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JP2002537230A - ｃ−ｍｙｃのアンチセンス標的化による再狭窄の処置方法 - Google Patents

ｃ−ｍｙｃのアンチセンス標的化による再狭窄の処置方法

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JP2002537230A
JP2002537230A JP2000596139A JP2000596139A JP2002537230A JP 2002537230 A JP2002537230 A JP 2002537230A JP 2000596139 A JP2000596139 A JP 2000596139A JP 2000596139 A JP2000596139 A JP 2000596139A JP 2002537230 A JP2002537230 A JP 2002537230A
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antisense compound
antisense
region
catheter
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、心臓血管形成術後の再狭窄のリスクまたは重症度を減少させるための改善された方法を提供する。本発明は、荷電していないリン含有骨格結合を有し、かつヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの開始コドンにわたるモルホリノアンチセンス化合物を、標的血管領域に投与する工程を包含する。新規なアンチセンス化合物および組成物、ならびに標的血管領域へのアンチセンス送達および取り込みの有効性をアッセイするための方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、再狭窄を処置するための組成物および方法に関し、そして特に、ｃ
−ｍｙｃに対して指向されるアンチセンス組成物、ならびに経管的血管形成術（
例えば、経皮的経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ））における再狭窄のリスクを減
少させるための、この組成物の投与方法に関する。
【０００２】 （参考文献）
【０００３】
【表１】
【０００４】
【０００５】 （発明の背景） 経管的冠動脈形成術は、１９７０年代後期に、閉塞性の冠動脈疾患のための非
外科的な処置として導入された。その導入以降、装置および技術における大きな
進歩は、冠動脈疾患およびアンギナを処置するための方法の広範な使用につなが
っている。典型的には、この手順は、先端部がバルーンの（ｂａｌｌｏｏｎ−ｔ
ｉｐ）カテーテルを閉塞の部位に配置する工程、および閉塞した血管を、カテー
テルのバルーンの膨張により破壊し、そして拡げる工程を包含する。
【０００６】 装置および技術における進歩にもかかわらず、再狭窄は、血管形成術の際の血
管開存性の維持における制限的な要因として残り（患者の３０％〜５０％で起こ
る）、そして、有意な罹患率および健康管理出費の原因となっている。（Ｃａｓ
ｔｅｒｅｌｌａ）。血管形成術後の再狭窄は、血管壁の外傷に対する、部分的に
制限された創傷治癒応答である。動物モデルおよびヒトの剖検斑組織を用いる研
究は、以下により誘発される事象のカスケード様経過を示す：（ａ）内皮構造お
よび内皮下構造の破壊、（ｂ）内弾性板の破裂を伴う内側領域の外傷、（ｃ）コ
ラーゲンまたは組織因子のようなトロンボゲン形成因子の放出、（ｄ）原癌遺伝
子（ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ）の引き続く発現を伴う平滑筋細胞の
伸展、（ｅ）血流の細胞、内皮細胞、およびＳＭＣからの増殖因子の放出、なら
びに（ｆ）ＳＭＣトロンビンレセプターの自己触媒的活性化を伴うトロンビン産
生（Ｂａｕｒｉｅｄｅｌ）。
【０００７】 炎症期間の重複により、顆粒化は、血管形成術の３日後に始まる。プラスミン
およびコラゲナーゼのようなプロテイナーゼは、細胞外マトリックス構造の崩壊
を誘導し、それによって斑形成を調節し、そして内膜内および中膜内の細胞小器
官に富むＳＭＣ表現型となる。顆粒化期間との重複により、細胞外マトリックス
の異なる構成要素の誘導は、おそらくＴＧＦ−βにより媒介されて、血管形成術
の１〜２週間後に起こる（マトリックス形成の相）。平滑筋細胞は、マトリック
スタンパク質（例えば、テネイシン、フィブロネクチン、コラーゲンおよびプロ
テオグリカン）を産生および分泌し、そしてそれによって新内膜斑容量の著しい
増加を誘導する。（Ｂａｕｒｉｅｄｅｌ）。
【０００８】 種々の血管再生デバイス、抗血小板薬、抗血栓薬、および抗炎症剤を用いる再
狭窄予防における臨床試験は、再狭窄の発生における制限された改善を生じた。
血管の傷害部位での、血管内ステント（Ｓａｖａｇｅ、Ｅｉｓｅｎｈｏｗｅｒ、
Ｒｕｂａｒｔｅｌｉ、Ｇｏｔｔｍａｎ）、放射線治療（Ｋｏｈ）、および抗増殖
薬の投与を用いて再狭窄のリスクまたは重症度を改善する試みもまた報告されて
いる。後者のアプローチは、代表的には、血管の閉塞部位に治療剤を誘導するた
め（Ｄｉｃｋ、Ｒｏｙ、Ｄｅｖ、Ｋｉｍｕｒａ、Ａｌｆｋｅ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
１９９７ａ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ １９９７ｂ、Ｂａｒａｔｈ、Ｈｅｒｄｅｇ、
Ｐａｖｌｉｄｅｓ、Ｏｂｅｒｈｏｆｆ、Ｈｏｄｇｋｉｎ、Ｈｏｎｇ、Ｃｏｎｓｉ
ｇｎｙ、Ｍｅｙｅｒ、Ｆｅｒｎａｄｅｚ−Ｏｒｔｉｚ、Ｌａｍｂｅｒｔ、および
Ｗｉｌｅｎｓｋｙ）、またはステントから薬物を放出するため（Ｔｅｏｍｉｎ、
Ｂａｒｔｏｎｅｌｌｉ、Ｒａｍａｎ、Ｇｉｂｓｏｎ）に、バルーンカテーテルを
使用する。
【０００９】 これらの進歩にもかかわらず、再狭窄の発生、および処置に対する応答を予測
できないことは、血管形成術における重篤なリスク要因のままである。従って、
（ｉ）血管形成術の後の再狭窄の発生および重症度の減少において効力を示す処
置方法を提供すること、（ｉｉ）ほとんど副作用を有さないかまたはいくらか副
作用を有し、患者により十分に許容されること、および（ｉｉｉ）種々の治療的
送達方法を用いて行われ得ることが望ましい。
【００１０】 この方法を行うための改善された治療的化合物および組成物、ならびに治療的
化合物の血管の標的部位への送達の有効性をモニターするための、単純で、迅速
な臨床的アッセイを提供することもまた望ましい。
【００１１】 （発明の要旨） １つの局面においては、本発明は、遠位端膨張可能バルーンを有するカテーテ
ルを用いる冠動脈血管形成術により処置されているか、または冠動脈バイパス手
術において形成された血管接合部である、患者の冠状血管の領域における再狭窄
のリスクを減少する方法を包含する。この方法は、血管の傷害部位への直接的局
部的投与により、（ｉ）ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンにわたる領域に
相補的である標的化塩基配列を含む、８〜４０ヌクレオチド、および（ｉｉ）荷
電していない、リン含有サブユニット間結合を有するモルホリノアンチセンス化
合物を、患者における再狭窄のリスクまたは重症度を減少するために有効な量で
、患者に投与する工程を包含する。
【００１２】 投与する工程は、（ａ）血管の領域をアンチセンス化合物を含むレザーバと接
触させ、そしてイオン導入またはエレクトロポレーションにより、この化合物を
このレザーバから血管内に導入する工程；（ｂ）加圧下で、カテーテルバルーン
の表面上に含まれる注射器（ここで、この注射器は血管における中膜を貫通し得
る）を通して、カテーテルから血管の領域に直接この化合物を注射する工程；（
ｃ）捕捉形態のアンチセンス化合物を含む微粒子を、血管の領域に注射するかま
たは配置する工程；（ｄ）血管の領域を、カテーテルバルーンの表面上に含まれ
、かつ拡散可能形態のアンチセンス化合物を含有する、ヒドロゲルコーティング
と接触させる工程；または（ｅ）血管の領域を、拡散可能形態のアンチセンス化
合物を含有する外表面層を有するステントと接触させる工程、により行われる。
【００１３】 このアンチセンス化合物は、好ましくは、図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造か
らなる群から選択されるサブユニット間結合を有し、そして特に図２Ｂ−Ｂで示
されるホスホロジアミデート結合（ここで、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ
である）により例示されるサブユニット間結合を有する。１つの例示的な配列は
、配列番号１により同定される配列である。
【００１４】 投与（ａ）の様式における使用のために、このアンチセンス化合物は、好まし
くはカテーテルにおける２つの膨張したバルーンの間の容量で含まれ、そしてこ
