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JP2002513575A - Attenuated influenza virus - Google Patents

Attenuated influenza virus

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JP2002513575A
JP2002513575A JP2000547239A JP2000547239A JP2002513575A JP 2002513575 A JP2002513575 A JP 2002513575A JP 2000547239 A JP2000547239 A JP 2000547239A JP 2000547239 A JP2000547239 A JP 2000547239A JP 2002513575 A JP2002513575 A JP 2002513575A
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JP
Japan
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virus
influenza
cells
segment
nucleic acid
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Withdrawn
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JP2000547239A
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Japanese (ja)
Inventor
ブラウンリー,ジョージ,ゴウ
フォドー,アーヴィン
パレッセ,ピーター
ガルシア−サストレ,アドルフォ
Original Assignee
アイシス イノヴェイション リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アイシス イノヴェイション リミテッド filed Critical アイシス イノヴェイション リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 インフルエンザウイルスタンパク質またはその機能性改変体のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3'非コード領域を含む、ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイルスを提供する。前記二本鎖領域は少なくとも1つの塩基対置換を有し、その結果、該ウイルスに感染した細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱毒化された表現型を与える。弱毒インフルエンザウイルスはワクチンとして使用できる。 (57) Abstract: 5 'and 3' non-coding regions providing mutant double-stranded regions of an influenza virus RNA genomic segment operably linked to a protein coding sequence of an influenza virus protein or a functional variant thereof Attenuated influenza virus carrying a genomic nucleic acid segment, comprising: The double-stranded region has at least one base pair substitution, resulting in reduced expression of the protein coding sequence in cells infected with the virus, resulting in an attenuated phenotype. Attenuated influenza virus can be used as a vaccine.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 本発明は、改変型ウイルス、特にインフルエンザウイルスワクチンとして使用
できる弱毒インフルエンザウイルスに関するものである。本発明の改変型ウイル
スには、標的細胞内で異種配列を発現させるためのウイルスベクターとして使用
するのに適した組換え体弱毒インフルエンザウイルスも含まれる。
The present invention relates to a modified virus, particularly to an attenuated influenza virus that can be used as an influenza virus vaccine. The modified viruses of the present invention also include recombinant attenuated influenza viruses suitable for use as viral vectors for expressing heterologous sequences in target cells.

【0002】 インフルエンザは依然として世界的にヒトの健康を脅かす存在である。不活化
インフルエンザウイルスワクチンが多年にわたって利用されてきたが、この種の
ワクチンは限られた防御を提供するにすぎない。インフルエンザの安全な弱毒生
ワクチンを提供しようとするこれまでの努力は、主として低温に順応したインフ
ルエンザウイルスに集中している。こうして、弱毒インフルエンザウイルスは、
以前には、低温でインフルエンザウイルスを徹底的に継代することによって得ら
れていた。低温での増殖に順応した結果、高温(約39℃)での複製能を失ったイ
ンフルエンザウイルスが得られる。このような低温順応型(cold-adapted: CA)ウ
イルスの複製は、比較的低温の上部気道では少ししか制限されないが、疾病に関
連した病理学の主要な部位である温かな下部気道では大いに制限される。野生型
と低温順応型のインフルエンザウイルスの配列比較により、いくつかの遺伝子セ
グメントのコード領域にアミノ酸変化をもたらす非サイレン突然変異とサイレン
突然変異の両方が明らかになった。ほとんどのアミノ酸変化は点突然変異の結果
であることが判明した。CAインフルエンザウイルスを世界中で一般的に利用され
るワクチンとして使用するには、点突然変異の遺伝的不安定性およびCAインフル
エンザウイルスの免疫原性のレベルについての潜在的問題が依然として残されて
いる。
Influenza remains a threat to human health worldwide. Although inactivated influenza virus vaccines have been available for many years, this type of vaccine provides only limited protection. Previous efforts to provide live, attenuated vaccines for safe influenza have focused primarily on cold-adapted influenza viruses. Thus, the attenuated influenza virus
Previously, it had been obtained by exhaustive passage of the influenza virus at low temperatures. Adaptation to low temperature growth results in an influenza virus that has lost replication at high temperatures (about 39 ° C). Replication of such cold-adapted (CA) viruses is only slightly restricted in the relatively cold upper respiratory tract, but is significantly restricted in the warm lower respiratory tract, a major site of disease-related pathology. Is done. Sequence comparisons between wild-type and cold-adapted influenza viruses have revealed both non-siren and siren mutations that result in amino acid changes in the coding regions of several gene segments. Most amino acid changes were found to be the result of point mutations. The use of the CA influenza virus as a commonly available vaccine worldwide remains a potential problem with the genetic instability of point mutations and the level of immunogenicity of the CA influenza virus.

【0003】 弱毒インフルエンザウイルスを得るために研究されてきた別の方法は、インフ
ルエンザウイルスゲノムセグメントの非コード領域が、異なる型のインフルエン
ザウイルスのゲノムセグメント由来の非コード領域で置換されているキメラ・イ
ンフルエンザウイルスの構築である。このような弱毒キメラA/Bインフルエン
ザウイルスは、例えば、Musterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:517
7-5181; Luoら, J. Virology (1992) 66:4679-4685;およびBergmann & Muster,
J. General Virology (1995) 76:3211-3215において述べられている。
Another method that has been studied to obtain an attenuated influenza virus is to use a chimeric influenza in which non-coding regions of influenza virus genomic segments have been replaced with non-coding regions from genomic segments of different types of influenza viruses. The construction of the virus. Such attenuated chimeric A / B influenza viruses are described, for example, in Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 517.
7-5181; Luo et al., J. Virology (1992) 66: 4679-4685; and Bergmann & Muster,
J. General Virology (1995) 76: 3211-3215.

【0004】 インフルエンザウイルスは3種類が知られており、A型、B型、C型と呼ばれ
ている。これらの型はそれぞれが多くの株を含んでいる。インフルエンザウイル
スのゲノムはいくつかの(-)センスRNAから成るセグメント化ゲノムであり(Aお
よびB型では8セグメント、C型では7セグメント)、A型の場合には10種のポ
リペプチドをコードしている。すなわち、ヌクレオキャプシドを形成しているRN
A指令RNAポリメラーゼタンパク質(PB1、PB2、PA)および核タンパク質(NP)、基質
タンパク質(M1、M2)、リポタンパク質エンベロープから突き出ている2種の表面
糖タンパク質(赤血球凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA))、ならびに非構造タ
ンパク質NS1およびNS2である。大多数のゲノムRNAセグメントはモノシストロン
性である。こうして、A型のインフルエンザウイルスの場合には、8つのゲノム
RNAセグメントのうち6セグメントがモノシストロン性で、HA、NA、NPおよびウ
イルスポリメラーゼタンパク質PB1、PB2、PAをコードしている。
[0004] Three types of influenza viruses are known, and are called type A, type B, and type C. Each of these types contains many strains. The influenza virus genome is a segmented genome consisting of several (-) sense RNAs (8 segments for types A and B, 7 segments for type C), and encodes 10 polypeptides for type A. ing. That is, the RN forming the nucleocapsid
A-directed RNA polymerase proteins (PB1, PB2, PA) and nucleoprotein (NP), substrate proteins (M1, M2), two surface glycoproteins protruding from the lipoprotein envelope (hemagglutinin (HA) and neuraminidase ( NA)), and the nonstructural proteins NS1 and NS2. Most genomic RNA segments are monocistronic. Thus, in the case of type A influenza virus, eight genomes
Six of the RNA segments are monocistronic and encode HA, NA, NP and the viral polymerase proteins PB1, PB2, PA.

【0005】 インフルエンザウイルスの複製においては、ウイルスゲノム(vRNA)がmRNAに転
写されて相補的RNA(cRNA)分子へと複製され、次いでこれがvRNA合成のための鋳
型として用いられる。これらのプロセスは、PB1、PB2およびPAポリペプチドによ
り形成された3サブユニットから成るウイルスポリメラーゼ複合体によって触媒
されることが知られている。mRNA合成はキャップされたRNAプライマーにより開
始されるが、該プライマーはウイルスポリメラーゼ複合体と関連したエンドヌク
レアーゼによって宿主細胞のmRNAから切断される。mRNAの合成は、インフルエン
ザAの場合にはvRNA鋳型の5'末端から16または17ヌクレオチド離れて、一連のウ
リジンで早期に終結し、続いてポリ(A)テイルが付加される。一方、cRNAの合成
は、プライマーの不在下で開始されてvRNAセグメントの正確な全長コピーをもた
らすと考えられている。核タンパク質はスイッチング因子として関与しており、
該因子はcRNA合成において抗ターミネーターとして働く。
In influenza virus replication, the viral genome (vRNA) is transcribed into mRNA and replicated into a complementary RNA (cRNA) molecule, which is then used as a template for vRNA synthesis. These processes are known to be catalyzed by a viral polymerase complex consisting of three subunits formed by PB1, PB2 and PA polypeptides. mRNA synthesis is initiated by a capped RNA primer, which is cleaved from host cell mRNA by an endonuclease associated with the viral polymerase complex. mRNA synthesis terminates prematurely with a series of uridines, 16 or 17 nucleotides away from the 5 'end of the vRNA template in the case of influenza A, followed by the addition of a poly (A) tail. On the other hand, cRNA synthesis is thought to be initiated in the absence of a primer, resulting in an exact full-length copy of a vRNA segment. Nuclear proteins are involved as switching factors,
The factor acts as an anti-terminator in cRNA synthesis.

【0006】 インフルエンザvRNAセグメントを、プラスミドDNAからの転写によりin vitro
で調製し、ウイルスポリメラーゼタンパク質および核タンパク質と混合して、転
写と複製に必要な全成分を有するリボ核タンパク質複合体(RNP)を形成させるこ
とができる。このようなRNPは、細胞パッケージング系で、例えばヘルパーウイ
ルスを用いて、生存能のあるインフルエンザウイルス粒子中に組み入れることが
できる。
[0006] Influenza vRNA segments are transcribed in vitro by transcription from plasmid DNA.
And can be mixed with a viral polymerase protein and a nucleoprotein to form a ribonucleoprotein complex (RNP) that has all components necessary for transcription and replication. Such RNPs can be incorporated into viable influenza virus particles in a cell packaging system, for example, using a helper virus.

