JP2002519030A - ヒトシグナルペプチド含有タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトシグナルペプチド含有タンパク質（HSPP）と、それを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、HSPPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、ヒトシグナルペプチド含有タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列
、並びにこれらの配列を用いた、癌を含む細胞増殖異常及び炎症、心血管疾患、
神経疾患、生殖障害、発生障害の診断及び治療、予防に関連する。

【０００２】 発明の背景 タンパク質の輸送は、細胞機能にとって必須である。タンパク質の輸送は、輸
送されるタンパク質のアミノ末端に位置するシグナルペプチドによって仲介され
得る。シグナルペプチドは、１０〜２０個の疎水性アミノ酸からなり、新生タン
パク質をリボソームから小胞体（ＥＲ）などの膜で囲まれた特定の区画に付着す
る。ＥＲに付着したタンパク質は、分泌経路を介して輸送されるか、或いはＥＲ
またはゴルジ体、リソソームなどの任意の分泌細胞小器官に留まる。分泌経路を
通って輸送されるタンパク質は細胞外に分泌されるか、或いは細胞膜に留まる。
分泌されたタンパク質は、不活性な前駆体として合成され、分泌経路を通って輸
送される際に翻訳後プロセッシングによって活性化される場合が多い。このよう
なプロセッシングには、グリコシル化及びリン酸化、タンパク分解、シグナルペ
プチダーゼによるシグナルペプチドの切断が含まれる。タンパク輸送中に起こり
得る他の現象には、新生タンパク質のシャペロン依存性変性及びフォールディン
グ、タンパク質と受容体または細孔複合体との相互作用がある。アミノ末端シグ
ナルペプチドを有する分泌タンパク質には、受容体及び細胞外基質分子（matrix
molecule）、サイトカイン、ホルモン、成長及び分化因子、神経ペプチド、血
管介在物質（vasomediator）、ホスホキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパー
ゼ、ホスホジエステラーゼ、Ｇタンパク質、Ｒａｓ関連タンパク質、イオンチャ
ンネル、輸送体／ポンプ、プロテアーゼ、転写因子などがある。これらについて
以下に記載する（Alberts, B. 他 (1994) Molecular Biology of The Cell, Gar
land Publishing, New York, NY, pp. 557-560, 582-592.を参照）。

【０００３】 Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞外シグナルを伝達する内在性膜
タンパク質のスーパーファミリーを構成する。ＧＰＣＲには、ドーパミン及びエ
ピネフリン、ヒスタミン、グルタミン酸（代謝調節効果）、アセチルコリン（ム
スカリン効果）、セロトニンなどの生体アミンの受容体と、プロスタグラジン及
び血小板活性化因子、ロイコトリエンなどの炎症の脂質仲介物質の受容体と、カ
ルシトニン及びＣ５ａアナフィラトキシン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン
放出ホルモン、ニューロキシン、オキシトシン、トロンビンなどのペプチドホル
モンの受容体と、網膜感光色素及び嗅覚刺激分子などの感覚シグナル伝達物質の
受容体とが含まれる。これらの高度に保存された受容体の構造は、７つの疎水性
膜貫通領域と、第２の細胞外ループと第３の細部外ループとの間のシステインジ
スフィルド架橋と、細胞外Ｎ末端と、細胞質のＣ末端とからなる。Ｎ末端がリガ
ンドと相互作用し、ジスフィルド架橋がアゴニスト及びアンタゴニストと相互作
用し、大きな第３の細胞内ループがＧタンパク質と相互作用して、ｃＡＭＰまた
はホスホリパーゼＣ、イノシトール三リン酸、イオンチャンネルなどのセカンド
メッセンジャーが活性化される(Watson, S. 及びArkinstall. S. (1994) The G-
orotein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, pp. 2
-6; 及び Bolander, F.F. (1994) Molecular Endocrinologv, Academic Press,
San Diego, CA, pp. 162-176.を参照)。

【０００４】 他のタイプの受容体には、免疫系の白血球細胞で見つかった細胞表面抗原が含
まれる。これらの抗原は、系統的なモノクロナール抗体（ｍＡｂ）に基づいたシ
ョットガン配列技術によって同定された。未知の細胞表面白血球抗原を調べるた
めに、これらの技術を用いて何百ものｍＡｂが生産された。これらの抗原は、分
化した或いは未分化の様々な白血球細胞型における一般的な免疫細胞化学的な局
在パターンに基づいて、分化の集団（ＣＤ：cluster of differentiation）に分
類した。所定の集団の抗原は、１つの細胞表面タンパク質を同定すると考えられ
、「ＣＤ」番号を付した。ＣＤ抗原によって同定されたタンパク質をコードする
幾つかの遺伝子を単離して、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）
などの脂肪酸含有糖脂質への共有結合によって細胞膜に固着する細胞表面タンパ
ク質及び膜貫通タンパク質の両方の特徴が見つかった。(Barclay, A. N.他 (199
3) The Leucocyte Antigen Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, pp.
144-145; Noel, L. S. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:3878-3883.を参照)。

【０００５】 tetraspaninは、膜タンパク質のスーパーファミリーであり、細胞系譜特異的
タンパク質（lineage-specific protein）及びインテグリン、他のtetraspanin
を含む細胞表面シグナル伝達複合体の形成及び安定化を促進する。tetraspanin
は、細胞の活性化及び（癌を含む）細胞増殖、分化、接着、運動性に関与する。
これらのタンパク質は、膜を４回貫通し、保存された細胞内ドメイン及びＣ末端
、細胞外ドメイン、非保存の親水性ドメインを有する。tetraspaninには、血小
板細胞膜タンパク質及び内皮細胞膜タンパク質、白血球表面タンパク質、組織特
異的抗原及び腫瘍抗原、網膜色素変性症関連遺伝子ペリフェリンなどが含まれる
(Maecker, H.T. 他 (1997) FASEB J. 11:428-442.)。

【０００６】 基質タンパク質（ＭＰ：matrix protein）は、膜貫通タンパク質や細胞外タン
パク質であり、組織の形成及び成長、再造形、維持をする。また、炎症応答の重
要な介在物質であり制御因子でもある。ＭＰの発現とバランスは、先天的または
後成的疾患、感染症による生化学的な変化によって撹乱され得る。更に、ＭＰは
、免疫応答における白血球の移動及び増殖、分化、活性化に影響を及ぼす。ＭＰ
は、コラーゲン様ドメイン及びＥＧＦ様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、
フィブロネクチン様ドメインを含み得る１つ以上のドメインを有するという特徴
をもつ場合が多い。更に、ＭＰは、重度にグリコシル化されている。ＭＰには、
フィブロネクチンやコラーゲン、galectinなどの細胞外タンパク質と、細胞接着
分子（ＣＡＭ）及びカドヘリン、インテグリンなどの細胞接着受容体とが含まれ
る。(Ayad, S. 他 (1994) The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Pr
ess, San Diego, CA, pp. 2-16; Ruoslahti, E. (1997) Kidney Int. 51:1413-1
417; Sjaastad. M.D. and Nelson, W.J. (1997) BioEssays 19:47-55.を参照)。

【０００７】 レクチンは、別々のモジュラー糖認識ドメイン、ＣＲＤによって糖を細胞膜に
結合するという特徴をもつタンパク質である(Kishore, U. 他 (1997) Matrix Bi
ol. 15:583-592.)。ある種のサイトカイン及び膜貫通タンパク質は、細胞外リガ
ンドや細胞内リガンドとの相互作用、或いは分泌経路のタンパク質との相互作用
、シグナル伝達経路の分子との相互作用を促進し得るＣＲＤを有する。リポカリ
ンスーパーファミリーは、様々な生理的に重要なリガンドに結合して輸送する４
０以上のタンパク質からなる系統的に保存されたグループを構成する。(Tanaka,
T. 他 (1997) J. Biol. Chem.272:15789-15795; 及び van't Hof, W. 他 (1997
) J. Biol. Chem. 272:1837-1841.)セレクチンは、炎症を起こしている血管内皮
及びある種の白血球の表面に発現するカルシウムイオン依存性レクチンのファミ
リーである(Rossiter. H. 他 (1997) Mol. Med. Today 3:214-222.)。

【０００８】 プロテインキナーゼは、リン酸基をタンパク質に付加することで多種多様な細
胞増殖及び分化、情報伝達プロセスを調整する。可逆的なタンパク質のリン酸化
が、真核細胞におけるタンパク質の機能的な活性を調節する重要な手段である。
活性化を起こす高エネルギーのリン酸は通常、プロテインキナーゼによってアデ
ノシン三リン酸分子（ＡＴＰ）から特定のタンパク質に移送され、プロテインホ
スファターゼによってタンパク質から取り除かれる。リン酸化は、細胞外シグナ
ル及び細胞周期チェックポイント、環境または栄養ストレスに応答して起こる。
プロテインキナーゼは、チロシン残基をリン酸化するチロシンキナーゼ（ＰＴＫ
）と、セリンまたはスレオニン残基をリン酸化するセリンスレオニンキナーゼ（
ＳＴＫ）の２つのグループに大別できる。僅かであるが、プロテインキナーゼの
中には２つの特異性をもつものもある。キナーゼの殆どは、類似の２００〜３０
０個のアミノ酸触媒ドメインを含む(Hardie, G.及び Hanks, S. (1995) The Pro
tein Kinase Facts Book, Vol I, pp. 7-47, Academic Press, San Diego, CA.)
。

【０００９】 プロテインホスファターゼは、プロテインキナーゼによって修飾された分子か
らリン酸基を取り除くことで、細胞情報伝達及び細胞増殖、分化、接触、発癌に
関与する。タンパク質のリン酸化は、真核生物におけるタンパク質の機能的な活
性を調節する重要な手段である。高エネルギーのリン酸は、プロテインキナーゼ
によってＡＴＰからタンパク質に転移され、プロテインホスファターゼによって
取り除かれる。プロテインホスファターゼ（ＰＰ）及びチロシンホスファターゼ
（ＰＴＰ）、酸性／アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の進化的に異なった３つの
プロテインホスファターゼ遺伝子ファミリーに分けられる。ＰＰは、ホスホセリ
ン／スレオニン残基を脱リン酸し、細胞におけるｃＡＭＰによって媒介される多
くのホルモン応答の重要な制御因子である。ＰＴＰは、チロシンキナーゼの効果
を逆転させ、細胞周期及び細胞情報伝達プロセスにおいて重要な役割を果たして
いる。ＡＰはin vitroで基質を脱リン酸するが、in vivoでの機能はあまり知ら
れていない。(Charbonneau, H. 及び Tonks, N.K. (1992) Annu. Rev. Cell Bio
l. 8:463-493.)。

【００１０】 サイクリックヌクレオチド（ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ）は、細胞内のセカンドメ
ッセンジャーとして機能し、ホルモンや光、神経伝達物質を含む様々な細胞の外
からのシグナルを伝達する。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（
ＰＤＥ）は、サイクリックヌクレオチドを対応する一リン酸塩に分解して、細胞
内のサイクリックヌクレオチドの濃度及びシグナル伝達の効果を調節する。少な
くとも７つの哺乳類ＰＤＥのファミリーが、基質特異性及び親和性、補助因子に
対する感受性、阻害剤に対する感受性に基づいて同定された。(Beavo. J.A. (19
95) Physiological Reviews 75: 725-748.)。