の容量は、この化合物を血管の領域にイオン導入的に押し込むのに効果的なパル
ス電場に供される。
【００１５】 投与（ｂ）の様式における使用のために、カテーテルバルーンは、好ましくは
、遠位端レザーバと連絡する複数の外向きのチャネルを有し、ここで各チャネル
は、１つ以上の注射ポートまたは注射フィンガーを有し、そして注射する工程は
、バルーンが膨張位置にある場合に、アンチセンス化合物の溶液または懸濁液を
、注射ポートを通ってレザーバから押し出す工程を包含する。
【００１６】 投与（ｃ）の様式における使用のために、カテーテルは、好ましくは、遠位端
レザーバを有し、微粒子は粒子懸濁液としてこのレザーバ中に含まれ、そして注
射する工程は、血管の領域と接触しているカテーテル表面を通って、この懸濁液
をカテーテルの外へ押し出す工程を包含する。例示的な粒子としては、捕捉され
たアンチセンス化合物を有する生分解性ポリマー粒子もしくはリポソーム、また
は超音波エネルギーを受けた場合に捕捉された化合物を放出するように設計され
た微小泡が挙げられる。
【００１７】 投与（ｄ）のモードにおける使用のために、ヒドロゲルコーティングは、好ま
しくは、バルーン血管形成術の後に、このコーティング中のアンチセンス化合物
の大部分を、５〜６０分間にわたって放出するように設計される。
【００１８】 様式（ｅ）における使用のために、ステントは生分解性であり得、そしてバル
ーン血管形成術の後に、コーティング中のアンチセンス化合物の大部分を、５〜
６０分間にわたって放出するように設計される。
【００１９】 関連する局面において、本発明は、遠位端膨張可能バルーンを有するカテーテ
ルを用いる冠動脈血管形成術により処置されている、患者の冠状血管の領域にお
ける再狭窄のリスクを減少させる方法を包含する。この方法は、傷害部位への直
接的投与により、（ｉ）配列番号１として同定される塩基配列、および（ｉｉ）
図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート骨格（ここで、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ
、およびＺ＝Ｏである）を有するモルホリノアンチセンス化合物を、患者に投与
する工程を包含する。このアンチセンス化合物は、水性媒体中でのこの化合物の
溶解度を向上させる部分、および／または生理学的なｐＨでこの化合物に電荷を
与える部分を用いて、（例えば、その５’末端で）誘導体化され得る。この化合
物は、好ましくは、バルーン血管形成術の後すぐに、または冠動脈バイパス手術
の間に、約１〜３０ｍｇの間の量で、標的領域へ投与される化合物の最終的な量
が約０．５〜２ｍｇの間になるように、標的血管領域へのこの化合物の直接的な
適用により送達される。
【００２０】 別の局面においては、本発明は、（ｉ）ヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ遺伝子の開
始コドンにわたる領域に相補的である標的化核酸配列を含む、８〜４０ヌクレオ
チド、および（ｉｉ）荷電していない、リン含有サブユニット間結合を有するモ
ルホリノアンチセンス化合物を包含する。このサブユニット間結合は、好ましく
は、特に図２Ｂ−Ｂで示されるホスホロジアミデート結合（ここで、Ｘ＝ＮＨ2
、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである）により例示されるような、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−
Ｅに示される構造からなる群から選択される。１つの例示的な配列は、配列番号
１により同定される配列により与えられる。このアンチセンス化合物は、水性媒
体中でこの化合物の溶解度を向上させる部分、および／または生理学的なｐＨで
この化合物に電荷を与える部分を用いて、（例えば、その５’末端で）誘導体化
され得る。この化合物は、リポソームまたは他の微粒子ビヒクル中に含まれ得る
。
【００２１】 なお別の局面においては、本発明は、アンチセンス化合物を用いて再狭窄のリ
スクを減少させる処置方法において、血管細胞中のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡに到達
し、そして血管細胞中のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡと相互作用するアンチセンス化合
物の能力をアッセイするための方法を包含する。この方法は、（ａ）実質的に荷
電していない骨格、およびヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの開始コドンにわたる配列
を有するモルホリノアンチセンス化合物を患者に投与する工程、（ｂ）この化合
物が投与された後の選択された時間に、被験体から体液のサンプルを採取する工
程、および（ｃ）サンプル中の、このアンチセンス化合物および標的ＲＮＡ領域
から構成されるヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程、を包含す
る。
【００２２】 本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の本発
明の詳細な説明が、添付の図面と共に読まれる場合に、より十分に明らかになる
。
【００２３】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 本明細書中で使用されるような以下の用語は、他に示されない限り、以下の意
味を有する： 「アンチセンス」とは、アンチセンスオリゴマーが、ワトソン−クリック塩基
対形成によって、ＲＮＡにおける標的配列にハイブリダイズして、標的配列内に
、代表的にはｍＲＮＡによる、ＲＮＡ：オリゴマーのヘテロ二重鎖を形成するこ
とを可能にするヌクレオチド塩基およびサブユニット間骨格の配列を有するオリ
ゴマーのことをいう。このオリゴマーは、標的配列に対する相補性またはほぼ相
補性の正確な配列を有し得る。これらのアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの
翻訳をブロック、または阻害し、かつ／あるいはｍＲＮＡのプロセシングを改変
して、ｍＲＮＡのスプライス改変体を生成し得る。例えば、本発明の支持で行わ
れる研究は、配列番号１により示されるアンチセンス化合物が、ｃ−ｍｙｃ ｍ
ＲＮＡプロセシングを妨げ、正常な開始コドンおよび隣接する領域が、そのｍＲ
ＮＡ外にスプライスされた短縮型ｍＲＮＡを導くことを示す。
【００２４】 本明細書中で使用される場合、用語「化合物」、「薬剤」、「オリゴマー」、
および「オリゴヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに
関して、交換可能に使用され得る。本明細書中で使用される場合、「モルホリノ
オリゴマー」は、代表的なポリヌクレオチドへの水素結合を可能にする塩基を支
持する骨格を有するポリマー分子をいい、ここでこのポリマーは、ペントース糖
骨格部分、およびより詳細には、ヌクレオチドおよびヌクレオシドを代表するホ
スホジエステル結合により連結されるリボース骨格を欠如するが、代わりに、環
内（ｒｉｎｇ）窒素を介した連結を有する環内窒素を含む。好ましい「モルフォ
リノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂにおいて示される形態のモルフォリノ
サブユニット構造から構成され、ここで（ｉ）この構造は、リン含有結合（１〜
３原子長）により共に連結され、隣接するサブユニットの５’環外炭素に、１つ
のサブユニットのモルフォリノ窒素を連結し、そして（ｉｉ）ＰiおよびＰjは、
塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効な
、プリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分である。本発明における使用の
ためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的構造としては、図２Ａ−Ａ〜図
２Ｅ−Ｅにおいて示される結合を有する、図１Ａ〜Ｅで示されるモルフォリノサ
ブユニット型が挙げられる。
【００２５】 本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴ
マー）は、骨格がホスホジエステル結合のヌクレアーゼ切断に感受性ではない、
オリゴマー分子である。
【００２６】 本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴ
マーは、実質的に、オリゴマーが３７℃より高い、好ましくは少なくとも５０℃
、および代表的には６０℃〜８０℃またはそれより高いＴｍを有する生理学的条
件下で、標的とハイブリダイズする場合、標的オリゴヌクレオチドと「特異的に
ハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、規定されたイオ
ン強度およびｐＨで、約１０℃および好ましくは、その特異的配列についての熱
