JP2002533473A - 微生物起源のヒアルロン酸分解酵素を含有する薬学的配合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、動脈の内壁でのアテローム性沈着物の結果として生じる血管性疾患において治療的に適用される注射用調製物として特に好適な薬学的配合物に関する。この注射用調製物は、細菌起源のヒアルロン酸リアーゼ、またはこの酵素から調製されたヒアルロン酸分解性フラグメントを含有する。細菌ヒアルロン酸リアーゼのヒアルロン酸分解性フラグメントもまた本発明の目的である。そのようなフラグメントは、特異的に分解するプロテアーゼでホロ酵素を処理することによって調製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 加齢とともに、あるいは病理学的状態の場合、疎水性プラークが、ヒトならび
に哺乳動物において動脈の内壁（脈管内膜）に沈着する。この疎水性プラークは
、動脈壁の硬化、病変、および血管内での新内膜の形成による内腔の縮小をもた
らす。不整脈、凝血塊の形成および血栓症、脳梗塞、脳血栓症、高血圧ならびに
血液供給の低下などの病理学的症状は、このような血管の変化と密接に関連して
いる。

【０００２】 本発明は、動脈内または静脈内で使用されたときに、プラークによって覆われ
ている脈管内膜の領域面積を減少させるか、あるいは血流に対する作用を低下さ
せる特性を有する薬学的組成物に関する。このような作用は、本発明の薬学的配
合物における完全な酵素（ホロ酵素）および／またはそのような酵素から作製す
ることができる新規な小さな酵素フラグメントの存在に密接に関連している。

【０００３】 提案されたホロ酵素はヒアルロン酸リアーゼであり、そのフラグメントもまた
ヒアルロン酸分解活性を有する。この活性は、特に、ヒアルロン酸の好ましい分
解をもたらす。 さらに、本発明は、特別な酵素的分解プロセスによって得られる新しい酵素フラ
グメントに関する。

【０００４】 ヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリンおよびヘパ
ラン硫酸とともにグリコサミノグリカンに属する。ヒアルロン酸を除いて、前記
のグリコサミノグリカンは硫酸基を含有する（硫酸化グリコサミノグリカンであ
る）。グリコサミノグリカンは、すべての脊椎動物の組織に存在している。ヒア
ルロン酸は、特に、細胞内マトリックス、皮膚および軟骨性組織、ならびに関節
液および眼の房水などの体液に存在している。ヒアルロン酸は、他のグリコサミ
ノグリカンとともに、血管壁に含まれ、そして動脈内壁でのアテローム性沈着物
またはアテローム性プラークにもおそらくは存在している。ヒアルロン酸は、水
と結合し、粘性の親水コロイド液を形成し、そして強塩基性タンパク質との溶解
度が低い複合体を形成する特性を有する。ヒアルロン酸は、β−（１―３）−グ
リコシド結合によって結びつけられたグルクロン酸およびアセチル化グルコサミ
ンから構成されている。この二糖類ユニットが、次に、β−（１―４）−グリコ
シド結合により連結している。ヒアルロン酸は、ヒアルロニダーゼという総称的
な名称のもとでまとめられている酵素により分解される。

【０００５】 ヒアルロニダーゼという総称的な名称により、系統的な酵素学的意味において
は正しくないが、異なる作用を示す３つのヒアルロン酸分解型の酵素が表される
（Ｊ．Ｌｕｄｏｗｉｅｇ、「ヒアルロニダーゼの機構」、ＪＢＣ、２３６、３３
３〜３３９（１９６１））。これらは、水を付加することでβ−（１―３）−結
合を加水分解的に分解するエンドヒドロラーゼである。これらには、ウシの精巣
から得られた医療的に使用されているヒアルロニダーゼなどの高等生物から得ら
れた大部分のヒアルロニダーゼが含まれる。これらの酵素は、ヒアルロン酸−グ
リカンヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３５／３６）とも呼ばれているが、
ヒアルロン酸を加水分解し、そして限られた程度ではあるが、他のグリコサミノ
グリカン結合もまた加水分解する。β−（１―４）−結合を非常に特異的に分解
するヒルから得られたエンド−β−ヒアルロニダーゼはさらなるタイプである。
言及されたこれらの酵素のすべては、加水分解活性を有するヒアルロニダーゼで
あり、すなわち、より厳密な意味でのヒアルロニダーゼである。

【０００６】 第３のタイプの酵素であるヒアルロン酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．１）
は、グルクロン酸の（４−５）位における二重結合の形成を伴う脱離機構によっ
てヒアルロン酸をβ（１―４）−結合で分解する。従って、ヒアルロン酸リアー
ゼはヒアルロニダーゼではない。ヒアルロン酸リアーゼは微生物に存在している
。ヒアルロン酸リアーゼは、例えば、ストレプトマイセス属の放線菌および他の
細菌において見出されている。その共通した特徴的な特性は、ヒアルロン酸に対
するその狭い特異性である。他のグリコサミノグリカンの分解は、通常は無視で
きるほどである（Ｊ．−Ｈ．Ｏｚｅｇｏｗｓｋｉ他、「ストレプトコッカス・ア
ガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のヒアル
ロニダーゼの精製および特徴付け」、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．２８０、４９７〜５０
６（１９９４）；Ａ．Ｌｉｎｋｅｒ他、「細菌ヒアルロニダーゼによる不飽和ウ
ロニドの産生」、ＪＢＣ、２１９、１３〜２５（１９５６）；Ｔ．Ｏｈｙａ、Ｙ
．Ｋａｎｅｋｏ、「ストレプトマイセス属の新規なヒアルロニダーゼ」、ＢＢＡ
、１９８（１９７０）、６０７〜６０９；Ｋ．Ｇａｓｅ、Ｊ．−Ｈ．Ｏｚｅｇｏ
ｗｓｋｉおよびＨ．Ｍａｌｋｅ、「ヒアルロン酸リアーゼをコードするストレプ
トコッカス・アガラクチアエのｈｙｌＢ遺伝子：完全な配列および発現分析」、
ＢＢＡ、１９９８、８６〜９８）。

【０００７】 大部分の細菌ヒアルロン酸リアーゼは、分子量が１１６，０００ダルトン〜１
２０，０００ダルトンの間にある高分子量のタンパク質である。これらの高分子
量のヒアルロン酸リアーゼは、一般には、変性剤および極端な生理学的条件によ
る影響を比較的受けやすい。特に、薬学的配合物および動物用配合物を調製して
いる時において、かなりの程度の活性が変性プロセスのために喪失し得る。さら
に、比較的大きな酵素の拡散能は、より小さな分子の拡散能よりも著しく小さい
。結果として、理論的には、浸透および／または拡散による高分子量ヒアルロン
酸リアーゼ（ホロ酵素）の組織内への拡散および同時に輸送（例えば、同様にプ
ラーク内への輸送）は限定される。免疫原性効果はより低いと考えられる。

【０００８】 一般には酵素活性を有していない配列決定用のタンパク質フラグメントを得る
ために、酵素プロセスにおいてプロテアーゼの助けを借りてタンパク質を分解す
ることはこの分野の最新技術である。従って、微生物から得られた酵素（ホロ酵
素）を、特定の活性を有するプロテアーゼによる部分的な消化によって小さくす
ることは理論的に可能であるはずである。しかし、今日まで、酵素フラグメント
、特に、ヒアルロン酸リアーゼの起源をアミノ酸配列の同一部分によって同定す
ることができ、あるいはヒアルロン酸リアーゼから調製される微生物ヒアルロン
酸リアーゼの酵素活性フラグメントは知られていなかった。従って、酵素活性フ
ラグメントをヒアルロン酸リアーゼから調製することができる方法も知られてい
ない。

