JP2002515730A - 遺伝子発現を変調する因子のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞成長、分化、もしくは増殖を刺激するかもしくは阻害する因子、１つ以上のシグナル伝達経路に関与する因子、またはタンパク質-タンパク質相互作用に関与する因子を含む因子の検出により、遺伝子発現を変調する因子のスクリーニング方法を記載する。遺伝子発現を変調するこのような因子の同定は、この因子により媒介される細胞内事象の検出により達成される。細胞内事象は、転写活性または翻訳活性の増加または減少であり得る。細胞内事象の検出は、転写産物または翻訳産物をこの因子により誘導される新生の転写物に対して標的化する、任意の非常に高感度のアッセイ（例えば、bDNAアッセイを含む）により達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子発現を変調する因子のスクリーニング方法 発明の分野 本発明は、遺伝子発現を変調する因子のスクリーニング方法に関する。本発明 により同定可能な因子は、細胞の成長、分化、または増殖を刺激するかまたは阻 害する因子を包含し、従って、シグナル伝達経路、他の細胞内シグナリングに関 与し、そして転写効果および翻訳効果を発揮し得る因子を包含する。本質的に、 応答細胞に対するこれらの因子の効果は、この応答細胞における細胞内事象を検 出することにより検出される。細胞内事象は、転写活性または翻訳活性における 増加または減少、あるいはシグナル伝達活性または他のシグナリング活性におけ る増加または減少であり得る。細胞内事象の検出は、このような細胞内応答を検 出するのに十分に感度の高い任意の適切な手段（例えば、bDNAアッセイ、RNase 保護アッセイ、またはRT-PCR検出手段を含む）により達成される。 発明の背景 遺伝子発現を変調する因子の同定の従来の方法は、典型的には、試験される比 較的多量の因子、および検出可能なシグナルを発生させるための多数の応答細胞 を必要とする。これらの方法は、一般的に、細胞内に少量または微量で天然に産 生される因子のスクリーニングに適用可能でない。ほとんどの生物学的因子は、 少量で細胞により生成されるので、少量で産生される因子の検出または同定を可 能にし、そして小数の応答細胞に対するこのような因子の直接的または間接的な 効果を研究するための高感度のアッセイを設計することは有利である。さらに、 多くの因子を迅速かつ正確にスクリーニングすることを可能にし、そしてまた、 調節因子の検出のためにレポーター構築物で形質転換された細胞を必要とするこ ととは対照的に、初代細胞（primary cell）培養をスクリーニングする機会を提 供する因子をスクリーニングするためのアッセイを設計することは有利である。発明の要旨 本発明は、遺伝子発現を変調する因子の高スループットスクリーニング方法で あり、この方法は、少量の候補因子を提供する工程、少量の応答細胞を提供する 工程、応答細胞と候補因子とを接触させる工程であって、ここで応答細胞は、初 期細胞内事象を示すことにより、遺伝子発現を変調する因子に応答し得る、工程 ；および初期細胞内事象を直接的に検出する工程、を包含する。本発明はまた、 ポリヌクレオチド配列の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによ り容易にされる検出を包含し、標的ポリヌクレオチドがmRNA転写物であり得、標 的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が、合成DNA、 合成RNA、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、およびRNase保 護アッセイプローブからなる群より選択され得ることを提供する。標的ポリペプ チドにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列はまた、合成DNA、分枝(branch ed)DNAであり得る。候補因子は、ポリペプチド因子、低分子因子、およびポリヌ クレオチド因子であり得る。本方法はまた、産生細胞および応答細胞を同時培養 する工程を包含する。 本発明のさらなる目的に従って、増殖因子、分化因子、ホルモン、サイトカイ ン、転写因子、阻害因子、リガンドおよび/またはレセプター、あるいはレセプ ターに対するアンタゴニストが提供され、上記の方法により産生される。 本発明のさらなる目的に従って、c-fos転写の誘導により証明された増殖因子 活性を示す、配列番号２の配列のポリペプチドが提供される。 本発明のさらなる目的に従って、配列番号２の配列を有するポリペプチドが提 供される。 本発明のさらなる目的に従って、異種ポリヌクレオチド配列に結合した配列番 号１のポリヌクレオチド配列が提供される。 本発明は、特に遺伝子発現を変調する因子をスクリーニングするために設計さ れ、そして検出可能な効果が小数の細胞において生じるために、少量の任意の１ つの候補因子のみが必要とされるアッセイにおいて、多量の候補因子をスクリー ニングするための迅速かつ有効な方法である。好ましい実施態様の詳細な説明 本明細書中に記載される発明は、以前に公開された業績および係属中の特許出 願を利用する。例としては、このような業績は、科学論文、特許、または係属中 の特許出願からなる。本明細書中で引用されるこのような公開された業績の全て は、本明細書中で参考として援用される。 本発明者らは、遺伝子発現を変調する因子をスクリーニングするインビボ方法 を確立した。このような因子は、低分子またはポリペプチド因子であり得、そし てこれらの因子は、例えば、刺激性または阻害性であり得る。変調される遺伝子 は、任意の遺伝子であり得、これらの遺伝子の発現は変調され得、そしてこれら の遺伝子の発現の変調は、細胞内での所望の変化の指標である。例えば、増殖因 子が求められるところでは、変調され得る遺伝子は、細胞増殖に関連する遺伝子 （例えば、c-fos遺伝子）であり得、そしてこの遺伝子の変調は、遺伝子転写物 の増加であり得る。細胞における所望の変化は、調節因子の投与に応答して起こ る細胞増殖であり得る。 ある因子の遺伝子発現変調効果の検出は、任意の十分に感度の高い手段により 行われ得、そして転写変調または翻訳変調に標的化され得る。転写変調は、標的 遺伝子、またはより大きな効果（例えば、細胞増殖、細胞分化、増殖阻止、炎症 応答、シグナリング経路、および他の遺伝子の発現）のインジケーターとして命 名された遺伝子の転写物のレベルの変化を検出することにより検出され得る。定義 本明細書中で用いられる「遺伝子発現を変調する因子」は、現在既知または未 知であって、応答細胞における細胞内事象を発現させ得る化合物をいう。このよ うな細胞内事象は、転写活性または翻訳活性およびシグナル伝達活性の増加また は減少であり得る。化合物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプトイ ド、または他の低分子であり得、そして天然に存在するかまたは合成的に作製さ れ得る。このような因子は、刺激因子または阻害因子であり得る。因子はまた、 リガンドまたはレセプターであり得、これらは一方の他方への接触の際に、細胞 内でシグナル伝達し得る。因子は、産生細胞の天然産物であり得るか、または因 子をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された産生細胞の発現産物で あり得る。各々の場合において、因子は、分泌される因子、または細胞表面上に 発現される因子、または核作用因子(例えば、転写因子)、または細胞溶解の際に 放出される因子であり得る。本明細書中の因子は、直接的にもしくは間接的に作 用し得、そして目的の遺伝子、目的の遺伝子の発現を制御する調節配列を変調し 得るか、または別の遺伝子の発現を調節し、次いで目的の遺伝子を変調し得る。 本明細書中で初期細胞内事象の検出に関して用いられる用語「直接的に」は、 検出手段が、転写物または他の標的に直接的に結合し、この結合が検出目的のた めに増幅され得るが、この増強は、プローブもしくは検出分子と、転写物もしく は他の標的分子との直接的結合から生じることを意味する。間接的検出は、遺伝 子発現変調の効果の検出（例えば、タンパク質活性の検出、または特定の遺伝子 の発現の変調に因果関係を有すると考えられるタンパク質発現の検出）である。 従って、直接的検出は、遺伝子の転写物または翻訳産物への検出分子の直接的ハ イブリダイゼーションを意味する。 本明細書中で用いられる用語「変調する」は、別の分子の機能を変えるある分 子の能力をいう。従って、変調するは、例えば、阻害する、アンタゴナイズする 、アゴナイズする、アップレギュレートする、ダウンレギュレートする、誘導す る、または抑制するを意味する。モジュレーターは、その標的の機能を変える能 力を有する。このような変化は、タンパク質の転写、翻訳、発現、または機能の 任意の段階で達成され得、その結果、例えば、標的遺伝子の変調は、遺伝子のDN A、RNA、およびタンパク質産物の変調によって達成され得る。標的遺伝子の機能 の変調は次いで、機能または経路（これは、遺伝子およびさもなくば標的遺伝子 に結合し、そして相互作用するか、もしくは応答するタンパク質の機能に通じる ）を変調するか、変化するか、あるいはそれらに影響を及ぼすことを想定する。 標的遺伝子のモジュレーターは、例えば、その発現されたポリペプチドの活性の モジュレーター、そのmRNA転写のレベルのモジュレーター、およびタンパク質発 現のレベルのモジュレーターであり得る。 本明細書中で用いられる用語「候補因子」は、上記で定義された「遺伝子発現 を変調する因子」であるべきその能力について試験されるべき化合物をいう。こ のような候補因子には、例えば、任意の生物（原核生物、または真核生物）に由 来するcDNA、ゲノムDNA、またはcRNAライブラリーの発現産物が含まれる。候補 因子はまた、化学ライブラリーまたは低分子ライブラリーに由来するポリペプチ ド、ペプチド、ペプトイド、または他の低分子を含む。既知の低分子ライブラリ ーの例には、以下に開示されるものがある：米国特許第5,010,175号、WO 91/178 23、WO 91/19735、および「基質結合環式有機化合物のコンビナトリアルライブ ラリー」と題され、1995年６月７日に出願された米国特許出願第08/485,006号、 R．Zuckermannら、J．Am．Chem．Soc.(1992)114:10646-7、ならびにCHEMISTRY A ND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES，AND PROTEINS--A SURVEY OF RECE NT DEVELOPMENTS，Weinstein，B.編、Marcell Dekker，Inc.，発行New York(198 3)。この用語、候補因子は、産生細胞の天然産物、またはこのような因子をコー ドするポリヌクレオチドで形質転換された産生細胞の発現産物である因子を含む 。本明細書における候補因子は、分泌されるか、産生細胞の表面上で発現される か、または産生細胞の溶解の際に放出され得る。候補因子は、レセプターに結合 するリガンドであり得、ここでリガンド/レセプター複合体は、応答性細胞にお いて細胞内応答を誘発し得る。候補因子は、レセプターに対するアゴニストまた はアンタゴニストであるリガンドであり得る。候補レセプターは、応答性細胞に おいて天然に存在するレセプター、または応答性細胞中に導入されるレセプター をコードするポリヌクレオチドの発現の際に応答性細胞において発現されるレセ プターであり得る。候補因子は、細胞外分子（例えば、分泌因子）または細胞内 分子（例えば、転写因子）であり得る。候補因子は、血清、組織、または細胞抽 出物から得られ得る。因子はまた、植物もしくは動物の抽出物のような供給源、 または種々の動物もしくは植物の供給源からの抽出物の混合物に由来し得る。候 補因子および候補レセプターのライブラリーは、当業者により実施される任意の 発現系の使用により、または当業者に公知の低分子ライブラリーの合成の方法に より構築され得る。 用語「高スループット」は、遺伝子発現を比較的迅速に変調する多くの候補因 子のスクリーニングを可能にする方法論である。高スループットは、この方法論 が、工程の数の減少または試薬の取り扱いの減少（例えば、洗浄、もしくは１つ の容器から別の容器への試薬および反応物の移動の量の減少）を包含することを 一般的に意味する。高スループットは、より少ない高スループットおよびより労 働集約的な方法論によって、より少ない因子をスクリーニングするために必要と され得た同じ時間内で、より多くの候補因子をスクリーニングするための方法論 を提供する。 本明細書中で用いられる「少量」は、同一の状況で以前に使用された標準量と 比較して、減少した量、または低い量をいう。遺伝子発現を変調する因子をスク リーニングする状況において、候補因子のプールがより少量にサブプールされ、 そしてそれゆえ各サブプールがアッセイにおいて試験されている各因子のほんの 少量の分子である場合に、少量の因子がもたらされる。スクリーニングアッセイ が、小さな反応容器において起こる場合、少量の候補因子および少量の応答細胞 が反応において用いられる。本発明の大きな利点は、反応の感度が、スクリーニ ングのための少量の候補因子の使用を可能にするという点である。従って、より 感度の低いアッセイにおける変調の検出を達成するための、より大量の候補因子 を作製する労力、時間、および費用が、本発明を用いる場合は不要である。少量 の候補因子が用いられるので、少量の応答細胞もまた用いられ得、従って応答細 胞に対して少量の活性因子分子の活性の検出がなされ得る。検出感度は、例えば 、マイクロウェルに配置された応答細胞の量の、例えば転写の増加が可能である ことを許容する。少量は、100、数百、または数千の例えば分子または細胞より 少ないものを意味し得、そしてこれは相対的な用語である。一般に、少量とは、 特に、検出方法の感度が高い場合、転写を検出する方法によって（例えば、マイ クロウェル中に配置しそして培養され得る細胞の量での転写物の転写における変 調を検出しそして増幅するために、bDNA検出を用いることによって）検出可能な シグナルを提供する因子の基底レベルの量である。 本明細書中で用いられる「初期細胞内事象」は、細胞において遺伝子発現を変 調する因子との接触の後に応答細胞において即座に起こる事象をいう。細胞内事 象はそれ自体変調であるが、細胞内の変化は、スクリーニングアッセイによって 検出される細胞内事象によって指示される変化よりも広範であり得る。しかし、 細胞内事象は、細胞内の１つまたは数個の遺伝子の発現における変調から生じる 事象のカスケードへと最終的に導く一連の事象における最初の事象であり得る。 本発明のスクリーニングアッセイの目的のために、細胞内事象は、標的遺伝子の 転写レベルの変化である。変調因子が、研究されている標的プロセスまたは治療 剤が求められている細胞内プロセスを操作することにおいて有用であることを、 標的遺伝子の遺伝子発現の変調が示すという事実に基づいて、標的遺伝子は選択 される。従って、c-fos遺伝子転写物の転写レベルの増加は、例えば、転写の増 加を引き起こす変調因子が増殖因子であること、または増殖因子活性を有するこ とを示し得る。従って、初期細胞内事象は、検出手段によって検出されるために 選択された遺伝子（標的遺伝子としても知られる）の転写レベルの変化である。 この細胞内事象は、初期と呼ばれる。なぜなら転写効果がプロセス（すなわち、 転写、翻訳、タンパク質発現、およびタンパク質活性）の中で最も即時的である からである。 本明細書中で用いられる用語「刺激因子」は、現在既知または未知であって、 転写、翻訳、またはシグナル伝達を刺激するか、さもなくば細胞内活性を刺激す る、上記で定義された「遺伝子発現を変調する因子」のサブセットをいう。刺激 因子の例には、増殖因子、分化因子、遺伝子産物の産生を刺激する因子（例えば 、obタンパク質）が含まれる。 本明細書中で用いられる用語「阻害因子」は、現在既知または未知であって、 転写、翻訳、またはシグナル伝達を阻害するか、さもなくば細胞内活性を阻害す る、上記で定義された「遺伝子発現を変調する因子」のサブセットをいう。 本明細書中で用いられる用語「増殖因子」は、現在既知または未知であって、 任意の１つ以上の細胞型の増殖を刺激する、上記で定義された「刺激因子」のサ ブセットをいう。このような因子は、Albertsら、THE MOLECULAR BIOLOGY OF TH E CELL(Garland Publishing，NY，NY 1989)、およびLewin，GENE V(Oxford Univ ．Press，Oxford，England1 994)に一般的に記載され、そして例えば、線維芽細 胞増殖因子(FGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インス リン様増殖因子(IGF-IおよびIGF-II)、およびケラチノサイト増殖因子（KGF）を 含む。 本明細書中で用いられる用語「分化因子」は、現在既知または未知であって、 Gilbert，DEVELOPMENTAL BIOLOGY(Sinauer Assoc.，Sunderland，MA 1991)に一 般的に記載されるように、１つ以上の細胞型の分化を刺激する「刺激因子」のサ ブセットをいう。分化因子の１つの例は、神経成長因子(NGF)、すなわちサイト カインである。 本明細書中で用いられる用語「応答性細胞」または「応答細胞」は、細胞内事 象の発現によって上記で定義された「遺伝子発現を変調する因子」に応答し得る 任意の細胞をいう。応答性細胞は、目的のレセプターまたは遺伝子を発現し得る 細胞、さもなくば細胞内事象（例えば、シグナル伝達）を発現し得る細胞を含む 。本発明に適切な応答性細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞の両方を含む 。真核生物細胞の場合、細胞は、哺乳動物細胞、菌類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞 、蠕形動物細胞、魚類細胞、甲殻類細胞、は虫類細胞、両生類細胞または植物細 胞であり得る。哺乳動物細胞は、好ましくはヒト細胞であるが、他の動物もまた 含む。応答性細胞の例は、NIH3T3細胞由来のFTL細胞である。さらなる例として 、求められる因子がタンパク質（例えば、Zhangら、(1994)、Nature 372:425に 記載のobタンパク質）の産生を刺激する因子である場合、本明細書中で適切な応 答性細胞の一例は、obを発現する脂肪細胞である。本発明に従う応答性細胞とし て特に適用可能なものは、造血幹細胞、神経幹細胞、および胚幹細胞である。増 殖因子が求められる場合、哺乳動物細胞（例えば、増殖因子に応答してc-fosを 発現するPC12細胞）が応答性細胞として用いられ得る。