融解温度より低い約５０℃であるように選択されたストリジェントなハイブリダ
イゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ［ｍ］
は、５０％の標的配列が相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズする温度で
ある。
【００２７】 ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２本の一本鎖ポリヌクレオチ
ド間で逆平行の構造を生じる場合、互いに「相補的」として記載される。二本鎖
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドと第２
のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間で生じ得る場合、別のポリヌクレオチドと
「相補的」であり得る。相補性（あるポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチド
と相補的である程度）は、一般的に受容されている塩基対規則に従って、互いに
水素結合を形成することが期待される反対の鎖の塩基の比率から定量可能である
。
【００２８】 本明細書中において使用される場合、用語「ｃ−ｍｙｃアンチセンス化合物」
は、相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列またはほぼ相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列（例え
ば、正常なＡＵＧ開始部位を含みかつ補う配列）に対し高い親和性を有する（す
なわち、「特異的にハイブリダイズする」）ヌクレアーゼ耐性アンチセンスモル
フォリノ化合物をいう。
【００２９】 本明細書中で使用される場合、オリゴマーに関する用語「アナログ」は、参照
（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）オリゴマーのアナログに類似の構造的特性および化学的
特性の両方を保有する物質を意味する。
【００３０】 本明細書中で使用される場合、アンチセンスオリゴマーに関する「有効量」は
、バルーン血管形成術後に、再狭窄の危険（発生数）または重篤度（閉塞の量）
を減少するのに有効である、単回投与としてまたは連続投与の１部としてのいず
れかで、哺乳動物の被験体に投与されるアンチセンスオリゴマーの量をいう。
【００３１】 本明細書中で使用される場合、用語「体液」は、被験体から得られる種々のサ
ンプル型（尿、唾液、血漿、血液、髄液、および生物学的起源の他の液体サンプ
ルを含む）を含み、そしてその中に懸濁された細胞または細胞フラグメントある
いは液体培地およびその溶質をいい得る。
【００３２】 （ＩＩ．化合物および組成物） （Ａ．ｃ−ｍｙｃアンチセンス化合物） ｃ−ｍｙｃは、細胞増殖および細胞分化を調節するプロトオンコジーンであり
、アポトーシスに役割を果たすのに加えて、脈管の再構築、平滑筋細胞の増殖お
よび細胞外マトリックス合成を調節するプロセスに関与する。ｃ−ｍｙｃの異常
な発現は、しばしばヒトの癌において観察される。ｃ−ｍｙｃの異常な構成的発
現または過剰発現は、多くのヒトの癌（肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血
病、肺癌などを含む）に関連している。
【００３３】 いくつかのインビトロ研究は、平滑筋細胞の増殖に関与する遺伝子に対して標
的化されるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが、増殖および移動
の両方を阻害することを実証している。ブタ冠状動脈モデル（Ｓｈｉ）における
多孔性バルーンカテーテルを用いたｃ−ｍｙｃに対して標的化されたホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドのインビボでの投与の１つの研究において、および
別の研究において、管腔内に送達されそしてｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２
キナーゼ、ｃｄｃｋ２キナーゼおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対して標的
化されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ラット頸動脈およびブタ冠
状動脈モデル（Ｌｅｅ）の両方で、バルーン損傷（ｉｎｊｕｒｙ）後、新脈管内
膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）形成を阻害した。
【００３４】 しかし、多孔性バルーンカテーテルを用いた、細胞サイクル調節タンパク質に
対して指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの単一管腔内経カテーテル送
達の類似の研究は、新脈管内膜形成または管サイズに影響しなかった（Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ）。ｃ−ｍｙｂおよびｃ−ｍｙｃに対して指向されるホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドを用いたさらなる研究の結果、平滑筋増殖の阻害を示した
。しかし、観察された阻害は明らかにアンチセンス機構を介さないが、インビト
ロの平滑筋細胞の初代培養およびエキソビボの動脈におけるのオリゴヌクレオチ
ド配列における４個の隣接するグアノシン残基の存在に関連した（Ｂｕｒｇｅｓ
ｓ）。
【００３５】 本発明に従って、（ｉ）８〜４０個のヌクレオチド（ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの
翻訳開始コドンを補う領域に相補的である標的塩基配列を含む）および（ｉｉ）
非荷電、リン含有サブユニット間結合を有するモルホリノアンチセンス化合物が
、再狭窄の発症率および重篤度における有意な低減を生じることが発見されてい
る。本発明の支持において行われるインビトロおよび動物モデル研究は、アンチ
センス化合物が（ｉ）アンチセンス化合物に曝露される管の内腔の細胞によって
有効に取り込まれ、（ｉｉ）細胞内で作用して、正確なプロセシング（ｍＲＮＡ
スプラシング）およびプロセスされたｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、そ
して（ｉｉｉ）再狭窄の発症率および重篤度を低減することにおいて、ｃ−ｍｙ
ｃアンチセンス化合物の他の型（例えば、ホスホロチオエートｃ−ｍｙｃアンチ
センス化合物）より有意に有効であることを示す。
【００３６】 モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、上記で引用される米
国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，
０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５
２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号において詳しく述べられる（
これらの全てが参考として本明細書中に援用される）。本発明のアンチセンスオ
リゴマー（化合物）は、上記で引用される特許で示される形態のモルホリノサブ
ユニットから構成され、ここで（ｉ）モルホリノ基は、荷電していないリン含有
結合（１〜３原子長）によって共に連結され、１つのサブユニットのモルホリノ
窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、そして（ｉｉ）モルホ
リノ基に結合された塩基は、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の
塩基に結合するのに有効な、プリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分であ
る。プリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分は、代表的に、アデニン、シ
トシン、グアニン、ウラシルまたはチミジンである。このようなオリゴマーの調
製は、米国特許第５，１８５，４４４号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅ
ｒ、１９９３）において詳細に記載される（これはその全体が参考として本明細
書中により援用される）。参考において示される場合、非イオン結合のいくつか
の型は、モルホリノ骨格を構築するために使用され得る。
【００３７】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な骨格構造としては、図１
Ａ〜Ｅに示されるβ−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリヌクレオチ
