JP2002535287A

JP2002535287A - 単分散性６量体のアシル化されたインスリンアナログ製剤

Info

Publication number: JP2002535287A
Application number: JP2000594487A
Authority: JP
Inventors: ン・キンマン; シュン・リ; エリック・アラン・ワッツ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-01-26
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2002-10-22
Also published as: WO2000043034A2; DE60000288D1; EP1146896A2; ES2180511T3; ATE220917T1; AU2624400A; EP1146896B1; DE60000288T2; WO2000043034A3; PT1146896E; DK1146896T3

Abstract

(57)【要約】本発明はｐＨが約７．９より大きい水溶液を含有する製剤および、該製剤の製造法について提供する。該水溶液は等張化剤、フェノール誘導体、亜鉛イオン、アシル化されたヒトインスリンアナログを含む。より具体的には、本発明は、ｐＨが約７．９より大きく、モノアシル化されたヒトインスリンアナログ（例えば、アシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンアナログ）、あるいは場合により、天然であるかまたは改変した（場合によりＡ２１位が改変されている）ヒトインスリンＡ鎖、および改変された天然のヒトインスリンＢ鎖（このものは場合によりＢ３位が改変されていたり、およびＢ２８位が改変されていたり、またはＢ２８位およびＢ２９位の両方が改変されており、そしてＢ２８位もしくはＢ２９位のどちらかで脂肪酸残基によってアシル化されたリシン残基を含有する）アナログを含む。本発明は、高血糖症を患っている患者に本発明の医薬組成物を用いて処置する方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、アシル化されたヒトインスリンアナログに関する。より具体的には
、本発明はモノアシル化されたヒトインスリンアナログ、金属イオンおよび等張
化剤およびフェノール誘導体を含有する約７．９より大きいｐＨを有する医薬製
剤に関する、。

【０００２】（背景技術）１９２０年代における治療的なインスリンの導入以来、糖尿病の処置を改善し
ようとする絶え間ない努力がなされてきた。インスリン代償療法の利用は、真性
糖尿病の死亡率および急性合併症の羅患率を防止してきた。しかしながら、慢性
糖尿病の合併症は、主に血糖のコントロールに乏しいことから生じ、持続的な代
謝性錯乱が原因の大きな健康上の問題として残る。ＤＣＣＴ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ
ＣｎｏｔｒｏｌａｎｄＣｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＴｒｉａｌ）からの結果
は、ＨｂＡ１ｃ（グリコシル化ヘモグロビン）の１％の減少は、網膜症の発症率
の３５％より大きい改善と相関関係があることを示している［ＴｈｅＤＣＴＴ
ＲｅｓｅａｒｃｈＧｒｏｕｐ、ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２
９，９７７−９８６（１９９３）］。

【０００３】正常な血糖症を得るために、療法は正常な個人の内因性インスリン分泌のパタ
ーンにできるだけ近く近似するように設計しなければいけない。インスリンに対
する毎日の生理学的な要求は変動しており、これは２つの相：（ａ）食事に関連
する血中グルコースの急激な変動の処理（diopose）のためにインスリンのパル
スを必要とする吸収相および（ｂ）最適な空腹時の血中グルコースを維持するた
めに肝臓でのグルコースの産出を制御するためのインスリンの維持された量を必
要とする吸収後の相に分けることができる。従って、有効な療法は、２種類の外
因性のインスリン、すなわち速効性の食事時のインスリンおよび長期間作用性の
ベースのインスリンを組み合わせた使用を含む。

【０００４】長時間作用性の基本作用を得るために、インスリンは現在、不溶性で結晶状態
の６量体の立体配置の形成を促進する条件で製剤化されている。これら長時間作
用性の製剤は、ウルトラレンテ（Ｕｌｔｒａｌｅｎｔｅ）、レンテ（Ｌｅｎｔｅ
）およびセミ−レンテ（ｓｅｍｉ−Ｌｅｎｔｅ）である。しかしながら、最新の
長時間作用性製剤の不溶性は、時間作用の予測ができないことと併せて、投与−
反応の不一致に関連する問題を生じることが示された。加えて、現在利用可能な
長時間作用性のインスリン製剤の１つであるビーフウルタラレンテは免疫原性で
ある。ビーフウルタラレンテの免疫原性から生じる抗体の存在は、速効性のイン
スリンの薬物動態学を変える。

【０００５】不溶性ウルタラレンテ製剤の時間作用は簡便な１日１回のインスリンとなるが
、多数の医師が実際には、中間的な時間作用性のインスリン、インスリン−プロ
タミン製剤（これは、一般的インスリン−ＮＰＨと呼ばれる）を使用することを
好んでいる。インスリン−ＮＰＨはベースのインスリンとして１日に２回使用さ
れるが、その理由としてはより短時間の時間作用性の薬物で最適な用量を調節す
ることが比較的より容易であるからである。結果として、中間的な時間作用性の
インスリンは、米国市場の７０％、日本市場の６０％、欧州市場の４５％および
世界市場の総計５５％と説明されている。

【０００６】しかしながら、不溶性インスリン−ＮＰＨおよび不溶性ウルタラレンテ・イン
スリンは共に懸濁液製剤である。従って、それらの製剤は可溶性製剤よりも本質
的に予測しにくく、血中グルコースの十分なコントロールに劣り、生命を脅かす
高血糖症のエピソードの羅患率が大きくなる。血中グルコースの基本的なコント
ロールを得ようとする１つの試みは、脂肪酸を用いてインスリンをアシル化し、
延長された時間、血清アルブミンによる脂肪酸の結合に頼って循環中のインスリ
ン活性を保持することである。従って、ヒトインスリンおよびヒトインスリンア
ナログのアシル化について、かなりの研究上の努力が集中されている。

【０００７】ポーク、ビーフまたはヒトのインスリンのアシル化については、ムラハシおよ
びキソによる特願平１−２５４，６９９号に開示されている。以下の化合物：Ｂ
２９−Ｎ^ε−パルミトイルインスリン（ε−アミノ基がアシル化されている）、
Ｂ１−Ｎ^α−パルミトイル−インスリン（Ｂ鎖のＮ末端αアミノ基がアシル化さ
れている）およびＢ１，Ｂ２９−Ｎ^α，Ｎ^ε−ジパルミトイルインスリン（ε−
アミノ基およびＮ末端α−アミノ基の両方がアシル化されている）が具体的に開
示されている。

【０００８】同様に、ハシモトらによるｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒ
ｃｈ，６，１７１−１７６（１９８９）では、Ｂ１−Ｎ^α−パルミトイルインス
リン（Ｎ末端α−アミノ基がアシル化されている）および、Ｂ１，Ｂ２９−Ｎ^α ，Ｎ^ε−ジパルミトイルインスリン（ε−アミノ基およびＮ末端α−アミノ基の
両方がアシル化されている）について開示している。ハシモトらは雄性ラットに
おいて極めて高用量である２５Ｕ／ｍＬの割合でのＢ１−Ｎ^α−パルミトイルイ
ンスリンおよびＢ１，Ｂ２９−Ｎ^α，Ｎ^ε−ジパルミトイルインスリンの高血糖
症に与える影響について研究している。これらの用量の場合は、ハシモトの図５
は、静脈投与の場合では非常に低い活性を示している。筋肉内投与の場合では、
Ｂ１−Ｎ^α−パルミトイルインスリンのほんの短時間の高血糖症ヘの効果および
Ｂ１，Ｂ２９−Ｎ^α，Ｎ^ε−ジパルミトイルインスリンの負の効果がハシモトの
図６に開示されている。

【０００９】ムラハシおよびキソ並びにハシモトらによるインビボでの報告に加えて、ワル
ダー（Ｗａｌｄｅｒ）らによるＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１４７６は、タンパク質
およびペプチドの半減期が、タンパク質を非極性基（具体的には、脂肪酸誘導体
）と化学的に結合させることによってインビボで延長できることを開示している
。該脂肪酸は、タンパク質とアルブミンの間の架橋基を与える。ワルダーらはま
た、非極性基はタンパク質のユニークな部位に限定されるのが好ましいことを開
示し、ヘモグロビンのシステイン残基の結合を例示する。それらの文献はインス
リンの脂肪酸誘導体について一般的に開示している。しかしながら、インスリン
の脂肪酸誘導体については具体的には全く開示も例示もされておらず、インスリ
ンの脂肪酸誘導体の生物学的活性が保持されるということを示すデータは全く開
示されていない。

【００１０】ベーカー（Ｂａｋｅｒ）らによる米国特許第５，６９３，６０９号では、モノ
マーインスリンアナログの遊離アミノ基の選択的なアシル化により、有効なベー
スのインスリン活性を有するアシル化されたモノマーインスリンアナログを与え
、一方で非アシル化インスリンアナログは作用の急速な開始および急速な解除（
clearance）を与えることを開示している。具体的には、Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ
^２９ヒトインスリンのアシル化およびＢ２８−Ｎ^ε−パルミトイル−Ｌｙｓ^Ｂ２ ^８Ｐｒｏ^Ｂ２９インスリン（ε−アミノ基がアシル化されている）の製造に関す
る技術が開示されている。しかしながら、この文献ではこれら化合物の単分散性
会合体を含有する製剤または組成物については開示も示唆もされておらず、また
それら製剤または組成物を製造する方法についても示唆されていない。

【００１１】天然のヒトインスリンは亜鉛の存在下で６量体を形成することは長く知られて
いる（ブランデル（Ｂｌｌｕｎｄｅｌｌ）らによるＡｄｖ．ＰｒｏｔｅｉｎＣ
ｈｅｍ．，２６，２７９−４０２（１９７２）；およびベーカー（Ｂａｋｅｒ）
らによるＰｈｉｌｏｓ，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ３１９，３
６９−４５６（１９８８））。亜鉛−インスリン６量体の構造については、一連
のＸ線結晶構造によって十分に決定されている（ベーカーらによるＰｈｉｌｏｓ
．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ３１９，３６９−４５６（１９８
８）；デレウェンダ（Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ），ＵらによるＮａｔｕｒｅ，３３８
，５９４−５９６（１９８９）；サイスザック（Ｃｉｚａｋ），ＥらによるＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，１５１２−１５１７（１９９４）；スミス（Ｓｍ
ｉｔｈ），Ｇ．Ｄ．らによるＰｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，１４．４０１−４０８（１９９２）；スミス，Ｇ．Ｄ．らによるＢｉ
ｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３２，１７４９−１７５６（１９９２））。他の研究者達
は、６量体のヒトインスリン会合体の安定性を増大させようと試みている。例え
ば、ブランゲ（Ｂｒａｎｇｅ）らによる米国特許第４，４７６，１１８号は、ウ
シ、ブタおよびヒトインスリンの６量体を含有する（４．２〜４．５のＺｎ^２＋／６量体を含有することが好ましい）溶液について開示している。実施例１〜８
において、ブランデらは６量体の生成がｐＨが７．４〜７．５の範囲の溶液中で
達成できると開示している。亜鉛の量は溶液中での６量体の複合体の安定性にお
いて重要な役割を果たしていることを見出している。

【００１２】同様に、ヒトインスリンＢ鎖の２９位のＬｙｓのε−アミノがパルミトイル化
されているヒトインスリン（Ｎ^ε−パルミトイルＬｙｓ^Ｂ２９ヒトインスリン）
はヒトインスリンの６量体を生成するのに使用する同一の条件下でＺｎ（ＩＩ）
およびＣｏ（ＩＩ）６量体を生成することを開示している（ブレーダー（Ｂｒａ
ｄｅｒ），マーク（Ｍａｒｋ）Ｌらによる「ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＳｕｒｆａ
ｃｅＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｏｎｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎ」，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶＩＩＩ：ＴｅｎｔｈＳｙｍｐｏ
ｓｉｕｍｏｆｔｈｅＰｒｏｔｅｉｎＳｏｃｉｅｔｙ, ２８９−２９７頁
、マルシャク（Ｍａｒｓｈａｋ），Ｄ．Ｒ．編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
，ｓａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９７７））。

【００１３】最後に、バカイサ（Ｂａｋａｙｓａ）らによる米国特許第５，４７４，９７８
号では、非アシル化ヒトインスリンアナログが約７．５のｐＨで亜鉛および様々
なフェノール化合物と６量体を形成すると開示している。具体的には、非アシル
化Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンの６量体について開示されている。
バカイサらは更に、６量体の複合体の吸収速度がインスリンの場合に観察される
速度の少なくとも２倍であることを開示している。しかしながら、６量体の複合
体が製剤化されると、化学的な分解反応に対しては等しく安定であることが報告
されている。