【0007】 RNP再構成およびトランスフェクション系の開発により、転写開始、終結およ
びポリアデニル化の調節に係わるインフルエンザA vRNAのRNAシグナルの詳細な
特徴づけが可能となった(4, 20-22, 25, 32, 34)。これらのシグナルはすべて、
vRNAセグメントの末端配列にあることが知られている(19)。5'および3'末端はそ
れぞれ13および12個の保存されたヌクレオチドを含み、部分的に二本鎖のパンハ
ンドル(panhandle)/RNA-フォークまたはコルクスクリュー(corkscrew)構造を形
成することができる(6, 7, 13)。モデルRNA鋳型を用いた初期のin vitro転写研
究では、vRNAおよびcRNAプロモーターがもっぱら3'末端配列に位置すること(25,
32)、およびパンハンドルはin vitroで転写の開始に明らかな役割を担っていな
いことが示唆された。しかしながら、その後、末端配列の詳細な突然変異誘発実
験から、5'末端がプロモーターの必須部分を形成していることが示された。こう
した知見は、RNAポリメラーゼの推定上のプロモーターRNAへの結合実験(7, 33)
に基づいており、さらに重要なことには、変異体モデルRNA鋳型を用いたin vitr
o転写研究(7, 8, 28)にも基づいていた。加えて、ウイルスポリメラーゼ関連エ
ンドヌクレアーゼの活性化には、ポリメラーゼ複合体と、vRNAセグメントの3'末
端配列のみならず5'末端配列との相互作用が必要である(11)。
The development of RNP reconstitution and transfection systems has allowed detailed characterization of the influenza A vRNA RNA signal involved in regulating transcription initiation, termination and polyadenylation (4, 20-22, 25, 32, 34). All of these signals
It is known to be in the terminal sequence of the vRNA segment (19). The 5 'and 3' ends contain 13 and 12 conserved nucleotides, respectively, and can form a partially double-stranded panhandle / RNA-fork or corkscrew structure ( 6, 7, 13). Early in vitro transcription studies using model RNA templates showed that the vRNA and cRNA promoters were located exclusively at the 3 'end sequence (25,
32), and the panhandle did not play an apparent role in the initiation of transcription in vitro. However, subsequent mutagenesis experiments of the terminal sequences showed that the 5 'end forms an essential part of the promoter. These findings suggest that RNA polymerase binds to putative promoter RNA (7, 33).
And more importantly, in vitro using a mutant model RNA template.
o Based on transcription studies (7, 8, 28). In addition, activation of the viral polymerase-related endonuclease requires interaction of the polymerase complex with the 3 ′ as well as the 5 ′ end sequence of the vRNA segment (11).

【0008】 インフルエンザA vRNAセグメントのプロモーターの推定上の二本鎖領域は、
今では5〜8塩基対から成ることが認められている。最初の3塩基対は、5'末端
のヌクレオチド11'から13'および3'末端のヌクレオチド10から12により形成され
るもので、すべてのインフルエンザAウイルスの異なるvRNAセグメント間で厳格
に保存されている。塩基配列決定実験からは、インフルエンザBおよびC vRNA
セグメントの3'および5'非コード末端配列も高度に保存されており、部分的な逆
方向相補性を示すことがわかった(36, 37)。その結果として、パンハンドル構造
を形成するために非コード領域のヌクレオチドが塩基対合できることは、すべて
のインフルエンザvRNAが適切に機能するのに重要である。以下で用いるインフル
エンザvRNAセグメントの二本鎖領域という用語は、このような塩基対合によって
形成される領域をさすものと理解されるだろう。
[0008] The putative double-stranded region of the promoter of the influenza A vRNA segment is:
It is now recognized that it consists of 5-8 base pairs. The first three base pairs are formed by nucleotides 11 'to 13' at the 5 'end and nucleotides 10 to 12 at the 3' end and are strictly conserved among the different vRNA segments of all influenza A viruses. . From the sequencing experiments, influenza B and C vRNA
The 3 'and 5' non-coding end sequences of the segment were also highly conserved and were found to show partial reverse complementarity (36, 37). As a result, the ability of the noncoding region nucleotides to base pair to form a panhandle structure is important for all influenza vRNAs to function properly. As used below, the term double stranded region of an influenza vRNA segment will be understood to refer to the region formed by such base pairing.

【0009】 Kimら(14)は、以前に、推定上の二本鎖プロモーター領域の突然変異がクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の発現に及ぼす効果をMadin-D
arbyウシ腎(MDBK)細胞で調べるために、インフルエンザAウイルスNS遺伝子の非
コード配列によって(-)センスCAT RNAが挟まれているCATレポーター遺伝子構築
物を使用した。(-)センスCAT RNA構築物をRNP複合体に組み込み、その後ヘルパ
ーインフルエンザウイルスを感染させたMDBK細胞の単層にトランスフェクトし、
CAT活性についてアッセイした。このモデル系を使用すると、CAT遺伝子構築物の
3'末端の11位と12位および5'末端の12'位と13'位の保存残基の単一突然変異がCA
T活性を消失させるか、または実質的に消失させることがわかった。しかし、ワ
トソン-クリック塩基対合の可能性を回復させるように該構築物に第2の相補的
突然変異を導入すると、CAT活性が部分的に回復することが見いだされた。こう
して、塩基対C12-G13'をU12-A13'で、またはC11-G12'をA11-U12'で置換した構築
物は、野生型インフルエンザA遺伝子の非コード領域をもつ対照構築物と比較し
て、それぞれ31%と22%の比率でCATを発現することが判明した。
[0009] Kim et al. (14) have previously described the effect of a putative double-stranded promoter region mutation on chloramphenicol acetyltransferase (CAT) expression in Madin-D.
For testing in arby bovine kidney (MDBK) cells, a CAT reporter gene construct was used in which the (-) sense CAT RNA was flanked by non-coding sequences of the influenza A virus NS gene. Incorporating the (-) sense CAT RNA construct into the RNP complex and subsequently transfecting a monolayer of MDBK cells infected with helper influenza virus,
Assayed for CAT activity. Using this model system, the CAT gene construct
Single mutation of conserved residues at positions 3 and 11 at the 3 'end and at 12' and 13 'at the 5' end
T activity was found to be eliminated or substantially eliminated. However, it was found that CAT activity was partially restored when a second complementary mutation was introduced into the construct to restore the possibility of Watson-Crick base pairing. Thus, constructs in which base pair C12-G13 'was replaced with U12-A13' or C11-G12 'was replaced with A11-U12', respectively, as compared to a control construct having a non-coding region of the wild-type influenza A gene. It was found that 31% and 22% of CAT express CAT.

【0010】 同じCATレポーター遺伝子系がU10-A11'塩基対の突然変異の影響を調べるため
にも使用された。U10からG10およびA11'からC11'への単一の突然変異はCAT活性
を顕著に減少させたが、両方の突然変異体とも検出可能な活性を示した。G10-C1
1'塩基対を導入する2個の突然変異の組合せは、CAT活性の向上を示さなかった
。したがって、10-11'位の塩基対の性質は11-12'位および12-13'位のものと相違
する可能性のあることが示唆された。
[0010] The same CAT reporter gene system was also used to investigate the effects of U10-A11 'base pair mutations. Single mutations from U10 to G10 and A11 'to C11' markedly reduced CAT activity, but both mutants showed detectable activity. G10-C1
The combination of the two mutations introducing a 1 'base pair did not show an increase in CAT activity. Therefore, it was suggested that the nature of the base pair at positions 10-11 'may be different from those at positions 11-12' and 12-13 '.

【0011】 かかる実験は、ヒト培養細胞においてインフルエンザvRNA二本鎖領域の突然変
異が異種CATレポーター遺伝子の発現に及ぼす影響を単に調べたにすぎない。こ
うした研究から、いくらかのCAT活性を可能にする突然変異が、インフルエンザv
RNAゲノム断片に組み込まれたとき、該断片の生存可能なウイルスへのレスキュ
ーを可能にするのか否かを予想することは不可能である。同様に、たとえこの種
の突然変異が生存可能なウイルスを生じさせるとしても、かかるウイルスが弱毒
化されるのか否かを予測することも不可能である。実際、このことは、インフル
エンザAウイルスのNA遺伝子vRNAセグメントにおけるC12-G13'のU12-A13'による
塩基対置換が、生存能のあるインフルエンザAウイルス(MDBK細胞上で顕著な弱
毒化を示さない)へとレスキューされ得る、という本発明者らの知見により支持
される(実施例参照)。
[0011] Such experiments merely examined the effect of mutation of the influenza vRNA double-stranded region on the expression of the heterologous CAT reporter gene in cultured human cells. From these studies, mutations that allow for some CAT activity have been linked to influenza v
When integrated into an RNA genomic fragment, it is not possible to predict whether it will allow rescue of the fragment into viable virus. Similarly, even if such a mutation results in a viable virus, it is not possible to predict whether such virus will be attenuated. In fact, this indicates that base pair replacement of C12-G13 'with U12-A13' in the NA gene vRNA segment of influenza A virus is a viable influenza A virus (which does not show significant attenuation on MDBK cells). Supported by the inventors' finding that they can be rescued (see Examples).

【0012】 対照的に、インフルエンザAウイルスのNA特異的vRNAの二本鎖領域における11
-12'位でのCのAによるおよびGのUによる置換が、MDBK細胞上で、また培養下
の他の細胞型上でも、弱毒化へと至らせることが、今回見いだされた。さらに、
同じ塩基対置換を有するインフルエンザAウイルスは生体内で弱毒化され、かつ
野生型インフルエンザAウイルスに対する防御免疫を引き出しうることが示され
た。かかる弱毒化はNA特異的mRNAのポリアデニル化の減少から生じることが証拠
により示唆される。かくして、vRNAセグメントの二本鎖領域における塩基対置換
は、インフルエンザウイルスの弱毒化を達成するための新しい一般的戦略として
提案される。そのような塩基対置換は、以下でさらに述べるように、遺伝子操作
したインフルエンザvRNAセグメントを生存可能なインフルエンザウイルスに組み
込むための公知のレスキュー系を適用することで選択することができる。
In contrast, 11 in the double-stranded region of the NA-specific vRNA of influenza A virus
It has now been found that replacement of C by A and G by U at position -12 'leads to attenuation on MDBK cells and also on other cell types in culture. further,
It has been shown that influenza A virus with the same base pair substitution is attenuated in vivo and can elicit protective immunity against wild-type influenza A virus. Evidence suggests that such attenuation results from a decrease in polyadenylation of NA-specific mRNA. Thus, base pair substitutions in the double-stranded region of the vRNA segment are proposed as a new general strategy for achieving influenza virus attenuation. Such base pair substitutions can be selected by applying known rescue systems for incorporating the engineered influenza vRNA segment into a viable influenza virus, as described further below.

【0013】 したがって、一態様において、本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質
またはその機能性改変体のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフ
ルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3
'非コード領域を含む、ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイル
スであって、該二本鎖領域が少なくとも1つの塩基対置換を有し、その結果、該
ウイルスに感染した細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱
毒化された表現型を与えることを特徴とする、弱毒インフルエンザウイルスを提
供する。
Thus, in one aspect, the invention provides a mutated double-stranded region of an influenza virus RNA genomic segment operably linked to a protein coding sequence of an influenza virus protein or a functional variant thereof. 'And 3
An attenuated influenza virus carrying a genomic nucleic acid segment, comprising a non-coding region, wherein the double-stranded region has at least one base pair substitution, such that the protein-coding sequence in a cell infected with the virus is An attenuated influenza virus is provided, wherein the expression is reduced to give an attenuated phenotype.

【0014】 インフルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域とは、さま
ざまな型の野生型インフルエンザウイルスのvRNAに由来するあらゆる天然のイン
フルエンザウイルスvRNA二本鎖領域を除外するものとして理解されるだろう。
A mutated double-stranded region of an influenza virus RNA genome segment will be understood as excluding any natural influenza virus vRNA double-stranded region derived from various types of wild-type influenza virus vRNA. Would.

【0015】 本明細書中で「細胞」とは、通常インフルエンザウイルスにin vivoで感染す
るヒトおよび/または動物細胞をさす。本発明の弱毒ウイルスの選択のためには
、この用語は1種以上の細胞、例えば、1種以上の培養したヒトまたは非ヒト動
物細胞をさすものと理解される。それらはin vivo細胞、例えば動物モデルの細
胞であってもよい。in vitroで本発明の弱毒ウイルスを選択するのに有用であり
うる培養細胞としては、MDBK細胞、Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞およびVero(
アフリカミドリザル腎)細胞がある。
[0015] As used herein, "cells" refers to human and / or animal cells that are normally infected in vivo with an influenza virus. For the purpose of selecting an attenuated virus of the invention, the term is understood to refer to one or more cells, for example, one or more cultured human or non-human animal cells. They may be cells in vivo, for example cells of an animal model. Cultured cells that may be useful for selecting the attenuated virus of the present invention in vitro include MDBK cells, Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and Vero (
African green monkey kidney) cells.

