JP2002531103A

JP2002531103A - 組換え細胞の作成法

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Publication number: JP2002531103A
Application number: JP2000585452A
Authority: JP
Inventors: ジョージ・エル・アセベド; ピーター・アール・ロード
Original assignee: スノル・モレキュラー・コーポレーション
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2002-09-24
Also published as: US6156514A; WO2000032821A1; CN1328605A; DK1137808T3; DE69920747T2; EP1137808B1; US6306605B1; CA2353575A1; AU1835600A; TWI221483B; ES2230908T3; EP1137808A4; EP1137808A1; CN1202261C; AU770119B2; ATE278024T1; DE69920747D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アミノ酸配列の増大された発現を有する組換え細胞および特に哺乳類の組換え細胞株を産生する方法に関する。また、アミノ酸配列を高レベルに産生する哺乳類の組換え細胞株にも関する。本発明の方法および組換え細胞株には、組換えタンパク質およびポリペプチドの効率的かつ大量の産生における使用を含む多くの有用な適用がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般的に、少なくとも一つのアミノ酸配列を発現している組換え細
胞を作成する方法に関する。本発明は、安定であり所望のタンパク質を高レベル
に発現する哺乳類の組換え細胞の産生における使用を含め、種々の有用な用途を
有する。

【０００２】（技術背景）外来（異種）の核酸を宿主細胞に導入することと、次いでその核酸を当該細胞
内において発現することにより、所望のアミノ酸を高レベルに産生するための多
くの試みがなされてきた。真核細胞および特に哺乳類細胞は雑多な結果をもって
用いられてきた。たとえば、アミノ酸配列を高レベルに産生する哺乳類の組換え
細胞の作成法の改良に向けた多くの努力にもかかわらず、当該細胞のほとんどは
当該核酸を充分なレベルで発現しない。したがってこの分野においては、導入さ
れた核酸を高レベルに発現する哺乳類の組換え細胞の生成法をもつ必要性がある
。

【０００３】一般に、哺乳類細胞において異種の核酸の発現を増強するためには二つの方法
が用いられてきた。一つのアプローチは、薬剤耐性の増幅などの細胞選択法によ
り核酸のコピー数を増やすことであった。もう一つのアプローチは、細胞内での
核酸の発現を、たとえば一つまたはそれより多い有利な調節要素を当該核酸に添
加することにより増大することであった。一般的には、「Kaufman, R.J.＆P.A.
Sharp（1982）J. Mol. Biol. 159 : 601」、「Sambrookら、Molecular Cloning
（第２版 1989）」、および「Ausubelら、Current Protocols in Molecular Bio
logy,（19890 ジョン・ウィリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、ニューヨーク
）」を参照されたい。

【０００４】特に薬剤耐性の増幅は、二つの遺伝子、すなわちその一つは異種タンパク質な
どの対象となるアミノ酸配列をコードしており、もう一つはジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ＤＨＦＲ）などの選択可能な遺伝子マーカーをコードしている遺伝子を
用いた細胞の形質転換を含むことが報告されている。遺伝子マーカーがＤＨＦＲ
の場合には、形質転換された細胞は選択薬剤メトトレキセート（ＭＸＴ）の存在
下に培養される。正常には細胞毒性であるＭＸＴの効果は、ＤＨＦＲの発現によ
り実質的に排除される。形質転換細胞はＤＨＦＲのコピー数を充分に高いレベル
まで増加（増幅）させたため生き残る。このアミノ酸配列をコードする核酸配列
もまた増幅され、それにより当該配列の発現が増強される。上記の「Kaufman, R
.J. ＆P.A. Sharp」を参照。

【０００５】しかしながら、薬剤耐性の増幅および関連技術には欠陥があることがわかって
いる。たとえば、この技術を用いたほとんどの哺乳類の組換え細胞株の生成には
時間がかかり、実行には数ヵ月を必要とすることがある。さらに、異種の核酸が
増幅される場合には標準的な核酸配列決定法はネガティブに強く影響される可能
性があるという認識がある。さらに、厳しくまた時には長期間の選択圧を強いる
ことなく、充分な核酸のコピー数を維持することには、非常に困難なことがある
。拡大された選択圧を必要とする細胞選択戦略には費用がかかることがあり、ま
た異種タンパク質が製薬的な使用のために産生されるような場合には、規制上の
問題を提起するかもしれない。

【０００６】さらに、薬剤耐性の増幅は、特定の異種の核酸を商業用または研究用の使用と
いった適用に充分なレベルにまで発現を亢進することができないことがある。

【０００７】薬剤耐性の増幅に関するさらなる問題は、クローン化された細胞株の遺伝的不
安定性を含む。これらの問題は非常に重要である。たとえば、この方法はしばし
ば、不安定な遺伝子増幅の結果、たとえば微小染色体対の形成から展開する組換
え細胞を産生する。このような細胞は、選択薬剤が除去されると所望の性質を失
うことがある。Kaufman, R.J. ら（1985）Mol. Cell Biol. 5 : 1750およびそれ
に引用された参考文献を参照のこと。

【０００８】さらに、ほとんどの薬剤耐性の増幅技術の最適な実施には、高度に特殊化され
た細胞、ベクター、および／または細胞の増殖条件が必要になっていた。たとえ
ばほとんどの方法は、特別な方法で遺伝的に操作された宿主細胞を使用している
。かかる突然変異細胞は、いくつかの適用には適さないことがある。この点の難
しい実例として、ＤＨＦＲとＭＴＸに関係する薬剤耐性の増幅は、正常なＤＨＦ
Ｒ遺伝子をもっている細胞においては最適に作動することはない。その正常な遺
伝子を無能にすることは、長くて面倒な工程となる可能性がある。「Wiglerら、
（1980）PNAS（USA）3567」および「Urlaub＆Chasin（1989）PNAS（USA）77 : 4
216」を参照されたい。

【０００９】特別のベクターと増殖条件とを用いることに関するＤＨＦＲ／ＭＴＸ増幅法の
さらに特殊な欠点が開示されている。上記の「Kaufman & Sharp」、「Schimke,
R. Cell（1984）37 ; 705」を参照されたい。また米国特許第５,６８６,２６３
号；同第４,９５６,２８８号および同第５,５８５,２３７号と、それらに引用さ
れた参考文献も参照されたい。

【００１０】適応性があり、かつ遺伝的に安定した組換え細胞株を産生するべく用いること
が可能な組換え細胞の作成法をもつことは有用であろう。高度に特殊化された細
胞、ベクター、および／または増殖条件の使用を有意に減じるかまたは避けた、
哺乳類の組換え細胞株の産生法をもつことは、特に望ましいであろう。これらの
方法によって作られた、異種タンパク質などの対象となるアミノ酸配列を高レベ
ルに産生する哺乳類の組換え細胞株をもつことは、さらに望ましいであろう。

【００１１】（発明の開示）本発明は組換え細胞の産生法に関し、特に、遺伝的に安定しておりかつ少なく
とも一つのアミノ酸配列を高レベルに発現する組換え細胞株を産生する方法に関
する。一つの様態においては、本発明は異種のタンパク質を高レベルに発現する
組換え細胞株の産生法を提供する。この方法は一般的に、当該アミノ酸配列をコ
ードする少なくとも一つのベクターを宿主細胞に導入することと、当該配列を高
レベルに産生する組換え細胞株の単離を導く条件に当該細胞をさらすことを含包
する。好ましい方法は、高レベルのアミノ酸配列を産生すると共に、高度に特殊
化された宿主細胞、ベクター、および／または増殖条件の使用を有意に減じてい
る。さらに、本発明の方法によって産生される哺乳類の組換え細胞株が提供され
る。

【００１２】より詳しくは、本発明は、遺伝的に安定しておりかつ少なくとも一つの対象と
するアミノ酸配列を高レベルに発現する哺乳類の組換え細胞株を産生する方法に
関する。一つの態様においては、このアミノ酸配列の発現は当該配列をコードす
る第１のベクターを宿主細胞に導入することにより実質的に増進される。第１の
ベクターは少なくとも一つの選択可能な配列、典型的には当該アミノ酸配列をコ
ードするセグメントに操作可能に結合された第１の選択可能な配列を含む。さら
に、第１のベクターは所望であれば当該アミノ酸配列のコピーよりも多くをコー
ドしてもよい。第１のベクターは宿主細胞に１回（一つずつ）か、または必要に
応じて１回よりも多く（多重に）導入されることができる。次いで宿主細胞は、
当該アミノ酸配列の発現を促す条件下に培養され、続いて当該配列を第１の高い
発現レベルで発現している組換え細胞株（第１の高発現細胞）が単離される。

【００１３】この方法はさらに、好ましくは第１の高発現細胞に、当該アミノ酸配列をコー
ドする第２のベクターを導入することを含む。第２のベクターは第１のベクター
と同じかまたは異なってもよく、必要であれば当該アミノ酸配列の１コピーより
多くを含んでもよい。第２のベクターは第１の高発現細胞に１回（単独）か、ま
たは必要に応じて１回よりも多く（多重に）導入される。次いで第２のベクター
を含んでいる組換え細胞は、当該アミノ酸配列の発現を導く条件下に培養される
。当該アミノ酸配列を第２の高い発現レベルで発現している細胞（第２の高発現
細胞）が実質的に単離される。

【００１４】上述のように、先の細胞選択の計略および特に薬剤耐性増幅技術によって作成
された細胞株は不利益をこうむってきた。特別な不利益には、遺伝的不安定性と
、高度に特殊化された細胞、ベクター、および／または増殖条件を使う必要性と
が含まれる。本発明の方法は、当該アミノ酸配列を高レベルに産生する遺伝的に
安定した細胞株を産生することにより、このような不利益を有意に回避する。さ
らに、本発明の方法は先の企画よりも一般的により適応性があり、かつ広範囲の
ベクターとの適合性がある。ほとんどの初代、２代、または培養された哺乳類細
胞を含め、ほとんどどのようなトランスフェクション可能な細胞でも、この方法
について使用することができる。好適には本発明の方法は、特定のトランスフェ
クション可能な哺乳類細胞の、必要に応じた種々の選択または非選択的な増殖条
件下における増殖を提供する。

【００１５】さらなる特別の適応性は、当該アミノ酸配列を高レベルに発現している組換え
細胞の直接または間接的な選択に備えることによって提供される。たとえば、本
方法の一つの態様においては、哺乳類の組換え細胞株は少なくとも一つのベクタ
ーにコードされた細胞表面マーカーの選択によって間接的に選択される。本発明
によるこの細胞表面マーカーの選択は、当該アミノ酸配列を高レベルに発現する
細胞株の効率的な単離を促進する。議論されたように、結果として得られる細胞
株は遺伝的に安定であり、高度に特殊化された細胞、ベクター、および／または
増殖条件の使用を最小限にするか除外しながら産生されることが可能である。

【００１６】本方法の特別な態様においては、第２の高発現レベルは第１の高発現レベルよ
りも、実質的に少なくとも約２〜１０倍まで高いフォールドか、またはそれより
多いフォールドになっている。タンパク質などのアミノ酸配列のレベルの測定法
はこの分野において周知であり、抗体反応性などの確実な技術を含む。

【００１７】さらに特別の態様においては、この方法はさらに、当該アミノ酸配列をコード
する第３のベクターを第２の高発現細胞に導入することと、第２の発現レベルよ
りも高い第３の発現レベルにおいて当該アミノ酸配列を発現することを導く条件
下に細胞をさらすことを含む。次いで当該アミノ酸配列を第３の発現レベルで発
現している細胞は、細胞株（第３の高発現細胞）を産生するべく単離される。第
３のベクターは、好ましくは少なくとも一つの対象とするアミノ酸配列をコード
しており、またそれは第１または第２のベクター（または双方のベクター）と同
じか、または異なることが可能である。第３のベクターは、第２の高発現細胞に
１回（一つずつ）か、または必要に応じて１回よりも多く（多重に）導入される
ことができる。第３の高発現細胞は、第１または第２の高発現細胞に比較した時
、典型的には当該アミノ酸配列の増大された発現を示すであろう。

【００１８】もう一つの特別の態様においては、この方法はさらに第３の高発現細胞に、当
該アミノ酸配列をコードする少なくとも一つのベクター、好ましくはかかるベク
ターの一つを導入することと、第３の発現レベルよりも高いレベルにおいて当該
アミノ酸配列を発現することを導く条件下に細胞をさらすことを含む。この方法
はさらに、第３の高発現細胞よりも高いレベルにおいて当該アミノ酸配列を発現
している細胞株を単離するために、導入するおよびさらす工程を少なくとも１回
、好ましくは約２から１０回の間か、またはそれよりも多く反復することを含む
。この工程が何回繰返されるかの選択は、いくつかのパラメーターによって左右
されるであろうが、特に、必要とされる発現のレベルによる。

【００１９】もう一つの態様においては、第１のベクターの選択を導く条件下に宿主細胞を
培養する工程は、さらに宿主細胞を選択培地中で増殖させることを含む。好まし
くは、当該選択培地は第１の選択可能な配列のための、少なくとも一つの薬剤お
よび通常は一つの薬剤を含む。選択可能な核酸配列を含む本文に開示されたベク
ター、たとえば第１および第４のベクターが、通常は選択可能な一つのアミノ酸
配列をコードすることは認識されるであろう。ベクターの選択のための実例とな
る薬剤は、以下の議論および実施例において述べられている。

