160> 22
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 1
cgaattcatg accgccgcca gtatgggccc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 2
cgaattccag aactgcagcg ggccgtgccg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 3
cgaattcatg ccatgtctcc gtacatcttc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 4
cgaattctgc catgtctccg tacatcttcc 30
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 5
cggaattcca ccatgaccgc cgccagtatg ggccc 35
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 6
caaggaccaa accgtggttg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 7
caaccacggt ttggtccttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 8
gcacgttcca gcattcttac 20
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 9
cggaattcca ccatgccacg gctcctgacg ccccttctct gcct 44
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 10
cggaattcat gccacggctc ctgacgcccc ttctctgcct 40
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 11
cggaattctg ctcccagcca agtgggacct gcctgaat 38
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 12
cggaattcct gcgagggcag cggaggctcc accggctca 39
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 13
gatatggccg acttcgagtt tgag 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 14
gaataagtgc gacatcatca tcgg 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 15
catgaggggc aacccactga 20
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 16
cctctagaga aggcactgtt ccatg 25
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 17
ggcccaagct ttctagatat ccgtatgatg ttcctgat 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 18
gtgcggtcga cctagaggct agcataatca ggaacatc 38
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 19
gtacaaaggc gaccagttaa g 21
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 20
caagcttctc tacaatgtac tccattc 2
7
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 21
tgggttattc tgggttcaac tgtg 24
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer
<400> 22
ccattcttgt cgtcatcgtc tttgtagtcc acctcagttg ctatgatgca c 5
1
【００４４】
【図１】 pM/ ecNotch1, pVP/ matCTGFから蛋白が発現
され細胞核に移行していることを確認した図である。レ
ーン1:pM/NotchA, pVP/matCTGF, レーン2:pM/NotchB, p
VP/matCTGF, レーン3:pM/NotchC, pVP/matCTGF, レーン
4:遺伝子導入なし、レーン5: pM/NotchA, レーン6: pM/
NotchB, レーン7: pM/NotchC, レーン8: pVP/matCTGF
。
され細胞核に移行していることを確認した図である。レ
ーン1:pM/NotchA, pVP/matCTGF, レーン2:pM/NotchB, p
VP/matCTGF, レーン3:pM/NotchC, pVP/matCTGF, レーン
4:遺伝子導入なし、レーン5: pM/NotchA, レーン6: pM/
NotchB, レーン7: pM/NotchC, レーン8: pVP/matCTGF
。
【図２】 HAタグを付けたCTGF(CTGF-HA)とFlagタグを
付けたNotch(Notch-Flag)をコードするcDNAをCOS細胞に
導入し、このCOS細胞の細胞溶解液を用いて免疫沈降を
行った結果を示す図である。
付けたNotch(Notch-Flag)をコードするcDNAをCOS細胞に
導入し、このCOS細胞の細胞溶解液を用いて免疫沈降を
行った結果を示す図である。
【図３】 HAタグを付けたNov(Nov-HA)とFlagタグを付
けたDelta、Serrate、Notch(Delta-Flag、Serrate-Fla
g、Notch-Flag)をコードするcDNAをCOS細胞に導入し、
このCOS細胞の細胞溶解液を用いて免疫沈降を行った結
果を示す図である。写真上段は、抗Flag抗体を用いて免
疫沈降を行い、沈降物のwestern blottingを抗HA抗体で
行った結果を示し、Nov-HAとNotch-Flagを共導入した場
合にのみ多量の複合体が沈降していることがわかる。
けたDelta、Serrate、Notch(Delta-Flag、Serrate-Fla
g、Notch-Flag)をコードするcDNAをCOS細胞に導入し、
このCOS細胞の細胞溶解液を用いて免疫沈降を行った結
果を示す図である。写真上段は、抗Flag抗体を用いて免
疫沈降を行い、沈降物のwestern blottingを抗HA抗体で
行った結果を示し、Nov-HAとNotch-Flagを共導入した場
合にのみ多量の複合体が沈降していることがわかる。
【図４】 Notch(+)または (-)/ Nov / HES5-lucをC2/4
に共導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す
図である。ルシフェラーゼ活性は、遺伝子導入効率を示
す対照群として、Renilla由来のルシフェラーゼをC2/4
にtransfectionした場合のルシフェラーゼ活性を１とし
た場合の相対値を示している。Notchの存在下でのみ、N
ovの濃度依存的にルシフェラーゼ活性が増大しているこ
とがわかる。この結果からNovによってNotchを介したシ