応答性細胞であり得るい くつかの哺乳動物細胞は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む哺乳動物株であり、これらには 、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓 （BHK）細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞ガン細胞(例えば、Hep G2)、ヒト 胎児腎臓細胞、マウスSertoli細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細 胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、およびその他が含まれる が、これらに限定されない。 本明細書中で用いられる用語「産生細胞」は、１つ以上の因子または候補因子 を産生するように要請された細胞をいう。因子または候補因子は、産生細胞の天 然産物であり得るか、またはその因子をコードするポリヌクレオチドで形質転換 された産生細胞の発現産物であり得る。応答性細胞と同様に、産生細胞は上記の 原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。産生細胞の一例は、ヒトcRNAライ ブラリーを用いてトランスフェクトされ、そしてそのライブラリーを発現し得る Xenopus卵母細胞である。 因子を応答細胞の密接させる状況において本明細書中で用いられる用語「接触 」は、従来の手段により達成され得る。例えば、因子が溶液中に留まり得る分子 である場合、接触は、因子を応答細胞を含む培地に添加することにより達成され る。本明細書中の「接触」はまた、産生細胞を応答細胞の密接に配置する工程を 包含する。ここで、産生細胞は、因子または候補因子を天然に産生するか、また は因子をコードするポリヌクレオチドを導入することにより形質転換され、この ような因子を産生するかのいずれかである。スクリーニングされるべき因子のラ イブラリーが、発現のために１つ以上のXenopus卵母細胞に注入され、そしてそ の応答性細胞が、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である、１つの例において 、その応答性細胞の接触は、１つ以上の卵母細胞をマイクロウェル中の応答性細 胞のベッドに置き、そしてその細胞を哺乳動物細胞に好ましい温度で一緒にイン キュベートすることにより達成され得る。候補因子のライブラリー（リガンド、 刺激因子、または阻害因子のいずれでであろうと）が、ポリペプチド、ペプチド 、ペプトイド、または他の低分子のライブラリーである場合、応答性細胞の接触 は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、ペプトイド、または他の低分子を直接 マイクロウェル中に応答性細胞とともに置くことにより達成される。 本明細書中で用いられる用語「細胞内事象」は、因子もしくは候補因子との接 触に応答して、またはリガンド/レセプター結合に応答して細胞内で起こる事象 をいう。この変化には、例えば、細胞内の転写活性または翻訳活性、および１つ 以上の一連の事象（一般にシグナル伝達といわれ、レセプターへのリガンドの結 合によって、または細胞/細胞相互作用の結果として生ずる）の増加もしくは減 少が含まれる。例えば、細胞内事象は、リガンドPDGFのそのレセプター（PDGFレ セプター）への結合によって誘発され得る。細胞内事象には、特定のタンパク質 のリン酸化またはＧタンパク質シグナリングが含まれ、これらは、特定の細胞内 経路の活性化を導く。 本明細書中で用いられる用語「検出」は、当該分野で従来的な任意の適切な手 段による細胞内事象の検出をいう。細胞内事象を検出するための手段は、その事 象に合わせて作製される。例えば、細胞内のRNAのレベルでの変化の検出は、WO 92/02526または米国特許第5,451,503号、および米国特許第4,775,619号に記載さ れるbDNAアッセイによって、またはRT-PCRもしくはRNase保護アッセイ（両方がS ambrookら、(1989)，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第２版(Cold Sp ring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)およびAusubelら、CURRENT PRO TOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)(Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons，New York，N.Y.)に記載されている）によって達成され得る。例 えば、本発明が増殖因子を検出するために用いられ、そして細胞内事象が増殖因 子刺激に応答している場合、c-fos mRNAに特異的なbDNAは、c-fosの刺激を検出 するために用いられ得る。必要に応じて、変調されるべきc-fosプロモーターま たは調節配列は、レポーター遺伝子に連結され得、そしてレポーター遺伝子の発 現が検出される。レポーター遺伝子を用いた検出の方法は、SambrookらおよびAu subelらに記載のように公知である。このようなレポーター遺伝子は、例えば、 ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、グ リーン蛍光タンパク質(GFP)、アルカリホスファターゼ(AP)、およびβ-ガラクト シダーゼを含む。細胞内事象がシグナル伝達である場合、伝達されたシグナルは 当該分野で公知の手段（例えば、Pasqualeら、「cDNA発現ライブラリーをスクリ ーニングするために抗ホスホチロシン抗体を用いることによる発生的に調節され たタンパク質であるチロシンキナーゼの同定」Proceedings of the National Ac ademy of Sciences of the United States of America，1989 Jul，86(14):5449 -53に開示されている、抗ホスホチロシン抗体を用いたホスホチロシンの検出） によって検出される。分化因子が求められる場合、例えば、検出方法は、顕微鏡 下で応答性細胞の表現型変化（例えば、応答性細胞の軸索成長）を観察すること であり得る。 本明細書中で用いられる用語、細胞の「天然産物」は、細胞内の遺伝子発現の 内因性産物をいい、その遺伝子の構成への人的介入なしに細胞によって産生され るタンパク質、ポリペプチド、またはそれらのフラグメントを含む。 「天然細胞」は、異種DNAで形質転換されていない細胞、特にレポーター遺伝 子で形質転換されていない細胞である。 標的遺伝子の変調の「直接検出」は、標的転写物でのプローブハイブリダイゼ ーションおよびそれに続く形成されたハイブリッド対の検出による、タンパク質 発現なしに転写レベルを測定することによる検出である。検出は、「直接」と呼 ばれる。なぜなら、検出分子は直接転写物に結合するからである。直接検出は、 プローブハイブリッドの増幅が、検出プローブ分子の増幅から（例えば、bDNA検 出手段の使用によって）達成され得る場合、少量の転写物の検出の機会を提供す る。 本明細書中で用いられる「原核生物細胞」は、細菌細胞および藍色細菌細胞を 含む。 本明細書中で用いられる「真核生物細胞」は、哺乳動物細胞、菌類細胞、昆虫 細胞、鳥類細胞、蠕形動物細胞、魚類細胞、甲殻類細胞、は虫類細胞、両生類細 胞、および植物細胞、ならびにこれらの細胞株を含む。産生細胞としての真核生 物細胞の一例は、カエルXenopus laevis卵母細胞である。 本明細書中で用いられる「哺乳動物細胞」は、真核生物細胞のサブセットをい い、そしてヒト細胞、および動物細胞（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ ギ、マウス、ヤギ、ブタなどの由来の細胞）を含む。用いられる細胞は、遺伝子 的に変化されないか、または例えば、適切な発現ベクター、マーカー遺伝子など での形質転換により遺伝子的に変化され得る。本発明の方法に適切な哺乳動物細 胞は、目的の遺伝子を発現し得る任意の哺乳動物細胞、または本発明の方法に有 用なcDNAライブラリー、cRNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリー、または任 意のタンパク質もしくはポリペプチドを発現し得る任意の哺乳動物細胞である。 哺乳動物細胞はまた、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入 手可能なそれらの不死化細胞株のような細胞株由来の細胞を含む。このような細 胞株は、例えば、ラット褐色細胞腫細胞(PC12細胞)、胎生性癌腫細胞(P19細胞) 、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓 （BHK）細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌腫細胞(例えば、Hep G2)、ヒト 胎児腎臓細胞、マウスSertoli細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝 臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳房腫瘍細胞、およびその他を含む 。造血幹細胞、神経幹細胞（神経球細胞(neuronal sphere cell)）、および胚幹 細胞（ES細胞）もまた含まれる。 本明細書中で用いられる用語「リガンド」は、レセプター（例えば、タンパク 質レセプター）に結合する分子をいう。リガンドは、レセプターと結合対を形成 し得る、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプトイド、または任意の他の 分子であり得る。リガンドとレセプターとの間の結合は、結合対が形成されるよ うな高親和性として特徴づけられる。 本明細書中で用いられる用語「レセプター」は、リガンドに結合して結合対を 形成するタンパク質分子のような分子をいう。レセプターは、細胞表面上で発現 される。リガンドのレセプターへの結合は、しばしば細胞内での遺伝子発現を変 調することにより細胞を変調する細胞を介してシグナルを伝達する。 本明細書中で用いられる用語「レセプターに対するアンタゴニスト」は、レセ プターに結合し、そして他のリガンドのそのレセプターへの結合をブロックする が、シグナル伝達を誘発し得ないリガンドをいう。アンタゴニストは、不可逆的 にまたは可逆的にレセプターに結合し得る。 用語「結合対」は、２つの分子間で結合相互作用し得る一対の分子をいう。通 常、結合相互作用は、細胞シグナルまたは細胞の事象を促進する。用語、結合対 は、タンパク質/タンパク質、タンパク質-DNA、タンパク質-RNA、DNA-DNA、DNA- RNA、およびRNA-RNA結合相互作用といい得る。そして用語、結合対はまた、低分 予、ペプトイド、またはペプチドと、タンパク質、DNA分子、またはRNA分子との 間の結合相互作用を含み得、ここでその対の構成要素が、ランダムな分子に対す るよりも互いに高親和性で特異的に結合し、その結果、結合の際に(例えばリガ ンド/レセプター相互作用の場合)、結合対は細胞応答または細胞内応答を誘発す る。リガンド/レセプター結合対の一例は、PDGF（血小板由来増殖因子）とPDGF レセプターとの間で形成された対である。異なる結合対の一例は、抗原/抗体対 であり、ここで抗体は、抗原での宿主の免疫化によって生成される。結合対の別 の例は、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターとの間、またはプロテアーゼ 基質とプロテアーゼインヒビターとの間の結合対の形成である。特異的結合は、 特異的結合と非特異的バックグラウンド結合とを区別する低い解離定数を有する 結合相互作用を示す。 本明細書中で用いられる「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、特定の アミノ酸配列をコードするRNAもしくはDNA分子またはその相補鎖のいずれかをい う。核酸分子はまた、非コード配列（例えば、リボザイム、アンチセンスオリゴ ヌクレオチド、または遺伝子の非翻訳部分）であり得る。本明細書中で用いられ る「コード配列」は、特異的アミノ酸配列コードするRNAもしくはDNAまたはその 相補鎖をのいずれかをいう。ポリヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴ ヌクレオチド、またはリボザイムを含み、そして遺伝子の3'もしくは5'非翻訳領 域、または遺伝子のイントロン、または遺伝子のコード領域を構成しない遺伝子 の他の領域のようなアイテムもまた含み得る。DNAまたはRNAは、１本鎖または２ 本鎖であり得る。合成核酸または合成ポリヌクレオチドは、化学的に合成された 核酸配列であり得、そしてまた化学的部分により改変されて、その分子を分解に 対して耐性にし得る。合成核酸は、例えば、リボザイムまたはアンチセンス分子 であり得る。合成核酸分子への改変は、核酸モノマーまたはそれらの誘導体また は改変体（化学的部分を含む）を含む。例えば、ホスホチオエートは、改変のた めに使用され得る。ポリヌクレオチド誘導体は、例えば、分枝DNA（bDNA）のよ うなポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、合成または組換えポリ ヌタレオチドであり得、そして例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、ま たは相補DNAもしくは相補RNAの組換え発現、または化学合成によって生成され得 る。 本明細書中の「調節配列」は、遺伝子配列がそれを調節配列の制御に供するよ うな位置におかれた場合、遺伝子配列の発現（その転写または翻訳を含む）を変 調またはそれに影響し得る１つ以上のエレメントをコードする核酸配列をいう。 このような調節配列は、例えば、最小プロモーター配列、完全プロモーター配列 、誘導性活性プロモーター、エンハンサー配列、上流活性化配列（「UAS」）、 オペレーター配列、下流終結配列、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を最適化す る最適な5'リーダー配列、またはShine-Dalgarno配列であり得る。あるいは、調 節配列は、上記の任意のプロモーターのハイブリッド（例えば、ハイブリッドエ ン ハンサー／プロモーターエレメント）を含み得る。目的の遺伝子の発現に適切な 調節配列は、構築物が発現されるべき宿主系に依存して異なる。本明細書中での 使用に適切な調節配列の選択は、当業者の能力の範囲内である。真核生物では、 例えば、このような配列は、プロモーター配列および／または転写終結配列の１ つ以上を含み得る。本明細書中での使用に適切な調節配列は、原核生物供給源、 真核生物供給源、ウイルス、ウイルスベクター、バクテリオファージ、または線 状もしくは環状のプラスミドを含む任意の供給源に由来し得る。本明細書中での 調節配列はまた、合成された配列、例えば、ある遺伝子のUASと別の遺伝子由来 の必須のプロモーターの残りとの組合せにより作製される配列（例えば、GADP／ ADH2ハイブリッドプロモーター）であり得る。調節配列はまた、リプレッサー配 列であり得る。 本明細書中で用いられる用語「組織マーカー」は、細胞または組織において発 現される任意のタンパタ質またはそのフラグメントであって、そのタンパク質ま たはフラグメントの発現によりその細胞または組織を同定するものをいう。組織 マーカーは、分化因子を検出または同定するために本明細書中で有用である。分 化因子が候補因子のプールから求められる場合、応答性細胞は、アッセイに用い られる細胞に特異的な組織マーカーの転写または翻訳の増加についてアッセイさ れる。本発明を実施するために、アッセイされるべき組織マーカーまたは遺伝子 は既知である必要はないが、既知の組織マーカーが存在する場合には、これらは 、分化を担う分化因子のスクリーニングのために用いれら得る。この目的のため に用いられ得るいくつかの組織マーカーは、組織特異的または細胞特異的な様式 で発現される遺伝子（既知および未知の遺伝子の両方を含む）を含む。本発明は 、mRNAディファレンシャルディスプレイの使用によって未知の遺伝子を検出する ための手段を含む。分化因子のスクリーニングに使用され得る組織マーカーは、 例えば、ニューロン特異的エノラーゼ(Forss-Petterら、（1990）Neuron 5:187- 197に記載される)；インシュリン；誘導性一酸化窒素シンターゼ；インターフェ ロン調節因子１；インターフェロン調節因子２；インターフェロン-刺激性遺伝 因子-3γ(ISGFR3γ)；ブラチュリー(brachyury)；グースコイド(goosecoid)；筋 肉アクチン；およびIVCAMを含むが、これらに限定されない。他の組織マーカー は、 タンパク質ホルモン、サイトカイン、細胞接着分子、プロテアーゼ、血清結合タ ンパク質、ヒドロキシラーゼのような酵素、ニューロン特異的タンパク質、細胞 表面レセプター、および免疫系に特異的なタンパク質であり得る。 遺伝子発現を変調する転写的事象のための「マーカー」は、その転写が変調因 子の結果として変調される任意の遺伝子の転写レベルの変化を含み得る。このよ うなマーカーは、例えば、即時初期遺伝子、サイトカイン、転写因子、タンパク 質ホルモン、シグナリング分子、アポトーシスの遺伝子、オンコジーン、原ガン 遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、炎症に関連する遺伝子、造血遺伝子、神経シ グナリングおよび活性に関連する遺伝子、ならびに一般に別の遺伝子の活性によ って誘導されることが知られているか、または考えられている任意の遺伝子を含 み得るが、これらに限定されない。さらに、ニューロン特異的エノラーゼを含む ニューロンインデューサー因子、インスリンインデューサー因子、インターフェ ロン調節因子Ｉ、インターフェロン調節因子２、インターフェロン刺激性遺伝子 因子３γ、ブラチュリーおよびグースコイドのような中胚葉インデューサー、な らびに筋肉アクチンおよびIV CAMのようなニューロン組織インデューサー。この ようなマーカーのいくつかの特定の例には、例えばIL-2、IL-6、NFKBエレメント 、A20(アポトーシス遺伝子)、誘導性一酸化窒素シンターゼ、c-fos、c-myc、イ ンターフェロン、βグロビン、ペリフェリン(peripherin)、p48を含むインター フェロン誘導性エレメント、IRF-1、CIS、およびOSMが含まれる。他の潜在的な マーカーは、例えば、FaisstおよびMeyer、Nucleic Acids Research，20(1);3-2 6(1992)に記載され、これはその全体が本明細書中で参考として援用される。ア ッセイにおける使用のためのマーカーとして作用し得るなおさらなる遺伝子は、 その全体が参考として援用されるDamelら、MOLECULAR CELL BIOLOGY，Scientifi c American Books，NY，1990，408頁に列挙されている。転写的事象の遺伝子マ ーカーの別の例は、DhawaleおよびLane、Nucleic Acids Research，v.21(24):55 37-5546(1993)（これもまた、その全体が参考として援用される）に記載される ものを含む。