【００２０】第２または第３のベクター（または双方のベクター）は、少なくとも一つの選
択可能な配列および特に細胞表面タンパク質などの選択可能な細胞表面マーカー
をコードする少なくとも一つの他のベクター（本文においては時に「第４の」ま
たは「第５の」ベクターと呼ばれる）と共に細胞に同時導入されることがしばし
ば好ましいであろう。驚くべきことに、選択可能な細胞表面マーカーをコードす
るベクターを同時導入することにより、所望のアミノ酸配列を高レベルに発現し
ている高度に有用な哺乳類の組換え細胞株の産生を容易にすることができること
が発見されている。たとえば、当該ベクターを本発明に一致して同時導入するこ
とにより、高度に特殊化された細胞、ベクター、および／または増殖条件を用い
る必要性を減じるかまたは全く排除しながら細胞株を生成することが可能である
ことが見出されている。さらに、遺伝的に安定な組換え細胞の産生は、この方法
の実施により有利に運ばれる。

【００２１】この方法のもう一つの態様においては、第２のベクターを第１の高発現細胞に
導入する工程はさらに、第４のベクターを当該細胞へ導入することを含む。上述
のように、第４のベクターは少なくとも一つの選択可能な配列（本文においては
「第２の」選択可能な配列と呼ばれる）、好ましくは選択可能な細胞表面マーカ
ーをコードする。第４のベクターは、この方法の同じもう一つのベクターであっ
てもよいが、ほとんどの場合には第４のベクターはこれらのベクターのどれか一
つまたはすべてと異なるであろう。もう一つの態様においては、第４のベクター
は興味のアミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合された第２の選
択可能な配列を含む。さらに特別の態様においては、この方法はさらに、第２の
選択可能な配列の選択のための少なくとも一つの薬剤を含んでいる選択培地にお
いて当該細胞を増殖させることを含む。

【００２２】第４のベクターが細胞表面マーカーをコードする態様においては、この方法は
好ましくはさらに、クロマトグラフィー、細胞のパンニング、フローサイトメト
リー、抗体結合、免疫沈降、または抗体結合の少なくとも一つにより、当該選択
可能な細胞表面マーカーを発現している細胞を単離することを含む。通常は、こ
のような技術の一つが細胞表面マーカーを発現している細胞を単離するべく用い
られるであろう。単離を促すことにより、ベクターによりコードされたアミノ酸
配列を高レベルに発現している細胞株が取得される。

【００２３】この方法のもう一つの態様においては、第３のベクターを第２の高発現細胞へ
導入する工程は、さらに第５のベクターをこの細胞に導入することを含む。特別
の態様においては、第５のベクターは少なくとも一つの選択可能な配列（本文で
は「第３の」選択可能な配列と呼ばれる）をコードする。第５のベクターは本文
に開示されたベクターのいずれかと同じかまたは異なってよい。さらに特別の態
様においては、第５のベクターは、所望であれば当該アミノ酸配列をコードする
セグメントに操作可能に連結されることが可能な第３の選択可能な配列を含む。
次に細胞は、第２の発現レベルよりも高い第３の発現レベルで当該アミノ酸配列
を発現することを促す条件下にさらされる。好ましくはこの方法はさらに、第３
の選択可能な配列の選択のための少なくとも一つの薬剤および好ましくは一つの
薬剤を含む選択培地においてこの細胞を増殖することを含む。

【００２４】さらに好ましい第５のベクターは、第４のベクターによってコードされた細胞
表面マーカーと同じかまたは異なることが可能な選択可能な細胞表面マーカーを
コードする配列をさらに含む。所望であれば、この選択可能な細胞表面マーカー
は、当該アミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合されることがで
きる。この方法はさらに、第５のベクターによってコードされた選択可能な細胞
表面マーカーを発現している細胞を単離する工程と、必要に応じて第４または第
５のベクター（または双方のベクター）により発現された細胞表面マーカーを発
現している細胞を単離するべく、クロマトグラフィー、細胞のパンニング、フロ
ーサイトメトリー、抗体結合、免疫沈降、または抗体結合の少なくとも一つを用
いることを含む。単離を行なうことにより、当該ベクターによってコードされた
アミノ酸配列を高レベルに発現している組換え細胞株が取得される。

【００２５】本発明に一致したさらに特別の第２の高発現細胞は、定量ゲル電気泳動、クロ
マトグラフィー、およびウェスタンイムノブロット、ＥＬＩＳＡ、および抗体反
応性といった免疫学的技術などの標準的なタンパク質定量技術により決定される
際、一般に第１の高発現細胞よりも少なくとも約２倍の当該アミノ酸配列を発現
する。さらに特別な第２の高発現細胞は、抗体反応性により決定される際、第１
の高発現細胞に比較して約３から約４０倍の間の当該アミノ酸配列を発現する。

【００２６】特別に興味のある第３の高発現細胞は、標準的なタンパク質配列定量技術によ
って決定される際、一般に第２の高発現細胞よりも少なくとも約２倍多い当該ア
ミノ酸配列を発現する。さらに特別の第３の高発現細胞は、抗体反応性によって
決定された場合、第２の高発現細胞に比較すると、約３から約４０倍の間の当該
アミノ酸配列を発現する。

【００２７】この方法のさらに特別の態様においては、第１、第２、または第３のベクター
は各々独立して第１の薬剤耐性遺伝子（本明細書では時に遺伝子マーカーと呼ば
れる）、選択可能な細胞表面マーカー、および第２の薬剤耐性遺伝子を各々コー
ドする。この態様においては、各々のベクターは対象とするアミノ酸配列をコー
ドするセグメントに操作可能に結合されている。さらに、第４および第５のベク
ターは、各々無関係に第３の薬剤耐性遺伝子およびもう一つの細胞表面マーカー
を各々コードする。第１、第２、および第３の薬剤耐性遺伝子は、必要に応じて
同じかまたは異なることができる。例示薬剤耐性遺伝子および選択可能な細胞表
面マーカーは、以下にさらに詳細に述べられている。

【００２８】本発明の一つの実例として、異種タンパク質を最適に発現するために、高度に
特殊化されたベクターかまたは増殖条件を必要としない、好適な哺乳類の宿主細
胞がまず選ばれる。好ましい哺乳類の宿主細胞は、異種タンパク質を検出可能な
レベルで発現しない。しかしながらいくつかの例では、適当な哺乳類の宿主細胞
は当該タンパク質を同種タンパク質として、たとえばバックグラウンド（すなわ
ち基本の）レベルですでに発現していてもよい。この場合には、本発明はこの同
種タンパク質の発現を基本レベルよりも高いレベルにまで押上げるために使用さ
れることができる。あるいはこの方法は、所望の異種タンパク質またはポリペプ
チド配列の細胞発現を増強するために使用されることが可能である。さらに特別
の哺乳類の宿主細胞は下記に提供される。

【００２９】第１のベクターの哺乳類の宿主細胞への導入に続き、第１の高発現細胞は、一
般に第１のベクターを選択するための増殖培地において単離される。第２の高発
現細胞は、当該アミノ酸配列をコードする第２のベクターを第１の高発現細胞へ
導入することによって産生される。一つの態様においては、第１および第２のベ
クターは一つの異種タンパク質の１コピーをコードしており、実質的には同一で
ある。第２のベクターの導入は、選択可能な細胞表面マーカーをコードするもう
一つの（「第４の」）ベクターの導入を伴う。第２の高発現細胞の単離は、この
細胞表面マーカーの選択を促す条件下に行なわれ、所望であれば選択培地におけ
る増殖を任意に含んでもよい。この態様においては、細胞表面マーカーの選択が
、第１および第２のベクターによってコードされた所望のアミノ酸配列の高度の
同時発現も選択する。当該細胞を選択するための、高度に特殊化された宿主細胞
、ベクター、および増殖培地の使用は、この実例においては有意に減じられる。

【００３０】本発明は広範囲の組換え細胞および、特に少なくとも一つの所望の対象とする
アミノ酸配列か、または機能性のタンパク質フラグメントなどの当該アミノ酸配
列の一部分を高レベルに発現する哺乳類の細胞株を作成するべく用いられること
が可能である。たとえば、この発明の方法は、免疫グロブリン鎖（重鎖または軽
鎖）か、またはそれらの機能性フラグメントといった免疫学的に興味のあるアミ
ノ酸配列を発現するべく用いられることが可能である。さらに特異的な対象とす
るアミノ酸配列について、以下に議論する。

【００３１】本発明は、以前の細胞選択技術および特に通常の薬剤耐性増幅法と対比された
場合、有意な利点を提供する。たとえば、上述のように、ほとんどの薬剤耐性増
幅法は一般的に高度に特殊化された細胞株、ベクター、および増殖条件の使用を
必要とする。ほとんどの例では、細胞はある薬剤に対する抵抗性を阻害するべく
遺伝的に操作されており、常に良好な増殖特性を示すわけではない。さらに、か
かる細胞は作成および／または維持することが難しいことがあり、多くの特異的
な細胞選択戦略用には特に不適切であってよい。本発明は、このような高度に特
殊化された細胞株の使用を減じるかまたは除外する組換え細胞株の生成法を提供
することにより、これらの欠点を処理する。

【００３２】さらに、本方法は異種の核酸を宿主細胞ゲノムに導入することにより、結果と
して得られる組換え細胞株の遺伝的安定性を最大限にする。高度に不安定な染色
体の形成は減じられ、しばしば完全に回避される。

【００３３】本発明によりさらなる利点が提供される。たとえば、本方法は哺乳類の組換え
細胞の生成については先の方法よりも実質的にさらに適応性があり、かつ種々の
哺乳類の発現ベクターと共に用いられることができる。対照的に、薬剤耐性増幅
といった先の細胞選択技術のほとんどは、高度に特殊化されたベクターを用いた
使用に合わせられている。この問題の一つの実例として、多くの薬剤耐性増幅技
術のためのベクターは大きくなりすぎ、操作することが困難になったことが認め
られている。また、先の細胞選択計画について使用するためのほとんどの最適な
ベクターは特許薬品であり、必要な時にいつでも入手できるとは限らない。本発
明はこの問題を、たとえば広範囲の哺乳類の発現ベクターとの適合性を提供する
ことにより解決する。

【００３４】議論されたように、本文に述べた少なくとも一つのベクターは、対象のアミノ
酸配列の一部分をコードしてもよい。一つの実例として、ある特定の完全長の異
種タンパク質については、第１のベクターは当該タンパク質の１番目の部分をコ
ードすることができ、第２、第３、第４、および第５のベクターの少なくとも一
つが当該タンパク質の同じかまたは異なる他の部分をコードすることができる。
この実例においては、ベクターによってコードされるタンパク質配列の総計は、
完全長の当該タンパク質と実質的に同等となる。もう一つの実例では、第１のベ
クター（または他のいずれかのベクター）は完全長をコードしてよく、少なくと
も一つの他のベクター、たとえば第２、第３、または第４のベクターが当該タン
パク質の特定の部分をコードしてもよい。残りのベクターは、たとえば当該タン
パク質配列の付加的な部分か、または所望であれば完全長のタンパク質配列でさ
えも導入するべく使用されることができる。

【００３５】この方法の、対象とするアミノ酸配列の部分を導入する能力は、いくつかの利
点を提供する。たとえば、この方法は一つまたはいくつかのアミノ酸配列部分の
高度に制御された増幅を提供するべく使用されることができる。すなわち、全配
列を含めた当該アミノ酸配列の特定の部分が、特定の細胞（たとえば第１または
第２の高発現細胞）において、他の配列の増幅に先立つかまたは同時に増幅され
ることができる。したがって本発明は、一つまたはいくつかの対象のアミノ酸配
列の連続的かつ統合的発現（sequentical and cordinate expression）に必要な
手段をもつ。

【００３６】さらに特異な実例として、第１のベクターは多サブユニットタンパク質（同種
または異種の）の第１のサブユニットをコードすることができ、さらに第２のベ
クターがその同じタンパク質の第２のサブユニットをコードすることができる。
この実例においては、第１のサブユニットをコードするベクターは宿主細胞へ導
入されることができ、第１の高発現細胞が選択される。第２のサブユニットをコ
ードする第２のベクターは、第１の高発現細胞に導入されることができ、第１お
よび第２のサブユニットの双方を発現する第２の高発現細胞が選択される。もし
、たとえば多サブユニットタンパク質が２量体であるなら、当該タンパク質は第
１の高発現細胞において、第１および第２のサブユニットの発現が亢進される条
件下に特異的に形成されることができる。したがって本発明は、サブユニットの
発現が連続的かつ高度に制御された条件下での、多サブユニットタンパク質の集
合および安定性の分析のために特に有用である。

【００３７】特に期待されるのは、免疫グロブリンおよび特に免疫グロブリンの重鎖および
軽鎖などの免疫学的に興味のあるタンパク質の、連続的かつ高度に制御された集
合である。

【００３８】さらに一般的には、本発明は、実質的な適応性と増幅過程を通じた制御とを提
供することにより、多サブユニットタンパク質の集合のための戦略の実行を容易
にする。たとえば、この方法はサブユニットの産生を、たとえば細胞内のあらか
じめ決められた高い発現レベルにおいて亢進するために使用されることができる
。対照的に、先行のほとんどおよび特に薬剤耐性増幅技術は、実質的により適応
性が低く、サブユニットの集合を通しての制御は提供しない。

【００３９】もう一つの観点においては、本発明は本明細書に開示された方法により産生さ
れる細胞株、および特に哺乳類の組換え細胞株を提供する。かかる細胞株は概し
て安定であり、当該アミノ酸配列またはそれらの部分を高レベルに発現するため
に特異的に選択される。本発明の方法は、特に、少なくとも異種のタンパク質を
高レベルに発現する哺乳類の組換え細胞株の選択に必要な手段を備えている。

【００４０】本発明の特別な方法は、さらなる利点を提供する。たとえば、哺乳類の組換え
細胞株（時には「高発現細胞株」と呼ばれる）を生成するための方法の実行は、
ほとんどの先の薬剤増幅法を含めた他の細胞選択法よりも有意に少ない時間内に
行なわれることができる。さらにこの方法は、先のほとんどの方法よりも回数の
少ない細胞継代を用いることによって高産生細胞を産生しており、それにより労
力および培地の費用が減じられる。

