JP2002529091A - 毒性遺伝子およびタンパク質、およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、その産物が微生物の病原性に関係している可能性がある、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１内の毒性遺伝子の系列の同定に基づく。遺伝子の同定は、それら、またはその発現した産物が、感染を処置する多くの方法で使用することを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、毒性遺伝子およびタンパク質の同定およびそれらの使用に関する。
さらにとりわけ、治療での、および薬物のスクリーニングでのその使用に関する
。

【０００２】 （発明の背景） 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、動物の腸管に棲息するグラム陰性微生物である、
腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）または腸細菌の一員であ
る。この細菌ファミリーの他のメンバーには、エンテロバクター属（ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびエルジニア属（
Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が含まれる。大腸菌は正常にヒト胃腸管で見られるけれども
、敗血症、骨膜炎、尿路感染、傷感染、膿瘍形成、腹膜炎および胆管炎を含むヒ
ト疾患に関連する。

【０００３】 大腸菌が原因である疾患状態は特定の悪性決定因子に依存する。たとえば、大
腸菌は新生児髄膜炎に関与し、毒性の主要な決定因子はＫ１抗原として同定され
、これはシアル酸のホモポリマーである。Ｋ１抗原は、宿主の免疫学的系を無効
にし、ファゴサイトーシスを防止する時に役割を持つ可能性がある。

【０００４】 （発明の要約） 本発明は大腸菌Ｋ１中の毒性遺伝子の系列の同定に基づき、またその産物が微
生物の病原性に関連する可能性のある微生物に関連する。

【０００５】 本発明の１つの観点にしたがって、ペプチドは、本明細書で大腸菌Ｋ１からの
ｍｄｏＧ、ｃｒｅＣ、ｒｅｃＧ、ｙｇｇＮ、ｔａｔＡ、ｔａｔＢ、ｔａｔＣ、ｔ
ａｔＥ、ｅｃｋ１、ｉｒｏＤ、ｉｒｏＣ、ｉｒｏＥ、ｍｔｄ２およびｍｓ１〜１
６として、またはグラム陰性細菌中のその相同物またはその機能的断片として同
定した任意の遺伝子を含むオペロンによってコードされる。そのようなペプチド
は、たとえば単離した場合、治療的使用に好適である。

【０００６】 語句「機能的断片（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」は本明細
書で、全遺伝子またはペプチドと同様の治療的有用性を残した遺伝子またはペプ
チドの部分を定義するために使用した。たとえば、ペプチドの機能的断片は、抗
原性決定基として使用してよく、ワクチンまたは抗体の産出で有用である。遺伝
子断片は活性ペプチドをコードするように使用してよい。あるいは、遺伝子断片
は、治療的効果を発揮するためにｉｎ ｖｉｖｏで野生型遺伝子を標的とする遺
伝子治療での有用性を持っている可能性がある。

【０００７】 本発明にしたがったペプチドは、本明細書で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ．２、５
、７、９、１１、１２、１３、１４、１６、２３、２４、２５、２６、２８、３
１、２９、３２および３５−４８として同定した任意のアミノ酸配列を含んでよ
い。

【０００８】 これらのペプチドの毒性決定因子としての同定によって、これが感染の治療で
の多くの方法で使用することが可能になる。たとえば、宿主を本発明によるペプ
チドを発現するように形質導入してよく、またはこのペプチドをコードしている
遺伝子の発現を妨害するように変更してよい。ワクチンはまた、感染の治療のた
めの、本発明によるペプチド、またはその発現の方法を含んでよい。さらに、ワ
クチンは、毒性遺伝子欠失を持つ微生物を含んでよく、そこで、この遺伝子は本
発明にしたがったペプチドをコードしている。

【０００９】 本発明の他の観点にしたがって、ペプチドまたは遺伝子は、潜在的な抗菌性薬
剤をスクリーニングするために、または毒性の決定のために使用してよい。

【００１０】 本発明のさらなる観点は、グラム陰性細菌、とりわけ大腸菌による感染に関連
する状態の処置または防止のために、本明細書で同定した任意の産物の使用であ
る。

【００１１】 （発明の詳細な記述） 本発明は大腸菌の毒性遺伝子（および毒性決定因子）を同定するために、弱毒
化変異体に関して、大腸菌Ｋ１株ＲＳ２２８（Ｐｌｕｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ，
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：５９９−６０８）ミニ
−Ｔｎ５変異バンクを選別するために特性タグ化変異導入（ＳＴＭ）（Ｈｅｎｓ
ｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５；２６９：４００−４０３）を使
用した。

【００１２】 大腸菌Ｋ１を毒性遺伝子を同定するための微生物として使用したけれども、他
の腸内細菌の相当する遺伝子も本発明の意図の範囲内であると考えられる。たと
えば、相当する遺伝子またはコードされたタンパク質は、配列相同性に基づいて
、エンテロバクター属（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ）および、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（
Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびエルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）を含むヒト腸疾患
で見られる他の属で見ることができうる。

【００１３】 語句「毒性決定因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は、
本明細書で、たとえば病原性細菌の維持で役割を持つ可能性のあるペプチドまた
はタンパク質のような産物を定義するために使用する。とりわけ、毒性決定因子
は、感染性または疾病の原因となる微生物の病原性に関連する細菌タンパク質ま
たはペプチドである。

【００１４】 毒性決定因子をコードする遺伝子は「毒性遺伝子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅ
ｎｅ）」と表してよい。変異、欠失または挿入の方法による毒性遺伝子の破壊は
、結果として宿主における細菌の生存レベルを減少させ、または微生物の病原性
の一般的な減少をもたらす。