【００１４】上記の通り、多数の文献が、アシル化されたヒトインスリンアナログの製造に
ついて開示している。他の文献では、ヒトインスリン、アシル化されたヒトイン
スリンおよび非アシル化されたヒトインスリンアナログの６量体の会合体の製造
について開示している。該先行技術は、アシル化されたインスリンアナログの高
い安定性および溶液からの小さい沈降性という望ましい性質を有するアシル化さ
れたインスリンアナログ製剤または組成物の製造法について教示も示唆もしてい
ない。特に、該先行技術は、アシル化されたヒトインスリンアナログの単分散性
６量体の会合体を含有する医薬製剤についても、または組成物についても示唆さ
れていない。加えて、それら製剤および組成物の製造法についても、またはそれ
ら製剤および組成物を用いた高血糖症を患っている患者を処置する方法について
は開示も教示もされていない。

【００１５】その上、ヒトインスリン、アシル化されたヒトインスリンまたは非アシル化ヒ
トインスリンアナログを生成する先行技術を実施しても、目的のアシル化された
ヒトインスリンアナログの６量体を得ることができない。従って、アシル化され
たインスリンアナログの高い安定性および溶液からの小さい沈降性という望まし
い性質を有するアシル化されたインスリンアナログ製剤または組成物に対する要
求、およびそれら製剤および組成物の製造法に対する要求がある。上で説明した
通り、多数の人々が糖尿病を患っており、現在利用できる治療学的なインスリン
製剤について欠点が存在する。従って、上記の望ましい性質を有する組成物を含
有する組成物または製剤を用いた、高血糖症を患っている患者を処置する改善さ
れた方法に対する要求がある。

【００１６】（発明の概要）従って、本発明の目的は医薬製剤を提供することであって、該製剤は等張化剤
および、単分散性６量体の会合状態のモノアシル化されたヒトインスリンアナロ
グまたはその医薬的に許容し得る塩を含有する水溶液を含む。該モノアシル化さ
れたヒトインスリンアナログは、配列番号２のポリペプチドに適当に架橋した配
列番号１のポリペプチドを含み、それらの配列において配列番号１の２１位のＸ
ａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙおよびＧｌｘからなる群から選ばれ、配列番号２
の３位のＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｘからなる群から選ばれ、配列番号
２の２８位のＸａａはＡｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａおよびアシル化されたＬ
ｙｓからなる群から選ばれ、配列番号２の２９位のＸａａはＰｒｏおよびアシル
化されたＬｙｓからなる群から選ばれる。更に２８位または２９位はアシル化さ
れたＬｙｓであるが、２８位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２９位は
アシル化されたＬｙｓでなく、２９位がアシル化されたＬｙｓである場合には、
２８位はアシル化されたＬｙｓでない。本発明の好ましい態様では、医薬製剤は
単分散性６量体の会合状態であるアシル化されたＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒト
インスリンまたはアシル化されたＡｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリンを含む。

【００１７】本発明の別の目的はｐＨが約７．９より大きい水溶液を含む医薬製剤を提供す
ることであって、該製剤は等張化剤、フェノール誘導体、金属イオン（１つ以上
の亜鉛イオンが好ましい）およびモノアシル化されたヒトインスリンアナログも
しくはそのアナログの医薬的に許容し得る塩を含む。該モノアシル化されたヒト
インスリンアナログは、配列番号２のポリペプチドに適当に架橋した配列番号１
のポリペプチドを含む。それらの配列において配列番号１の２１位のＸａａはＡ
ｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙおよびＧｌｘからなる群から選ばれ、配列番号２の３位の
ＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｘからなる群から選ばれ、配列番号２の２８
位のＸａａはＡｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａおよびアシル化されたＬｙｓから
なる群から選ばれ、配列番号２の２９位のＸａａは、Ｐｒｏおよびアシル化され
たＬｙｓからなる群から選ばれる。そして、２８位または２９位はアシル化され
たＬｙｓであるが、２８位がアシル化されたＬｙｓである場合には２９位はアシ
ル化されたＬｙｓでなく、２９位がアシル化されたＬｙｓである場合には２８位
はアシル化されたＬｙｓでない。

【００１８】本発明の好ましい態様では、製剤のｐＨは約７．９〜８．０の間である。別の
好ましい態様では、フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾールおよびそ
れらの組み合わせからなる群から選ばれ、金属は＋２の酸化状態の亜鉛であり、
該製剤はグリセリンおよび場合により、トリス、リン酸ナトリウム、グリシルグ
リシンおよびクエン酸塩からなる群から選ばれる緩衝剤を含む。他の好ましい態
様では、モノアシル化されたヒトインスリンアナログはアシル化されたＬｙｓ^Ｂ ^２８Ｐｒｏ^Ｂ２９およびアシル化されたＡｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリンである。

【００１９】本発明の更に別の目的は、単分散性６量体の会合体であるモノアシル化された
ヒトインスリンアナログ医薬製剤の製造法を提供することであって、該製造法は
＋２の酸化状態の金属をモノアシル化されたヒトインスリンアナログもしくはそ
のアナログの医薬的に許容し得る塩と接触させ、フェノール誘導体および等張化
剤を加え、そして該製剤のｐＨを約７．９より大きくなるように調節することを
含む。該モノアシル化されたヒトインスリンアナログは、配列番号２のポリペプ
チドに適当に架橋した配列番号１のポリペプチドを含み、それらの配列において
配列番号１の２１位のＸａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙおよびＧｌｘからなる群
から選ばれ、配列番号２の３位のＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｘからなる
群から選ばれ、配列番号２の２８位のＸａａはＡｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ
およびアシル化されたＬｙｓからなる群から選ばれ、配列番号２の２９位のＸａ
ａはＰｒｏおよびアシル化されたＬｙｓからなる群からなる群から選ばれる。そ
して、２８位または２９位はアシル化されたＬｙｓであるが、２８位がアシル化
されたＬｙｓである場合には２９位はアシル化されたＬｙｓでなく、２９位がア
シル化されたＬｙｓである場合には２８位はアシル化されたＬｙｓでない。

【００２０】本発明の別の目的は、単分散性６量体の会合状態である医薬製剤を提供するこ
とであって、該製剤は等張化剤およびモノアシル化されたヒトインスリンアナロ
グまたはその医薬的に許容し得る塩を含有する水溶液を含む。

【００２１】本発明の別の目的は、ｐＨが約７．９より大きい水溶液を含有する医薬製剤を
提供することであって、該製剤は等張化剤、フェノール誘導体、金属イオン（１
つ以上の亜鉛イオンが好ましい）、およびモノアシル化されたヒトインスリンア
ナログまたはそのアナログの医薬的に許容し得る塩を含む。該モノアシル化され
たヒトインスリンアナログはアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンを含
む。本発明の好ましい態様では、製剤のｐＨは約７．９〜８．０の間である。別
の好ましい態様では、フェノール誘導体はフェノール、ｍ−クレゾールおよびそ
れらの組み合わせからなる群から選ばれ、金属は＋２の酸化状態の亜鉛であり、
該製剤はグリセリンおよび場合により、トリス、リン酸ナトリウム、グリシルグ
リシンおよびクエン酸塩からなる群から選ばれる緩衝剤を含む。

【００２２】本発明の更に別の目的は、単分散性６量体の会合体であるモノアシル化された
ヒトインスリンアナログ医薬製剤の製造法を提供することであって、該製造法は
＋２の酸化状態の金属とモノアシル化されたヒトインスリンアナログまたはその
アナログの医薬的に許容し得る塩とを接触させ、フェノール誘導体および等張化
剤を加え、そして金属／アナログ混合物のｐＨを約７．９より大きくなるように
調節する工程を含む。ここで、モノアシル化されたヒトインスリンアナログとは
アシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンである。

【００２３】本発明の更に別の目的は、高血糖症を患っている患者の処置法を提供するもの
であって、該方法は患者にモノアシル化されたインスリンアナログの単分散性６
量体の会合体溶液の有効な量を含有する医薬製剤を投与することを含む。

【００２４】本発明の更なる目的、特徴および利点については、以下の発明の詳細な記載お
よび添付する図面から明白であろう。

【００２５】（発明の詳細な記載および好ましい態様）本明細書で使用する全てのアミノ酸の略号は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１８２２(ｂ)
２に記載されている通り、米国特許庁によって受容されている略号である。

【００２６】（定義）ｐＨレベルについての用語「約」とは、±０．０５ｐＨ単位であるｐＨの範囲
を意味する。例えば、「約８．０」のｐＨとは、７．９５〜８．０５のｐＨの範
囲を意味する。

【００２７】本明細書で使用する用語「組成物」とは、多数の要素または成分を混合するか
、または組み合わせた生成物を記載するのに使用する一般的な用語である。本明
細書の目的として、用語「組成物」は製剤を含む。

【００２８】本明細書で使用する用語「製剤」とは、組成物のあるタイプを意味する。本明
細書で使用する用語「医薬製剤」とは、他の典型的な医薬賦形剤の存在下で活性
化合物または活性化合物の塩を含有するあるタイプの製剤を意味する。典型的に
は、医薬製剤は減菌されており、特に非経口投与に使用するものである。

【００２９】用語「アシル化されたＬｙｓ」とは、ε−アミノ基をＣ_６〜Ｃ_２１脂肪酸でア
シル化したＬｙｓを意味する。用語「アシル化基」とは、インスリンアナログの
ε−アミノ基に化学結合した脂肪酸を意味する。

【００３０】用語「アシル化」とは、タンパク質の遊離アミノ基へアシル基が共有結合して
いることを意味する。１つ以上の該アミノ基がアミド結合で脂肪酸の酸基と結合
している場合には、インスリンは「アシル化されている」という。

【００３１】本明細書で使用する用語「ヒトインスリン」とは、アミノ酸配列および空間構
造がよく知られているヒトインスリンを意味する。ヒトインスリンは、システイ
ン残基間のジスルフィド結合によって架橋した、アミノ酸数が２１のＡ鎖および
アミノ酸数が３０のＢ鎖を含む。ヒトインスリンは３個のジスルフィド架橋を含
み、１つめはＡ鎖の７位とＢ鎖の７位の間で、２つめはＡ鎖の２０位とＢ鎖の１
９位の間で、３つめはＡ鎖内のの６位と１１位の間にある［Ｎｉｃｏｌ, Ｄ．Ｓ
．Ｈ．Ｗ．およびＳｍｉｔｈ, Ｌ．Ｆ．によるＮａｔｕｒｅ, １８７, ４８３−
４９５（１９６０）］。

【００３２】用語「脂肪酸］とは、飽和または不飽和のＣ_６〜Ｃ_２１脂肪酸を意味する。本
発明を実施するに好ましい脂肪酸は飽和脂肪酸であり、例えばミリスチン酸（Ｃ
１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸
（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）を含む。これら脂肪酸の各々も個々に
好ましい。炭素数が６〜１０であったり、炭素数が６〜９であったり、そして炭
素数が６〜８である脂肪酸も好ましい。脂肪酸はミリスチン酸、パルミチン酸、
ヘキサン酸およびオクタン酸がより好ましい。本発明の組成物および製剤は、モ
ノアシル化されたヒトインスリンアナログを含む。モノアシル化されたインスリ
ンアナログは、インスリンアナログ分子の１個につき１つのアシル基を含む。特
に、本発明のモノアシル化されたインスリンアナログは、アナログ当り１個のリ
シンのε−アミノ基がＣ_６〜Ｃ_２１脂肪酸でアシル化されている。本発明のヒト
インスリンアナログは、Ｂ２８またはＢ２９位のリシンのε−アミノ基がＣ_６〜
Ｃ_２１脂肪酸でモノアシル化されていることが好ましい。

【００３３】用語「インスリンアナログ」とは、ヒトインスリンのそれぞれＡ鎖およびＢ鎖
と実質的には同じアミノ酸配列を有するが、インスリンアナログのインスリン活
性を損なわない１つ以上のアミノ酸の欠損、１つ以上のアミノ酸の置換および／
または１つ以上のアミノ酸の付加を有することによって、該ヒトインスリンのＡ
鎖とＢ鎖は異なる、Ａ鎖およびＢ鎖を有するタンパク質を意味する。。１つのタ
イプのインスリンアナログは、「モノマーインスリンアナログ」である。別のタ
イプのヒトインスリンアナログはデス（Ｂ３０）ヒトインスリンであって、この
ものはヒトインスリンのＢ鎖のＢ３０位でのＴｈｒが存在しない。アシル化され
たモノマーヒトインスリンアナログおよびアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトイ
ンスリンの両方が、本発明の医薬製剤に好ましくは含まれている。