【０００９】 ウシの精巣から得られたヒアルロニダーゼが、動物組織またはヒト組織の浸透
性をより大きくするために使用されている。このヒアルロニダーゼは、皮下また
は筋肉内に投与された薬物の浸透促進剤または吸収促進剤として機能し、あるい
はより大量の液体の灌流を容易にするために、そして水腫をより迅速に退行させ
るために機能している。良好な効果が、既に１９６０年代に、急性腱鞘炎および
傍腱炎（Ｐａｒａｔｅｎｏｎｉｔｉｓ ｃｒｅｐｉｔａｎｓ）の場合において、
足底かかと棘の静脈的処置に関して、そして皮膚科学において、静脈内投与され
た高用量のウシ精巣ヒラーゼ（ｈｙｌａｓｅ）の「デサウ（Ｄｅｓｓａｕ）」を
用いて得られていた。例えば、進行性強皮症、限局性強皮症およびケロイドの場
合、症状はヒアルロニダーゼ処置の後で著しく軽減している。

【００１０】 １９７０年代において、ヒアルロニダーゼを用いて、動物モデルでの心筋梗塞
の後期後遺症に作用させることが試みられた。この研究の目的は、梗塞後におけ
る新血管の加速された形成による心臓の壊死領域を減少させて、末梢の血液循環
を改善することであった。

【００１１】 １９６０年代以降においては、ヒトにおける動脈血管性疾患の治療的作用、特
に、末梢血管における血液循環の改善を行うためにウシ精巣ヒアルロニダーゼを
使用することに関連する参考文献がいくつか存在する（例えば、Ｗｏｌｆｆによ
り引用される、ＴｈｕｒｎｈｅｒｒおよびＫｏｃｈ、「骨盤型第ＩＩ期動脈症の
症例におけるマグネシウム組成物／ヒラーゼの混合静脈注射による処置の結果」
、Ｚ．ａｒｚｔｌ．Ｆｏｒｔｂｉｌｄ．、１９７２、６６、４４６〜４４７）。
例えば、Ｗｏｌｆｆは、マグネシウムイオンと併用されるウシ精巣から得られた
ヒアルロニダーゼを静脈内投与（１週間に３回の３００ＩＵの６週間にわたる混
合注射）することによって、調べた骨盤型第ＩＩ期動脈症患者の９０％において
血管の血液循環が改善されたと報告した。Ｇｒｏｓｓｈｅｎｎｉｇは、（「マグ
ネシウム組成物「Ｓｃｈａｒｆｆｅｎｂｅｒｇ」およびヒアルロニダーゼの静脈
内投与による下肢の変性動脈血管障害の処置結果」（Ｄｔｓｃｈ．Ｇｅｓ．−ｗ
ｅｓｅｎ、１９６５、２１、８６９〜８７２）において）、下肢の変性動脈血管
障害ならびに骨盤型の大きな着座型変性動脈閉塞患者の症例において類似した混
合処置を行い、「見事な結果」を得た。Ｇｒｏｓｓｈｅｎｎｉｇは、３００ＩＵ
を、１週間に３回、約５週間の期間にわたって投与した。少数の重症な場合には
、合計で３０回の注射を行った。達成された症状の悪化は、処置後、６週間〜８
週間の追跡試験期間中に検出されなかった。

【００１２】 ウシ精巣から入手可能なヒアルロニダーゼは比較的低い活性で入手できるだけ
であり、従って、低い酵素活性でしか投与できないことは明らかに非常に不都合
なことであった。例えば、高コレステロール血症ウサギに対する３００ＩＵの非
常に低いヒアルロニダーゼ活性の１ヶ月間の静脈内投与、腹腔内投与または皮下
投与はアテローム性動脈硬化性の血管変化に対して何ら効果を有していなかった
。３ヶ月までの期間にわたるこの量の反復投与は血中コレステロール含有量およ
び血漿のフィブリン含有量を低下させ、血漿の遊離ヘパリン含有量を増大させ、
組織方向での血管透過性を増大させ、そしてアテローム性血管プラークの著しい
減少をももたらした（Ａ．Ｉ．Ｐｅｒｓｏｖｓｋｉｉ、Ｓ．Ｉ．Ｋｏｖａｌ’ｃ
ｈｕｋ、Ｖ．Ａ．Ｂａｒｏｎｅｎｋｏ、Ｒ．Ｎ．Ｇｏｌｄ’ｍａｎ、Ｓ．Ｙａ．
ＧｕｚおよびＴ．Ｌ．Ｆｏｎｂａｒｏｖａ（１９７３）、「実験的アテローム性
動脈硬化症の経過に対するヒアルロニダーゼの効果」、Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｊ
ａ、１３、３７〜４０）。

【００１３】 ヒアルロン酸リアーゼと呼ばれた酵素であって、英国特許第１，０６０，５１
３号により動物組織から得られた「実質的に均一な物質であると考えられる酵素
は、その広い特異性のために特に効果的なヒアルロニダーゼである」ことが、Ｇ
ｏｔｔｌｉｅｂらにより記載された。この酵素は、例えば英国特許第１，０９８
，９５７号において提案され、そしてアレルギー症状の処置に関する英国特許第
１，１７９，７８７号において動物起源のヒアルロニダーゼとの混合物で提案さ
れた。Ｇｏｔｔｌｉｅｂはまた、このヒアルロニダーゼまたはヒアルロン酸リア
ーゼによって、不整脈、血栓症、脳梗塞、脳血栓症および心筋梗塞などのヒトに
おける血管性疾患（特に、アテローム性動脈硬化症）を処置することを提案した
（米国特許第３，７０８，５７５号）。例えば、１０，０００ＩＵ／ｍＬの滅菌
等張液が、静脈内、動脈内またはくも膜下に注射される。この酵素は、特許（米
国特許第３，７０８，５７５号）に示される情報に従って動物材料から得られた
。使用された酵素が精巣ヒアルロニダーゼであったことは、本発明の明細書から
明らかであることは間違いない。酵素に認められるエステラーゼ活性、主張され
た広い特異性、ならびに活性を測定するために用いられた方法（この方法はリア
ーゼ反応に特異的でない）は、動物ヒアルロニダーゼに関連している。従って、
動物の精巣から得られたヒアルロン酸リアーゼの分解特異性を有する酵素はごく
最近の文献にも記載されていない（総説：Ｇ．Ｌ．Ｆｒｏｓｔ、Ｔ．Ｃｓｏｋａ
およびＲ．Ｓｔｅｒｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．８、４１９〜４３４）。

【００１４】 文献に示されている情報によれば、ウシ精巣から得られたヒアルロニダーゼは
、アテローム性沈着物が、そしておそらくは凝固血液の成分および凝血塊もが溶
解され、分解され、または透過性にされるという事実のために血流に対する血管
の透過性を増大させるのに好適である。溶解され得る血液血栓の成分は、脈管内
膜から分離される、凝血塊が形成されたプラーク粒子であり得る。さらに、ヒア
ルロニダーゼの使用によって、組織ならびにその隣接すると考えられる組織に対
する血管壁の透過性がより大きくなるということが示されている。

【００１５】 しかし、動物起源のヒアルロニダーゼ（特に、ウシ精巣から得られたヒアルロ
ニダーゼ）を使用することの不都合な点として、そのような酵素は、その起源の
ために、ウイルス、ＢＳＥ（ウシ海綿様脳症）および他の感染性物質を伝え得る
ということである。さらなる不都合な点として、ヒアルロニダーゼの製造に関し
て、非常に多くの精製手間が、動物材料に由来する成分（特に、異物タンパク質
）の形態で不純物を除くために必要とされることである。さらに、十分な量のヒ
アルロニダーゼを得るためには、従って、大量の出発材料を、腐敗しない条件の
もとで集めなければならない。

【００１６】 哺乳動物の精巣から得られたヒアルロニダーゼは、その非特異性のために、血
管壁に存在する硫酸化グリコサミノグリカンをも加水分解する。しかし、デルマ
タン硫酸またはコンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、その凝固
阻害性のために、血管内壁への凝血塊の付着を妨げていると考えられる。従って
、これらの化合物の加水分解は、管脈内壁での凝固血液の二次的な形成を増大さ
せるという可能性があり、従って、精巣のヒアルロニダーゼは望ましくない副作
用をも有し得るという可能性がある。

【００１７】 Ｓａｗｙｅｒ他（ＥＵ１９３３３０Ｂ１）は、眼疾患の場合における生理学的
流体の流れを刺激するために、ヒルから得られた分子量が２８，５００Ｄの特別
なエンド−β−グルクロニダーゼの調製および使用を記載した。この酵素は、ヒ
アルロン酸に対して非常に特異的であり、そして高温および極端なｐＨ値におけ
る安定性がより大きいことによって、ヒル（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
ｉｓ）から得られた既知のエンド−β−グルクロニダーゼとは異なる。