【００１５】 特性タグ化変異導入は、毒性遺伝子およびその産物を同定するためのとても有
用な技術であることが証明されてきた。この技術は許容条件下で、微生物のゲノ
ム内に無作為的に挿入するトランスポゾンの能力を頼みにしている。このトラン
スポゾンを、同定が簡単なように別々に印を付け、ついで別々に微生物内に導入
し、結果としてゲノムの破壊となる。ついで毒性が減少した変異導入微生物をネ
ガティブ選択によって検出し、挿入不活性化が起こった遺伝子を同定し、特性化
した。

【００１６】 ＳＴＭ工程の第一段階は好適なトランスポゾンまたはトランスポゾン様要素の
調製である。それぞれ微生物内への伝送を促進するためにベクターまたはプラス
ミド内へ組み込んだ、異なるトランスポゾンのライブラリーを調製する。好適な
トランスポゾンを持つベクターの調製は、当業者に対して明らかであろうし、さ
らに第ＷＯ−Ａ−９６／１７９５１号で記述されている。たとえば大腸菌のよう
なグラム陰性細菌に対して、好ましいトランスポゾンにはＴｎ５およびＴｎ１０
が含まれる。トランスポゾンを調製したならば、ついで細菌株の変異導入を行い
、個々に変異導入した細菌のライブラリーを作製する。

【００１７】 ついで、変異導入した微生物のプールを好適な宿主に導入する。好適な期間の
後、微生物を宿主より回収し、宿主内で生存していた微生物を同定し、またそれ
によって生存できなかった変異株、すなわち無毒株を同定する。ついで保存した
ライブラリー内の相当する無毒性株を、挿入不活性化が起こった遺伝子を同定す
るのに使用する。通常トランスポゾン挿入の部位は、トランスポゾン挿入部位が
隣接するＤＮＡを単離することによって同定し、このことにより毒性に関与する
遺伝子の特性化が可能になる。

【００１８】 いったん無毒性微生物を同定したならば、好適な宿主動物に致死量の変異体を
感染させることで、毒性における変異した遺伝子の潜在的役割をより完全に決定
することが可能である。感染した動物の生存時間を野生型株を感染させた対照と
比較し、対照より長い期間生存している動物を、変異導入した毒性遺伝子を持つ
微生物を感染したものと呼んでよい。

【００１９】 または、毒性における潜在的な役割を、野生型および変異体細菌の混合物で動
物宿主を感染させて見積もることができる。好適な期間の後、細菌を宿主動物の
臓器より回収し、野生型および変異体細菌の比を決定した。この比を、接種物内
の野生型細菌に対する変異体細菌の比で割り、競合指数（ＣＩ）を決定する。１
未満の競合指数を持つ変異体を無毒性であると言ってよい。

【００２０】 トランスポゾンの挿入によって不活性化する遺伝子が真の毒性遺伝子であるだ
けでなく、下流（毒性）遺伝子における極性効果を持っている可能性もある。こ
のことは、遺伝子のより定義された領域に非極性変異を置くか、または他の近接
遺伝子に変異導入すること、およびその変異が毒性であるかどうかを確定するこ
とのさらなる実験によって決定できる。

【００２１】 大腸菌内の毒性遺伝子を特性化することによって、その遺伝子配列を他の微生
物内での相同性を確立するために使用できる。この方法では、他の微生物が同様
の毒性決定因子を持っているかどうかを決定することができる。配列相同性は、
たとえばＥＭＢＬまたはＧｅｎｂａｎｋのような現存するデータベースでの検索
によって確定してよい。

【００２２】 毒性遺伝子はしばしば、病原性島と呼ばれる別のクロモソーム領域内で一緒に
クラスターを形成する。病原性島は、通常繰り返し配列、挿入要素またはｔＲＮ
Ａ遺伝子と隣接していると認識されうる。またＧ＋Ｃ含量は通常クロモソームの
残りの部分とは異なり、このことはそれらが他の微生物からの水平伝送によって
得られたことを示唆している。たとえば、大腸菌Ｋ１２ゲノムのＧ＋Ｃ含量は５
２％である。大腸菌で見られた病原性島はこの平均より変化に富むＧ＋Ｃ含量を
持つ傾向にある。

【００２３】 同定した毒性遺伝子は、弱毒化ワクチン株を作製するのに、そして抗菌剤の標
的としての両方で有用でありそうである。同様のことが一般的にグラム陰性細菌
での類似物に対してもあり得る。

【００２４】 本発明の目的に対して、相同性の望ましい度合いは、（アミノ酸またはヌクレ
チドレベルで）一般的に少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、６０
％または７０％、さらに好ましくは８０％または９０％である。

【００２５】 本発明によるタンパク質は本技術分野で公知の方法によって精製し、単離して
よい。とりわけ、遺伝子配列を同定したならば、好適な宿主内に遺伝子を発現さ
せる組換え体技術が使用できる。活性断片および相同物が同定でき、これは治療
に有用でありうる。たとえば、このタンパク質またはその活性断片はワクチンで
の抗原性決定基として使用してよく、免疫応答を誘発する。また受動免疫化また
は診断適用のための抗体の調製でも使用してよい。好適な抗体には、モノクロー
ナル抗体または一本鎖ｆｖ断片を含むその断片が含まれる。抗体の調製のための
方法は当業者に対して明らかであろう。