ドは、１より多い結合型を含み得ることが理解される。
【００３８】 図１中のサブユニットＡは、１原子のリン含有結合を含み、この結合は、図２
中のＡ−Ａで示される５原子の繰り返し単位骨格を形成し、ここで、モルホリノ
環は、１原子のホスホアミド結合によって結合される。
【００３９】 図１中のサブユニットＢは、図２中のＢ−Ｂで示されるような、６原子の繰り
返し単位骨格のために設計される。構造Ｂにおいて、５’モルホリノの炭素をリ
ン含有基に結合する原子Ｙは、イオウ、窒素、炭素、または、好ましくは酸素で
あり得る。リン含有基からぶら下がっているＸ部分は、以下のうちのいずれかで
あり得る：フッ素；アルキルまたは置換アルキル；アルコキシまたは置換アルコ
キシ；チオアルコキシまたは置換チオアルコキシ；あるいは、置換されていない
窒素、１置換の窒素、または２置換の窒素（環構造を含む）。
【００４０】 図１中のサブユニットＣ〜Ｅは、図２中のＣ−Ｃ〜Ｅ−Ｅとして示されるよう
な、７原子の単位長さ骨格のために設計される。構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、構
造Ｂにおける通りであり、そして部分Ｙは、メチレン、イオウ、または好ましく
は酸素であり得る。構造Ｄにおいて、ＸおよびＹの部分は、構造Ｂにおける通り
である。構造Ｅにおいて、Ｘは、構造Ｂにおける通りであり、そしてＹは、Ｏ、
Ｓ、またはＮＲである。図１Ａ〜Ｅにおいて示される全てのサブユニットにおい
て、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰiまたはＰjは、アデニン、シトシン、グア
ニンまたはウラシルである。
【００４１】 好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂに示される形態の
モルホリノサブユニット構造から構成され、ここで、（ｉ）この構造は、１〜３
個の原子長さで、あるサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニット
の５’環外炭素に連結する、ホスホロジアミデート含有結合によって一緒に結合
され、（ｉｉ）ＰiおよびＰjは、塩基特異的な水素結合によるポリヌクレオチド
中の塩基への結合に有効な、プリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分 であり、そしてＸ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、ならびにＺ＝Ｏである。
【００４２】 上述のように、化合物はｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの開始コドンを補う配列を有し
、このことは、化合物がＡＵＧ ｍＲＮＡ開始部位を含み、そして５’塩基およ
び３’塩基に隣接する、ｃ−ｍｙｃ ＲＮＡの領域に相補的な配列を含むことを
意味する。化合物に対するｍＲＮＡの領域はまた、標的配列として本明細書中で
言及される。アンチセンスが結合するｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡは、予備処理（予備
スプライシング）されたｍＲＮＡであり得、この場合、アンチセンス化合物は、
正確なスプライシングを阻害し、翻訳されたタンパク質の切断型を誘導するよう
に作用し得るか、または処理されたｍＲＮＡに結合し得、翻訳の阻害を誘導する
。
【００４３】 化合物は、実質的に３７℃より高いＴｍを有する生理学的条件下で（例えば、
少なくとも５０℃、そして好ましくは６０℃〜８０℃で）、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮ
Ａにハイブリダイズするように設計される。化合物は、標的配列に必ずしも１０
０％相補的ではないが、標的配列の発現が調節されるように、標的配列に安定に
特異的に結合することは有効である。十分な特異性を伴って結合された、安定で
、有効な結合を可能にする、オリゴマーの適切な長さは、約８〜４０ヌクレオチ
ド塩基単位、そして好ましくは約１２〜２５塩基単位である。ミスマッチは、存
在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央よりも末端の領域に向かってより不安定
化しなくなる。塩基対を標的塩基と縮重させるオリゴマー塩基がまた考慮され、
標的に対する塩基対特異性は維持されると仮定する。化合物は、好ましくは、Ａ
ＵＧ部位に相補的な内部３−塩基トリプレット、および開始部位に対して５’お
よび３’の１個以上の塩基に相補的な塩基を含む。１つの好ましい化合物配列は
、配列番号１として同定された２０マーであり、塩基配列：５’−ＡＣＧ ＴＴ
ＧＡＧＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’を有し、ここで、この配列中の
ＣＡＴトリプレットはＡＵＧ開始部位に結合し、ＣＡＴ配列に対して３’の６個
の塩基は標的の上流の（５’）方向に伸長し、そしてＣＡＴ配列に対して５’の
１１個の塩基は標的の下流に伸長する。この化合物は、自己アニーリング領域を
有さないことによって、溶解度を高めた。アンチセンス化合物の溶解度、および
溶液中での保存に際する沈澱に抗するこの化合物の能力は、オリゴマーを可溶化
部分（例えば、親水性オリゴマー）あるいは荷電部分（荷電アミノ酸または荷電
有機酸）と誘導体化することによってさらに高められる。この部分は、周知の誘
導体化法によって、アンチセンス化合物（例えば、その５’末端）に化学的に付
着され得る。１つの好ましい部分は、カルボネート結合を通してアンチセンス化
合物の５’末端に共有結合的に結合された、所定の長さのオリゴエチレングリコ
ール部分（例えば、トリエチレングリコール）であり、ピペラジン結合基を介し
てトリエチレングリコールとカルバミル酸塩結合を形成する。ここで第２ピペラ
ジンの窒素は、このアンチセンスの５’末端ホスホロジアミデート結合に結合さ
れる。あるいは、またはさらに、この化合物は、少数の荷電した骨格結合の１つ
（例えば、ホスホジエステル結合、好ましくは、化合物の一方の末端に近い結合
）を含むように設計され得る。付加された部分は、好ましくは、水溶性媒質中で
、少なくとも約３０ｍｇｓ／ｍｌまで、好ましくは少なくとも５０ｍｇｓ／ｍｌ
まで化合物の溶解性を高めるために有効である。
【００４４】 特定のｃ−ｍｙｃアンチセンス配列の有効性は、公知のスクリーニング方法に
よって決定され得る。例えば、オリゴマーは、標的ＲＮＡを発現する細胞培養物
を用いてインキュベートされ、そしてヘテロ二重鎖の存在または非存在が、以下
に述べるような技術によって、すなわち、標準的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡま
たはウエスタンブロッティング）によって決定されるようなコードされた全長タ
ンパク質の存在または非存在、あるいは活性タンパク質の存在または非存在をモ
ニターすることによって、決定される。
【００４５】 別の実施形態において、アンチセンス化合物は、再狭窄処置における使用のた
めの粒子組成物の一部を形成する。１つのこのような粒子は、トラップされたア
ンチセンス化合物を含む、生分解性の粒子（例えば、ポリ乳酸塩またはポリグリ
コール酸塩の粒子）である。この粒子は、好ましくは、１〜５ミクロンの範囲で
あり、そして、以下に記載するような、血管形成の脈管部位への直接的な粒子送
達（バルーンから管壁に対する圧力によって壁に押し入れられることによるか、
またはステントのような粒子キャリアからの放出によるかのいずれか）による送
達に有用である。
【００４６】 あるいは、この粒子は、トラップされた形態で化合物を含む微小泡であり得る
。アンチセンスキャリアのような適切な微小泡の調製は、例えば、上記に引用さ
れるＰｏｒｔｅｒらによって記載される。この粒子は、脈管の部位へ直接的に、
すなわち、管壁を粒子の懸濁液と直接的に接触させることによって、送達され得
、脈管の領域が超音波エネルギーに曝された場合に、粒子からの化合物の放出を
伴う。
【００４７】 さらに別の実施形態において、この粒子は、トラップされたアンチセンス化合
物を含むリポソームである。このリポソーム粒子は、管の部位に直接的に適用さ
れるので、このリポソームは、長い循環時間を達成するために必要とされる表面
修飾を伴わない従来のリポソームであり得る。
【００４８】 （ＩＩＩ．再狭窄を処置する方法） 再狭窄とは、脈管介入（例えば、ステントの挿入を伴うかまたは伴わない、冠
状動脈のバルーン血管形成術）後の脈管内腔の再狭窄をいう。それは、臨床では
、処置後の、最初の内腔径増加の５０％より多い減少として定義される。再狭窄
は、血管形成術によって処置される障害の約３０％〜６０％、およびステントを
用いて処置される障害の約２０％において、処置後３〜６ヶ月以内に生じると考
えられる（例えば、Ｄｅｖを参照のこと）。
【００４９】 「再狭窄」はまた、冠状動脈バイパス手術（詰まった動脈の周囲で、血液を別
経路で送る（すなわち「バイパスする」）ために、そして血液および酸素の心臓