【００３４】本明細書で使用する用語「モノマーインスリンアナログ」とは、二量化または
自己会合する傾向に乏しい、速効性のインスリンアナログを意味する。本発明の
モノマーインスリンアナログは、（１）Ｂ２８位のＰｒｏがＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌ
ｅｕ、ＶａｌまたはＡｌａで置換されており；（２）Ｂ２９位のＬｙｓがリシン
またはプロリンで置換されている、という改変を１つ以上含むヒトインスリンで
ある。これらの置換に加えて、モノマーインスリンアナログは、以下の改変を１
つ以上含んでもよい。（１）Ａ２１位のＡｓｎはＡｓｐ、ＧｌｙまたはＧｌｘで
置換されてもよい；（２）Ｂ３位のＡｓｎはＡｓｐまたはＧｌｘで置換されても
よい。当該分野の当業者は、モノマーインスリンアナログについての他の改変が
可能であり、そのことは当該分野において広く受容されていると認めるであろう
。本発明の組成物および製剤のモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナ
ログは、配列番号２のポリペプチドに適当に架橋した配列番号１のポリペプチド
を含む。他のモノマーインスリンアナログとしては、デス（Ｂ２７）およびデス
（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインスリンを含む。

【００３５】用語「架橋」とは、システイン残基間のジスルフィド架橋を意味する。「適当
に架橋した」ヒトインスリン、モノマーヒトインスリンアナログ、ヒトイスリン
アナログ、アシル化されたヒトインスリンアナログまたはアシル化されたモノマ
ーヒトインスリンアナログは３個のジスルフィド架橋を含む。１つのジスルフィ
ド架橋は、Ａ鎖の７位およびＢ鎖の７位のシステイン残基同士を連結する。２つ
めのジスルフィド架橋は、Ａ鎖の２０位とＢ鎖の１９位のシステイン残基同士を
連結する。３つめのジスルフィド架橋は、Ａ鎖中の６位と１１位のシステイン残
基同士を連結する。

【００３６】配列番号１は、

【化１】のアミノ酸配列を有するヒトインスリンＡ鎖またはそのアナログであって、２１
位のＸａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＧｌｘである。

【００３７】配列番号２は、

【化２】のアミノ酸配列を有するヒトインスリンＢ鎖アナログである。該配列において、３位のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｘである。２８位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａまたはアシル化されたＬ
ｙｓである。２９位のＸａａは、Ｐｒｏまたはアシル化されたＬｙｓである。そして、２８位または２９位はアシル化されたリシンであり、２８位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２９位はアシル化されたＬｙ
ｓでなく、２９位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２８位はアシル化されたＬｙ
ｓでない。

【００３８】本発明の好ましい態様は、アシル化されたＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９およびア
シル化されたＡｓｐ^Ｂ２８を含有する組成物および製剤を含む。本発明の他の好
ましい態様は、Ｂ２８−Ｎ^ε−パルミトイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９、Ｂ２
８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９、Ｂ２９−Ｎ^ε−パルミト
イル−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリンおよびＢ２９−Ｎ^ε−ミリストイル−Ａｓｐ ^Ｂ２８ヒトインスリンを含有する組成物および製剤を含む。本発明の他の好まし
い態様では、配列番号１の２１位のＸａａがＡｓｎであるか、もしくは配列番号
２の３位のＸａａがＡｓｎであるか、または配列番号１の２１位および配列番号
２の３位の両方がＡｓｎである。

【００３９】モノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログまたはモノアシル化され
たヒトインスリンアナログの「医薬的に許容し得る塩」とは、インスリンアナロ
グの１つ以上の荷電した基のいずれかと１つ以上の医薬的に許容し得る塩、非毒
性のカチオンまたはアニオンとの間で形成する塩を意味する。有機塩および無機
塩としては、例えば塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水素酸、
グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香
酸、アスコルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレ
ンスルホン酸、プロピオン酸および炭酸などの酸から製造した塩を含む。モノア
シル化されたモノマーインスリンアナログおよびモノアシル化されたインスリン
アナログの医薬的に許容し得る塩はカチオン（例えば、アンモニウム、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムを含むが、これらに限定しない）
を含み得る。

【００４０】用語「単分散性６量体の会合体」とは、アシル化されたモノマーヒトインスリ
ンアナログまたはアシル化されたヒトインスリンアナログの製剤であって、該ア
シル化されたモノマーヒトインスリンアナログまたはアシル化されたヒトインス
リンアナログが実質的に全て６量体の会合状態であることを意味する。従って、
アシル化されたモノマーヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会合体は、
沈降係数の分布プロフィールにおいて６量体状態であるモノアシル化されたヒト
インスリンアナログに対応する１本のはっきりとしたピークを示す（このことは
、８４％以上のアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログが６量体の会合
状態であることを示す）製剤を意味する。少なくとも８５％、少なくとも９０％
、少なくとも９５％または少なくとも９５％のアシル化されたモノマーヒトイン
スリンアナログが６量体の会合状態であることを、該沈降係数の分布プロフィー
ルが示すことがより好ましい。同様なピークの分布は、モノアシル化されたヒト
インスリンアナログの単分散性６量体の会合体の場合にも当てはまるであろう。

【００４１】用語「等張化剤」とは任意物であるが非常に好ましい薬剤であって、生理学的
に許容性であり、製剤に適当な張性を与え、水の正味の流れが細胞膜を通過する
のを防止する薬剤を意味する。化合物（例えば、グリセリン、並びにスクロース
、デキストロース、マニトールおよびトレハロースなどの他の炭水化物またはそ
れらの混合物を含むが、これらに限定されない）は通常、公知の濃度でそれらの
目的に使用される。従って、これらの化合物は個別にであったり、または混合物
として好ましい等張化剤である。例えば、グリセリン（このものはグリセロール
とも呼ばれる）は約１２〜約２５ｍｇ／ｍＬの濃度では、本発明の好ましい等張
化剤である。グリセリンは、約１６ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することが最も好ま
しい。従って、グリセリンは、約１．２〜約２．５重量％の範囲の量で存在する
ことが好ましいが、約１．６〜約１．５重量％の量で存在することがより好まし
い。炭水化物（例えば、マンニトール）は好ましい等張化剤であるが、このもの
は約１０〜約６０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で使用することが好ましく、約２０〜約
４０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で使用することがより好ましい。炭水化物は、約３０
〜約３８ｍｇ／ｍＬの量で使用することがより一層好ましく、約３６ｍｇ／ｍＬ
の量で使用することが最も好ましい。グリセリンまたは上記などの炭水化物は等
張化剤として個別に使用することが可能であるが、これら等張化剤の組み合わせ
を本発明の特定の好ましい医薬製剤において使用することができる。塩化ナトリ
ウムもそれ自体等張化剤として使用することができるが、他の等張化剤（例えば
、グリセリンまたはマンニトール）と組み合わせることが好ましい。塩化ナトリ
ウムが本発明の医薬製剤中に存在する場合には、そのものは１５０ｍＭより少な
い量で存在することが好ましい。

【００４２】用語「フェノール誘導体」とは、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾー
ル、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン
、レゾルシノール、フェニルエタノール、フェノキシエタノールおよびそれらの
混合物を意味する。本発明の最も好ましいフェノール誘導体は、フェノールおよ
びｍ−クレゾールを含む。

【００４３】用語「保存剤」とは、組成物および医薬製剤に加えて抗菌剤として作用させる
化合物を意味する。保存剤の１種はフェノール誘導体である。医薬製剤において
有効であると知られる他の保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニ
ウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンルアルコール、メ
チルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロク
レゾール、レゾルシノール、フェニル水銀硝酸塩、チメロサール、安息香酸およ
びそれらの様々な混合物を含む。本発明で使用するのに特に好ましいフェノール
の混合物は、ｍ−クレゾールとフェノールの混合物を含む。

【００４４】用語「緩衝剤」および「生理学的に許容な緩衝剤」は当該分野でよく知られて
いる。生理学的に許容な緩衝剤としては、トリス、リン酸緩衝剤（例えば、リン
酸ナトリウム）またはアルギニンが好ましい。トリスとは、トリス(ヒドロキシ
メチル)アミノメタンについて当業者によって通常使用される命名である。他の
生理学的に許容な緩衝剤としては、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム
、グルタミン酸塩、炭酸塩およびグリシルグリシンを含むが、これらに限定され
ない。これら緩衝剤の各々が本発明の製剤に使用するのが好ましい。特に好まし
い緩衝剤はトリス、リン酸ナトリウム、グリシルグリシンおよびクエン酸塩を含
む。加えて、本発明の製剤においてこれら緩衝剤の混合物を使用することが可能
であり、且つ好ましい。

【００４５】本明細書において使用する用語「処置する」とは、疾患、病状または障害と闘
う目的での患者の管理およびケアを言い、症候群もしくは合併症の発症を防止す
るためであったり、症候群もしくは合併症を軽減するためであったり、または疾
患、病状もしくは障害を排除するために本発明の製剤を投与することを含む。

【００４６】用語「有効な量」とは、治療学的にまたは予防学的に、血糖レベルを低下させ
るか、または維持するために必要な、１つ以上の本発明のアシル化されたアナロ
ーグの量を意味する。この量は典型的に、１日当り約１０単位を超える量（また
はヒトインスリンのｍｇ当り約２７．５単位と仮定される約０．３〜約２ｍｇ）
にまで及んでもよい。しかしながら、実際に投与されるアシル化されたアナログ
の量は、関連する環境（例えば、処置する病気、高血糖症の原因、投与するある
インスリンアナログ、投与経路の選択、個々の患者の年齢、体重および反応、並
びに患者の症状の重度を含む）に照らして医師によって決定されるであろう。従
って、上記の投与量の範囲はいかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意
図するものではない。個々の患者のある要求に応じるために、投与量の範囲を調
節することは当業者によく知られている。

【００４７】本発明の１つ以上の製剤を、処置が必要な患者、すなわち高血糖症を患ってい
る患者に投与する。本発明のモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナロ
グまたはモノアシル化されたヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会合体
の有効な量を、高血糖症または糖尿病を患っている患者に投与する。本発明の医
薬製剤は典型的に、ｍＬ当り約１００単位を含むように製剤化することができ、
またはモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログもしくはモノアシル
化されたヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会合の有効な量を含有する
ような同じ濃度を含むように製剤化することができる。従って、本発明は単位用
量形態（例えば、ｍＬ当り１００単位を含有するバイアルまたはアンプル）のア
シル化されたインスリンアナログを含む。上記の通り、本発明のアシル化された
インスリンアナログの典型的な単位用量は、１日当り約１０単位以上である。必
然ではないが、これらの製剤は典型的に本来は非経口製剤であり、当業者にとっ
て知られる多数の技法によって製造することができる。しかしながら、それらの
組成物は、当業者にとって知られる肺運搬法またはその他の運搬法のために製造
することもできる。

【００４８】例えば、本発明の医薬製剤は、本明細書に記載であるかまたは当該分野で公知
の吸入投与に適当な多数の装置および方法のいずれか（例えば、ネブライザーま
たはスプレーの使用）を用いて運搬することができる。該装置は、アシル化され
たヒトインスリンアナログ製剤をエアロゾル中に分配した（dispensing）ものを
投与するのに適当な製剤の使用を必要とする。該エアロゾルは溶液を含むことが
できる。ネブライザー（例えば、ＡＥＲｘ（登録商標）Ａｒａｄｉｇｍ、Ｕｌｔ
ｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザー（Mallinckrodt）およびＡｓｃｏｒｎＩ
Ｉ（登録商標）ネブライザー（Marquest Medical Products）（米国特許５４０
８７１号Ａｒａｄｉｇｍ、ＷＯ９７／２２３７６号）により、液剤からエアロゾ
ルを得ることができる。商業的に入手可能な吸入装置についてのこれら具体例は
、本発明の実施に適当な特別な装置を例示するものであるが、これらは本発明の
範囲を限定することを意図するものではない。