可能なマーカーのなお他の例には、Wingender，Nucleic Acids Res ．16(5)1880-1992(1988)、BustinおよびMcKay，Brit J．Biomed．Sci．51:147-1 57(1994)、PetersonおよびTupy，Biochem．Pharm 47:127-128(1994)、およびGho sh， Nucleic Acids Research，20補遺：2091-2093(1993)に記載されるものが含まれ 、これら全てが参考としてその全体が援用される。 因子、または発現されたかもしくは変調された遺伝子の産物の文脈において本 明細書中で用いられる用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、「成熟タ ンパク質」ならびに、成熟タンパク質の短縮体(truncation)、改変体、対立遺伝 子、および誘導体であるその「アナログ」を含む。別の方法で特に言及されない 限り、「アナログ」は、「成熟タンパク質」の１つ以上の生物活性を有する。し たがって、ヒトまたは非ヒト供給源のいずれにも由来する成熟タンパク質のアミ ノ酸配列に同一であるか、少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80 ％、そして最も好ましくは90％のアミノ酸相同性を含むポリペプチドは、この定 義内に含まれる。 本明細書中の「改変体」は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む。アミ ノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸残基を排除するための置 換（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、アセチル化部位の変更、または 機能には必要でない１つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失によるミスフ ォールディングの最小化）であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミ ノ酸の一般的な電荷、疎水性/親水性、および/または立体的かさを保存する置換 である。例えば、以下の群のメンバー間の置換は、保存的置換である：Gly/Ala 、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Cys/Thr、およびPhe/Trp/Tyr 。本明細書中のアナログは、１つ以上のペプチド模倣物（mimic）を有するペプ チド（ペプトイドとしても知られ、タンパク質の生物活性を有する）をさらに含 む。１つ以上のアナログアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、置換 された連結を有するポリペプチド、および当該分野で公知の他の改変体（天然に 存在するものおよび非天然に存在するものの両方）が、定義の範囲にまた含まれ る。用語ポリペプチドはまた、発現後のポリペプチドの改変（例えば、グリコシ ル化、アセチル化、リン酸化など）を除外しない。 本明細書中で用いられる用語「同時培養する」は、１つより多い細胞型を一緒 に培養する状態をいう。例えば、スクリーニングアッセイにおける同時培養は、 産生細胞と応答細胞と一緒であり得る。ここで、産生細胞は主に応答細胞とは異 なる。なぜなら産生細胞は、産生細胞中へ導入されたcDNAまたはcRNAからタンパ ク質を発現しそして分泌するためである。同時培養はまた、例えば、Xenopus細 胞と哺乳動物細胞との間、または２つの異なる哺乳動物細胞との間、または同一 種もしくは異種の他の細胞の間で起こり得る。本発明の独特の特徴は、Xenopus 卵母細胞と哺乳動物細胞とを同時培養する能力を達成したことである。この方法 論は後述されるが、温度制御および同時培養時間の制御を含む。本発明における 細胞の同時培養の有用性は、同じ培地で培養される応答細胞に作用し得る因子を 発現および分泌する産生細胞の能力である。 本明細書中で使用される単語「発見された」は、その因子が以前にその変調を 促進するかまたは引き起こし得る因子として知られていなかった遺伝子の発現を 変調し得る因子の同定である。例えば、増殖因子として発見された因子は、以前 から公知の因子であり得るが、その発見とは、その因子が増殖を変調し得るとい うことであり、以前には知られていなかった事実である。 本発明の１つの実施態様において、方法は、新規の因子（例えば、増殖因子） を検出または同定またはスクリーニングするために利用される。これは、応答性 細胞の集団を用いて試験されるべき候補因子（単数または複数）間に接触を作製 することにより、そしてこのような接触に対する細胞内の応答を捜すことにより なされ得る。候補因子は、低分子ライブラリーの場合のように応答性細胞を含む 培地に添加され得るか、または１つ以上の産生細胞の発現産物であり得るかのい ずれかである。産生細胞は、候補因子を天然に産生する細胞であり得るか、また は候補因子をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAもしくはRNA）で形質転 換された細胞であり得る。 従って、産生細胞は、ポリヌクレオチドを導入することによって候補因子を産 生するために作製され得る。ポリヌクレオチドは、任意の従来の方法（例えば、 エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、およびリポフェクタミン(lip ofectamine）トランスフェクションのようなトランスフェクションを含む）によ って産生細胞中へ導入され得る。本発明の１つの実施態様において、ポリヌクレ オチドは、産生細胞におけるポリヌクレオチドの発現に適切なベクターまたはプ ラスミドに挿入される。ベクターまたはプラスミドは、独立して複製し得るもの であり得るか、または宿主ゲノム中へ組み込み得るものであり得る。 候補因子をコードするポリヌクレオチドは、公知の供給源から単離され得る公 知のフラグメントであり得るか、または例えば、cDNAライブラリー、cRNAライブ ラリー、またはゲノムDNAライブラリーを含むプラスミドに由来するポリヌクレ オチドのプール由来であり得る。従来のリンカーまたはポリリンカーは、候補因 子をコードするポリヌクレオチドを含むこのようなベクターの構築において用い られ得る。 １つ以上の産生細胞は、本発明において用いられ得る。一例として、Xenopus laevis卵母細胞は、本明細書中で産生細胞として用いられ得る。産生細胞として 選択されるべき細胞型は、同定またはスクリーニングされるべき因子に依存する 。例えば、候補因子が真核生物細胞DNAライブラリー中にある場合、産生細胞は 、好ましくは真核生物細胞である。産生細胞が形質転換されて候補因子を産生す る場合、好ましくは、候補因子をコードするポリヌクレオチドを含む安定な細胞 株がまず得られ、そしてこのような細胞株の子孫が本発明の方法において用いら る。あるいは、１つ以上の産生細胞が、ポリヌクレオチドライブラリーを含むプ ラスミドで形質転換され得、そしてその産生細胞が、本発明の方法において用い られ、このようなライブラリーを発現し得る。 産生細胞または応答細胞もしくは応答性細胞は、任意の生物に由来する細胞で あり得る。これらの細胞には、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞を含む菌類細胞 、昆虫細胞、鳥類細胞、蠕形動物細胞、魚類細胞、甲殻類細胞、は虫類細胞、両 生類細胞、細菌細胞、および植物細胞が含まれる。求められる因子による遺伝予 発現の変調の読み出し（readout）として用いられる遺伝子はまた、任意の生物 に由来する遺伝子であり得る。それらの生物には、例えば哺乳動物、酵母を含む 菌類、昆虫、鳥類、蠕形動物、魚類、甲殻類、両生類、は虫類、細菌、および植 物が含まれる。 本明細書中の応答細胞または応答性細胞はまた、スクリーニングまたは同定さ れるべき因子に基づいて選択される。例えば、ヒト増殖因子が検出されるのであ れば、応答性細胞は好ましくはヒト細胞である。応答性細胞が、例えば候補レセ プターを産生するために形質転換されるのであれば、候補レセプターを含む安定 な細胞株が選択され、そしてその子孫が本発明の方法において用いられ得る。あ るいは、応答性細胞の集団は、例えばポリヌクレオチドライブラリーを含むプラ スミドで形質転換され得、そしてこのような応答性細胞の集団は、本発明の方法 において用いられ得、そしてこの細胞は、このようなライブラリーを発現し得る 。 本明細書中の産生細胞または候補因子と応答性細胞との間の必要な接触は、因 子または産生細胞の存在下で、応答性細胞の生存に適し、かつ転写、翻訳、シグ ナル伝達、または他の細胞内活性が起こるのに適した温度で、応答性細胞を培養 することにより達成される。従って、血清、組織、または細胞抽出物はまた、こ のような血清、組織、または細胞抽出物が候補の供給源である場合、このような 培養物中で用いられ得る。細胞は、適切な容器またはディッシュ、あるいは好ま しくはマイクロタイタープレートのマイクロウェル中で、細胞内事象が起こるた めに適切な時間インキューベートされ得る。 応答性細胞中での候補因子に対する細胞内事象または応答は、このような応答 を検出するために十分に感度の高い任意の適切な手段（好ましくは、転写活性ま たは翻訳活性を検出するためのbDNAアッセイ、およびリン酸化を検出するための 抗体アッセイ）により検出され得る。検出はまた、RT-PCRまたはRNase保護アッ セイの使用により達成され得る。一般的に転写物レベルの変化の検出は、初期細 胞内事象の検出のために用いられ得る。なぜなら、転写の変化は、所与の遺伝子 の翻訳、発現、またはタンパク質活性の前に起こるからである。転写の変化の検 出はまた、転写レベルでの非常にわずかな変化を伴うシグナルを提供する転写の 検出システムの能力により、可能な最も感度の高い検出を提供する。 検出手段は、その変調が有意である、目的の遺伝子に標的化される。そのため 、例えば、分化因子が求められる場合、例えば、分化に関連する遺伝子が標的遺 伝子であり、阻害因子が求められる場合、細胞増殖の阻害に関連する遺伝子が求 められ、そしてレセプターに対するリガンドが求められる場合、増大したレセプ ター活性によって生ずると考えられる増大した活性に関連する遺伝子が求められ る。遺伝子の転写レベルの増大または減少を検出することによって、求められる 因子を検出するための読み出しとして用いられ得るこれらの遺伝子のうちのいく つかの例は、例えば、MOLECULAR AND CELL BIOLOGY，Darnellら、編、Scientifi c Am erican Books，N.Y．1990，FraisstおよびMeyer，Nucleic Acids Research，第2 0刊、(1)3-26(1992)，DhawaleおよびLane，Nucleic Acids Research，第21刊、 （24）5537-5546(1993)に記載されている。 レセプターが求められる場合、候補レセプター分子は、cDNA、cRNA、またはゲ ノムDNAのライブラリーから、産生細胞または応答性細胞のいずれかにおいて、 好ましくはそれらの表面上で発現され得る。候補レセプター分子が産生細胞にお いて発現される場合、応答性細胞もまた、産生細胞でのレセプター分子と相互作 用するレセプター分子を発現し得、このような相互作用は、応答性細胞における 細胞内事象を誘発する。候補レセプターが応答性細胞において発現される場合、 産生細胞は、レセプター分子と相互作用するリガンドを発現し得、応答性細胞に おける細胞内事象を誘発する。 転写因子が求められる場合、レセプターのためのスクリーニングと同様に、産 生細胞および応答性細胞は、同一の細胞であり、そして転写因子は、スクリーニ ングされるライブラリーから産生される非分泌因子の中から求められる。 細胞内事象は、遺伝子の転写の増大かもしくは減少であり得、または、例えば リン酸化もしくはＧタンパク質シグナリングのようなシグナル伝達事象であり得 る。 求められる因子に応答した転写の増大または減少についての遺伝子が既知の場 合、遺伝子の転写の変化の検出は、例えば、米国特許第5,451,503号およびWO 92 /02526に開示されるようなbDNA技術によって達成される。選択されるbDNAは、そ れについての転写の増大または減少が予想される応答性細胞において発現された 遺伝子に対してである。そのため、増殖因子が求められる場合、c-fos転写に対 するbDNAが、c-fos遺伝子転写の増大を検出するために用いられる。また例えば 、インヒビターが求められる場合、IL-2転写に対するbDNAは、IL-2を発現する応 答細胞におけるIL-2転写の減少を検出するために用いられ得る。例えば、リガン ドが求められる場合、遺伝子の転写のアップレギュレーションまたはダウンレギ ュレーションを伴うリガンド/レセプター結合対に応答する応答性細胞が用いら れ得る。そして、その遺伝子転写物に対するbDNAが、ポジティブを検出するため に用いられ得る。例えば、レセプターに対するアンタゴニストが求められる場合 、 応答性細胞は、アンタゴニスト/レセプター結合対に対して、リガンド/レセプタ ー結合対によって通常アップレギュレートされる遺伝子のダウンレギュレーショ ンを伴って応答し、そしてこの転写の減少が、調節された遺伝子に対するbDNAに よって検出される。 例えば、調節配列において作用する転写因子が求められる場合、調節配列はレ ポーター遺伝子か、または調節配列が通常調節する遺伝子に連結される。そして 、レポーター遺伝子または天然の遺伝子に対するbDNAを用いて、候補の特定のプ ールにおける転写因子の存在を検出する。本発明の目的に用いられ得るレポータ ー遺伝子には、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ（βGal）、クロラムフェ ニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、グリーン蛍光タンパク質（GFP） 、および分泌性アルカリホスファターゼ（SEAP）が含まれるが、これらに限定さ れない。本発明の機能に適切な他のレポーター遺伝子は、当該分野で公知であり 、かつ使用されている。 例えば、リガンドに対するレセプターが求められる場合、結合対が調節する遺 伝子に対するbDNAを用いて、リガンドの検出について記載されたように産生細胞 /応答細胞の表面上のレセプターの存在を検出する。 細胞内事象の検出のための他の手段であって、その事象が遺伝子の転写の増大 または減少である手段には、RNase保護アッセイおよびRT-PCRが含まれ、この両 方がSambrookらおよびAusubelら（前出）に記載される。これらのプロトコルは 、刺激因子、阻害因子、リガンド、レセプター、レセプターに対するアンタゴニ スト、および転写因子が求められる状況についての遺伝子の転写の増大または減 少を検出するために、上記のbDNAアッセイについて記載されたものと基本的に同 じ様式で適用される。 アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子が未知である場合 には、RT-PCRの使用のための特別の状況が、本発明に適用される。このプロセス はmRNAディファレンシャルディスプレイシステムと呼ばれる。このプロセスは、 米国特許第5,262,311号およびLiangら（1992）Science 257:967-971に開示され 、そしてGenHunter CorporationによってRNAimage^TMの商品名のもとに製造され ている。この技術が本発明においていかに有用であるかの一例は、応答性細胞が 増殖 の増加に関して血清に応答する場合である。これらの応答性細胞は、血清ととも にインキュベートされ、そしてランダムプライマーを用いるRT-PCRを用いて、RT -PCR産物のディファレンシャルディスプレイによって、血清によってアップレギ ュレートされる遺伝子を同定する。その遺伝子は、RT-PCR産物から配列決定され 、そしてbDNAプローブが、配列情報からその遺伝子について作製される。次いで 、本発明は以前に記載のように進行する：血清が細分され、応答細胞が血清プー ルの存在下で培養され、ポジティブがbDNAアッセイ（またはRNase保護アッセイ またはRT-PCR）によって検出され、そして増殖因子が最終的に単離される。 レセプター、またはリガンド、またはレセプターに対するアンタゴニストが求 められ、そして細胞内事象がシグナル伝達である場合、そのシグナル伝達を検出 するためのアッセイを使用して、リガンド/レセプター結合対またはアンタゴニ スト/レセプター結合対を検出する。シグナル伝達を検出するためのこのような 方法は、Pasqualeら「cDNA発現ライブラリーをスクリーニングするために抗ホス ホチロシン抗体を用いることによる発生的に調節されたタンパク質であるチロシ ンキナーゼの同定」Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，1989 Jul，86(14):5449-53に開示されるように、シ グナル伝達における中間体のリン酸化の検出を含む。 本発明はまた、患者の初代細胞が、例えば、取り出され、そして提起された治 療剤の使用の有効性についてのアッセイによってスクリーニングされる状況にお いて用いられ得る。従って、例えば、冒された器官の組織または腫瘍組織からの 患者の細胞が取り出され、異なる治療剤の存在下で培養され、そして所望の変調 効果が、例えば分枝DNAまたはRT-PCRを用いた標的遺伝子転写物の検出によって スクリーニングされる。このアプローチは、薬剤の実際の投与前の、所定の個々 の患者についての適切な治療剤の迅速な評価を容易にし得る。このスクリーニン グアッセイは迅速なので、患者の効果的な処置を始めるのに時間はほとんど失わ れない。このアプローチはまた二次的なスクリーニングとして使用して、提起さ れた治療剤を患者の集団の細胞におけるその効果について試験し得、従って、特 定の治療剤の成功の可能性を示す二次的なしかし臨床前のアッセイを提供する。 本発明を実施するために、候補刺激因子、阻害因子、候補レセプター、候補リ ガンド、候補転写因子、またはレセプターに対する候補アンタゴニストの供給源 がまず選択される。アッセイは、例えば、96マイクロウェルのプレート各々にお いて実施され得る。候補物の供給源は、100〜1000の産生細胞が各プールを成す ようにプールに分割される。スクリーニングされる候補物について適切であり、 そして同定されるべきか、または検出されるべき遺伝子を発現し得る応答性細胞 が選択される。 レセプターが求められる特定の場合には、応答性細胞は産生細胞でもあり、そ してその両方が、求められるレセプターを発現し、そしてリガンド/レセプター 結合対に応答する。本発明の方法によって求められ得るレセプターには、リガン ド（例えば、Noggin，Wnt、およびNotch）に対するレセプターが含まれる。 