JP2002514764A - 血清中の抗体を検出するための指示片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者の血清中の抗体を検出するための指示片（１）であって、１つまたは複数の疾病に対する抗原が固定され、そこで患者の血清が添加されると、対応する抗原が該疾病に相当する抗体に粘着し、該抗体が続く反応において着色ステインの形で可視化する、１つまたは複数の区域（５）を含んでなる指示片に関する。ヒト抗体が異なった濃度で固定されている、本発明の別の区域（６）が、前記抗体を定性的のみならず、その量をも決定するできるように提供される。生成する着色ステインを評価することによって、血清中の抗体の濃度を推定することが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、患者の血清中の抗体を検出するための指示片であって、１つまたは
複数の疾病に対する抗原が固定化された、１つまたは複数の区域を含んでなり、
そこで患者の血清が添加されると、対応する抗原が該疾病に相当する抗体に粘着
し、該抗体が続く反応において着色ステインの形で可視化される前記指示片に関
する。

【０００２】

【従来の技術】

このような酵素免疫アッセイと称される、血液中の抗体の検査のための指示片
は、ドイツ公開ＤＥ３３４６７９５Ａ１からすでに公知であり、特許請求の範囲
の請求項１の前提部を構成する。そこに記載された検査は、ウイルス、細菌等の
病原菌よって引き起こされる感染のような疾病の血清学的検出に役立つ。前記検
査は、疾病が存在するとき生体が病原菌抗原にぴったり適合する抗体を血清（血
液）中につくる（それらは抗原に結合し、無害化する）事実を利用する。従って
、このような疾病特異的な抗体が血清中に検出されうるならば、患者は現在また
は過去にその疾病を持っていたことが間接的に導かれる。その作用機構のために
、前記検査は所謂、間接測定方法に属する。何故なら、検査は病原菌（抗原）を
それ自体検出するのではなく、病原菌に応答して生体によってつくられる特異的
な抗体を検出するからである。

【０００３】 前記公知の検査片を製造するために、まず抗原、すなわち既知の疾病の原因と
なる蛋白を種々の疾病について複数の検査区域（特に、ニトロセルロースフィル
ムまたはポリアミドフィルム）の固相上に塗付し、固定化する。その後、抗原に
よって占有されていないフィルムの吸着部位が飽和される。前記検査を実施する
ためには、患者の血清を滴らす。該患者の血清中に、病原菌に特異的な抗体が存
在するかぎり、沈積した疾病に対応する抗原と特異的な結合（すなわち、抗原抗
体反応、Ａｇ−Ａｋ−または免疫反応）を形成する。それから抗原と反応した抗
体は、続く反応で例えば、特定の酵素コンジュゲート（接合体）との処理、およ
びその後該コンジュゲート中に含まれる酵素の基質と色素前駆体とを加えること
によって可視化される。その結果、明瞭に見え、そしてフィルムにしっかり付着
する着色ステイン（「ブロット」、または免疫反応の後では「免疫ブロット」と
呼ばれる）がフィルム上に形成する。上記の処理工程の各々の後で、過剰な試薬
が付加的な工程で洗浄によって除去される。最後に、フィルム上の暗色染色（Ｄ
ｕｎｋｅｌｆａｒｂｕｎｇ）を可視的に評価する。以前に罹った、または現在あ
る疾病に対応する区域は、染色されるが、一方他の区域は、染色されない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】

上記の方法およびそれに使用する測定片は、血清中の病原菌に特異的な抗体（
従って、疾病）を定性的に検出するのを可能にするが、定量的検出は可能にしな
い。疾病がある、或いはあったかどうか知るだけではなく、どれだけの抗体が存
在するか、すなわち、前記疾病の重症度および急性度を知ることも望ましい。

【０００５】 従って、本発明は血液中に存在する抗体の定量化を可能にする指示片を提供す
る課題を基礎におく。

【０００６】

【課題を解決するための手段】

上記課題を解決するために、本発明の指示片はそれにヒト基準抗体が異なる濃
度で固定化されている別の区域が提供されていることを特徴とする。前記区域は
、免疫反応の後に続く公知の（酵素）反応の際、抗体の数に対応して染色される
。該区域と抗原区域の着色度（明度の比較）とを比較することによって、どのよ
うな疾病が存在するかのみならず血清中の抗体の量、すなわち該疾病の重症度お
よび急性度を判定することができる。