グナルが細胞内に伝達されていることが確認された。
に共導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す
図である。ルシフェラーゼ活性は、遺伝子導入効率を示
す対照群として、Renilla由来のルシフェラーゼをC2/4
にtransfectionした場合のルシフェラーゼ活性を１とし
た場合の相対値を示している。Notchの存在下でのみ、N
ovの濃度依存的にルシフェラーゼ活性が増大しているこ
とがわかる。この結果からNovによってNotchを介したシ
グナルが細胞内に伝達されていることが確認された。
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(72)発明者 勝部 憲一
東京都文京区湯島１−５−45 東京医科歯
科大学内
(72)発明者 坂本 啓
東京都文京区湯島１−５−45 東京医科歯
科大学内
(72)発明者 中西 徹
岡山県岡山市西古松238−105−１−501
(72)発明者 西角 文夫
大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住
友製薬株式会社内
Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB10 BB14 BB20 BB46
CB01 DA13 FB01 FB02 FB03
FB05 FB09
4B024 AA01 AA11 BA21 BA63 CA04
CA07 CA20 DA02 EA04 GA13
HA11
Claims (5)
- 【請求項１】 被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競
合的に、Notchの活性を制御するか否かを測定すること
を特徴とする、CCNファミリー蛋白質活性制御剤、およ
び／または、Notch活性制御剤のスクリーニング方法。 - 【請求項２】 以下の（１）〜（３）の工程を含むこと
を特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法： （１）Notch、CCNファミリー蛋白質、および被験物質を
接触させる工程、（２）Notchの活性を検出する工程、
（３）被験物質非存在下におけるNotchの活性と、前記
（２）におけるNotchの活性とを比較する工程。 - 【請求項３】 被験物質が、CCNファミリー蛋白質と競
合的にNotchに結合するか否かを測定することを特徴と
する、CCNファミリー蛋白質活性制御剤、および／また
は、Notch活性制御剤のスクリーニング方法。 - 【請求項４】 CCNファミリー蛋白質が、NovまたはCTGF
であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載
のスクリーニング方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか記載のスクリー
ニング方法により得られるCCNファミリー蛋白質活性制
御剤、および／または、Notch活性制御剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001379548A JP2003177126A (ja) | 2001-12-13 | 2001-12-13 | Ｃｃｎファミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001379548A JP2003177126A (ja) | 2001-12-13 | 2001-12-13 | Ｃｃｎファミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003177126A true JP2003177126A (ja) | 2003-06-27 |
Family
ID=19186872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001379548A Pending JP2003177126A (ja) | 2001-12-13 | 2001-12-13 | Ｃｃｎファミリー蛋白質活性制御剤のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003177126A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526455A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-09-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 癌を特徴付ける、制御する、診断する、および処置するための組成物ならびに方法 |
| JP2008530582A (ja) * | 2005-02-18 | 2008-08-07 | チルドレンズ メディカル センター コーポレイション | 上皮由来の癌診断および予後診断のためのバイオマーカーとしてのＣｙｒ６１ |
| WO2011054315A1 (zh) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | 上海市免疫学研究所 | Cyr61蛋白在制药中的应用 |
| JP2012233873A (ja) * | 2011-04-22 | 2012-11-29 | Institute Of National Colleges Of Technology Japan | 抗アレルギー因子のスクリーニング方法 |
-
2001
- 2001-12-13 JP JP2001379548A patent/JP2003177126A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526455A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-09-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 癌を特徴付ける、制御する、診断する、および処置するための組成物ならびに方法 |
| JP2008530582A (ja) * | 2005-02-18 | 2008-08-07 | チルドレンズ メディカル センター コーポレイション | 上皮由来の癌診断および予後診断のためのバイオマーカーとしてのＣｙｒ６１ |
| WO2011054315A1 (zh) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | 上海市免疫学研究所 | Cyr61蛋白在制药中的应用 |
| EP2510940A1 (en) * | 2009-11-06 | 2012-10-17 | Shanghai Institute Of Immunology | Use of cyr61 protein for preparing medicine |
| EP2510940A4 (en) * | 2009-11-06 | 2013-07-10 | Shanghai Inst Of Immunology | USE OF THE CYR61 PROTEIN FOR THE MANUFACTURE OF MEDICINE |
| JP2012233873A (ja) * | 2011-04-22 | 2012-11-29 | Institute Of National Colleges Of Technology Japan | 抗アレルギー因子のスクリーニング方法 |
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