【００４１】本明細書に開示されたすべての文献はことごとく参考文献に取込まれている。
以下の制限しない実例は、本発明を説明するものである。

【００４２】（発明を実施するための最良の形態）前記されたように、本発明は広範囲の細胞および特に組換え細胞株を作成する
方法を提供する。特に、一般的に安定しており、かつ興味の異種または同種のタ
ンパク質を高レベルに発現する哺乳類の組換え細胞株の作成法が提供される。上
述のように、本発明は適応性があり、高度に特殊化された細胞、ベクター、およ
び／または増殖条件の使用を有意に避けながら、当該タンパク質を高レベルに産
生する高度に有用な細胞株を作成するべく使用されることが可能である。さらに
、当該タンパク質を高レベルに産生する哺乳類の組換え細胞株が提供される。

【００４３】一般に、本発明の最適な実施は、認められた操作の使用によって行なわれる。
たとえば、ＤＮＡの単離、ＤＮＡの発現用ベクターの作成および選択、核酸の生
成および分析のための技術、組換えベクターＤＮＡの作成、制限酵素を用いたＤ
ＮＡの切断、ＤＮＡの連結、ベクターＤＮＡを含んでいるＤＮＡの安定または一
過性の手段による宿主細胞への導入、選択または非選択培地中での宿主細胞の培
養のための特別な方法、代表的な宿主細胞、安定または一過性にＤＮＡを発現し
ている細胞を選択および維持するための方法は、この分野においては一般的に周
知である。全体的には、上記「Sambrookら」、および上記「Ausubelら」を参照
されたい。

【００４４】本発明は、一つの観点において、哺乳類の組換え細胞株を生成するための新規
な方法を提供する。組換え哺乳類細胞株は、本明細書では時に「高産生」細胞株
か、または関連用語で呼ばれるであろう。「高レベル」、「高産生」などの文言
が、当該細胞株によって産生されるアミノ酸配列の量を指すために用いられる場
合には、親細胞または親の細胞株に比較して、少なくとも２倍、および好ましく
は約３倍から約４０倍までの間、あるいはそれより多い（いくつかの異種の配列
は親の細胞株には存在していない）アミノ酸配列が当該細胞株によって産生され
ることを意味する。

【００４５】本明細書に述べられる組換え細胞株によって産生される特定のアミノ酸配列の
量を決定する方法は、この分野では周知であり、タンパク質のゲル電気泳動など
のクロマトグラフ法と、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡといった免疫学
的技術とを含む。さらに特別のゲル電気泳動法は、クマシーブルーまたは銀染色
を用いてタンパク質またはペプチド配列が検出され定量される方法を含む。好ま
しいタンパク質定量法は抗体反応性である。

【００４６】「抗体反応性」という用語により、所望の抗体と、当該細胞または細胞株によ
って産生されたアミノ酸配列との間の特異的な結合が意味される。この用語はさ
らに、たとえばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ゲル移動度シ
フト測定、エンザイムイムノアッセイ、競合測定、飽和検定、またはこの分野に
おいて知られている他の適当なアミノ酸配列結合測定法により測定される、当該
アミノ酸配列（すなわちその上のエピトープ）と抗体（他の分子には有意に結合
しない）との間の特異的な結合対の形成を指すことを意味する。これらの、およ
び、他の適当な測定法に関する開示については、全般的には、「HarlowおよびLa
ne著、Antibodies：A Laboratory Manual、CSH出版、ニューヨーク州（1988）」
を参照されたい。

【００４７】「親の」という用語により、それが宿主細胞または細胞株を指すために用いら
れている場合には、後の細胞株を作成するために用いられた当該細胞または細胞
株の祖先が意味される。実例となる親細胞は、第１の高発現細胞を作成するため
に用いられた適当な宿主細胞である。第１の高発現細胞は、今度は第２の高発現
細胞を作成するために用いられた親の細胞株の実例である。細胞株とは、他にこ
とわらない限り、単一の祖先細胞から由来したクローン性細胞集団であることが
理解されよう。細胞株の作成法はこの分野では一般に知られており、周知の連続
希釈法を含む。上記「Ausbelら」を参照されたい。

【００４８】本発明の一つの観点によれば、異種タンパク質などの特異的なアミノ酸配列の
増大された発現を提供する哺乳類の宿主細胞は、少なくとも一つの選択可能な配
列と、好ましくは当該タンパク質をコードするセグメントに操作可能に結合され
た一つの選択可能な配列（第１の選択可能な配列）とを含む第１のベクターを、
当該細胞へ導入することにより取得される。当該タンパク質を第１の高い発現レ
ベルで発現している細胞（第１の高発現細胞）の培養および単離に続き、当該タ
ンパク質をコードする第２のベクターが、第１の高発現細胞へ導にされる。一般
的に、第２のベクターの導入は、少なくとも一つの、および好ましくは一つの選
択可能な細胞表面マーカーをコードするもう一つのベクター（すなわち第４のベ
クター）の導入と同時に行なわれることが好ましい。しかしながら、他の態様に
おいては、第２のベクターは当該タンパク質と、少なくとも一つの細胞表面マー
カー、好ましくは一つのかかるマーカーとの双方をコードする。当該細胞は、第
１の発現レベルよりも高い第２の発現レベルにおいて当該アミノ酸配列が発現す
ることを導く条件にさらされる。好ましい条件は、少なくとも一つの細胞表面マ
ーカーについて選択し、高度に特殊化された細胞、ベクター、および増殖条件は
使用しない。当該タンパク質を第２の発現レベルで発現している細胞株は、次い
で第２の高発現細胞を産生するべく単離される。

【００４９】「単離された」とい用語は、それが本文に開示された特別の細胞または細胞株
を指す場合には、少なくとも約８０〜９５％（ｗ／ｗ）の均一性まで精製された
細胞を意味する。より高い純度、たとえば少なくとも約９８％〜９９％の均一性
（ｗ／ｗ）に精製された細胞が、ほとんどの適用にはさらに好ましい。一旦精製
されれば、当該細胞は認められた連続希釈法を用いて、細胞のトランスフェクシ
ョンまたは細胞株の確立といった次の操作のために用いられることができる。

【００５０】議論されたように、第１および／または第２のベクターは、各々の細胞へ１回
（一つずつ）または１回より多く（多重に）、好ましくは約２から約２０回まで
の間、およびさらに好ましくは約２から５回までの間、必要に応じて導入される
ことができる。第１および／または第２のベクターを各々の細胞へ１回または１
回より多く導入するかどうかの選択は、所望の亢進された発現レベルおよび興味
の特定のアミノ酸配列といったいくつかのパラメーターにより左右されるであろ
う。

【００５１】さらに特別の態様においては、第２の高発現細胞の選択に用いられる条件は、
少なくとも一つの細胞表面マーカー、好ましくは一つの細胞表面マーカーを含み
、当該マーカーは第１の高発現細胞に同時導入されたベクターの一つによってコ
ードされている。議論されたように、それらのベクターは第４または第５のベク
ターであることができる。本発明の方法のこの態様が、薬剤耐性増幅術などの先
の発現システムに対する実質的な改良であることが強調される。たとえば、当該
細胞にベクターを同時導入することにより、第２の高発現細胞の選択が、それに
より多くの問題がすでに議論された細胞表面マーカーの選択によって促されるこ
とができる。また有意なことには、本発明による第１および第２のベクターの連
続的な導入は、当該アミノ酸配列のレベルの合計よりも高く当該アミノ酸配列の
発現レベルを亢進することができる。

【００５２】「アミノ酸配列」は一般的に、その大きさにかかわらず、基本的には２０個の
アミノ酸のいずれかから成るポリマーを指す。この用語は本明細書においてはタ
ンパク質を指すために用いられるが、この用語は他に特別にことわらないかぎり
、ポリペプチドおよびペプチドを含むものと理解されよう。当該アミノ酸配列は
、完全長のタンパク質（発現細胞に関して異種かまたは同種）か、または機能性
フラグメントなどのそれらの一部分をコードしてもよい。さらに特別のアミノ酸
配列については以下に述べられている。特別に好ましいアミノ酸配列は、免疫グ
ロブリン重鎖、軽鎖；またはそれらの機能性フラグメントである。

【００５３】「機能性フラグメント」という用語により、それがアミノ酸配列に関して使用
される場合には、完全長のアミノ酸配列のうちの少なくとも一つの活性を有する
アミノ酸配列である、少なくとも一つのセグメントが意味される。タンパク質配
列に関しては、これらの活性は特異的な結合および酵素的な活性を含む。好まし
い機能性フラグメントは、適当な分析法によって測定された場合、完全長のタン
パク質の少なくとも約７０％、および、さらに好ましくは約８０％から約９５％
の間である。

【００５４】「操作可能に結合された」という用語により、機能的な関係性におけるポリヌ
クレオチドエレメントの結合が意味される。核酸は、それがもう一つの核酸配列
と機能的関係におかれる場合、本発明によれば「操作可能に結合される」。特に
、操作可能に連結された配列は、同一のベクターか、または同一細胞内の異なる
ベクター上に存在してもよい。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは一
つの特別なコード配列について、もしそれがそのコード配列の転写に影響を及ぼ
すのであれば、操作可能に結合されている。すなわち、この例に関しては、「操
作可能に結合された」は結合されているＤＮＡ配列が隣接しており、さらに、二
つのタンパク質コード領域を結合する必要があるところで、隣接しかつリーディ
ングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、いくつかの例では、操作
可能に結合された配列は異なるベクター上に存在してもよい。一つの実例として
、多サブユニットタンパク質の一つのサブユニットをコードするベクター配列は
、そのタンパク質のもう一つのサブユニット（結合相手）をコードするベクター
配列に操作可能に結合されることとなる。

【００５５】本発明の方法は、広範囲の宿主細胞、特に組織培養に良好に適合されたものに
ついて操作可能であり、かつ高度に有用である。一般的には、宿主細胞は真核性
であり、好ましくは標準的な培地標品において良好な増殖特性を示す哺乳類細胞
である。実質的にはほとんどすべての非微生物細胞は、先に形質転換されていて
もいなくても、また所望のアミノ酸配列を高レベルに発現することができてもで
きなくても、本発明に使用されることができる。このような種々の細胞はこの技
術において知られており、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ヒーラ、および他の細胞を含む。
全般的には、上記「Sambrookら」、および上記「Ausubelら」、および、「アメ
リカン・ティシュー・タイプ・カルデャー・コレクション、10801 ブルバール大
学、マナサス、バージニア州」を参照されたい。

【００５６】以下に続く議論および実施例から、またさらに明らかにされるように、種々の
ベクターおよび特に哺乳類の発現ベクターが、本発明に用いられることができる
。特別のベクターは、概して自己複製および好ましくは所望の宿主細胞または細
胞株における選択のための適当な調節配列を含むであろう。

【００５７】「ベクター」という用語は、より特別には、宿主細胞に取込まれることと、結
果として興味の核酸配列の発現を生じることが可能な興味の核酸配列として定義
される。当該興味の核酸配列は、好ましくは上述のアミノ酸配列のすべてか、ま
たは重要な一部分をコードするであろう。適当なベクターは、直鎖の核酸、プラ
スミド、コスミド、ファージミド、エピソーム、および染色体外ＤＮＡを含むこ
とができるがこれに制限されない。さらに、ウイルスＤＮＡおよびウイルスＲＮ
Ａが含まれる。特に、当該ベクターは組換えＤＮＡであることができる。また本
文において用いられたように、「発現」または「遺伝子の発現」という用語は、
ＤＮＡの転写とＲＮＡ転写物の翻訳とを含め、対象の核酸配列のタンパク質産物
を指すことが意味される。

【００５８】本発明に使用するためのさらに特別のベクターは、少なくとも一つの選択可能
な核酸配列、通常はかかる配列の一つを含む。例証のためには、選択可能な配列
は、時に当該配列が細胞内の配列をコードする場合には選択遺伝子マーカー（ま
たは関連用語）；または当該配列が細胞表面タンパク質をコードする場合には細
胞表面マーカー（または関連用語）と呼ばれる。

【００５９】広範囲のベクターにコードされた選択可能な配列が本発明に適合することが明
らかであろう。好ましいベクターは、ベクターまたは同時導入された他のベクタ
ーを細胞内にかくまう宿主細胞または細胞株の選択を容易にする。その目標は、
続けて毒性薬剤にさらされる細胞の実質的な生残を含めた種々の技術により成遂
げられる。一般的には、「Southern, P.J.ら（1982）J. Mol. Appl. Gen. 1 : 3
27」、上記「Sambrookら」、および「Ausubelら」を参照されたい。

【００６０】例として、この発明に使用するための例証となる選択遺伝子マーカーは、ある
種の栄養要求性真核細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
のためのＤＨＦＲ、アミノ配糖体抗生物質Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ（ｈｍ
ｂ）、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（ｎｅｏ）、ピュ
ーロマイシン、およびアデンシンデアミナーゼ遺伝子を含む。ある状況において
は、ベクターによってコードされた所望のアミノ酸配列自体が充分な選択マーカ
ーであってよく、あるいは選択マーカーの機能にポジティブに強い影響を与えて
もよい。アミノ酸配列自体が選択マーカーをコードする場合には、別の選択マー
カーが当該ベクターに含まれる必要はない。「Southern, P.J.ら（1981）J. Mol
. Biol. 150 : 1」、上記「Sambrookら」、および上記「Ausubelら」を、また遺
伝子マーカーに関する付加的な開示についてはそれらの引用文献を参照されたい
。