【００４９】本発明のインスリン製剤を含有するスプレー剤は、加圧下でノズルから製剤を
強く押し出すことによって製造することができる。本発明のインスリン製剤は、
ネブライザー（例えば、ジェットネブライザーまたはウルトラソニックネブライ
ザー）によっても投与することができる。肺経路によって投与する本発明のイン
スリン製剤は、例えば等張化剤、金属イオン、フェノール誘導体、緩衝剤、賦形
剤、界面活性剤およびバルクタンパク質などの成分を１つ以上含んでもよい。、

【００５０】インスリンアナログの製造本発明のモノアシル化されたインスリンアナログは、先ず分子のインスリンア
ナログ部分を合成し、次いでそのインスリンアナログをアシル化することによっ
て製造する。

【００５１】本発明のインスリンアナログは、公知の化学的方法のみで、組換えＤＮＡ法の
みで、または化学的方法および組換えＤＮＡ法の組み合わせによって製造するこ
とができる。以下のリストでは、これらインスリンアナログを製造するためのい
くつかの基本的な方法について概説する。それらのリストは限定的なものではな
く、それら基本的なスキームを変形することも可能である。

【００５２】１）組換えＤＮＡ法を用いた標準的な生合成法によるヒトインスリンＡ鎖アナロ
グ（配列番号１）の合成、および組換えＤＮＡ法を用いた標準的な生合成法によ
るヒトインスリンＢ鎖またはヒトインスリンＢ鎖アナログ（配列番号２）の別合
成、続く公知のジスルフィド化学を用いる鎖の架橋（Ｃｈａｎｃｅらによる米国
特許第４,４２１,６８５号、これは本明細書の一部を構成する）。

【００５３】２）標準的な化学的方法によるヒトインスリンＡ鎖アナログ（配列番号１）の合
成、および標準的な化学的合成法によるヒトインスリンＢ鎖またはヒトインスリ
ンＢ鎖アナログ（配列番号２）の別合成、続く公知のジスルフィド化学を用いる
それらの架橋（上記を参照）。

【００５４】３）１つの鎖の化学的合成、および他方の鎖の組換えＤＮＡ法を用いた生合成法
、続く公知のジスルフィド化学を用いたそれらの架橋（上記を参照）。

【００５５】４）化学的合成法または好ましくは組換えＤＮＡ法を用いた生合成法（例えば、
トリプシン様活性を有する酵素を用いる方法）によるプロインスリン様前駆体の
切断。

【００５６】化学的合成ポリペプチドの固相化学合成の原理はよく知られており、当該分野の教科書で
知ることができる［例えば、Ｈ．ＤｕｇａｓおよびＣ．ＰｅｎｎｅｙによるＢ
ＩＯＯＲＧＡＮＩＣＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，
ＮｅｗＹｏｒｋ，５４−９２頁（１９８１）を参照］。それらの方法は、上記
の本発明のインスリンおよびインスリンアナログの化学的合成に使用することが
できる。従って、本発明のポリペプチドを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ４３０Ａｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣａｌｉｆｏｒｎｉａから商
業的に入手可能である）および合成サイクル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓによって供給されている）を用いた固相方法によって合成することができ
る。保護したアミノ酸（例えば、ｔ−ブトキシカルボニルで保護したアミノ酸）
およびそれら化学的合成において使用する他の試薬を多数の化学薬品供給社から
商業的に入手することができる。

【００５７】Ｃ−末端カルボキサミドの製造の場合には、出発物質であるｐ−メチルベンズ
ヒドリルアミン樹脂に、２組のカップリング（ｃｏｕｐｌｅ）プロトコルを用い
た連続ｔ−ブトキシカルボニル化学を適用する。Ｃ−末端酸の製造の場合には、
対応するピリジン−２−アルドキシムメチオジド（ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）樹脂
を使用する。アスパラギン、グルタミンおよびアルギニンを予め製造したヒドロ
キシベンゾトリアゾールエステルとカップリング反応させる。以下の側鎖の保護
基を使用することができる。Ａｒｇの場合にはトシルであり、Ａｓｐの場合にはシクロヘキシルであり、Ｇｌｕの場合にはシクロヘキシルであり、Ｓｅｒの場合にはベンジルであり、Ｔｈｒの場合にはベンジルであり、Ｔｙｒの場合には４−ブロモカルボベンゾキシである。

【００５８】ｔ−ブトキシカルボニル部分の除去（脱保護）は、ジクロロメタン中でトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて達成することができる。合成が完結した後、該ペ
プチドを脱保護し、そのものを１０％メタ−クレゾールを含有する無水フッ化水
素を用いて該樹脂から切断することができる。側鎖保護基の切断および樹脂から
のペプチドの切断は摂氏０℃以下で行なうが、−２０℃で３０分間行なって、続
いて０℃で３０分間行なうことが好ましい。

【００５９】フッ化水素の除去後、該ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄し、該ペプチドを氷
酢酸を用いて抽出し、次いで凍結乾燥する。精製は、限外クロマトグラフィー（
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム、１０％酢酸）によ
って行なう。

【００６０】組換えＤＮＡ法を用いる合成本発明の個々のＡ鎖およびＢ鎖、または本発明のインスリンアナログのプロイ
ンスリン様前駆体を、組換えＤＮＡを出発として生合成を行なうことができる。
高収率を望むならば、組換え法が好ましい。いずれかの目的のＤＮＡ配列の構築
についての一般的方法は、Ｊ．ＢｒｏｗｎらによるＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，１９（１９７９）［Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋらによるＭ
ＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ａＬＡＢＯＲＳＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ
，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）を参
照］で提供されている。

【００６１】目的のタンパク質の組換え産生法における基本的な工程は、ａ）目的のタンパク質をコードした、合成ＤＮＡまたは半合成ＤＮＡを構築す
る；ｂ）目的のタンパク質の発現に適当な様式で、発現ベクター中にＤＮＡを単独
でまたは融合タンパク質として組み込ませる；ｃ）発現ベクターを用いて適当な真核生物または原核生物の宿主細胞を形質転
換する；ｄ）目的のタンパク質を発現するような様式で、形質転換するかまたはトラン
スフェクトした宿主細胞を培養する；ｅ）目的の組換え産生したタンパク質を回収し、且つ精製することである。

【００６２】一般に、本発明のベクターを構築する際のＤＮＡ配列をクローニングするのに
真核生物を使用する。真核生物は、目的のタンパク質の産生に使用することもで
きる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｋ１２菌株２９４ (ＡＴＣ
Ｃ第３１４４６号）は外来タンパク質の原核生物による発現に特に有用である。
使用可能な他の菌株のＥ．Ｃｏｌｉ（および関連する遺伝子型）は以下のものを
含む。表１．インスリンアナログの製造に使用可能なＥ．Ｃｏｌｉの遺伝子型

【表１】

【表２】

【００６３】これらの菌株は全て供給源（例えば、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２
０８７７およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９２０３７号）から商業的に入手可能か
、または公の供給源（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２０３１，ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，１０８５２−１７７６）から容易に入手可能で
ある。

【００６４】特に断わらない限り、これら細菌の菌株を互換的に使用することができる。上
記の表の遺伝子型は、細菌の宿主を選択する際の多数の望ましい性質を例示する
ものであって、このものはいかなる形で本発明を限定することを意図するもので
はない。それら遺伝子型の表示は、標準的な命名法と一致する［例えば、Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋによる上記を参照のこと］。本発明の遺伝子のクローニングおよ
び発現において使用するＥ．Ｃｏｌｉの好ましい菌株はＲＶ３０８であり、これ
はＡＴＣＣ（目録番号ＡＴＣ３１６０８）から入手可能であり、そのことについ
ては米国特許第４，５５１，４３３号（１９８５年１１月５日に発行）によって
記載されている。

【００６５】上記のＥ．Ｃｏｌｉの菌株に加えて、バチルス（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｓｔｉｌｉｓ））、他の腸内細菌科（例えば、ネズミチフス菌（
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはレイ菌（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａｍａｃｒｅｓｃａｎｓ）および多数のシュードモナス種を使用することが
できる。これらグラム陰性菌に加えて、他の菌（特に、ストレプトマイセスｓｐ
ｐ）を本発明のタンパク質の原核生物によるクローニングおよび発現に使用する
ことができる。

【００６６】原核生物の宿主を用いて使用するのに適当なプロモーターは、β−ラクタマー
ゼ［ベクターpGX2907（ＡＴＣＣ３９３４４）は、レプリコンおよびβ−ラクタ
マーゼ遺伝子を含む］およびラクトースプロモーターシステム［チャング（Ｃｈ
ａｎｇ）らによるＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２７５，６１５（１９７８）；
およびゲデルらによるNature(London)、２８１、５４４（１９７９）］、アルカ
リ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム［ベクタ
ーｐＡＴＨ１（ＡＴＣＣ３７６９５）はｔｒｐプロモーターのコントロール下で
ｔｒｐＥ融合タンパク質として読み取り枠の発現を促進するように設計する］お
よびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤ
Ｒ５４０ＡＴＣＣ３７２８２から単離することができる）を含む。しかしなが
ら、ヌクレオチド配列が通常知られているような他の機能性バクテリアプロモー
ターは、当業者がいずれかの必要とされる制限部位を供するようなリンカーまた
はアダプターを用いて本発明のタンパク質のＤＮＡコードとライゲートすること
ができる。バクテリアシステムでの使用のためのプロモーターも、目的のポリペ
プチドをコードしたＤＮＡに操作可能に結合したシャイン・ダルガルノ配列を含
むであろう。これらの例は限定するよりも例示するものである。

【００６７】本発明のタンパク質は、酵素による切断であるかまたは化学的切断によって除
去することができる別のタンパク質またはペプチドとの翻訳融合物として、直接
的な発現によるか、または目的のタンパク質を含有する融合タンパク質として合
成することができる。組換えシステムにおけるあるペプチドの産生において、融
合タンパク質としての発現は寿命を延長し、目的のペプチドの収率を増加させる
か、または目的のタンパク質の精製の便利な手法を提供する。特定の位置でポリ
ペプチドを切断したり（例えば、トリプシン）、またはペプチド鎖のアミノ末端
もしくはカルボキシ末端からペプチドを消化する（例えば、ジペプチジルアミノ
ペプチダーゼ）ような多数のペプチダーゼ（例えば、トリプシン）について知ら
れている。その上、特定の化学薬品（例えば、臭化シアン）は特定の位置でポリ
ペプチド鎖を切断するであろう。当業者は、位置特異的な内部切断部位を組み込
むために、アミノ酸配列（および、組換え手法を使用する場合には、合成コード
配列または半合成コード配列である）に必要な改変を認めるであろう［例えば、
Ｐ．カーター（Ｃａｒｔｅｒ）による「ＳｉｔｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔ
ｅｏｌｙｓｉｓｏｆＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｓ」，ＰＲＯＴＥＩＮ
ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮの１３章：ＦＲＯＭＭＯＬＥＣＵＬＡＲＭＥＣＨ
ＡＮＩＳＭＳＴＯＬＡＲＧＥＳＣＡＬＥＰＲＯＣＥＳＳＥＳ, 米国化学
会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，D．C (１９９０）］。

【００６８】アシル化タンパク質（例えば、インスリンを含む）の遊離アミノ基のアシル化について
は当該分野で知られている。アシル化の一般的な方法については、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５，４９４−４９９（１９７２）に記載さ
れており、該方法は活性化エステル、酸クロリドまたは酸無水物の使用を含む。
脂肪酸の活性化エステル（特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使
用は、脂肪酸を用いた遊離アミノ酸のアシル化の特に有利な手法である。ラピド
ット（Ｌａｐｉｄｏｔ）らは、Ｎ−ヒドキシスクシンイミドエステルの製造、並
びにＮ−ラウロイル−グリシン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリンおよびＬ−ラウロ
イル−Ｌ−グルタミン酸の製造におけるそれらの使用について記載している。

【００６９】 ε−アミノ基を選択的にアシル化するために、カップリング反応の間に、α−
アミノ基をブロックするのに多数の保護基を使用することができる。適当な保護
基の選択は当業者に知られており、例えばｐ−メトキシベンゾイルカルボニル（
ｐｍＺ）を含む。ε−アミノ基はアミノ保護基を使用しない１段階の合成でアシ
ル化されることが好ましい。該アシル化は、塩基性条件下、極性溶媒中で、活性
化した脂肪酸エステルとタンパク質のε−アミノ基とを反応させることによって
行なう。該反応液の塩基性は、インスリンアナログの全ての遊離のアミノ基を脱
プロトン化するのに十分でなければいけない。弱塩基性条件下では、全ての遊離
アミノ基は脱プロトン化されず、Ｎ−末端またはα−アミノ基が優先的にアシル
化される。水性溶媒または共溶媒の場合では、塩基性条件とはｐＨが約９．０よ
り大きい時に反応を行なうことを意味する。タンパク質の分解はｐＨが約１２．
０を超えると起こるので、反応混合物のｐＨは１０．０〜１１．５が好ましく、
１０．５が最も好ましい。混合有機溶媒および水性溶媒中での反応混合物の反応
におけるｐＨの測定値は、混合前の水性溶媒のｐＨである。