【００１８】 （発明の開示） 本発明の目的は、アテローム性動脈硬化性の血管変化の処置ならびに予防に好
適な薬学的配合物において微生物から得られた酵素を使用することによってプラ
ークを分解する酵素としての動物起源のヒアルロニダーゼの以前に提案された使
用の欠点を回避することである。原理的には、生物工学的手段によって製造でき
るために、微生物酵素は容易に得ることができる。

【００１９】 本発明の目的はまた、好適な微生物ホロ酵素から簡便な方法でプラーク分解活
性を有する酵素的に活性な酵素フラグメントを作製することであり、そしてその
ようなフラグメントを薬学的配合物として使用することである。フラグメントは
、薬学的配合物中ではより安定であり、使用したときの免疫原性はより低く、そ
して良好に浸透することが予想され得る。

【００２０】 さらに、本発明に従って利用できる酵素は、より大きな酵素活性が長期間にわ
たって投与されたときに、生きている哺乳動物生物に対する負の効果を有してい
ないはずである。この酵素はまた、硫酸化グリコサミノグリカンを限られた程度
にしか分解しないはずであり、一方で、動物の精巣から得られたヒアルロニダー
ゼにより得られる溶解と匹敵し得るプラークおよび凝固血成分の溶解をもたらす
はずである。他方で、脈管内膜における硫酸化グリコサミノグリカンの分解は非
常に限られているため、凝固血が二次的に生成する危険性は、硫酸化グリコサミ
ノグリカンが存在していないためにあまり大きくならないはずである。

【００２１】 従って、本発明により、微生物起源で、プラークを分解し、そして血管系で使
用される薬学的配合物の成分として、プラークまたは凝血塊成分または凝固血で
覆われた血管内壁を軽減させるときにウシ精巣から得られたヒアルロニダーゼの
配合物で達成される効果と匹敵し得るか、あるいはそのような効果よりも良好な
効果を有し、そして血管性疾患の発症に対して好ましい効果を有し、毒性がなく
、そして注射用調製物としてヒトまたは動物で使用されたときに他の負の効果を
全く有しない酵素が見出されるはずである。

【００２２】 本発明のなおさらなる目的は、ヒアルロン酸リアーゼ活性を伴ったより小さな
タンパク質またはフラグメントを利用できるようにすることであり、そしてその
作製方法を示すことである。そのようなフラグメントは、そのホロ酵素よりも小
さい酵素活性特性を有するか、またはそのホロ酵素と同じ酵素活性特性を有する
はずである。

【００２３】 従って、本発明は、直接的に生じるか、あるいはアテローム性プラークが形成
される結果として生じる血管性疾患の処置に好適な薬学的配合物を含む。

【００２４】 本発明により、ヒアルロン酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．１）、特に、ス
トレプトコッカス属の微生物（好ましくは、一般に利用可能なストレプトコッカ
ス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）種
ｂまたはストレプトコッカス・アキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）種の微生物）が発酵により浸漬培地に分泌するヒアルロ
ン酸リアーゼの活性を有する１つまたは複数の細菌酵素、あるいはそのようなヒ
アルロン酸リアーゼから作製される酵素フラグメントを含有する薬学的配合物は
、インビトロ条件下で、哺乳動物またはヒトのアテローム性血管から得られる単
離されたプラーク沈着物から物質を遊離させ、あるいは薄いプラーク切片を溶解
することが見出された。

【００２５】 さらに、比較的大きな酵素活性ならびにヒアルロン酸リアーゼおよび／または
酵素フラグメントを含有する本発明の薬学的配合物の静脈注射物を生きたワタナ
ベウサギ（このウサギは遺伝的欠陥のために大動脈にプラークの大きな沈着物を
有する）に繰り返し静脈注射したとき、血管内のプラーク沈着物の範囲が、処置
後、顕著に減少したことが判明した。処置しなかった動物の血管内部は、表面が
、より厚いプラークと同様に、白みがかった薄い層で覆われていた。他方で、処
置した動物の血管内部は、そのようなより薄いプラーク沈着物はなく、血管の健
康な内面の深赤色であった。より厚いプラーク性沈着物の領域範囲もまた減少し
ていた。

【００２６】 この効果は、薬学的配合物において、分子量が１１４，０００Ｄ〜１２４，０
００Ｄの範囲にあるホロ酵素が存在することに限定されず、分子量が、例えば、
８４，０００〜８６，０００のホロ酵素の高活性で安定なフラグメントによって
もまた得られることは驚くべきことである。

【００２７】 さらに、本発明のフラグメントは、プロテアーゼ（好ましくは、芳香族アミノ
酸のＣ端側のペプチド結合を切断するプロテアーゼ）で細菌ヒアルロン酸リアー
ゼをタンパク質分解的に消化することによって作製できることが見出された。好
ましい実施例において、ストレプトコッカス・アガラクチアエから得られた分子
量が１１６，０００ダルトンのヒアルロン酸リアーゼが、ヒアルロン酸リアーゼ
の酵素活性フラグメントに分解される。このフラグメントは、８４，０００ダル
トン〜８６，０００ダルトンの分子量を有する。その分解特異性において、フラ
グメントは未消化のヒアルロン酸リアーゼ（ホロ酵素）と異なっていない。しか
し、ホロ酵素との比較において、フラグメントは、水溶液および変性剤の存在下
における安定性が明らかに大きくなっていることにより区別される。この酵素は
、比活性が４００，０００ＩＵ／ｍｇ〜８００，０００ＩＵ／ｍｇの間である。
これは、ホロ酵素の４００，０００ＩＵ／ｍｇの比活性と同じであるか、あるい
はホロ酵素の比活性よりもさらに大きい。

【００２８】 従って、本発明は、微生物起源のヒアルロン酸リアーゼを、ホロ酵素として、
ヒアルロン酸を分解するそのフラグメントとして、またはその両形態の混合物と
して、それぞれが高度に精製された形態で含有し、かつ少なくとも１つの安定化
剤および／または薬学的に安全なキャリアまたは不活性な物質、ならびに必要に
応じて使用される薬学的に安全な希釈剤を含有する薬学的配合物に関する。

【００２９】 本発明の薬学的配合物は、哺乳動物（ヒトおよび動物）において、主として、
不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳梗塞、脳血栓症、冠状動脈血栓症および心
筋梗塞などの血管におけるアテローム性プラークの存在に帰因し得る血管性疾患
の処置に好適である。

【００３０】 本発明に従って調製される薬学的配合物は、特に、静脈注射用または動脈注射
用の注射用調製物であって、ホロ酵素の高度に精製された酵素タンパク質および
／またはそのフラグメントまたは両方の活性な酵素種の規定された混合物の滅菌
された等張水溶液からなる注射用調製物である：この場合、酵素活性は２０，０
００ＩＵ／ｍＬ〜４，０００，０００ＩＵ／ｍＬの間である。酵素タンパク質は
、通常は安定化用添加剤を含有する凍結乾燥固体の形態で都合よく使用される。
安定化用添加剤として、例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マグネシウム塩
、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、アルブミン（特に、オバルブミン）および
その加水分解物、または穀物タンパク質およびその加水分解物を挙げることがで
きる。注射物において使用されるヒアルロン酸リアーゼおよび／またはそのフラ
グメントの量は、処置する動物またはヒトの体重１ｋｇあたり２，０００ＩＵ〜
１２，０００ＩＵの間である。

【００３１】 本発明に従って使用される酵素またはそのフラグメントは、実験動物の健康状
態に対する負の作用を示していない。提案された酵素および／またはそのフラグ
メントが、実際の沈着物の除去に限定されず、心筋虚血、冠状動脈梗塞、心筋梗
塞、不整脈、アテローム性動脈硬化症および類似する症状発現などの循環性疾患
の予防ならびに処置の意味において有利な効果をも有していることは明らかであ
り、そして本発明の保護範囲の一部である。本発明の適用において、フラグメン
トは、そのサイズがより小さい結果として、プラークの固体層により迅速に浸透
して、その結果、より迅速にその分解をもたらし得るために、ホロ酵素を上回る
利点を有していた。