【0016】 本発明の弱毒ウイルスはゲノムセグメントの二本鎖非コード領域に単一の塩基
対置換をもつことができるが、このようなウイルスは同一のゲノムセグメントま
たは異なるゲノムセグメント上に1つより多い塩基対置換(例えば同一のゲノム
セグメントの二本鎖領域に2つの塩基対置換)を有していてもよい。1つ以上の
二本鎖塩基対置換は、親野生型ウイルスと比べたとき、MDBK細胞上でプラーク力
価の若干の低下、例えば少なくとも約1logの低下をもたらすことが望ましい。
1つ以上の二本鎖塩基対置換は、親野生型ウイルスと比べたとき、MDCK細胞およ
びVero細胞上でプラーク力価の若干の低下、例えば少なくとも約1log、より好
ましくは少なくとも3〜4logの低下を示す弱毒ウイルスを提供することが好ま
しい。例えば、本発明の弱毒ウイルスは、vRNA非コード領域の塩基置換に起因し
て、親野生型ウイルスと比べたときVero細胞上でプラーク力価の約5logもの低
下を示しうる。かかる弱毒ウイルスは、二本鎖領域の11-12'位のC-Gに代わる塩
基対置換A11-U12'を含み、さらにU10-A11'に代わる塩基対置換G10-C11'を含むNA
特異的vRNAセグメントを有するインフルエンザA/WSN/33により例示される(実施
例で言及される変異体D1/2)。NA特異的vRNAセグメントまたは別のインフルエン
ザウイルスタンパク質をコードするvRNAセグメント中に同一の塩基対置換を含む
他のインフルエンザAウイルスも本発明の例となる。
Although the attenuated virus of the present invention may have a single base pair substitution in the double-stranded non-coding region of the genomic segment, such a virus may have more than one on the same genomic segment or a different genomic segment. It may have many base pair substitutions (eg, two base pair substitutions in a double-stranded region of the same genome segment). Desirably, the one or more double-stranded base pair substitutions result in a slight decrease in plaque titer on MDBK cells, eg, at least about 1 log, when compared to the parent wild-type virus.
The one or more double-stranded base pair substitutions result in a slight decrease in plaque titer on MDCK and Vero cells, eg, at least about 1 log, more preferably at least 3-4 logs, when compared to the parent wild-type virus. It is preferred to provide an attenuated virus that exhibits For example, the attenuated virus of the present invention may show as much as about a 5 log reduction in plaque titer on Vero cells when compared to the parent wild-type virus due to base substitutions in the vRNA non-coding region. Such attenuated viruses contain a base pair substitution A11-U12 'in place of CG at positions 11-12' of the double-stranded region, and further comprise a base pair substitution G10-C11 'in place of U10-A11'.
Illustrated by influenza A / WSN / 33 with a specific vRNA segment (variant D1 / 2 mentioned in the examples). Other influenza A viruses that contain identical base pair substitutions in the NA-specific vRNA segment or the vRNA segment encoding another influenza virus protein are also examples of the invention.

【0017】 先に示したように、本発明の弱毒ウイルスには、NA特異的vRNAセグメント中に
単一の塩基対置換A11-U12'を有するインフルエンザA/WSN/33(実施例で言及され
る変異体D2)およびNA特異的vRNAセグメントまたは別のウイルスタンパク質コー
ド化vRNAセグメント中に同じ塩基対置換を有する他のインフルエンザAウイルス
も含まれる。したがって、一実施形態において、本発明は、非コード二本鎖領域
中に弱毒化性の塩基対置換をもたらすように、天然親セグメントの3'末端から11
位にCからAへの突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から12'位にG
からUへの突然変異を有するか、または同じ位置に機能的に等価の置換(例えば
修飾塩基による置換)を有する変異型のインフルエンザAウイルスゲノムRNAセ
グメントを担う、A型の弱毒インフルエンザウイルスを提供する。さらに、別の
実施形態において、本発明は、非コード二本鎖領域中に追加の塩基対置換をもた
らすように、同じvRNAセグメント中に天然親セグメントの3'末端から10位にUか
らGへの突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から11'位にAからCへ
の突然変異を有するか、または同じ位置に機能的に等価の置換を有するA型の弱
毒ウイルスを提供する。そのようなウイルスは非コード二本鎖領域中に上記のよ
うな1つ以上の塩基対置換を導入することによって弱毒化された野生型ウイルス
、または以下でさらに述べるような異種コード配列を担う組換え体弱毒ウイルス
でありうる。好ましくは、例えば、弱毒化性の塩基対置換はNAまたはその表面糖
タンパク質の機能性改変体をコードするゲノム核酸セグメントに導入されるだろ
う。
As indicated above, the attenuated virus of the present invention includes influenza A / WSN / 33, which has a single base pair substitution A11-U12 ′ in the NA-specific vRNA segment (described in the Examples). Variants D2) and other influenza A viruses having the same base pair substitution in the NA-specific vRNA segment or another viral protein-encoding vRNA segment are also included. Thus, in one embodiment, the present invention provides an attenuating base pair substitution in the non-coding double stranded region that is 11 to 11 from the 3 'end of the native parent segment.
A C to A mutation at position and G at position 12 'from the 5' end of the native parent segment.
A, attenuated influenza virus of type A carrying a mutant influenza A virus genomic RNA segment having a mutation from A to U or having a functionally equivalent substitution at the same position (eg, substitution by a modified base). . Further, in another embodiment, the present invention provides that U to G at position 10 from the 3 'end of the native parent segment in the same vRNA segment to effect additional base pair substitutions in the non-coding duplex region. Attenuated virus of type A having an A to C mutation at position 11 'from the 5' end of the native parent segment or having a functionally equivalent substitution at the same position . Such viruses may be attenuated wild-type viruses by introducing one or more base pair substitutions as described above in the non-coding double-stranded region, or a group carrying a heterologous coding sequence as further described below. It may be a recombinant attenuated virus. Preferably, for example, an attenuating base pair substitution will be introduced into a genomic nucleic acid segment encoding a functional variant of NA or its surface glycoprotein.

【0018】 本発明は、特にインフルエンザA/WSN/33を例に引いて、以下でさらに説明され
るが、本発明はA型のインフルエンザウイルスに制限されない。BおよびC型の
ウイルスにおける、D2またはD1/2突然変異と機能的に等価の突然変異、すなわち
弱毒化性の塩基対置換の同定は、利用可能な配列情報を参照し、かつ完全なイン
フルエンザウイルスに弱毒化の特徴を賦与するのに適した、どの遺伝子操作型イ
ンフルエンザvRNAセグメントにも応用可能な公知のレスキュー系を適用すること
で、同様に行なうことができる。
The present invention is further described below, particularly with the example of influenza A / WSN / 33, but the invention is not limited to influenza A virus. Identification of mutations functionally equivalent to the D2 or D1 / 2 mutations, ie, attenuating base pair substitutions, in type B and C viruses refers to available sequence information and to complete influenza virus The same can be done by applying a known rescue system applicable to any genetically engineered influenza vRNA segment, which is suitable for imparting attenuating characteristics to E. coli.

【0019】 かくして、本発明の更なる実施形態は、上でD2と命名したインフルエンザA/WS
N/33の塩基対置換と機能的に相応する位置で、非コード二本鎖領域中に弱毒化性
の塩基対置換を有する変異型インフルエンザBウイルスゲノムRNAセグメント(
例えばNAコード化セグメント)を担うB型のインフルエンザウイルスである。本
発明はまた、変異型インフルエンザCウイルスゲノムRNAセグメント(例えば変
異型NAコード化セグメント)中にそのような塩基対置換を有するC型のインフル
エンザウイルスにも及ぶものである。
Thus, a further embodiment of the present invention provides an influenza A / WS designated above as D2
A mutated influenza B virus genomic RNA segment with an attenuating base pair substitution in the noncoding double-stranded region at a position that functionally corresponds to the N / 33 base pair substitution (
For example, influenza B virus that carries the NA-encoding segment). The invention also extends to type C influenza viruses having such base pair substitutions in the mutant influenza C virus genomic RNA segment (eg, the mutant NA encoding segment).

【0020】 上述のように弱毒化性の塩基対置換を組み込んだ本発明のウイルスの核酸セグ
メント、およびこうした核酸を提供するための転写能力があるDNAもまた、本発
明の別の態様を構成する。本発明の核酸は好ましくは非コード二本鎖領域中に適
切な弱毒化性の塩基対置換を有する、突然変異した天然のインフルエンザウイル
スRNAゲノムセグメントである。こうしたRNAは、例えば、3'および/または5'末
端、あるいは内部に、機能を破壊しない1以上の別のヌクレオチドが添加される
などの、別の改変を有していてもよい。それはキメラRNAでもよい。
[0020] Nucleic acid segments of the viruses of the present invention that incorporate attenuating base pair substitutions as described above, and transcriptionally competent DNA to provide such nucleic acids also form another aspect of the present invention. . The nucleic acids of the invention are preferably mutated natural influenza virus RNA genomic segments with appropriate attenuating base pair substitutions in the non-coding double-stranded region. Such RNAs may have other modifications, such as, for example, the addition of one or more additional nucleotides that do not disrupt function, at the 3 'and / or 5' end, or internally. It may be a chimeric RNA.

【0021】 in vitroで転写されて本発明のRNA核酸セグメントを提供することができるDNA
を、最初に通常の技術によって1つのプラスミド中に構築し、そして制限エンド
ヌクレアーゼ消化によってそのプラスミドから単離することができる。上述のプ
ラスミドpT3NAm1によって説明したように、この目的のため、天然インフルエン
ザウイルスvRNAセグメントのcDNAを、適切なプロモーターおよび制限エンドヌク
レアーゼ部位に隣接させてプラスミド中に挿入することができる。次にこのcDNA
を、例えば適切な突然変異性プライマーを使用するPCR指令突然変異によって、
部位特異的突然変異を起こさせ、転写のための所望の突然変異vRNAセグメントを
コードする配列を提供させることができる。あるいは、本発明のゲノム核酸セグ
メントを合成してもよい。
DNA that can be transcribed in vitro to provide an RNA nucleic acid segment of the invention
Can be first constructed in one plasmid by conventional techniques and isolated from that plasmid by restriction endonuclease digestion. For this purpose, the cDNA of the native influenza virus vRNA segment can be inserted into the plasmid, flanked by a suitable promoter and restriction endonuclease sites, as explained by the plasmid pT3NAm1 described above. Then this cDNA
By, for example, PCR-directed mutagenesis using appropriate mutagenic primers.
Site-directed mutations can be made to provide sequences encoding the desired mutated vRNA segment for transcription. Alternatively, a genomic nucleic acid segment of the present invention may be synthesized.