【００７０】非水性溶媒の場合には、ε−アミノ基の選択的アシル化はε−アミノ基が十分
に脱プロトン化するために、水中でのｐＫａが１０．７５以上に相当する塩基性
を有する塩基の存在下で行なう。すなわち、該塩基は少なくともトリエチルアミ
ンと同じくらい強くなければいけない。該塩基はトリメチルグアニジン、ジイソ
プロピルエチルアミンまたはテトラブチルアンモニウムヒドロキシドが好ましい
。弱塩基を使用することにより、α−アミノ基のアシル化が生じる。

【００７１】溶媒の選択は重要ではないが、インスリンアナログおよび脂肪酸エステルの溶
解度に大きく依存する。溶媒は全て有機溶媒でなければいけない。一般的に許容
される有機溶媒はＤＭＳＯ、ＤＭＦなどを含む。水性溶媒および水性溶媒と有機
溶媒との混合物もまた使用可能である。極性溶媒の選択は反応試薬の溶解度によ
ってのみ制限される。ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アセトニトリルと水、アセトンと水、
エタノールと水、イソプロピルアルコールと水、イソプロピルアルコール、エタ
ノールと水、およびエタノールとプロパノールと水が好ましい溶媒である。溶媒
はアセトニトリルおよび水が好ましく、５０％のアセトニトリルが最も好ましい
。当業者は他の極性溶媒も使用可能であると認めるであろう。

【００７２】一般的に、活性化脂肪酸エステルがモル過剰量であることが好ましい。反応は
、エステルの約１〜４モル当量で行ない、約１〜２モル当量であることが好まし
い。当業者は、非常に高レベルの活性化エステル、ジ−またはトリ−アシル化さ
れた生成物を有意な量で得るであろうと認めるであろう。

【００７３】反応温度は重要ではない。反応は摂氏２０〜４０℃で行ない、一般的に約１５
分〜約２４時間で完結する。

【００７４】アシル化の後、生成物を標準的な方法（例えば、逆相クロマトグラフィーまた
は疎水性クロマトグラフィー）によって精製する。その後、生成物を標準的な方
法（例えば、凍結乾燥または結晶化）によって回収する。

【００７５】本発明の組成物および製剤の製造モノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログおよびモノアシル化され
たヒトインスリンアナログは、＋２の酸化状態の金属をモノアシル化されたヒト
インスリンアナログまたは該アナログの医薬的に許容し得る塩と接触させ、該混
合物にフェノール誘導体および場合により等張化剤を加え、そしてｐＨを約７．
９より大きくなるように調節することによって、単分散性６量体の会合体を含有
する組成物に変換されることを見出した。

【００７６】アシル化されたモノマーヒトインスリンアナログおよびアシル化されたヒトイ
ンスリンアナログの単分散性６量体の会合体を含有する組成物および製剤を製造
しようとする初期の試みは、失敗した。それら初期の試みにおいては、約３．６
ｍｇ／ｍＬの濃度を得るように、アシル化されたモノマーヒトインスリンアナロ
グ溶液を、ｐＨが２．５の酸性水溶液中にアシル化されたインスリンアナログを
溶解することによって製造しようとした。次いで、アシル化されたヒトインスリ
ンアナログの６モル当り、２．０〜２．５モルの範囲の量の酸化亜鉛を加えた。
得られた溶液のｐＨを、水酸化ナトリウムなどの塩基を加えることによって、約
７．５に調節した。次いで、その一部（約１．０〜２．０ｍＬ）をとりだし、そ
のものをバイアルに加え、次いで凍結乾燥して粉末を得た。次いで、ｐＨが約７
．５の希釈液（このものは、１６ｍｇ／ｍＬの等張化剤（例えば、グリセリン）
、５ｍｇ／ｍＬのフェノール誘導体（例えば、フェノール）および緩衝剤（例え
ば、トリス（１０ｍＭ）またはリン酸水素二ナトリウム・７水和物（７ｍＭ）を
含有する））を、該凍結乾燥した粉末を含有するバイアルに加えた。沈降速度実
験を行ない、その結果は溶液が会合の観点で不均一であることを示した。言いか
えれば、単分散性６量体の会合組成物は存在しなった。従って、通常の方法では
単分散性６量体の会合組成物および製剤を得ることはできず、該結果は、アシル
化されたヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会合体を得ることが不可能
であることを示した。驚くべきことに且つ予想しないことに、ｐＨをシフトさせ
ることにより劇的に異なる結果が得られ、目的の単分散性６量体の会合体の組成
物および製剤を得ることを見出した。

【００７７】約７．９より大きいｐＨでは、アシル化されたモノマーヒトインスリンアナロ
グおよびアシル化されたヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会合体を含
有する組成物および製剤の製造を達成することができることを発見した。本発明
の組成物および製剤にとって好ましいｐＨの範囲は、約７．９〜約８．３である
。より好ましいｐＨの範囲は約７．９〜約８．０である。別の好ましいｐＨの範
囲は、約７．９〜約８．４である。

【００７８】金属イオンおよびモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログまたは
モノアシル化されたヒトインスリンアナログを含有する溶液は、該アナログを酸
性水溶液中に溶解し、次いでモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナロ
グの６モル当り、２〜２．５モルの金属を加えることによって調製する。別の好
ましい態様では、モノアシル化されたヒトインスリンアナログの６モル当り、２
．５〜３モルの金属イオンを加える。アナローグを溶解するのに使用する水溶液
のｐＨは、約２．０〜約３．０の範囲である。該アナローグを溶解するのに使用
する水溶液のｐＨは約２．５であることがより好ましい。

【００７９】金属イオン（＋２の酸化状態の金属であることが好ましく、亜鉛またはコバル
トが好ましく、亜鉛が最も好ましい）を、様々な金属種の形態でモノアシル化さ
れたモノマーヒトインスリンアナログまたはモノアシル化されたヒトインスリン
アナログを溶解するのに加える。例えば、亜鉛は酸化亜鉛、硝酸亜鉛、リン酸亜
鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛および硫酸亜鉛が
好ましい。当業者は本発明の製法において使用することができる多数の別の金属
塩が存在することを認めるであろう。しかしながら、金属種の特定の塩形態が特
に関連するわけではないが、しかしながら、使用する塩は医薬的に許容されるべ
きである。亜鉛は酸化亜鉛の形態で加えることが好ましい。金属の添加が完結す
ると、通常、塩基（例えば、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定しな
い）を加えることによって、得られた溶液のｐＨを約７．５に調節する。当業者
は、この開始溶液が、単分散性６量体の会合体であるモノアシル化されたモノマ
ーヒトインスリンアナログまたはモノアシル化されたヒトインスリンアナログの
生成後に有害な影響を与えない様々な他のｐＨを有し得ると認めるであろう。

【００８０】溶媒の除去は必要でないが、金属イオンおよびモノアシル化されたモノマーヒ
トインスリンアナログもしくはモノアシル化されたヒトインスリンアナログを含
有する溶液を凍結乾燥して粉末を得て、このものを適当な希釈溶液を用いて再構
成することが好ましい。用語「希釈溶液」とは、凍結乾燥した粉末を溶解するた
めにその凍結乾燥した粉末に加える溶液を言う。凍結乾燥した粉末を希釈剤を用
いて溶解する方法は、「再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」と呼ばれる
。

【００８１】希釈溶液は、様々な他の物質（例えば、等張化剤が挙げられるが、これらに限
定しない）が存在してもよいが、一般にはフェノール誘導体を含む。希釈溶液は
、フェノール誘導体、緩衝剤および等張化剤を含むことが好ましい。該希釈溶液
は、グリセリン、フェノール誘導体、および緩衝剤（このものは、トリス、リン
酸ナトリウム、グリシルグリシンおよびクエン酸塩から選ばれることが好ましい
）を含むことがより好ましい。該希釈溶液のｐＨはかなり広範囲に及ぶことが可
能である。塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは当業者に知
られる他の塩基）はｐＨを上方へ調節するのに使用することができ、また酸（例
えば、塩酸、臭化水素酸および当業者に知られる他の酸）はｐＨを下方に調節す
るのに加えることができるので、希釈溶液のｐＨは最終的な組成物または製剤の
ｐＨと等しい必要はない。

【００８２】凍結乾燥した粉末を希釈剤を用いて再構成した後、溶液のｐＨを塩基または酸
（上記の通り）を加えて調節することによって、ｐＨを約７．９より大きくする
。溶液のｐＨが既にモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログまたは
モノアシル化されたヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会合体を含有す
る組成物および製剤を製造するのに十分な範囲にあるならば、最終的なｐＨの調
節は必要ないであろう。

【００８３】本発明の組成物および製剤を別経路によって製造することが可能であることは
当業者にとって認められるであろう。例えば、酸性の水溶液に金属イオンを加え
、続いてモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログまたはモノアシル
化されたヒトインスリンアナログの誘導体を加えて溶解することができる。次い
で、フェノール誘導体を該試料に加え、次いでｐＨを調節して約７．９より大き
い最終値を得る。その上、様々な成分の濃度を変え、且つ本発明の組成物および
製剤に更なる物質を加えることができることを当業者は認めるであろう。

【００８４】本発明の組成物および医薬製剤は、単分散性６量体の会合状態であるアシル化
されたモノマーヒトインスリンアナログまたはアシル化されたヒトインスリンア
ナログを含む。該アシル化されたモノマーヒトインスリンアナログは、配列番号
２の配列を有するポリペプチドに適当に架橋させた配列番号１の配列を有するポ
リペプチドを含む。他のアシル化されたヒトインスリンアナログ（例えば、アシ
ル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリン）は特に有用であり、本発明の医薬製
剤の製造において使用される。

【００８５】本発明の組成物および医薬製剤は、更にフェノール誘導体および金属イオンを
含み、そしてｐＨは約７．９より大きい。該組成物および製剤のｐＨは約７．９
〜約８．３の範囲であることが好ましいが、該ｐＨは約７．９〜約８．０の範囲
であることが最も好ましい。加えて、ｐＨ値が約８．４である製剤がアシル化さ
れたモノマーヒトインスリンアナログおよびアシル化されたヒトインスリンアナ
ログの単分散性６量体の会合体を製造するのに有用であることも見出した。従っ
て、約７．９より大きく、約８．４以下の範囲のｐＨも好ましい。組成物および
医薬製剤の金属イオンは＋２の酸化状態が好ましく、コバルトまたは亜鉛が好ま
しい。該金属イオンは＋２の酸化状態の亜鉛が最も好ましい。

【００８６】上記の通り、本発明の組成物および医薬製剤は他の成分（例えば緩衝剤、他の
塩および炭水化物などの等張化剤を含むが、これらに限定されない）を含んでも
よい。好ましいモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログおよびモノ
アシル化されたヒトインスリンアナログは、Ｂ２８−Ｎ^ε−パルミトイル−Ｌｙ
ｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９、Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２ ^９、Ｂ２８−Ｎ^ε−ヘキサノイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９、Ｂ２８−Ｎ^ε−
オクタノイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９、Ｂ２９−Ｎ^ε−パルミトイル−Ａｓ
ｐ^Ｂ２８ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−ミリストイル−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトイン
スリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−ヘキサノイル−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリン、Ｂ２９−
Ｎ^ε−オクタノイル−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−ミリストイ
ル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−パルミトイル−デス（Ｂ３
０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−オクタノイル−デス（Ｂ３０）ヒトインス
リンおよびＢ２９−Ｎ^ε−ヘキサノイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリンを含む
。