【００６１】上述のように、選択可能な核酸配列は、適当な細胞表面マーカーおよび特に細
胞表面タンパク質をコードしてもよい。代表的な細胞表面マーカーは、細胞表面
レセプター、糖タンパク質、炭水化物、タンパク質、リポタンパク質、主要組
織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ／ＨＬＡ）、抗体、抗原、またはそれらの機能性フ
ラグメントを含む。さらに特別の細胞表面マーカーは、典型的にはＴ細胞に見出
されるＧＤ（分化クラスター）糖タンパク質などの免疫学的に興味のある糖タン
パク質を含む。実施例はＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＬＦＡ−１を
含む。さらに特別の興味の糖タンパク質は、ＣＤ４分子であり、特にその分子の
機能性フラグメントである。インヴィトロジェン社（InVitrogen）により提供さ
れる「ＣａｐｔｕｒｅＴｅｃ（登録商標）システム」も参照されたい。

【００６２】上述のように、以下の実施例においては、特異的な細胞表面マーカーを発現す
る細胞は、一つかまたは異なる戦略の組合せにより単離されることができる。た
とえば、一つのアプローチにおいては、細胞はクロマトグラフィー、細胞のパン
ニング、フローサイトメトリー、抗体結合、または免疫沈降により単離されるこ
とができる。好ましいアプローチは、下記に議論されるような磁気による選択を
含む。

【００６３】「機能性フラグメント」という用語により、この用語が一つの選択マーカーを
定義するために用いられる場合には、そのマーカーの一部分、たとえばモノクロ
ーナル抗体のような抗体といったもう一つの免疫学的分子を特異的に結合するこ
とができるＣＤ４糖タンパク質が意味される。この用語はまた、当該機能性フラ
グメントをコードする核酸配列を含むことも意味する。

【００６４】一般的に、適当な選択可能な配列が一旦選ばれれば、それは一つまたはそれよ
り多い調節配列に操作可能に結合されることとなり、コードされたアミノ酸配列
がベクター内において、たとえばプロモーターに隣接するように位置される。こ
の方法で、所望のアミノ酸配列の発現は促進される。異種または同種のタンパク
質などのいくつかのアミノ酸配列は、それ自身の細胞または組織に特異的なプロ
モーターをもつかもしれないことが考慮されている。さらに含まれている調節配
列は、適当なリーダーおよびポリアデニル化配列である。

【００６５】本発明のさらに特別の実例においては、アミノ酸配列の発現は所望されるよう
に１−または２−シストロンのいずれかである。たとえば、プロモーターが選択
可能な核酸配列と、対象のアミノ酸配列の双方に操作可能に結合されている場合
、たとえば、プロモーター／コードされたアミノ酸配列／選択可能な核酸配列；
プロモーター／選択可能な核酸配列／コードされたアミノ酸配列、では、発現は
１−シストロン性である。かわりに、２−シストロン性の発現は、別々のプロモ
ーターからの、たとえば、プロモーター／コードされたアミノ酸配列かまたは選
択可能な核酸配列、のアミノ酸配列の発現に続いて起る。

【００６６】上述のように、本発明の方法は広範囲のベクターに適合する。これらのベクタ
ーは典型的には、増大された発現が所望されるアミノ酸配列（またはかかる配列
のうちのいくつか）をコードする。好ましいベクターの形式は、時に発現カセッ
トと呼ばれる。一つの態様においては、発現カセットは概して、ベクターを受容
している細胞または細胞株において機能性であるプロモーター、オペレーター、
リボソーム開始部位、当該アミノ酸配列、および、プロセッシングと、いくつか
の場合には当該アミノ酸配列の細胞からの分泌とを容易にするために充分なポリ
アデニル化シグナルをコードする３’部分を含む。好ましいターミネーター配列
は、ＳＶ４０からのポリアデニル化配列である。所望であれば、当該発現カセッ
トかまたは当該ベクターの他の適当な部分は、当該配列の翻訳後のプロセッシン
グを促進するためのシグナル配列を、当該配列の５’末端付近に含んでもよい。
必要であれば、少なくとも一つの適当な遺伝子マーカーかまたは細胞表面ベクタ
ーが、当該ベクター内に位置されることができる。

【００６７】当該発現カセットを含んでいる適当なベクターのさらに特別な実例は、（ｉ）
大腸菌において機能性である複製の起点（Ｏｒｉ）；（ii）適当な遺伝子マー
カー（抗生物質耐性遺伝子、たとえば、Ａｍｐ、Ｔｅｔ、ＮｅｏまたはＫａｎ耐
性）；（iii）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの強力なウイ
ルスプロモーター、および任意にＣＭＶエンハンサー、（iv）（Ｉｇ−Ｃ_Ｌ）免
疫グロブリン軽鎖定常領域のリーダー配列、（ｖ）対象のアミノ酸配列、（v i
）Ｉｇ−Ｃ_Ｌエクソンに結合された完全長のＩｇ−Ｃ_Ｌイントロン、（vii）成
長ホルモンポリアデニル化配列、たとえばウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）ポリＡ配
列、および（viii）抗生物質耐性遺伝子に結合され、かつウイルスのポリアデニ
ル化配列（たとえばＳＶ４０ポリＡ配列）に融合された強力なウイルスプロモー
ター（たとえばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター）などの選択可
能な真核性マーカーをコードするＤＮＡを含んでいるＤＮＡベクターである。別
法として、当該ＤＮＡベクターは、上記の（ｉ）〜（ｖ）のすべて、および、（
vii）〜（viii）を、（vi）のＩｇ−Ｃ_Ｌエクソンに結合された完全長のＩｇ−
Ｃ_Ｌイントロンなしに含むことができる。代表的なＩｇ−Ｃ_Ｌリーダー配列は
、マウスのκリーダーである。完全長のＩｇ−Ｃ_Ｌイントロンおよびエクソン
の実例は、完全長のＣκ遺伝子である。

【００６８】増大された発現が所望されるアミノ酸配列は、異種のタンパク質かまたは宿主
細胞により天然に産生される同種の（内在性の）タンパク質のほぼどれでもよい
。ほとんどの場合に、当該アミノ酸配列は、多サブユニットタンパク質などの、
より大きいアミノ酸配列のサブユニットかまたは機能性のフラグメントを含めた
真核性タンパク質であろうが、これに限定されない。さらに特異的なアミノ酸配
列は、酵素、免疫グロブリン、ペプチドホルモン、ワクチン、Ｔ細胞レセプター
を含むレセプター、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子（クラスＩおよびクラスＩＩ）；または
それらのフラグメントを含む。さらに特異的なタンパク質は、成長因子、血液凝
固因子、サイトカイン、たとえばプラスミノーゲンアクティベーター、組織因子
（ＴＦ）、インスリン、哺乳類の成長ホルモン、エリスロピエチン、ＩｇＥ、ウ
ロキナーゼ、インターロイキン１、２、および３；またはそれらのフラグメント
を含む。本発明はさらに、他の知られた、部分的に知られた、または新規な遺伝
子配列をコードするものを含めた未知のアミノ酸配列に適用性がある。

【００６９】かかるアミノ酸配列の種類は、たとえばジェンバンク（Genbank）（ナショナ
ル・ライブラリー・オブ・メディスン、メリーランド州、ベセズダ、ロックビル
・パイク、８Ｎ０５、３８Ａ)に見出されることができる。ジェンバンクはまた
「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．」にてインター
ネット上でも利用可能である。

【００７０】本明細書において述べる特別のベクターの分子量は、アガロースゲル電気泳動
によるサイジングなどの通常の技術によって測定されることが可能であり、たと
えば意図する用途に依存して変わるであろう。しかしながら、ほとんどの適切な
ベクターおよび特に適切なＤＮＡベクターは、少なくとも約５ｋｂ、および特に
約５ｋｂから約３５ｋｂまでの間か、またはそれより高い分子量を有するであろ
う。特定のアミノ酸配列の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの標
準的なタンパク質サイジング技術によって測定されることができる。別法として
、または付加的に、当該分子量は対応する核酸配列の分子量の測定とそれに続く
その配列の仮設上の翻訳により概算されることができる。ほとんどの適用には、
当該アミノ酸配列をコードする核酸の大きさは、約５００から約３００,０００
ダルトンまでの間のタンパク質またはポリペプチドをコードするために充分であ
り、一般的には約１５〜約２００,０００ダルトンが好ましいであろう。

【００７１】ｐＪＡＩｇ４Ｔｆ．Ａ８、ｐＤＲＨＫ、およびｐＭＡＣＳなどの、本発明に使
用するためのさらに特別のベクターについては、以下の実施例を参照されたい。
また図１および図２も参照されたい。特にｐＤＲＨＫベクターは、ブダペスト条
約に従い、前記に開示されたアドレスのＡＴＣＣに寄託されている。当該ＤＮＡ
は１９９７年９月１７日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号２０９７４が割当てら
れた。ｐＤＲＨＫベクターは哺乳類の発現ベクターであり、ＣＭＶプロモーター
、マウスＩｇＣκリーダーペプチド、クローニング領域、マウスκイントロン、
およびヒトκ定常ドメインエクソン配列を含む。

【００７２】上述のように、本発明は高レベルのアミノ酸配列を発現する哺乳類の組換え細
胞株を生成するための、連続的かつ整合的なベクターの導入を含む一連の組換え
操作を特色とする。ベクターの導入は、レトロウイルス性トランスファー、ウイ
ルス感染、カルシウム−、リポソーム−、またはポリブレンを一介在トランスフ
ェクション、バイオリスティック（biolistic）トランスファー、またはこの技
術において知られている他の技術を含む種々の方法により行なわれることができ
る。より好ましい導入法は、電気穿孔などの哺乳類細胞の安定したトランスフェ
クションに適応できるものを含む。しかしながら、もし結果として生じる組換え
細胞株が遺伝的に安定しているとすれば、いくつかの適用については、いくつか
の一過性の導入法に用いることが有用であってよい。

【００７３】本発明のさらに特別の実例としては、ＣＨＯなどの適当な哺乳類の宿主細胞が
、各々少なくとも一つの選択可能なマーカーを含んでおりかつ少なくとも一つの
対象の異種タンパク質をコードする適当なベクターを用いて、１回（一つずつ）
または少なくとも２回（多重に）トランスフェクションされる。さらに特別の態
様においては、宿主細胞は、当該コードされたタンパク質に操作可能に結合され
たセグメントに、操作可能に結合された第１の選択可能な配列（遺伝子マーカー
）を含む一つのベクターを用いてトランスフェクションされる。ベクターを宿主
細胞へ導入するために、標準的なリン酸カルシウムを介するトランスフェクショ
ンか、またはリポフェクション法といった種々のトランスフェクション法が使用
されることができる。トランスフェクションされた宿主細胞は、次いで選択性の
増殖条件にさらされ、第１の高発現細胞が単離できるようにする。トランスフェ
クションされた細胞を単離する方法は、たとえば上記「Sambrookら」、上記「Au
subel」ら、および、上記「Wingler PNAS（1979）76 : 1376」に述べられている
。

【００７４】第１の高発現細胞は単離され、所望であれば標準的な技術の一つかまたは組合
せにより特徴づけされることができる。たとえば、一つのアプローチではＣＨＯ
細胞は、免疫グロブリンをコードする配列および特に一つの抗体をコードする配
列といった一つのタンパク質配列に操作可能に結合されたネオマイシン遺伝子マ
ーカー（Ｇ４１８抵抗性を提供する）をコードするベクターを用いてトランスフ
ェクションされる。当該タンパク質配列を発現しているトランスフェクションさ
れた宿主細胞は、次に、マイクロタイター組織培養プレート中で行なわれる標準
的な技術（たとえば、限界希釈と増殖）によりクローン化される。この細胞をお
よそ数日から数週間、またはそれよりも長く培養した後、単コロニーが一般的に
は出現するであろう。好ましくは、単コロニーだけがさらなる操作に用いられる
。高産生細胞は、標準的な免疫学的方法および特にＥＬＩＳＡ分析法などの許容
される何らかの方法によって選択される。好ましいのは、抗体産生を検出および
定量するため最適化されたＥＬＩＳＡ分析法である。好ましい高産生細胞は、Ｅ
ＬＩＳＡ分析法において実質的に最大量の抗体を産生するものである。さらに好
ましいのは、培地１ミリリットル当たり、約０.５から約２０マイクログラムの
間の抗体を産生する第１の高産生細胞である。特に好ましいのは、培地１ミリリ
ットル当たり、約１から約５マイクログラムの間の抗体を産生する第１の高産生
細胞である。

【００７５】第１の高産生細胞はさらに、当該タンパク質をコードする核酸の細胞コピーを
増やすために特別に操作される。この実例における特別の目的は、遺伝的に安定
した抗体産生細胞株を産生することである。一つの態様においては、第１の高産
生細胞はさらに、たとえば電気穿孔により、二つの異なるベクター、一つは当該
タンパク質配列をコードしているベクター、他方は糖タンパク質および特にＣＤ
４かまたはそのフラグメントといった適当な細胞表面マーカーをコードしている
ベクターを用いてトランスフェクションされる。図１を参照されたい。ＣＤ４を
コードする好ましい市販のベクターは、ｐＭＡＣＳである（以下を参照）。この
実例においてはトランスフェクション産物は、細胞表面タンパク質に特異的に結
合することができる特異抗体か、またはそれらの抗原結合フラグメントを用いて
処理される。

【００７６】「遺伝的に安定」という用語は、それが本明細書において細胞を指すことにあ
てられる場合には、異種の核酸を含むゲノムの改変が実質的にないことを意味す
る。特に避けられる改変はＤＭ染色体を含む。本発明の方法は好ましくは、遺伝
的安定性を最大化するべく、異種の核酸を宿主細胞ゲノムへ導入する。