【０００７】 本発明は、着色化反応（染色反応）が検査する液体（体液）からの固相に固定
化された生体固有の抗体のみならず、固相に提供された基準抗体をも均等に標識
するという、予期せずに発見された事実を利用する。酵素−基質染色反応は、生
体固有の抗体と同様に基準抗体の暗色染色をも引き起こす。基準抗体は、検査片
の固相に異なった濃度で塗付されているが、酵素−基質染色反応は、該基準抗体
のそれぞれの濃度に特徴的な着色ステインを形成するので、色の比較尺度および
それとともに固相上の抗体の濃度に対する比較標準がつくられる。この比較標準
と生体固有の抗体それぞれの暗色染色との間の視覚による色の検定によって、抗
体の定量が直接的に可能になる。従って、沈積している基準抗体の濃度を読み取
ることによって、色が同一であるなら、量も同一性と言える。生体固有の抗体の
染色強度が沈積している基準抗体の濃度の二つの染色強度間にある場合、生体固
有の抗体量もその二つの濃度の間にある値として読み取られうる。従って、免疫
性、すなわち病原菌に対する後天性の抵抗力を調べること、並びに感染病、自己
免疫病（例えば、リウマチ、アレルギー、腫瘍等）のような根底にある疾病の状
態または重症度を決定することができる。

【０００８】 ある所定の病原菌に対する薬剤そして／または該薬剤の用量の有効性を本発明
に従い抗体の濃度を決定することによって、インキュベーション時間の後で定量
的に調べることができるので、本発明はある疾病の動的な進行具合をよりよくモ
ニターすることも可能にする。本発明は、さらに液体中の抗体を定量的に検出す
るための測定装置を提供し、該装置は直接読み取ることができ、普遍的にいつい
かなる場所でも使用することができるのみならず、安価に製造することができる
。

【０００９】 本発明を実施するにあたり、特定の抗原（単一の疾病を検出するための片の場
合）または特定の抗原類（複数の疾病を検出するための片の場合）が好適に、固
相に塗付される。このようにして、抗体の該固相への結合を保証する。異なった
複数の抗原を前記固相に塗付し、幾つか疾病、例えば異なった感染症を同時に検
査することができる。

【００１０】

【発明の実施の形態】

本発明の１つの有利な実施の形態は、同一の亜型特異的なクラス、例えばＩｇＧ
、ＩｇＡ、ＩｇＭ等を有する基準抗体が塗付されることにある。このようにして
、検査（検定）はある所定の疾病を検査するために定量化にいたる。言い換えれ
ば、基準抗体としてある所定の亜型特異的なクラスを適用すると疾病を検出する
のに要求される決定的な基準が提供される。比較標準を備える異なった亜型特異
的な基準抗体を用いることによって、体液中に存在する亜型特異的な抗体クラス
もまた決定することができる。

【００１１】 本発明の別の実施の形態に従えば、抗体および基準抗体を検出するために、固
相を酵素コンジュゲート、例えば亜型特異的な免疫グロブリンＧ型、Ａ型、また
はＭ型（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）等で処理することになる。このようにして、
使用した酵素コンジュゲートと比較して同一の亜型特異的なクラスが占有すると
ころの抗体および基準抗体のみが標識される。検査する液体中に存在する抗体ク
ラスを決定するのに、同一の亜型特異的なクラスの基準抗体および酵素コンジュ
ゲートを用いる。

【００１２】 本発明の１つの有利な実施の形態は、基質として、好ましくはテトラメチルベ
ンジジンに基づく酵素基質が沈殿着色に用いられることにある。このようにして
、高い感度を有する、よく粘着し、安定な着色が固相上に、しかも標識された抗
体が位置する箇所のみならず、標識された基準抗体が位置する箇所にも生成する
。

【００１３】 抗原としては有機物質、特にタンパク質、炭水化物、脂肪、核酸等、また同様
に無機物質も含まれ得る。このようにして、有機物質のみならず、無機物質によ
って生体内で産生される抗体が、固相に結合されるので、本発明の指示片によっ
て化学物質に対する免疫性および例えば、化学毒素による敗血症の経過の検査が
可能となる。

【００１４】 本発明の別の好適な実施の形態に従えば、蛍光性または放射性標識物質として
のトレーサーを使用することができる。とりわけ、このようにして、その目的の
ために特に装備された実験室内で前記検査片で測定した抗体濃度の正確な数値を
求めることが可能になり、そこで分光光度計、電気泳動装置、および／または放
射能測定装置を前記計数に使用することができる。

【００１５】 本発明の指示片の１つの好適な実施の形態は、固相が吸着フィルムとし形成さ
れることにある。こうして、抗原および基準抗体の吸着フィルムの表面上への沈
積が達成される。沈積物は、安定であるので本発明の測定片が好ましくは４℃の
環境温度で数ヶ月貯蔵できる。