求められる因子が応答エレメントで作用するか、または応答エレメントで作用 する因子を刺激するように作用する場合、調節エレメントが通常調節する遺伝子 か、またはレポーター遺伝子のいずれかに連結した目的の遺伝子の調節配列を含 む構築物が、調節配列の制御下で遺伝子を発現し得る適切な応答性細胞中へ安定 にトランスフェクトされる。この細胞株は、応答性細胞の供給源となる。調節エ レメントにおいてアップレギュレートまたはダウンレギュレートする転写因子に ついてアッセイするために、応答性細胞が、候補因子のライブラリー（例えば、 ライブラリーによって形質転換された産生細胞によって発現および分泌されるラ イブラリー）とともにインキュベートされる。転写の変化の検出は、例えば、レ ポーター遺伝子検出アッセイ、レポーター遺伝子に対するbDNA、または調節エレ メントの調節制御下の遺伝子に対するbDNAによって達成される。本発明の方法に よってアッセイされて応答エレメントを活性化する因子を見出し得る他の例示的 な応答エレメントであって、それについてこれらの応答エレメントで作用する転 写因子についての限定された知識が現在存在するエレメントは、NFKB応答エレメ ント、インターフェロン応答エレメントすなわちpIRE、インターフェロン刺激応 答エンハンサーすなわちISRE、インターフェロンγ活性化配列すなわちGAS、な らびに以下の調節される遺伝子のプロモーター、エンハンサー、およびリプレッ サーを含む調節配列である：ニューロン特異的エノラーゼ、インスリン、誘導性 一酸化窒素シンターゼ、インターフェロン調節因子１、インターフェロン調節因 子２、インターフェロン刺激性遺伝子因子３γ（ISGFR3γ）、ブラチュリー、グ ースコイド、筋肉アクチン、細胞接着分子-４、またはIVCAM。一般に、任意の調 節エレメントが、これらを制御する因子を同定するために本発明によってアッセ イされ得る。 遺伝子転写のスティミュレーターおよびインヒビター、リガンド、ならびにレ セプターに対するアンタゴニストは、低分子ライブラリーから求められ得る。刺 激されるかまたは阻害されるよう求められる遺伝子を発現する応答性細胞が選択 されるか、あるいは細胞表面上でのリガンド/レセプター結合対相互作用に応答 してシグナル伝達を発現し得る応答性細胞が選択される。応答性細胞が、低分子 のプールの存在下でインキュベートされる。ポジティブが、低分子スティミュレ ーター、インヒビター、リガンド、またはアンタゴニストが同定されるまで細分 される。 本発明は、任意の遺伝子の刺激因子または阻害因子を捜すために使用され得る 。スティミュレーターまたはインヒビターが求められ得、そして本発明の方法に よって求められ得る遺伝子のいくつかは、例えば、細胞外分子（例えば、タンパ ク質ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、分化因子、細胞外マト リックス分子、ならびに転写因子および細胞表面レセプターまたは核レセプター を含む細胞外分子シグナリング分子）を含む。細胞外因子が求められる場合、分 泌された因子はスクリーニングされ、そして細胞内分子が求められる場合、産生 細胞および応答性細胞は、同一の細胞内のものである。これらの分類のいくつか の特定の例には、遺伝子産物IL-2、c/EBPα、サイクリンＤ、obタンパク質、A20 タンパク質、細胞接着分子１(ICAM-1)、およびサイトカイン（例えば、TNF、IL- 2、IL-3、IL-6、IL-8）によって誘導される他のタンパク質の遺伝予産物；c-fos および他の増殖マーカー、増殖因子（例えば、PDGF、EGF、およびKGF）によって 誘導されるタンパク質、ならびに神経成長因子（NGF）のような分化因子が含ま れる。 その遺伝子の発現が、遺伝子発現を変調する因子を検出するためのスクリーニ ングアッセイにおいて用いられ得る遺伝子は、DNA結合タンパク質、疾患マーカ ー、増殖マーカー、分化マーカー、アポトーシスマーカー、転移マーカー、疾患 の後期発症に関連するマーカー、およびオンコジーンをコードする遺伝子であり 得る。 変調因子がそれについて求められる全ての遺伝子について、目的の遺伝子は、 その因子のための検出システムのための標的として用いられ得るか、または、そ の発現の変調が目的の遺伝子の変調に関連している別の遺伝子もまた用いられ得 る。 以下の節は、本発明において用いられ得る発現の例示的な方法、本発明におけ る産生細胞または応答性細胞のいずれかであり得る細胞、およびcDNA、cRNA、も しくはゲノムDNAまたは低分子のライブラリーが構築されて、増殖因子、分化因 子、転写因子、または阻害因子、リガンド、レセプター、またはレセプターのア ンタゴニストの供給源を提供し得る方法を記載する。候補因子のcDNAライブラリ ーは、所望の任意のゲノムから生成され得る。ポリＡ＋mRNAが、選択された細胞 または組織から単離され、そしてcDNAが、逆転写酵素を用いてRNAから作製され る。次いで、生成されたcDNAのプールがベクター中へ連結され、このベクターは そのベクターに適切な細胞中へ形質転換され得る。その細胞には、例えば、本明 細書中に列挙される細胞、特に細菌細胞が含まれる。当業者は、このようなベク ターおよび宿主細胞をこのような目的のために選択し得る。プールは、例えば、 プール当たり100〜1000の細胞のコロニーから作製される。適切なベクターおよ び宿主細胞の例が以下に記載される。cDNAを含むベクターが、例えば、本明細書 中に列挙される細胞のような宿主細胞中へ、従来の技術（エレクトロポレーショ ン、リン酸カルシウム処理、リポフェクタミントランスフェクション、およびマ イクロインジェクションを含む）によって導入される。 その転写の変調が検出手段により検出され得る遺伝子または標的遺伝子は、任 意の遺伝子であり得、その発現の変調が、因子が求められる様式での変調因子で あることの指標である。従って、例えば、細胞増殖を生じる遺伝子発現を変調し 得る因子が求められる場合、その標的遺伝子は、細胞増殖の前かまたはそれと同 時に増大したレベルの転写を示す遺伝子である。そのため、例えば、DNA結合タ ンパク質、疾患マーカー、増殖マーカー、分化マーカー、アポトーシスマーカー 、転移マーカー、疾患の後期発症に関連するマーカー、およびオンコジーンをコ 一 ドするこのような遺伝子は、本発明の目的のための標的遺伝子であり得、そして この遺伝子の転写レベルは、目的の遺伝子の発現を変調し得る因子を同定する目 的のために本発明によって検出され得る。目的の遺伝子は、標的遺伝子であり得 るか、またはその発現の変調が標的遺伝子の発現の変調に関連するかまたはそれ によって生じる遺伝子であり得る。また、例として、標的遺伝子であって、その 変調が本発明によって検出される遺伝子は、レプチンタンパク質、およびA20タ ンパク質、ICAM、c-fosタンパク質、c-mycタンパク質、ならびにその他をコード する遺伝子であり得る。 一旦プールがポジティブな因子を含むことが同定されると、そのプールは、例 えば10個のサブプールに細分されて、そして再びスクリーニングされる。これら のサブプールからのポジティブプールは、ポジティブプールが１つの単一のコロ ニー（これはポジティブ応答を生成する因子のクローンを示す）を生成するまで 、例えば、10個のサブプールなどに細分化される。このクローンは、プラスミド のベクターの調節制御下にあり、そして因予のcDNAに連結したベクターの5'およ び3'末端に相補的なプライマーを用いてこのベクターから配列決定され得る。コ ロニーはまた、ベクターから単離され得、そして適切な宿主細胞において因子を コードするポリペプチドの大規模産生のために発現カセット中へ置かれ得る。ベ クターおよび宿主細胞および発現カセットは、当該分野で入手可能な材料から選 択される。一旦因子が単離され、そしてcDNAが配列決定されると、因子およびそ の調節配列をコードする全長遺伝子がゲノムDNAから求められ得る。発現系 以下に記載の方法論は、当業者が本発明を実施し得るために十分な詳細を含む と考えられるが、詳細に例示されていない他のもの（例えば、プラスミド）は、 標準的な組換えDNA技術(例えば、Sambrookら、(1989)，MOLECULAR CLONING:A LA BORATORY MANUAL，第２版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N. Y.))およびAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994),(Green e Publishing AssociatesおよびJohn Wiley & Sons，New York，N.Y.により記載 される）を用いて、アメリカ合衆国保健教育福祉省の、組換えDNA研究のた めの国立衛生研究所(NIH)ガイドラインに記載される現在の規則に基づいて、構 築および精製され得る。これらの参考文献は、以下の標準的な方法の手順を含む ：プラスミドを用いたクローニング手順、宿主細胞の形質転換、細胞培養、プラ スミドDNA精製、DNAのフェノール抽出、DNAのエタノール沈澱、アガロースゲル 電気泳動、アガロースゲルからのDNAフラグメントの精製、および制限エンドヌ クレアーゼ、ならびに他のDNA修飾酵素反応。 リガンドが、応答性細胞の表面上に発現される候補レセプターを活性化するた めに構築されなければならない場合、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の発現系 について以下のように記載される発現の標準的な方法が使用され得、そしてこれ らの発現系は、リガンド（次いでこれは精製される）を発現するための産生細胞 として、または非拡散性リガンドを発現して応答性細胞を接触させるための産生 細胞としてのいずれかで使用され得る。以下の発現系はまた、cDNAまたはcRNAラ イブラリーの構築に適用可能であり、ここで分泌されたタンパタ質は、応答細胞 において遺伝子発現を変化させるそれらの能力についてスクリーニングするため に産生される。発現系はまた、調節エレメントに作用することにより刺激するか 、または阻害する因子の同定のためのレポーター遺伝子と連結した調節エレメン トの構築に適用可能である。以下の細胞は、応答性細胞、または候補因子のライ ブラリーが生成される細胞（産生細胞とも呼ばれる）の両方として適切である。細菌細胞における発現 細菌における使用のための制御エレメントには、プロモーター(必要に応じて 、オペレーター配列を含む)、およびリボソーム結合部位が含まれる。有用なプ ロモーターには、糖代謝酵素(例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、および マルトース)由来の配列が含まれる。さらなる例として、生合成酵素(例えば、ト リプトファン(trp)、βラクタマーゼ(bla)プロモーター系、バクテリオファージ λPL、およびT7)由来のプロモーター配列が挙げられる。さらに、tacプロモータ ーのような合成プロモーターが使用され得る。βラクタマーゼおよびラクトース プロモーター系は、Changら、Nature（1978）275:615、およびGoeddelら、Natur e（1979）281:544に記載され；アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp) プ ロモーター系は、Goeddelら、Nucleic Acids Res．(1980)8:4057およびEP 36，7 76に記載され、そしてtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターは、 米国特許第4,551,433号、およびde Boerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1983 ）80:21-25に記載される。しかし、真核生物タンパク質の発現に有用な他の公知 の細菌プロモーターもまた、適切である。当業者は、このようなプロモーターを 、例えば、Siebenlistら、Cell(1980)20:269に記載されるように、任意の必要な 制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、目的のコード 配列に作動可能に連結し得る。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、一 般に、標的ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されているシャイン ダルガーノ(SD)配列を含む。天然の標的ポリペプチドシグナル配列を認識せずそ してプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば 、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロト キシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換され得 る。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であ る。 前述の系は、特にEscherichia coliに適合する。しかし、細菌宿主での使用の ための多数の他の系には、とりわけ、Bacillus spp.、Streptococcus spp.、Str eptomyces spp.、P．aeruginosaのようなPseudomonas種、Salmonella typhimuri um、またはSerratia marcescansのようなグラム陰性またはグラム陽性生物が含 まれる。外来DNAをこれらの宿主に導入するための方法には、代表的には、CaCl₂ 、または２価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤の使用が挙げられる。DNAは また、Sambrookら、（1989）(前出)に一般的に記載される、エレクトロポレーシ ョン、核注入、またはプロトプラスト融合によって細菌細胞中に導入され得る。 これらの例は、例示であって、限定しない。好ましくは、宿主細胞は、最少量の タンパク質分解酵素を分泌する。あるいは、クローニングのインビトロ方法(例 えば、PCRまたは他の核酸ポリメラーゼ反応)が適切である。 本発明の標的ポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、上記 で引用されたSambrookら（前出）に一般的に記載されるように、適切な培地中で 培養される。酵母細胞における発現 発現ベクターおよび形質転換ベクター(染色体外レプリコンまたは組み込みベ クターのいずれか)が、多くの酵母中への形質転換のために開発されている。例 えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母について開発されている：Hinnen ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1978）75:1929;Itoら、J．Bacteriol．(1983 )153:163に記載されるSaccharomyces cerevisiae;Kurtzら、Mol．Cell．Biol．( 1986)6:142に記載されるCandida albicans；Kunzeら、J．Basic Microbiol．(19 85)25:141に記載されるCandida maltosa；Gleesonら、J．Gen．Microbiol．（19 86）132:3459およびRoggenkampら、Mol．Gen．Genet．(1986)202:302に記載され るHansenula polymorpha；Dasら、J．Bacteriol．(1984)158:1165に記載されるK luyveromyces fragilis；De Louvencourtら、J．Bacteriol．(1983)154:737およ びVan den Bergら、Bio/Technology(1990)8:135に記載されるKluyveromyces lac tis;Kunzeら、J．Basic Microbiol．(1985)25:141に記載されるPichia guilleri mondii；Creggら、Mol．Cell．Biol．(1985)5:3376および米国特許第4,837,148 号および同第4,929,555号に記載されるPichia pastoris；BeachおよびNurse，Na ture（1981）300:706に記載されるSchizosaccharomyces pombe；ならびにDavido wら、Curr．Genet．(1985)10:380およびGaillardinら、Curr．Genet.(1985)10:4 9に記載されるYarrowia lipolytica、Ballanceら、Biochem．Biophys．Res．Com mun．(1983)112:284-289；Tilburnら、Gene（1983）26:205-221およびYeltonら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1984）81:1470-1474に記載されるA．nidulans 、およびKellyおよびHynes，EMBO J．(1985)4:475479に記載されるA．nigerのよ うなAspergillus宿主；EP 244,234に記載されるTrichoderma reesia、ならびにW O 91/00357に記載される、例えば、Neurospora，Penicillium，Tolypocladiumの ような糸状菌。 酵母ベクターのための制御配列は、公知であり、そしてEP 284,044に記載され るアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、EP 329,203に記載されるエノラーゼ、グ ルコキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド- 3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホ フルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルベートキナーゼ （PyK）のような遺伝子由来のプロモーター領域を含む。酵母PH05遺伝子(酸性ホ スファターゼをコードする)はまた、Myanoharaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA （1983）80:1に記載されるように、有用なプロモーター配列を提供する。酵母宿 主での使用に適切な他のプロモーター配列としては、Hitzemanら、J．Biol．Che m．(1980)255:2073に記載される3-ホスホグリセレートキナーゼ、またはHessら 、J．Adv．Enzyme Reg．(1968)7:149およびHollandら、Biochemistry(1978)17:4 900に記載される、他の解糖酵素(例えば、ピルベートデカルボキシラーゼ、トリ オースホスフェートイソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ)のプ ロモーターが挙げられる。