【００７７】ベクターの一つからの細胞表面タンパク質と他のベクターによりコードされた
当該タンパク質とを発現している細胞間の特異的な結合は、クロマトグラフィー
および特に磁気ビーズを必要とするカラムクロマトグラフィーなどの標準的な免
疫学的技法を含む種々の方法において検出されることができる。このアプローチ
においては、細胞表面タンパク質に対してターゲットされた抗体は磁気ビーズに
共有結合により付着しており、それにより当該細胞表面タンパク質を発現してい
るいかなる細胞も、細胞および磁気ビーズに磁場を適用することによって単離さ
れることが可能となる。結合された細胞は、次いでカラムから除去され、マイク
ロタイター組織培養プレートにおいて増殖される。任意で、細胞はＧ４１８を補
足された培地などの選択培地中で増殖されることができる。

【００７８】第２の高産生細胞は、いくつかの技法により単離されることができる。たとえ
ば、一つの特別なアプローチでは、細胞はウェルにおいて抗体産生および培地中
への分泌を行なわせるに充分な時間をかけて増殖される。Ｆｃ部位に対する好適
な抗イディオタイプ抗体がマイクロタイター培養プレートウェルに塗布され、そ
こに細胞培養液が添加される。高レベルの抗体を含んでいる培地は、たとえば西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて標識された好適な第２の抗体を用
いる通常のサンドイッチ型の検定法などの標準的な技法によって検出されること
ができる。好ましい第２の高産生細胞は、プレート内の細胞数に対する高い抗体
産生を同定することにより単離される。この分析を実行する方法は、以下にさら
に詳細に述べられており、特にＥＬＩＳＡ検出方式を含む。好ましいのは、約２
４時間の間に、１０^６個の細胞当たり約０.１から約１０マイクログラムの間の
抗体か、またはそれより多くを産生する第２の高産生細胞である。さらに好まし
い範囲は、約２４時間の間に１０^６個の細胞あたり約１から約５マイクログラム
の間である。

【００７９】上述のように、さらに好ましいのは、第１の高産生細胞に比較した場合、約３
から約４０倍の間か、またはそれより多くを産生する第２の高産生細胞である。
抗体反応性は、この測定を行なうための好ましい方法である。

【００８０】第２の高発現細胞はさらに、より多くのタンパク質を発現する細胞株、たとえ
ば第３の高発現細胞の単離に備えるため、さらにトランスフェクションされる。
たとえば、第２の高い細胞における抗体の産生を増進するべく、第１の高発現細
胞をトランスフェクションするために用いた二つのベクターが、再び第２の高発
現細胞を同時トランスフェクションするために再度用いられる。好ましいトラン
スフェクション法は電気穿孔であるが、所望であれば他のトランスフェクション
法が使用されることが可能である。抗体の増大されたレベルを生じている高産生
細胞は、ＣＤ４発現細胞の磁気カラムクロマトグラフィーに続く高産生細胞の単
離を含め、上述のように単離されることができる。任意で、細胞は非選択培地か
またはＧ４１８補足培地などの選択培地中で増殖されてよい。好ましい高産生細
胞は、高い抗体産生率をプレート中の細胞数に対して同定することによって測定
されような、最大レベルの抗体を産生する。

【００８１】この実例においては、選択された細胞株は好ましくは連続的に希釈され、マイ
クロタイター組織培養プレートにおいて、通常の方法により増殖される。およそ
数日後から数週間までか、またはそれより後に、ＥＬＩＳＡなどの適当な免疫学
的技法により、抗体の産生が検査される。高い抗体産生レベルをもつクローンは
さらに増幅される。好ましいのは、２４時間の間に１０^６個の細胞あたり、約１
から約１００マイクログラムの間かまたはそれより多い抗体を有するクローンで
ある。さらに好ましい範囲は、２４時間の間に１０^６個の細胞あたり、約１５か
ら約５０マイクログラムの間の抗体である。さらに好ましいのは、第２の高産生
細胞よりも少なくとも約２倍から約１０倍までのより多い抗体産生を示すクロー
ンである。

【００８２】上記の基準を満たしている第２のクローンは、標準的な方法により、好ましく
は連続的に希釈される。数日後から数週間までかまたはそれより後に、単コロニ
ーはＥＬＩＳＡなどの適当な免疫学的方法により、抗体産生について検査される
。最も高い産生クローン（第３の高発現細胞）が、下記に詳細に述べられるよう
な静置培養の調製にむけて選択される。好ましい第３の高発現細胞は、培養物１
ミリリットル当たり、約２０から約２００マイクログラムを産生する。さらに好
ましい第３の高発現細胞は、培養物１ミリリットル当たり、約５０から約１５０
マイクログラムを産生し、培養物１ミリリットル当たり約１００マイクログラム
が一般には好ましい。

【００８３】さらに好ましいのは、第２の高産生細胞に比べた場合、抗体反応性による決定
では、約３から約４０倍の間かまたはそれより多くの抗体を産生する第３の高産
生細胞である。

【００８４】さらに好ましいのは、第１の高産生細胞に比べた場合、抗体反応性による決定
では、約１０から約２００倍の間かまたはそれより多くの抗体を産生する第３の
高産生細胞である。

【００８５】適当な抗体についての特別の実例は、図１に示したｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ．Ａ８
ベクターによりコードされた抗ＴＦ抗体である。

【００８６】本明細書において述べられた方法により産生された高産生細胞株は、商業的、
研究的、および医学的環境における用途を含め、数多くの高度に有用な適用があ
る。たとえば、この方法により生成された高産生細胞は特に、当該タンパク質配
列の商業的規模の製造を受けることが可能であることがわかっている。一つの例
証として以下の実施例は、当該タンパク質配列を大量（すなわちｍｌ当たりミリ
グラムの量）に産生するための中空糸バイオリアクターの使用について述べてい
る。

【００８７】本発明の特別な実施例においては、哺乳類の組換え細胞株は、高レベルのＭＨ
Ｃ複合体および特に、組換えＭＨＣの単鎖およびヘテロダイマー複合体を産生す
るように生成されることができる。これらの複合体は、たとえば１９９５年２月
１日出願の係属中の米国出願第０８／３８２,４５４号；１９９６年１月３１日
出願の同第０８／５９６,３８７号；および１９９６年２月１５日に公開された
国際出願公開ＷＯ９６／０４３１４号に開示されている；これらの開示は参考文
献として本文に取入れられている。係属中の米国出願第０８／３８２,４５４号
および同第０８／５９６,３８７号と、公開された国際出願公開ＷＯ９６／０４
３１４号において特に述べられたのは、共有結合により結合された呈示ペプチド
（present peptide）を含んでいる単鎖ＭＨＣ融合複合体の一種である。

【００８８】たとえば、所望の単鎖ＭＨＣ複合体を高レベルに発現している哺乳類の組換え
細胞株を生成するためには、ＣＨＯなどの適当な哺乳類の宿主細胞が、好適なベ
クターを用いて１回（一つずつ）または少なくとも２回（多重に）トランスフェ
クションされる。当該ベクターの各々は、前記に定義された少なくとも一つの選
択可能なマーカーと、単鎖ＭＨＣ複合体をコードする少なくとも一つのセグメン
トとを含む。好ましい態様においては、当該単鎖複合体はクラスＩＩであるが、
クラスＩ単鎖複合体もいくつかの例においては好ましいといえる。宿主細胞は、
好ましくは、選択可能なマーカーに対して操作可能に結合された、当該単鎖複合
体をコードする一つの好適なベクターを用いてトランスフェクションされる。標
準的なリン酸カルシウムを介したトランスフェクションまたはリポフェクション
技法などの、種々のトランスフェクション法が用いられることができる。トラン
スフェクションされた宿主細胞は、次いで選択的な増殖条件にさらされ、第１の
高発現細胞が単離されるようにする。トランスフェクションされた細胞の単離法
は、たとえば上記「Sambrookら」、上記「Ausubelら」、および「Wigler PNAS（
USA）（1979） 76 : 1376」に述べられている。

【００８９】さらに特別の方法においてはベクターは、単鎖ＭＨＣ複合体に対して操作可能
に結合されたネオマイシン遺伝子などの選択可能な遺伝子を含む。宿主細胞は好
ましくは電気穿孔によりトランスフェクションされ、融合タンパク質配列を発現
しているトランスフェクションされた宿主細胞は、マイクロタイター組織培養プ
レートにおいて行なわれる限界希釈法によりクローン化される。当該細胞を１日
程度から数週間まで、またはそれより長く培養した後、トランスフェクションさ
れた細胞は収穫され、非選択またはＧ４１８を補足した培地などの選択培地中に
希釈される。上澄は前記に述べたように、また以下に続く実施例のように検査さ
れる。高産生クローンが選択され拡張される。選択されたクローンは収穫され、
第１の高産生細胞を単離するべく、数日から数週間まで、またはそれよりも長く
増殖される。好ましいのは、培地１ｍｌ当たり約１から１００ナノグラムの間の
融合タンパク質を産生する第１の高産生細胞である。さらに好ましいのは、１ｍ
ｌ当たり約１０から５０ナノグラムの間を産生する第１の高産生細胞である。

【００９０】単鎖ＭＨＣ融合タンパク質を作る第１の高産生細胞は、以下のようにさらに操
作される。第１の高産生細胞は、たとえば電気穿孔により、二つのベクター、一
つは単鎖融合タンパク質をコードしているベクター、もう一つは糖タンパク質お
よび特にＣＤ４などの適当な細胞表面タンパク質をコードするベクターを用いて
さらに同時トランスフェクションされる。ＣＤ４をコードする好ましいベクター
は、市販のｐＭＡＣＳベクター（以下を参照）である。トランスフェクション産
物は、当該細胞表面タンパク質特異的に結合することが可能な特異抗体か、また
はそれらの好適な抗原結合フラグメントを用いて処理される。特異的な結合は、
種々の方法において検出されることができるが、磁気ビーズが関係するカラムク
ロマトグラフィーは好ましい方法である。結合した細胞はカラムから除去され、
マイクロタイター組織培養プレート中で増殖される。これらの第２の高産生細胞
は、非選択またはＧ４１８を補足した培地などの選択培地中で増殖されることが
できる。

【００９１】所望であれば第２の高産生細胞の静置培養が作成されることができる。好まし
いのは、１ｍｌ当たり約５０から５００ナノグラムの間の融合タンパク質を産生
する第２の高産生細胞である。さらに好ましいのは、１ｍｌ当たり約１００から
２００ナノグラムの間の融合タンパク質を産生する高産生細胞である。

【００９２】単鎖ＭＨＣ複合体の産生をさらに増大するため、第２の高産生細胞はさらにト
ランスフェクションされることができる。一つのアプローチにおいては、第２の
高産生細胞は、単鎖ＭＨＣ融合タンパク質をコードするベクターと、ピューロマ
イシンなどの薬剤かまたは他の好適な薬剤に対する抵抗性を与える選択可能な核
酸配列を運んでいるもう一つのベクターとの混合物を用いて、同時トランスフェ
クションされる。この同時トランスフェクションは、所望であれば電気穿孔など
を含む好適ないずれの方法によっても実行されることができる。数日から数週間
までか、またはそれより長い培養の後、細胞は収穫され、ピューロマイシンを補
足された培地中に再懸濁される。抵抗性クローンを可視化した後、培養液はたと
えばＥＬＩＳＡにより、融合タンパク質の産生について検査されることができる
。静置培養は、当該タンパク質を高レベルに発現しているクローンから作成する
ことができる。好ましい第３の高産生細胞は、ミリリットル当たり約５００から
約５０００ナノグラムの間の融合タンパク質を産生する。さらに好ましいのは、
ミリリットル当たり約１０００から約２０００ナノグラムの間の当該タンパク質
を産生する第３の高産生細胞である。

【００９３】所望であれば、好適な第３の高産生細胞は、組換えタンパク質の発現を改良す
るべくさらにサブクローン化されることができる。好ましい方法は、限界希釈ク
ローニングである。さらに好ましいのは、２４時間にミリリットル当たり約１０
０から約１０００ナノグラムの間の融合タンパク質を産生する第３の高産生細胞
のクローンである。特に好ましいのは、２４時間にミリリットル当たり約２００
から約５００ナノグラムの間の融合タンパク質を産生するクローンである。

【００９４】単鎖ＭＨＣ複合体をコードするベクターの実例は、図２に示したｐＤＲＨＫベ
クターである。当該ベクターはｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ単鎖クラスIIＭＨＣ複合体
をコードする。

【００９５】本発明の方法は、意図された用途に合わせて変更されることができる。たとえ
ば、本発明は特に次の態様を含む。：１）薬剤耐性遺伝子を運んでいる発現ベク
ターのトランスフェクション、２）一つの発現ベクターと、一過性に細胞表面マ
ーカーを発現するベクターとを用いた同時トランスフェクション、および３）一
つの発現ベクターと異なる薬剤耐性遺伝子を運んでいるベクターとを用いた同時
トランスフェクション。本明細書において述べる細胞選択法は、このような特定
の戦略を実行するために用いられることができる。本発明はまた、一つの発現ベ
クターが二つのポリペプチド配列（免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）をコード
するような場合に、特定の対象とする組換えタンパク質をコードする発現ベクタ
ーを用いて細胞を再トランスフェクションするために用いられることもできる。
好ましい発現は、双方のポリペプチド鎖の同等の発現を含む。これらの特別の方
法および本明細書において議論された他の方法は、細胞の選択およびスクリーニ
ングを容易にすることを含め、種々の用途を見出す。

【００９６】本発明は、以下の実施例によりさらに例証される。これらの実施例は本発明の
理解することを助けるために提供されるものであり、本発明を制限するものとし
て構成されるものではない。