【００１１】 ホスホリパーゼ（ＰＬ）は、ホスホグリセリドから脂肪酸残基の除去を触媒す
る酵素である。ＰＬは、膜貫通シグナル伝達に重要な役割を果たし、加水分解さ
れるホスホグリセリドの特異的なエステル結合によって、それぞれＰＬＡ₁、Ｐ
ＬＡ₂、ＰＬＣ、ＰＬＤと名付けられた。ＰＬＡ₂は、アラキドン酸を生じる膜リ
ン脂質のグリセリン成分の位置２でエステル結合を切断する。アラキドン酸は、
エイコサノイドの４つの主要なクラス（プロスタグランジン及びプロスタサイク
リン、トロンボキサン、ロイコトリエン）の共通の前駆体である。エイコサノイ
ドは、平滑筋の収縮、血小板の凝集、痛み及び炎症応答に関与する情報伝達分子
である(Alberts, B. 他 (1994) Molecular Biology of The Cell, Garland Publ
ishing, Inc., New York, NY, pp. 85. 211, 239-240, 642-645.)。

【００１２】 ヌクレオチドシクラーゼ、即ちアデニル酸シクラーゼ及びグアニル酸シクラー
ゼは、ＡＴＰ及びＧＴＰからサイクリックヌクレオチドであるｃＡＭＰ及びｃＧ
ＭＰそれぞれへの合成を触媒する。これらは、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを分解する
ホスホジエステラーゼと共同して、これらの分子の細胞レベル及びそれらの機能
を調節する。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは、ホルモンや光、神経伝達物質などの様々
な細胞の外からのシグナルを伝達する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能
する(Stryer, L. (1988) Biochemistry W.H. Freeman and Co., New York, pp.
975-980, 1029-1035.)。

【００１３】 サイトカインは細胞の動揺に応答して産生される。あるサイトカインは前駆体
の形で産生され、あるサイトカインは活性化するべく多量体を形成する。サイト
カインは、特定の刺激や疾患に特有の形でグループで産生され、グループのメン
バーが互いに或いは別の分子と相互作用して、全体として生物学的な応答をする
。インターロイキン及びニューロトロフィン、インターフェロン、成長因子、ケ
モカインは全てサイトカインのファミリーであり、細胞受容体と共同して働いて
細胞増殖及び分化を調節し、白血球の移動及び機能、造血性細胞増殖、温度調節
、感染に対する急性応答、組織再生、アポトーシス、細胞の生存などの活性に影
響を与える。特定のサイトカインの活性を変える抗体や他の薬剤を用いた研究に
よって、病理学及び生理学における個々のサイトカインの役割が解明されてきた
。

【００１４】 特に、ケモカインは、炎症、白血球の増殖及び移動、血管形成及び毛細血管形
成、造血の調節、ＨＩＶ感染、サイトカインの分泌の刺激に関与する小さな化学
誘引物質サイトカインである。ケモカインは通常、７０〜１００個のアミノ酸を
含み、保存されたシステイン系のモチーフの存在によって４つのサブファミリー
に細分される(Callard, R. 及び Gearing, A. (1994) The Cytokine Facts Book
. Academic Press, New York, NY, pp. 181-190, 210-213, 223-227.)。

【００１５】 成長及び分化因子は分泌タンパク質であり、細胞内伝達において機能する。あ
る因子は、活性化するためにオリゴマー形成したりＭＰと結合する必要がある。
これらの因子とそれらの受容体の間の複合体の相互作用によって、細胞分裂及び
細胞分化、細胞のシグナル伝達、細胞の運動性を刺激したり阻害する細胞内シグ
ナル伝達経路が形成される。多くの成長及び分化因子は、それらの局所的な環境
において細胞に作用する（パラ分泌シグナル伝達）。成長及び分化因子は、３つ
のクラスに大別できる。第１のクラスには、上皮細胞成長因子、腺維芽細胞成長
因子、トランスフォーミング成長因子、インシュリン様成長因子、血小板由来成
長因子などの大ペプチド成長因子が含まれる。第２のクラスには、コロニー刺激
因子（ＣＳＦ）などの造血成長因子が含まれる。造血成長因子は、Ｂリンパ球、
Ｔリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、肝
細胞前駆体などの血球の増殖及び分化を刺激する。第３のクラスには、増殖以外
の細胞機能を調節するホルモンとして機能するボンベシン及びバソプレシン、オ
キシトシン、エンドセリン、トランスフェリン、アンジオテンシンII、血管作用
性小腸ペプチド、ブラジキニンなどの小ペプチド因子が含まれる。

【００１６】 成長及び分化因子は、in vitroでの細胞の腫瘍性形質転換及びin vivoでの腫
瘍の進行に極めて重要な役割を果たす。腫瘍細胞による成長因子の不適当な発現
は、黒色性腫瘍の血管新生及び転移につながる可能性がある。血球新生中の成長
因子の調節不良は、貧血及び白血病、リンパ腫を引き起こし得る。インターフェ
ロンなどのある成長因子は、in vitro及びin vivoの両方で腫瘍細胞に対して細
胞障害性である。更に、ある成長因子及び成長因子受容体は、構造的及び機能的
に腫瘍性タンパク質に関連する。更に、成長因子は、プロトオンコジーン及び腫
瘍抑制遺伝子の両方の転写調節に影響を与える(Pimentel, E. (1994) Handbook
of Growth Factors, CRC Press, Ann Arbor, MI, pp. 1-9.を参照)。

【００１７】 タンパク質分解酵素即ちプロテアーゼが、ペプチド結合を加水分解してタンパ
ク質を活性化或いは不活化する。サイトゾル及び膜結合区画、細胞外の部分にプ
ロテアーゼが存在する。主要なファミリーには、亜鉛プロテアーゼ（zinc prote
ase）及びセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、チオールプロテアー
ゼ、カルボキシルプロテアーゼ（carboxyl protease）がある。

【００１８】 亜鉛プロテアーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼは活性部位に結合した亜鉛
イオンを有する。これらのプロテアーゼは、芳香族またはかさ高い脂肪族の側鎖
を含むＣ末端残基を認識して、そのＣ末端残基に隣接するペプチド結合を加水分
解する。セリンプロテアーゼは活性化部位セリン残基を有し、トリプシンやキモ
トリプシンなどの消化酵素と、補体及び血液凝固カスケードの成分と、細胞外マ
トリックス分子（ＥＣＭ）の分解及び代謝回転を調節する酵素と含む。システイ
ンプロテアーゼ（例えば、カテプシン）は、単球、マクロファージ、及び他の免
疫細胞によって産生され、前駆体タンパク質のプロセッシングから細胞内分解ま
での多様な細胞プロセスに関与する。これらの酵素の過剰産生は、リウマチ様関
節炎及び喘息に関連した組織破壊を引き起こす恐れがある。チオールプロテアー
ゼ、例えばアパインは活性部位システインを含み、組織内に広く分布する。カル
ボキシルプロテアーゼ、例えばペプシンは酸性（ｐＨ２〜３）の下でのみ活性で
ある。

【００１９】 グアノシン三リン酸結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、ヘテロ三量体Ｇタン
パク質と低分子量Ｇタンパク質の２つ主用なクラスに分類できる。ヘテロ三量体
Ｇタンパク質は、ホルモンや成長因子、神経調節物質、他のシグナル伝達分子に
応答するＧＰＣＲと相互作用する。ＧＰＣＲとＧタンパク質の相互作用によって
、Ｇタンパク質のＧＴＰとグアノシンニリン酸（ＧＤＰ）が交換される。この交
換によって、Ｇタンパク質が活性化されて受容体から解離し、アデニル酸シクラ
ーゼまたはグアニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、イオンチャンネルなどの
同族のセカンドメッセンジャー産生タンパク質と相互作用する。Ｇタンパク質の
ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解はスイッチのオン−オフ動作として働き、Ｇタン
パク質の動作を終わらせ、別の受容体分子と相互作用するように準備して、別の
シグナル伝達を開始する。

【００２０】 低分子量Ｇタンパク質は、２１〜３０キロドルトンの１つのポリペプチドから
なり、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｎ、Ｒａｂ及びＡＤＰリボシル化因子の５つのサブ
ファミリーに分類できる。これらのタンパク質は、細胞増殖及び細胞周期、タン
パク質の分泌、細胞内小胞の相互作用を調節する。詳しくは、Ｒａｓタンパク質
は、細胞増殖及び分化を調節する受容体チロシンキナーゼからセリン／スレオニ
ンキナーゼへのシグナル伝達に必須である。結合してもＧＴＰを加水分解しない
変異Ｒａｓタンパク質は常に活性化状態であり、絶え間ない細胞増殖或いは癌を
引き起こす。５つのサブファミリーの全てが、共通の構造的特徴と４つの保存さ
れたモチーフとを有する。殆どの膜結合Ｇタンパク質には、膜との会合及び生物
活性のために翻訳後に付加されるカルボキシル末端イソプレニル基（ＣＡＡＸ）
が必要である。Ｇタンパク質はまた、モチーフIとモチーフIIとの間にある可変
エフェクター領域を有する。この領域は、グアニンヌクレオチド交換因子または
ＧＴＰ加水分解酵素作動性タンパク質の相互作用部位である。

【００２１】 真核細胞は膜によって囲まれ、各膜結合区画に分かれている。多くのイオンや
極性分子は膜を透過できないため、これらの分子の輸送は、イオンチャンネルや
イオンポンプ、輸送タンパク質、ポンプによって仲介される。共輸送体及び対向
輸送体は、膜を通してアミノ酸やグルコース、薬剤などの小分子及びイオンを輸
送してサイトゾル内のｐＨを調節する。共輸送体は小分子やイオンを同じ方向に
輸送し、対向輸送体は逆方向に輸送する。共輸送体のスーパーファミリーには、
複数の薬剤耐性及びクラスI ＭＨＣ分子と抗原ペプチドの結合に関与する促通輸
送体及び活性状態のＡＴＰ結合カセット輸送体が含まれる。これらの輸送体は、
膜を透過してイオンや分子を輸送するために、特定のイオンまたは他の分子に結
合して構造的に変化する。輸送は、濃度依存性機構で受動的に、或いはＡＴＰ加
水分解またはイオン勾配などのエネルギー源に結合することでなされ得る。

【００２２】 イオンチャンネル及びイオンポンプ、輸送タンパク質は、細胞膜を透過する分
子の輸送を仲介する。共輸送体及び対向輸送体は、アミノ酸やグルコース、薬剤
などの小分子及びイオンを輸送してサイトゾル内のｐＨを調節する。共輸送体は
小分子やイオンを一方向に輸送するが、対向輸送体は両方向に輸送する。共輸送
体のスーパーファミリーには、複数の薬剤耐性及びクラスI ＭＨＣ分子と抗原ペ
プチドの結合に関与する促通輸送体及び活性状態のＡＴＰ結合カセット輸送体が
含まれる。これらの輸送体は、膜を透過してイオンや分子を輸送するために、特
定のイオンまたは他の分子に結合して構造的に変化する。輸送は、濃度依存性機
構で受動的に行われ得るし、また、ＡＴＰ加水分解などのエネルギー源に結合す
ることでもなされ得る(Alberts, B. 他 (1994) Molecular Biology of The Cell
, Garland Publishing, New York, NY, pp. 523-546.を参照)。