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有 する誘導性酵母プロモーターとしては、上記のリストおよび他(アルコールデヒ ドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連す る分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロ ゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモータ ー領域を含む)に由来するプロモーターが挙げられる。酵母発現での使用に適切 なベクターおよびプロモーターは、Hitzeman、EP 073,657にさらに記載される。 酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。さらに 、天然には存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能す る。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列(UAS)は、別の酵母プロ モーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製 し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例として、米国特許第4,876,19 7号および同第4,880,734号に記載される、GAP転写活性化領域に連結されたADH調 節配列が挙げられる。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、EP 164,556 に記載される、GAPまたはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と合わせ られた、ADH2、GAL4、GAL10、またはPH05遺伝子のいずれかの調節配列からなる プロモーターが挙げられる。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラー ゼに結合しそして転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロ モーターを含み得る。 酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御エレメントは、例えば、Hollandら、J ． Biol．Chem．(1981)256:1385に記載される、GADPH由来およびエノラーゼ遺伝子 由来のターミネーター、および分泌のためのシグナル配列をコードするリーダー 配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、EP 012,873およびJP 62,0 96,086に記載される酵母インベルターゼ遺伝子、ならびに米国特許第4,588,684 号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号、ならびにEP 324,274、およWO 8 9/02463に記載されるα因子遺伝子のような分泌酵母タンパク質の遺伝子に由来 し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーは また、EP 060,057に記載されるように、酵母での分泌を提供する。 外来DNAを酵母宿主に導入する方法は、当該分野で周知であり、そして代表的 には、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理したインタクトな酵母細 胞の形質転換のいずれかを含む。 酵母への形質転換は、Van Solingenら、J．Bact．(1977)130:946およびHsiao ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1979）76:3829に記載される方法に従って行 われ得る。しかし、細胞へDNAを導入するための他の方法(例えば、核注入、エレ クトロポレーション、またはプロトプラスト融合)もまた、一般に、Sambrookら 、(前出)に記載されるように使用され得る。 酵母分泌のために、天然の標的ポリペプチドシグナル配列が、酵母インベルタ ーゼ、α因子、または酸性ホスファターゼリーダーによって置換され得る。２μ プラスミド起点由来の複製起点は、酵母に適切である。酵母での使用に適切な選 択遺伝子は、Kingsmanら、Gene（1979）7:141またはTschemperら、Gene（1980） 10:157に記載される酵母プラスミド中に存在するtrp1遺伝子である。trp1遺伝子 は、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の変異株のための選択マーカーを提 供する。同様に、Leu2-欠損酵母株(ATCC 20,622または38,626)が、Leu2遺伝子を 保有する公知のプラスミドによって相補される。 酵母における本発明のポリペプチドの細胞内産生のために、酵母タンパク質を コードする配列が、所望のポリペプチドのコード配列に連結され得、発現の際に 酵母細胞によって細胞内で切断され得る融合タンパク質を産生し得る。このよう な酵母リーダー配列の例は、酵母ユビキチン遺伝子である。昆虫細胞における発現 バキュロウイルス発現ベクター(BEV)は、発現されるべき外来遺伝子のコード 配列がウイルス遺伝子(例えば、SmithおよびSummers、米国特許第4,745,051号に 記載されるポリヘドリン)の代わりに、バキュロウイルスプロモーターの後ろに 挿入されている、組換え昆虫ウイルスである。 本明細書中の発現構築物は、昆虫細胞系の感染または形質転換のための中間体 として有用なDNAベクター、バキュロウイルス転写プロモーターをコードするDNA を一般に含み、必要に応じて、しかし好ましくは、所望のタンパク質の分泌を指 向させ得る昆虫シグナルDNA配列が下流に続く、ベクター、および外来タンパク 質をコードする外来遺伝子の挿入のための部位を含み、シグナルDNA配列および 外来遺伝子はバキュロウイルスプロモーターの転写制御下に置かれており、本明 細書中の外来遺伝子は所望のポリペプチドのコード配列である。 本明細書中での使用のためのプロモーターは、一般に昆虫(例えば、Lepidopte ra、Diptera、Orthoptera、Coleoptera、およびHymenoptera目)に感染する500を 超える任意のバキュロウイルスに由来する、バキュロウイルス転写プロモーター 領域であり得、例えば、Autographo calfornica MNPV、Bombyx mori NPV、rrich oplusia niM NPV、Rachlplusia ou MNPV、またはGalleria mellonella MNPVのウ イルスDNAが含まれるが、これらに限定されない。従って、バキュロウイルス転 写プロモーターは、例えば、バキュロウイルス即時初期遺伝子IEIまたはIENプロ モーター；39Kおよび、遅延初期遺伝子を含有するHindIIIフラグメントからなる 群より選択されるバキュロウイルス遅延初期遺伝子プロモーター領域との組合せ の即時初期遺伝子；またはバキュロウイルス後期遺伝子プロモーターであり得る 。即時初期プロモーターまたは遅延初期プロモーターは、転写エンハンサーエレ メントで増強され得る。 本明細書中での使用に特に適切なものは、Friesenら、(1986)「バキュロウイ ルス遺伝子発現の調節」：THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(W．Doerfl er編)；EP 127,839およびEP 155,476に記載される、バキュロウイルスの強力な ポリヘドリンプロモーター(これは、DNAインサートの高レベルの発現を指向させ る)、および、Vlakら、J．Gen．Virol．(1988)69:765-776に記載される、p10タ ンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターである。 本明細書中での使用のためのプラスミドはまた、通常、ポリヘドリンポリアデ ニル化シグナル(Millerら、Ann．Rev．Microbiol．(1988)42:177に記載される) 、ならびにE．coliでの選択および増殖のための原核生物アンピシリン耐性(amp) 遺伝子および複製起点を含む。適切なシグナル配列をコードするDNAがまた含ま れ得、そしてそれは一般に、分泌される昆虫またはバキュロウイルスタンパク質 の遺伝子(例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子)(Carbonellら、Gene（ 1988）73:409に記載される)、ならびに以下をコードする遺伝子由来のシグナル 配列のような哺乳動物シグナル配列に由来する：ヒトαインターフェロン(Maeda ら、Nature（1985）315:592-594に記載される)；ヒトガストリン放出ペプチド(L ebacq-Verheydenら、Mol．Cell．Biol．(1988)8:3129に記載される)；ヒトIL-2( Smithら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1985）82:8404に記載される)；マウスI L-3(Miyajimaら、Gene(1987)58:273に記載される)；およびヒトグルコセレブロ シダーゼ(Martinら、DNA（1988）7:99に記載される)。 多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびに宿主(例えば、Spodoptera frugiperda(毛虫)、Aedes aegypti(蚊)、Aedes albopictus(蚊)、Drosophila me lanogaster(ショウジョウバエ)、およびBombyx mori宿主細胞)由来の対応する許 容性の昆虫宿主細胞が、同定され、そして本明細書中で使用され得る。例えばLu ckowら、Bio/Technology(1988)6:47-55、Millerら、GENETIC ENGINEERING(Setlo w，J．K.ら編)、第８巻(Plenum Publishing，1986)、277-279頁、およびMaedaら 、Nature，（1985）315:592-594の記載を参照のこと。種々のこのようなウイル ス株は、公共に入手可能である(例えば、Autographa californica NPVのL-1変異 体およびBombyx mori NPVのBm-5株)。このようなウイルスは、Spodoptera frugi perda細胞のような宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使 用され得る。 ポリヘドリンプロモーターに加えて、他のバキュロウイルス遺伝子は、バキュ ロウイルス発現系において有利に用いられ得る。これらには、それらが発現され る間のウイルス感染の期によって、即時初期(α)、遅延初期(β)、後期(γ)、ま たは超後期(very late)(δ)が含まれる。これらの遺伝子の発現は、おそらくは 転写調節の「カスケード」機構の結果として、連続的に起こる。従って、即時初 期遺伝子は、他のウイルス機能の非存在下で感染の直後に発現され、そして、生 じる遺伝子産物の１つ以上は、遅延初期遺伝子の転写を誘導する。次に、いくつ かの遅延初期遺伝子産物は、後期遺伝子の転写を誘導し、そして最終的には、超 後期遺伝子は、１つ以上のより初期のクラスからの既に発現されている遺伝子産 物の制御下で発現される。この調節カスケードの１つの比較的良く規定されてい る成分は、Autographo californica多核体病ウイルス(AcMNPV)の好ましい即時初 期遺伝子であるIEIである。IEIは、他のウイルス機能の非存在下で発現され、そ して遅延初期クラスのいくつかの遺伝子(好ましい39K遺伝子(GuarinoおよびSumm ers、J．Virol．(1986)57:563-571およびJ．Virol．(1987)61:2091-2099に記載 される)ならびに後期遺伝子(GuarinoおよびSummers、Virol．(1988)162:444-451 に記載される)を含む)の転写を刺激する産物をコードする。 上記の即時初期遺伝子は、遅延初期カテゴリーのバキュロウイルス遺伝子プロ モーター領域と組み合わせて使用され得る。即型初期遺伝子とは異なり、このよ うな遅延初期遺伝子は、即時初期遺伝子または遺伝子産物のような、他のウイル ス遺伝子または遺伝子産物の存在を必要とする。即時初期遺伝子の組合せは、39 KまたはバキュロウイルスゲノムのHindIIIフラグメント上に見出される遅延初期 遺伝子プロモーターの１つのような、任意のいくつかの遅延初期遺伝子プロモー ター領域と共に作製され得る。本発明の場合では、39Kプロモーター領域は、発 現されるべき外来遺伝子に連結され得、その結果、発現はIEIの存在によってさ らに制御され得る(L．A．GuarinoおよびSummers(1986a)、前出；GuarinoおよびS ummers（1986b）J．Virol.，(1986)60:215-223、およびGuarinoら、(l986c)，J ．Virol．(1986)60:224-229に記載される)。 さらに、即時初期遺伝子と遅延初期遺伝子プロモーター領域との組合せを使用 する場合、異種遺伝子の発現の増強は、遅延初期遺伝子プロモーター領域との直 接的なシス連関でのエンハンサー配列の存在によって実現される。このようなエ ンハンサー配列は、即時初期遺伝子またはその産物が限定されている状況におけ る、遅延初期遺伝子発現のその増強によって特徴づけられる。例えば、Guarino およびSummers(1986a)、(1986b)、およびGuarinoら(1986)に記載されるように、 hr5エンハンサー配列は、シスで直接的に遅延初期遺伝子プロモーター領域(39K) に連結され得、それによって、クローン化された異種DNAの発現が増強され得る 。 ポリヘドリン遺伝子は、超後期遺伝子として分類されている。従って、ポリヘ ドリンプロモーターからの転写は、未知の、しかし恐らくは多数の他のウイルス および細胞遺伝子産物の先の発現を必要とする。ポリヘドリンプロモーターのこ の遅延発現のため、当該分野の状態のBEV、例えば、米国特許第4,745,051号で、 SmithおよびSummersにより記載される例示のBEVシステムは、ウイルスゲノムの 残りからの遺伝子発現の結果としてのみ、そしてウイルス感染が良好に進行した 後にのみ外来遺伝子を発現する。これは、現存のBEVの使用に対する制限を意味 する。新たに合成されたタンパク質をプロセッシングする宿主細胞の能力は、バ キュロウイルス感染が進行するにつれて減少する。従って、ポリヘドリンプロモ ーターからの遺伝子発現は、新たに合成されたタンパク質をプロセッシングする 宿主細胞の能力が特定のタンパク質(例えば、ヒト組織プラスミノーゲンアクチ ベーター)について潜在的に小さくなるときに起こる。結果として、BEVシステム における分泌糖タンパク質の発現は、クローン化された遺伝子産物の不完全な分 泌、それによってクローン化された遺伝子産物を細胞内に不完全なプロセッシン グ形態に捕獲することに起因して複雑である。 昆虫シグナル配列を用いて、切断されて成熟タンパク質を産生し得る外来タン パク質を発現し得ることが認識されているが、好ましくは、本発明は、遺伝子発 現に適切な哺乳動物シグナル配列を用いて実施する。 本明細書で適切な例示の昆虫シグナル配列は、鱗翅目脂肪動員ホルモン(AKH) ペプチドをコードする配列である。AKHファミリーは、昆虫のエネルギー基質の 動員および代謝を調節する短ブロックの神経ペプチドからなる。好ましい実施態 様では、鱗翅目Manduca sexta AKHシグナルペプチドをコードするDNA配列を使用 し得る。直翅目Schistocerca gregariaの遺伝子座由来のシグナルペプチドのよ うな他の昆虫AKHシグナルペプチドもまた有利に使用され得る。別の例示の昆虫 シグナル配列は、CP1、CP2、CP3またはCP4のようなショウジョウバエ小皮タンパ ク質をコードする配列である。 現在、外来遺伝子をAcNPV中に導入するために本明細書で用いられ得る最も一 般的に用いられる移入ベクターは、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベ クターもまた、本明細書で用いられ得る。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の ための材料および方法は、Invitrogen(San Diego CA)のような会社からキット形 態(「MaxBac」キット)で市販されている。本明細書で利用される技術は、一般に 、当業者に公知であり、そしてSummersおよびSmithのA MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES、Texas Agricultur al Experiment Station Bulletin No.1555、Texas A & M University(1987)；Sm ithら、Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156、およびLuckowおよびSummers(1989)に十 分に記載されている。これらは、例えば、LuckowおよびSummers、Virology(1989 )17:31に記載されるように、ポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変え、そし てこのATTから32塩基対下流にBamHIクローニング部位を導入するpVL985の使用を 含む。 従って、例えば、本発明のポリペプチドの昆虫細胞発現には、所望のDNA配列 を、公知の技術を用いて移入ベクター中に挿入し得る。昆虫細胞宿主は、野生型 バキュロウイルスのゲノムDNAとともに、挿入された所望のDNAを含む移入ベクタ ーで、通常同時トランスフェクションにより同時形質転換され得る。ベクターと ウイルスゲノムは組換えられ、容易に同定および精製され得る組換えウイルスを 生じる。パッケージ化された組換えウイルスを用いて、昆虫宿主細胞を感染し、 所望のポリペプチドを発現し得る。 本明細書で利用可能である他の方法は、上記で引用したSummersおよびSmith(1 987)で呈示されている、昆虫細胞培養、プラスミドの同時トランスフェクション および調製の標準的な方法である。この参考文献はまた、AcMNPV移入ベクター中 への遺伝子のクローニング、プラスミドDNA単離、AcmMNPVゲノム中への遺伝子の 移入、ウイルスDNA精製、組換えタンパク質の放射能標識および昆虫培養培地の 調製の標準的な方法にも関係する。ウイルスおよび細胞の培養手順は、Volkman およびSummers、J.Virol.(1975)19:820-832ならびにVolkmanら、J.Virol.(1976) 19:820-832に記載されている。