【００２６】 弱毒化した微生物に基づいたワクチンの調製は当業者に公知である。ワクチン
組成物は、必要または望ましいようにたとえば明礬のような好適な担体または抗
原性補強剤と共に処方でき、治療に使用でき、大腸菌または他のグラム陰性細菌
に対する効果的な免疫化を提供する。ワクチン処方の調製は当業者に明らかであ
ろう。

【００２７】 さらに一般的に、当業者によく公知のように、好適な量の本発明の活性成分を
、治療的使用のために、好適な担体または賦形剤および投与経路として選択でき
る。これらの因子は処置すべき状況の性質／厳しさ、対象の型または健康のよう
な公知の基準に従って選択し、または決定される可能性がある。

【００２８】 以下の実施例は本発明を例示する。実施例においては、ＳＴＭを、全身性感染
のマウスモデルを使用して、弱毒化した変異体に対して、大腸菌Ｋ１ミニ−Ｔｎ
５をスクリーニングするために使用した。基礎的な手順は、上記のＨｅｎｓｅｌ
ｅｔ ａｌで開示されたものにしたがった。毒性遺伝子内のミニ−Ｔｎ５挿入
を含む大腸菌Ｋ１は変異体の混合集団を接種したマウスからは回収されず、した
がって弱毒化されている可能性がある。

【００２９】 ミニ−Ｔｎ５挿入のどちらかの側と隣接しているＤＮＡ領域を、逆ＰＣＲによ
るか、またはカナマイシン抵抗性マーカーのレスキューによってクローン化した
。後者の場合、ＳＴＭ−由来変異体からのクロモソームＤＮＡを制限酵素によっ
て消化し、プラスミドｐＵＣ１９内にライゲーションし、カナマイシン耐性クロ
ーンをコンピテント大腸菌Ｋ１２細胞内に形質導入した後に選別した。次いで続
くクローニングおよび配列決定を行い、遺伝子配列を、公的に入手可能な配列デ
ータベース（ＥＭＢＬ）での配列を使用して比較し、推定される遺伝子産物の特
性化を補助する。

【００３０】 （実施例） 実施例１ 第一の変異体において、クローン化したＤＮＡの２つの断片を配列決定した。
ヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３とし
て表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１からのＤＮＡの翻訳領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．２として示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１は、ヌクレオチド２５７７から６９０
８で大腸菌Ｋ１２からのｍｄｏＧＨ領域（ＥＭＢＬデータベース受け入れ番号Ａ
Ｅ０００２０６）に対して９９．８％の同一性を示す。このＤＮＡ断片は、ｙｍ
ｄＤ遺伝子の５’部分、全ｍｄｏＧ遺伝子およびｍｄｏＨ遺伝子の５’部分をコ
ードしている。ｍｄｏＧ遺伝子の産物は、その機能は未知であるが、しかし、膜
由来オリゴサッカライドの生合成に関連すると信じられている。

【００３１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３は、大腸菌Ｋ１２からのｍｄｏＨ遺伝子の３’部分お
よび下流遺伝子配列（ヌクレオチド７１８７−７７６０）と９８．３％同一性を
示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２はアミノ酸１−５１１で大腸菌Ｋ１２からのｍｄ
ｏＧタンパク質（Ｓｗｉｓｓ Ｐｏｒｔ受け入れ番号Ｐ３３１３６）と９９．６
％同一性を示す。

【００３２】 この新規遺伝子を、全身性感染のネズミモデル（Ａｃｈｔｍａｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９８３；Ｖｏｌ．３９
：３１５−３３５）で混合感染を用いて、毒性の弱化に関して試験し、０．３８
の競合指数（ＣＩ）で弱毒化することを示した。このことは、もともとのトラン
スポゾン変異体の弱毒化が、ｍｄｏＧ遺伝子の破壊によるものでありそうなこと
を確かにする。

【００３３】 ｍｄｏＧの極性および非極性欠失変異体を構築した。ｍｏｄＧ遺伝子および隣
接する領域を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＴＡＣ
ＴＣＡＧＡＡＴＧＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９）および５’−ＣＧＣ
ＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．５０）でのＰＣＲで増幅した。この産物をｐＵＣ１９内にクローン化した。次
いで、ｍｄｏＧの５’−および３’−末端断片および全ｐＵＣ１９配列を含んで
いるＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＧＣＡ
ＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１）および５’−ＧＡＴ
ＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．５２）にて逆ＰＣＲにて増幅した。非極性カナマイシン耐性カセット（ａｐｈ
Ｔ）を、ｍｄｏＧ配列間に両方向で挿入し、極性および非極性構造物を得た。次
いでｍｄｏＧ：：ａｐｈＴ融合体を自殺ベクターｐＣＤＶ４４２に伝送した。ｍ
ｄｏＧのクロモソームコピーを、ｐＣＤＶ４４２構造物の野生型大腸菌Ｋ１へ結
合後に対立移動によって変異導入した。

【００３４】 構築した変異体を、全身性感染のネズミモデル（上記Ａｃｈｔｍａｎ ｅｔ
ａｌ．）で毒性の弱化に関して試験した。 極性および非極性構造物両方が毒性
を弱化し、競合指数はそれぞれ０．３７と０．３５であった（それぞれ３匹のマ
ウスの平均ＣＩ）。このことは、もともとのトランスポゾン変異体の弱毒化が、
ｍｄｏＧ遺伝子の破壊によるものでありそうであることを確かにしている。

【００３５】 （実施例２） 第二の変異体を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示したヌクレオチド配列およびＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．５として示した翻訳アミノ酸配列を持っている毒性遺伝子を
持つと同定した。ミニ−Ｔｎ５トランスポゾンをヌクレオチド５８１（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．４）およびアミノ酸１８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）で挿入した
。