【００１６】 本発明のさらに好適な特徴に従えば、反応区域および／または標準区域は、例
えば検査する病原菌の名称、対照ラベル、記号等のデータ区域に、分類され、例
えば印刷されている。このようにして測定片を評価するとき、その属する反応区
域が、染色を示すと、検査される疾病の１つを直接的に検出することが可能であ
る。さらに、例えば、印刷された対照ラベルを備える基準区域は、異なった濃度
の基準抗体が塗付された基準区域の再構成が確認されているので、評価によって
疾病の重症度も直接的に決定できる。このため酵素−基質染色反応によっておき
る反応区域の暗色染色と基準区域の暗色染色とを互いに比較する。

【００１７】 複数の異なった病原菌を検出する酵素免疫アッセイのための本発明の指示片の
２つの実施例は、後の図面に例示された例に基づいて、詳細に説明される。さら
に、記載された、および／例示されたすべての特徴は、単独でまたは任意の組み
合わせで本発明の主題を構成する。

【００１８】 図１および図２は、抗体を検出するための本発明に従う測定片の可能な実施の
形態を示す。

【００１９】 本発明の測定片１は、図１に示されており、０．４５μｍの孔径を有する、市
販のニトロセルローズフィルム材２を含む。外側の境界線３および同定区域４は
、前記ニトロセルローズフィルム２上で指示片１の大きさに印刷されている。さ
らに、上下に配置された複数の抗原区域５および抗体区域６が左および右欄にそ
れぞれ印刷されている。加えて、検査する病原菌の名称が行として配置されてい
る左側の抗原区域５の上方にそれぞれ印刷されている。対照ラベルは、異なった
濃度を表す、例えばＡからＨの文字でそれぞれ右側抗体区域６の上方に印刷され
ている。ここで選択された、検査する８個の呼吸器系病原菌の実施例の場合、こ
れは左側の欄にあるインフルエンザウイルスＡおよびＢ、アデノウイルス、肺炎
マイコプラズマ菌、百日咳菌、パラインフルエンザ１〜３、ＲＳＶ、ＨＳＶ、そ
してコクサッキーウイルスである。

【００２０】 本発明の指示片の作製は、例えば、ニトロセルロースフィルム２をリン酸緩衝
液（ＰＢＳバッファ）中で湿らせることにより実施される。さらに、検査する病
原菌用の蛋白抗原の溶液は、市販の蛋白抗原から公知の様式で５〜１５ｎｇ／μ
ｌの濃度に調製される。

【００２１】 ニトロセルロースフィルム２は、続いて通常のドットブロット装置、例えばＨ
ｏｆｅｒ社製「スロットブロッター（ＳｌｏｔＢｌｏｔｔｅｒ）」にはめ込まれ
る。

【００２２】 引き続き、１５０μｌの希釈した蛋白抗原溶液（約５００ｎｇ〜１．５μｇタ
ンパク質に相当する）がニトロセルロースフィルム２の左側の欄の一部をなして
いる抗原区域５に塗付される。それから、連続して増加する濃度のヒト抗体を含
む溶液がニトロセルロースフィルム２の右側の欄の抗体区域６に塗付される。

【００２３】 前記タンパク質溶液とヒト抗体溶液の吸着を許す反応時間の後、ニトロセルロ
ースフィルム２をＰＢＳバッファで洗浄する。

【００２４】 ニトロセルロースフィルム２をそれから粉ミルク溶液で処理して、該フィルム
の占有されていない吸着箇所のまわりを飽和させる。

【００２５】 その後、ニトロセルロースフィルム２をＰＢＳバッファで３回続けて洗浄し、
それから室温で減圧下、乾燥する。

【００２６】 最後に、本発明の測定片１を境界線３の外側で打ち抜く。このようにして製造
された本発明の指示片１をフィルムの状態で乾燥剤とともにパックし、４℃で後
の使用のために貯蔵する。

【００２７】 測定片１は、医者によってまたは実験室で、例えばまず測定片１を上記の調製
された粉ミルク溶液で処理し、再生することにより使用できる。それから、検査
する患者の血清を粉ミルク溶液中、公知の方法に従い希釈し、測定片１に塗付す
る。これによって、免疫反応が起き、前記血清中に含まれる病原菌特異的抗体が
左側の欄上の抗原区域５に沈積している抗原と特異的な結合を形成する。