への供給を改良するために、心臓手術がなされる）の後に生じ得る。このような
場合において、再狭窄は、移植された血管セグメントにおいて、そして特に弛緩
された血管の接合部分で生じ得る。
【００５０】 本発明は、特にバルーン血管形成術後の、または他の脈管障害に応じた（例え
ば、動脈バイパス手術後の）、危険（発生率）または重篤度（狭窄の程度）を減
少させるための方法に関する。その方法は、患者に、上記のアンチセンス化合物
または組成物を、ある量で、そして障害の脈管部位での化合物の局所的な直接投
与を介して、再狭窄の危険および／または重篤度を減少させるように投与する工
程を包含する。一般に、実質的に完全な組織摂取を想定して、脈管部位に送達さ
れる化合物の量は、約０．５〜２ｍｇの間のアンチセンス化合物が好ましい。従
って、脈管組織への摂取が、送達される量の１０％である場合、送達される量は
、好ましくは５〜２０ｍｇの間、好ましくは総容量で０．２〜１ｍｌの間である
。
【００５１】 この方法の１つの局面に従って、以下に議論される投与の形式は、より重要な
特色：（ｉ）高い細胞摂取率を有するアンチセンス化合物の使用、（ｉｉ）アン
チセンス化合物の、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡプロセシングおよびｍＲＮＡ翻訳を阻
害する能力、ならびに（ｉｉｉ）脈管障害部位で化合物の高い局在化濃度を達成
するために有効な投与の形式による化合物の局所的送達、のうちの１つを利用す
る。最初の２つの特色は、上で議論された。ここで第３の特色を達成するために
有効な投与の形式が、詳述される。
【００５２】 （Ａ．イオン導入） １つの実施形態において、本発明は、処置される領域をアンチセンス化合物を
含むレサーバと接触させ、そして化合物をイオン導入によってレサーバから脈管
へ導入する、アンチセンス化合物の送達を提供する。
【００５３】 本明細書中に記載されるアンチセンス化合物は、荷電していない。最適なイオ
ン導入は、投与される因子が全体的な実効電荷を有することが必要である。アン
チセンス化合物は、生理学的ｐＨまたは生理学的に近いｐＨで荷電される基を、
少なくとも与えるために、上記のように改変され得る。あるいは、パルス電場は
、電気泳動効果（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ）を介した荷電
していないアンチセンス化合物の細胞への侵入を容易にすることに効果的であり
得る。
【００５４】 例えば、バルーンカテーテルデバイスによって脈管部位におけるイオン導入薬
物送達を実行する際に使用するデバイスが、記載されている。一般的に、そのよ
うなデバイスは、カテーテルの遠位先端（ｄｉｓｔａｌ−ｔｉｐ）バルーンの外
側の殻に含まれる化合物溶液のためのレサーバ、レサーバから脈管壁への化合物
の通過を可能にする外側のバルーン膜、および内部レサーバと通じる電極を含む
。第二の対極は、体の上に配置され、そしてパルス電圧は、荷電された化合物を
脈管部位へ引き寄せるように操作された場を作製するために、２つの電極にわた
って印加される。デバイス、および電気パルス電圧および時間は、当該分野に開
示のこれらに従う：例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｘ−Ｏｒｔｉｚ，Ｄｅｖ，Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎならびに米国特許第５，５９３，９７４号、同第５，６２８，７３０
号および同第５，４２５，７０３号。
【００５５】 あるいは、荷電していない化合物のその部位への拡散または注射のために設計
され、パルスフィールドに誘導されるエレクトロポレーションによって容易にさ
れる細胞取り込みを伴う、パルスフィールドデバイスもまた意図される。
【００５６】 両方の方法は、化合物の脈管組織への導入の際に高い液体圧力の必要がない、
アンチセンス化合物の脈管壁細胞への高効率な送達の利点を提供する。脈管部位
への送達の所望される１ｍｇの用量および２５〜８０％の間の組織取り込みの効
率を仮定すると、送達のためのレサーバ中に含まれる化合物の総量は、約１．２
５と４ｍｇの間であり、好ましくは約２５〜５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度である。
【００５７】 （Ｂ．ニップルバルーンカテーテルまたは浸潤物） 第二の一般的な化合物送達アプローチにおいて、化合物は脈管、すなわち、脈
管表面の下に、記載されたような（例えば、Ｒｏｙ，ＰａｖｌｉｄｅｓおよびＢ
ａｒａｔｈ）注射のバルーンカテーテルによって注射される。「Ｉｎｆｉｌｔｒ
ａｔｏｒ Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ Ｂａｌｌｏｏｎ Ｃａｔｈｅｔｅｒ」また
は「ＩＡＢＣ」として商業的に公知のカテーテルは、１つはバルーンを膨張させ
るため、中心の１つはガイドワイヤーのため、そして３つ目は薬物送達のための
、３つの内腔を有するバルーンカテーテルである。バルーンの表面上には、いく
つかの長手のストリップまたはチャネルが存在し、各々は、複数の注射針（例え
ば、６つの針）を有し、これらの針は、膨張の際に立ち上がって、チャネル表面
上に突出し、そして針は、薬物送達内腔に連結されている。バルーンが膨張した
場合、針は病巣を貫入し、脈管壁の中膜への薬物送達を可能にする。
【００５８】 本発明において、レサーバは、好ましくは約２５〜５０ｍｇ／ｍｌの化合物濃
度を含むアンチセンス組成物で満たされている。組織への取り込みを約１５〜５
０％の間と仮定すると、注射された物質の量は、約０．０４ｍｌ〜０．２５ｍｌ
の範囲である。投与された相対的に少ない量の化合物は、圧力下における液体注
射による、損傷部位へのさらなる損傷のリスクを減少した。
【００５９】 この投与型は、化合物の脈管組織への高効率の取り込み（２０％以上）の利点
を提供する。
【００６０】 （Ｃ．ヒドロゲルコーティング） 第３の送達アプローチにおいて、化合物は、バルーンの外部表面（例えば、血
管形成術に使用されるバルーンカテーテル上）をコーティングする拡散可能な媒
体中（代表的にはヒドロゲル）に、包埋されるかまたは溶解される。そのような
ヒドロゲルコーティングをカテーテルバルーン上に作製しかつ使用する方法が、
記載された（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ，Ｄｉｃｋ）。
【００６１】 ヒドロゲルコーティングは、アンチセンス化合物を好ましい濃度の約２５〜５
０ｍｇ／ｍｌで含み、そして選択された用量の化合物を約５〜６０分の期間で放
出するように処方される。ヒドロゲルの全量は、約５〜４０％の組織取り込み効
率を適用するために好ましくは約０．１〜０．５ｍｌの間であり、全送達を約２
．５〜２５ｍｇを与える。ヒドロゲル拡散方法は、上記のようなイオン導入また
はエレクトロポレーションと組み合わされて、ゲルから組織への化合物の取り込
みを増強し得る。この場合、ゲル中の物質の量は、取り込み効率の増強を考慮に
入れ、実質的に減少し得る。
【００６２】 この方法は、化合物送達期間の間の、化合物レサーバと脈管壁との間の密接な
接触を保持する利点を有し、相対的に遅い速度の薬物放出および細胞による取り
込みを与え、そして増大した注射の重圧を回避する。
【００６３】 （Ｄ．ステント） このアプローチは、化合物が、脈管内のステント上に含まれるコーティング中
に拡散可能形態で含まれること以外は、上記のヒドロゲル方法に類似する。ステ
ントは、バルーン血管形成の時に脈管部位に配置され得るか、または冠状動脈バ
イパス手術の間にその部位へ配置され得る。生分解において化合物を放出するか
または拡散可能形態で化合物を含有するコーティングを含む、生分解性のステン
トを含む、ステントの設計および材料は、公知である（Ｒａｍａｎおよび米国特
許第５，９９７，４６８号および同第５，８７１，５３５号）。
【００６４】 上記のようにステントまたはステントのコーティングは、約０．５〜２ｍｇ用
量を５〜６０分間かけて、５〜２０％の間の所望される取り込み効率で組織へ送
達するに十分な量の薬物を含む。
【００６５】 移植されたステントは、本発明の実施において２つの利点を提供する。第一に
、ステントは、他の方法の場合のように、短期の用量を可能にし、そしてまた延
長した期間（例えば、１〜１４日）にわたる低いレベルでの連続した用量を可能
にし、再狭窄の初期事象を阻害する。第二に、ステントそれ自身が、報告された
ように、再狭窄のリスクの減少に効果的であり得る。
【００６６】 （Ｅ．微粒子） 放出可能形態でアンチセンス化合物を含む微粒子（例えば、ポリスチレン微粒
子（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、生分解性粒子、
リポソームまたは微小泡）は、化合物の脈管組織への直接な送達に使用され得る
。
【００６７】 この粒子は、組織の取り込み効率に依存する全用量で、好ましくは０．５〜２
ｍｇの全用量を含むように調製される。粒子が組織に注射される場合、粒子の取
り込みは高く、例えば、３０〜７０％以上である。粒子が脈管壁と単に接触させ