【００３６】 これらの配列は大腸菌Ｋ１２のｃｒｅＣ遺伝子（ＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎ
ｋ受け入れ番号Ｍ１３６０８、Ａ０００５１０およびＵ１４００３）と９７．９
％同一性を示す。

【００３７】 大腸菌Ｋ１２からのｃｒｅＣタンパク質は、ヒスチジンキナーゼのタンパク質
ファミリーに属し、同時にシグナル領域を含んでいるタンパク質からなるタンパ
ク質ファミリーに属する。

【００３８】 新規遺伝子を毒性の弱化について試験し（上記Ａｃｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．）
、競合指数０．０９で弱毒化されたことを示した。

【００３９】 大腸菌Ｋ１２ ｃｒｅＣ遺伝子はｃｒｅＤ遺伝子を持つオペロンの部分として
転写されたので、この弱毒化が推定大腸菌Ｋ１ ｃｒｅＤ遺伝子上での極性効果
による可能性がある。

【００４０】 実施例３ 第三の変異体は、ミニ−Ｔｎ５の直後にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６として示した
ヌクレオチド配列を持った。この配列の翻訳物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７として
示した。

【００４１】 前記配列は、ヌクレオチド５−１４６において大腸菌Ｋ１２のｒｅｃＧ遺伝子
（ＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｐ２４２３０およびＭ６４３６７
）と９３．７％同一性を示す。このことは、破壊した遺伝子が、少なくとも部分
的に大腸菌Ｋ１２のｒｅｃＧ遺伝子と同一であることを示唆している。大腸菌Ｋ
１２のｒｅｃＧ遺伝子は、ＡＴＰ依存ＤＮＡへリカーゼとして機能する７６．４
ｋＤａのタンパク質をコードしており、ＤＮＡ修復で重要な役割を果たしている
。

【００４２】 弱毒化に関する試験において、競合指数は０．４８であると示された。ｒｅｃ
Ｇ遺伝子は、オペロンの末端遺伝子として転写され、したがって、この弱毒化が
他の大腸菌Ｋ１遺伝子における極性効果によることはありそうにない。

【００４３】 実施例４ 第四の変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として示した転写産物を持つ、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．８として示したヌクレオチド配列内に挿入されたトランスポゾ
ンを持った。

【００４４】 ミニ−Ｔｎ５トランスポゾンは、ヌクレオチド３５９およびアミノ酸８０で挿
入された。

【００４５】 これらの配列は、ヌクレオチド３３９−１０５４にて、大腸菌Ｋ１２のｙｇｇ
Ｎ遺伝子（ＥＭＢＬ受け入れ番号ＡＥ０００３７８）と９８．５％配列同一性を
示し、アミノ酸レベルでは９９．６％の同一性を示す。

【００４６】 ｙｇｇＮ遺伝子の配列は公知であるけれども、そのコードしているタンパク質
の機能は未だ決定されていない。

【００４７】 本新規遺伝子を、毒性の弱化に関して試験し、０．４３の競合指数で弱毒化し
たことを示した。

【００４８】 実施例５ いくつかの変異体でまた、同様の領域内でのトランスポゾン挿入が見られた。
前記領域のクローニングおよび配列決定によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０と
して示したヌクレオチド配列が明らかになった。この配列は大腸菌Ｋ１２のｔａ
ｔＡＢＣＤオペロン（ＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＪ００５８
３０、ＡＥ０００４５９およびＡＥ０００１６７）と相同性を持つ。このオペロ
ンは、予想質量９．６ｋＤ、１８．４ｋＤ、２８．９ｋＤおよび２９．５ｋＤの
タンパク質をコードし、このタンパク質はＳｅｃ依存タンパク質輸出経路の要素
として機能する。この経路は、細胞室内での補助因子の接着後、完全に折り畳ま
れたタンパク質を、ゲート孔を通してペリプラズムへ移動させることを可能にす
る。

【００４９】 前記ヌクレオチド配列の翻訳物は、ｔａｔＡに相当するタンパク質（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１１）、ｔａｔＢに相当する配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）、
ｔａｔＣに相当する配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）、ｔａｔＤに相当する配
列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）を示した。

【００５０】 ＳＴＭによって同定された変異体内のミニ−Ｔｎ５トランスポゾンは、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１０のヌクレオチド１４２９および２２２６に局在する。これら
のトランスポゾン挿入は、アミノ酸５０でのｔａｔＢタンパク質配列およびアミ
ノ酸１４３でのｔａｔＣタンパク質配列を破壊する。

【００５１】 ｔａｔＢおよびｔａｔＣ遺伝子を、毒性の弱化について試験し、それぞれ競合
指数０．００１２および０．００３９で弱毒化されたことが示された。これらの
遺伝子はまた、全身性感染の同一のモデルでの単一感染で試験した場合にも毒性
が弱化された。

【００５２】 実施例６ さらなる変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５として示した大腸菌Ｋ１２のｔ
ａｔＥ遺伝子に相当する領域内で挿入されて不活性化した。前記配列の翻訳物は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６で示した。ｔａｔＥ遺伝子は、ヌクレオチド６７１９
−７３０６で、大腸菌Ｋ１２遺伝子のもの（受け入れ番号ＡＥ０００１６７）と
９８％同一性を示す。