【００２３】 イオンチャンネルは膜を貫通して存在し、Ｎａ⁺及びＫ⁺、Ｃａ²⁺、Ｃｌ^-など
のイオンや水が透過する経路を形成する膜タンパク質である。例えば、塩素イオ
ンチャンネルは、膜を通るイオンの吸収や分泌をはじめ、膜電位の調節に関与す
る。塩素イオンチャンネルはまた、膜結合細胞小器官の内部ｐＨの調節も行う。

【００２４】 イオンポンプは、膜の電位勾配を能動的に維持するＡＴＰ分解酵素である。イ
オンポンプは、その構造及び機能によってＰまたはＶ、Ｆにクラス分けされる。
全てのクラスは、サイトゾルドメインに１つ以上のＡＴＰ結合部位を有する。Ｐ
クラスのイオンポンプは、Ｃａ²⁺ＡＴＰ分解酵素及びＮａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰ分解酵素
を含み、Ｈ⁺及びＮａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺イオンの輸送機能をもつ。Ｐクラスのイオ
ンポンプは、２つのα膜貫通サブユニットと２つのβ膜貫通サブユニットとから
なる。Ｖクラス及びＦクラスイオンポンプも類似の構造をもつが、Ｈ⁺のみ輸送
する。ＦクラスＨ⁺イオンポンプは、ミトコンドリア及び葉緑体の膜を通る輸送
を仲介する。一方、ＶクラスＨ⁺イオンポンプは、リソソーム及びエンドソーム
、植物液胞の内部の酸性度を調節する。

【００２５】 促通グルコース輸送体として知られ、内在性膜タンパク質に構造的に関連する
１つのファミリーは、細胞膜を通るグルコース及び他の選択された糖の運動を触
媒する。このファミリーのタンパク質は、１２個のαへリックスからなる高度に
保存された大きな膜貫通ドメインと、軽度に保存された幾つかの細胞質内ドメイ
ン及び細胞質外ドメインとを含む(Pessin, J. E., 及び Bell, G.I. (1992) Ann
u. Rev. Physiol. 54:911-930)。

【００２６】 アミノ酸の輸送は、Ｎａ⁺依存性アミノ酸輸送体によって仲介される。これら
の輸送体は、胃腸の食事の取込み及び腎臓の細胞性アミノ酸の取込み、神経の神
経伝達物質の再取込みに関与する。陽イオン性のアミノ酸の輸送は、系y＋ファ
ミリー（system y+ family）及び陽イオンアミノ酸輸送体（ＣＡＴ）ファミリー
によって仲介される。ＣＡＴファミリーのメンバーは高度の配列相同性を有し、
それぞれは１２〜１４の推定上の膜貫通ドメインを含む(Ito, K. 及び Groudine
, M. (1997) J. Biol. Chem. 272 :26780-26786)。

【００２７】 プロトンが結合したＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２などの１２膜貫通ドメイン輸送
体は、駆動力として電気化学的なＨ⁺勾配を用いた胃腸の吸収及び腎臓のペプチ
ド再吸収に関与している。ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２からなるヘテロ二量体ペプ
チド輸送体は、抗原プロセッシングに関係する。ペプチド抗原は、小胞体の膜を
通して輸送され、ＭＨＣクラスI分子に提示され得る。それぞれのＴＡＰタンパ
ク質は、多数の疎水性膜貫通分画及び高度に保存されたＡＴＰ結合カセットから
なる(Boll, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.93 :284-289.) ホルモンは、循環して標的細胞の表面或いは内部の受容体に特異的に結合する
分泌分子である。ホルモンは多様な生物化学的組成及び作動機構を有するが、２
つにグループに分類できる。第１のグループは、標的細胞の細胞膜を通って散在
し、サイトゾルまたは核の受容体と結合して遺伝子発現を変える複合体を形成す
る親油性の小ホルモンからなる。これらのホルモンには、プロゲステロン及びエ
ストロゲン、テストステロン、コルチゾル、アルドステロンなどのコレステロー
ル由来のステロイドホルモン、レチノイン酸、チロキシンが含まれる。第２のグ
ループは、細胞膜を通してシグナルを伝達する細胞表面受容体と結合することで
機能する親水性ホルモンからなる。このようなホルモンには、グルカゴン及びイ
ンシュリン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、副腎皮質刺激ホルモ
ン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、バソプレシン
などのペプチドホルモン及びカテコールアミンなどのアミノ酸誘導体が含まれる
(例えば、Lodish 他 (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Bo
oks Inc., New York, NY, pp. 856-864.を参照)。

【００２８】 神経ペプチド及び血管介在物質（vasomediator）(ＮＰ／ＶＭ)は、内在性シグ
ナル伝達分子の大きなファミリーを構成する。このファミリーには、ボンベシン
、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、ニューロメディンＮ、メラノコルチン、
オピオイド、ガラニン、ソマトスタチン、タキキニン、平滑筋刺激に関与するウ
ロテンシンII及び関連ペプチド、バソプレシン、血管作用性小腸ペプチドなどの
神経ペプチドホルモン及び神経ペプチドと、アンジオテンシンや補体、カルシト
ニン、エンドセリン、ホルミル−メチオニルペプチド、グルカゴン、コレシスト
キニン、ガストリンなどの循環系由来のシグナル伝達分子とが含まれる。ＮＰ／
ＶＭは直接シグナルを伝達して、他の神経伝達物質及びホルモンの解離や活性を
調節でき、カスケードにおける触媒酵素として作用する。ＮＰ／ＶＭの効果時間
は、極端に短いものから長く続くものもまで幅広い(Martin, C. R. 他 (1985) E
ndocrine Physiology, Oxford University Press, New York, NY, pp. 57-62.を
参照) 調節分子は、細胞や生物の多様な誘導機構に応答して、個別の遺伝子或いは遺
伝子のグループのスイッチを入れたり切ったりする。即ち、転写の開始や促進、
抑圧を決定して転写因子として作用したり、特定の細胞や組織において指令され
た通りに転写物のスプライシングをする。また、調節分子は、ゲノム全体に散在
するＤＮＡの短い配列と相互作用するが、殆どの遺伝子発現は、転写が開始され
る部位の近く或いは発現する遺伝子のオープンリーディングフレームの内部で調
節される。多くの転写因子は、ＤＮＡ結合構造モチーフのセットの１つを含み、
それぞれがαへリックスかβシートのどちらかを有してＤＮＡの主溝に結合する
(Pabo, CO. 及び R.T. Sauer (1992) Ann. Rev. Biochem. 61 1053-95.)。転写
因子の他のドメインはＤＮＡとの重要な接触を形成する。更に、アクセサリータ
ンパク質（accessory protein）によって、特定のタンパク質複合体を活性化因
子やリプレッサーに変えたり結合を阻害する重要な相互作用が起こり得る(Alber
ts, B. 他 (1994) Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Co, N
ew York, NY pp. 401-474.) 新規のヒトシグナルペプチド含有タンパク質及びそれらをコードするポリヌク
レオチドの発見により、癌を含む細胞増殖異常、炎症、心血管疾患及び神経疾患
、生殖異常、発生障害の診断及び治療、予防に有用な新規の組成物を提供するこ
とで当分野のニーズに答えることができる。

【００２９】 発明の要約 本発明は、個別にはそれぞれ「HSPP−1」、「HSPP−2」〜「HSPP−134」であ
り、総称して「HSPP」と呼ぶシグナルペプチド含有タンパク質である実質的に精
製されたポリペプチドを提供する。本発明の一実施態様では、SEQ ID NO:1−134
及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製
されたポリペプチドを提供する。

【００３０】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的
に精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−134及びそれらの
断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単
離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID
NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上のポリヌクレ
オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供
する。

【００３１】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条
件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、SEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチドとを提供する。

【００３２】 本発明はまた、SEQ ID NO:135−268及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供す
る。また、本発明は、SEQ ID NO:135−268及びそれらの断片からなる一群から選
択されたポリヌクレオチド配列と９０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有
する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、
SEQ ID NO:135−268及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポ
リヌクレオチドを提供する。

【００３３】 本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのサンプルのポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する
過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そ
のハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの
存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイ
ブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。

【００３４】 本発明は更に、SEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも
１つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発現ベクターは
宿主細胞内に含まれる 本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現
ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からその
ポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。

【００３５】 本発明はまた、SEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に提供する。

【００３６】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポ
リペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストとを提供する。

【００３７】 本発明はまた、HSPPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者にSEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好
適な医薬用担体と共に効果的な量投与することを含む、HSPPの発現または活性の
低下に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。

【００３８】 本発明はまた、HSPPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者にSEQ ID NO:1−134及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与すること
を含む、HSPPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法を提
供する。

【００３９】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。

【００４０】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００４１】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。

【００４２】 定義 本明細書において「HSPP」とは、天然、合成、半合成或いは組換え体など全て
の種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳動
物）から得られる実質的に精製されたHSPPのアミノ酸配列のことである。

【００４３】 本明細書において「アゴニスト」とは、HSPPと結合したとき、HSPPの効果を増
大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。このアゴニストには
、HSPPに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の分子
を含み得る。

【００４４】 本明細書において、「アレル変異配列」とは、HSPPをコードする遺伝子の別の
形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって
生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変
わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝子
には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般に
アレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換
による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内
で一回或いはそれ以上生じる。

【００４５】 本明細書において、HSPPをコードする「変異」核酸配列とは、様々なヌクレオ
チドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、HSPPと同じポヌクレオチド或いは
HSPPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドのことである。この定義
には、HSPPをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座ではな
い位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及び
HSPPをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質
も変異され得り、サイレント変化を生じHSPPと機能的に等価となるアミノ酸残基
の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或い
は免疫学的にHSPPの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水
性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。た
とえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得
り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得り、そして近い
親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、
バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン
、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００４６】 本明細書において「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド
、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の分
子または合成された分子である。HSPPの断片である「断片」及び「免疫原性断片
」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も
好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、HSPPのある生物学的活性または免疫学
的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミ
ノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。

【００４７】 本明細書において用語「増幅」とは、核酸配列の付加的な複製を生成すること
に関連する。一般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
技術を用いて行われる(例えば、Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) P
CR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY,
pp. 1-5.を参照)。

【００４８】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、HSPPと結合したとき、HSPPの生
物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮す
る分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはHSPPの
効果を減少させるの他の分子である。

【００４９】 本明細書において「抗体」とは、Ｆab及びＦ(ab')₂、及びそれらの断片、Ｆｖ
断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。HSPPポリペプチド
と結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小ペプチドを含む無傷の分子またはそ
の断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサ
ギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡ
の翻訳から引き出されたり化学的に合成され得り、必要に応じて担体プロテイン
と結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担
体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペットヘモニア
ン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する
。

【００５０】 本明細書において「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグメ
ント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動
物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定
基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の
産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免
疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。