られた場合、化合物の取り込みはより低くなる。
【００６８】 粒子を送達するための方法としては、粒子懸濁液の注射、または例えば、粒子
の外部コーティングを含むバルーン中（例えば、ヒドロゲル媒体中）のバルーン
圧力によってか、もしくはステント中に放出可能形態の粒子を包埋することによ
る、脈管壁に対して粒子を物理的に圧迫することが挙げられる。粒子が、微小泡
である場合、この方法はさらに、投与された粒子を超音波エネルギーへ曝露し、
粒子部位で小泡を破裂させかつ小泡を放出する工程を含む。化合物の粒子送達は
、特に粒子が注射された場合に高い取り込みの利点を有し、そして、デポット放
出（ｄｅｐｏｔ−ｒｅｌｅａｓｅ）粒子（例えば、生分解性粒子）からの高い、
短期間の薬物放出ならびに拡大された放出の両方に関する潜在力を有する。粒子
はまた、化合物の取り込み効率を増強させるために、結合剤（例えば、増殖因子
または初期の細胞事象の間に内皮細胞によって積極的に合成されて再狭窄を引き
起こす他のタンパク質に対して特異的な抗体（Ｂａｕｒｉｅｄｅｌを参照のこと
））でコーティングされ得る。最後に、アンチセンス化合物は、微小泡に関する
場合のように、所望の時間において粒子から選択的に放出され得る。
【００６９】 （ＩＶ．再狭窄の方法） 関連した局面において、本発明は、患者の冠状脈管の領域における再狭窄のリ
スクの処置を含む。この方法は、損傷の領域への直接的な局所送達によって、（
ｉ）配列番号１として同定される塩基配列、（ｉｉ）図２Ｂ−Ｂに示されるホス
ホロジアミデート骨格（ここで、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ）、ならび
に（ｉｉｉ）化合物の溶解度を、好ましくは、水性媒体中で２５〜５０ｍｇ／ｍ
ｌの間かまたはそれ以上の溶解度まで増強する部分を有するモルホリノアンチセ
ンス化合物を、患者に投与することによって実行される。投与は、脈管との直接
的な接触によってであり、上記の方法、または薬物−溶液レサーバを有するＷｉ
ｌｉｎｓｋｙ型のバルーンカテーテルを介した物質の直接的な注射、および脈管
壁に対してバルーン中の孔を介して溶液を注射する手段のような代替方法を用い
る。注射された物質の量は、好ましくは組織による物質の取り込み用量が、０．
５〜２ｍｇの間のアンチセンス化合物を与えるように設計される。
【００７０】 化合物の溶解度を増加させる部分は、アンチセンス化合物へ結合され得、かつ
標的配列への化合物の結合を阻害しない、任意の生体適合性親水性部分または荷
電部分であり得る。１つの好ましい部分は、上記のカルバメート−ピペリジン結
合を介してアンチセンス化合物に誘導体化されたトリエチレングリコール部分で
ある。
【００７１】 （Ｖ．アンチセンス送達および取り込みの効果をアッセイするための方法） ＰＴＣＡの成功の標準的な指標は、影響を受けた脈管の最小内腔直径（すなわ
ち、再閉塞の程度）を決定するための１つ以上の追従アルゴリズムである。本発
明の方法の成功を決定する際、追従アルゴリズムは、ｃ−ｍｙｃアンチセンス含
有カテーテルの埋没に続いて、１回以上完全にされ得る。治療的介入の成功の指
標には、低いパーセンテージの再閉塞および／または再狭窄の発生ならびに再閉
塞および／または再狭窄の発生までの延長された時間が挙げられる。
【００７２】 本発明の別の局面に従って、脈管部位へのアンチセンスの投与の後に、標的細
胞におけるｃ−ｍｙｃアンチセンス化合物の存在を確認するため、そして種々の
化合物投与の方法によって達成された化合物の取り込みレベルを比較するための
迅速で容易に実施される方法が提供され、効果的な再狭窄処置のための条件およ
び投薬量が最適化される。
【００７３】 この方法は、上記に引用された「Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＲＮＡ」の米国仮出願６０／１１７，８４６号に
開示された、インビボで投与された場合、本明細書中に開示の型のモルホリノア
ンチセンス化合物が、アンチセンス化合物およびそのＲＮＡ相補体から構成され
るヘテロ二量体形態における被験体から受けた尿中に検出され得る、という発見
に基づく。このデータは、一連の事象が、以下を含むことを示す：（ｉ）被験体
の細胞によるアンチセンス化合物の取り込み、（ｉｉ）細胞内での化合物の標的
ｍＲＮＡとの結合、（ｉｉｉ）アンチセンス／標的複合体の一本鎖部分の細胞内
ヌクレアーゼ切断、アンチセンスおよびそのｍＲＮＡ相補体から構成されるヘテ
ロ二本鎖の解離、（ｉｖ）おそらく外来分子として認識される、細胞によるヘテ
ロ二本鎖の分泌、ならびに（ｖ）血液そして最終的には尿へのヘテロ二本鎖の出
現。
【００７４】 本発明の場合、この一連の事象は、上記の詳述の任意の方法に従って、ｃ−ｍ
ｙｃアンチセンスの投与を可能にし、そして、標的細胞への化合物の取り込みの
追跡を可能にし、これは、尿または他の体液（例えば、血液または血清）におけ
るｃ−ｍｙｃアンチセンスｍＲＮＡの存在および／または量をモニターすること
による。
【００７５】 本方法の実施において、本発明のアンチセンス化合物は、選択された用量、そ
して選択された送達の型（上記の任意のものを含む）によって、患者または動物
モデルに投与される。その後、そして投与後の選択された時間（例えば、投与後
の４、１２、および２４時間）において、尿をヘテロ二量体の出現および／また
は量に関してモニターし、選択された用量および投与方法における化合物の取り
込み効果を決定する。
【００７６】 尿の検出に使用される１つの例示的なアッセイフォーマットにおいて、アンチ
センス／：ＲＮＡヘテロ二量体を含むサンプルを、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二
量体を特異的に結合するかまたは改変する化合物（例えば、特定のヘテロ二量体
に対して特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ））と反応させ、続いて、改変さ
れたかまたは結合体化されたオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二量体を検出する。
【００７７】 別の例示的なアッセイフォーマットにおいて、アンチセンスオリゴマーは、被
験体に投与する前にアンチセンスオリゴマーをレポーター分子と結合体化させる
ことによって改変され、ヘテロ二量体の非複合体レポーター標識アンチセンスオ
リゴマーからの分離、そしてヘテロ二量体関連レポーター分子の検出が続く。い
くつかの場合において、そのような分離は、クロマトグラフィーまたは電気泳動
を介することによって実行され得る。
【００７８】 例示的な検出方法は、分光光度検出（例えば、蛍光検出器を用いて）または抗
体を用いた検出（例えば、ＦＡＣＳ分析）を含む。そのような方法は、分析の効
率を上げるために分離方法と組み合わされ得る（例えば、蛍光検出と同時のクロ
マトグラフィー分離、あるいはゲルの染色、蛍光検出またはオートラジオグラフ
ィー検出による検出を用いた電気泳動分離）。そのような技術は、当業者に公知
であり、そして所定のアンチセンスオリゴマーおよび標的ＲＮＡ配列に容易に適
用可能である。
【００７９】 核酸標識のための当該分野で公知の任意の蛍光分子は、本発明の方法で使用さ
れ得、例えば、以下が挙げられる：フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体
（例えば、カルボキシフルオレセイン、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２
−イル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡＦ））；エオシン；ローダミン（例
えば、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄおよびテトラメチルローダミン）；シアニン色素（例
えば、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ならびに米国特許第４，９
５７，８７０号および同第４，８８８，８６７号に記載の関連する色素）；ピレ
ン；ポルフィリン色素（例えば、Ｌａ ＪｏｌｌａＢｌｕｅ）。蛍光標識は、そ
の蛍光寿命が長さにおいて、蛍光色素が全ての影響されるタンブリング時間に結
合するオリゴヌクレオチドの温度、粘性、および大きさを考慮に入れて、測定さ
れる相関時間に匹敵するように選択されなければならない。蛍光標識は、標識か
らの蛍光発光もしくはプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションのいずれ
も阻害しないようにシグナルプライマーに共有結合されるか、または結合体化さ
れる。（また、米国特許第５，６１４，６１７号および同第５，６５２，０９９
号を参照のこと。） 別の場合において、アンチセンスオリゴマーは、反応性アミノ基に結合した５
’末端の配列とともに所定の標的に相補的な配列を有して合成され得る（Ｓｍｉ
ｔｈ，Ｌ．Ｍ．らによって記載されるように（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