【0022】 本発明の弱毒ウイルスを調製するため、上に定義した弱毒化性の塩基対置換を
1以上有するゲノム核酸セグメントをin vitroでインフルエンザウイルスポリメ
ラーゼタンパク質および核タンパク質と複合体化させてRNP複合体を形成させる
ことができる。こうしたRNP複合体は本発明のさらに別の態様を構成するが、こ
れらは細胞中のウイルスレスキューのためにRNA複合体中に遺伝子操作したイン
フルエンザウイルスRNAゲノムセグメントを組み込むために従来から使用されて
いるような通常の手法で調製することができる(4、5、38)。本発明のRNP複合
体をやはり通常の技法を使用して、培養細胞、例えばMDBK細胞、MDCK細胞または
Vero細胞中にトランスフェクトすることができる。この目的のために通常使用さ
れる方法としてDEAEデキストラントランスフェクションおよびエレクトロポレー
ションが含まれる(19、39)。
To prepare an attenuated virus of the invention, a genomic nucleic acid segment having one or more attenuating base pair substitutions as defined above is complexed in vitro with an influenza virus polymerase protein and a nucleoprotein to form an RNP complex. The body can be formed. Such RNP complexes form yet another aspect of the present invention, but are conventionally used to incorporate engineered influenza virus RNA genomic segments into RNA complexes for virus rescue in cells. It can be prepared by a usual method such as (4, 5, 38). The RNP conjugates of the present invention may also be cultured using conventional techniques, for example, in cultured cells, such as MDBK cells, MDCK cells or
It can be transfected into Vero cells. Methods commonly used for this purpose include DEAE dextran transfection and electroporation (19, 39).

【0023】 さらに別の態様において、本発明は、本発明の弱毒インフルエンザウイルスを
調製する方法であって、このウイルスのためのゲノム核酸セグメントをそのセグ
メントがウイルス粒子中にパッケージされる条件下で宿主細胞中に提供すること
を含む方法を提供する。この目的のため、ゲノム核酸セグメントをプラスミドに
よってその宿主中に提供することができる。あるいは、本明細書に前記したよう
な本発明のRNP複合体を、RNP複合体を補足し所望の弱毒ウイルス粒子の選別を可
能とするインフルエンザヘルパーウイルスで予め感染させた宿主細胞中にトラン
スフェクトすることができる。特定のインフルエンザウイルス遺伝子に関する、
ヘルパーウイルスに基づく多数の細胞レスキュー系が以前に記載されており、Mu
sterおよびGarcia-Sastreによる総説がある(56)。こうした遺伝子特異的レス
キュー系を以下に簡単に要約する。
In yet another aspect, the invention provides a method of preparing an attenuated influenza virus of the invention, comprising the steps of: providing a genomic nucleic acid segment for the virus under conditions in which the segment is packaged in a viral particle Methods are provided that include providing in a cell. For this purpose, the genomic nucleic acid segment can be provided in its host by a plasmid. Alternatively, the RNP complex of the invention as described herein above is transfected into host cells previously infected with an influenza helper virus that complements the RNP complex and allows for the selection of the desired attenuated virus particles. be able to. For certain influenza virus genes,
A number of cell rescue systems based on helper viruses have been previously described and have been described by Mu.
There is a review by ster and Garcia-Sastre (56). These gene-specific rescue systems are briefly summarized below.

【0024】 ヘルパーウイルスに基づくインフルエンザ遺伝子レスキュー系 NAおよびHA表面抗原、非構造タンパク質、NP、PB2ポリメラーゼタンパク質な
らびにMタンパク質について、インフルエンザA vRNAの遺伝子操作を可能にする
、ヘルパーに基づくレスキュー系が報告されている。
Helper virus-based influenza gene rescue system A helper-based rescue system has been reported that allows genetic manipulation of influenza A vRNA for NA and HA surface antigens, nonstructural proteins, NP, PB2 polymerase protein and M protein. ing.

【0025】 NA遺伝子特異的レスキュー系 最も一般的に使用されるヘルパーウイルスに基づくインフルエンザ遺伝子レス
キュー系はインフルエンザA/WSN/33ウイルスのNAに限定される(4、5)。この方
法は、インフルエンザA/WSN/33由来のNA遺伝子を有するインフルエンザウイルス
のみがトリプシン不在下でMDBK細胞上で成長することができるという観察に基づ
いている。このレスキュー系では、ヘルパーウイルスはインフルエンザA/WSN/33
由来の7個の遺伝子セグメントとインフルエンザA/WSN/33以外のウイルス由来のN
A遺伝子1個を含有する再構築物である。一般的にヘルパーウイルスとして、イ
ンフルエンザA/HK/8/68由来のNA遺伝子1個を有するA/WSN-HKが使用される。こ
の系においては、インフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子を、このヘルパーウイルス
を感染させた細胞中にトランスフェクトする。次に外因性プロテアーゼの不在下
でMDBK細胞上で増殖させることによって、このウイルスを選択する。
The NA Gene-Specific Rescue System The most commonly used helper virus-based influenza gene rescue system is restricted to the NA of influenza A / WSN / 33 virus (4,5). This method is based on the observation that only influenza viruses having the NA gene from influenza A / WSN / 33 can grow on MDBK cells in the absence of trypsin. In this rescue system, the helper virus is influenza A / WSN / 33
7 gene segments and N from viruses other than influenza A / WSN / 33
A reconstruct containing one A gene. Generally, A / WSN-HK having one NA gene derived from influenza A / HK / 8/68 is used as a helper virus. In this system, the NA gene of influenza A / WSN / 33 is transfected into cells infected with this helper virus. The virus is then selected by growing on MDBK cells in the absence of exogenous protease.

【0026】 ヘルパーウイルスとしてNA欠失突然変異ウイルスを使用することによって、NA
遺伝子をレスキューすることもできる。こうしたヘルパーウイルスは組織培養で
増殖するためには外因性ノイラミニダーゼを必要とする。このヘルパーウイルス
を感染させた細胞中にNA遺伝子をトランスフェクトする。次にノイラミニダーゼ
の不在下で細胞上で増殖させることによって、ウイルスを選択する(43)。
By using the NA deletion mutant virus as a helper virus,
Genes can also be rescued. These helper viruses require exogenous neuraminidase to grow in tissue culture. The NA gene is transfected into cells infected with this helper virus. The virus is then selected by growing on cells in the absence of neuraminidase (43).

【0027】 NS遺伝子特異的レスキュー系 NS遺伝子特異的レスキュー系のヘルパーウイルスとして、NS1タンパク質に欠
陥がある温度感受性インフルエンザウイルスを使用する。NS遺伝子セグメントは
NS1およびNS2タンパク質をコードする2つのオーバーラップ遺伝子を保有する。
このレスキュー系によって、許容されない温度で活性を有するNS1タンパク質を
コードするNS遺伝子セグメントのレスキューが可能になる。この系においては、
レスキューされるべきNS遺伝子セグメントを、温度感受性ウイルスを感染させた
細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクトされたNS遺伝子セグメントを
有するウイルスを、Enamiら(40)によって記載された通りに、許容されない温
度でこのウイルスを増殖させることによって選択する。
[0027] As NS gene-specific rescue system NS gene specific rescue system of a helper virus, using a temperature sensitive influenza virus is defective NS1 protein. NS gene segment
It carries two overlapping genes encoding NS1 and NS2 proteins.
This rescue system allows for the rescue of NS gene segments encoding NS1 proteins that are active at unacceptable temperatures. In this system,
The NS gene segment to be rescued is transfected into cells infected with the temperature-sensitive virus. Viruses with the transfected NS gene segment are selected by growing the virus at unacceptable temperatures, as described by Enami et al. (40).

【0028】 PB2遺伝子特異的レスキュー系 PB2遺伝子特異的レスキュー系のヘルパーウイルスとして、トリインフルエン
ザAウイルスPB2遺伝子を有するウイルスを使用することができる。このトリイン
フルエンザAウイルスPB2遺伝子は、哺乳動物細胞中でのヘルパーウイルスの複製
を制限する。したがって、このレスキュー系によって哺乳動物細胞中でインフル
エンザウイルスの複製を可能にするPB2遺伝子をレスキューすることができる。
レスキューされるべきPB2遺伝子を、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にト
ランスフェクトする。トランスフェクトしたPB2遺伝子を有するウイルスを、哺
乳動物細胞中でこのウイルスを増殖させることによって選択する。Subbaraoら(
41)はこのようなトリインフルエンザAウイルスPB2遺伝子に基づく系を使用して
、野生型インフルエンザA/Ann Arbor/6/60ウイルスのPB2遺伝子をレスキューし
た。
[0028] PB2 gene-specific rescue system PB2 gene specific rescue system of a helper virus, it is possible to use viruses with avian influenza A virus PB2 gene. This avian influenza A virus PB2 gene limits helper virus replication in mammalian cells. Thus, this rescue system can rescue the PB2 gene, which allows influenza virus replication in mammalian cells.
The PB2 gene to be rescued is transfected into cells infected with the helper virus. A virus having the transfected PB2 gene is selected by growing the virus in mammalian cells. Subbarao et al. (
41) rescued the PB2 gene of wild-type influenza A / Ann Arbor / 6/60 virus using a system based on the avian influenza A virus PB2 gene.

【0029】 M遺伝子特異的レスキュー系 M遺伝子特異的レスキュー系のヘルパーウイルスとして、インフルエンザA/ウ
マ/Miami/1/63ウイルスのM遺伝子を保有するアマンチジン感受性インフルエンザ
ウイルスを使用することができる。このレスキュー系でウイルスにアマンチジン
耐性を与えるM遺伝子のレスキューが可能になる。この系では、レスキューされ
るべきM遺伝子を、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトす
る。アマンチジン存在下でこのウイルスを増殖させることによって、トランスフ
ェクトしたM遺伝子を有するウイルスを選択する。CastrucciおよびKawaoka(42
)はこうしたアマンチジン感受性M遺伝子に基づく系を使用して、インフルエン
ザA/PR/8/34ウイルスのM遺伝子をレスキューした。
[0029] As M gene-specific rescue system M gene-specific rescue system of a helper virus, may be used amantidine sensitive influenza viruses carrying the M gene of influenza A / Equine / Miami / 1/63 virus. This rescue system allows for the rescue of the M gene, which confers amantidine resistance to the virus. In this system, the M gene to be rescued is transfected into cells infected with a helper virus. The virus with the transfected M gene is selected by growing this virus in the presence of amantidine. Castrucci and Kawaoka (42
Has rescued the influenza A / PR / 8/34 virus M gene using a system based on this amantidine-sensitive M gene.

【0030】 抗体に基づくレスキュー系 これらの系は、特定の抗体に対するトランスフェクタントウイルスの結合また
は非結合に依存する(5、52)。こうした抗体とは、インフルエンザウイルスに
結合し組織培養中でその増殖を減退させる中和抗体である。ヘルパーウイルスは
、例えば、抗体エピトープを表示するインフルエンザ表面タンパク質をコードす
る遺伝子を保有する。したがってこの系は、こうした遺伝子を保有しないが、確
実に生存し得るトランスフェクタントウイルスを選択するために使用することが
できる。このようにこのタイプのレスキュー系でインフルエンザ表面タンパク質
をコードする遺伝子のレスキューが可能になる。レスキューされるべき遺伝子を
、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトする。抗体の存在下
でこのウイルスを増殖させることによって、トランスフェクトした遺伝子を有す
るウイルスを選択する。こうした系はEnamiおよびPaleseによって使用されて(5
)、トランスフェクトされた合成HAセグメントがレスキューされた。
Antibody-based rescue systems These systems rely on the binding or non-binding of a transfectant virus to a particular antibody (5, 52). Such antibodies are neutralizing antibodies that bind to the influenza virus and reduce its growth in tissue culture. Helper viruses carry, for example, genes encoding influenza surface proteins displaying antibody epitopes. Thus, this system can be used to select transfectant viruses that do not carry such genes, but can survive. Thus, this type of rescue system allows for the rescue of genes encoding influenza surface proteins. The gene to be rescued is transfected into cells infected with the helper virus. By propagating the virus in the presence of the antibody, a virus having the transfected gene is selected. These systems are used by Enami and Palese (5
), The transfected synthetic HA segment was rescued.