【００３２】 本発明は特定の微生物に由来するヒアルロン酸リアーゼまたはそのフラグメン
トに限定されない。しかし、本発明は、例として、一般に入手可能なストレプト
コッカス・アガラクチアエの酵素を使用して説明される。得られたヒアルロン酸
リアーゼは、等電点が約８．６であり、分子量が約１１６，０００Ｄであり、エ
ンドグリカナーゼとして作用する。この酵素は、さらにヒアルロン酸などの硫酸
化グリコサミノグリカンで阻害されるという有利な特性を有している。下記に記
載されている精製方法によって、ヒアルロン酸リアーゼが、注射目的のために高
度に精製された酵素として得られ、あるいは精製されたヒアルロン酸リアーゼは
、特定活性のプロテアーゼによりフラグメントに変換される。本発明を限定する
ものではないが、微生物ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＡＰ４０から得ることができる酸
性メタロプロテアーゼＭＯ／２（ＤＤ２７０９２４）を、例えば、特異的に作用
するプロテアーゼとして使用することができる。このプロテアーゼは、約１４，
０００ｋＤの分子量と、３．８５〜４．０の間の等電点とによって区別される。

【００３３】 ホロ酵素の産生ならびにフラグメントの作製、特に一連の精製工程の下記に示
される詳細な説明もまた、例として示され、本発明の範囲を限定することを目的
としていない。高純度なヒアルロン酸リアーゼおよび高度に精製されたフラグメ
ントの、注射に好適な薬学的配合物での作製は、例えば、下記のように行うこと
ができる。精製工程の順序ならびに選択に関して、本発明の範囲は、記載されて
いる方法に限定されない。

【００３４】 微生物（例えば、上記の微生物のいずれか）の発酵は、攪拌型発酵槽で、ｐＨ
６．５〜ｐＨ７．５の酸性度の一定したｐＨで行われる。発酵中に生成する乳酸
は、薄い水酸化ナトリウムを加えることによって中和される。培地は、無機塩類
、酵母加水分解物、必要に応じてカゼインペプトンまたはダイズペプトン、およ
びグルコースからなる。約２０時間の発酵を行った後に細胞を分離する。細胞塊
は廃棄される。培養ろ過液を限外濾過装置で濃縮して精製する。限外ろ過フィル
ターモジュールの排除限界（カットオフ）は３０ｋＤ〜５０ｋＤの間である。予
備精製された酵素溶液が得られるが、これはさらなる精製工程に付さなければな
らなず、その後、注射用調製物として使用することができる。パイロジェンが注
射用調製物に存在しないことは、精製工程によって、そしてパイロジェンを含ま
ない不活性な物質を使用することによって保証される。

【００３５】 飽和度が４０％になるまで硫酸アンモニウムを加えてイオン強度を増大させた
後、酵素をフェニルセファロースに吸着させる。続いて、酵素を、１００％の飽
和度に必要な硫酸アンモニウムの２５％の量を含有する緩衝化された中性水溶液
で脱離する。不純物を除く透析工程の後、溶液をＱ−セファロース（Ｐｈａｒａ
ｍａｃｉａ）で処理する。その後、アミノフェニルオキサム酸などの色素に特異
的に吸着させる。最終精製は、分子量測定とともに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）での分子量クロマトグラフィーからなり得る。

【００３６】 ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ
ｓｉｍｉｌｉｓ）が酵素を得るために使用される場合、色素に吸着させる精製工
程は省くことができる。この酵素はエキソグリカナーゼとして作用する。その等
電点はｐＨ４．５〜ｐＨ４．８の間である。この酵素は、硫酸化グリコサミノグ
リカン類によって非常に小さい程度で阻害されるだけである。

【００３７】 ホロ酵素のフラグメントへの部分的な消化は、特定のプロテアーゼを用いて行
われる。このようなプロテアーゼは固定化され、あるいは固定化されていない。
固定化されたプロテアーゼによる反応は、プロテアーゼ自身による混入がなく消
化を選択的に行うことができるために都合がよい。プロテアーゼを加えて行われ
る直接的な変換の場合、プロテアーゼによる消化を行った後で、不活化工程、プ
ロテアーゼタンパク質の分離、および高度な精製を行わなければならない。酵素
画分は、フラグメントを作製するために、次の方法で使用することができる。

【００３８】 特異的に分解するプロテアーゼＭＯ／２を、知られている方法で、例えばセフ
ァロースに結合させる。固定化されたプロテアーゼを、ヒアルロン酸リアーゼの
水溶液と、例えば、７．５のｐＨおよび３７℃の温度で混合する。消化が完了し
た後、フラグメントを硫酸アンモニウムで沈殿させ、そして分子量クロマトグラ
フィーによって高純度な形態で得る。ウサギで免疫化した後、高度に精製された
酵素または酵素画分のみが特異的な沈殿を示すだけである。ブロットで検出可能
なすべてのバンドはモノクローナル抗体で染色される。ホロ酵素は約４００，０
００ＩＵ／ｍｇの比活性を有し、フラグメントの比活性は４００，０００ＩＵ／
ｍｇ〜８００，０００ＩＵ／ｍｇの間である。安定化させるために、アルブミン
（好ましくは、オバルブミン）および無機塩などの少なくとも１つの安定化剤が
酵素またはフラグメントに加えられる。

【００３９】 フラグメントを得る１つの方法を記載するが、それによって本発明は限定され
ない。本発明により、芳香族アミノ酸のＣ端側のペプチド結合を切断するプロテ
アーゼが消化のために使用される。好ましい実施形態において、ストレプトマイ
セス・ヒグロスコピクス（ＡＰ４０株）の培養ろ過液から得られるメタロプロテ
アーゼＭＯ／２が使用される。ＭＯ／２は、活性中心にＣｏ⁺⁺を有するメタロプ
ロテアーゼである（ＤＤ２７０ ９２４）。プロテアーゼは、好ましくは、精製
された形態で使用される。プロテアーゼＭＯ／２は、例えば、フェニルセファロ
ース、ＤＥＡＥセファロース、Ｑ−セファロースおよびセファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）Ｓ１００でのクロマトグラフィーによって、２０倍の濃縮倍率で精
製される。比活性は、０．２５クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）単位／ｍｇ（Ｕ／ｍｇ
）の程度であり、最大の反応はｐＨ４．２の酸性度で生じ、最高反応温度は６５
℃である。ＳＤＳゲル電気泳動およびセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ５
０スーパーファインでの分子量クロマトグラフィーで求められた酵素の分子量（
Ｍｍ）は１４，０００Ｄ〜１５，０００Ｄである。プロテアーゼＭＯ／２は、３
．８５の等電点と３．９２の等電点とを有するエンドペプチダーゼである。この
酵素は、カゼイン、ヘモグロビン、ウシ血清アルブミンおよびオバルブミンなど
の天然のポリペプチドを加水分解する。

【００４０】 酵素タンパク質を非常に特異的に分解し、タンパク質に対してほとんど消化活
性を有しないプロテアーゼＭＯ／２を使用することは都合がよい。この酵素は、
ほとんどもっぱら芳香族アミノ酸のＣ端基のペプチド結合を切断する。この酵素
は、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−プロリンニトロアニリドに対するエステル分解活性お
よび顕著なミルク沈殿化特性を有する。非常に特異的な作用を有する実験室酵素
によるミルク沈殿により形成されるゲルの安定性と匹敵し得る長時間の安定性を
有するカゼインゲルの形成によって検出することができるミルク沈殿特性は、フ
ラグメントの分解をもたらすことなく、ホロ酵素の結合を特異的に分解するプロ
テアーゼＭＯ／２の限定されるが、本発明に関して非常に好都合な活性のさらな
る指標として評価され得る。

【００４１】 本発明のさらなる実施形態において、プロテアーゼＭＯ／２は、必要に応じて
適切な不溶性の固定化支持体に結合させられ、この形態でホロ酵素を分解するた
めに使用される。この手法は、溶解したプロテアーゼのフラグメント溶液への移
行がこの方法では防止されるという利点を有する。