【００５３】 ｔａｔＡ、ｔａｔＤおよびｔａｔＥ遺伝子が毒性に必要であるかどうかを確か
めるために、非極性欠失変異体をそれぞれで構築した。ｔａｔＡ、ｔａｔＤおよ
びｔａｔＥ遺伝子それぞれが隣接するＤＮＡの領域を以下のプライマーを用いて
増幅した。 ｔａｔＡ ５’−ＴＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＧＡ Ｇ
ＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３） ５’−ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＡＴ ＡＣＣ Ａ
ＣＣ Ｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４） ５’−ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ Ｇ
ＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５） ５’−ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＣＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＡＣ Ｃ
ＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６） プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４をｔａｔ
ＡのＤＮＡ配列上流を増幅をするために使用した。プライマーＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．５５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６をｔａｔＡのＤＮＡ配列下流を増幅す
るのに使用した。 ｔａｔＤ ５’−ＴＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ ＡＴＧ Ａ
ＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７） ５’−ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＣＧ ＡＡＣ Ｔ
ＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８） ５’−ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＣＧＡ Ｃ
ＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９） ５’−ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＣＣ ＡＴＴ ＧＴＴ Ｃ
ＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０） プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８をｔａｔ
ＤのＤＮＡ配列上流を増幅をするために使用した。プライマーＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．５９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０をｔａｔＤのＤＮＡ配列下流を増幅す
るのに使用した。 ｔａｔＥ ５’−ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＧＧ Ａ
ＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１） ５’−ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＴＴ Ｇ
Ｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２） ５’−ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＧＴ Ｇ
ＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３） ５’−ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＧＡ Ｇ
ＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４） プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２をｔａｔ
ＥのＤＮＡ配列上流を増幅をするためにに使用した。プライマーＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．６３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４をｔａｔＥのＤＮＡ配列下流を増幅
するのに使用した。

【００５４】 これらの隣接するＤＮＡ断片のｐＵＣ１９内へのクローニングの後、非極性ａ
ｐｈＴカナマイシン耐性カセット（Ｇａｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ，１９９２；１７４：４３３８−４３４９）を前記隣接するＤＮＡ断片間
に挿入し、ｔａｔＡ、ｔａｔＤおよびｔａｔＥ遺伝子を置き換えた。ついでこれ
らのＤＮＡ断片を好適なベクターｐＣＶＤ４４２（Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄ ｅｔ
ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，１９９１；５：１４４７−１４５７）に伝送した
。次いで大腸菌Ｋ１ ｔａｔＡ、ｔａｔＤおよびｔａｔＥ遺伝子のクロモソーム
コピーを、ｐＣＶＤ４４２構造物の野生型大腸菌Ｋ１内へ結合の後に対立伝送に
よって変異導入した。

【００５５】 ｔａｔＡ、ｔａｔＤおよびｔａｔＥ遺伝子の破壊は、毒性の弱毒化について試
験されてきた（上記Ａｃｈｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．）。

【００５６】 どの遺伝子も単独で欠失した場合は弱毒化されなかった。前記遺伝子は毒性に
おいてまだ役割を果たしている可能性があり、これを試験するために、変異体を
ｔａｔＡおよびｔａｔＥ遺伝子両方での欠失で調製した。二重変異体を、野生型
株での混合感染を用いて毒性の弱化について試験し、競合指数０．００１７で弱
毒化されたことを示した。したがって、ｔａｔＡ、ｔａｔＤおよびｔａｔＥ遺伝
子は弱毒化微生物を作製するために組み合わせて使用してよいことが明らかであ
る。

【００５７】 ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ゲノムおよび髄膜炎菌（Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ゲノム内に存在する予想されるｔ
ａｔＡＢＣＤ遺伝子との大腸菌Ｋ１ ｔａｔＡＢＣＤの類似性を考えると、ｔａ
ｔ系はまた、これらのそして他の微生物における毒性に必要である可能性がある
ことが明らかであった。ネズミチフス菌ｔａｔＣ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
１７）内の欠失を、以下のプライマーを用いてｔａｔＣ遺伝子のどちらかの側と
隣接するＤＮＡを増幅することで構築した。 ５’−ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＧＴ ＴＧＴ ＣＧＡ ＴＣＣ Ｔ
Ｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５） ５’−ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＧＣＣ ＧＡＧ ＣＡＧ Ａ
ＣＴ Ｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６） ５’−ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＴＴ ＴＡＣ Ｇ
ＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７） ５’−ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＧＡ ＣＡＧ ＴＴＴ Ｇ
ＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８） プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６をネズミ
チフス菌ｔａｔＣ遺伝子のＤＮＡ配列下流を増幅するために使用した。プライマ
ーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８をネズミチフス菌
ｔａｔＣのＤＮＡ配列上流を増幅するのに使用した。

【００５８】 ｔａｔＣ遺伝子の２つの領域に対してコードされたアミノ酸配列をＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９として示した。

【００５９】 これらの隣接しているＤＮＡ断片のｐＵＣ１９内へのクローニングの後、非極
性カナマイシン耐性カセット（ａｐｈＴ）を前記隣接しているＤＮＡ断片間に挿
入し、ネズミチフス菌ｔａｔＣ遺伝子を置き換えた。ついでこのＤＮＡ断片を自
殺ベクターｐＣＶＤ４４２に伝送した。次いでネズミチフス菌ｔａｔＣ遺伝子の
クロモソームコピーを、ｐＣＶＤ４４２構造物の野生型ネズミチフス菌株ＴＭＬ
およびＳＬ１３４４内へ結合の後に対立伝送によって変異導入した。