【0031】 NP遺伝子特異的レスキュー系 Liと共同研究者(39)は、インフルエンザAウイルス核タンパク質遺伝子のレ
スキューのための逆遺伝学系を報告した。この系において、ヘルパーウイルスと
して温度感受性(ts)突然変異体ts56を使用する。前記(5)のようにin vivoで
RNA複合体を再構築し、その後ts56ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にエレ
クトロポレーションによって導入する。非許容温度でMDBK細胞上にプラーク形成
させることによって、レスキューされたNPをコードするvRNAセグメントを有する
トランスフェクタントウイルスを選択する。
The NP gene-specific rescue system Li and coworkers (39) have reported a reverse genetics system for rescue of the influenza A virus nucleoprotein gene. In this system, the temperature-sensitive (ts) mutant ts56 is used as a helper virus. In vivo as in (5) above
The RNA complex is reconstituted and then introduced by electroporation into cells infected with the ts56 helper virus. Transfectant viruses with rescued NP-encoding vRNA segments are selected by plaque formation on MDBK cells at non-permissive temperatures.

【0032】 インフルエンザBウイルスレスキュー系 BarclayおよびPalese(44)は、インフルエンザBウイルスにおけるHA遺伝子の
レスキューについてもさらに記載している。
Influenza B virus rescue systems Barclay and Palese (44) further describe the rescue of the HA gene in influenza B virus.

【0033】 別法として、Pleschkaら(45)が開発した発現ベクターに基づくインフルエン
ザ遺伝子レスキュー戦略を使用して、本発明の弱毒ウイルスの調製を達成するこ
とができる。上述のRNPトランスフェクション系とは対照的に、これはRNP複合体
のin vitro再構築のためには必要な、ウイルスNPおよびポリメラーゼタンパク質
の精製を必要としない。NPおよびPタンパク質、ならびに弱毒化塩基対突然変異
を組み込んでいる本発明のゲノムセグメントを提供する発現ベクターを、宿主細
胞中に共にトランスフェクトする。この場合、本発明のRNP複合体が細胞内に形
成される。次に細胞に前記のようにインフルエンザヘルパーウイルスを感染させ
て、必要な弱毒インフルエンザウイルスを選択することができる。
[0033] Alternatively, the preparation of the attenuated virus of the present invention can be accomplished using an influenza gene rescue strategy based on an expression vector developed by Pleschka et al. (45). In contrast to the RNP transfection system described above, this does not require the purification of viral NP and polymerase proteins, which is necessary for in vitro reconstitution of the RNP complex. An NP and P protein, and an expression vector providing a genomic segment of the invention incorporating an attenuated base pair mutation are co-transfected into a host cell. In this case, the RNP complex of the present invention is formed in the cell. The cells can then be infected with an influenza helper virus as described above to select the required attenuated influenza virus.

【0034】 宿主細胞中にさらに別の補足性RNA複合体をトランスフェクトすることによっ
て、本発明のRNA複合体を宿主細胞中で生存可能な弱毒ウイルス中にレスキュー
し、それによってヘルパーウイルスの必要性を排除することもできる。これは、
さらに最近になってEnami(46)によって記載されたインフルエンザウイルス遺
伝子のための一般的なレスキュー戦略にしたがって達成することができる。この
戦略には適切なインフルエンザウイルスからRNPを精製し、レスキューすべきイ
ンフルエンザウイルス遺伝子とハイブリダイズするcDNAの存在下でこのRNPをRNA
アーゼHでin vitro処理することを含む。この方法において、RNAアーゼHによる
その遺伝子の特異的消化が達成される。次に、この遺伝子枯渇RNPをその核酸セ
グメントを含有するRNP複合体とともに細胞中に同時トランスフェクトして、弱
毒化性の塩基対置換を提供する。次に細胞を寒天で被覆して、直接プラーク形成
によって、トランスフェクタント弱毒ウイルスを取得する。この戦略は、上記の
ヘルパーウイルスに基づく遺伝子レスキュー戦略とは異なって、任意のインフル
エンザウイルスからの任意のインフルエンザ遺伝子に適用することができる。し
たがって、これを任意のインフルエンザタイプの本発明の弱毒ウイルスまたは遺
伝子を取得するために適用することができる。
[0034] By transfecting yet another complementary RNA complex into the host cell, the RNA complex of the present invention is rescued into an attenuated virus viable in the host cell, thereby reducing the need for a helper virus. Can be eliminated. this is,
More recently it can be achieved according to the general rescue strategy for influenza virus genes described by Enami (46). This strategy involves purifying the RNP from the appropriate influenza virus and converting this RNP to RNA in the presence of a cDNA that hybridizes to the influenza virus gene to be rescued.
In vitro treatment with ase H is included. In this way, specific digestion of that gene by RNAase H is achieved. This gene-depleted RNP is then co-transfected into a cell with the RNP complex containing the nucleic acid segment to provide an attenuating base pair replacement. The cells are then coated with agar and the transfectant attenuated virus is obtained by direct plaque formation. This strategy can be applied to any influenza gene from any influenza virus, unlike the helper virus-based gene rescue strategy described above. Therefore, it can be applied to obtain any attenuated virus or gene of the invention of any influenza type.

【0035】 塩基対の突然変異の復帰には2つの特異的突然変異を必要とするので、本発明
の弱毒インフルエンザウイルスは高度に安定であることが期待される(実施例12
を参照されたい)。したがって、こうしたウイルスはインフルエンザウイルスワ
クチンとしての使用にとって特に好都合であるといえる。
Since the reversion of a base pair mutation requires two specific mutations, the attenuated influenza virus of the present invention is expected to be highly stable (Example 12).
Please refer to). Therefore, such viruses may be particularly advantageous for use as influenza virus vaccines.

【0036】 上に示したように、本発明のウイルスにさらに、標的細胞中で発現され得る異
種コード配列を付加的に含ませることができる。こうした異種コード配列は、病
原体に対する免疫応答(抗体応答または細胞仲介応答のいずれか)を刺激するこ
とができる抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードするものがよい。こうし
た病原体の代表的な例はウイルス、例えばその他のインフルエンザウイルスまた
はHIVなどの非インフルエンザウイルス、細菌、真菌類、寄生体(マラリア寄生
体等)、および癌細胞などの病原細胞である。
As indicated above, the viruses of the present invention can additionally include a heterologous coding sequence that can be expressed in a target cell. Such a heterologous coding sequence preferably encodes an antigenic peptide or polypeptide capable of stimulating an immune response (either an antibody response or a cell-mediated response) to the pathogen. Representative examples of such pathogens are viruses, eg, other influenza viruses or non-influenza viruses such as HIV, bacteria, fungi, parasites (such as malaria parasites), and pathogenic cells such as cancer cells.

【0037】 したがって、さらに別の態様において、本発明は本発明のウイルスを含むワク
チンを提供する。特に好ましいのは弱毒インフルエンザウイルスが2種以上の病
原体、例えばインフルエンザウイルス1種およびインフルエンザウイルス以外の
第2の病原体に対して複合ワクチン剤として作用するようなワクチンである。こ
うしたワクチンをこの目的のために知られている方法にしたがって製剤化して投
与することができる。
Thus, in yet another aspect, the invention provides a vaccine comprising the virus of the invention. Particularly preferred are vaccines wherein the attenuated influenza virus acts as a conjugate vaccine against more than one pathogen, for example one influenza virus and a second pathogen other than the influenza virus. Such a vaccine can be formulated and administered according to known methods for this purpose.

【0038】 このように、また別の態様において、本発明はインフルエンザウイルス(例え
ばA型のインフルエンザウイルス)に対する免疫応答を、単独でまたは1以上の
別の病原体に対する免疫応答の刺激と同時に刺激する方法であって、免疫応答を
誘導する能力がある本発明の弱毒インフルエンザウイルスを免疫化モードで投与
することを含む方法を提供する。例えば、本発明の弱毒インフルエンザウイルス
での鼻腔内免疫化が好ましい。こうした免疫化は、Musterら(49)およびFerko
ら(53)によって報告されたHIVエピトープの1つを発現する組換えインフルエ
ンザウイルスによる免疫化研究によって説明されたようにして実施することがで
きる(実施例15も参照されたい)。好適な免疫化用量は、例えば103〜109 pfuの
範囲となり得る。初回免疫化に続いて、同一の機能的特性を有するが別のサブタ
イプまたはタイプのウイルスでの追加免疫を与えてもよい。
Thus, in yet another embodiment, the invention provides a method of stimulating an immune response to an influenza virus (eg, an influenza A virus), alone or simultaneously with stimulating an immune response to one or more other pathogens. Wherein the method comprises administering an attenuated influenza virus of the invention capable of inducing an immune response in an immunization mode. For example, intranasal immunization with an attenuated influenza virus of the invention is preferred. Such immunizations have been described by Muster et al. (49) and Ferko.
(53) can be performed as described by immunization studies with recombinant influenza virus expressing one of the HIV epitopes (see also Example 15). Suitable immunization dose, for example, may be 10 3 to 10 9 pfu range. The initial immunization may be followed by a booster with another subtype or type of virus having the same functional properties.

【0039】 インフルエンザウイルス中に異種コード配列を組み込むための方法は、例えば
国際公開公報WO91/03552(Paleseら)に以前に記載されており、またMusterおよ
びGarcia-Sastreによる「Textbook of Influenza 1998」(56)中に総説もある
。異種コード配列は、弱毒化性の塩基対置換を組み込んだゲノムセグメント上ま
たは別のゲノムセグメント上にあってもよい。選択圧力(selection pressure)を
提供することは、1つのインフルエンザウイルスタンパク質のための遺伝子を同
様に組み込んだ別の核酸セグメントによって実施できる。例えば少なくとも9種
のvRNAセグメントを保有するインフルエンザウイルスを構築することができるこ
とが以前に報告されている(40)。
Methods for incorporating heterologous coding sequences into influenza viruses have been described previously, for example, in WO 91/03552 (Palese et al.) And have been described by Muster and Garcia-Sastre in "Textbook of Influenza 1998" ( 56) There is also a review. The heterologous coding sequence may be on a genome segment that incorporates attenuating base pair substitutions or on another genome segment. Providing selection pressure can be performed by another nucleic acid segment that also incorporates the gene for one influenza virus protein. For example, it has been previously reported that influenza viruses can be constructed that carry at least nine vRNA segments (40).

【0040】 ワクチン接種目的での外来抗原を発現するためのベクターとしての本発明の弱
毒化組換えインフルエンザウイルスの使用は魅力的な治療戦略である。その理由
は以下の通りである。
The use of the attenuated recombinant influenza virus of the present invention as a vector to express foreign antigens for vaccination purposes is an attractive therapeutic strategy. The reason is as follows.