【００５１】 本明細書において「アンチセンス」とは、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的
な核酸配列を含む全ての組成物である。アンチセンス分子は、合成や転写を含む
任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻
訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プラ
ス（＋）」という表現はセンス鎖と言える。

【００５２】 本明細書において「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、或
いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活性
」とは、天然或いは組換え体のHSPP、合成のHSPPまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力のことである。

【００５３】 本明細書において「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の温
度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することで
ある。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。
２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、
或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。
核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並
びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。

【００５４】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定
のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いは
アミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤或
いは水溶液、無菌組成物を含み得る。HSPP若しくはHSPPの断片をコードするポリ
ヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用
され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化
剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例え
ば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例えば、デ
ンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開され得る。

【００５５】 本明細書において「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために再
配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^TM（Perkinn Elmer, Norwalk, CT）
を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或いは
GELVIEW Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの
構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン社
の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によって
コンセンサス配列に構築されるものもある。

【００５６】 本明細書において「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン分析によるHSPPをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、サ
ンプル内のHSPPをコードする核酸の存在を示すことから、HSPPをコードするポリ
ヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを意味する。

【００５７】 本明細書において「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が
欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００５８】 本明細書において「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、
アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌ
クレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少な
くとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もと
のポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する
、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによ
って修飾されたものである。

【００５９】 本明細書において「類似性」とは、相補性の程度を表すものである。これには
、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも
言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも
部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全
に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低
下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或い
はノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査さ
れる。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を
低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合し
て抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合
が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条
件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性と
もいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用い
て、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在し
ない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイ
ブリダイゼーションしない。

【００６０】 本明細書において「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ
酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。こ
の百分率同一性は、例えば、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Inc., Madison Wl)
など電子装置を用いて決定可能である。このMEGALIGNプログラムは、様々な方法
、例えば、クラスター方法 (例えば、Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gen
e73:237-244.を参照)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すこ
とが可能である。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配
列を各クラスターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次
ぎにグループに分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配
列Ａと配列Ｂの百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配
列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引い
たもので除し、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配
列間の低い類似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれ
ない。核酸配列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法など
の当分野で周知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(
例えば、Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同
一性はまた、例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で周
知の別の方法によって決定することも可能である。

【００６１】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み
得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微
小染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参照）
。

【００６２】 本明細書において「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒト
の抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子で
ある。

【００６３】 本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な
一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００６４】 本明細書において「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間
の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである
。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ₀ｔまたはＲ₀ｔ分析）で
形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜
、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸
を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成さ
れ得る。

【００６５】 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対し
て、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸
配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００６６】 本明細書において「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症
、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に
影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子
の発現によって特徴づけられ得る。

【００６７】 本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌ
クレオチドのアレイのことである。

【００６８】 本明細書のマイクロアレイの記述における「要素」或いは「アレイ要素」とは
、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのこ
とである。

【００６９】 本明細書において「変調」とは、HSPPの活性の変化のことである。変調の例と
して、HSPPのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物学的
特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００７０】 本明細書において「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若し
くは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤ
ＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ
様物質も指す。本明細書において「断片（またはフラグメント）」とは、（例え
ば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）SEQ ID NO:135−268を特別に同
定する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列のことである。例えば
、SEQ ID NO:135−268は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、
更に、関連ポリヌクレオチド配列からSEQ ID NO:135−268を区別する類似性の検
査にも有用である。SEQ ID NO:135−268の断片は、少なくともヌクレオチド１５
〜２０個の長さである。この断片に対応するSEQ ID NO:135−268の正確な長さ及
びSEQ ID NO:135−268の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一般的な技
術の１つを用いて日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場合、完全
長のポリペプチドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位な
どの構造的ドメイン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。

【００７１】 本明細書において「機能的に関係した」或いは「機能的に結合した」とは、機
能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロ
モータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する
或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は
近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝
子要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリ
ペプチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。

【００７２】 本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼ
ーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さ
は少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５か
ら３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチド
である。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義
される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じで
ある。

【００７３】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるア
ミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さの
オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この
末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖
ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコー
ル化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993) An
ticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。

【００７４】 本明細書において「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。HS
PPをコードする核酸若しくはその断片、HSPP自体を含むと推測される生物学的サ
ンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小
器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。

【００７５】 本明細書において「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク
質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用の
ことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原
決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右され
る。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していな
い標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペ
プチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と
結合する標識Ａの量が減少する。

【００７６】 本明細書において「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載され
たポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条
件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野
で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルム
アミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳
密性を高めることができる。

【００７７】 本明細書において「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれて
から、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合
している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは
約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。

【００７８】 本明細書において「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそ
れぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００７９】 本明細書において「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ
、ファイバー、磁気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微
細粒子、毛管を含む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポ
リヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャンネル、孔など
の様々な表面形態を有する。

【００８０】 本明細書において「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化
させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、
自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の
中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この
形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この
方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェク
ション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換さ
れた」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは
宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる
。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細
胞も含まれる。

【００８１】 本明細書において「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置
換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が
含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「
非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿
入、或いはその両方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TMソ
フトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミ
ノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００８２】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、HSPPに関連
したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、「ス
プライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ変異
配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング
中のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなっ
たり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わった
り、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオ
チド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。
多形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列に
おける変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基
が異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は
、例えば、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。

【００８３】 発明 本発明は、新規のヒトシグナルペプチド含有タンパク質(HSPP)、及びHSPPをコ
ードするポリヌクレオチドの発見に基づき、癌を含む細胞増殖、炎症、心血管疾
患、神経疾患、生殖障害、発生障害の診断及び治療、予防におけるこれらの組成
物の使用法に関する。

【００８４】 表１は、HSPPをコードする完全長のヌクレオチド配列を得るために用いたイン
サイト社クローンのリストである。列１及び列２は、アミノ酸及び核酸の配列番
号（SEQ ID NO）をそれぞれ示す。列３は、それぞれのHSPPをコードする核酸が
同定されたインサイト社クローンのクローンＩＤを示し、列４は、これらのクロ
ーンを単離したｃＤＮＡライブラリを示す。列５は、インサイト社クローン、そ
れぞれに対応するｃＤＮＡライブラリ、及びショットガン配列を示す。これらの
クローン及びショットガン配列は、各HSPPのコンセンサスヌクレオチド配列の一
部であり、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用である。

【００８５】 表６は、表１のｃＤＮＡ断片に対応するHSPPの完全長のヌクレオチド配列の領
域を示す。列１はヌクレオチドの配列番号を示し、列２は各HSPPをコードする核
酸が同定されたインサイト社クローンのクローンＩＤを示す。列３は、各HSPPの
コンセンサスヌクレオチド配列の一部であインサイトクローン及びショットガン
配列を示し、ハイブリダイゼーションのプローブとして有用である。列４は及び
列５はそれぞれ、ｃＤＮＡ断片に対応する完全長のHSPPの領域のヌクレオチドの
開始位置及び終了位置を示している。

【００８６】 表２の各列は、本発明のポリペプチドの様々な特性を示す。列１はアミノ酸の
配列番号(SEQ ID NO)、列２はそれぞれのポリペプチドのアミノ酸残基の数、列
３は潜在リン酸化部位、列４は潜在グリコシル化部位、列５はサイン配列及びモ
チーフを含むアミノ酸残基、列６は各タンパク質の相同配列、列７はシグナルペ
プチド含有タンパク質として各HSPPを同定するために用いた分析方法をそれぞれ
示す。列５において、各欄の１行目は、予想されるシグナルペプチド配列を含む
アミノ酸残基を示す。追加の識別モチーフやサイン（signature）も列５の中に
示した。注目すべきは、SEQ ID NO:126におけるグリコシル化水分解酵素ファミ
リー９活性部位サインと、SEQ ID NO:127におけるリボソームタンパク質Ｓ１８
サインと、SEQ ID NO:132におけるアドレノドキシンファミリー鉄―硫黄結合領
域サイン及びチトクロムｃファミリーヘム結合部位サインと、SEQ ID NO:96にお
けるウロテンシンIIサイン配列とである。

【００８７】 ＢＬＡＳＴを用いて、SEQ ID NO:68（HSPP−68）がTWIK関連酸感受性Ｋ⁺チャ
ンネルと同定され、SEQ ID NO:92（HSPP−92）がチロシン特異的プロテインホス
ファターゼと同定された。SEQ ID NO:92（HSPP−92）の概ねV328からF340まで（
C330における推定上の活性部位システイン残基を含む）のチロシン特異的プロテ
インホスファターゼサインは、ＢＬＯＣＫＳ及びＰＲＩＮＴＳを用いて同定され
た。注目すべきは、ＢＬＡＳＴによってSEQ ID NO:66（HSPP−66）がステロイド
結合タンパク質と同定されたことである。

【００８８】 表３の各列は、HSPPをコードするヌクレオチド配列の組織特異性及びそれに関
連する疾患及び異常、症状を示す。表３の第１の列はヌクレオチドの配列ＩＤ番
号を示す。第２の列は、HSPPを発現する組織の分類区分を示し、全組織の分類区
分の一部である。第３の列は、HSPPを発現する組織と関連する疾患、異常症、病
態を示す。第４の列はｃＤＮＡライブラリのサブクローニングに用いたベクター
を示す。注目すべきは、肺組織におけるSEQ ID NO:200及びSEQ ID NO:203、SEQ
ID NO:225の発現、癌組織におけるSEQ ID NO:223の発現、生殖組織におけるSEQ
ID NO:212及びSEQ ID NO:216、SEQ ID NO:220の発現、胃腸組織、特に小腸また
は回腸におけるSEQ ID NO:232の発現（１６のcDNAライブラリの内の１５（93.8%
））、癌組織及び増殖組織におけるSEQ ID NO:224の発現である。また、SEQ ID
NO:252及びSEQ ID NO:257の組織特異的発現にも注目されたい。SEQ ID NO:252は
、卵巣腫瘍ｃＤＮＡライブラリのOVARTUT01由来であり、生殖腫瘍組織にのみ発
現した。SEQ ID NO:257は、5-aza-2'-デオキシシチジン処理ヒト前単球ｃＤＮＡ
ライブラリのTHP1AZT01由来であり、造血組織にのみ発現した。