【００８７】本発明の医薬製剤は液体状態であることが好ましい。それらは有機溶媒（例え
ばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ｉ−プ
ロパノール、および他の同様な１級および２級のアルコール）を本質的に、また
は実質的に有しない水溶液であることがより好ましい。従って、好ましい製剤は
これらのアルコールを２パーセントより少なく含むことがより好ましく、または
１％よりも少なく含むことがより好ましい。該製剤は、濁りを生じたり、または
モノアシル化ヒトインスリンアナログもしくはモノアシル化されたモノマーヒト
インスリンアナログの沈殿物を生成し得るような他の溶媒を実質的に完全に含有
しないことが好ましい。本発明の製剤は沈降した物質がないことが好ましく、あ
るいは沈降したモノアシル化されたヒトインスインアナログもしくはモノアシル
化されたモノマーヒトインスリンアナログがないことがより好ましい。従って、
より好ましい組成物または製剤は、溶液から沈降したモノアシル化されたヒトイ
ンスリンアナログまたはモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログを
２％より少なく有するものであり、１％より少ないことがより好ましく、最も好
ましい組成物および製剤は溶液中に全てのタンパク質を有する。したがって、本
発明に記載の好ましい組成物および製剤はアシル化されたインスリンアナログの
沈降物を生じるであろういずれの物質もない。好ましい組成物および製剤は透明
の溶液であり、外見上は濁っていないことが最も好ましい。いくつかの有機溶媒
（例えば、上記に列挙した１級および２級アルコール）を添加することにより、
濁った溶液が生じ得る。

【００８８】本発明の組成物および製剤は別の成分を含有し得ると当業者は認めるであろう
。例えば、多数の塩（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）を有害な影
響を与えずに、該組成物および製剤に加えることができる。上記の通り、本発明
の医薬組成物中に１５０ｍＭより少ない濃度で存在する場合には、塩化ナトリウ
ムを等張化剤として使用することができる。

【００８９】以下の実施例および製造例は、本発明のアシル化されたモノマーヒトインスリ
ンアナログまたはアシル化されたヒトインスリンアナログの単分散性６量体の会
合体の組成物および製剤の製造法について更に例示する目的で単に提供するのみ
である。本発明の範囲は、単に以下の例からなるものと解釈すべきものではない
。

【００９０】製造例および分析例実施例１凍結乾燥したＺｎ／Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９イ
ンスリンアナログの試料バイアルの調製Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９の凍結乾燥試料は、
Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９をｐＨが約２．５の減
菌した水に溶解することによって調製し、約３．６ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。次
いで、モノアシル化されたモノマーインスリンアナログの６モル当り、約２〜約
２．５モルの範囲の量の酸化亜鉛を該溶解したアシル化されたモノマーインスリ
ンアナログに加えた。混合した後、水酸化ナトリウムを加えることによって、溶
液のｐＨを７．５に調節した。次いで、一部（２．０ｍＬ）をバイアルに注入し
、将来の使用のために凍結乾燥した。

【００９１】実施例２異なるｐＨのトリス緩衝剤を有する、Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２ ^８Ｐｒｏ^Ｂ２９インスリンアナログ製剤の製造Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９（６．８ｍｇ）およ
びモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログの６モル当り２モルのＺ
ｎ^２＋の凍結乾燥した粉末を含有するバイアルに、トリスの希釈水溶液（１０ｍ
Ｍ、１．９ｍＬ、これは５ｍｇ／ｍＬのフェノールおよび１６ｍｇ／ｍＬのグリ
セリンを含有する）を加えた。再構成した後、ｐＨを調べて７．５８と決定した
。次いで、塩酸を加えることによって、ｐＨを７．５２に下方調節した。その再
構成した物質の少量（０．５ｍＬ）を保存し、残りの溶液を第２のバイアルに入
れ、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７．９６とした。

【００９２】実施例３リン酸緩衝剤を有するｐＨが７．５のＢ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２ ^８Ｐｒｏ^Ｂ２９インスリンアナログ製剤の製造Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９（６．８ｍｇ）およ
びモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログの６モル当り２モルのＺ
ｎ^２＋の凍結乾燥した粉末を含有するバイアルに、５ｍｇ／ｍＬのフェノールお
よび１６ｍｇ／ｍＬのグリセリンを含有するリン酸水素二ナトリウム・７水和物
の希釈水溶液（７ｍＭ、１．９ｍＬ）を加えた。再構成した後、混合物のｐＨを
調べて、７．５と決定した。

【００９３】実施例４リン酸緩衝剤を有するｐＨが７．９５のＢ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９インスリンアナログ製剤の製造Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９（６．８ｍｇ）およ
びモノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログの６モル当り２モルのＺ
ｎ^２＋の凍結乾燥した粉末を含有するバイアルに、５ｍｇ／ｍＬのフェノールお
よび１６ｍｇ／ｍＬのグリセリンを含有するリン酸水素二ナトリウム・７水和物
の希釈溶液（７ｍＭ、１．９ｍＬ）を加えた。再構成した後、混合物のｐＨを調
べて、７．８５と決定した。水酸化ナトリウムを加えて、溶液のｐＨを７．９５
とした。

【００９４】Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９についての沈降速度実験沈降速度実験はベックマンＸＬＩ分析用超遠心分離機を用いて行なった。。試
料および希釈液（約０．４２ｍＬ）をサファイアのウィンドウ（sapphire windo
w）を備えた１２ｍｍのカラムセルにロードした。同量の試料および希釈液は、
標準の側面および試料の側面の両方のメニスカスがマッチすることを保証する。
その試料を、２２℃で５０,０００ｒｐｍの回転速度で沈降させた。試料が沈降
するにつれて、ラジアル濃度勾配を形成した。界面の動きの速度を干渉顕微鏡に
よって追跡した。ラジアルスキャンのデータの組を１分間隔で収集した。界面全
体についてアプローチすることによって速度データについて分析し、ｇ（ｓ^＊）
対ｓ^＊のプロフィール（ここで、ｓ^＊は沈降係数であり、ｇ（ｓ^＊）は分布関数
である）を得た。［Ｓｔａｆｆｏｒｄ，ＩＩＩ，Ｗ．Ｆ．によるＡｎａｌｙｔｉ
ｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０３，２９５−３０１（１９９２）を参
照］。ｇ（ｓ^＊）プロフィールは、分析する溶液中に存在する異なった種の水力
学的なサイズの分布を示す。理想的な単分散性系の場合は、ｇ（ｓ^＊）分布は非
常によい近似でガウス分布である。従って、巨大分子の拡散係数は以下の式によ
るｇ（ｓ^＊）プロフィールの標準偏差に関連する。

【化３】Ｄ＝（σＲ_ｍω^２ｔ）^２／２ｔここで、Ｄは拡散係数（単位はｃｍ^２／秒）である。 σはガウス分布に適合させることによって決定したｇ（ｓ^＊）プロフィールの
標準偏差（ピーク幅）である。Ｒ_ｍはメニスカスの半径（単位はｃｍ）である。 ωは回転速度（単位はラジアン／秒）である。ｔはデータを分析するのに使用する全てのスキャンの調和平均時間（単位は秒
）である。

【００９５】拡散係数を算出した後、種の分子量を以下のスベドベリ式を用いて算出した。

【化４】ここで、ｓは沈降係数（ピーク位）（単位は秒）である。Ｄは算出した拡散係数（単位はｃｍ^２／秒）である。Ｍは分子量（単位はｇ／モル）である。

【化５】は、モノアシル化されたモノマーヒトインスリンアナログまたはモノアシル
化されたヒトインスリンアナログの部分比容（単位はｍＬ／ｇ）である（本発明
の分析の場合には、０．７３ｍＬ／ｇ）。 ρは溶媒の密度（単位はｇ／ｍＬ）である。（本発明の分析の場合には、密度
＝１ｇ／ｍＬである）。Ｒは気体定数（８．３１×１０^７ｅｒｇ／モル／Ｋ（ケルビン））である。そ
して、Ｔは絶対温度（単位はケルビン）である。

【００９６】図１は、アシル化されたモノマーヒトインスリンアナログの６モル当り２モル
のＺｎ^２＋、グリセリンおよびフェノールを含有するＢ２８−Ｎ^ε−ミリストイ
ル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９製剤についてのベックマンＸＬＩ分析用超遠心分
離機で得られた沈降係数分布図である。該製剤をｐＨ７．９５でリン酸水素二ナ
トリウムを用いて緩衝化し（△）；ｐＨ７．９６でトリスを用いて緩衝化し（□
）；ｐＨ７．５でリン酸水素二ナトリウムを用いて緩衝化し（◇）；そしてｐＨ
７．５２でトリスを用いて緩衝化した（マーカーなし）。該図は、アシル化され
たヒトインスリンアナログの会合特性に及ぼすｐＨの効果を示す。ｐＨが約７．
５の場合では、沈降速度分布は不均一な製剤を示す。直接的に対比すると、ｐＨ
が約７．９〜８．０の間では、沈降速度分布は、モノアシル化されたモノマーヒ
トインスリンアナログの単分散性６量体の会合体を示す。該図はまた、２つの異
なる緩衝系における単分散性６量体の会合状態にあるアシル化されたモノマーヒ
トインスリンアナログを含有する製剤の生成を示す。単分散性６量体の会合体製
剤についての沈降速度分布から算出した分子量を表２に示し、これは単分散性６
量体の会合体を示唆する。Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ ^２９ヒトインスリンアナログの分子量は、６，０１８ｇ／モルであり、Ｂ２８−
Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンアナログの６量
体の理論的な分子量は、３６，１０８ｇ／モルである。表２に示す算出した分子
量は、６量体の会合体と一致する。表２Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９の単分散性６量
体の会合体製剤についての沈降速度実験から得られるデータ

【表３】

【００９７】上記の沈降速度係数実験から収集したデータをソフトウェアＤＣＤＴプラスバ
ージョン１．０５（ＡｌｌｉａｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から商業的に入手可能）を用いても分析し
た。値を上記の通り手計算によって算出することができるが、ソフトウェアのア
ルゴリズムによって、より効率良く値を得ることができる。該アルゴリズムは沈
降係数分布関数を算出し、これに適合させて、濃度、沈降係数および拡散係数ま
たは分子量を得る。この分析法は典型的に拡散係数を過小評価するので、その結
果、分子量は数パーセントだけ過大評価される。ＤＣＤＴプラスバージョン１．
０５ソフトウェアを用いてＢ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２９ＰｒｏＢ ^２９ヒトインスリンアナログの場合の値を算出し、その値を上記の方法によって
得られた値と比較した。ｐＨが７．５の場合には、ｇ（ｓ^＊）分布関数は、大き
な沈降係数を有する不均一な凝集現象を示した。一方で、ｐＨが８．０の場合に
は、沈降係数が３．３スベドベリであり、分散係数が８．８フィックであるか、
または分子量が３４，４００ｇ／モルであるモデルを得て、このものはデータの
９６％以上を示すことが分かった。同一の溶媒密度（１．０ｇ／ｍＬ）および溶
質の部分比容（０．７３ｇ／ｍＬ）を用いて、分子量を算出した。その結果は、
上記の式を用いて手で算出した値と一致する。従って、ＤＣＤＴプラスバージョ
ン１．０５ソフトウェアは、他の実施例の溶液についてのデータを分析するのに
使用した。

【００９８】各実験におけるアシル化されたモノマーインスリンアナログまたはアシル化さ
れたインスリンアナログの会合状態を決定するのに使用する標準的な方法は、以
下の工程によって記載される。第１に、上記の沈降速度実験からのデータを用い
て、沈降分布関数を算出する。次いで、該沈降分布関数を１つのガウス関数に適
合させた。残りのプロットの検査（inspetion）によって決定される通り、１つ
のガウス関数がデータと十分に適合する場合には、次いで会合状態を測定した。
良く適合する場合には、該理論値の分子量は約３２，０００ｇ／モル〜約４０,
０００ｇ／モルであると算出され、このことは６量体が存在することを示す。該
データを１つのガウス関数に十分に適合させるには、試料は実質的に均一でなけ
ればいけない。上記の通り、単分散性６量体の会合体は沈降係数分布プロフィー
ルにおいて１本のはっきりした分布を示し、これはアシル化されたモノマーヒト
インスリンアナログまたはアシル化されたインスロンアナログの少なくとも約８
４％が単分散性６量体の会合状態であることを示している。

【００９９】１つのガウス関数を用いて得られる適合が、残りのプロットによって判断して
、良くない場合には、次いでそのデータを少なくとも２つの異なる種が溶液中に
存在すると仮定する２つのガウス関数を用いて適合させた。異なる種からの相対
的な寄与は濃度比によって示され、これは曲線下の各々の面積によって算出され
る。データが２つのガウス関数を用いて十分に適合しない場合には、系の不均一
性のレベルは溶液中に優位な種がないレベルであると決定した。１つのガウス関
数がデータに適合するが、分布が非常に広い場合には、このことは系中の別の不
均一性を示す。次いで、曲線下の面積を６量体の母集団を与える仮説的なガウス
分布と比較する。その２つの比は、存在し得る６量体のパーセンテージを示して
いる。