【００９７】実施例１−組換え抗組織因子（ＴＦ）抗体の高レベル産生のためのＣＨＯ細胞の
再トランスフェクション１. ベクターの特徴づけｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８（図１）と呼ばれるベクターは、哺乳類細胞におい
てキメラ抗組織因子（ＴＦ）免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現するべく構成
された。最初の一過性のトランスフェクション実験は、ｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ．Ａ
８ベクターからの抗体の発現を検査するために行なわれた。ＣＯＳ細胞はキアゲ
ン（Qiagen）リポフェクチン試薬を用いて一過性にトランスフェクションされた
。手短に言えば、ウェル当たり２.５x１０５個の細胞が６ウェルプレートに播種
され、３７℃において２４時間インキュベートされた。２ミリグラムのｐＪＡＩ
ｇＧ４ＴＦ．Ａ８ＤＮＡは１００μｌのＩＭＤＭと混合された。脂質複合体を作
成するため、１０μｌの脂質が当該ＤＮＡ溶液に添加された。この混合物はボル
テックスされ、さらに室温において５分間インキュベートされた。ＤＮＡが脂質
複合体を形成している間に、細胞はＰＢＳにて洗浄された。ＤＮＡ-脂質混合物
は６００μｌの１０％ＳＳＭ［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補給されたセル
グロ（CellGro）ＩＭＤＭ（メディアテック（Media Tech））培地］と混合され
、さらに、洗浄された細胞に添加された。細胞は脂質複合体と共に、３７℃およ
び１０％ＣＯ_２において３時間インキュベートされた。トランスフェクションさ
れた細胞はＰＢＳを用いて洗浄され、２ｍｌの１０％ＳＳＭが与えられ、さらに
３７℃および１０％ＣＯ_２において７２時間インキュベートされた。培養上澄は
、抗体産生について検査された。

【００９８】２. 抗体産生を検査するためのＥＬＩＳＡヒトＩｇＧ４抗体の存在を検出するため、ヒトＨＣ／κに特異的なサンドイッ
チＥＬＩＳＡが開発された。つまり、マキシソープ（Maxisorp）９６ウェルプレ
ート（ＮＵＮＣ）は、１００μｌの、Ｒ５緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８.５）中の１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｆａｂ）を用いて被覆
され、４℃において一晩インキュベートされた。次にウェルはＲ５５緩衝液（２
ｍＭイミダゾール、７.５ｍＭＮａＣｌ、０.０２％ツイーン−２０）にて１回洗
浄され、プラスチックフィルムで覆われ、使用されるまで４℃において保管され
た。抗体の産生を検定するためには、Ｒ５５は除去され、さらに１００μｌのト
ランスフェクション産物の上澄が、被覆されたウェルに添加された。３７℃にて
３０分の後、Ｒ５５緩衝液を用いてウェルは６回洗浄され、１００μｌの、抗ヒ
トκ鎖−ＨＲＰ抗体（サザンバイオテック社（Southern Biotech））の１：８０
０希釈物（１０％ＦＢＳを含んでいるＰＢＳ中）が添加された。次いでプレート
は３７℃においてインキュベートされ、４００μｌのＲ５５緩衝液を用いて６回
洗浄された。プローブ抗体の存在を検出するためには、１００μｌの１倍のＡＢ
ＴＳ基質（キルケゴール＆ペリー・ラブズ（Kiekegaard & Perry Labs））が４
分間にわたって添加され、それに、１００μｌのＡＢＴＳクエンチ緩衝液（キル
ケゴール＆ペリー・ラブズ）が続けられた。吸光度は４０５ｎｍにおいて読取ら
れた。精製されたヒトＩｇＧ４タンパク質が、ポジティブな対照として働いた。
かかる検定からの結果は、抗ＴＦＩｇＧ４抗体が、ｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８ベ
クターによって一過性にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞によって産生さ
れたことを示した。

【００９９】３. 抗体特異性の検査についてのＥＬＩＳＡヒトの組織因子に対する抗体野結合を特異的に検出するため、第２のサンドイ
ッチＥＬＩＳＡが開発された。マキシソープ９６ウェルプレート（NUNC）は、１
００μｌの、Ｒ６５緩衝液（１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８.2）中の５０
０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト−ＴＦを用いて、４℃において一晩被覆された。翌日
、プレートはＲ５５緩衝液を用いて洗浄され、覆われ、使用されるまで４℃にて
保管された。抗ＴＦ抗体産生の検出のためには、Ｒ５５は除去され、さらに１０
０μｌのトランスフェクション産物の上澄が、被覆されたウェルに添加された。
３７℃にて３０分後、Ｒ６５緩衝液を用いてウェルは６回洗浄され、さらに１０
０μｌの、抗ヒトκ鎖−ＨＲＰ（サザンバイオテック）の１：８００希釈物（１
０％ＦＢＳを含んでいるＰＢＳ中）が添加された。次いでプレートは３７℃にお
いてインキュベートされ、４００ｐｉのＲ５５緩衝液を用いて６回洗浄された。
プローブ抗体の存在を検出するためには、１００μｌの１倍のＡＢＴＳ基質が４
分間にわたって、またそれに続いて１００μｌのＡＢＴＳクエンチ緩衝液が添加
された。吸光度は４０５ｎｍにおいて読取られた。精製されたマウスＨ３６.Ｄ
２抗ＴＦタンパク質が、ポジティブな対照として働いた。かかる検定からの結果
は、抗ＴＦＩｇＧ４抗体が、ｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８によって一過性にトラン
スフェクションされたＣＯＳ細胞によって産生されたことを示した。

【０１００】４. ＣＨＯ細胞の最初の安定なトランスフェクション組換え抗ＴＦ抗体を発現している安定な細胞株を生成するため、ＣＨＯ.Ｋ１
細胞はｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８ベクターを用いてトランスフェクションされた
。つまり、１００μｇのｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８ＤＮＡは、Ｐｖｕｌを用いて
３７℃において約４時間消化することによって直鎖化された。ＣＨＯ.Ｋ１細胞
（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）は１.２５ｘ１０^７細胞／ｍｌの濃度に希釈された
。８００μｌの体積の細胞は、０.４ｃｍの電気穿孔キュベットに添加され、１
０分間にわたり氷上でインキュベートされた。２５マイクログラムのｐＪＡＩｇ
Ｇ４ＴＦ.Ａ８ＤＮＡが添加され、細胞と混合され、さらに１０分間インキュベ
ートされた。細胞は次いで、９６０μＦおよび２５０Ｖにて電気穿孔された。氷
上での１０分間のインキュベーションの後、細胞の懸濁液は１０ｍｌの１０％Ｓ
ＳＭと共にＴ２５フラスコに添加され、さらに３７℃にて１０％ＣＯ_２中一晩イ
ンキュベートされた。２４時間後、トリプシン−ＰＢＳを用いたインキュベーシ
ョンにより細胞は収穫され、ＰＢＳに再懸濁され、さらにＧ４１８補足培地中で
１：９、１：２７、および１：８１に希釈された。トランスフェクションされた
細胞は９６ウェルプレートに、１００μｌ／ウェルでプレートされ、さらに３７
℃にて１０％ＣＯ_２中でインキュベートされた。

【０１０１】トランスフェクションされた細胞からの培養上澄は、抗体産生について前記に
述べたように検査された。ポジティブなクローンは選択され、拡張された。１：
２７希釈プレートのＨ列９段からのＨ９クローンは、高い抗体レベルの生産者と
して選ばれた。

【０１０２】この細胞株は、限界希釈法によりクローン化された。つまり、選ばれたクロー
ンはＰＢＳにて１０００細胞／ｍｌに希釈された。１０％ＳＳＭにおける一連の
１：１０希釈が、１細胞／ｍｌを得るべくおこなわれた。このような希釈液から
、１００μｌ／ウェルが９６ウェル平底プレートにプレートされた。これらのプ
レートは３７℃にて１０％ＣＯ_２中でインキュベートされた。３日間のインキュ
ベーションの後、各々のウェルに対し１００μｌ／ウェルの１０％ＳＳＭが添加
された。３週間後、単コロニーが現われ始めた。単コロニーだけがＥＬＩＳＡに
より抗体産生について検査された。高レベルの抗体産生のあるクローンは増幅さ
れ、かつ選択された。クローンＨ９ｇ１２は最高の生産者として選ばれ、静置培
養において抗体産生が分析された。

【０１０３】選ばれたクローンはトリプシンを用いた処理によって収穫され、１０ｍｌの１
０％ＳＳＭ培地にて１ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁され、さらにＴ２５組
織培養フラスコに加えられた。細胞は３７℃にて１０％ＣＯ_２中で、２１日間か
、または８０％細胞死までインキュベートされた。この細胞懸濁液は遠心分離さ
れ、上澄はＥＬＩＳＡ分析法によりＡｂ産生について調べられた。

【０１０４】５. ＣＨＯ−Ｈ９ｇ１２細胞株の安定な再トランスフェクションこの方法は、安定なＡｂ産生細胞株のゲノムに、対象の遺伝子のさらに多くの
コピーを加えるべく開発された。この方法を用いて進行するため、クローンＨ９
ｇ１２は抗ヒトＴＦメガベクターｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８とｐＭＡＣＳの混合
物を用いて同時トランスフェクションされた。ｐＭＡＣＳベクターは、膜結合Ｃ
Ｄ４タンパク質の一過性の発現を可能にするベクターである。Ｈ９ｇ１２細胞株
を同時トランスフェクションするためには、８００μｌの１．２５ｘ１０^７細胞
／ｍｌの懸濁液が０.４ｃｍの電気穿孔キュベットに添加され、氷上にて１０分
間インキュベートされた。この細胞に、３：１のモル比のｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.
Ａ８およびｐＭＡＣＳＤＮＡ（４０μｌの、Ｐｖｕｌで直鎖化された１μｇ／ｍ
ｌのｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８と、５μｌの、スーパーコイル化された１μｇ／
ｍｌのｐＭＡＣＳ）が添加された。氷上での１０分間のインキュベーションの後
、細胞は９６０μＦおよび２５０Ｖにて電気穿孔された。細胞は３７℃にて１０
分間インキュベートされ、Ｔ２５フラスコ内の１０ｍｌの１０％ＳＳＭに対して
希釈され、さらにＣＤ４タンパク質の一過性の発現を可能にするべく、３７℃に
て１０％ＣＯ_２中で７２時間インキュベートされた。この時点で、細胞は５ｍｌ
のＰＢＥ（ＰＢＳ溶液中のＥＤＴＡ）により、室温にてそれらが剥離されるまで
処理された。細胞は１回洗浄され、３８０ｍｌのＰＢＥに再懸濁され、さらに、
細胞表面に発現されるヒトＣＤ４分子に対して特異的な８０μｌの抗体を用いて
標識された。この抗体は、共有結合により磁気ビーズに結合されている。４℃で
の１５〜２０分間のインキュベーションに続いて、抗体標識された細胞は磁気カ
ラムにかけられた。その表面にＣＤ４を発現するトランスフェクションされた細
胞は、磁気カラムに結合することが期待される。トランスフェクションされなか
った細胞は１ｍｌのＰＢＥを用いてカラムから洗い出された。結合した細胞は次
に、カラムを磁場から移動することと、１ｍｌのＰＢＥをカラムに通すことによ
り、カラムから溶出された。ＣＤ４発現細胞はＧ４１８（１.５ｍｇ／ｍｌ）を
補足された１９９ｍｌの１０％ＳＳＭ中に希釈され、９６ウェル平底プレートに
プレートされた。このプレートは３７℃にて１０％ＣＯ_２中でインキュベートさ
れた。

【０１０５】抗体産生を検査するためには、マキシソープ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）
は、前文に述べたように１００μｌの、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ
（Ｆａｂ）（ピエルス社（Pierce））を用いて被覆された。再トランスフェクシ
ョンされた細胞からの培地は、検査の２４時間前に交換された。トランスフェク
ション産物の２４時間の上澄５μｌが、９５μの１０％ＦＢＳ−ＰＢＳに添加さ
れた。希釈された上澄は、当該被覆されたウェルに加えられ、３７℃において６
０分間インキュベートされた。ウェルはＲ５５緩衝液を用いて６回洗浄され、前
文に述べたように、抗ヒトκ鎖抗体−ＨＲＰ（サザンバイオテック社）が、当該
上澄中に存在する組換え抗体を検出するべく用いられた。精製されたヒトＩｇＧ
４タンパク質（バイオデザイン社（Biodesign））は、ポジティブな対照として
働き、抗体濃度についての標準曲線を確立するために用いられた。

【０１０６】クローンの選択は、細胞数に対する抗体産生率を比較することによって行なわ
れた。つまり、高産生クローンはトリプシン処理され、カウントされた。算出さ
れた抗体産生率と細胞数とを用いて、μｇ抗体／１０^６細胞／２４時間が測定さ
れた。高産生クローンは２４ウェル／プレートに増幅され、拡張された。選ばれ
たクローンは、３Ｄ２と名付けられた。

【０１０７】限界希釈クローニングのためには、選ばれたクローンは１０％ＳＳＭ中にて連
続的に希釈され、９６ウェル平底プレートに播種され、前記に述べたようにイン
キュベートされた。３週間後、単コロニーはＥＬＩＳＡにより抗体産生について
調べられた。高レベルの抗体産生のあるクローンは、増幅されかつ選択された。
クローン３Ｄ２Ａ９は、２.５８μｇ抗体／１０^６細胞／２４時間を示し、最高
のクローンとして選ばれた。静置培養における抗体産生の分析は、このクローン
について開始された。

【０１０８】３Ｄ２Ａ９クローンの静置培養は、１０％ＳＳＭ培地１０ｍｌ中の、２ｘ１０ ^５細胞／ｍｌの濃度をＴ２５培養フラスコへ加えることによって開始された。フ
ラスコは３７℃にて１０％ＣＯ_２中で、２１日間または８０％細胞死までインキ
ュベートされた。細胞懸濁液は遠心分離され、上澄はＥＬＩＳＡにより抗体産生
について調べられた。３Ｄ２Ａ９クローンの最大の抗体産生は、２１μｇ／ｍｌ
であった。この産生レベルは第１のトランスフェクションクローンよりも７倍高
かった。