【００８９】 HSPPをコードするヌクレオチド配列の以下に示す断片は、SEQ ID NO:135−268
を同定し、SEQ ID NO:135−268と関連ポリヌクレオチド配列とを区別するハイブ
リダイゼーションまたは増幅技術に有用である。有用な断片は、SEQ ID NO:230
の概ねヌクレオチド75から104までの断片と、SEQ ID NO:231の概ねヌクレオチド
210から239までの断片と、SEQ ID NO:232の概ねヌクレオチド157から186までの
断片と、SEQ ID NO:233の概ねヌクレオチド268から297までの断片と、SEQ ID NO
:234の概ねヌクレオチド160から186までの断片と、SEQ ID NO:235の概ねヌクレ
オチド201から230までの断片と、SEQ ID NO:236の概ねヌクレオチド165から194
までの断片と、SEQ ID NO:237の概ねヌクレオチド366から395までの断片と、SEQ
ID NO:238の概ねヌクレオチド714から743までの断片と、SEQ ID NO:239の概ね
ヌクレオチド1731から1760までの断片と、SEQ ID NO:240の概ねヌクレオチド419
から448までの断片と、SEQ ID NO:241の概ねヌクレオチド494から523までの断片
と、SEQ ID NO:242の概ねヌクレオチド100から129までの断片と、SEQ ID NO:243
の概ねヌクレオチド104から133までの断片と、SEQ ID NO:244の概ねヌクレオチ
ド136から165までの断片と、SEQ ID NO:245の概ねヌクレオチド140から169まで
の断片と、SEQ ID NO:246の概ねヌクレオチド125から154までの断片と、SEQ ID
NO:247の概ねヌクレオチド687から758までの断片と、SEQ ID NO:248の概ねヌク
レオチド327から398までの断片と、SEQ ID NO:249の概ねヌクレオチド741から78
5までの断片と、SEQ ID NO:250の概ねヌクレオチド184から255までの断片と、SE
Q ID NO:251の概ねヌクレオチド165から242までの断片と、SEQ ID NO:252の概ね
ヌクレオチド271から342までの断片と、SEQ ID NO:253の概ねヌクレオチド1081
から1152までの断片と、SEQ ID NO:254の概ねヌクレオチド781から852までの断
片と、SEQ ID NO:255の概ねヌクレオチド620から691までの断片と、SEQ ID NO:2
56の概ねヌクレオチド872から916までの断片と、SEQ ID NO:257の概ねヌクレオ
チド242から313までの断片と、SEQ ID NO:258の概ねヌクレオチド595から648ま
での断片と、SEQ ID NO:259の概ねヌクレオチド163から216までの断片と、SEQ I
D NO:260の概ねヌクレオチド244から315までの断片と、SEQ ID NO:261の概ねヌ
クレオチド75から128までの断片と、SEQ ID NO:262の概ねヌクレオチド650から7
03までの断片と、SEQ ID NO:263の概ねヌクレオチド143から214までの断片と、S
EQ ID NO:264の概ねヌクレオチド434から487までの断片と、SEQ ID NO:265の概
ねヌクレオチド218から271までの断片と、SEQ ID NO:266の概ねヌクレオチド89
から145までの断片と、SEQ ID NO:267の概ねヌクレオチド198から254までの断片
と、SEQ ID NO:268の概ねヌクレオチド10から54までの断片とである。

【００９０】 本発明はまた、HSPPの変異体を含む。HSPPの変異体は、HSPPのアミノ酸配列と
好ましくは約８０％以上の配列同一性、更に好ましくは約９０％以上の配列同一
性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有し、HSPPの機能的特性或いは
構造的特性のうちの少なくとも１つを含む。

【００９１】 本発明はまた、HSPPをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例にお
いて、本発明は、HSPPをコードするSEQ ID NO:135−268からなる一群から選択さ
れた配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【００９２】 本発明はまた、HSPPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはHSPPをコー
ドするポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性、更に好ましくは９０％
以上の配列同一性、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また本
発明の特定の実施態様では、SEQ ID NO:135−268からなる一群から選択された核
酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは約９０％以上の配列同一
性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するSEQ ID NO:135−268から
なる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上
記の各ポリヌクレオチド変異配列のすべてが、HSPPの機能的或いは構造的特徴の
少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

【００９３】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るHSPPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のHSPPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。

【００９４】 HSPPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された厳
密な条件の下で、自然発生のHSPPのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが
望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用
を有するHSPP又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有
益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを
選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高め
ることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、HSPP及びその誘
導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ
転写物を作ることにある。

【００９５】 本発明はまた、HSPP及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片
を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分
野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何
れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、HSPPまたはその任意の断
片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００９６】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:135−268またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオ
チド配列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods En
zymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511
.を参照)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム
と約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満
の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好まし
くは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウ
ムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低い
ハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは
５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーション
になる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７
℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメ
ーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には周
知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えること
ができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７
５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで
行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと
５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１０
０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例で
は、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナト
リウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ
で行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００９７】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗
浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度
を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例
えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。
洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２
℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過
程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が
４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０
．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で
、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％Ｓ
ＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであ
る。

【００９８】 当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施
例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断
片であるSequenase（US Biochemical社, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Pe
rkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはELON
GASE増幅システム(GIBCO/BRL,Gaithersburg, MD)にみられるような校正エキソヌ
クレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。このプロセ
スは、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)、Ham
ilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC20
0；MJ Reserch, Watertown MA）並びにABI Catalyst及び373及び377 DNAシーケ
ンサ（Perkin Elmer）等の装置を用いて自動化するのが好ましい。次に、ABI 37
3または377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)またはMEGABACE 1000
DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)のどちらか
１つを用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なア
ルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubei, F.M. (1997) Short Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers,
R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY,
pp. 856-853.を参照)。

【００９９】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした
種々の方法を用いてHSPPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要
素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの
方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベ
クター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Sarkar, G. (19
93) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広
範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用い
る。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由
来する。（Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。キャプチャＰ
ＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に
隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）
PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による
消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組
換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を
用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)N
ucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー
、PromoterFinder^TMライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である
（Clontech, Palo Alto CA）。この方法ではライブラリをスクリーニングする必
要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法
をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis s
oftware（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラム
などを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６
８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される。

【０１００】 完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、大きなｃＤＮＡを含むように
サイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ラ
イブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有
する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用で
ある。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう
。

【０１０１】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光
色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能であ
る。出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer社のGenotyper^{T M} 及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローデ
ィングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ
制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在し
ない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。

【０１０２】 本発明の別の実施例では、HSPPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にHSPP、その断片または機
能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的
に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ
得り、これらの配列をHSPPのクローン化及び発現に利用可能である。

【０１０３】 種々の目的でHSPPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの
混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌク
レオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による
定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グ
リコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等
が可能である。

【０１０４】 別の実施例によれば、HSPPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Re
s Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてHSPP自体また
はその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技
術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:202-
204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ（Per
kin Elmer）を用いて達成し得る。更にHSPPのアミノ酸配列または任意のその一
部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク
質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプチド
を作ることが可能である。

【０１０５】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei
n.s, Structures and Molecular Properties, WH Freeman and Co., New York,
NYを参照)。

【０１０６】 生物学的に活性のHSPPを発現させるために、HSPPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含
む。これらの要素には、ベクター及びHSPPをコードするポリヌクレオチド配列に
おけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻
訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様
々である。特定の開始シグナルによって、HSPPをコードする配列のより効果的な
翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン
及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。HSPPをコードする配列及びその
開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる
転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、
コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければ
ならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから
得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含
めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (19
94) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.を参照)。

【０１０７】 当業者に周知の方法を用いて、HSPPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in
vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる
。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratom Manua
l, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及
び Ausubel, F.M. 他. (1995, and periodicsupplements) Current Protocols i
rt Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,NY. ch. 9章及び13章、1
6章を参照)。

【０１０８】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、HSPPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌な
どの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベ
クター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベ
クター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プ
ラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明
は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【０１０９】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、HSPPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、HSPPを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、Bluescript? (Stratagene)またはpSportlTM plasmid (GIBCO BRL)な
どの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニ
ング部位にＨＬＯＲをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破
壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニン
グ法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列
のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一
本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば、Van Hee
ke. G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を参照)。例
えば、抗体の産生のためなどに多量のHSPPが必要な場合は、HSPPの発現をハイレ
ベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５また
はＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。

【０１１０】 HSPPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。酵母菌サッカロミセス−セレ
ビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨなどの構成型或いは誘導
型のプロモーターを含む多種のベクターが使用可能である。更に、このようなベ
クターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安
定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、上記のAus
ubel.; 及び Grant 他 (1987) Methods Enzymol.153:51−794: Scorer. C. A.
他 (1994) Bio/Technology 12:181-184.を参照) 植物系もHSPPの発現に使用可能である。HSPPをコードする配列の転写は、例え
ば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーター
が単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来の
オメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮ
Ａ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中
に導入可能である。（例えば、Hobbs, S.又はMurry, L.E. in McGraw Hill Year
book of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）
。

【０１１１】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にHSPPをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にHSPPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用い
ることが可能である。

【０１１２】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０Ｍｂ
のＨＡＣｓを作製し、従来の方法（リボソーム、ポリカチオンアミノポリマー、
またはベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Gene
t.15:345-355.を参照)。

【０１１３】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるHSPPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、HSPPをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。

【０１１４】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (19
77) Cell 11:223-232; and Lowy. I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14; 及び上記のMurryを参照)。さらに選択に
利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhi
sDが文献に記載されている（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Na
tl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）(Clontech. Palo Alto. CA)、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ
，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これ
らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参
照）。

【０１１５】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、HSPPをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、HSPPをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がHSPPをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【０１１６】 一般に、HSPPをコードする核酸配列を含み、HSPPを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核
酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或い
はチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイ
が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【０１１７】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるHS
PPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。HSPP上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratony Manual. APS Press. St Paul
. MN, Section IV; Coligan. J. E. 他 (1997 and periodic supplements) Curr
ent Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscien
ce, New York. NY: 及び Maddox. D.E. 他 (1983) J. Exp. Med. 158:1211-1216
)。

【０１１８】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。HSPPをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーショ
ン、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる
。別法として、HSPPをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプロー
ブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では
周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６な
どの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in
vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例え
ば、Pharmacia＆Upjohn（Kalamazoo, MI）及びPromega（Madison WI）、U.S. Bi
ochemical Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて行うことがで
きる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質
、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化
学発光剤、色素産生剤などが含まれる。

【０１１９】 HSPPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の出現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞で作製されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される
その配列及び／またはそのベクターによる。HSPPをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を通ってHSPPの分泌を誘導す
るシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。別の
作製物を用いて、HSPPをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促すポリ
ペプチド領域をコードするヌクレオチド配列と結合させることも可能である。こ
のような精製を促す領域には、固定された金属上での精製を可能とするヒスチジ
ントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロ
ブリンでの精製を可能とするタンパク質Ａ領域、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ
ー精製システム（Immunex Corp., Seattle WA）に用いられる領域が含まれるが
、これらに限定されるものではない。精製領域と配列をコードするHSPPとの間の
XA因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego, CA)に特異的なものな
どの切断可能なリンカー配列を含むものを用いて、精製が促進され得る。このよ
うな発現ベクターの１つは、HSPPと、チオレドキシン或いはエンテロキナーゼ切
断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含む融合タンパク質を
発現させる。ヒスチジン残基は、固定された金属イオンアフィニティクロマトグ
ラフィー上で精製を促進する(IMAC)（例えば、Porath, J他（1992）; Protein E
xp. Purif. 3:263-281を参照）。エンテロキナーゼ切断部位が、融合タンパク質
からHSPPを精製する手段を提供する(例えば、Kroll, D.J.他(1993); DNA Cell B
iol. 12:441-453を参照)。

【０１２０】 更に、挿入した配列の発現調節能力またはタンパク質の発現を所望の形にプロ
セシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの
修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（li
pidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タ
ンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タン
パク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活
性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ異なった宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ
ロセシングを確実にするために選択される。