【０１００】静的光散乱実験Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９の会合状態を静的光
散乱実験を用いて分析して、６量体の生成を確認した。Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリスト
イル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９製剤は、上に記載の通り製造した凍結乾燥した
バイアルを、希釈溶液（これは、７ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１６ｍｇ／
ｍＬのグリセリンおよび５ｍｇ／ｍＬのフェノールを含有する）を用いて再構成
し、次いで塩酸または水酸化ナトリウムを加えることによって、実験のための目
的レベルにまでｐＨを調節することによって、濃度が３．６ｍｇ／ｍＬで製造し
た。最後に、製造した溶液を０．２２ミクロンＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ低タンパク質
結合フィルターを通してろ過して、実験のための試料を得た。

【０１０１】静的光散乱測定は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ装置９０００ＡＴオートコリレータ
ーおよびゴニオメーターを用いて行った。全ての実験は散乱角が６の１ｍｍピン
ホールを用いて行い、４８８ｎｍでＬｅｘｅｌモデル３５００アルゴンイオンレ
ーザーを用いて４回繰り返した。実験の間、ＨａａｋｅＦ３温度浴を用いて温度
を２５℃に保ち、散乱信号をレイリー比（Ｒ_θ）が公知の値である、０．２ミク
ロンでろ過したトルエンを用いて９０°で較正した。次いで、重量平均分子量を
、当業者にとって公知の標準式を用いて算出した［カントル（Ｃａｎｔｏｒ），
Ｃ．Ｒ．およびシメル（Ｓｈｉｍｍｅｌ），Ｐ．Ｒ．によるＢＩＯＰＨＹＳＩＣ
ＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，
ＮｅｗＹｏｒｋ，８３８−８４３（１９８０）を参照］。該分析において、０
．１８３ｍＬ／ｇの値（これは当業者にとって公知の数字である）は、タンパク
質の濃度の変化当りの屈折率の変化を反映するのに使用する。加えて、１．３３
３の値を水の屈折率として使用する。重量平均分子量（Ｍｗ）を多数のｐＨレベ
ルで算出し、表３に示す。ｐＨが８．０および８．３でのこれらの研究から得ら
れる重量平均分子量は、６量体の会合体の生成を予想した値と一致する。表３様々なｐＨレベルでのＢ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ ^Ｂ２９溶液についての静的光散乱実験から算出した分子量

【表４】

【０１０２】実施例５リン酸緩衝剤を有するｐＨが７．５および８．０のＢ２８−Ｎ^ε−オクタノイル
−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリンアナログ製剤の製造減菌した水（８０ｍＬ）を含有するバイアルに、合成グリセリン（３．２ｍｇ
）および液化したフェノール（１．１３ｇ）およびリン酸水素二ナトリウム（３
６５ｍｇ）を加えた。溶解後、減菌した水を加えて混合物の最終重量を１００ｇ
とした。溶液のｐＨを測定すると、８．０であることが分かった。

【０１０３】Ｂ２９−Ｎ^ε−Ｎ−オクタノイル−Ａｓｐ^Ｂ２８−ヒトインスリンアナログ（
４ｍｇ）を含有する２番目のバイアルに、０．１Ｎ塩酸（０．５ｍＬ）を加えた
。タンパク質を溶解した後、ＺｎＯストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１７．３μＬ
）を加えた。最後に、１番目のバイアルからの溶液（０．５ｍＬ）を加えて、ｐ
Ｈを１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調節して、最終的な値を７．５とした。

【０１０４】３番目のバイアルに、ｐＨを７．５に調節した２番目のバイアルの溶液（０．
５ｍＬ）を加えた。次いで、ｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムを加えることによって
、最終的な値を８．０とした。

【０１０５】２番目のバイアル中のｐＨが７．５の溶液（約０．４５ｍＬ）の試料を遠心分
離機のセルに加えて、ベックマンＸＬＩ超遠心分離機を用いて遠心分離（６０，
０００ｒｐｍで２２℃）を作動させた。その実験を３番目のバイアル中のｐＨが
８．０の溶液（約０．４５ｍＬ）を用いて繰り返した。データを、ＤＣＤＴプラ
スベージョン１．０５によって上記の通り分析した。１つのガウス分布はデータ
と十分に適合せず、このことは系が完全に１つの均一な母集団の種からなるもの
ではないことを示す。従って、１つのガウス分布を用いるその適合結果は、系中
のある程度の不均一性を示唆している。データを２つのガウス分布関数を用いて
適合させた。ｐＨが７．５である溶液については、沈降係数が３．０スベドベリ
であり、分子量が２７，７００ｇ／モルであるモデルが、データの９２％以上を
十分に示していることが分かった。算出された低分子量は、ｐＨが７．５の溶液
中では６量体が優位な種ではないことを示す。ｐＨが８．０の溶液については、
沈降係数が３．０スベドベリであり、分子量が３３，２００ｇ／モルであるモデ
ルがデータの８５％を適当に表現しており、このことは溶液中で６量体が優位な
種であることを示していることが分かった。残りの１５％は６量体よりも小さい
種に相当する。従って、ｐＨを７．５〜８．０にシフトすることによって、溶液
状態を実質的に６量体の会合状態に変換すること（すなわち少なくとも８５％の
６量体であること）が可能である。

【０１０６】実施例６リン酸緩衝剤を有するｐＨが７．４および８．０のＢ２８−Ｎ^ε−オクタノイル
−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンアナログ製剤の製造減菌した水（約８０ｍＬ）を含有するバイアルに、合成グリセリン（３．２ｇ
）、液化フェノール（１．０３ｇ）およびリン酸水素二ナトリウム（約３６５ｍ
ｇ）を加えた。溶解後、減菌した水を加えて、混合物の最終的な重量を１００ｇ
とした。溶液のｐＨを測定して、８．０であることが分かった。

【０１０７】２番目のバイアルに、Ｂ２８−Ｎ^ε−オクタノイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２ ^９ヒトインスリンアナログ（８．３ｍｇ）および０．０１Ｎ塩酸（１ｍＬ）を加
えた。次いで、酸化亜鉛ストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ、３５μＬ）を２番目のバ
イアルに加えた。次に、１番目のバイアルからの溶液（１ｍＬ）を２番目のバイ
アルに加えて、ｐＨを測定すると約４．４であった。次いで、ｐＨを１Ｎ水酸化
ナトリウムを用いて調節して、最終的な値を７．４とした。ｐＨが７．４の溶液
（１ｍＬ）を３番目のバイアルにピペットとして、ｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム
を加えて調節して最終的な値を８．０とした。

【０１０８】２番目のバイアル中のｐＨが７．４の溶液（約０．４５ｍＬ）試料を遠心分離
機のセルに加えて、ベックマンＸＬＩ分析用遠心分離機を用いて６０，０００ｒ
ｐｍ、２２℃で作動させた。該実験は、３番目のバイアル中でｐＨが８．０の溶
液（約０，４５ｍＬ）を用いて繰り返した。該データを、上記の通り、ＤＣＤＴ
プラスバージョン１．０５によって分析した。ｐＨが７．４の溶液については、
残りのプロットによって判断される通り、１種または２種のモデルのどちらも該
データに十分に適合せず、信頼性のある分子量測定値を全く得ることができず、
このことは系中の有意な量の不均一性を示す。

【０１０９】一方で、ｐＨが８．０の溶液からのデータと適合させようとする試みにより、
適合パラメーターが２．９スベドベリ単位であり、そして分子量が３５，３００
ｇ／モルである適合を得た。ｐＨが８．０の溶液についてのデータの適合は、更
に精密化して沈降係数が３．０スベドベリであり、分子量が４０,８００ｇ／モ
ルであるモデルを得ることができた。このことは９４％以上のデータが溶液中で
６量体種が優位な種であることを示していることが分かった。ｐＨ７．４である
場合にも少量の６量体が存在し得るが、該研究はこのものがこのｐＨで優位な種
ではないことを示している。しかしながら、ｐＨが８．０の場合では、溶液状態
は実質的に６量体の会合状態からなる。

【０１１０】実施例７リン酸緩衝液を有するｐＨが７．４，７．９７および８．４のＢ２９−Ｎ^ε−ミ
リストイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリン製剤の製造減菌した水（約８０ｍＬ）を含有する１番目のバイアルに、合成グリセリン（
約３．５ｍｇ）および液化フェノール（１．１３ｇ）およびリン酸水素二ナトリ
ウム（３７７ｍｇ）を加えた。溶解後、減菌した水を加えてその混合物について
１００ｇの最終的な重量を得た。溶液のｐＨを測定し、８．０であることが分か
った。

【０１１１】Ｂ２９−Ｎ^ε−ミリストイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリン（４．２ｍｇ）
を含有する２番目のバイアルに、０．１Ｎ塩酸（０．５ｍｌ）を加えた。Ｂ２９
−Ｎ^ε−ミリストイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリン中のアシル化されたタン
パク質の含有量は約８０重量％であり、６６重量％のタンパク質が正確な位置で
アシル化されていた。タンパク質を溶解した後、ＺｎＯストック溶液（１ｍｇ／
ｍＬ、１７．３μＬ）を加えた。最後に、１番目のバイアルからの溶液（０．５
ｍＬ）を加え、ｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調節して最終的な値を７．
５とした。

【０１１２】３番目のバイアルに、ｐＨを７．５に調節した２番目のバイアルからの溶液（
約０．５ｍＬ）を加えた。次いで、ｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムを加えることに
よって調節して最終的な値を約８．４とした。

【０１１３】Ｂ２９−Ｎ^ε−ミリストイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリン（１．８ｍｇ）
を１Ｎ塩酸（０．２５ｍＬ）に溶解した。酸化亜鉛（１ｍｇ／ｍＬ、９μＬ）ス
トク溶液を該インスリン溶液に加えて、次いで希釈液（これは、１４ｍＭのリン
酸水素二ナトリウム、３２ｍｇ／ｍＬのグリセリンおよび１０ｍｇ／ｍＬのフェ
ノールを含む）（０．２５ｍＬ）を加えた。次いで、ｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウ
ムを用いて調節して７．９７の値とした。

【０１１４】２番目のバイアル中のｐＨが７．５の溶液（約０．４５ｍＬ）の試料を遠心分
離機のセルに加えて、ベックマンＸＬＩ分析用遠心分離機を用いて６０，０００
ｒｐｍ、２２℃で作動させた。該実験は、３番目のバイアル中でｐＨが８．４の
溶液（約０．４５ｍＬ）を用いて繰り返した。該実験は、ｐＨが７．９７の溶液
（約０．４５ｍＬ）を用いても繰り返した。ｇ（ｓ＊）分布関数は、３つの異な
るｐＨで非常に異なる。ピークの位置は、ｐＨがより低いとより高い値にシフト
する。加えて、分布関数はより低いｐＨでは非常にブロードとなり、このことは
系の不均一性の増大を示している。該データを１つのガウス分布関数に適合させ
ることにより、許容できる結果が得られ、このことは沈降分布が１つのガウス分
布を用いて十分に示されていると考えられる。該適合させたパラメーターについ
ては、以下の表および図２に示す。それらはピークが狭く、ｐＨが７．５から増
加すると、より低い値にシフトすることを例示する。表４様々なｐＨでのＢ２９−Ｎε−ミリストイル−デス（Ｂ３０）ヒトインス
リン溶液についての沈降速度実験から得られたデータ

【表５】

【０１１５】ｐＨが７．５の場合のデータは、系中の均一性のまたは中間体の存在を示す。
沈降係数が約５．７スべドベリである分子が、拡散係数が２２．６フィックであ
るような移動度を有することは非常にありそうもない。より高いｐＨにシフトす
ることにより、系の不均一性は上述のように顕著に減少する。ｐＨを約８．０に
シフトすることによって、アシル化されたインスリンアナログの大部分（９２％
以上と見積もられる）は、観察された沈降プロフィールの面積を理想の仮説の６
量体の母群分布を示す曲線と比較することによって決定して、６量体の会合状態
であった。ｐＨを８．４にシフトすることによって、適合結果は、より多くのア
シル化されたインスリンが６量体の会合状態であり、不均一性が有意に減少する
ことを示した。