【0041】 (i) 異なるサブタイプに対する抗体はほとんど交差反応性を示さない。ワク
チンとしてウイルスを使用する際の欠点の1つは、そのウイルスに対する免疫応
答がもたらされることである。初回免疫化後、同一の抗原を含む1回以上の追加
免疫を与えることが好ましい場合が多い。しかし、そのウイルスに対する免疫応
答が同一のウイルスでの逐次的免疫化の効力を低下させる。異なるインフルエン
ザサブタイプに対する抗体はほとんど交差反応性を示さないので、異なるサブタ
イプであるが同一の抗原を発現するインフルエンザウイルスでのその後の免疫化
はこの影響を克服するはずである。
(I) Antibodies to different subtypes show little cross-reactivity. One of the disadvantages of using a virus as a vaccine is that it produces an immune response against the virus. After the first immunization, it is often preferable to give one or more boosters containing the same antigen. However, the immune response to the virus reduces the efficacy of sequential immunizations with the same virus. Subsequent immunization with an influenza virus of a different subtype but expressing the same antigen should overcome this effect, as antibodies to different influenza subtypes show little cross-reactivity.

【0042】 (ii) インフルエンザウイルスは強い細胞性および体液性応答を誘導すること
が示されている。
(Ii) Influenza virus has been shown to induce strong cellular and humoral responses.

【0043】 (iii) インフルエンザウイルスは強い粘膜性応答を誘導することが示されて
いる。インフルエンザウイルスによる鼻腔内免疫化は生殖器および腸管粘膜にお
ける長期継続応答を誘導することが示されている。
(Iii) Influenza virus has been shown to induce a strong mucosal response. Intranasal immunization with influenza virus has been shown to induce long-lasting responses in genital and intestinal mucosa.

【0044】 (iv) インフルエンザウイルスは非組込性かつ非腫瘍形成性である。(Iv) Influenza virus is non-integrative and non-tumorigenic.

【0045】 (v) 上述したように、本発明の弱毒インフルエンザウイルスは弱毒性が安定
しているものと期待される。
(V) As described above, the attenuated influenza virus of the present invention is expected to be stable in attenuity.

【0046】 ワクチン接種の目的で、本発明の弱毒ウイルス中に、病原体の抗原または免疫
応答を刺激する能力があるそれらの改変体をコードする異種コード配列を配置す
ることができる。異種コード配列をウイルス遺伝子中にインサートして、親ウイ
ルスタンパク質の機能を保持している融合タンパク質を提供することができる。
外来抗原のインサート(エピトープの移植)に耐えることがすでに判明している
部位の1つはHAの抗原B部位である。その表面タンパク質の抗原部位Bはタンパク
質の先頭部に位置する露出ループ構造で構成されており、高度に免疫原性である
ことが知られている。HAタンパク質B部位にウイルスエピトープの1つをインサ
ートするための、インフルエンザウイルスHA遺伝子の操作が報告されている(49
中に報告されたMusterらの研究および48に報告されたLiらの報告を再度参照され
たい)。マラリア寄生体由来のB細胞エピトープを発現させるために、同一の戦
略がRodriguesらによって以前用いられている(50)。例えば抗原性ポリペプチ
ドに関する異種コード配列をインフルエンザウイルスNA遺伝子中にインサートす
るのも好ましい。インフルエンザウイルスタンパク質中へのエピトープ移植のた
めの戦略も以前、例えばWO91/03552に記載されている。
For the purpose of vaccination, a heterologous coding sequence encoding an antigen of the pathogen or a variant thereof capable of stimulating an immune response can be placed in the attenuated virus of the invention. Heterologous coding sequences can be inserted into the viral gene to provide a fusion protein that retains the function of the parent viral protein.
One site that has been shown to withstand foreign antigen inserts (epitope transplantation) is the antigen B site of HA. The antigenic site B of the surface protein is composed of an exposed loop structure located at the head of the protein, and is known to be highly immunogenic. The manipulation of the influenza virus HA gene to insert one of the viral epitopes into the HA protein B site has been reported (49
(Refer again to Muster et al.'S work reported in and Li et al.'S report reported in 48). The same strategy has been previously used by Rodrigues et al. To express B cell epitopes from malaria parasites (50). It is also preferred to insert, for example, a heterologous coding sequence for an antigenic polypeptide into the influenza virus NA gene. Strategies for transplanting epitopes into influenza virus proteins have also been previously described, for example, in WO 91/03552.

【0047】 インフルエンザウイルスタンパク質中への外来配列のエピトープ移植の結果と
して非機能性キメラウイルスタンパク質となって、生育可能なトランスフェクタ
ントウイルスのレスキューが不可能になることがある。本発明の弱毒ウイルスに
応用し得る、組換えインフルエンザウイルスによる外来配列を発現させるための
別の戦略は、別のオープンリーディングフレームを含有する遺伝子セグメントの
遺伝子工学的操作に関与する。異種コード配列のための内部リボソームエントリ
ー部位を提供する組換えゲノムセグメントを構築し得る。この手法は、例えばGa
rcia-Sastreらによって、NAおよびHIVのgp41の両方の末端切断型をコードするイ
ンフルエンザウイルスvRNAセグメントを取得するために以前使用されている(9
)。あるいは、ウイルスタンパク質コード配列の1つに異種コード配列をフレー
ム内融合させて、自己タンパク質分解性プロテアーゼで切断することができるキ
メラポリタンパク質をコードするようにし、そのウイルスタンパク質および所望
の第2のポリペプチド(例えばウイルス抗原)を生成させることができる。この
戦略はPercyらによって、長さが200アミノ酸までの非インフルエンザタンパク質
を発現させるのに好適であることが示された(51)。
Transplantation of an epitope of a foreign sequence into an influenza virus protein may result in a non-functional chimeric virus protein, making rescue of viable transfectant virus impossible. Another strategy for expressing foreign sequences by recombinant influenza virus that can be applied to the attenuated virus of the present invention involves genetic engineering of a gene segment containing another open reading frame. Recombinant genomic segments can be constructed that provide internal ribosome entry sites for heterologous coding sequences. This method is, for example, Ga
previously used by rcia-Sastre et al. to obtain influenza virus vRNA segments that encode both truncated forms of NA and HIV gp41 (9
). Alternatively, a heterologous coding sequence is fused in-frame to one of the viral protein coding sequences to encode a chimeric polyprotein that can be cleaved by an autoproteolytic protease, wherein the viral protein and the desired second polyprotein are encoded. Peptides (eg, viral antigens) can be generated. This strategy was shown by Percy et al. To be suitable for expressing non-influenza proteins up to 200 amino acids in length (51).

【0048】 ワクチン接種の他に各種の治療目的のために、標的細胞中での異種コード配列
の発現のための運搬体として、本発明の組換え弱毒ウイルスを使用することがで
きることが理解されるであろう。こうした組換えウイルスは、例えば以下のいず
れかをコードするゲノムセグメントを有するものがよい。
It is understood that the recombinant attenuated virus of the present invention can be used as a vehicle for expression of a heterologous coding sequence in target cells for various therapeutic purposes besides vaccination. Will. Such a recombinant virus preferably has, for example, a genome segment encoding any of the following.

【0049】 −インターフェロンまたはインターロイキンなどのサイトカイン、 −トキシン、 −病原体の機能を直接または間接的に阻害する能力がある緩和剤、例えばウ
イルスプロテアーゼインヒビター、 −細胞傷害性がほとんどまたは全くない化合物を細胞傷害性化合物に転換す
る能力がある酵素、例えばプリンおよびピリミジン類似体をリン酸化して活性毒
性形態にする能力がある、単純ヘルペスチミジンキナーゼなどのウイルス酵素、 −アンチセンス配列、 −リボザイム。
A cytokine such as interferon or interleukin, a toxin, a palliative capable of directly or indirectly inhibiting the function of the pathogen, eg a viral protease inhibitor, a compound with little or no cytotoxicity. Enzymes capable of converting to damaging compounds, for example viral enzymes, such as herpes simplex thymidine kinase, capable of phosphorylating purine and pyrimidine analogs into active toxic forms, -antisense sequences, -ribozymes.

【0050】 外来エピトープを発現する本発明の弱毒ウイルスの提供に関連して、上述した
技法のいずれかによって、本発明の弱毒インフルエンザウイルス中に、こうした
物質をコードする配列を組み入れることができる。
In connection with providing an attenuated virus of the invention that expresses a foreign epitope, a sequence encoding such a substance can be incorporated into the attenuated influenza virus of the invention by any of the techniques described above.

【0051】 本発明の弱毒化組換えウイルス中の異種コード配列は組織特異的および/また
は作用特異的プロモーターの制御下に置くのがよい。本発明の組換えウイルスを
遺伝子治療法のために使用することができる。
The heterologous coding sequence in the attenuated recombinant virus of the present invention may be under the control of a tissue-specific and / or action-specific promoter. The recombinant virus of the present invention can be used for gene therapy.

【0052】 本発明の組換えウイルスを直接投与するか、または、後で患者に投与する細胞
にex vivoで感染させるのに使用できる。
The recombinant virus of the present invention can be administered directly or used to infect cells that are subsequently administered to a patient ex vivo.

【0053】 このように、さらに別の態様において、本発明は、標的細胞への異種コード配
列の送達用の、本発明の組換えウイルスを製薬上許容される担体または希釈剤と
組み合わせて含む医薬組成物を提供する。また、本発明のウイルスの1つを感染
させたex vivo細胞(本発明の組換えインフルエンザウイルスを内蔵する細胞)
であって、製薬上許容される担体または希釈剤とともに投与用に製剤化したもの
も提供する。さらに別の態様において、本発明は異種コード配列を細胞に送達す
るための方法であって、この配列を保有する本発明の弱毒化組換えインフルエン
ザウイルスをこの細胞に感染させることを含む方法を提供する。
Thus, in yet another aspect, the invention relates to a medicament for the delivery of a heterologous coding sequence to a target cell, comprising a recombinant virus of the invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. A composition is provided. In addition, ex vivo cells infected with one of the viruses of the present invention (cells containing the recombinant influenza virus of the present invention)
And a formulation formulated for administration with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. In yet another aspect, the invention provides a method for delivering a heterologous coding sequence to a cell, the method comprising infecting the cell with an attenuated recombinant influenza virus of the invention carrying the sequence. I do.

【0054】 本発明のウイルスは、弱毒化突然変異によって影響を受けた遺伝子を置換し、
選択した細胞タイプ上での増殖が増加したウイルスを提供することができる、遺
伝子をレスキューするためのヘルパーウイルスとしての用途も見出だされ得る。
この目的のため、弱毒ウイルスは、1以上の細胞タイプ上で、対応する野生型ウ
イルスと比較して少なくとも約3-4 log、好ましくは少なくとも約5 logの増殖低
下を示すものを選択するのが好ましい。こうして、さらに別の実施形態において
、本発明は細胞中のインフルエンザウイルスゲノムの核酸セグメントをレスキュ
ーするためのヘルパーウイルスとしての本発明のウイルスの使用を提供するもの
であって、ここではこのセグメントを含有する製造されたウイルスは、選択され
たタイプの細胞上でヘルパーウイルスと比べて増大した増殖に基づいて選択され
る。例えば、そのNAコードvRNAの非コード二本鎖領域中に弱毒化性の塩基対置換
を有する本発明のインフルエンザAウイルスを有効に利用して、第2のインフル
エンザAウイルスに由来するNAをコードするvRNAまたはその機能性改変体をレス
キューすることができる。この目的のための典型的なプロトコルは以下のステッ
プを含む。
The virus of the invention replaces the gene affected by the attenuating mutation,
A use as a helper virus to rescue genes that can provide a virus with increased growth on selected cell types may also be found.
For this purpose, attenuated viruses should be selected that exhibit a reduction in growth of at least about 3-4 logs, preferably at least about 5 logs, on one or more cell types as compared to the corresponding wild-type virus. preferable. Thus, in yet another embodiment, the invention provides the use of a virus of the invention as a helper virus to rescue a nucleic acid segment of the influenza virus genome in a cell, wherein the segment comprises The produced virus is selected on the basis of increased growth on the selected type of cells as compared to the helper virus. For example, the influenza A virus of the present invention having an attenuating base pair substitution in the non-coding double-stranded region of the NA-encoding vRNA is effectively used to encode NA derived from the second influenza A virus vRNA or a functional variant thereof can be rescued. A typical protocol for this purpose includes the following steps.