【０１２１】 本発明の別の実施例では、HSPPをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラHS
PPタンパク質が、HSPPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク
質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢ
Ｐ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、
これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈ
ｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物
（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族
の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素
（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクロ
ナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製
ができる。また、HSPPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタン
パク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、HSPPが精
製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Au
subel. F. M. 他による (1995 and periodic supplements) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Ne,,v York. NY. ch 10.に記載さ
れている。本発明の別の実施例では、ＴＮＴ^TMウサギ網状赤血球可溶化液または
コムギ胚芽抽出系(Promega. Madison. WI)を用いてin vitroで放射能標識したHS
PPの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと
機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。転写は
、好ましくは３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の
下で起こる。

【０１２２】 HSPPの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えばApplied Bi
osystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能で
ある。HSPPの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成
する。

【０１２３】 治療 例えば配列及びモチーフの化学的及び構造的類似性が、HSPPとシグナルペプチ
ド配列との間に存在する。更に、配列及びモチーフの化学的及び構造的類似性が
、HSPP−66とラット由来の前立腺ステロイド結合C3前駆体シグナルペプチド配列
（GI 206453）との間と、HSPP−68とヒト由来のTWIK関連酸感受性Ｋ⁺チャンネル
（GI 2465542）との間と、HSPP−92とチロシン特異的プロテインホスファターゼ
（PROSITE PDOC00323）との間とに存在する。更に、HSPPの発現は、細胞増殖、
癌、炎症、心血管、神経、生殖、造血／免疫及び発達組織と密接な関係がある。
従って、HSPPは、癌を含む細胞増殖異常、炎症、心血管疾患、神経疾患、生殖異
常、発生障害において一定の役割を果たすと考えられる。HSPPの発現または活性
の増大に関連する癌を含む細胞増殖異常、炎症、心血管疾患、神経疾患、生殖異
常、発生障害の治療において、HSPPの発現または活性を低下させることが望まし
い。HSPPの発現または活性の低下に関連する上記の疾患の治療において、HSPPの
発現または活性を増大させることが望ましい。

【０１２４】 従って、一実施例において、HSPPの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、そのような患者にHSPPまたはその断片や誘導体を投与す
ることが可能である。このような疾患の例には、細胞増殖異常が含まれ、その中
には、日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝
炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症
、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒
色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳
房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、
副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含
まれ、更に、炎症性疾患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ
）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロ
イド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免
疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌障害−カンジダ−外胚葉ジストロフィー
（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮
膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅
斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、
橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ラ
イター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフ
ィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大
腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及
び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が
含まれ、更に心血管疾患も含まれ、その中には、動静脈瘻及びアテローム硬化、
高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静
脈血栓び、血管の腫瘍などの血管の障害が含まれ、更に心疾患も含まれ、その中
には、うっ血心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性
弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化
、僧帽弁脱出、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血
栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋
症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性性心疾患、先天性心疾患などが含まれ、更に肺疾患
も含まれ、その中には、先天性肺異常、無気肺、肺うっ血及び肺水腫、肺塞栓、
肺出血、肺梗塞、肺高血圧、血管硬化、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞
性肺疾患、気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張、細菌性肺炎、ウイル
ス性肺炎、マイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺、
サルコイドーシス、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺実質炎、肺好
酸球増加閉塞性細気管支器質性肺炎（pulmonary eosinophilia bronchiolitis o
bliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー
症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病性肺疾患、肺胞蛋白症、肺腫瘍、炎症性及
び非炎症性胸水、気胸、胸膜腫瘍ガ含まれ、更に、神経障害も含まれ、その中に
は、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、
ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及び他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬
化症及び他の運動ニューロン疾患、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝
性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳
膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経
根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病
、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン
病（prion disease）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神
経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblast
omatosis）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、
脳性麻痺、神経骨格異常症（neuroskeletal disorder）、自律神経系障害、脳神
経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、皮膚筋炎及び多発性筋
炎と、遺伝性の代謝性及び内分泌性、中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期
性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、分裂病性精神障害と、静座不能、健
忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニ
ー、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、更に、生殖障
害が含まれ、その中には、プロラクチンの産生異常と、卵管病及び排卵異常、子
宮内膜症、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群
、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形発生を含
む不妊症と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症と、精子形成異常、生理学上の精
子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、イ
ンポテンス、男性乳房及び女性化乳房癌とが含まれ、更に、発生障害も含まれ、
その中には、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性
小人症、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型偽肥大性筋ジストロフィ、
性腺無形成、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱
）ミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis- syndrome)、異形成脊髄、遺伝性粘
膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症
などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)
及び脳性小児麻痺などの発作、脊髄２分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内
障、白内障、感覚神経性聴力損失とが含まれるが、ここに列記したものに限定さ
れるわけではない。

【０１２５】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPPの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HSPPまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。

【０１２６】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたHSPPを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも
可能である。

【０１２７】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HSPPの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。

【０１２８】 更に、別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPP
の発現または活性の増大に関連した疾患の治療や予防のために、HSPPの活性を調
節するアンタゴニストを投与することが可能である。一実施態様では、HSPPと特
異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはHSPPを発現する細胞ま
たは組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。

【０１２９】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPPの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、HSPPをコードする
ポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能で
ある。

【０１３０】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１３１】 HSPPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたHSPPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてHSPPと特異的に結合するものを同定が可能である。HSPP
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメント
が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（
即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１３２】 抗体の作製のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、HSPPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium par
vumが特に好ましい。

【０１３３】 HSPPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望まし
いのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或い
はペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と
同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む。
HSPPアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨ(キーホールリンペットヘモシニアン)など
の別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１３４】 HSPPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler
, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. M
ethods 81.:31-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2
030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１３５】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
HSPP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１３６】 抗体は、in vivoでのリンパ球集団の中の生成を誘発することによって、また
は免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、
高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、作製する
こともできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
3833-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１３７】 HSPPに対する特異的な結合部位を含む抗体も作製することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）
２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成さ
れるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆ
ａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦ
ａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989)
Science 254:1275-1281を参照）。

【０１３８】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、HSPP
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性HSPPエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することがで
きる(Pound、前出）。

【０１３９】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、H
SPP抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平
衡状態の下でHSPP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割っ
たものである。多数のHSPPエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール
抗体試薬の測定値Ｋａは、HSPP抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定の
HSPPエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和性の真の
測定値を表す。Ｋａ値が１０⁹〜１０¹²Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、HSPP
抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好
ましい。Ｋａ値が１０⁶〜１０⁷Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、HSPPが抗体か
ら最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及
び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I
: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cr
yer, A. (1991) A Practical Guide to Monocional Antibodies, John Wiley &
Sons, New York NY)。

【０１４０】 ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、あるダウンス
トリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、HSPP抗体複合体を沈殿させなけ
ればならない処理に適している。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価
、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Cat
ty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。

【０１４１】 本発明の別の実施例では、HSPPをコードするポリヌクレオチド、または任意の
断片またはその相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、HSPPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止する
のに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、HSPPをコード
するポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって
、相補的分子または断片は、HSPPの活性の調節、または遺伝子機能の調節のため
に使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまた
はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、HSPPをコードする配列
の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である
。

【０１４２】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてHSPPをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。

【０１４３】 HSPPをコードする遺伝子は、HSPPをコードするポリヌクレオチド又はその断片
を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによ
って止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はア
ンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れられ
ない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損な
われるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一
ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに
長く持続し得る。

【０１４４】 上記した通り、遺伝子の発現は、HSPPをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、Ｐ
ＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開始
部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適であ
る場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。
三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結
合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用いる最
近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: H
uber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分
子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの
翻訳を阻止するように設計できる。

【０１４５】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、HSPPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効
果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１４６】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。

【０１４７】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでHSPPをコードするＤＮＡ
配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等
の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入
れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成
するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入すること
ができる。

【０１４８】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めるこによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。

【０１４９】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr
o、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。

【０１５０】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１５１】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、HSPP、HSPPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はHSPPの
インヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類
以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。
このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが
含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又
はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１５２】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、もく膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１５３】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., E
aston, PA)に記載されている。

【０１５４】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１５５】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。

【０１５６】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。

【０１５７】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１５８】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１５９】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１６０】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１６１】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。

【０１６２】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。HSPPの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１６３】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。

【０１６４】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１６５】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばHSPP又はその
断片、HSPPの抗体、HSPPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど
の活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ₅₀（服
用に対して集団の５０％に医薬的効果がある。）またはＬＤ₅₀（服用に対して集
団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験にお
ける標準的な薬剤手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果との
薬用量比は治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の比率で示すことができる。高い治
療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得ら
れたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる
。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ₅₀ を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及
び患者の感受性、投与の経路にによって、この範囲内で様々である。

【０１６６】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。

【０１６７】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１６８】 診断 別の実施例では、HSPPに特異的に結合する抗体が、HSPPの発現による特徴をも
つ疾患の診断、またはHSPPやHSPPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビ
ターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断
に有益な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。HSPPの
診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取
されたものからHSPPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或
いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着
によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが
、その内の幾つかは上記した。

【０１６９】 HSPPを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロト
コルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのHSPPの発現を診
断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なHSPPの発現の値は、複合体
の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者から採
取した体液または細胞とHSPPに対する抗体とを結合させることによって決定する
。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（photometri
c）が好ましい。被験者のHSPPの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサン
プルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパ
ラメーターとなる。

【０１７０】 別の実施例によれば、HSPPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用
いて、疾患と相関し得るHSPPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出及
び定量する。この診断アッセイを用いて、HSPPの不在、存在、及び過度の発現を
調べ、治療中のHSPPレベルの制御を監視する。

【０１７１】 ある実施形態では、HSPPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーション
によって、HSPPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'
調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特
異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブがHSPP
をコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コ
ードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。

【０１７２】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、HSPPをコードする任意の配
列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブリ
ダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、SEQ ID NO:13
5−268の配列、或いはHSPP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを
含むゲノム配列に由来し得る。

【０１７３】 HSPPをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの
作製方法には、HSPP及びHSPP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮ
Ａプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このような
ベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ
及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例え
ば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）
結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等
の種々のレポーターの集団によって標識され得る。