【０１０９】３. 第３の安定なトランスフェクショントランスフェクションされた細胞の抗体産生レベルをさらに増大させるべく、
クローン３Ｄ２Ａ９は再び、抗ヒトＴＦメガベクターｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８
とｐＭＡＣＳとの混合物を用いて同時トランスフェクションされた。この細胞株
をトランスフェクションするためには、８００μｌの１.２５ｘ１０^７細胞／ｍ
ｌの懸濁液が０.４ｃｍの電気穿孔キュベットに添加され、氷上にて１０分間イ
ンキュベートされた。この細胞に、３：１のモル比のｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８
およびｐＭＡＣＳＤＮＡ（５０μｌの、Ｐｖｕｌで直鎖化された１μｇ／ｍｌの
ｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ.Ａ８と、５μｌの、スーパーコイル化された１μｇ／ｍｌ
のｐＭＡＣＳ）が添加された。氷上での１０分間のインキュベーションの後、細
胞は９６０μＦおよび２５０Ｖにて電気穿孔された。細胞は３７℃にて１０分間
インキュベートされ、Ｔ２５フラスコ内の１０ｍｌの１０％ＳＳＭに対して添加
され、さらにＣＤ４タンパク質の一過性の発現を可能にするべく、３７℃にて１
０％ＣＯ_２中で４８時間インキュベートされた。この時点で、トランスフェクシ
ョンされた細胞は抗ＣＤ４磁気ビーズを用いて標識され、前文に述べたように磁
気カラム上で選択された。ＣＤ４発現細胞は、Ｇ４１８（１.５ｍｇ／ｍｌ）を
補足された２００ｍｌの１０％ＳＳＭ中に希釈された。この細胞懸濁液は９６ウ
ェル平底プレートにプレートされた。このプレートは３７℃にて１０％ＣＯ_２中
で、およそ３週間インキュベートされた。

【０１１０】マキシソープ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）は、前文に述べたように１００
μｌの、Ｒ５中の１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｆａｂ）（ピエルス
）を用いて被覆された。抗体産生を検定するため、再トランスフェクションされ
た細胞からの培地は、検査の２４時間前に交換された。トランスフェクション産
物の２４時間の上澄５μｌが、９５μの１０％ＦＢＳ−ＰＢＳに添加された。希
釈された上澄は、当該被覆されたウェルに加えられ、３７℃において６０分間イ
ンキュベートされた。ウェルはＲ５５緩衝液を用いて６回洗浄され、前記に述べ
たように、抗ヒトκ鎖抗体−ＨＲＰ（サザンバイオテック社）が、前記に述べた
ように、当該上澄中に存在する組換え抗体を検出するために用いられた。精製さ
れた抗ＴＦキメラ抗体がポジティブな対照として働き、抗体濃度の標準曲線を確
立するために用いられた。この検査からの結果は、高い抗体産生クローンの選択
を可能にしており、それらは次いで１２ウェルプレートに増幅された。これらの
クローンはウェルの８０％まで増殖され、２４時間上澄が検査された。この２４
時間の培養上澄の１：１００希釈物がＥＬＩＳＡによって検査された。細胞もま
た数えられ、μｇ／１０^６細胞／２４時間、の抗体産生値が測定された。最も高
い抗体産生母クローンＡ９Ｂ１１およびＡ９Ｆ１２は、これらの値に基づいて選
ばれた。

【０１１１】選ばれたクローンは１０％ＳＳＭ中にて連続的に希釈され、９６ウェル平底プ
レートに播種され、前文に述べたようにインキュベートされた。３週間後、単コ
ロニーはＥＬＩＳＡにより抗体産生について調べられた。高レベルの抗体産生の
あるクローンが増幅された。初代のクローンＡ９Ｆ１２Ｃ２およびＡ９Ａ１１Ｂ
５は、３０〜４０μｇ抗体／１０^６細胞／２４時間の抗体産生率をもつ最高のク
ローンを有することが見出された。このクローンは静置培養用に拡張された。

【０１１２】Ａ９Ｆ１２Ｃ２クローンの静置培養は、１０％ＳＳＭ培地１０ｍｌ中の、２ｘ
１０^５細胞／ｍｌの濃度をＴ２５培養フラスコへ加えることによって開始された
。フラスコは３７℃にて１０％ＣＯ_２中で、２１日間または８０％細胞死までイ
ンキュベートされた。細胞懸濁液は遠心分離され、上澄はＥＬＩＳＡによりＡｂ
産生について調べられた。Ａ９Ｆ１２Ｃ２クローンの最大の抗体産生は、５２
μｇ／ｍｌであった。この産生レベルは第２のトランスフェクションクローンよ
りも２倍高かった。

【０１１３】選ばれたクローンＡ９Ｆ１２Ｃ２は１０％ＳＳＭ中にて連続的に希釈され、９
６ウェル平底プレートに播種され、前文に述べたようにインキュベートされた。
３週間後、単コロニーはＥＬＩＳＡにより抗体産生について調べられた。２次ク
ローンＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７は最も高い抗体産生率をもつことが見出され、静置培
養用に拡張された。これらの静置培養は、前記に述べたように行なわれた。

【０１１４】静置培養上澄における抗体濃度を測定するため、５μｌのＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７
の細胞上澄が４,９９５μｌの１０％ＰＢＳに添加された。この希釈された上澄
は、前文に述べた抗体ＥＬＩＳＡにより、キメラ抗体について検査された。ポジ
ティブな対照として、精製された抗ＴＦキメラ抗体が使用された。この検査から
の結果は、２次クローンＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７が静置培養において５２.６μｇ／
ｍｌの最高の抗体産生レベルをもつことを示した。

【０１１５】この選ばれたクローンＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７は、１０％ＳＳＭ中にて連続的に希
釈され、９６ウェル平底プレートに播種され、前文に述べたようにインキュベー
トされた。３週間後、単コロニーはＥＬＩＳＡにより抗体産生について調べられ
た。３次クローンＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７Ｂ４は最も高い生産者として選ばれ、静置
培養用に拡張された。これらの培養は、前記に述べたように開始された。

【０１１６】静置培養上澄における抗体濃度を測定するため、５μｌのＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７
の細胞上澄が４,９９５μｌの１０％ＰＢＳに添加された。この希釈された上澄
は、前記に述べた抗体ＥＬＩＳＡにより、キメラ抗体について検査された。ポジ
ティブな対照として、組織内で精製された抗ＴＦキメラ抗体が使用された。クロ
ーンＡ９Ｆ１２Ｃ２Ｅ７Ｂ４についての最大の抗体産生は、１０２.３μｇ／ｍ
ｌであった（図３）。この細胞株は増幅され、さらに凍結された。１ｘ１０^６細
胞／ｍｌの濃度の５０バイアルが最初の種細胞のバンクとして作成され、液体窒
素中に保存された。細胞株の名称はｃＨ３６（キメラＨ３６）とされた。

【０１１７】４. バイオリアクター注入中空糸のバイオリアクターは、製造業者の説明書に示されているように組立て
られた。選択されたクローンは、正確な体積の３０％ＳＳＭにて１ｘ１０^８細胞
／ｍｌに再懸濁され、バイオリアクターに注入された。次いでバイオリアクター
は、製造業者の説明書に明示されていたとおりに運転された。最大の産生は、前
記に示したようにＥＬＩＳＡにより調べられた。最初のトランスフェクションの
初代クローンＨ９ｇ１２は、１．１００μｇ抗体／ｍｌを産生した第３のトラン
スフェクションの初代クローンＡ１１Ｂ５と比較して、７０μｇ抗体／ｍｌを産
生した（図４）。

【０１１８】実施例２−組換えＨＬＡ−ＤＲ２ＭＨＣクラスＩＩ分子の産生のための細胞株
の生成１. ベクターの特徴づけｐＤＲＨＫ（図２）と呼ばれるベクターは、ヒト免疫グロブリンκ定常ドメイ
ンに融合された可溶性の単鎖ＨＬＡ−ＤＲ２／ＭＢＰ分子の、哺乳類での発現の
ために構成された。最初の一過性のトランスフェクション実験は、ｐＤＲＨＫベ
クターからのタンパク質の発現を検査するために行なわれた。ＣＯＳ細胞はキア
ゲンリポフェクチン試薬を用いて一過性にトランスフェクションされた。手短に
言えば、ウェルあたり２．５ｘ１０^５個の細胞が６ウェルプレートに播種され、
３７℃において２４時間インキュベートされた。２ミリグラムのｐＤＲＨＫＤ
ＮＡが１００μｌのＩＭＤＭと混合された。脂質複合体を作成するため、１０μ
ｌの脂質が当該ＤＮＡ溶液に添加された。この混合物はボルテックスされ、さら
に室温において５分間インキュベートされた。ＤＮＡが脂質複合体を形成してい
る間に、細胞はＰＢＳにて洗浄された。ＤＮＡ-脂質混合物は、６００μｌの１
０％ＳＳＭと混合され、さらに、洗浄された細胞に添加された。細胞は脂質複合
体と共に、３７℃および１０％ＣＯ_２において３時間インキュベートされた。ト
ランスフェクションされた細胞はＰＢＳを用いて洗浄され、２ｍｌの１０％ＳＳ
Ｍが与えられ、さらに３７℃および１０％ＣＯ_２において７２時間インキュベー
トされた。上澄は、組換えＤＲ２／ＭＢＰ−ＣＫ産生について検査された。

【０１１９】２．ｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ産生を検出するためのＥＬＩＳＡｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃ６の存在を検出するため、ヒト６／ＨＬＡκに特
異的なサンドイッチＥＬＩＳＡが開発された。手短に言えば、マキシソープ９６
ウェルプレート（ＮＵＮＣ）は、１００μｌの、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヤギ
抗ヒトＩｇＧ−κを用いて被覆され、４℃において一晩インキュベートされた。
次にウェルはＲ５５緩衝液にて１回洗浄され、プラスチックフィルムで覆われ、
使用されるまで４℃で保管された。組換えタンパク質の産生を検定するためには
、Ｒ５５は除去され、さらに１００μｌのトランスフェクション産物の上澄が、
被覆されたウェルに添加された。３７℃にて６０分の後、ウェルはＲ５５緩衝液
を用いて６回洗浄され、１００μｌの、ＨＲＰに結合された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体
Ｌ２４３（アナージェン社（Anergen）、ＡＴＣＣＨＢ−５５）の１：１０００
希釈物（１０％ＦＢＳを含んでいるＰＢＳ中）が添加された。次いでプレートは
３７℃においてインキュベートされ、４００μｌのＲ５５緩衝液を用いて６回洗
浄された。プローブ抗体の存在を検出するためには、１００μｌの１倍のＡＢＴ
Ｓ基質が５分間にわたって添加され、それに、１００μｌのＡＢＴＳクエンチ緩
衝液が続けられた。吸光度は４０５ｎｍにおいて読取られた。かかる検定からの
結果は、ｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ融合タンパク質が、ｐＤＲＨＫベクター
によって一過性にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞によって産生されたこ
とを示した。

【０１２０】３. 最初の安定なトランスフェクションｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ融合タンパク質を発現している安定な細胞株を生
成するため、ＣＨＯ.Ｋ１細胞はｐＤＲＨＫベクターを用いてトランスフェクシ
ョンされた。つまり、１００μｇのｐＤＲＨＫＤＮＡは、Ｐｖｕｌを用いて３
７℃において約４時間消化することによって直鎖化された。ＣＨＯ.Ｋ１細胞（
ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）は１．２５ｘ１０^７細胞／ｍｌの濃度に希釈された。
８００μｌの体積の細胞が、０.４ｃｍの電気穿孔キュベットに添加され、氷上
で１０分間インキュベートされた。２０マイクログラムのｐＤＲＨＫＤＮＡが
添加され、細胞と混合され、さらに１０分間インキュベートされた。細胞は次い
で、９６０μＦおよび２５０Ｖにて電気穿孔された。氷上での１０分間のインキ
ュベーションの後、細胞の懸濁液は１０ｍｌの１０％ＳＳＭと共にＴ２５フラス
コに添加され、さらに３７℃にて１０％ＣＯ_２中一晩インキュベートされた。２
４時間後、トリプシン−ＰＢＳを用いたインキュベーションにより細胞は収穫さ
れ、ＰＢＳに再懸濁され、さらにＧ４１８を補足された培地中で１：９、１：２
７、および１：８１に希釈された。トランスフェクションされた細胞は９６ウェ
ルプレートに、１００μｌ／ウェルでプレートされ、さらに３７℃にて１０％Ｃ
Ｏ２中でインキュベートされた。

【０１２１】異なる９６ウェルプレートからの細胞からの培養上澄は、前文に述べたように
検査された。ポジティブなクローンは選択され、拡張された。１：２７プレート
のＡ列５段からのクローンＡ５は、高生産者として選ばれた。この細胞株は、前
文に述べたように、限界希釈法によりサブクローン化された。スクリーニングの
後、最高の産生細胞株としてクローンＡ５Ｂ４が選ばれ、静置培養が開始された
。

【０１２２】選ばれたクローンはトリプシンを用いた処理によって収穫され、１０ｍｌの１
０％ＳＳＭ培地にて１ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁され、さらにＴ２５組
織培養フラスコに加えられた。細胞は３７℃にて１０％ＣＯ_２中で、２１日間か
、または８０％細胞死までインキュベートされた。この細胞懸濁液は遠心分離さ
れ、上澄はＥＬＩＳＡ分析法により組換えＤＲ２産生について調べられた。Ａ５
Ｂ４クローンによる組換えｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃ６融合タンパク質の産生は
、２０ｎｇ／ｍｌであった。