【0055】 1.ヘルパーウイルスによる細胞の感染、 2.ヘルパーウイルスに感染した細胞中への、レスキューすべき遺伝子を含有
するRNP複合体のトランスフェクション、および 3.ヘルパーウイルスが増大した弱毒化を示す同一の細胞型または別の細胞型
のいずれかでの、レスキューされたウイルスの選択。
1. 1. infection of cells by helper virus; 2. transfection of the RNP complex containing the gene to be rescued into cells infected with the helper virus, and Selection of the rescued virus on either the same or another cell type in which the helper virus shows increased attenuation.

【0056】 ステップ3における細胞型は、トランスフェクトされた遺伝子を獲得したウイ
ルスのみが高力価まで増殖することが期待されるように選択される。
The cell type in step 3 is selected such that only the virus that has acquired the transfected gene is expected to grow to high titers.

【0057】 例えば、上記のインフルエンザA/WSN/33のD1/2突然変異体は別のA型インフル
エンザウイルス起源のNA遺伝子をレスキューするために使用するヘルパーウイル
スとして特に好適である。この場合、例えば、MDBK細胞に最初にこのD1/2ヘルパ
ーウイルスを感染させるのがよく、そして弱毒化突然変異がないvRNAを含有する
NA遺伝子を保有するウイルスの選択のためには、Vero細胞を使用するのが好まし
い。インフルエンザA/WSN/33に由来するD2突然変異体も同様に使用することがで
きる。
For example, the D1 / 2 mutant of influenza A / WSN / 33 described above is particularly suitable as a helper virus used to rescue the NA gene from another influenza A virus. In this case, for example, MDBK cells should first be infected with this D1 / 2 helper virus and contain vRNA without attenuating mutations
For selection of a virus carrying the NA gene, Vero cells are preferably used. D2 mutants derived from influenza A / WSN / 33 can be used as well.

【0058】 インフルエンザA/WSN/33はその表面抗原NAに関連した神経毒性をマウスにおい
て示すことが知られている(54)。この理由によって、上記のようなこのウイル
スの弱毒化改変体は直接のワクチンとしての使用には好適ではないと考えられる
。しかし、例えば、上記のようにヘルパーウイルスとしてD1/2突然変異体を使用
することによって、部位特異的突然変異誘発のためのNA vRNAを取得して、例え
ばワクチンなどの治療用途のためにより好適な、本発明に従う別の弱毒インフル
エンザAウイルスを構築することができる。
Influenza A / WSN / 33 is known to exhibit neurotoxicity in mice related to its surface antigen NA (54). For this reason, attenuated variants of this virus as described above would not be suitable for use as direct vaccines. However, obtaining NA vRNA for site-directed mutagenesis, for example by using the D1 / 2 mutant as a helper virus as described above, makes it more suitable for therapeutic uses such as vaccines Alternatively, another attenuated influenza A virus according to the present invention can be constructed.

【0059】 以下の実施例は本発明を説明するものである。The following examples illustrate the invention.

【0060】実施例1 A型インフルエンザウイルスのNAコード化ウイルスRNAの二本鎖領域中への突
然変異の導入 NAコード化ウイルスゲノムRNAで5'および3'の非コード領域中に突然変異を
有するものを産生させるために、所望の突然変異を有している対応するcDNA
を含むプラスミドを構築した。
Example 1 Intrusion of the influenza A virus into the double-stranded region of the NA-encoded viral RNA
In order to produce the NA-encoding viral genomic RNA with mutations in the 5 'and 3' non-coding regions, the corresponding cDNA with the desired mutation
Was constructed.

【0061】 位置特異的突然変異誘発のための出発プラスミドはpT3NAm1(図3参照)であり、
該プラスミドは前述のとおり、制限酵素切断部位EcoRI(2398の位置)とHind III(
3837の位置)の間に入れたpUC19クローニングベクターの骨格中に、一方の末端に
唯一のBbsI制限酵素切断部位(2404の位置)が隣接し、もう一方の末端にはバクテ
リオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーター(3821〜3836の位置)が隣接し
ている、インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA遺伝子の完全長cDNA(2412〜3
820の位置)を含有する(9)。プラスミドpT3NAm1中にNAコード化cDNAインサー
トを調製するためのインフルエンザA/WSN/33のサンプルは、例えば、W.H.O. Col
laborating Centre, Division of Virology, National Institute for Medical
Research, 英国ロンドン、から入手しうる。
The starting plasmid for site-directed mutagenesis is pT3NAm1 (see FIG. 3)
As described above, the plasmid was constructed with restriction enzymes EcoRI (position 2398) and Hind III (position 2398).
In the backbone of the pUC19 cloning vector inserted between the (3837) position, one end is flanked by a unique BbsI restriction enzyme cleavage site (2404 position) and the other end is the bacteriophage T3 RNA polymerase promoter ( Flanking the full length cDNA of the NA gene of influenza A / WSN / 33 virus (positions 2412-338).
820 positions) (9). A sample of influenza A / WSN / 33 for preparing an NA-encoding cDNA insert in plasmid pT3NAm1 is available, for example, from WHO Col.
laborating Centre, Division of Virology, National Institute for Medical
Available from Research, London, UK.

【0062】 インフルエンザA/WSN/33の突然変異型のNAコード化vRNAセグメントの転写
のためのDNA鋳型を構築するために用いることのできる別のプラスミドとして
は、pUC19由来のプラスミドpT3NAvがあり、その構築についてはWO91/03552(Pale
se, P.ら)に述べられている。プラスミドpT3NAvも、バクテリオファージT3RN
Aポリメラーゼによって特異的に認識されるプロモーターおよび制限エンドヌク
レアーゼ開裂部位が隣接している、インフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の完全長
cDNAを含んでいる。
Another plasmid that can be used to construct a DNA template for transcription of the mutant NA-encoding vRNA segment of influenza A / WSN / 33 is plasmid pT3NAv, derived from pUC19. For construction, refer to WO91 / 03552 (Pale
se, P. et al.). Plasmid pT3NAv also contains bacteriophage T3RN
Contains the full-length cDNA of the NA gene of influenza A / WSN / 33, flanked by a promoter specifically recognized by A polymerase and a restriction endonuclease cleavage site.

【0063】 PCR産物は、鋳型としてのpT3NAm1および図1に示した突然変異をもたらすよう
に改変された下記のプライマーを用いて作製した: 5'-CGGAATTCGAAGACGCAGCAAAAGCAGGAGTTTAAATGAATCC-3'(プライマー1)および、
5'-CCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC-3'(プライマー2)(突
然変異を導入した残基には下線を付しており、例えば、D1突然変異cDNAの構
築のためにはプライマー1および2の双方において下線を付した最初のAヌクレオ
チドをCヌクレオチドで置換した)。そのPCR産物をEcoRIおよびHindIII制限酵素
で消化し、同じ酵素で切断したpT3NAm1中にクローン化した。改変したプラスミ
ド中のNA遺伝子および隣接配列について自動配列決定機(Applied Biosystems)で
配列決定した。
The PCR product was made using pT3NAm1 as a template and the following primers modified to effect the mutation shown in FIG. 1: 5′-CGGAATTCGAAGACGCAGCAAAAGC AGG AGTTTAAATGAATCC-3 ′ (primer 1) and
5'-CCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACA AGG AGTTTTTTGAAC-3 '(mutated residues are underlined, e.g., for construction of D1 mutant cDNA, both primers 1 and 2 are underlined The first A nucleotides marked with were replaced with C nucleotides). The PCR product was digested with EcoRI and HindIII restriction enzymes and cloned into pT3NAm1 cut with the same enzymes. The NA gene and flanking sequences in the modified plasmid were sequenced on an automated sequencer (Applied Biosystems).

【0064】 インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA遺伝子中に下記の二重突然変異を導入し
た:U-A→G-C(10-11')(突然変異体D1)、C-G→A-U(11-12')(突然変異体D2)、およ
びC-G→U-A(12-13')(突然変異体D3)(図1)。さらに、対応する1個所の突然変異を
有する6個のNA遺伝子を構築した(U→G10、A→C11’、C→A11、G→U12'、C→U12
、およびG→A13’)。
The following double mutations were introduced into the NA gene of the influenza A / WSN / 33 virus: UA → GC (10-11 ′) (mutant D1), CG → AU (11-12 ′) (Mutant D2), and CG → UA (12-13 ′) (mutant D3) (FIG. 1). In addition, six NA genes with corresponding single mutations were constructed (U → G10, A → C11 ′, C → A11, G → U12 ′, C → U12).
, And G → A13 ′).

【0065】実施例2 リボ核タンパク質(RNP)複合体の産生およびトランスフェクション トランスフェクタントウイルスはEnamiとPalese(5)が述べている方法に従って
調製した。NA特異的RNP複合体をin vitroで再構成し、A/WSN-HK ヘルパーウイル
スを感染させてMDBK細胞中にトランスフェクトした(5)。
Example 2 Production and Transfection of Ribonucleoprotein (RNP) Complex The transfectant virus was prepared according to the method described by Enami and Palese (5). The NA-specific RNP complex was reconstituted in vitro and infected with A / WSN-HK helper virus and transfected into MDBK cells (5).

【0066】 合成RNAはBbsI制限酵素で直鎖化した改変pT3NAm1プラスミドのT3RNAポ
リメラーゼによる転写によって得られた。RNAを、インフルエンザX-31ウイル
スから単離されたRNAポリメラーゼおよびNPタンパク質を用いてRNP複合体に
再構成した。インフルエンザX-31ウイルスはインフルエンザA/HK/8/68およびA/P
R/8/34ウイルスを再分類したもの(reassortant)であり、Evans Biological, Ltd
., Liverpool, 英国から供給されたものである。RNP複合体は、10日令の胚形成
(embryonated)ニワトリ卵中で増殖させたWSN-HKヘルパーインフルエンザウイル
スを感染させたMDBK細胞中に、DEAE-デキストラントランスフェクション法でト
ランスフェクトした。そのMDBK細胞を補強最小必須培地中において増殖させた。
その後の実験では、インフルエンザA/WSN/33の野生型ウイルスも補強最小必須培
地中でMDBK細胞中で増殖させた。レスキューされたトランスフェクタントウイル
スはMDBK細胞中で3回プラーク精製した。その後の分析のためのストックウイル
スの調製には単一のプラークを用いた。
Synthetic RNA was obtained by transcription of a modified pT3NAm1 plasmid linearized with BbsI restriction enzyme using T3 RNA polymerase. RNA was reconstituted into RNP complexes using RNA polymerase and NP proteins isolated from influenza X-31 virus. Influenza X-31 virus is influenza A / HK / 8/68 and A / P
A re-sorted version of the R / 8/34 virus (reassortant), which is Evans Biological, Ltd.
., Liverpool, sourced from the UK. The RNP complex was transfected into MDBK cells infected with WSN-HK helper influenza virus grown in 10 day old embryonated chicken eggs by DEAE-dextran transfection. The MDBK cells were grown in supplemented minimal essential medium.
In subsequent experiments, wild-type influenza A / WSN / 33 virus was also grown in MDBK cells in supplemented minimal essential medium. The rescued transfectant virus was plaque purified three times in MDBK cells. Single plaques were used for the preparation of stock virus for subsequent analysis.