【００２８】 続いて、結合しない血清の成分を、吸引し、そして測定片１を通常のＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ洗剤で３回洗浄する。

【００２９】 その後で、随意のクラスの抗ヒト免疫グロブリン酵素コンジュゲートとのイン
キュベーションが続き、それによって病原菌特異的抗体が標識される。酵素コン
ジュゲートの添加によって、測定片の右側欄に塗付された異なる濃度のヒト抗体
も標識される。

【００３０】 ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗剤でのさらなる洗浄工程が続き、そこではＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ洗剤を３回交換する。洗剤を除去するためにフィルムをもう一度蒸留水で
洗浄する。

【００３１】 染色はテトラメチルベンジジンに基づく、Ｋｉｒｋｅ−Ｇａａｒｄ Ｐｅｒｒ
ｙ社の市販基質（製品コード５０−７７−０２）を各フィルムあたり１ｍｌを用
いて、生成される。

【００３２】 測定片１を蒸留水で徹底的に洗浄して、染色工程を終了する。

【００３３】 ８個の呼吸器系病原菌の実施例を参照すると、測定片１の左側欄に配置された
抗原区域５は、異なった着色ステインを示し、その着色強度は血清に含まれる病
原菌特異的な抗体のそれぞれの量に依存する。測定片１の右側欄に配置された抗
体区域６は、継続的に増加する着色強度を有する着色ステインを示し、これは塗
付されたヒト抗体の異なる濃度によって生じる。

【００３４】 患者の血清中の抗体の量から疾病の病状についての結論を導き出すことは、測
定片１の左側欄の区域５の着色強度と右側欄の区域６の着色強度との視覚による
色の検定で実現する。左側抗原区域５の一つまたは複数の着色（例えば、「アデ
ノウイルス」と表示された区域）が右側の抗体区域６の一つの着色（例えば、対
照ラベルＦ）と同一ならば、患者の血清中に含まれるアデノウイルスの抗体濃度
は、対応する暗色染色を有する抗体区域６の値に相当する。左側区域５の一つの
着色強度（例えば、「ＨＳＶ」と表示された区域）が二つの隣接する右側区域６
の着色強度の中間（例えば、対照ラベルＤおよびＥの着色強度の間）にあるなら
ば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶウイルス）に対する患者の血清に含まれる抗
体濃度は、対応する区域６Ｄと６Ｅとの二つの濃度の中間値に相当する。

【００３５】 図２は、同定区域４ａ、ならびに上下に配置された複数の抗原区域５および抗
体区域６を有する非常に狭い測定片１ａを示す。これは特に小さく（例えば、５
ｘ３ｍｍ）、それによって１つの検査に患者の血清の極少量しか必要とされない
。検査する病原菌の名称は、それぞれ抗原区域５の上方に、そして各濃度は抗体
区域６の上方に、例えば、異なる濃度についてＡ〜Ｄの文字、さらに対照チェッ
クの区域（抗体なし）について「−」が印刷されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 抗体を検出するための本発明に従う測定片の可能な実施の形態を示す。

【図２】 抗体を検出するための本発明に従う測定片の可能な実施の形態を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＮ，ＪＰ，Ｋ Ｒ，ＵＳ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者の血清中の抗体を検出するための指示片（１）であって
   、１つまたは複数の疾病に対する抗原が固定化された、１つまたは複数の区域（
   ５）を含んでなり、そこで患者の血清が添加されると、対応する抗原が該疾病に
   相当する抗体に粘着し、該抗体が続く反応において着色ステインの形で可視化さ
   れ、さらにヒト基準抗体が異なる濃度で固定化されている、別の区域（６）によ
   って特徴付けられる前記指示片。
2. 【請求項２】 前記基準抗体を固定化する手段として、少なくとも１つの特
   定の抗原が固相（２）上に塗付されることを特徴とする、請求項１に記載の指示
   片。
3. 【請求項３】 同一の亜型特異的なクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ
   等を有する基準抗体が提供されていることを特徴とする、請求項１または２に記
   載の指示片。
4. 【請求項４】 前記続く反応が酵素コンジュゲ―トを用いて行われることを
   特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の指示片。
5. 【請求項５】 前記続く反応での基質として、好ましくはテトラメチルベン
   ジジンに基づく酵素基質が沈殿着色のために使用されることを特徴とする、請求
   項１〜４のいずれか１項に記載の指示片。
6. 【請求項６】 蛍光性または放射性標識物質が続く反応のために使用され、
   そこで後者の場合、前記着色ステインは、非光学スペクトル領域に位置すること
   を特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の指示片。