【００６０】 破壊したネズミチフス菌ｔａｔＣ遺伝子を、全身性感染のネズミモデルでの混
合および単一感染を用いて、毒性の弱化について試験した。混合感染に関して、
６−７週齢ｂａｌｂＣマウスに１０⁴細菌細胞を腹腔内に移植した。３日後脾臓
内に存在する変異体および野生型細菌の数を比較した後に、競合指数を計算した
。単一感染に関して、マウスにさまざまな投与量で腹腔内または経口どちらかで
移植し、マウスの生存を１７日間モニタした。この種は毒性が弱化され、ＳＬ１
３４４ ｔａｔＣおよびＴＭＬ ｔａｔＣ欠失株がそれぞれ０．０７８および０
．０９８の競合指数であった。

【００６１】 単一感染において、マウス生存は野生型対象に比べて引き延ばされた。

【００６２】 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのｔａｔ配
列との配列相同性もまた示された。髄膜炎菌からの遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２０で示し、ｔａｔＣに関するコードされたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２１で示す。

【００６３】 毒性について試験するために、以下のプライマーを使用して欠失変異体を作製
した。 ５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．６９） ５’−ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＧ−３’（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．７０） ５’−ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ−３’（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．７１） ５’−ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ−３’（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．７２）

【００６４】 ＤＮＡ断片とａｐｈＴカナマイシン耐性カセットのｐＵＣ１９内へのクローニ
ングを、ネズミチフス菌に対して以上で概略した方法にしたがって行った。髄膜
炎菌ｔａｔＣ遺伝子のクロモソームコピーを、野生型髄膜炎菌細胞内でｐＵＣ１
９に基づいた構造物を形質転換することで変異導入した。

【００６５】 得られた形質転換物のサザン解析によって、すべての形質転換物が、部分二倍
体であり、ｔａｔＣ遺伝子の野生型および変異したコピー両方を含んでいること
が示唆された。このことは、ｔａｔＣ遺伝子が欠失された変異体の単離に対して
何らかの選別があったことを示唆する。

【００６６】 極性および非極性構造物でのさらなる研究で、形質転換物が選択培地上で増殖
しないことが示された。このことは、髄膜炎菌ｔａｔＣ遺伝子がこの微生物のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏの増殖で重要であることを示している。

【００６７】 実施例７ さらなる変異体を、ヌクレオチド３９８１で、本明細書にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．２２として同定された核酸配列内にトランスポゾンを挿入して同定した。前記
配列を本明細書ではｅｃｋ１と定義し、多くの細菌からのさまざまな第１群グリ
コシル転移酵素と配列相同性を示す。大腸菌Ｋ１２のｇｎｄ遺伝子（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．２２のヌクレオチド４１９７−４６０４）とも配列相同性が示された
。

【００６８】 大腸菌ｅｃｋ１遺伝子の翻訳物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６として示す。前記
遺伝子を上述のように毒性の弱化に関して試験し、０．０２５の競合指数で弱毒
化されたことを示した。

【００６９】 さまざまなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をまたＤＮＡ配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．２２）から同定した。これらの第一のものは、本明細書でＭＳ
１として同定し、翻訳産物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５として示す。このアミノ
酸配列は大腸菌血清型０１１１（ＴｒＥＭＢＬデータベース受け入れ番号ＡＡＤ
４６７３２）からの予想されるグリコシル転移酵素と５０．３％の同一性を持つ
。このアミノ酸配列はまた、大腸菌Ｋ１からのｅｃｋ１タンパク質と相同性を示
し、エルジニア エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌ
ｉｔｉｃａ）（ＴｒＥＭＢＬデータベース受け入れ番号Ｑ５６９１７）からのＴ
ｒｓＥタンパク質とも相同性を示す。

【００７０】 本明細書でＭＳ２として同定した第二のオープンリーディングフレームはＳＥ
Ｑ IDＮＯ．２４として示した配列を持つ。これはエルジニア エンテロコリテ
ィカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（ＴｒＲＭＢＬデー
タベース受け入れ番号Ｑ５６９１５）からの予想されるグリコシル転移酵素Ｔｒ
ｓＣに配列相同性を示し、また大腸菌血清型０１１３（ＴｒＥＭＢＬデータベー
ス受け入れ番号ＡＡＤ５０４８５）からのグリコシル転移酵素ＷｂｎＡとも配列
相同性を示す。

【００７１】 第三のオープンリーディングフレームは本明細書でＭＳ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．２３）として同定された産物をコードしている。このアミノ酸配列は連鎖球
菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）変異体からのラムノシル転移酵素に対して３０．
２％同一性を示す。

【００７２】 ＳＥＱ ＩＤ NO．２２として示した遺伝子配列は、複数の毒性遺伝子が微生
物ゲノム上でクラスターで位置している病原性島の少なくとも部分であってよい
。

【００７３】 実施例８ さらなる変異体が、ｉｒｏＣＤＥオペロン内にトランスポゾンの挿入があると
同定された。ミニ−Ｔｎ５挿入のどちらかの側と隣接しているヌクレオチド配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０として示した。

【００７４】 ミニ−Ｔｎ５トランスポゾンはＳＥＱ ＩＤ NO．２７のヌクレオチド１２７
２、ＳＥＱ ＩＤ NO．３０のヌクレオチド１で挿入されており、ｉｒｏＤを中
断している。ｉｒｏＤのＮ−末端領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９で示し、Ｃ−
末端領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１で示す。

【００７５】 ｉｒｏＤに加えて、ＳＥＱ ＩＤ NO．２７として示した遺伝子は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２８として示したアミノ酸配列を持つ部分ペプチドをコードしてい
る。このアミノ酸配列は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）から
の予想されるＡＴＰ結合カセットトランスポーターと７０．９％の同一性を示す
。