【０１１６】本発明は、その精神またはその特定の特性を逸脱することなく、他のある形で
使用することができる。上記の実施態様は全ての面において単に例示するもので
あり、限定するものではないと解釈すべきである。従って、本発明の範囲は、上
記の記載によるよりもむしろ特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲
の均等物の意味およびその範囲は、本範囲内にあると許容される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２ ^９ヒトインスリンアナログ製剤（このものは、亜鉛およびフェノールを含有する
）についてのベックマンＸＬＩ分析用超遠心分離機で得られた沈降係数分布プロ
フィールであって、該製剤をｐＨ７．９５で７ｍＭのリン酸水素二ナトリウムで
緩衝化した場合（△）；ｐＨ７．９６で１０ｍＭのトリスで緩衝化した場合（□
）；ｐＨ７．５で７ｍＭのリン酸水素二ナトリウムで緩衝化した場合（◇）；お
よびｐＨ７．５２で１０ｍＭのトリスで緩衝化した場合（マーカーなし）である
。該図は、アシル化されたヒトインスリンアナログの会合特性に及ぼすｐＨの影
響を示す。該図は２つの異なる緩衝剤の系中で、アシル化されたイトインスリン
アナログを含有する製剤が単分散性６量体の会合状態を形成することをも示す。

【図２】図２は、Ｂ２９−Ｎ^ε−ミリストイル−デス（Ｂ３０）ヒトイン
スリンアナログ製剤（このものは、亜鉛およびフェノールを含有する）について
のベックマンＸＬＩ分析用超遠心分離機で得られた沈降係数分布プロフィールで
あって、該製剤をリン酸水素二ナトリウムでｐＨ７．５で緩衝化した場合（△）
；ｐＨ７．９７で緩衝化した場合（□）；およびｐＨ８．４で緩衝化した場合（
◇）である。該図は、アシル化されたヒトインスリンアナログの会合特性に及ぼ
すｐＨの影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/26 Ａ６１Ｋ 47/42 47/42 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｋ 37/26 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シュン・リアメリカ合衆国46268インディアナ州インディアナポリス、バンカスター・ドライブ 7620番 (72)発明者エリック・アラン・ワッツアメリカ合衆国46217インディアナ州インディアナポリス、ロックウッド・レイン 7332−エイ番Ｆターム(参考） 4C076 AA12 BB11 CC21 DD23D DD26Z DD37 DD38D DD39 DD41 DD43Z DD50Z DD67D EE30D EE38D EE41Z FF14 FF61 4C084 AA02 AA03 BA01 BA18 BA19 BA23 CA18 CA59 DB34 MA05 MA17 MA66 NA14 ZC352

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｐＨが約７．９より大きい水溶液を含有する医薬製剤であっ
て、該水溶液は（ａ）等張化剤、（ｂ）フェノール誘導体、（ｃ）１つ以上の亜鉛イオン、および（ｄ）モノアシル化されたヒトインスリンアナログまたは該モノアシル化された
ヒトインスリンアナログの医薬的に許容し得る塩を含有し、該モノアシル化され
たヒトインスリンアナログまたは該モノアシル化されたヒトインスリンアナログ
の医薬的に許容し得る塩は配列番号２のポリペプチドに適当に架橋させた配列番
号１のポリペプチドを含有し、それらの配列において配列番号１の２１位のＸａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙおよびＧｌｘからなる
群から選ばれ、配列番号２の３位のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｘからなる群から選
ばれ、配列番号２の２８位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａおよびアシ
ル化されたＬｙｓからなる群から選ばれ、配列番号２の２９位のＸａａは、Ｐｒｏおよびアシル化されたＬｙｓからなる
群から選ばれ、更に２８位または２９位はアシル化されたＬｙｓであるが、２８位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２９位はアシル化されたＬｙ
ｓでなく、そして２９位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２８位はアシル化されたＬｙ
ｓでない医薬製剤。
【請求項２】モノアシル化されたヒトインスリンアナログの６モル当り、
２．５〜３モルの亜鉛イオンが存在する、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】モノアシル化されたヒトインスリンアナログの６モル当り、
２〜３モルの亜鉛イオンが存在する、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項４】配列番号２の３位のＸａａがＡｓｎである、請求項１に記載
の医薬製剤。
【請求項５】配列番号１の２１位のＸａａがＡｓｎであり、配列番号２の
３位のＸａａがＡｓｎである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項６】モノアシル化されたヒトインスリンアナログは、アシル化さ
れたＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンである、請求項１に記載の医薬製
剤。
【請求項７】モノアシル化されたヒトインスリンアナログは、炭素数が６
〜２１のアシル基を含むモノアシル化されたヒトインスリンアナログである、請
求項１に記載の医薬製剤。
【請求項８】アシル基はミリストイル基およびパルミトイル基からなる群
から選ばれる、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】モノアシル化されたインスリンアナログは、Ｂ２８−Ｎ^ε−
パルミトイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９インスリンおよびＢ２８−Ｎ^ε−ミリ
ストイル−Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９インスリンからなる群から選ばれる、請求
項１に記載の医薬製剤。
【請求項１０】モノアシル化されたヒトインスリンアナログは、アシル化
されたＡｓｐ^Ｂ２８インスリンである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１１】モノアシル化されたヒトインスリンアナログは、Ｂ２９−
Ｎ^ε−パルミトイル−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリンおよびＢ２９−Ｎ^ε−ミリス
トイル−Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリンからなる群から選ばれる、請求項１０に記
載の医薬製剤。
【請求項１２】製剤のｐＨは７．９５、７．９６、８．０および８．３か
らなる群から選ばれる、請求項１の記載の医薬製剤。
【請求項１３】製剤のｐＨは約８．０である、請求項１に記載の医薬製剤
。
【請求項１４】製剤はｐＨが約７．９よりも大きく、約８．３よりも小さ
い、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１５】水溶液のｐＨが約７．９よりも大きく、約８．０よりも小
さい、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１６】更に緩衝剤を含有する、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１７】緩衝剤は、トリス(ヒドリキシメチル)アミノメタン、リン
酸ナトリウム、グリシルグリシン、クエン酸塩およびそれらの組み合わせからな
る群から選ばれる、請求項１６に記載の医薬製剤。
【請求項１８】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−
クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、フェニ
ルエタノール、フェノキシエタノール、メチルパラベンおよびそれらの組み合わ
せからなる群から選ばれる、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１９】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾールおよび
それらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項２０】等張化剤は、グリセリン、塩化ナトリウム、炭水化物およ
びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項２１】炭水化物は、スクロース、デキストロース、マンニトール
、トレハロースおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２０
に記載の医薬製剤。
【請求項２２】高血糖症を患っている患者の処置法であって、該患者に請
求項１に記載の医薬製剤の有効な量を投与することを含む処置法。
【請求項２３】医薬製剤の製造法であって、該方法は、（ａ）＋２の酸化状態の金属をモノアシル化されたインスリンアナログもしく
は該アナログの医薬的に許容し得る塩と接触させ、（ｂ）医薬製剤のｐＨを約７．９より大きくなるように調節し、（ｃ）フェノル誘導体および等張化剤を加えることを含む方法であって、該アナログは、配列番号２のポリペプチドに適当に架橋させた配列番号１のポ
リペプチドを含有し、それらの配列において配列番号１の２１位のＸａａはＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｙおよびＧｌｘからなる
群から選ばれ、配列番号２の３位のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｘからなる群から選
ばれ、配列番号２の２８位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａおよびアシ
ル化されたＬｙｓからなる群から選ばれ、配列番号２の２９位のＸａａは、Ｐｒｏおよびアシル化されたＬｙｓからなる
群から選ばれ、更に２８位または２９位はアシル化されたＬｙｓであるが、２８位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２９位はアシル化されたＬｙ
ｓでなく、そして２９位がアシル化されたＬｙｓである場合には、２８位はアシル化されたＬｙ
ｓでない医薬製剤。
【請求項２４】配列番号１の２１位のＸａａはＡｓｎである、請求項２３
に記載の方法。
【請求項２５】配列番号２の３位のＸａａはＡｓｎである、請求項２３に
記載の方法。
【請求項２６】配列番号１の２１位のＸａａはＡｓｎであり、配列番号２
の３位のＸａａはＡｓｎである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】金属は亜鉛である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−
クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、フェニ
ルエタノール、メチルパラベン、レゾルシノール、フェノキシエタノールおよび
それらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾールおよび
それらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】製剤に緩衝剤を加えることを更に含む、請求項２３に記載
の方法。
【請求項３１】緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、リン
酸ナトリウム、グリシルグリシン、クエン酸塩およびそれらの組み合わせからな
る群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】等張化剤は、グリセリン、塩化ナトリウム、炭水化物およ
びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】炭水化物は、スクロース、デキストロース、マンニトール
、トレハロースおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項３２
に記載の方法。
【請求項３４】工程（ａ）の金属／アナログ混合物を凍結乾燥することを
更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】ｐＨを約７．９より大きくて約８．３より小さい値に調節
する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】ｐＨを約７．９より大きくて約８．０より小さい値に調節
する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】ｐＨが約７．９より大きい水溶液を含有する医薬製剤であ
って、該製剤は（ａ）等張化剤、（ｂ）フェノール誘導体（ｃ）１つ以上の亜鉛イオンおよび（ｄ）モノアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンアナログまたは該モ
ノアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンアナログの医薬的に許容し得る
塩を含有する水溶液を含む、医薬製剤。
【請求項３８】モノアシル化されたヒトインスリンアナログの６モル当り
、２．５〜３モルの亜鉛イオンが存在する、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項３９】モノアシル化されたヒトインスリンアナログの６モル当り
、２〜３モルの亜鉛イオンが存在する、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項４０】水溶液のｐＨが約７．９〜約８．４である、請求項３７に
記載の医薬製剤。
【請求項４１】緩衝剤を更に含有する、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項４２】緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、リン
酸ナトリウム、グリシルグリシン、クエン酸塩およびそれらの組み合わせからな
る群から選ばれる、請求項４１に記載の医薬製剤。
【請求項４３】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−
クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、フェニ
ルエタノール、フェノキシエタノール、メチルパラベンおよびそれらの組み合わ
せからなる群から選ばれる、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項４４】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾールおよび
それらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項４３に記載の医薬製剤。
【請求項４５】等張化剤は、グリセリン、塩化ナトリウム、炭水化物およ
びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項４６】炭水化物は、スクロース、デキストロース、マンニトール
およびトレハロースおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項
４５に記載の医薬製剤。
【請求項４７】モノアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンアナロ
グは炭素数が６〜２１のアシル基を含む、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項４８】モノアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンアナロ
グは、Ｂ２９−Ｎ^ε−パルミトイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリンおよびＢ２
９−Ｎ^ε−ミリストイル−デス（Ｂ３０）ヒトインスリンからなる群から選ばれ
る、請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項４９】製剤のｐＨは７．９７〜８．４からなる群から選ばれる、
請求項３７に記載の医薬製剤。
【請求項５０】高血糖症を患っている患者の処置法であって、該方法はそ
の患者に請求項３７に記載の医薬製剤の有効な量を投与することを含む処置法。
【請求項５１】医薬製剤の製造法であって、該方法は（ａ）＋２の酸化状態の金属を、モノアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトイン
スリンアナログまたは該モノアシル化されたデス（Ｂ３０）ヒトインスリンアナ
ログの医薬的に許容し得る塩と接触させ、（ｂ）医薬製剤のｐＨを約７．９より大きく調節し、そして（ｃ）フェノール誘導体および等張化剤を加えることを含む製造法。
【請求項５２】金属は亜鉛である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−
クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、フェニ
ルエタノール、メチルパラベン、レゾルシノール、フェノキシエタノールおよび
それらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】フェノール誘導体は、フェノール、ｍ−クレゾールおよび
それらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】製剤に緩衝剤を加えることを更に含む、請求項５１に記載
の方法。
【請求項５６】緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、リン
酸ナトリウム、グリシルグリシン、クエン酸塩およびそれらの組み合わせからな
る群から選ばれる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】等張化剤は、グリセリン、塩化ナトリウム、炭水化物およ
びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】炭水化物は、スクロース、デキストロース、マンニトール
、トレハロースおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項５７
に記載の方法。
【請求項５９】ｐＨを約７．９〜約８．４の値に調節する、請求項５１に
記載の方法。