【００４２】 本発明により、フラグメントが、好ましくは芳香族アミノ酸のＣ端側でペプチ
ド結合を切断する特異的な切断活性のプロテアーゼによるホロ酵素の部分的な消
化あるいはタンパク質分解的な部分的な分解によって作製される。

【００４３】 フラグメントを含有する高純度の酵素の溶液または画分は、水を部分的に除く
ことで濃縮することができ、そして必要に応じて安定化剤、不活性物質または薬
学的に活性な物質を加えて滅菌ろ過した後で、注射用調製物として使用すること
ができる。酵素またはフラグメントの高純度溶液は、滅菌ろ過を行い、そして例
えば、５ｍＭの塩化マグネシウムおよび１％のオバルブミンを加えた後で、凍結
乾燥することもできる。凍結乾燥された酵素またはフラグメントは塩溶液に溶解
して、等張性の注射用調製物にすることができる。 本発明はまた、微生物起源のヒアルロン酸リアーゼ、ヒアルロン酸を分解するそ
のフラグメントまたは両方の形態の混合物の哺乳動物およびヒトでの使用であっ
て、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳梗塞、脳血栓症、冠状動脈血栓症およ
び心筋梗塞などのアテローム性プラークが血管に存在することに帰因し得る血管
性疾患を処置するための使用に関する。

【００４４】 本発明のさらなる目的は、ヒアルロン酸リアーゼ活性を有する細菌ヒアルロン
酸リアーゼのフラグメントに関する。

【００４５】 下記の実施例は本発明を説明するために役立つが、本発明を決して限定するも
のではない。

【００４６】 （実施例） 実施例１ 発酵を、総容量が３０Ｌの攪拌型発酵槽で行う。作業容量は２０Ｌである。接
種のために、ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎ
ｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に第２１３４^γ号（＝ＡＴＣＣ１３８１３＝ＮＣＴ
Ｃ８１８１）で保管されているストレプトコッカス・アガラクチアエ種の一般に
入手可能な菌株を使用する。貯蔵用保存を、Ｋｒｙｏｋｏｎｓｅｒｖｅ（Ｍａｓ
ｔ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて行う。貯蔵物で覆われた球を、微生物計
数寒天の斜面寒天チューブに加え、動かすことによって寒天表面と接触させる（
培養Ａ）。続いて、無菌性を調べるために、転がした球を３ｍＬのハート・ブレ
イン・ブイヨンに加える（培養Ｂ）。両方の培養を、直立培養として３７℃で２
４時間培養した。

【００４７】 最初の前培養 ５ｇ／Ｌのカゼインペプトンおよび１０ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）を
含有する培地（２ｘ５０ｍＬ）を、２つの１００ｍＬ容の「Ｓｔｅｉｌｂｒｕｓ
ｔ」フラスコに入れ、７．０のｐＨで滅菌する。５０ｍＬの培養培地に加えて、
５ｍＬのイーグル（Ｅａｇｌｅ）培地を、それぞれの場合、接種する直前に加え
る。接種を、斜面寒天チューブ（培養Ａ）を培養Ｂの培養液でゆすぐことによっ
て行う。「Ｓｔｅｉｌｂｒｕｓｔ」フラスコを（１５０ｒｐｍで）振とうしなが
ら３７℃で２４時間培養する。

【００４８】 第２の前培養 ２０ｇ／Ｌの酵母抽出物および１０ｇ／Ｌの膵臓ペプトン、１．７５ｇ／Ｌの
酢酸ナトリウム、７ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（別個に溶解する）、７ｇ／Ｌ
のリン酸水素二ナトリウム二水和物、および３．５ｇ／Ｌのリン酸二水素ナトリ
ウムからなる培地（２ｘ１Ｌ）を２０％硫酸でｐＨ６．２に調節し、その後、滅
菌する。オートクレーブ処理後、ｐＨは約７．０である。６．０ｇ／Ｌのグルコ
ース溶液を別にオートクレーブ処理し、この１００ｍＬを、接種前の第２の前培
養液に加える。接種を、５０ｍＬの最初の前培養液を加えることによって行う（
５％ｖ／ｖで接種される）。培地を、約４５ｒｐｍで緩く振とうしながら３２℃
で２４時間培養する。

【００４９】 主培養 主培養の培地は、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌの膵臓ペプトンおよび
２５ｇ／Ｌのグルコースからなる。グルコースは別に滅菌される。接種は、１Ｌ
の第２の前培養液を用いて行われる。発酵の操作条件は、３４℃、ｐＨ７．０、
上部空間の通気（２３ｌ／分の空気）、および１５０ｒｐｍの攪拌速度である。
ｐＨは、４０％水酸化ナトリウム溶液を滴下することによって一定に保たれる。
グルコースは、グルコース濃度が５ｇ／Ｌ未満にならないように手動で加えられ
る。培養を２０時間後に止める。

【００５０】 実施例２ ストレプトコッカス・アガラクチアエ種を発酵した４００ＩＵ／ｍＬのヒアル
ロン酸リアーゼ活性を有する培養液（５０Ｌ）を、０．２μｍフィルターでの滅
菌ろ過によって生細胞を除く。続いて、透明な培養ろ過液を、カットオフが６０
，０００Ｄの限外濾過で２Ｌに濃縮する。固体の硫酸アンモニウム（４８０ｇ）
をこの２Ｌの培養濃縮液に加える。この濃度で沈殿するタンパク質を、フィルタ
ー補助を使用して、透明化ろ過によって除く。その後、透明な濃縮液を、リン酸
塩で緩衝化したｐＨ６．５の４０％硫酸アンモニウム溶液で前もって平衡化した
２．５ｘ２０ｃｍのフェニルセファロースカラムに加える。リン酸塩で緩衝化し
たｐＨ６．５の３５％硫酸アンモニウム溶液で洗浄した後、ヒアルロン酸リアー
ゼを、リン酸塩で緩衝化したｐＨ６．５の２５％硫酸アンモニウム溶液で溶出す
る。溶出画分をまとめ、そして固体の硫酸アンモニウムを加えることによって８
０％飽和に調節する。沈殿を集め、１００ｍＬの０．０３Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
８．２）に溶解して、同じ緩衝液に対して透析する。続いて、透析した粗ヒアル
ロン酸リアーゼを、平衡化した２．２ｘ１５ｃｍのＱ−セファロースカラムに加
える。ヒアルロン酸リアーゼは吸着されず、溶出液に見出される。この溶出液を
、固体の硫酸アンモニウムを加えることによって８０％飽和にする。沈殿したタ
ンパク質を集め、０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解して、セファデ
ックスＧ１０カラムで硫酸アンモニウムを除く。そのようにして平衡化したヒア
ルロン酸リアーゼ溶液を、Ｎ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸−アガロース
の適切に平衡化したアフィニティーカラム（０．８ｃｍｘ１０ｃｍ）に移し、０
．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．７）で溶出する。

【００５１】 ヒアルロン酸リアーゼを含有する溶出画分をまとめ、硫酸アンモニウムで飽和
度を８０％にすることによって沈殿させる。沈殿物を集め、１ｍＬの０．１Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（１６
ｘ６０）に移す。１１６，０００Ｄのヒアルロン酸リアーゼのタンパク質バンド
を集め、０．００５のＭｇＣｌ₂を含有する０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）に対して透析する。ヒアルロン酸リアーゼが、１０ｍｇの収量および４００
，０００ＩＵ／ｍｇの比活性で得られる。オバルブミンを、透析したヒアルロン
酸リアーゼ溶液に１％の濃度で加えて、溶液を凍結乾燥する。

【００５２】 実施例３ 実施例１および実施例２に対応して、ストレプトコッカス・エキシミリス種の
微生物の前培養および培養を行い、酵素を純粋な形態で得る。Ｎ−（ｐ−アミノ
フェニル）オキサム酸を使用する精製は省略する。