【０１２３】４. 安定な再トランスフェクションこの方法を用いて進行するため、クローンＨＡ４Ｂ５はｐＤＲＨＫとｐＭＡＣ
Ｓとの混合物を用いて同時トランスフェクションされた。８００μｌの体積の
１.２５ｘ１０^７細胞／ｍｌの懸濁液が０.４ｃｍの電気穿孔キュベットに添加さ
れ、氷上にて１０分間インキュベートされた。この細胞に、３：１のモル比のｐ
ＤＲＨＫおよびｐＭＡＣＳＤＮＡ（３０μｌの、Ｐｖｕｌで直鎖化された１μｇ
／ｍｌのｐＤＲＨＫと、５μｌの、スーパーコイル化された１μｇ／ｍｌのｐＭ
ＡＣＳ）が添加された。氷上での１０分間のインキュベーションの後、細胞は９
６０μＦおよび２５０Ｖにて電気穿孔された。細胞は３７℃にて１０分間インキ
ュベートされ、Ｔ２５フラスコ内の１０ｍｌの１０％ＳＳＭに対して希釈され、
さらにＣＤ４タンパク質の一過性の発現を可能にするべく、３７℃にて１０％Ｃ
Ｏ_２中で７２時間インキュベートされた。この時点で、細胞は５ｍｌのＰＢＥを
用いて、室温にてそれらが剥離されるまで処理された。細胞は１回洗浄され、３
８０ｍｌのＰＢＥに再懸濁され、さらに、細胞表面に発現されるヒトＣＤ４分子
に対して特異的な８０μｌの抗体を用いて標識された。この抗体は、共有結合に
より磁気ビーズに結合されている。４℃における１５〜２０分間のインキュベー
ションに続いて、抗体標識された細胞は磁気カラムにかけられた。その表面にＣ
Ｄ４を発現するトランスフェクションされた細胞は、磁気カラムに結合すること
が期待される。トランスフェクションされなかった細胞は１ｍｌのＰＢＥを用い
てカラムから洗い出された。結合した細胞は次に、カラムを磁場から移動するこ
とと、１ｍｌのＰＢＥをカラムに通すことにより、カラムから溶出された。ＣＤ
４発現細胞はＧ４１８（１.５ｍｇ／ｍｌ）を補充された１９９ｍｌの１０％Ｓ
ＳＭ中に希釈され、９６ウェル平底プレートにプレートされた。このプレートは
３７℃にて１０％ＣＯ_２中でインキュベートされた。

【０１２４】３週間後、異なる９６ウェルプレートからの上澄は、前文に述べたように組換
えタンパク質について検査された。ポジティブなクローンが選択され、拡張され
た。クローンＤＲ２^２は、最高の生産者として選ばれた。この細胞株は凍結され
た。

【０１２５】ＤＲ２^２クローンのバイアルは、３７℃の水槽内ですばやく溶かされ、９５％
生存率まで増殖された。限界希釈クローニングのため、細胞は前文に述べたよう
に連続的に希釈された。３週間の増殖の後、単コロニーはＥＬＩＳＡによりｓｃ
−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ産生について調べられた。最高の産生レベルをもつクロ
ーンが増幅され、選択された。クローンＤＲ２^２−Ｈ４は、最良の生産者として
同定された。前文に述べたように静置培養が行なわれ、ＤＲ２^２−Ｈ４クローン
からの組換えタンパク質の産生は１００ｎｇ／ｍｌであることが見出された。

【０１２６】４. 第３の安定なトランスフェクション組換えタンパク質の産生をさらに増大させるべく、初代クローンＤＲ２^２−Ｈ
４は、ｐＤＲＨＫと、ピューロマイシンに対する抵抗性を与える遺伝子を運んで
いるｐＰＵＢ（クロンテック社（Clonetech））との混合物を用いて同時トラン
スフェクションされた。つまり、８００μｌの１.２５x１０^７細胞／ｍｌの懸濁
液が０.４ｃｍの電気穿孔キュベットに添加され、氷上にて１０分間インキュベ
ートされた。この細胞に、３：１のモル比のｐＤＲＨＫおよびｐＭＡＣＳＤＮＡ
（２５μｌの、Ｐｖｕｌで直鎖化された１μｇ／ｍｌのｐＤＲＨＫと、５μｌの
、Ｐｖｕｌで直鎖化された１μｇ／ｍｌのｐＰＵＲ）が添加された。氷上での１
０分間のインキュベーションの後、細胞は９６０μＦおよび２５０Ｖにて電気穿
孔された。細胞は３７℃にて分間インキュベートされ、Ｔ２５フラスコ内の１
０ｍｌの１０％ＳＳＭに対して添加され、さらに３７℃にて１０％ＣＯ_２中で４
８時間インキュベートされた。次いで細胞はトリプシン処理により収穫され、遠
心分離され、さらにＧ４１８（１.５ｍｇ／ｍｌ）とピューロマイシン（２０μ
ｇ／ｍｌ）とを含んでいる１０％ＳＳＭに再懸濁された。コロニーが明らかにさ
れた後、培養液は組換えタンパク質について調べられた。クローンＡ９およびＢ
９は最も高い生産者であることがわかり、前文に述べたように静置培養において
検査された。静置培養の組換えタンパク質産生は、Ａ９については１,８００ｎ
ｇ／ｍｌであり、またＢ９については２,１０８であった（図５）。

【０１２７】これらの細胞株は限界希釈クローンによりサブクローン化され、組換えタンパ
ク質の産生について検査された。初代クローンＡ９Ｄ５、Ａ９Ｇ４、Ａ９Ｃ７、
Ｂ９Ｈ３、Ｂ９Ｇ４、およびＢ９Ｈ５は、２４時間で２００〜３００ｎｇ／ｍｌ
のｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ産生率を有するものと同定された。静置培養にお
けるこれらのクローンによる組換えタンパク質の産生は、上述したように行なわ
れた。

【０１２８】本発明は、その好ましい態様に関連して詳細に述べられてきた。しかしながら
、当業者はこの開示を検討するに当たり、本発明の精神および範囲内で、修正お
よび改良を行なってもよいことが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に関して使用するための例示ベクターを示した図である。ベクターｐＪ
ＡＩｇＧ４ＴＦは、抗キメラ組織因子（ＴＦ）免疫グロブリンの重および軽鎖を
コードする。

【図２】本発明に関して使用するための例示ベクターを示した図である。ベクターｐＤ
ＲＨＫは、ヒト免疫グロブリンκ鎖の定常ドメインに融合された単鎖のＨＬＡ−
ＤＲ２／ＭＢＰ分子をコードする。

【図３】Ｔ２５フラスコでの静置培養における組換えキメラ抗ＴＦ抗体の高レベルの産
生を示すグラフである。抗ＴＦ抗体を高レベルに産生している組換え細胞株は、
３回の連続したトランスフェクションに続いて単離された。高産生組換え細胞株
は、各々Ｈ９Ｇ１２、３Ｄ２Ａ９、およびＡ１１Ｂ５と名付けられた。

【図４】バイオリアクターにおける組換えキメラ抗ＴＦの高レベルの産生を示すグラフ
でる。抗ＴＦ抗体を高レベルに産生している組換え細胞株は、３回の連続したト
ランスフェクションに続いて単離された。高産生組換え細胞株は、第１および第
３のトランスフェクションの後に単離された列について、Ｈ９Ｇ１２およびＡ１
１Ｂ５と名付けられた。

【図５】Ｔ２５フラスコでの静置培養における組換えｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ産生
についての高レベルの産生を示すグラフである。ｓｃ−ＤＲ２／ＭＢＰ−Ｃκ
融合タンパク質を高レベルに産生している組換え細胞株は、３回の連続したトラ
ンスフェクションの後に単離された。高産生組換え細胞株は、各々Ａ５Ｂ４、Ｄ
Ｒ２Ｈ４、およびＢ９と名付けられた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ピーター・アール・ロードアメリカ合衆国フロリダ州 33185 マイアミ 14857 エス・ダブリュー 42番レーンＦターム(参考） 4B024 AA20 BA41 CA02 DA02 EA04 FA10 GA13 GA14 4B064 AG26 CA10 CC24 4B065 AA90X AB01 AC10 AC14 BA03 BA05 BA25 CA24 CA25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列の増大された発現を特色とする細胞株を産生す
る方法であって、前記方法が：ａ）前記アミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合された第１
の選択可能な配列を含んでいる第１のベクターを宿主細胞に導入すること、ｂ）前記第１のベクターを選択することを導く条件下に前記宿主細胞を培養
すること、ｃ）前記アミノ酸配列を第１の発現レベルで発現している細胞（第１の高発
現細胞）を単離すること、ｄ）前記第１の発現レベルで発現している前記細胞に、前記アミノ酸配列を
コードする第２のベクターを導入すること、ｅ）前記アミノ酸配列を前記第１の発現レベルよりも高い第２の発現レベル
で発現することを導く条件に前記細胞をさらすこと、および、ｆ）前記細胞株（第２の高発現細胞）を産生するべく、前記アミノ酸配列を
前記第２の発現レベルで発現している前記細胞を単離すること、を含む方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、前記方法がさらに：ｇ）前記第２の発現レベルで発現している前記細胞に、前記アミノ酸配列を
コードする第３のベクターを導入することと、前記アミノ酸配列を前記第２の発
現レベルよりも高い第３の発現レベルで発現することを導く条件に前記細胞をさ
らすことと、および、ｈ）前記細胞株（第３の高発現細胞）を産生するべく、前記アミノ酸配列を
前記第３の発現レベルで発現している前記細胞を単離すること、を含む方法。
【請求項３】請求項２に記載の方法であって、前記方法がさらに、第３の
高発現細胞に前記アミノ酸配列をコードするベクターを導入すること、前記第３
の発現レベルよりも高い発現レベルで前記アミノ酸配列を発現することを導く条
件に前記細胞をさらすこと、および、前記アミノ酸配列を前記第３の高発現細胞
よりも高いレベルで発現している細胞株を単離するために前記の導入することお
よびさらすことの工程を少なくとも１回行うことを含む方法。
【請求項４】請求項１に記載の方法であって、前記方法の工程ｂ）がさら
に、第１の選択可能な配列を選択する少なくとも一つの薬剤を含んでいる選択培
地において前記細胞を成長させることを含む方法。
【請求項５】請求項１に記載の方法であって、前記方法の工程ｄ）がさら
に、前記細胞に第４のベクターを導入することと、前記アミノ酸配列を前記第２
の発現レベルで発現することを導く条件に前記細胞をさらすことを含む方法。
【請求項６】請求項５に記載の方法であって、前記第４のベクターがさら
に一つの選択可能な配列を含んでいる方法。
【請求項７】請求項６に記載の方法であって、前記第４のベクターがさら
に、前記アミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合された第２の選
択可能な配列を含んでいる方法。
【請求項８】請求項６に記載の方法であって、前記方法がさらに、前記第
２の選択可能な配列を選択する少なくとも一つの薬剤を含んでいる選択培地にお
いて、前記細胞を成長させることを含む方法。
【請求項９】請求項５に記載の方法であって、前記第４のベクターがさら
に、選択可能な細胞表面マーカーをコードする配列を含む方法。
【請求項１０】請求項９に記載の方法であって、前記選択可能な細胞表面
マーカーが、前記アミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合されて
いる方法。
【請求項１１】請求項９に記載の方法であって、前記方法がさらに、クロ
マトグラフィー、細胞のパンニング（panning）、フローサイトメトリー、免疫
沈降、または抗体結合の少なくとも一つにより、前記細胞表面マーカーを発現し
ている細胞を単離することを含む方法。
【請求項１２】請求項２に記載の方法であって、前記方法の工程ｇ）がさ
らに、第５のベクターを前記細胞に導入することと、前記アミノ酸配列を前記第
３の発現レベルで発現することを導く条件に前記細胞をさらすことを含む方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法であって、前記第５のベクターが
さらに第３の選択可能な配列を含む方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法であって、前記第３の選択可能な
配列が、前記アミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合される方法
。
【請求項１５】請求項１３に記載の方法であって、前記方法がさらに、第
３の選択可能な配列を選択する少なくとも一つの薬剤を含んでいる選択培地にお
いて前記細胞を成長させることを含む方法。
【請求項１６】請求項１２に記載の方法であって、前記第５のベクターが
さらに、選択可能な細胞表面マーカーをコードする配列を含む方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記選択可能な細胞表
面マーカーが、前記アミノ酸配列をコードするセグメントに操作可能に結合され
る方法。
【請求項１８】請求項１６に記載の方法であって、前記方法がさらに、ク
ロマトグラフィー、細胞のパンニング、フローサイトメトリー、抗体結合、免疫
沈降、または抗体結合の少なくとも一つにより、前記細胞表面マーカーを発現し
ている前記細胞を単離することを含む方法。
【請求項１９】請求項１に記載の方法であって、抗体反応性により決定さ
れる際、前記第２の高発現細胞が前記第１の高発現細胞に比較して約３から約４
０倍の間のより多くの前記アミノ酸配列のフォールドを発現する方法。
【請求項２０】請求項２に記載の方法であって、抗体反応性により決定さ
れる際、前記第３の高発現細胞が前記第２の高発現細胞に比較して約３から約４
０倍の間のより多くの前記アミノ酸配列のフォールドを発現する方法。
【請求項２１】請求項１に記載の方法であって、前記アミノ酸配列が免疫
グロブリンの重鎖から軽鎖か、またはその機能性フラグメントをコードする方法
。
【請求項２２】請求項２に記載の方法であって、前記ベクターの各々が独
立して第１の薬剤耐性遺伝子、細胞表面マーカー、または第２の薬剤耐性遺伝子
をコードしており、さらに前記ベクターの各々が前記アミノ酸配列に操作可能に
結合される方法。
【請求項２３】請求項１、２、または３に記載の方法によって産生される
細胞株。