両生類細胞における発現 本発明の実施のための候補物のライブラリーの発現は、両生類の卵母細胞にお いて行われ得る。この目的に特に有用な１つの両生類は、Xenopus laevisである 。 なぜなら、この動物の卵母細胞は、大きなライブラリーを発現する能力があるか らである。LustigおよびKirschner，PNAS（1995）92:6234-38，KriegおよびMelt on（1987）Meth Enzymol 155:397-415およびRichardsonら(1998)Bio/Technology 6:565-570に記載されるように、X．laevisおよび他の両生類についての発現系 が確立され、そして発現が行われる。 Xenopus laevis卵母細胞を用いるライブラリーの構築のために、Xenopus卵母 細胞に、候補因子のcRNAライブラリーを注入する。cRNAライブラリーは、細胞株 または動物器官のような供給源由来の小さなcDNAライブラリープール由来のプラ スミドDNA由来である。プラスミドDNAは、以前に引用されたLustigおよびKirsch ner、KriegおよびMelton、ならびにRichardsonらに記載されたように、インビト ロでcRNAに転写され、次いで卵母細胞に注入される。卵母細胞は、18℃で一晩イ ンキュベートされる。翌日、卵母細胞を、応答細胞と接触させたマイクロウェル に配置する。マイクロウェルを、37℃で、30分〜３時間インキュベートする。次 いで、候補の刺激因子または阻害因子、リガンド、アンタゴニスト、または転写 因子を発現し、そして卵母細胞により分泌する。哺乳動物細胞における発現 本発明のポリペプチドの哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターには 、とりわけSV40初期プロモーター、CMVプロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプ ロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)、および単純ヘルペ スウイルスプロモーターなどが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来の プロモーターのような他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物構築物にお ける使用を見出す。哺乳動物発現は、プロモーターに依存して構成性または調節 性(誘導性)のいずれかであり得る。代表的には、翻訳停止コドンの3'側に位置す る転写停止およびポリアデニル化配列もまた存在し得る。好ましくは、ポリペプ チドコード配列の5'側に位置する翻訳開始の最適化のための配列もまた存在する 。転写停止/ポリアデニル化シグナルの例は、先に引用したSambrookら(1989)に 記 載のような、SV40由来のシグナルを含む。スプライスドナーおよびアクセプター 部位を含むイントロンもまた、本発明の構築物中に設計され得る。 哺乳動物構築物の発現レベルを増加するために、エンハンサーエレメントもま た本明細書で用いられ得る。例としては、Dijkemaら、EMBO J.(1985)4:761に記 載されるようなSV40初期遺伝子エンハンサー、およびGormanら、Proc.Natl.Acad .Sci.USA(1982b)79:6777に記載のようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR) 由来のエンハンサー/プロモーター、およびBoshartら、Cell(1985)41:521に記載 のようなヒトサイトメガロウイルスが挙げられる。哺乳動物細胞中で外来タンパ ク質の分泌を提供するためのシグナルペプチドをコードする配列を含むリーダー 配列もまた存在し得る。好ましくは、リーダー配列がインビボまたはインビトロ のいずれかで切断され得るように、リーダーフラグメントと目的の遺伝子との間 にコードされるプロセッシング部位が存在する。アデノウイルス三部分リーダー は、哺乳動物細胞中で外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である 。 一旦完成すれば、哺乳動物発現ベクターを用いて任意のいくつかの哺乳動物細 胞を形質転換し得る。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞中への導入方法は、 当該技術分野で公知であり、そしてデキストラン介在トランスフェクション、リ ン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融 合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプセル化 、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを含む。哺乳動物細胞宿主 系形質転換の一般的局面は、Axelにより米国特許第4,399,216号に記載されてい る。 本発明の応答性細胞または産生細胞として用いられる哺乳動物宿主細胞は種々 の培地で培養され得る。Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium([MEM]、 Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、およびDulbecco's Modified Eagles's Medium([DME M]、Sigma)のような市販の培地が宿主細胞を培養するために好適である。さらに 、HamおよびWallace、Meth.Enz.(1979)58:44、BarnesおよびSato、Anal.Biochem .(1980)102:255、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号 、または同第4,560,655号、WO 90/103430、WO 87/00195、および米国特許再発行 第30,985号に記載される任意の培地が、宿主細胞用の培養培地として用いられ得 る。これらの任意の培地は、必要に応じて、本発明の方法による細胞の機能のた めの 最適な条件を作製するために、ホルモンおよび/または他の成長因子(インスリン 、トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩類(塩化ナトリウム、カルシ ウム、マグネシウム、およびリン酸など)、緩衝液(HEPESなど)、ヌクレオシド( アデノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(Gentamycin^TM薬剤)、微量元素(通常 マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)、および グルコースまたは等価なエネルギー供給源で補充され得る。当業者に公知の他の 必要な任意の補充物もまた、適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような 培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に用いられている培 養条件であり、そして当業者に明らかである。 低分子ライブラリーは以下のように作製される。ペプチドの「ライブラリー」 は、米国特許第5,010,175号（'175特許）およびPCT WO91/17823に開示される方 法に従って、合成および使用され得る。'175特許の方法において、適切なペプチ ド合成支持体（例えば、樹脂）が、適切に保護され活性化されたアミノ酸の混合 物に結合される。 WO91/17823に記載される方法は類似している。しかし、合成樹脂と活性化アミ ノ酸の混合物とを反応させるかわりに、樹脂は、20に等分されるか、またはこの 工程において添加される異なるアミノ酸の数に対応する多数の部分に分けられ、 そして各アミノ酸は個々に、樹脂のその部分に結合される。次いで、樹脂部分が 組み合わされ、混合され、そして再度、第２のアミノ酸との反応のために多数の 等しい部分に分けられる。さらに、各工程での全ての樹脂を組み合わせることよ りむしろ平行して部分を処理することにより、別々の「サブプール」を維持し得 る。これは、どのペプチドが、応答細胞における遺伝子発現の全ての観察される 変化を担うかを決定するプロセスを単純にする。 WO91/17823および米国特許第5,194,392号に記載される方法は、平行した自動 化技術により、このようなプールおよびサブプールの調製を可能にし、その結果 、全ての合成および再合成が、数日以内に行われ得る。 さらなる別の因子は、遺伝子発現のスティミュレーターまたはインヒビター、 あるいはリガンドまたはアンタゴニストとして作用し得る、低分子（ペプチドア ナログおよび誘導体を含む）を含む。ペプチド、アナログ、または誘導体の産生 のために意図されるいくつかの一般的な手段は、CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY O F AMINO ACIDS，PEPTIDES，AND PROTEINS--A SURVEY OF RECENT DEVELOPMENTS， Weinstein，B.編、Marcell Dekker，Inc.,発行、New York(1983)に概説される。 さらに、通常のL-立体異性体のD-アミノ酸への置換は、分子の半減期を増大する ために行われ得る。 少なくともいくつかの置換されたアミノ酸のモノマー単位からなるポリマーで あるペプトイドは、本明細書中で低分子のスティミュレーターまたはインヒビタ ーとして作用し得、そしてPCT 91/19735に記載されるように合成され得る。現在 好ましいアミノ酸置換物は、グリシンのN-アルキル化誘導体であり、これは容易 に合成され、そしてポリペプチド鎖に組み込まれる。しかし、多様な分子のプー ルの配列特異的な合成を可能にするいずれのモノマー単位も、ペプトイド分予の 産生における使用に適切である。本発明の目的のためのこれれらの分子の利益は 、それらがペプチドとは異なるコンホメーション空間を占め、そして例えば、プ ロテアーゼの作用に対してより耐性になることである。 ペプトイドは、標準的な化学的方法により容易に合成される。好ましい合成方 法は、R.Zuckermannら、J.Am.Chem.Soc.(1992)114:10646-7により記載される「 サブモノマー」技術である。N-置換グリシンモノマー単位が骨格を形成する、複 素環式有機化合物の固相技術による合成は、1995年６月７日に出願された「N-置 換オリゴマーの合成」と題された同時継続出願に記載され、そして本明細書中に 参考としてその全体が援用される。次いで、このような複素環式有機化合物の混 合物のコンビナトリアルライブラリーは、遺伝子発現を変化させる能力について アッセイされ得る。 コンビナトリアルライブラリーにおける他の複素環式有機化合物の固相による 合成はまた、1995年６月７日に出願された「基質に結合した環式有機化合物のコ ンビナトリアルライブラリー」と題された同時継続出願である米国特許出願第08 /485,006号に記載され、本明細書中に参考としてその全体が援用される。高度に 置換された環式構造物は、サブモノマー法と強力な液相化学とを組み合わせるこ とにより、固体支持体上で合成され得る。１、２、または３以上の縮合環を含む 環式化合物は、同出願に記載されるように、最初に線状骨格を合成し、引き続い て分子内環化または分子間環化を行うことによるサブモノマー法により形成され る。リボザイムおよびアンチセンス 遺伝子発現を変調し得る候補物がリボザイムである場合、リボザイムは、化学 的に合成されるか、または遺伝子治療プロトコル（リボザイム配列をコードする DNAの調製を含む）のためのベクターに調製され得る。リボザイムは、ポリヌク レオチド基質の切断を触媒する能力を有するポリヌクレオチドである。候補リボ ザイムは、以下に記載されるように調製され、そして使用され得る。Longら、FA SEB J．7:25(1993)およびSymons，Ann.Rev.Biochem．61:641(1992)，Perrottaら 、Biochem．31:16，17(1992);ならびに米国特許第5,225,337号、米国特許第5,16 8,053号、米国特許第5,168,053号、および米国特許第5,116,742号、Ojwangら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10802-10806(1992)、米国特許第5,254,678号、 ならびに米国特許第5,144,019号、米国特許第5,225,337号、米国特許第5,116,74 2号、米国特許第5,168,053号。ハンマーヘッド構造におけるこのようなリボザイ ムフラグメントの調製および使用は、Koizumiら、Nucleic Acids Res．17:7059- 7071(1989)により記載される。ヘアピン構造におけるリボザイムフラグメントの 調製および使用は、ChowriraおよびBurke，Nucleic Acids Res．20:2835(1992) により記載される。 リボザイムまたはアンチセンスポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域は、直 線的配列に置換アーム(displacemant arm)を連結することにより改変され得るか 、あるいはHornおよびUrdea,Nucleic Acids Res．17:6959-67(1989)に記載され るように、分枝構造として調製され得る。リボザイムまたはアンチセンスポリヌ クレオチドの基本構造はまた、当業者にかなり知られている方法で化学的に変化 される。 化学的に合成されたリボザイムおよびアンチセンス分子は、モノマー単位で改 変された合成オリゴヌクレオチド誘導体としてスクリーニングされ得る。リボザ イムおよびアンチセンス分子はまた、ベクター内に配置され、そしてスクリーニ ングアッセイのために細胞内で発現され得る。 本発明は、最初にスクリーニングされるべき候補因子の供給源を決定すること により行われ得る。候補因子が低分子ライブラリー由来である場合、この因子は 、例えば、96マイクロウェル形式において試験するために、適切にプールされる 。候補因子がcDNAまたはcRNAにコードされる場合、宿主細胞系が選択され、そし て適切なcDNAまたはcRNAプールの調製後、細胞は核酸配列のプールで注入される か、または形質転換される。候補因子が分泌されることが予想される場合、「産 生」細胞は、「応答」細胞と共に同時培養される。候補因子が分泌され得ない場 合、宿主細胞は溶解され、そして細胞溶解物は、応答細胞を含むマイクロウェル に添加される。 転写変化が、ポジティブな因子を同定するためのマーカーを提供する場合、こ の標的を転写的に変調する能力について候補因子をスクリーニングするために、 適切な転写標的が選択される。この標的は、所望の応答を検出するのに適切な任 意のマーカーであり得る。その結果、例えば、所望の応答が炎症の低減である場 合、マーカーはNFKBエレメントであり得、そしてシグナルはこのようなエレメン トの転写物レベルの低下であり得る。さらに、所望の応答が抗腫瘍効果である場 合、マーカーはオンコジーンであり得、そしてシグナルはこのようなオンコジー ンの転写物レベルの低下であり得る。 本発明の１つの特定の利点は、因子を検出するためのレポーター遺伝子構築物 で細胞を形質転換する必要なく、応答細胞集団をスクリーニングする能力である 。従って、初代細胞培養物がスクリーニングされ得る。その結果、例えば、患者 の細胞のいくつかを取り出し、そして適切な用量の治療因子を初代細胞培養物へ 投与し、そして治療剤投与の結果として起こる転写効果または翻訳効果を測定す ることにより、特定の因子が腫瘍を有する患者に対してポジティブな効果を有す るか否かが、完全な治療投与に先だって試験され得る。さらに、診断が初代細胞 培養を用いて行われ得る。ここで、正常な患者における標的の転写レベルまたは 翻訳レベルと比較して、期待される転写変化または翻訳変化が疾患において予想 され、そして患者の細胞は、転写産物または翻訳産物の疾患状態レベルについて 試験され得る。例えば、bDNAは、既知の標的遺伝子転写物に対して患者細胞の集 団をスクリーニングするために使用され得る。ここで、転写物の発現は患者の疾 患 状態を示す。 本発明は、このように形質転換された応答細胞を用いて実施され得るが、レポ ーター遺伝子は、bDNAまたはPCRの標的として、あるいはそれ自体のレポーター 系として使用され得る。あるいは、標的遺伝子の転写物を発現することが知られ ている細胞は、応答細胞として使用され得、そして潜在的な変調因子との接触後 、標的転写物のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、核酸 ハイブリダイゼーション検出手段（例えば、bDNA検出手段、逆転写ポリメラーゼ 連鎖反応(RT-PCR)検出手段、またはRNAse保護アッセイ手段）により直接的に測 定され得る。 転写物の核酸と、DNA、RNA、化学的組合せ分子、合成的組合せ分子（核酸部分 、化学的部分、またはアミノ酸部分のような１つより多い部分の）、またはそれ に結合し得、そしてまた結合対として後の検出が可能なタンパク質分子のいずれ かとの間の結合相互作用を使用する、他の直接的な検出手段もまた利用可能であ る。検出はまた、結合相互作用が、DNA、RNA、化学的組合せ分子、合成的組合せ 分子（核酸部分、化学的部分、またはアミノ酸部分のような１つより多い部分の ）、あるいはタンパク質検出分子またはプローブのいずれかとのタンパク質結合 相互作用である場合には、翻訳産物について同様のやり方で可能である。いくつ かの例示的な検出分子は、係属中の米国特許出願第08/478,085号、米国特許第5, 451,503号、同第5,545,730号、同第5,541,313号、同第5,437,977号、同第5,430, 138号、同第5,430,136号、同第5,424,413号、同第5,367,512号、同第5,124,246 号、同第5,082,935号、および同第5,079,151号に記載され、これら全てが参考と してその全体が援用される。WO96/06104およびEP 544212に含まれる検出分子に ついての情報もまた、例示的な目的のために含まれ、これらもまたその全てが参 考としてその全体が援用される。 分泌された増殖因子のクローニングにおいて、本発明の方法が実施され、Xeno pus卵母細胞またはCos細胞のいずれかの因子産生細胞、およびNIH3T3、PC12、ま たはHela-NFκβluc細胞のいずれかのような因子応答細胞を選択した。ヒトおよ びマウスのcDNAライブラリーの小さなプールが因子産生細胞に導入され、そして 因子応答細胞は、因子産生細胞から収集された上清と共に培養されるか、または 因子産生細胞は、応答細胞と同時培養された。短期間の後、即時初期遺伝子（遺 伝子産物、または遺伝子から転写されたmRNAを含む）のレベルは、c-fos転写に おける増加により示された。c-fos転写物の検出は、bDNAアッセイまたはルシフ ェラーゼレポーターアッセイにより達成された。