【００５３】 実施例４ 精製されたプロテアーゼＭＯ／２（１０ｍｇ）を２ｍＬの０．１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム溶液に溶解し、１ｍＬのブロモシアンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を加えて４℃で１２時間振とうする。続いて、未結合のＭＯ／２を含有する
溶液を、得られたＭＯ／２プロテアーゼセファロースから焼結ガラスフィルター
を用いて分離する。続いて、飽和していないブロモシアンセファロースの結合部
位を、２ｍＬの０．１Ｍグリシン溶液との反応によってブロック処理する。ブロ
ック処理した後、ＭＯ／２セファロースを、０．１Ｍ酢酸（ｐＨ４．５）および
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄する。

【００５４】 ストレプトコッカス・アガラクチアエから得られたヒアルロン酸リアーゼ（１
０ｍｇ）を１ｍＬの０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、恒温槽
で温度を３７℃にする。０．１クニッツ単位のタンパク質分解活性を結合させた
固定化ＭＯ／２プロテアーゼセファロース（０．２５ｇ）をこの溶液に加える。
１５分後、プロテアーゼセファロースを分離し、得られたフラグメントを硫酸ア
ンモニウムによる８０％飽和によって溶液から沈殿させる。１８時間後、沈殿物
を集めて、０．０５トリス緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解する。フラグメントをＳ
ｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分子量クロマトグラフィーによって精製する。活性
なフラグメント画分をまとめ、０．０５Ｍトリス緩衝液に対して透析し、そして
アルブミンを加えて凍結乾燥する。このフラグメントは、比活性が６００，００
０ＩＵ／ｍｇである。

【００５５】 実施例５ ストレプトコッカス・アガラクチアエから得られたヒアルロン酸リアーゼ（４
ｍｇ）を含む１ｍＬのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）を恒温槽で温度を３７
℃にする。この溶液に、比活性が０．１クニッツ単位／ｍｇのプロテアーゼＭＯ
／２の８０μｇを加える。この混合物を３７℃で３０分間消化する。反応を停止
させるために、１０μＬの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を加える。その後
、混合物をＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸−アガロースの３ｍＬのアフ
ィニティーカラムに移して、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．７）で溶出す
る。フラグメントを硫酸アンモニウムによる８０％飽和によって沈殿させて集め
、そして分子量クロマトグラフィーにより精製した。活性なフラグメント画分を
まとめ、０．０５Ｍトリス緩衝液に対して透析し、そしてアルブミンを加えて凍
結乾燥した。このフラグメントは、比活性が４６０，０００ＩＵ／ｍｇである。

【００５６】 実施例６ ヒアルロン酸リアーゼフラグメント（実施例４）の溶液（０．５ｍＬ）を０．
５ｍＬの０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、等比系列の形態で希釈す
る。続いて、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）の１ｍＬあたり０．２ｍｇの
ヒアルロン酸を含有する０．５ｍＬのヒアルロン酸溶液を各希釈液に加える。続
いて、この混合物を３７℃で３０分間インキュベーションする。酵素反応を、各
希釈液を２ｍＬの２．５％臭化セチルトリメチルアンモニウム溶液／２％水酸化
ナトリウム溶液で処理することによって停止させる。室温で２０分間放置した後
、各希釈液の濁度を６００ｎｍにおいて１ｃｍのキュベットで測定して、ヒアル
ロン酸の分解量を、検量線を使用して求める。５国際単位（ＩＵ）のヒアルロン
酸リアーゼフラグメントは、１分あたり１６μｇのヒアルロン酸を分解する。

【００５７】 実施例７ ホロ酵素（２０，０００ＩＵ）および２０，０００ＩＵのフラグメント（実施
例４）を３ｍＬの蒸留水に溶解する。両溶液を室温で２４時間保つ。続いて、酵
素活性を測定する。ホロ酵素溶液の活性はこの間に６０％に低下するが、フラグ
メント溶液の活性は出発溶液の活性の９５％である。

【００５８】 実施例８ ヒアルロン酸リアーゼまたはそのフラグメントの活性測定 １．２３２ｎｍでの光学的試験 ヒアルロン酸（ＨＡ）および硫酸化ヒアルロン酸の貯蔵用溶液（ｍｇ／ｍＬ）
を調製し、４℃で保管する。

【００５９】 標準的な試験の定形化を、下記のように、３ｍＬの石英キュベット（ｄ＝１ｃ
ｍ）において、２３２ｎｍの波長および２６℃の温度で行う。１．８ｍＬの０．
１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に２００μＬのヒアルロン酸の貯蔵用溶液を加
え、そして２〜４Ｕ／ｍＬ（５０ｍＬ）のヒアルロン酸リアーゼを用いて反応を
開始する。最終容量は２０５０μＬである。

【００６０】 阻害実験の場合、上記の標準的な試験物質を下記のように変更した。１．５ｍ
Ｌ〜１．８ｍＬの緩衝液に、３００μＬ〜５００μＬの硫酸化ヒアルロン酸およ
び２００μＬのヒアルロン酸を加え、そしてヒアルロン酸リアーゼを加えること
によって反応を開始する。ヒアルロン酸リアーゼは非拮抗的に部分的に阻害され
る。Ｋｉ値は、５．５ｘ１０^-4ｍｇ／ｍＬである。

【００６１】 ヒアルロン酸リアーゼは２３２ｎｍにおける吸収を直線的に増大させ、その傾
きから活性を求めることができる。計算は、生成したΔ^-1.5不飽和ウロニドの吸
収係数（ε＝６．０ｘ１０^-3Ｌ／ｍｏｌｅ／ｃｍ）に基づく（Ｌ．Ｌｕｄｏｗｉ
ｇ、「ヒアルロニダーゼの機構」、ＪＢＣ、２３６、３３３〜３３９（１９９１
））。

【００６２】 ２．マイクロプレートでの６００ｎｍでの光学的試験 Ｄ．Ｇｅｒｌａｃｈ、Ｗ．Ｋｏｈｌｅｒ、「化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のヒアルロン酸リアーゼ ＩＩ．ヒアルロン酸リ
アーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．１）の特徴付け」、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．
、Ｉ．Ａｂｔ．Ｏｒｉｇ．、Ａ２２１、２９６〜３０２（１９７２）の方法によ
るリアーゼ活性の測定 ヒアルロン酸リアーゼ溶液を、貯蔵用溶液（５０，０００Ｕ／ｍＬ）を１：５
０で希釈することによって調製する。ヒアルロン酸リアーゼ溶液（０．５ｍＬ）
を０．５ｍＬの０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、等比系列の形態で
希釈する。続いて、０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ６．０）の１ｍＬあたり０．２ｍｇを
含有する０．５ｍＬのヒアルロン酸溶液を各希釈液に加える。続いて、この混合
物を３７℃で３０分間インキュベーションする。各希釈液を２ｍＬの２．５％臭
化セチルトリメチルアンモニウム溶液／２％水酸化ナトリウム溶液で処理するこ
とによって酵素反応を停止させる。室温で２０分後、各希釈液の濁度を６００ｎ
ｍにおいて１ｃｍのキュベットで測定して、ヒアルロン酸の分解量を、検量線を
使用して求める。５国際単位（ＩＵ）のヒアルロン酸リアーゼフラグメントは、
１分あたり１６μｇのヒアルロン酸を分解する。

【００６３】 実施例９ ヒアルロン酸リアーゼ（ホロ酵素、１０ｍｇ）を１ｍＬの０．０５Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、恒温槽で３７℃の温度にする。この溶液に、タ
ンパク質分解活性が０．１クニッツ単位／ｍｇである特異的に分解するプロテア
ーゼセファロースの０．２５ｇを加える。１５分後、不溶性のプロテアーゼセフ
ァロースを除く、生成したフラグメントを溶液から硫酸アンモニウムによる８０
％飽和によって沈殿させる。１８時間後、沈殿物を除き、０．０５Ｍトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に溶解する。フラグメントをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分
子量クロマトグラフィーによって精製する。活性画分を精製し、０．０５Ｍトリ
ス緩衝液に対して透析し、そしてアルブミンを加えて凍結乾燥する。

【００６４】 実施例１０ ヒアルロン酸リアーゼのプラーク溶解活性を検出するために、ヒトの頸動脈脈
管内膜の新内膜から得られた約０．３ｍｍの白みがかった黄色組織片（プラーク
片）をヒアルロン酸リアーゼ溶液（１ｍＬのトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．
０）中に約２０，０００ＩＵ）に懸濁して、室温で１２時間インキュベーション
した。プラーク片の以前には鋭かった相境界は部分的に分解され、懸濁された細
かい分散物が放出される。同時に行う試験では、プラーク片をトリス緩衝液のみ
で処理した。後者の場合、分解の兆候はなかった。