３（７）：２３９９（１９８５）））。そのような場合、ビオチン、ペプチドま
たは酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）が、５’アミノ基に付着され得
る。（また、米国特許第５，７８３，３９１号を参照のこと。） さらに別の実施形態において、ヘテロ二量体は、例えば、体液サンプルからの
単離の後に、質量分析によって検出され得る。本発明を支持する実施された研究
において、ＲＮＡ：モルホリノオリゴマーのヘテロ二量体は、２つの異なるＭＷ
分画（２つのヘテロ二量体鎖）に容易に分解されることが質量分析によって見出
された。従って、本方法は、２つの成分鎖の観点から、ヘテロ二量体の陽性の識
別を提供する。
【００８０】 上記から理解され得るように、本方法は、種々の型の効果、投与の効果および
最適な用量（代表的には、尿における最大または最大に近いヘテロ二量体のレベ
ルを導く用量）を容易に評価することを可能にする。これは、医師が処置方法の
効果をモニターすることを可能にし、そしてこれにより、アンチセンス化合物が
脈管組織によって取り込まれたことを医師が確認する。例えば、この試験が２４
時間後に低いレベルのヘテロ二量体を示した場合、医師は、その部位を再処置す
ることが必要であるとみなし得る。
【００８１】 以下の実施例は、本アッセイ方法の基本的な特徴を示す。
【００８２】 （実施例１） （アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二本鎖を用いたインビボ研究） フルオレセイン結合体化オリゴマーを検出可能な装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ６７２ ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ）を用いて実
施した較正研究を用いて、種々の長さのフルオレセイン結合体化オリゴマー（１
５マー、２０マー、２４マーおよび３８マーリボザイム）の移動速度を決定した
。濃度は、ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ中で評価した。
【００８３】 ラットに、ラットチトクロムＰ−４５０３Ａ２に対するアンチセンスであるカ
ルボキシフルオレセイン結合体化ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（
ＰＭＯ）を注射した。
【００８４】 ＰＭＯ投与後種々の時間で回収した血液から調製した血漿サンプルのクロマト
グラムは、以下のことを示した。注射後１時間のラットから調製した血漿サンプ
ルは、２７０分および３４０分（別々に移動する２つの可能なカルボキシフルオ
レセイン結合に起因する２つのピーク）で移動された蛍光化合物を含んでいた。
注射後２４時間のラットから調製した血漿サンプルは、約７５分および約８０分
で移動された蛍光化合物を含んでいた。質量分析のデータ（示さず）により、よ
り短い移動時間は、ＰＭＯの分解に起因するものではないことを確認し、そして
ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二本鎖が、その時間にわたって形成されることが示された
。
【００８５】 図３は、Ｐ４５０アンチセンスのＰＭＯの投与後の種々の時間（分）において
採取されたサンプルを表し、そしてそのような投与に続くラットの血漿において
、ＰＭＯモノマー（白四角）の消滅およびこれに対応するＲＮＡ：ＰＭＯヘテロ
二量体（黒丸）の出現を示す。血漿における有意な量の二本鎖の出現は、非二本
鎖ＰＭＯの大多数が血漿から離れるまで生じない（一般的に、「分布期」として
呼ばれる）。ＰＭＯモノマーが、相補体ｍＲＮＡ転写物が局在する被験体の組織
中に分布する後まで、ＰＭＯヘテロ二本鎖は、血漿中に蓄積しない。荷電された
ＲＮＡ：ＰＭＯ二本鎖が、おそらくこれらの組織中で形成され、そして細胞から
流出し、そして血漿に戻る。この全てのプロセスは、数時間を必要とする。
【００８６】 ｐ４５０アンチセンスＰＭＯの投与後、腎臓および肝臓の両方におけるフルオ
レセインを検出した。腎臓組織サンプルのクロマトグラムは、非二本鎖ＰＭＯと
一致する３５０分でのバンドおよびＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二本鎖と一致する８０
分でのさらなるバントを示し、これは、腎臓の間隙空間中および細胞内に存在し
得る二本鎖ＰＭＯおよび親（ｐａｒｅｎｔ）ＰＭＯの両方を示す。肝臓組織サン
プルは、本質的に非二本鎖ＰＭＯを示さず、そして有意により多くのＰＭＯ：Ｒ
ＮＡヘテロ二本鎖を示す。これらの結果は、Ｐ４５０ ｍＲＮＡ転写物のレベル
が、肝臓よりも腎臓においてより低いという観察と一致する。
【００８７】 非二本鎖アンチセンスＰＭＯオリゴマーおよびアンチセンスＰＭＯオリゴマー
：ＲＮＡヘテロ二本鎖の尿のクリアランスのタイムコースを反映した研究により
、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二本鎖の形成および組織から血漿への流出、続くそれら
の最終的な尿での出現には数時間必要であるということが示される。
【００８８】 本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載してきたが、種々の改変
および変化が、本発明から離れることなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ポリマーを形成するのに適切な、５個の原子（Ａ）連結基、６個の原
子（Ｂ）連結基および７個の原子（Ｃ〜Ｅ）連結基を有するいくつかの好ましい
サブユニットを示す。
【図２】 図２Ａ−Ａ〜図２Ｅ−Ｅは、例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの繰り返
しサブユニットセグメント（Ａ−Ａ〜Ｅ−Ｅと命名され、それぞれ図１のサブユ
ニットＡ〜Ｅを用いて構築される）を示す。
【図３】 図３は、Ｐ４５０アンチセンスＰＭＯを投与されたラットの血漿における、Ｐ
ＭＯモノマーの消失の動態学的提示およびＲＮＡ：ＰＭＯヘテロダイマーの出現
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｎ 1/30 Ａ６１Ｎ 1/30 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 9/14 Ａ６１Ｐ 9/14 Ｇ０１Ｎ 33/493 Ｇ０１Ｎ 33/493 Ａ 33/53 33/53 Ｍ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ (72)発明者 ウェラー， ドワイト ディー． アメリカ合衆国 オレゴン 97330， コ ーバリス， エヌ．ダブリュー． エルム ウッド 3323 Ｆターム(参考） 2G045 AA15 AA35 CB03 DA14 FB03 FB12 4B063 QA01 QA08 QQ03 QQ41 QQ52 QR66 QX02 4C053 HH01 4C076 AA11 AA19 BB12 CC26 FF68 4C084 AA13 MA16 MA24 MA65 NA14 ZA362 ZB212 4C086 AA02 EA16 MA01 MA04 MA16 MA24 MA65 ZA36 ZB21

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遠位端膨張可能バルーンを有するカテーテルを用いる冠動脈
    血管形成術により処置されているか、冠動脈バイパス手術において形成された接
    合部である、患者の冠状血管の領域における再狭窄のリスクを減少する方法であ
    って、該方法は、以下の工程： （ｉ）ヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ遺伝子の開始コドンにわたる領域と相補的な
    標的化塩基配列を含む、８〜４０ヌクレオチド、および（ｉｉ）荷電していない
    、リン含有サブユニット間結合を有するモルホリノアンチセンス化合物を、該患
    者における再狭窄のリスクを減少させるために有効な量で、血管の傷害部位への
    直接的な局所的投与により、該患者に投与する工程であって、ここで該投与する
    工程は、以下の工程： （ａ）該血管の該領域を、該アンチセンス化合物を含有するレザーバと接触さ
    せ、そして該化合物を、イオン導入またはエレクトロポレーションにより、該レ
    ザーバから該血管へ導入する工程； （ｂ）加圧下で、カテーテルバルーンの表面上に含まれる注射器を通して、該
    化合物を、該カテーテルから直接的に該血管の該領域に注射する工程であって、
    ここで該注射器は、該血管中の中膜を貫通し得る、工程； （ｃ）捕捉形態の該アンチセンス化合物を含有する微粒子を、該血管の該領域
    に注射するか、または該血管の該領域と接触させる工程； （ｄ）該血管の該領域を、該カテーテルバルーンの表面上に含まれ、かつ拡散