標的化された即時初期遺伝子( 例えば、c-fos)の顕著な誘導は、特定のサンプルに対応するcDNAの特定のサブプ ールがポジティブであることを示した。ポジティブな単一のクローンの性質は、 最終的に配列決定により決定される。転写事象を検出するためのbDNAの使用にお いて、bDNAは、c-fos転写物に指向された。ルシフェラーゼレポーター構築物を 使用する場合、bDNAはまた、ルシフェラーゼ転写物に対して使用され得るか、ま たはルシフェラーゼレポーター活性が検出され得た。 通常、デコンボリューション(deconvolution)は２回にわたって行われた。第 １回目のデコンボリューションは、最初に、ポジティブプールの１×(1×96)〜 ３×(3×96)の平均多様性(average diversity)を有するクローン（96の場合）を 選択することにより行われ、そしてこれらのクローンは、96ウェルプレートのウ ェルにおいて増殖された。96ウェルプレートの各列の培養物はプールされ、そし てそれらのミニプレ(mini-pre)DNAまたはcRNAが調製され、そして因子産生細胞 に導入された。第１回目のデコンボリューションの間に同定されたポジティブプ ールからの単一のクローンは、最終的なポジティブな単一のクローンを同定する ために第２回目のデコンボリューションのために使用された。 手で濾胞形成されない(manual defolliculated)Xenopus卵母細胞は、インビト ロで転写されたcRNAを発現することに優れており、そしてそのバックグラウンド c-fos誘導活性はほとんどない。Xenopus卵母細胞の大きさを利用して、Xenopus 卵母細胞およびNIH3T3細胞を用いる同時培養系が、マイクロプレートにおいて開 発され、拡散性増殖因子および膜結合非拡散性増殖因子の両方の検出を可能にし た。しかし、損傷した卵母細胞は、NIH3T3細胞において著しいc-fos誘導を生成 させることが示された。それでも、反復可能な条件が確立され、これは、0.08ng のPDGF c-sis cRNAを注入された卵母細胞から分泌されたPDGF c-sis活性を検出 するのに十分に高感度であった。この感度は、600のクローンのプールにおけるP DGF c-sis活性の検出を可能にすることが示された。次いで、１プールあたり平 均150クローンの多様性を有するマウス脳cDNAライブラリーの350プール、および １プールあたり80クローンの多様性を有するXenopus胚ライブラリーの100プール について、スクリーニングが行われた。卵母細胞間の生物学的変化を考慮して、 各cRNAプールは、３つの卵母細胞に注入され、その後３連の結果を得た。 これらの450プールのうち、61プールが初めにポジティブであった。複数回の 反復実験の後、14が中程度にポジティブなままであった。３プールのデコンボリ ューション、および11プールの部分的デコンボリューションは、単一の分子への プール16.1の首尾良いデコンボリューションを得たが、一方、他のプールのデコ ンボリューション（完全または部分的のいずれか）は活性の喪失をもたらした。 c-fos誘導性の段階的な増加は、プール16.1について示されなかったが、16.1の 動態(kinetics)は、インスリン様増殖因子(IGF)の動態と類似していた。クロー ン16.1に対するヌクレオチドおよび翻訳されたタンパク質配列が決定された。こ れは、61のアミノ酸ポリペプチドの配列を示す、配列番号１（ヌクレオチド）お よび配列番号２（アミノ酸）に示される。ペプチド16.1は、FGFで示された30倍 の誘導と比較して、c-fos転写の５倍の誘導を示した。これは、本発明の方法に より穏やかでかつ明白な転写効果を有する増殖因子を同定する可能性を証明する 。 Cos細胞/NIH3T3系は、PDGF c-sis構築物を用いて、拡散性増殖因子をクローニ ングするために開発された。トランスフェクトされたCos細胞の上清は、bDNAア ッセイによりc-fos誘導性についてNIH3T3細胞に対してアッセイされた。Cos細胞 系は、PDGF c-sisの発現に非常に効率的であると証明され、そしてさらにCos細 胞上清は、c-fos誘導の高いバックグラウンドを有さないことを証明した。活性 は、300クローンのプールの多様性で検出可能であった。マウス脳cDNAライブラ リーの100プール（１プールあたり150クローン）がスクリーニングされ、そして マウス胚ライブラリーの100プール（１プールあたり100クローン）、およびサイ ズ分画マウス胚ライブラリーの400プール（１プールあたり35〜50クローン）が スクリーニングされた。マウス脳ライブラリー由来の６つのポジティブプールお よびマウス胚ライブラリー由来の１つのポジティブプールが得られた。 マウス脳ライブラリー由来の第１のポジティブプールのデコンボリューション は、c-fos誘導性の段階的な増加を示した。このクローンの配列は、全長のbFGF cDNAをコードし、この研究の原理を証明した。残りの５つのポジティブプールも また、関与する増殖因子としてのFGFを示した。 FGF配列を有したクローンのうち１つが、非FGF c-fos誘導性クローンもまた有 することが示されたが、この配列は、挿入物が存在しないことを示した。ポリア デニル化部位の欠失により、このクローンは、生物学的リガンドの機能を模倣し 得る人工的なペプチド配列を潜在的にコードする。RNA開始部位後の700塩基対配 列のうち、２つの潜在的なペプチド（13アミノ酸および22アミノ酸の）が見出さ れた。従って、本発明は、生物学的活性を有する人工的なペプチド配列について のスクリーニングに適合され得る。 本発明の方法により、Cos細胞は、産生細胞として使用され得、そしてCos細胞 上清は、PC12細胞においてc-fos誘導性について試験され得る。さらに、腫瘍壊 死因子(TNF)様因予をクローニングするためのストラテジーの一部として、NFκ βエレメント調節制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現し、従ってTNF誘導に応 答性の安定なHela細胞株が設計された。ルシフェラーゼアッセイおよびルシフェ ラーゼmRNAについてのbDNAアッセイの両方は、誘導後４時間でピークに達し、そ してバックグラウンドを超えて、ルシフェラーゼmRNAおよびタンパク質の20倍の 誘導を生じた。ルシフェラーゼアッセイは、その簡便さのために検出方法として 選択された。サイズ分画マウス胚ライブラリーの300のプール（１プールあたり3 5〜50のクローン）がポジティブについてスクリーニングされた。 本発明者らは、標準的なチミジン取り込みアッセイ以上に、遺伝子発現を変調 する因子の同定のためのbDNA系を使用する利点を確認した。転写を測定するため のc-fos bDNAアッセイと細胞増殖を測定するためのチミジン取り込みアッセイと を比較する並行実験が行われた。チミジン取り込みは、細胞におけるDNA合成を 測定する。DNA合成の測定として、標識チミジンは、チミジン投与の約12〜14時 間後に細胞中に検出され得る。しかし、Cos上清は、増殖を阻害する因子を有し 、そしてこのような増殖に基づくアッセイを妨害し得る。比較実験のために、Co s上清が、PDGF c-sis DNAでトランスフェクトされた細胞から収集された。転写 は、変調因子が細胞と接触した後、比較的すぐに起こる事象であるので、DNA合 成が最終的に上清により阻害され得る場合でさえ、転写変化を検出することは可 能で ある。これは、変調の効果が発揮されたすぐ後に、転写の検出が起こり得るから である。比較実験において、Cos上清は細胞増殖を阻害したが、NIH3T3細胞にお けるc-fos mRNAを誘導するための能力を保持した。従って、例えば、bDNA検出手 段を用いた転写検出は、新規の増殖因子を特徴付けるために、チミジン取り込み アッセイより優れている。 本発明のさらなる目的、性質、および利点は、以下の詳細な説明から明らかに なる。しかし、本発明の好ましい実施態様を示したが、本発明の精神および範囲 内での種々の変更および改変が詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細 な説明は例示のみのために与えられることを理解すべきである。本発明はまた、 本発明の要素の作用についてのいかなる理論にも限定されない。 実施例１ SRE 誘導性転写因子についてのSRE-ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼレポーター遺伝子および血清応答エレメント（SRE）を作動可 能な連結で含む構築物を、応答性細胞として選択したNIH3T3由来FTL細胞に、安 定にトランスフェクトした。１プール当たり100〜500の独立したコロニーの小ラ イブラリープールからのプラスミドDNAを構築し、そしてインビトロでcRNAに転 写した。各々のcRNAのプールをXenopus laevis卵母細胞へ注入し、そして18℃で 一晩培養した。次いで、翌日、各卵母細胞を、SRE-ルシフェラーゼ構築物でトラ ンスフェクトしたFTL細胞と同時培養し、そしてマイクロウェル中で37℃で３時 間インキュベートした。卵母細胞を取り出し、そしてルシフェラーゼ遺伝子の誘 導をルシフェラーゼアッセイにより、およびまたルシフェラーゼmRNAに対するbD NAアッセイによりアッセイした。ルシフェラーゼアッセイは、4000個の細胞に対 して1nMのPDGFBB(PDGFβ鎖ダイマー)の最少濃度で感受性であった。bDNAアッセ イはより低濃度のライブラリーを検出し、4000個の細胞から0.01nM未満のPDGFBB を検出する能力を有した。 実施例２ CT ボックスのエンハンサーとして作用する因子についてのアッセイ 上記実施例１の変形である本発明の実施態様を、インスリン遺伝子由来のCTボ ックスエンハンサーエレメントを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結する ことにより、インスリン遺伝子プロモーターから取得したCTボックスエンハンサ ーにおいて作用する刺激因子（ポリペプチドまたは低分子を含む）のスクリーニ ングのために実施し得る。残りの実験は実施例１に記載のように実施する。 実施例３ 増殖因子についてのアッセイ c-fos遺伝子の発現を刺激する増殖因子についてアッセイするために、Xenopus 卵母細胞における発現について上記したように、ヒト組織からライブラリーを調 製する。異なるライブラリーを用いて形質転換した単一卵母細胞を、各マイクロ ウェル中、ニューロン(nuerons)の前駆細胞株であるPC12細胞のベッド上に置く 。卵母細胞産生細胞およびPC12応答性細胞のシステムを37℃で30分〜３時間培養 する。c-fos mRNAに対するbDNAプローブを用いてウェルをアッセイする。ポジテ ィブプールをサブプールに分割し、そしてc-fosのアップレギュレーションを担 う単一の因子を同定するまで、再びアッセイを行った。 実施例４ 分化因子についてのアッセイ PC12細胞を、cRNAライブラリーを注入したXenopus卵母細胞の上清とともに３ 〜５日間培養する。卵母細胞は、分化因子に対する応答のために必要なインキュ ベーション時間の長さに耐えないので、上清をインキュベーションの間用いる。 次いで、PC12細胞を、神経突起生長の表現型について、顕微鏡下で観察する。 実施例５ インヒビターについてのアッセイ 低分子ライブラリーからのインヒビターを探索する場合、当該分野で公知の方 法に従って、低分子ペプトイドライブラリーを調製する。IL-2を発現するJurkat 細胞を応答性細胞として選択する。Jurkat細胞をペプトイドライブラリーのプー ルの存在下でインキュベートし、そしてIL-2転写物に対するbDNAによりアッセイ する。ライブラリーに曝していないJurkat細胞と比較してのIL-2の転写物のダウ ンレギュレーションにより、ポジティブを同定する。IL-2のダウンレギュレーシ ョンを引き起こすペプトイドを、それらの潜在的な免疫抑制能力についてさらに 特徴付ける。 実施例６ ウイングレスショウジョウバエ由来のWntレセプターについてのアッセイ クローン-８ショウジョウバエ成虫盤細胞をウイングレスタンパク質とともに 培養し、そしてウイングレスに転写的に応答性である遺伝予を同定するために、 ディファレンシャルなmRNAおよびPCRによりアッセイする。この遺伝子の配列か らbDNAプローブを作製する。cDNAライブラリーをクローン-８細胞から作製し、 そしてcRNAライブラリーのコピーをXenopus laevis卵母細胞に注入し、そして培 養する。bDNAプローブをライブラリーのスクリーニングのために使用し、そして 単一クローンが同定されるまでポジティブプールの単離を進行させる。 実施例７ Ob- 誘導化合物についてのアッセイ Ob-誘導分子を、低分子ライブラリーから、または細胞、組織、もしくは植物 抽出物からスクリーニングし得る。応答性細胞は、ob遺伝子を発現する脂肪細胞 である。Ob遺伝子転写物のbDNAをポジティブを検出するために用い、そしてサブ プールがポジティブに応答性である単一因子を含むまで、アッセイを進行させる 。 実施例８ 内因性c-fosメッセンジャーの誘導を測定することによる 増殖因子のクローニング c-fos遺伝子の発現を刺激する増殖因子についてアッセイするために、NIH3T3 由来FTL細胞を応答性細胞として選択した。スクリーニングのためのライブラリ ーを、Xenopus卵母細胞における発現について上記したように、ヒト組織から調 製する。１プール当たり100〜500の独立したコロニーの小ライブラリープールか らのプラスミドDNAを構築し、そしてインビトロでcRNAに転写した。各々のcRNA のプールをXenopus卵母細胞に注入し、そして18℃で一晩培養した。次いで、翌 日、各卵母細胞をマイクロウェル中NIH3T3由来FTL細胞のベッド上で同時培養し 、そして３時間37℃でインキュベートした。 卵母細胞を取り出し、そして、c-fos mRNAに対するbDNAアッセイにより、c-fo sメッセンジャーを測定した。先の研究（実施例１に記載）において、FTL細胞に トランスフェクトしたSRE-ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物は、4000個の 細胞に対して1nMのPDGFBB(PDGFβ鎖ダイマー)の最少濃度で感受性であることを 示した。本実験において、bDNAアッセイはより低濃度のライブラリーを検出し、 4000個のFTL細胞から0.01nM未満のPDGFBB(PDGFβ鎖ダイマー)を検出する能力を 有した。先に記載のように、細胞（FTL細胞を含む）へのPDGFBBの投与は、c-fos 遺伝子の転写を誘導する。従って、bDNAアッセイの感度は、本発明の方法により 、非常に低濃度の増殖因子についてさえも、c-fosの増殖因子遺伝子誘導を検出 し得、次いで増殖因子を同定し、そしてクローン化し得ることを示す。 実施例９ c-fos 誘導のアンタゴニストおよびアゴニストについての 低分子ライブラリーのスクリーニング 低分子ライブラリープールを上記のように調製し、そして48のそのようなプー ルをマークし、そしてスクリーニングのために分割した。各プール（最終濃度２ μM）のアリコートをマイクロウェル中NIH3T3細胞のベッド上に置き、そして1nM のPDGFBBとともに37℃で45分間インキュベートした。 各ウェルを、c-fos mRNAに対するbDNAアッセイにより、c-fosメッセンジャー の誘導によってアッセイした。先の研究（実施例８に記載）において、bDNAアッ セイは、c-fos mRNAの誘導を0.01nM未満のPDGFBB(PDGFβ鎖ダイマー)で検出した 。1nMのPDGFBBは最大c-fos誘導の50％を与える。先に記載のように、細胞（FTL 細胞を含む）へのPDGFBBの投与は、c-fos遺伝子の転写を誘導する。 本研究において、c-fos遺伝子の誘導または減少をbDNAにより測定した。アゴ ニストが低分子ライブラリープール中に存在した場合、c-fosの誘導はPDGFBBの 投与による誘導と同じレベルか、またはより高いレベルで起こることが予測され た。アンタゴニストが低分子ライブラリープール中に存在した場合、c-fosの転 写はおそらく非検出可能レベルまで減少されることが予測された。bDNAアッセイ の感度の実施例８における実証から集めた信頼を有して、このタイプのスクリー ニングのためには、非常に低い量の増殖因子レセプターのアゴニストまたはアン タゴニストのみが必要であった。 次いで低分子プールを、アンタゴニストプールについては、１nMのPDGFBBによ り誘導されるc-fosのレベルに比較して50％より多い転写レベルの減少としての 、そしてアゴニストプールについては、１nMのPDGFBBにより誘導されるc-fosの レベルの転写レベルに比較して50％より多い転写レベルの増加としての基準を用 いてスクリーニングした。 本研究において、48プールの低分子のうち、２つの潜在的アゴニストおよび５ つの潜在的アンタゴニストを同定し、そしてこれらを、c-fos転写の制御を担う 特異的低分子を決定するための連続的スクリーニングによって単離中である。 48の低分子プールは複素環混合物プールである。この実験のため用いた基準は 、アンタゴニストプールについては、１nMのPDGFBBにより誘導されるc-fosのレ ベルに比較して50％より多い減少であり、そしてアゴニストプールについては、 １nMのPDGFBBにより誘導されるc-fosのレベルに比較して50％より多いc-fosレベ ルの増加である。 実施例10 NIH3T3 細胞においてc-fos転写を誘導し得る61アミノ酸ポリペプチドの同定 Xenopus卵母細胞に、実施例８に記載の方法を用いて、候補増殖因子の発現の ために、３連で（同じプールを３つの異なる卵母細胞に３回注入した）cRNAを注 入した。応答細胞であるNIH3T3細胞の応答性の感度を、600クローンのプールで 、0.08ngのPDGF c-sisc RNAを注入した卵母細胞から分泌されるPDGF c-sis活性 を検出するために、試験および設計した。マウス脳ライブラリーを１プール当た り150クローンの多様性で、350プールに、そして１プール当たり80クローンの平 均 の多様性で100プールのXenopus胚ライブラリーを分割した。450プールのうち、6 1プールが最初にポジティブであると見出され、そして１つは単一分予（これは 未刺激のNIH3T3細胞と比較して、約５倍のc-fosの誘導が可能である）までデコ ンボリュートした(deconvolute)。このクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸 配列を、それぞれ配列番号１および２に表す。 実施例11 既知の拡散性増殖因子FGFを同定するCos/NIH3T3システム PDGF c-sis構築物を用いて、PDGF c-sisを効率的に発現するためのCos細胞シ ステムを開発した。先に記載したように、トランスフェクトしたCos細胞の上清 を、NIH3T3細胞に対して、c-fos転写物に対するbDNAアッセイにより検出される ような、上清のc-fosを誘導する能力について、アッセイした。