【００６５】 実施例１１ ヒアルロン酸リアーゼフラグメントによるヒト起源のアテローム性血管沈着物を
分解する試み ヒトの頸動脈脈管内膜の新内膜から得られた約０．３ｍｍの白みがかった黄色
組織片（プラーク片）をフラグメント溶液（１ｍＬのトリス緩衝液（１０ｍＭ、
ｐＨ７．０）中に約１５，０００ＩＵ）に懸濁して、室温で１２時間インキュベ
ーションした。プラーク片の以前には鋭かった相境界は広範囲に分解され、懸濁
された細かい分散物が放出される。同時に行う試験では、プラーク片をトリス緩
衝液のみで処理した。後者の場合、分解の兆候はなかった。

【００６６】 実施例１２ ワタナベウサギＩｂｍ：ＷＨＨＬ（ワタナベ遺伝性高脂血症）におけるアテロー
ム性血管沈着物に対するヒアルロン酸リアーゼの効果。このウサギは、１９８１
年以降、Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ（神戸大学、日本）により品種改良され、そして
１９９２年に繁殖用系統としてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｓａｖｏにもたら
され、そして１９９４年以降、Ｂｒｏｅｋｍａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｏｍ
ｅｒｅｎ、オランダ）によってさらに飼育されている。

【００６７】 ワタナベウサギは、ＬＤＬレセプターにおける遺伝的欠陥によって引き起こさ
れる遺伝性の高脂血症を有する。高コレステロール血症（＞４００ｍｇ／１００
ｍＬ血漿）の結果として、すべての動物は大動脈のアテローム性動脈硬化症を早
期に発症する。

【００６８】 実験を開始する１４日前に、９ヶ月〜１１ヶ月の１０羽のワタナベウサギ（Ｉ
ｂｍ：ＷＨＨＬ；４羽の雌および６羽の雄）をＢｒｏｅｋｍａｎ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ（Ｓｏｍｅｒｅｎ、オランダ）から購入した。動物を１羽ずつケージ（０
．５ｘ１ｍ）に入れ、２０℃±２℃の室温で飼育した。動物には標準的な飼料（
ｓｓｎｉｆｆ Ｋａｎｉｃｈｅｎ−Ｈａｌｔｕｎｇ）および飲料水を自由に取ら
せた。実験を開始する前に、すなわち、最初の臨床化学的調査の前に、１０羽の
ウサギを性別に分け、無作為に取り出して、１〜１０の番号を付けた。

【００６９】 １週間に３回（月曜日、水曜日および金曜日）、動物は注入を受けた。４羽の
コントロール群ウサギ（１〜４）には、静脈内（ｉ．ｖ．）投与を行う各場合に
おいて、１時間以内にパイロジェンを含まない２０ｍＬの０．９％塩化ナトリウ
ム溶液を与えた。６羽の実験群動物（５〜１０）は、各場合、１時間について、
３０，０００ＩＵの高度に精製されたヒアルロン酸リアーゼのパイロジェンを含
まない０．９％塩化ナトリウム溶液の２０ｍＬの注入容量で静脈内注射した。こ
れは、体重１ｋｇあたり１０，０００ＩＵの投与量に対応する。

【００７０】 実験期間中、全体的な挙動、体重、体温および臨床化学的パラメーター（コレ
ステロール、トリグリセリドおよびアミラーゼ）を調べた。

【００７１】 動物の全体的な挙動は、０．９％塩化ナトリウム溶液またはヒアルロン酸リア
ーゼのいずれかでの処置により顕著な影響を受けなかった。完全に成長したワタ
ナベウサギ（コントロール群またはヒアルロン酸リアーゼ処置群）の体重は、９
６年１１月１８日から９７年２月３日までの処置期間中にほんのわずかに変化し
ただけであった。各注入の前後で測定された体温は、−０．３℃から＋１．２℃
の範囲で変動していた。コントロール群ウサギとヒアルロン酸リアーゼ処置ウサ
ギとの間には顕著な差はなかった。コントロール群動物の血清コレステロール値
は、０．９％塩化ナトリウムの注入によって大きく変化しなかった。４羽の動物
の１羽については、血清中のコレステロール濃度が半減した。ヒアルロン酸リア
ーゼ処置によってもまた、血清コレステロール濃度は顕著に変化しなかった。注
入処置のもとで、時折、非常に大きな血清グリセリド値がすべての動物において
低下した。２０回目の注入を行った後、コントロール群の値は５７０ｍｇ／ｄＬ
〜７４０ｍｇ／ｄＬの間であり、ヒアルロン酸リアーゼ処置ウサギの値は２００
ｍｇ／ｄＬ〜２９０ｍｇ／ｄＬの間であった。

【００７２】 ４羽のコントロール群ウサギの２羽において、大動脈弓は重度のアテローム性
であり、４羽の内の２羽では中程度〜重度のアテローム性であった。６羽のヒア
ルロン酸リアーゼ処置ウサギの２羽において、大動脈弓は中程度のアテローム性
であり、６羽の内の４羽では軽度〜中程度のアテローム性であった。４羽のコン
トロール群ウサギの２羽において、胸大動脈は重度のアテローム性であり、４羽
の内の２羽では中程度のアテローム性であった。６羽のヒアルロン酸リアーゼ処
置ウサギの４羽において、胸大動脈は軽度のアテローム性であり、６羽の内の２
羽において皮膜はほとんど検出することができなかった。４羽のコントロール群
ウサギの２羽において、腹部大動脈は重度のアテローム性であり、４羽の内の２
羽では中程度のアテローム性であった。６羽のヒアルロン酸リアーゼ処置ウサギ
の２羽においては中程度であり、６羽の内の４羽においては微弱〜軽度の皮膜を
検出することができた。４羽のコントロール群ウサギの２羽において、肺大動脈
はプラークで重度に覆われ、４羽の内の２羽では軽度〜中程度であった。６羽の
ヒアルロン酸リアーゼ群ウサギの１羽において、肺大動脈はプラークで重度に覆
われ、６羽の内の２羽ではプラークで軽度〜中程度で覆われていたが、６羽の内
の３羽においては、プラークは存在していなかった。

【００７３】 ０．９％塩化ナトリウム溶液およびヒアルロン酸リアーゼで処置したワタナベ
ウサギの全体的な挙動、体重発達、注入前後における体温、および臨床化学的パ
ラメーターは、それぞれが１０回の注入である２回の処置サイクルの期間中に顕
著な差を示さなかった。従って、注入液は十分に許容されると結論することがで
きる。

【００７４】 肉眼的な大動脈材料の主観的な評価により、アテローム性被膜の範囲は、微生
物ヒアルロン酸リアーゼで処置された６羽のワタナベウサギの場合よりも、０．
９％塩化ナトリウム溶液で処置された４羽のワタナベウサギの方が重症と考えら
れることが明らかにされる。

【００７５】 実施例１３ 高純度の濃縮された酵素溶液を十分な塩溶液で希釈して、得られた溶液が０．
９％塩および１０，０００ＩＵ／ｍＬのヒアルロン酸リアーゼを含有するように
する。この溶液を、ポア径が０．２μｍの滅菌用フィルターに通して滅菌ろ過す
る。この溶液を１ｍＬずつ、無菌条件のもとでアンプルに入れる。アンプルを無
菌条件下で凍結乾燥して、無菌条件下で封をする。注射前に、１ｍＬの滅菌した
蒸留水を加える。

【００７６】 実施例１４ 高純度の濃縮された酵素溶液を、ニコチン酸マグネシウムおよびアジピン酸マ
グネシウムの溶液（マグネシウム組成物「Ｓｃｈａｆｆｅｎｂｅｒｇ」）で希釈
して、得られた溶液が２５ｍｇのニコチン酸マグネシウムおよび８８ｍｇのアジ
ピン酸マグネシウムおよび１０，０００ＩＵ／ｍＬのヒアルロン酸リアーゼを含
有するようにする。この溶液を実施例１３の場合のようにアンプルに入れる。