【０１７４】 HSPPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、HSPPの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。このような疾患の例には、細胞増殖異常が含まれ
、その中には、日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、
硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロ
ビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リン
パ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄
、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣
、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌
などが含まれ、更に、炎症性疾患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（
ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎
、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血
、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌障害−カンジダ−外胚葉ジスト
ロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アト
ピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、
結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレー
ブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重
症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、
乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身
性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、
潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス
感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症
、外傷が含まれ、更に心血管疾患も含まれ、その中には、動静脈瘻及びアテロー
ム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈
炎及び静脈血栓び、血管の腫瘍などの血管の障害が含まれ、更に心疾患も含まれ
、その中には、うっ血心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾
患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪
状石灰化、僧帽弁脱出、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非
細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾
患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性性心疾患、先天性心疾患などが含まれ、更
に肺疾患も含まれ、その中には、先天性肺異常、無気肺、肺うっ血及び肺水腫、
肺塞栓、肺出血、肺梗塞、肺高血圧、血管硬化、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、
慢性閉塞性肺疾患、気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張、細菌性肺炎
、ウイルス性肺炎、マイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患
、塵肺、サルコイドーシス、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺実質
炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支器質性肺炎（pulmonary eosinophilia bronchi
olitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパ
スチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病性肺疾患、肺胞蛋白症、肺腫瘍、
炎症性及び非炎症性胸水、気胸、胸膜腫瘍ガ含まれ、更に、神経障害も含まれ、
その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピ
ック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及び他の錐体外路障害、筋萎縮
性側索硬化症及び他の運動ニューロン疾患、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜
炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄
膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎
及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐
ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む
プリオン病（prion disease）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代
謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal heman
gioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発
生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（neuroskeletal disorder）、自律神経系障
害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、皮膚筋炎及び
多発性筋炎と、遺伝性の代謝性及び内分泌性、中毒性ミオパシーと、重症筋無力
症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、分裂病性精神障害と、静座
不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、
ジストニー、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、更に
、生殖障害が含まれ、その中には、プロラクチンの産生異常と、卵管病及び排卵
異常、子宮内膜症、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺
激症候群、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形
発生を含む不妊症と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症と、精子形成異常、生理
学上の精子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニ
ー病、インポテンス、男性乳房及び女性化乳房癌とが含まれ、更に、発生障害も
含まれ、その中には、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形
成不全性小人症、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型偽肥大性筋ジスト
ロフィ、性腺無形成、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、
精神薄弱）ミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis- syndrome)、異形成脊髄、
遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経
線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's
chorea)及び脳性小児麻痺などの発作、脊髄２分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先
天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失とが含まれるが、ここに列記したもの
に限定されるわけではない。HSPPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザー
ンブロット法やノーザンブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、デ
ィップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び患者
から採取した体液或いは組織を利用して変異HSPPの発現の検出に用いられるマイ
クロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当
分野では周知である。

【０１７５】 特定の形態において、HSPPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、
特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。HSPPをコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと
較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のHSPPをコードするヌクレオチド
配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッ
セイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、
特定の治療効果を推定することが可能である。

【０１７６】 HSPPの発現に関連する疾患の診断の元となるものを提供するために、正常ある
いは標準的な発現の概要が確立される。この確立は、ハイブリダイゼーション或
いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出さ
れた体液或いは細胞と、HSPPをコードする配列或いはその断片とを結合させるこ
とにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から
得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
の値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的
な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者
の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１７７】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。

【０１７８】 癌において、個体からの生体組織における異常な量の転写物は、疾患の発生の
素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供するこ
とが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或い
は積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能と
なる。

【０１７９】 HSPPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成
、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましく
はHSPPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはHSPPをコードするポリヌク
レオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺
伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩い厳密性
条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いる
ことが可能である。

【０１８０】 HSPPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量の速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含ま
れ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを
用いることによって加速された。

【０１８１】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。

【０１８２】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、HSPPをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌
Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Price, C.M
. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:14
9-154を参照） In sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイ
トで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のHSPPをコードする遺伝子
の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような
疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列
を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検
出することもある。

【０１８３】 染色体標本のIn sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。

【０１８４】 本発明の別の実施例では、HSPP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。HSPPとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成
は計測されることもある。

【０１８５】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、HSPP、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたHSPPが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたHSPPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０１８６】 別の実施例では、HSPPと結合可能な中和抗体がHSPPと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、HSPPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。

【０１８７】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にHSPPをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。

【０１８８】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで十分に本発
明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目
的であって本発明を限定するものではない。

【０１８９】 前出及び以下に記載した全ての特許出願及び特許、刊行物、特に米国出願第６
０／０９０、７６２号、第６０／０９４、９８３号、第６０／１０２、６８６号
、第６０／１１２、１２９号を引用することをもって本明細書の一部とする。

【０１９０】

【実施例】

１ ｃＤＮＡライブラリの作製 ＲＮＡにはClontech社から購入したものと、表４に列記した組織から単離した
ものとがある。ある組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート
溶液に溶解した。一方で別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、
或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフ
ェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化
セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或
いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物から
ＲＮＡを沈殿させた。

【０１９１】 ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な
回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どの
ライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテック
ス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ
（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Arabion,
Austin TX)などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。

【０１９２】 ある場合には、Stratagene社にＲＮＡを提供しStratagene社が対応するｃＤＮ
Ａライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratag
ene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分
野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリ
を作製した。(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は
、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオ
チドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或い
は複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S
1000または SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersh
am Pharmacia Biotech)、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ
（300〜1000bp）を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT
1プラスミド(Life Technologies)、plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto
CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを
結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIueMRF
、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH 10B、ElectroMAX DH 10B
を含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。

【０１９３】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。

【０１９４】 別法では、高スループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドＤＮＡを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Blochem. 216:1-14)。宿
主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処
理してから３８４−ウエルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡ
の濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光
スキャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した
。

【０１９５】 ３ シークエンシング及び分析 シークエンシングのためのｃＤＮＡの準備には、ABI CATALYST 800 (Perkin-E
lmer)またはHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)、MICROLAB 220
0 システム(Hamilton)をPTC-200 thermal cyclers (MJ Research)と共に用いた
。ｃＤＮＡのシークエンシングには、ABI PRISM 373または377シークエンシング
システム(Perkin-Elmer)及び標準ABIプロトコル、塩基対呼び出しソフトウェア
、キットを用いた。別法では、ｃＤＮＡのシークエンシングには、MEGABACE 100
0 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)を用いた。更なる別法で
は、ｃＤＮＡの増幅及びシークエンシングにABI PRISM BIGDYE Terminator cycl
e sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いた。また、更なる別
法では、ｃＤＮＡのシークエンシングにAmersham Pharmacia Biotech社の溶液と
色素を用いた。ESTの読み枠は、標準的な方法(reviewed in Ausubel, 1997, sup
ra, unit 7.7)を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例
の５に記載した方法で延長した。

【０１９６】 ｃＤＮＡ及び延長、ショットガンシークエンシングから得たポリヌクレオチド
配列の構築及び分析は、当分野の技術者に既知のアルゴリズムを利用したソフト
ウェアを組合せて行った。表５は、利用したソフトウェアのプログラム名、プロ
グラムの説明、引用文献、閾値パラメーターの要約である。表５の第１の列は用
いたツール及びプログラム、アルゴリズムであり、第２の列はそれらの簡単な説
明であり、第３の列は引用することで本明細書の一部とした引用文献であり、第
４の列は２つの配列の一致度の評価に用いたスコア及び確率値、他のパラメータ
である（確率値が高ければ高いほど相同性が高くなる）。配列の分析には、MACD
NASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, S. San Francisco CA)
及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)を用いた。

【０１９７】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKSデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせ
て注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基づいたプログラムを用いて完全長の
ポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPS
に基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした
。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引
き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM、Pr
ositeなどのデータベース、またはPFAMなどのHidden Markov Model (HMM)に基づ
いたタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の
配列を分析した。HMMは、確率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次
構造を解析する(例えば、Eddy, S.R. (1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6:361-365
.を参照)。

【０１９８】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:135−268からのポリヌクレオチド配列の断片の同定
にも使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイ
ゼーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。

【０１９９】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,上記
, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、上記, 4章及び16章を参照)。

【０２００】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ
データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或い
は関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより
非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一
致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定すること
ができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０２０１】 ノーザン分析の結果は、HSPPをコードする転写物が発生したライブラリの分布
割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラ
リの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分
泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾患のカテゴリ
ーには、癌、炎症／外傷、胎児、神経、貯留(pooled)が含まれる。それぞれのカ
テゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全て
の範囲のライブラリの数で割った。各組織に特異的に発現する割合（パーセント
）と各疾患で発現する割合を表３に示した。

【０２０２】 ５ HSPPをコードするポリヌクレオチドの延長 SEQ ID NO:135−229の完全長の核酸配列は、表１の列５に示されている構成要
素である断片を延長して作製した。この時、これらの断片に基づいたオリゴヌク
レオチドプライマーを用いた。各核酸配列において、一方のプライマーはアンチ
センスポリヌクレオチドの延長を開始するために合成し、他方のプライマーはセ
ンスヌクレオチドの延長を開始するために合成する。これらのプライマーを用い
て既知の配列の「外側への」延長を促進し、目的の領域の新しい未知のヌクレオ
チド配列を含むアンプリコンを作り出す。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．
０６（National Biosciences, Plymouth, MN）或いは他の適切なプログラムを用
いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる長さで、約５０％以上のＧ
Ｃ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニールするようにｃ
ＤＮＡから設計する。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生ず
るようなヌクレオチドのストレッチは避ける。

【０２０３】 この配列の延長のために選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）
を用いる。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、既知領域
をさらに延長するための別のプライマーの組を設計する。

【０２０４】 ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って処理を行い、ま
た酵素と反応混合物とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅を行う
。それぞれ４０ｐｍｏｌの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全て
の成分とから増幅を開始する場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Res
erch, Watertown MA）を用いて、以下のパラメータ、即ち、 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行う。

【０２０５】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度の（約０．６〜０．８％）
アガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、何れの反応物が配列を延長する
ことに成功したかを決定する。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドを選
択して、ゲルから切り出し、QIAQuick^TM（QIAGEN Inc.）を用いて精製し、クレ
ノウ酵素を用いて末端の延び出しを切り取って、再連結及びクローニングが容易
になる平滑末端を作る。

【０２０６】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トする。（４０μｌの適切な培養液の中の）コンピテントな大腸菌細胞を、３μ
ｌの連結混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培養液で（例えば、Semb
roo、前出、Appendix A, p. 2を参照）で培養する。３７℃で１時間インキュベ
ートした後、全ての形質転換した混合物を、カルベニシリン（２ｘ ｃａｒｂ）
を含むLuria Bertani（ＬＢ）アガー（例えば、Sembrook、前出、Appendix A, p
. 1を参照）上にプレートする。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無
作為に選択し、適切な市販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの各ウェル内
に入れられた１５０μｌの液状のＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後
日、それぞれ５μｌの終夜培養した各培養物を非滅菌９６穴プレート内に移し、
水で１：１０に希釈した後、各サンプルの内の５μｌをＰＣＲアレイに移す。

【０２０７】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行う。

【０２０８】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ産物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロー
ンを選択し、プラスミドに連結して、配列決定を行う。

【０２０９】 SEQ ID NO:230−268の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計
したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長
して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の延長を開始するために合
成し、他方のプライマーは既知の断片の３'の延長を開始するために合成した。
開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（National Biosciences
）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチド
の長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列
にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量
体が生じないようにヌクレオチドを延長した。

【０２１０】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を延長した。２段階以
上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマ
ーの組を設計する。

【０２１１】 当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはPT
C-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて９６ウェルブロックプレート
で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ｎｍｏｌの各プライマー、Mg^2- と(NH₄)₂SO₄とβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液、Taq DNAポリメラーゼ(A
mersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリ
メラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパ
ラメーターで増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った
。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。

【０２１２】 各ウェルのＤＮＡ濃度は、１X TE及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物
に溶解した１００μｌのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular
Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)
の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレ
ートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サ
ンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌ
のアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れ
の反応物が配列を延長することに成功したかを決定する。

【０２１３】 延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルのプレートに移し
、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madi
son WI)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する
前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、
消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離
して断片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New Eng
land Biolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersh
am Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部
位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した
細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB
/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。