【００７６】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０として示した遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
３２として示したアミノ酸配列を持つペプチドをコードするオープンリーディン
グフレームを含み、これはチフス菌からのｉｒｏＥタンパク質と配列相同性を持
つ。

【００７７】 上述したような毒性の弱毒化に関するモデルでの遺伝子の試験によって、ｉｒ
ｏＤ遺伝子が０．１０７の競合指数で弱毒化されたことが示された。ｉｒｏＤ遺
伝子内でのミニ−Ｔｎ５変異体をＰ１形質導入によって野生型大腸菌Ｋ１株内へ
再導入した。得られた形質導入物はまた０．１の競合指数で毒性が弱毒化された
。このことは、弱毒化された表現型がｉｒｏＤ内の挿入物に関連していることを
示している。しかしながら、弱毒化は大腸菌Ｋ１ ｉｒｏＥ遺伝子上の極性効果
による可能性がある。

【００７８】 実施例９ さらなる変異体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３として示したヌクレオチド配列
内にトランスポゾン挿入を持つと同定された。このトランスポゾンはＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．３３のヌクレオチド２２６４で挿入される。このヌクレオチド配列は
、大腸菌Ｋ１２のａｓｌＡ／ｈｅｍＹ領域（ＥＭＢＬ受け入れ番号ＡＥ０００４
５６）と配列相同性を示す。ａｓｌＡはアリールスルファターゼ相同物をコード
しており、一方ｈｅｍＹはプロトヘムIXの生合成に関連する。このことは、破壊
した領域は、大腸菌Ｋ１２のａｓｌＡ／ｈｅｍＹ領域に少なくとも部分的に同一
であることを示唆している。

【００７９】 このトランスポゾンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３のヌクレオチド２２６４で挿
入されている。この挿入部位はｈｅｍＹ遺伝子の終止コドンから２１６ヌクレオ
チド下流であり、ａｓｌＡ遺伝子の開始コドンから４７２ヌクレオチド上流であ
る。

【００８０】 新規領域を上述にように毒性の弱化に関して試験し、０．０３３の競合指数で
弱毒化されたことが示された。この領域のミニ−Ｔｎ５変異をＰ１形質導入によ
って野生型大腸菌Ｋ１株内に再導入した。得られた形質導入物はまた０．００８
の競合指数で毒性が弱化された。このことは弱毒化された表現系はこの領域での
トランスポゾンの挿入に関連していることを示唆している。しかしながら、ａｓ
ｌＡの極性および非極性欠失変異体を構築し、上述のように毒性の弱化に関して
試験した。

【００８１】 極性または非極性変異体どちらも毒性が弱毒化されず、このことは本来のトラ
ンスポゾン変異体の弱毒化はａｓｌＡ遺伝子上の極性効果によるものでないこと
を示唆している。このことはこのトランスポゾンがａｓｌＡとｈｅｍＹ間の遺伝
子間領域内でコードされた他の機能を破壊していることを示している。たとえば
、この領域内にコードされたｏｘｙＳ（Ａｌｔｕｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，１９９７；９０：４３−５３）に類似の調節ＲＮＡのような非転写ＲＮＡ分
子があり得る。あるいはこのトランスポゾンは、たとえばＤＮＡ複製に関連する
可能性のあるいくつかのＤＮＡ構造物を破壊している可能性がある。このＤＮＡ
領域はまた病原体チフス菌にも存在し、このことは他の微生物内での病原性に重
要である可能性があることを示している。この領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３
）は、抗菌薬剤を同定するために標的として使用してよい。

【００８２】 実施例１０ さらなる変異体を同定し、ミニ−Ｔｎ５挿入物のどちらかの側に隣接している
ＤＮＡ領域をクローン化し、ヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４とし
て示した。このヌクレオチド配列はヘルペトシフォン オウランティアクス（Ｈ
ｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）（ＥＭＢＬ受け入れ番号
Ｐ２５２６５）と相同性を持ち、シトシン特異的メチル転移酵素として機能して
いるｍｔｄ２遺伝子産物と相同性を持つ。ｍｔｄ２遺伝子は大腸菌Ｋ１２ゲノム
内では見ることができず、病原島を表している可能性がある。

【００８３】 ミニ−Ｔｎ５トランスポゾン挿入物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４のヌクレオチ
ド４７７３と３７６４で局在し、ｍｔｄ２遺伝子を中断していると示された。