【００７７】 実施例１５ 高純度のヒアルロン酸リアーゼの溶液を塩およびオバルブミンの溶液で希釈し
て、溶液が４０，０００ＩＵ／ｍＬ、０．９％の塩および１％のオバルブミンを
含有するようにする。この溶液を実施例１３の記載に従ってさらに処理する。

【００７８】 実施例１６ 高純度のヒアルロン酸リアーゼの溶液を塩およびダイズタンパク質加水分解物
の溶液で希釈して、溶液が、４０，０００ＩＵ／ｍＬ、０．９％の塩および１％
の加水分解物（ダイズタンパク質加水分解物から調製）を含有するようにする。
この溶液を実施例１３の記載に従ってさらに処理する。

【００７９】 実施例１７ ストレプトコッカス・アガラクチアエのホロ酵素から得られた高純度フラグメ
ントの溶液を塩およびオバルブミンの溶液で希釈して、溶液が、４０，０００Ｉ
Ｕ／ｍＬ、０．９％の塩および１％のオバルブミンを含有するようにする。この
溶液を実施例１３の記載に従ってさらに処理する。

【００８０】 実施例１８ ストレプトコッカス・アガラクチアエから得られたフラグメントの高純度の高
濃度溶液を十分な塩溶液および塩化マグネシウムで希釈して、得られた溶液が１
００，０００ＩＵ／ｍＬのリアーゼ活性を含有するようにする。この溶液を、ポ
ア径が０．２μｍの滅菌用フィルターに通して滅菌ろ過する。この溶液を１ｍＬ
ずつ、アンプルに入れる。アンプルを無菌条件下で凍結乾燥して、無菌条件下で
封をする。注射前に、１ｍＬの滅菌した蒸留水を加える。

【００８１】 （開示の要約） 本発明は、動脈の内壁でのアテローム性沈着物の結果として生じる血管性疾患
において治療的に適用される注射用調製物として特に好適な薬学的配合物に関す
る。この注射用調製物は、細菌起源のヒアルロン酸リアーゼ、またはこの酵素か
ら調製されたヒアルロン酸分解性フラグメントを含有する。細菌ヒアルロン酸リ
アーゼのヒアルロン酸分解性フラグメントもまた本発明の目的である。そのよう
なフラグメントは、特異的に分解するプロテアーゼでホロ酵素を処理することに
よって調製することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 9/10 9/06 Ｃ１２Ｎ 9/88 9/10 Ａ６１Ｋ 37/56 Ｃ１２Ｎ 9/88 37/18 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アルベルト ヘルトル ドイツ国 デー−07749 イエナ オスカ ー−ザッハウ−シュトラーセ 10 (72)発明者 グンデラ ぺッシェル ドイツ国 デー−07743 イエナ クロス ヴィッツァー シュトラーセ 21ゲー Ｆターム(参考） 4B050 CC02 DD02 LL01 4C076 AA12 BB13 CC11 CC14 DD22 DD67 FF11 FF36 4C084 AA01 AA02 AA03 BA22 BA43 BA44 CA04 DC26 MA66 NA14 ZA36 ZA45 ZA54 ZC20

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細菌起源のヒアルロン酸リアーゼを、ホロ酵素として、その
   ヒアルロン酸分解性フラグメントとして、あるいは両形態の混合物として含有し
   、かつ少なくとも１つの安定化剤および／または薬学的に安全なキャリアもしく
   は不活性な物質を含有する薬学的配合物。
2. 【請求項２】 前記ヒアルロン酸リアーゼはストレプトコッカス属の微生物
   に由来する、請求項１に記載の薬学的配合物。
3. 【請求項３】 前記ヒアルロン酸リアーゼはストレプトコッカス・アガラク
   チアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の微生物に由来
   する、請求項１に記載の薬学的配合物。
4. 【請求項４】 前記の細菌ヒアルロン酸リアーゼは、ホロ酵素の形態におい
   て、等電点が８．６の範囲にあり、分子量が１１６ｋＤの範囲にある、請求項１
   に記載の薬学的配合物。
5. 【請求項５】 前記ヒアルロン酸リアーゼの前記フラグメントは、分子量が
   ８４ｋＤ〜８６ｋＤの範囲にある、請求項１に記載の薬学的配合物。
6. 【請求項６】 不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳梗塞、脳血栓症、冠状
   動脈血栓症および心筋梗塞からなる群から選択される血管性疾患を処置するため
   の請求項１に記載の薬学的配合物。
7. 【請求項７】 プロテアーゼによる部分的な酵素的加水分解によって細菌ヒ
   アルロン酸リアーゼから得られ、芳香族アミノ酸のＣ端基を切断するヒアルロン
   酸リアーゼのヒアルロン酸分解性フラグメントを含有する、請求項１に記載の薬
   学的配合物。
8. 【請求項８】 静脈注射用または動脈注射用の注射用調製物である、請求項
   １に記載の薬学的配合物。
9. 【請求項９】 微生物起源の前記ヒアルロン酸リアーゼおよび／またはその
   フラグメントの活性が２０，０００ＩＵ／ｍＬ〜４，０００，０００ＩＵ／ｍＬ
   の間である、請求項１に記載の薬学的配合物。
10. 【請求項１０】 ヒアルロン酸リアーゼおよび／またはそのフラグメントな
    らびに約１％（ｗ／ｗ）のアルブミンおよび／またはその加水分解物を含有する
    精製された水性注射液を含む、請求項１に記載の薬学的配合物。
11. 【請求項１１】 ヒアルロン酸リアーゼおよび／またはそのフラグメントな
    らびにマグネシウム塩を含有する精製された水性注射液を含む、請求項１に記載
    の薬学的配合物。
12. 【請求項１２】 ヒアルロン酸リアーゼおよび／またはそのフラグメントな
    らびにグルコースを含有する精製された水性注射液を含む、請求項１に記載の薬
    学的配合物。
13. 【請求項１３】 ヒアルロン酸リアーゼ活性を有する細菌ヒアルロン酸リア
    ーゼの酵素フラグメント。
14. 【請求項１４】 前記ヒアルロン酸リアーゼはストレプトコッカス属の微生
    物に由来する、請求項１３に記載の酵素フラグメント。
15. 【請求項１５】 前記ヒアルロン酸リアーゼはストレプトコッカス・アガラ
    クチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の微生物に由
    来する、請求項１３に記載の酵素フラグメント。
16. 【請求項１６】 プロテアーゼによる部分的な酵素的加水分解によって細菌
    ヒアルロン酸リアーゼから得られ、芳香族アミノ酸のＣ端基を切断する、請求項
    １３に記載の酵素フラグメント。
17. 【請求項１７】 細菌ヒアルロン酸リアーゼを、担体に固定化された形態の
    プロテアーゼによる部分的な酵素的加水分解に供することで得られる、請求項１
    ３に記載の酵素フラグメント。
18. 【請求項１８】 細菌ヒアルロン酸リアーゼを、担体に固定化された形態の
    メタロプロテアーゼＭＯ／２による部分的な酵素的加水分解に供することで得ら
    れる、請求項１３に記載の酵素フラグメント。
19. 【請求項１９】 連鎖球菌から得られたヒアルロン酸リアーゼを、６．５〜
    ８．０のｐＨ範囲の酸性度および２５℃〜４５℃の範囲の温度でのメタロプロテ
    アーゼＭＯ／２による部分的な酵素的加水分解に供することで得られる、請求項
    １３に記載の酵素フラグメント。
20. 【請求項２０】 分子量が約１１５，０００Ｄ〜１２０，０００Ｄであるス
    トレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａ
    ｃｔｉａｅ）から得られたヒアルロン酸リアーゼを部分的な酵素的加水分解に供
    することで得られる、請求項１３に記載の酵素フラグメント。
21. 【請求項２１】 分子量が約８４，０００Ｄ〜８６，０００Ｄである、請求
    項１３に記載の酵素フラグメント。
22. 【請求項２２】 比活性が４００，０００ＩＵ／ｍｇ〜８００，０００ＩＵ
    ／ｍｇである、請求項１３に記載の酵素フラグメント。