PDGF c-sisの発 現において、Cos細胞は非常に効率的であることが示された。さらに、Cos細胞シ ステムは、300クローンのプールの多様性においてc-fos活性の検出を可能にした 。100プール(１プール当たり150クローン)のマウス脳cDNAライブラリー、100プ ール（１プール当たり100クローン）のマウス胚ライブラリー、および400プール （１プール当たり35〜55クローン）のサイズ分画したマウス胚ライブラリーをス クリーニングした。マウス脳ライブラリーから６つのポジティブプールを同定し た。 マウス脳ライブラリーからの最初のポジティブプール(100.3)のデコンボリュ ーションは、c-fos誘導性の段階的な増加を示した。デコンボリュートされた100 .3の最終クローンの配列は、それが全長のbFGF(繊維芽細胞増殖因子)cDNAをコー ドしたことを示した。Cos/NIH3T3システムを通じてのFGFのクローニングは、シ ステムの潜在能力を実証した。マウス胚ライブラリーの残りの５つのポジティブ プールもまた、bFGF cDNAにデコンボリュートされた。FGFはc-fos転写を誘導す ることが知られている増殖因子である。 実施例12 Ｂ細胞リンパ腫を処置するための候補治療剤に対するＢ細胞応答性の試験 10mlのヘパリン処理した末梢血を、Ｂ細胞リンパ腫を有する患者から得る。 血液を、1.077g/mlの密度の10mlのFicoll-Hypaqueに重層し、そして1900×gで15 分間、20℃でスピンする。界面において白血球を取り出し、滅菌リン酸緩衝化生 理食塩水中で２回洗浄する。細胞を再懸濁し、そして60分間37℃でプレートして 、単球を接着させる。非接着細胞を取り出し、そして平底滅菌ガラスボトル中で ２-アミノエチルイソチオウロニウムブロミドヒドロブロミド（2-aminoethyliso thioruonium bromide hydrobromide）で処理した等容量のヒツジ赤血球と混合す る。細胞を300×gで10分間20℃でスピンし、２時間室温で放置する。再懸濁した 細胞をゆっくりと懸濁し、そしてロゼット化Ｔ細胞をFicoll-Hypaque(10ml)に重 層することにより除去する。白血球を界面から取り出し（これは主にＢ細胞であ る）、そしてリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁し、そして２回洗浄する。10ml の血液は健康なドナーから約10⁶の細胞を与え、そしてＢ細胞リンパ腫の患者か らは変動する量を与える。次いで、細胞をマイクロウェルプレート中にプレート する。 次いで、Ｂ細胞についての候補治療物をウェル中で試験し、そして治療物の投 与に際してのIL-2発現の減少についてスクリーニングする。IL-2転写物に特異的 なbDNAを、IL-2転写の減少を検出するために用いる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エスコベド，ジェイミー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131, アラモ，リボーナ ロード 1470

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子発現を変調する因子の高スループットスクリーニング方法であって、 以下の工程： （ａ）少量の候補因子を提供する工程； （ｂ）少量の応答細胞を提供する工程； （ｃ）該応答細胞と該候補因子とを接触させる工程であって、ここで該応答細 胞は、初期細胞内事象を示すことにより、遺伝子発現を変調する因子に応答し得 る、工程；および （ｄ）該初期細胞内事象を直接的に検出する工程、 を包含する、方法。 ２．前記工程（ｄ）が、ポリヌクレオチド配列の標的ポリヌクレオチドへのハイ ブリダイゼーションにより容易にされる検出を包含する、請求項１に記載の方法 。 ３．前記標的ポリヌクレオチドがmRNA転写物である、請求項２に記載の方法。 ４．前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前記ポリヌクレオチド配列 が、合成DNA、合成RNA、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、 およびRNase保護アッセイプローブからなる群より選択されることをさらに包含 する、請求項２に記載の方法。 ５．前記合成DNAが分枝DNAを含む、請求項４に記載の方法。 ６．前記工程（ａ）が、ポリペプチド因子、低分子因子、およびポリヌクレオチ ド因子からなる群より選択される候補因子を含む、請求項１に記載の方法。 ７．前記ポリペプチド因子がcDNA分子またはcRNA分子によりコードされる、請求 項６に記載の方法。 ８．前記cDNA分子またはcRNA分子が産生細胞において発現される、請求項７に記 載の方法。 ９．前記低分子因子が、有機低分子、ペプチド分子、およびペプトイド分子から なる群より選択される低分子を含む、請求項６に記載の方法。 １０．前記ポリヌクレオチド因子が、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌク レオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項６に記載の 方法。 １１．前記工程（ｃ）が、産生細胞および応答細胞を同時培養する工程を包含す る、請求項１に記載の方法。 １２．前記産生細胞が、候補ポリペプチド因子をコードするcDNAまたはcRNAで形 質転換される、請求項１１に記載の方法。 １３．前記産生細胞がXenopus卵母細胞である、請求項１１に記載の方法。 １４．前記応答細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の方法。 １５．前記遺伝子発現を変調する候補因子が、刺激因子および阻害因子からなる 群より選択される因子を含む、請求項１に記載の方法。 １６．前記刺激因子が、増殖因子、転写因子、分化因子、発生レギュレーター、 アポトーシス因子、免疫調節因子、および発ガン因子からなる群より選択される 因子を含む、請求項１５に記載の方法。 １７．前記標的ポリヌクレオチドが、誘導タンパク質をコードする遺伝子の転写 物を含む、請求項２に記載の方法。 １８．前記標的ポリヌクレオチドが、サイトカイン、造血因子、神経分化因子、 増殖因子、タンパク質ホルモン、リプレッサータンパク質、および組織マーカー からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子の転写物を含む、請求 項２に記載の方法。 １９．前記標的ポリペプチドが、DNA結合タンパク質、疾患マーカー、増殖マー カー、分化マーカー、アポトーシスマーカー、転移マーカー、疾患の後期発症に 関連するマーカー、およびオンコジーンからなる群より選択されるタンパク質を コードする遺伝子の転写物を含む、請求項１７に記載の方法。 ２０．前記工程（ａ）が、前記候補因子が、産生細胞の天然産物、前記候補因子 をコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された産生細胞による発現の産物 、および低分子ライブラリー由来の低分子からなる群より選択されることを包含 する、請求項１に記載の方法。 ２１．前記工程（ｂ）が、天然細胞である応答細胞を含む、請求項１に記載の方 法。 ２２．前記工程（ｂ）が、レポーター遺伝子構築物で形質転換された応答細胞を 含む、請求項１に記載の方法。 ２３．前記候補因子が、前記産生細胞の表面上で発現される、請求項８に記載の 方法。 ２４．前記候補因子が、前記産生細胞により分泌される、請求項８に記載の方法 。 ２５．前記応答細胞が、原核生物細胞または真核生物細胞を含む、請求項１に記 載の方法。 ２６．前記応答細胞が、哺乳動物細胞、菌類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、蠕形動 物細胞、魚類細胞、甲殻類細胞、は虫類細胞、両生類細胞、および植物細胞から なる群より選択される真核生物細胞を含む、請求項２５に記載の方法。 ２７．前記産生細胞が、原核生物細胞または真核生物細胞を含む、請求項８に記 載の方法。 ２８．前記産生細胞が、哺乳動物細胞、菌類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、蠕形動 物細胞、魚類細胞、甲殻類細胞、は虫類細胞、両生類細胞、および植物細胞から なる群より選択される真核生物細胞を含む、請求項２７に記載の方法。 ２９．前記工程（ｄ）の初期細胞内事象が、転写の増加または減少を含む、請求 項１に記載の方法。 ３０．前記阻害因子が標的ポリヌクレオチド量を減少させ、ここで、該標的ポリ ヌクレオチドが、サイトカイン、造血因子、神経分化因子、増殖因子、タンパク 質ホルモン、リプレッサータンパク質、および組織マーカーからなる群より選択 されるタンパク質をコードする遺伝子の転写物を含む、請求項１５に記載の方法 。 ３１．前記標的ポリペプチドが、DNA結合タンパク質、疾患マーカー、増殖マー カー、分化マーカー、アポトーシスマーカー、転移マーカー、疾患の後期発症に 関連するマーカー、およびオンコジーンからなる群より選択されるタンパク質を コードする遺伝子の転写物を含む、請求項３０に記載の方法。 ３２．公知のリガンドを結合するレセプターの高スループットスクリーニングに おける使用のための請求項１に記載の方法であって、以下の前記工程（ａ）から 前記工程（ｂ）の改変： （ａ）少量の候補レセプターを提供する工程； （ｂ）公知のリガンドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された応 答細胞を提供する工程； （ｃ）候補レセプターを含む応答細胞とリガンドとを接触させ、該応答細胞に おける検出可能な初期細胞内事象を誘発するレセプター/リガンド特異的結合対 の形成を可能にする工程；および （ｄ）該初期細胞内事象を検出する工程、 を包含する、方法。 ３３．前記リガンドが、産生細胞の天然産物、該リガンドをコードするポリヌク レオチド配列で形質転換された産生細胞による発現の産物、および低分子からな る群より選択される分子を包含する、請求項３２に記載の方法。 ３４．前記応答細胞が、前記候補レセプターをコードするポリヌクレオチドで形 質転換されている、請求項３２に記載の方法。 ３５．前記ポリヌクレオチドが、cDNA分子、cRNA分子、およびゲノムDNA分子か らなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。 ３６．前記ポリヌクレオチドが、哺乳動物、菌類、昆虫、蠕形動物、鳥類、魚類 、甲殻類、細菌、は虫類、両生類、および植物からなる群より選択される生命形 態のcDNAライブラリーに由来する、請求項３４に記載の方法。 ３７．前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。 ３８．前記工程（ｄ）が、前記初期細胞内事象が、bDNAアッセイ、RNase保護ア ッセイ、およびRT-PCRからなる群より選択されるものより検出される工程を包含 する、請求項１に記載の方法。 ３９．前記細胞内事象が、bDNAアッセイ、RNase保護アッセイ、およびRT-PCRか らなる群より選択されるものより検出される、請求項３２に記載の方法。 ４０．前記公知のリガンドが、Noggin、Wnt、Notchからなる群より選択されるリ ガンドを含む、請求項３２に記載の方法。 ４１．公知のレセプターを結合する未知のリガンドの高スループットスクリーニ ングにおける使用のための請求項１に記載の方法であって、以下の前記工程（ａ ）から前記工程（ｂ）の改変： （ａ）少量の候補リガンドを提供する工程； （ｂ）公知のレセプターをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された 応答細胞を提供する工程； （ｃ）公知のレセプターを発現する応答細胞と候補リガンドとを接触させ、該 応答細胞における検出可能な初期細胞内事象を誘発するレセプター/リガンド特 異的結合対の形成を可能にする工程；および （ｄ）該初期細胞内事象を検出する工程、 を包含する、方法。 ４２．前記リガンドが、産生細胞の天然産物、前記リガンドをコードするポリヌ クレオチド配列で形質転換された産生細胞による発現の産物、および低分子から なる群より選択される分子を包含する、請求項４１に記載の方法。 ４３．前記候補リガンドが、レセプターに対するアンタゴニストである、請求項 ４１に記載の方法。 ４４．前記工程（ａ）が、候補リガンドをコードするポリヌクレオチドで産生細 胞を形質転換する工程を包含する、請求項４１に記載の方法。 ４５．前記ポリヌクレオチドが、cDNA分子、cRNA分子、およびゲノムDNA分子か らなる群より選択される分子を含む、請求項４４に記載の方法、 ４６．前記cDNA分子またはゲノムDNA分子が、哺乳動物、菌類、昆虫、蠕形動物 、鳥類、魚類、甲殻類、細菌、は虫類、両生類、および植物からなる群に由来す るライブラリーから選択される配列に由来する、請求項４５に記載の方法。 ４７．前記ライブラリーが哺乳動物に由来する、請求項４６に記載の方法。 ４８．前記哺乳動物がヒトである、請求項４７に記載の方法。 ４９．前記細胞内事象が、遺伝子の転写における変化を検出し得るアッセイによ り検出される、請求項４１に記載の方法。 ５０．前記アッセイが、bDNAアッセイ、RNase保護アッセイ、およびRT-PCRから なる群より選択されるアッセイを含む、請求項４９に記載の方法。 ５１．前記因子が、遺伝子の転写活性の調節を引き起こす、請求項１に記載の方 法。 ５２．前記工程（ｃ）が、転写活性を調節するその能力について試験される候補 因子と、転写調節に供される調節配列を含む応答細胞とを接触させる工程をさら に包含し、さらにここで該工程（ｄ）が、該調節配列のアップレギュレーション 活性またはダウンレギュレーション活性を検出する工程をさらに包含する、請求 項５１に記載の方法。 ５３．前記応答細胞が、初期細胞内事象を示すことにより、遺伝子発現を変調す る因子に対して応答し得る、請求項５１に記載の方法。 ５４．前記応答細胞が、転写調節に供される調節配列に結合したレポーター遺伝 子配列で形質転換されない、請求項５１に記載の方法。 ５５．前記応答細胞が、転写調節に供される調節配列に結合したレポーター遺伝 子配列で形質転換される、請求項５１に記載の方法。 ５６．前記アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの検出が、レ ポーター遺伝子発現の検出により行われる、請求項５５に記載の方法。 ５７．前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、分泌性アルカリホスファター ゼ、β−ガラクトシダーゼ、CAT、およびGFPからなる群より選択されるレポータ ー遺伝子を含む、請求項５６に記載の方法。 ５８．前記レポーター遺伝子発現の検出が、核酸ハイブリダイゼーションアッセ イにより達成される、請求項５６に記載の方法。 ５９．前記レポーター遺伝子発現の検出が、bDNAアッセイ、RNase保護アッセイ 、およびRT-PCRからなる群より選択されるアッセイによって検出される、請求項 ５７に記載の方法。 ６０．前記調節配列が、プロモーター、エンハンサー、およびリプレッサーから なる群より選択される調節配列を含む、請求項５２に記載の方法。 ６１．前記候補因子が、産生細胞またはウイルスの天然産物、前記候補因子をコ ードするポリヌクレオチド配列で形質転換された産生細胞またはウイルスによる 発現の産物、および低分子からなる群より選択される因子を包含する、請求項５ １に記載の方法。 ６２．前記調節配列が、ウイルス遺伝子、バクテリオファージ遺伝子、原核生物 遺伝子、および真核生物遺伝子からなる群より選択される遺伝子に由来する調節 配列を含む、請求項５２に記載の方法。 ６３．前記真核生物遺伝子が、サイトカイン、造血因子、神経分化因子、増殖因 子、分化因子、タンパク質ホルモン、転写因子、リプレッサータンパク質、DNA 結合タンパク質、組織マーカー、ガンマーカー、疾患マーカー、obタンパク質、 A20タンパク質、ICAM、c-fosタンパク質、および任意の誘導性タンパク質からな る群より選択されるものを含む、請求項６２に記載の方法。 ６４．前記真核生物遺伝子が、哺乳動物遺伝子、菌類遺伝子、蠕形動物遺伝子、 昆虫遺伝子、鳥類遺伝子、魚類遺伝子、甲殻類遺伝子、は虫類遺伝子、両生類遺 伝子、および植物遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む、請求項６２に 記載の方法。 ６５．請求項１に記載の方法により発見される増殖因子。 ６６．請求項１に記載の方法により発見される分化因子。 ６７．請求項１に記載の方法により発見される阻害因子。 ６８．請求項１に記載の方法により発見されるリガンド。 ６９．請求項１に記載の方法により発見されるレセプター。 ７０．請求項１に記載の方法により発見されるホルモン。 ７１．請求項１に記載の方法により発見されるサイトカイン。 ７２．請求項１に記載の方法により発見される転写因子。 ７３．請求項１に記載の方法により発見されるレセプターに対するアンタゴニス ト。 ７４．請求項６５に記載の増殖因子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド。 ７５．請求項６６に記載の分化因子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド。 ７６．請求項６７に記載の阻害因子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド。 ７７．請求項６８に記載のリガンドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド。 ７８．請求項６９に記載のレセプターをコードするヌクレオチド配列を含むポリ ヌクレオチド。 ７９．請求項７０に記載のホルモンをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド。 ８０．請求項７１に記載のサイトカインをコードするヌクレオチド配列を含むポ リヌクレオチド。 ８１．請求項７２に記載の転写因子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ クレオチド。 ８２．請求項７３に記載のレセプターに対するアンタゴニストをコードするヌク レオチド配列を含むポリヌクレオチド。 ８３．配列番号２の配列の一部を含み、そしてc-fos転写の誘導により実証され るような増殖因子活性を示すポリペプチド。 ８４．前記c-fos転写の誘導が、正常なレベルより少なくとも約５倍大きな誘導 である、請求項８３に記載のポリペプチド。 ８５．配列番号２の配列を有するポリペプチド。 ８６．請求項８５に記載のポリペプチドのアナログ、誘導体、および改変体から なる群より選択される分子を含むポリペプチド。 ８７．請求項８６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。 ８８．異種ポリヌクレオチド配列に結合した配列番号１のポリヌクレオチド配列 。