    可能形態の該アンチセンス化合物を含有するヒドロゲルコーティングと接触させ
    る工程；ならびに （ｅ）該血管の該領域を、拡散可能形態の該アンチセンス化合物を含有する外
    表面層を有するステントと接触させる工程、 からなる群から選択される投与の様式により行われる、工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記サブユニット間結合が、図２ＡＡ〜図２ＥＥに示される
    構造からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記結合が、図２Ｂ−Ｂで示され、ここでＸ＝ＮＨ2、Ｙ＝
    Ｏ、およびＺ＝Ｏであるホスホロジアミデート結合である、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 前記アンチセンス化合物が、配列番号１により同定される配
    列を有する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 投与されるアンチセンス化合物の前記量が、約０．５ｍｇと
    ２０ｍｇとの間である、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 投与（ａ）の様式における使用のための、請求項１に記載の
    方法であって、ここで前記アンチセンス化合物は、前記カテーテルにおける２つ
    の膨張したバルーンの間の容量で含まれ、該化合物は実効電荷を含み、そして該
    容量は、該化合物を前記血管の領域にイオン導入によって押し込むために有効な
    パルス電場に供される、方法。
  7. 【請求項７】 投与（ａ）の様式における使用のための、請求項１に記載の
    方法であって、ここで前記アンチセンス化合物は、前記カテーテルにおける２つ
    の膨張したバルーンの間の容量で含まれ、そして該容量は、エレクトロポレーシ
    ョンによる血管領域細胞への化合物の取り込みを容易にするために有効なパルス
    電場に供される、方法。
  8. 【請求項８】 投与（ｂ）の様式における使用のための、請求項１に記載の
    方法であって、ここで、前記カテーテルバルーンは、遠位先端レザーバと連絡す
    る複数の外向きのチャネルを有し、各チャネルは、１つ以上の注入ポートを有し
    、そして該注射する工程は、該バルーンが膨張位置にある場合に、該注入ポート
    を通して、該レザーバから前記アンチセンス化合物の溶液または懸濁液を押し込
    む工程を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 投与（ｃ）の様式における使用のための、請求項１に記載の
    方法であって、ここで前記カテーテルは、遠位端レザーバを有し、前記微粒子は
    、粒子懸濁液として該レザーバ中に含まれ、そして前記注射する工程は、前記血
    管の領域と接触しているカテーテル表面を通して、該懸濁液を該カテーテルの外
    へ押し込む工程を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、ここで前記粒子は、捕捉
    形態の前記アンチセンス化合物を含有する微小泡であり、そして該方法は、さら
    に、該粒子の注射の後に、前記血管領域を超音波エネルギーに曝す工程を包含す
    る、方法。
  11. 【請求項１１】 投与（ｄ）の様式における使用のための、請求項１に記載
    の方法であって、ここで前記コーティングが、バルーン血管形成術の後に、５〜
    ６０分間にわたって、該コーティング中の前記アンチセンス化合物の大部分を放
    出するように設計されている、方法。
  12. 【請求項１２】 投与（ｅ）の様式における使用のための、請求項１に記載
    の方法であって、ここで前記ステントが生分解性であり、かつバルーン血管形成
    術の後に、５〜６０分間にわたって、前記コーティング中の前記アンチセンス化
    合物の大部分を放出するように設計されている、方法。
  13. 【請求項１３】 患者の冠状血管の領域における再狭窄のリスクを処置する
    方法であって、該方法は以下の工程： （ｉ）配列番号１として同定される塩基配列、および（ｉｉ）図２Ｂ−Ｂに示
    されるホスホロジアミデート骨格であって、ここでＸ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、および
    Ｚ＝Ｏである、骨格を有するモルホリノアンチセンス化合物を、傷害の領域への
    直接的な局所的送達により、該患者に投与する工程であって、ここで該投与する
    工程は、約０．５〜２ｍｇの間のアンチセンス化合物を組織血管領域に送達する
    ために有効な量で、該化合物を該血管領域との直接接触させて配置する工程によ
    る、工程、 を包含する、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、ここで前記化合物は、
    水性媒体中の該化合物の溶解度を向上させる部分で誘導体化され、そして該化合
    物は、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌの前記アンチセンス化合物を含有する溶液よ
    り投与される、方法。
  15. 【請求項１５】 前記部分が、前記化合物の５’末端に結合したトリエチレ
    ングリコールである、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 （ｉ）ヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ遺伝子の開始コドンにわ
    たる領域と相補的な標的化核酸配列を含む、８〜４０ヌクレオチド、および（ｉ
    ｉ）荷電していない、リン含有サブユニット間結合を有する、モルホリノアンチ
    センス化合物。
  17. 【請求項１７】 前記サブユニット間結合が、図２Ａ−Ａ〜図２Ｅ−Ｅに示
    される構造からなる群から選択される、請求項１６に記載の化合物。
  18. 【請求項１８】 前記結合が、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート
    結合であって、ここでＸ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである、請求項１７に
    記載の化合物。
  19. 【請求項１９】 前記アンチセンス化合物が、配列番号１により同定される
    配列を有する、請求項１６に記載の化合物。
  20. 【請求項２０】 前記化合物が、水性媒体中の該化合物の溶解度を、少なく
    とも約３０ｍｇ／ｍｌの前記アンチセンス化合物のレベルまで向上させる部分で
    誘導体化されている、請求項１９に記載の化合物。
  21. 【請求項２１】 前記部分が、前記化合物の５’末端に結合しているトリエ
    チレングリコールである、請求項２０に記載の化合物。
  22. 【請求項２２】 リポソームまたは生分解性微粒子中に捕捉されている、請
    求項１６に記載の化合物。
  23. 【請求項２３】 遠位端膨張可能バルーンを有するカテーテルを用いる冠動
    脈血管形成術により処置されている、患者の冠状血管の領域における再狭窄のリ
    スクを、標的ヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ配列に対して指向されるアンチセンス化
    合物を、該血管の領域に投与する工程により減少させるための方法において、血
    管細胞中のｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡに到達し、かつ血管細胞中のｃ−ｍｙｃ ｍＲ
    ＮＡと相互作用する、該アンチセンス化合物の能力をアッセイするための方法で
    あって、該方法は以下の工程： 実質的に荷電していない骨格、およびヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子の開始コドンにわ
    たる配列を有するモルホリノアンチセンス化合物を、該患者に投与する工程、 該投与する工程の後の選択された時間に、被験体から体液のサンプルを採取す
    る工程、および 該サンプル中の、該アンチセンス化合物および該標的ＲＮＡ領域により構成さ
    れるヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 前記体液が尿である、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記検出する工程が、前記サンプルと前記ヘテロ二重鎖に
    対して特異的な抗体を反応させる工程、および抗体−ヘテロ二重鎖結合体の存在
    を検出する工程により達成される、請求項２３に記載の方法。
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