【０２１４】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でＤＮＡを定量化した。ＤＮ
Ａ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％の
ジメチルサルホサイド（dimethysulphoxide）( 1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC D
IRECTキット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator
cycle sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシ
ングした。

【０２１５】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:135−268のヌクレオチド配列を利用し、この
延長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５
′調節配列を得た。

【０２１６】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:135−268から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用い
て、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩
基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮ
Ａフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、
OLIGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェア
を用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²
Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する
。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex^TM G-25超精細排除デキストラン
ビードカラム（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製す
る。毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンド
ヌクレアーゼ、AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN）
の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼ
ーション解析において用いる。

【０２１７】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、フィルムに写すためにブロッ
トに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０２１８】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。

【０２１９】 完全長のｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ：Expressed Sequence Tags）、或
いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を含み得る。ハイブリダイゼーショ
ンに好適な断片を、LASERGENE^TMなどの当分野で公知のソフトウェアを用いて選
択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ
、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリか
ら任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。
ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固
定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena,
M. 他. (1995) Science 270:467-470; 及び Shalon,D. 他. (1996) Genome Res.
6:639-645を参照)。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼ
ーションするために用いる。上記した方法によってこの基質を分析する。

【０２２０】 ８ 相補的ポリヌクレオチド HSPPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発
生のHSPPの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア及びHSPPのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを
設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌ
クレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合する
のを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計し
て、リボソームがHSPPをコードする転写物に結合するのを阻害する。

【０２２１】 ９ HSPPの発現 HSPPの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うこ
とができる。細菌でHSPPが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクロ
ーニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメント
に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハ
イブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換
えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性
をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発される
とＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのHSPPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物
細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californi
ca核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介に
よる遺伝子転移のどちらかによって、HSPPをコードするｃＤＮＡと置換する。ウ
イルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルの
ｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodopte
ra frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用
いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変
更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を
参照)。

【０２２２】 殆どの発現系では、HSPPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持し
た状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる。(Pharm
acia, Piscataway, N J)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯＲか
らタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市
販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免
疫親和性の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-His
によって、金属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及
び精製の方法は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの
方法で精製したＨＬＯＲを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。

【０２２３】 １０ HSPP活性の実証 HSPP−68 HSPP−68の活性は、HSPP−68ｃＲＮＡを注入した１つのツメガエル卵母細胞の
電位固定分析によってカリウム電流を測定して求めることができる。HSPP−68ｃ
ＲＮＡは、in vitroでT7 ＲＮＡポリメラーゼを用いて直線化されたHSPP−68を
コードするプラスミドから合成し、卵母細胞に注入した。用いる卵母細胞は、注
入から２〜４日経ったものである。０．３ｍｌの灌流チャンバー（perfusion ch
amber）において、１つの卵母細胞を３ＭのKCLで満たされた２つの標準的な微細
電極（１〜２．５ＭΩ）で突き刺す。この卵母細胞を、Dagan TEV200増幅器で電
圧固定して緩衝液（９６ｍＭのNaCl、１．８ｍＭのCaCl₂、２ｍＭのMgCl₂、５ｍ
ＭのHEPESを含むｐＨ７．４のNaOH）の中に維持した。標本の刺激及びデータの
収集、分析はコンピュータで行った。全ての実験は、室温（２０〜２１℃）で行
った。パルスで脱分極した後、得られたカリウム電流の特性を記録用電極で測定
する。１単位の脱分極に応答して流れるカリウム電流の量が、細胞内のHSPP−68
の活性に比例する(Duprat, F. 他 (1997) ENBO J. 16:5464-5471.)。

【０２２４】 HSPP−92 HSPP−92プロテインホスファターゼは、p-ニトロフェニルホスファターゼ（PN
PP）の加水分解によって測定できる。ｐＨ７．５のHEPES緩衝液でPNPPと共にHSP
P−92を、０．１％のb-メカプトエタノールの存在の下で３７℃で６０分間イン
キュベートした。６ｍｌの１０ＮのNaOHを添加して反応を止め、PNPPの加水分解
で得られる４１０ｎｍでの吸光度の増加を分光光度計で測定する。吸光度の増加
は、アッセイのPPの活性に比例する(Diamond R.H. 他 (1994) Mol Cell Biol 14
:3752-62)。

【０２２５】 別法では、HSPPまたは生物学的に活性なその断片を¹²⁵Iボルトンハンター試薬
で標識する(例えば、Bolton 他 (1973) Biochem J. 133:529)。多数のウェルを
備えるプレートのウェルに予め配置した候補分子を標識したHSPPでインキュベー
トし、洗浄し、標識したHSPPの複合体のあるウェルをアッセイする。濃度の異な
るHSPPで集めたデータを使って、候補分子と結合したHSPPの合計数及び親和性、
関連を計算する。

【０２２６】 HSPP活性の別のアッセイでは、細胞表面に発現するHSPPを測定する。HSPPをコ
ードするｃＤＮＡを、高レベルのｃＤＮＡの発現に好適な哺乳類発現ベクターに
サブクローニングする。得られた作製物をNIH3T3などの非ヒト株化細胞に形質移
入する。細胞表面タンパク質を、当分野で周知の方法を用いてビオチンで標識す
る。HSPPに特異的な抗体を用いて免疫沈降させ、免疫沈降したサンプルをSDS-PA
GE及び免疫ブロット技術を利用して分析する。無標識の免疫沈降物に対する標識
された免疫沈降物の比率が、細胞表面に発現したHSPPの量に比例する。

【０２２７】 更に、別のHSPP活性のアッセイでは、分泌膜結合細胞小器官のHSPPの量を測定
する。上記したように形質移入された細胞を採取して溶解する。この溶解物を、
スクロース勾配超遠心などの当分野で周知の方法で分画する。この方法で、ゴル
ジ体、ＥＲ、膜結合小胞及びその他の分泌細胞小器官などの細胞成分分画を単離
できる。HSPPに特異的な抗体を用いて分画された全細胞溶解物を免疫沈降させ、
免疫沈降したサンプルをSDS-PAGE及び免疫ブロット技術を利用して分析する。全
細胞溶解物のHSPPに対する分泌細胞小器官のHSPPの濃度が、分泌経路を介して移
行したHSPPの量に比例する。

【０２２８】 １１ 機能的アッセイ HSPPの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
HSPPをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレ
ベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニン
グする。このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies. Gaither
sburg. MD)及びpCR^TM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイ
トメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを
、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔
法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含
む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により
、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識
タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想
できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP) (Clontech,
Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。レーザ
ー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、GFPまたは
CD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシスの状態などの特
性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する
蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ
化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオ
キシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、
特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質
の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって
計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ormerod, M.
G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に記載されている
。

【０２２９】 遺伝子発現におけるHSPPの影響は、HSPPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グ
ロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参照)。ｍＲＮ
Ａは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。HSPP及び目的の他
の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で
分析することができる。

【０２３０】 １２ HSPPに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE) (例えば、Harrington,M.G. (1990)
Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術を用いて実質的に精
製されたHSPPを、標準的なプロトコルによりウサギを免疫化し、抗体を作り出す
ために用いる。

【０２３１】 別法では、HSPPアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（DNASTAR）
を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成
してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或い
は隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については
、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel他による11章を参照)。

【０２３２】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用い
た反応によりＫＬＨ（Sigma, St. Louis, MO）に結合させて、免疫原生を高める
(例えば、前出のAusubel 他による文献を参照)。フロイントの完全アジュバント
においてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた
抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合
し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに
放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０２３３】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生HSPPの精製 自然発生HSPP或いは組換えHSPPを、HSPPに特異的な抗体を用いるイムノアフィ
ニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Pharmacia & Upjohn）のような活性化クロマトグ
ラフィー用レジンとHSPP抗体とを共有結合させることにより構築する。結合の後
、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。

【０２３４】 HSPPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをHSPPを
優先的に吸着できる条件下で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強
度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とHSPPとの結合を切るような
条件下で（例えば、ｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシ
アン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、HSPPを回収する。

【０２３５】 １４ HSPPと相互作用する分子の同定 HSPP又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（例えば
、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウェルプ
レートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したHSPPと共にインキュベート
し、洗浄して、標識したHSPP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々
なHSPP濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とHSPPとの結合、親和性、数
について数値を計算する。

【０２３６】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【０２３７】 表の簡単な説明 表１は、HSPPをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチ
ド配列及びヌクレオチド配列のＩＤ番号(SEQ ID NO)、クローンＩＤ番号、ｃＤ
ＮＡライブラリ、ｃＤＮＡ断片を示す。

【０２３８】 表２は、予想されるシグナルペプチドを含む各ポリペプチド配列の特徴、及び
HSPPの同定に用いた方法及びアルゴリズムを示す。

【０２３９】 表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パター
ンと、これらの組織に関連した疾患や異常、症状と、各ＤＮＡがクローニングさ
れたベクターとを示す。

【０２４０】 表４は、HSPPをコードするインサイトｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡラ
イブラリを作製するために用いた組織を示す。

【０２４１】 表５は、HSPPの分析に用いたプログラム及びその説明、引用文献、パラメータ
ー閾値を示す。

【０２４２】 表６は、表１のｃＤＮＡ断片に対応するHSPPの完全長のヌクレオチド配列の領
域を示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】

【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

【表３６】

【表３７】

【表３８】

【表３９】

【表４０】

【表４１】

【表４２】

【表４３】

【表４４】

【表４５】

【表４６】

【表４７】

【表４８】

【表４９】

【表５０】

【表５１】

【表５２】

【表５３】

【表５４】

【表５５】

【表５６】

【表５７】

【表５８】

【表５９】

【表６０】

【表６１】

【表６２】

【表６３】

【表６４】

【表６５】

【表６６】

【表６７】

【表６８】

【表６９】

【表７０】

【表７１】

【表７２】

【表７３】

【表７４】

【表７５】

【表７６】

【表７７】

【表７８】

【表７９】

【表８０】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 29/00 25/00 35/00 29/00 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１０２，６８６ (32)優先日 平成10年10月１日(1998．10．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１２，１２９ (32)優先日 平成10年12月11日(1998．12．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴルゴン、ジーナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95006・ ボールダークリーク・パインクレストドラ イブ 1253 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 エイカーブラム、イングリッド・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州94061・ レッドウッドシティー・ジョンソンストリ ート 1234 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス アメリカ合衆国カリフォルニア州94702・ バークレイ・カインズアベニュー 1419 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 (72)発明者 レディ、ルーパ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・ウェストマッキンレードラ イブ 1233 (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1−134（配列番号：1−134）及びそれらの断片
   からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一
   性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも１つの核酸とハイ
   ブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
   ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプルに前記ポリヌクレオチドが存
   在することと相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出方法。
8. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチド
   を増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 SEQ ID NO:135−268及びそれらの断片からなる一群から選
   択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレ
    オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項３の少なくとも１つのポリヌクレオチドの断片を
    含む発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 好適な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 HSPPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療また
    は予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を
    含む、HSPPの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。
20. 【請求項２０】 HSPPの発現または活性の増加に関連する疾患の治療また
    は予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程
    を含む、HSPPの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法
    。