【００８４】 ｍｔｄ２遺伝子のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３として示す。

【００８５】 大腸菌Ｋ１ ｍｔｄ２遺伝子を上述のように毒性の弱化に関して試験し、０．
０７３競合指数で弱毒化されたことが示された。

【００８６】 ｍｔｄ２遺伝子に加えて、連続するオープンリーディングフレームもまた、本
明細書でＭＳ４からＭＳ１６、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ．４８−４４およ
び４２−３５として同定したトランスポゾン産物を持つと同定した。オープンリ
ーディングフレームが潜在的な病原性島内に局在しているので、これらの遺伝子
の変異はまた結果として毒性を弱毒化する可能性がある。さらに、大腸菌および
他の細菌がヌクレオチド配列内で異なる型でのペプチドをコードしている可能性
があるので、これらのタンパク質のいくつかのコード領域は重なり合っている可
能性がある。さらに、Ｖａｌで開始されていることが示された任意のアミノ酸配
列が実際はＭｅｔで始まっている可能性がある。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１月２６日（２００１．１．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/345 1/19 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｃ０８７ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ９８２７８１４．６ (32)優先日 平成10年12月17日(1998．12．17) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８２７８１５．３ (32)優先日 平成10年12月17日(1998．12．17) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８２７８１６．１ (32)優先日 平成10年12月17日(1998．12．17) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８２７８１８．７ (32)優先日 平成10年12月17日(1998．12．17) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９００７０８．０ (32)優先日 平成11年１月13日(1999．1．13) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９００７１０．６ (32)優先日 平成11年１月13日(1999．1．13) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９００７１１．４ (32)優先日 平成11年１月13日(1999．1．13) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９９０１９１５．０ (32)優先日 平成11年１月28日(1999．1．28) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クラーク，エンダ・エリザベス イギリス国 ダブリュー12 ０エヌエヌ ロンドン、ドゥ・カン・ロード、デプト・ オブ・インフェクティアス・ディジーズ、 インペリアル・カレッジ・スクール・オ ブ・メディシン・アット・ザ・ハマースミ ス・キャンパス (72)発明者 エベレスト，ポール・ハワード イギリス国 ダブリュー12 ０エヌエヌ ロンドン、ドゥ・カン・ロード、デプト・ オブ・インフェクティアス・ディジーズ、 インペリアル・カレッジ・スクール・オ ブ・メディシン・アット・ザ・ハマースミ ス・キャンパス (72)発明者 ドゥーガン，ゴードン イギリス国 ダブリュー12 ０エヌエヌ ロンドン、ドゥ・カン・ロード、デプト・ オブ・インフェクティアス・ディジーズ、 インペリアル・カレッジ・スクール・オ ブ・メディシン・アット・ザ・ハマースミ ス・キャンパス (72)発明者 ホールデン，デイビッド・ウィリアム イギリス国 ダブリュー12 ０エヌエヌ ロンドン、ドゥ・カン・ロード、デプト・ オブ・インフェクティアス・ディジーズ、 インペリアル・カレッジ・スクール・オ ブ・メディシン・アット・ザ・ハマースミ ス・キャンパス (72)発明者 シェア，ジャクリン・エリザベス イギリス国 ダブリュー12 ０エヌエヌ ロンドン、ドゥ・カン・ロード、デプト・ オブ・インフェクティアス・ディジーズ、 インペリアル・カレッジ・スクール・オ ブ・メディシン・アット・ザ・ハマースミ ス・キャンパス (72)発明者 フェルドマン，ロバート・グラハム イギリス国 ダブリュー12 ０エヌエヌ ロンドン、ドゥ・カン・ロード、デプト・ オブ・インフェクティアス・ディジーズ、 インペリアル・カレッジ・スクール・オ ブ・メディシン・アット・ザ・ハマースミ ス・キャンパス Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 4B024 AA01 AA13 BA07 BA80 CA02 DA01 DA02 DA06 DA11 EA04 GA11 GA25 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR01 QR32 QR36 QR39 QR48 QR74 QR80 4B064 AG01 CA01 CA02 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA26X AA26Y AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA01 BA16 CA24 CA27 CA45 CA46 4C084 AA01 AA02 AA17 BA44 CA04 CA53 ZB352 4C085 AA03 BA21 CC07 DD62 4C087 AA01 AA02 AA03 BC34 BC35 BC50 CA12 CA16 CA20 CA22 NA14 ZB35 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 EA20 EA50 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 治療的使用に関する、本明細書でｔａｔＡ、ｔａｔＢ、ｔａ
   ｔＣ、ｔａｔＥ、ｍｄｏＧ、ｃｒｅＣ、ｒｅｃＧ、ｙｇｇＮ、ｅｃｋ１、ｉｒｏ
   Ｄ、ｉｒｏＣ、ｉｒｏＥ、ｍｔｄ２およびｍｓ１〜１６として同定された任意の
   遺伝子を持つオペロンによってコードされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１より入
   手可能なペプチド、またはグラム陰性細菌内でのその相同物またはその機能的断
   片。
2. 【請求項２】 本明細書でＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ．２、５、７、９、１１、
   １２、１３、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２４、２５、２６、２８、
   ２９、３１、３２および３５−４８として同定された任意のアミノ酸配列を含む
   、請求項１に記載のペプチド。
3. 【請求項３】 治療的使用のための、請求項１または請求項２に記載のペプ
   チドをコードしているポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項１または請求項２に記載のペプチドを発現するように
   形質転換した宿主。
5. 【請求項５】 請求項１または請求項２に記載のペプチドを含んでいるワク
   チン、またはその発現のための方法。
6. 【請求項６】 遺伝子が請求項１または請求項２に記載のペプチドをコード
   している、毒性遺伝子変異を持っている微生物を含んでいるワクチン。
7. 【請求項７】 １つの遺伝子がｔａｔＡをコードしており、他がｔａｔＥを
   コードしている、２つの遺伝子での毒性遺伝子欠失を持っている、請求項６に記
   載のワクチン。
8. 【請求項８】 遺伝子が、病原性島内にあり、前記島が本明細書で同定され
   た遺伝子を含んでいる、請求項６に記載のワクチン。
9. 【請求項９】 潜在的な薬剤をスクリーニングするための、または毒性の検
   出のための、請求項１−４の任意、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３に記述の産
   物の使用。
10. 【請求項１０】 グラム陰性細菌による感染に関連した状態の治療または予
    防での使用のための薬剤の製造のための、請求項１−４の任意に記載の産物の使
    用。
11. 【請求項１１】 前記細菌が大腸菌である、請求項１０に記載の使用。