【0067】実施例3 トランスフェクタントウイルスのNA遺伝子の配列決定 トランスフェクタント中の突然変異の存在をNA遺伝子の3'および5'末端配列の
配列決定で確認した。配列決定用のウイルスRNAは、30%のスクロースクッシ
ョンを通過させた遠心によって精製したトランスフェクタントウイルスから、フ
ェノール-クロロホルム抽出により単離した。いくつかの場合では感染した細胞
からRNAzol B(Tel-Test, Inc., Friendswood, 米国テキサス州)を用いて単離し
た総RNAを用いた。5'末端の配列は直接的RNA配列決定または5' RACEのい
ずれかによって得た。5'末端の直接的配列決定は、インフルエンザA/WSN/33のNA
遺伝子のヌクレオチド1280〜1299の位置のもの(5'-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3')と
相補的なプライマーおよびRNA配列決定キット(United States Biochemical C
orporation, Cleveland, 米国オハイオ州)を製造者の使用説明書に従って用いて
行った。5' RACEには、ウイルスRNAはインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の
ヌクレオチド879〜898の位置のもの(5'-GGGTGTCCTTCGACCAAAAC-3')と相補的なプ
ライマーを用いて逆転写させた。その逆転写産物を末端デオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ(TdT)(Gibco BRL, Gaithersburg, 米国メリーランド州)で伸
長し、直接的RNA配列決定用として用いたプライマー(上記参照)および5' RAC
E 短縮アンカープライマー(Gibco BRL)を用いてPCRで増幅した。SpeI制限酵素で
切断されたPCR産物をpUC18のXbaI部位中にクローン化し、DNA配列決定キット
(United Stats Biochemical)で配列決定した。トランスフェクタントウイルスの
NA遺伝子の3'末端の配列を調べるために、ウイルスRNAをポリ(A)ポリメラー
ゼ(Gibco BRL)を用いて、3'-ポリアデニル酸を付加した。ポリアデニル酸付加さ
れたRNAをプライマー5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTTTTTTTTTT-3'を用いて逆転写
し、cDNAをインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の115〜98の位置に対応する
ヌクレオチド(5'-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3')を含むプライマーおよび逆
転写に用いられたプライマーを用いてPCRで増幅した。HindIIIで消化したPCR産
物をpUC18中にクローン化し、DNA配列決定キットで配列決定した。
Example 3 Sequencing of the NA Gene of the Transfectant Virus The presence of the mutation in the transfectant was confirmed by sequencing the 3 'and 5' end sequences of the NA gene. Viral RNA for sequencing was isolated by phenol-chloroform extraction from transfectant virus purified by centrifugation through a 30% sucrose cushion. In some cases, total RNA isolated from infected cells using RNAzol B (Tel-Test, Inc., Friendswood, Texas, USA) was used. The sequence at the 5 'end was obtained by either direct RNA sequencing or 5' RACE. Direct sequencing of the 5 'end was confirmed by influenza A / WSN / 33 NA
Primers complementary to those at nucleotide positions 1280 to 1299 of the gene (5′-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3 ′) and RNA sequencing kit (United States Biochemical C
orporation, Cleveland, Ohio, USA) according to the manufacturer's instructions. For 5 'RACE, viral RNA was reverse transcribed using primers complementary to those at nucleotide positions 879-898 of the NA gene of influenza A / WSN / 33 (5'-GGGTGTCCTTCGACCAAAAC-3'). The reverse transcript was extended with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) and primers used for direct RNA sequencing (see above) and 5 'RAC
E Amplified by PCR using truncated anchor primer (Gibco BRL). The PCR product cut with the SpeI restriction enzyme is cloned into the XbaI site of pUC18, and a DNA sequencing kit
(United Stats Biochemical). Transfectant virus
In order to examine the sequence of the 3 'end of the NA gene, 3'-polyadenylic acid was added to the viral RNA using poly (A) polymerase (Gibco BRL). The polyadenylated RNA was reverse-transcribed using primer 5′-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTTTTTTTTTT-3 ′, and the cDNA was transcribed at nucleotide positions corresponding to positions 115 to 98 of the NA gene of influenza A / WSN / 33 (5′-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3 ′). ) And the primers used for reverse transcription were amplified by PCR. HindIII digested PCR products were cloned into pUC18 and sequenced with a DNA sequencing kit.

【0068】 二重突然変異を有する3種のNA遺伝子全てのトランスフェクションによって、
トランスフェクタントウイルス(D1、D2、およびD3)がレスキューされた。他方、
単一突然変異構築物では6つのうちの3つがレスキューされたのみであり、それら
は10、11'、および13'の位置に突然変異のあるものであった(図1)。3回の試行に
おいて、他の3つの構築物(11、12、および12'の位置に突然変異がある)はいずれ
もレスキューされなかった。
By transfection of all three NA genes with double mutations,
Transfectant viruses (D1, D2, and D3) were rescued. On the other hand,
Only three of the six mutants in the single mutant construct were rescued, with mutations at positions 10, 11 'and 13' (FIG. 1). In three trials, none of the other three constructs (with mutations at positions 11, 12, and 12 ') were rescued.

【0069】 10および11'の位置に突然変異のある2つの単一突然変異トランスフェクタント
の突然変異の確認は、それらが不安定なためより困難であった。具体的には、U
→G10突然変異体のNA ウイルスRNAの3'末端のクローニングによって、突然変
異のある1種のクローンと野生型配列の2種のクローンが得られた。精製A→C11'
トランスフェクタント由来のNA特異的vRNAを、プラークからプラークへの継
代を3回行った後、その5'末端について直接的RNA配列決定を行ったところ野
生型配列であった。しかし、このトランスフェクタントのもとのプラークを用い
て感染させたMDBK細胞から得たNA特異的vRNAを配列決定すると、突然変異の
存在が確認された。従って、このトランスフェクタントはプラーク精製ステップ
の間に野生型に復帰した可能性が高いと考えられる。この解釈は、そのトランス
フェクタントが最初は小さなプラークを作るが継代を経るにつれて大きなプラー
クを示したという観察結果によって支持される。これらを総合すると、単一突然
変異体の配列データは、単一の突然変異を有するトランスフェクタントウイルス
、少なくとも10および11'の位置に突然変異のある突然変異体は、不安定である
ことを示している。
Confirmation of mutations in two single mutant transfectants with mutations at positions 10 and 11 ′ was more difficult due to their instability. Specifically, U
→ Cloning of the 3 'end of the NA viral RNA of the G10 mutant resulted in one clone with a mutation and two clones with the wild-type sequence. Purification A → C11 '
After transfection of the NA-specific vRNA from the transfectant three times from plaque to plaque, direct RNA sequencing was performed on the 5 ′ end of the transfectant. The result was a wild-type sequence. However, sequencing of NA-specific vRNA from MDBK cells infected with the original plaque of this transfectant confirmed the presence of the mutation. Therefore, it is likely that this transfectant returned to wild type during the plaque purification step. This interpretation is supported by the observation that the transfectants initially formed small plaques but showed large plaques as they passed through the passage. Taken together, the sequence data for a single mutant shows that transfectant viruses with a single mutation, mutants with mutations in at least 10 and 11 'positions are unstable Is shown.

【0070】実施例4 D1、D2、D1/2、およびD3突然変異体の増殖特性 D1、D2、およびD3をMDBK細胞で増殖させた。MDBK細胞のコンフルエントな単層
を低m.o.i.(0.01)で感染させ、培地中に放出された感染性ウイルスの量をMDBK細
胞上でのプラークアッセイを用いて、異なる時点においてアッセイした(図2)。D
2トランスフェクタントウイルスは野生型に比べるとプラーク力価で約1 logの低
減が示された。しかしD1およびD3トランスフェクタントウイルスは突然変異によ
っては顕著な影響を受けなかった。このことと一致して、D2のプラークサイズは
縮小したが、D1およびD3ウイルスの双方とも野生型と同様のプラークサイズを示
した。
Example 4 Growth Characteristics of D1, D2, D1 / 2, and D3 Mutants D1, D2, and D3 were grown on MDBK cells. Confluent monolayers of MDBK cells were infected at low moi (0.01) and the amount of infectious virus released into the medium was assayed at different time points using a plaque assay on MDBK cells (FIG. 2). D
2 transfectant virus showed about 1 log reduction in plaque titer compared to wild type. However, D1 and D3 transfectant viruses were not significantly affected by the mutation. Consistent with this, plaque size of D2 was reduced, but both D1 and D3 viruses showed plaque size similar to wild type.

【0071】 NA特異的vRNA中に複数の二重突然変異を有する突然変異インフルエンザA/
WSN/33の増殖特性も調べた。D1およびD2トランスフェクタント双方からの二重突
然変異を組み入れている構築物を首尾よくレスキューし(D1/2)(図1)、感染性の
ウイルスとした。D1/2トランスフェクタントをプラーク精製法で3回精製し、突
然変異の存在は配列決定することによって確認した。このウイルスはMDBK細胞上
でのプラーク力価(図2)およびプラークサイズにおいてD2トランスフェクタント
と類似の低減を示した。ウイルス増殖に対してのD1/2突然変異の影響はMDCK及び
Vero細胞ではより劇的であり、プラーク力価において少なくとも3〜4 logの低減
が認められた(下記の実施例10および12を参照)。
Mutant influenza A / with multiple double mutations in NA-specific vRNA
The growth characteristics of WSN / 33 were also investigated. Constructs incorporating double mutations from both D1 and D2 transfectants were successfully rescued (D1 / 2) (FIG. 1) and rendered infectious virus. D1 / 2 transfectants were purified three times by the plaque purification method and the presence of the mutation was confirmed by sequencing. This virus showed a similar reduction in plaque titer (FIG. 2) and plaque size on MDBK cells as D2 transfectants. The effect of the D1 / 2 mutation on virus growth was determined by MDCK and
More dramatic with Vero cells, there was at least a 3-4 log reduction in plaque titer (see Examples 10 and 12 below).

【0072】実施例5 トランスフェクタントウイルス中でのNAレベルの測定 これらのウイルスによって発現されるNAのレベルを、それが増殖レベルと対応
するか否かを調べるために測定した。インフルエンザA/WSN/33およびトランスフ
ェクタントウイルスをMDBK細胞中で増殖させ、30%〜60%のスクロース濃度勾配の
超遠心で精製した。約10μgのウイルスタンパク質を0.5%SDSおよび1% β-メルカ
プトエタノールで100℃で10分間変性させ、50mM リン酸ナトリウム pH7.5、1% N
P40、および5mMのPefabloc(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis,
米国インディアナ州)を含有する反応バッファー中400uのPNGase F(New England
Biolabs, Inc., Beverly, 米国マサチューセッツ州)で37℃で20時間消化した。P
NGase Fによる処理でNAおよびHAから窒素に結合している炭水化物鎖が除去され
る。これによって、ゲル上でNPおよびHAの近傍に移動するNAバンドの分離が良く
なる。タンパク質は12% SDS-PAGEで分析し、クーマシーブリリアントブルーで染
色した。
Example 5 Determination of NA Levels in Transfectant Viruses The levels of NA expressed by these viruses were measured to determine if they corresponded to the level of growth. Influenza A / WSN / 33 and transfectant viruses were grown in MDBK cells and purified by ultracentrifugation on a 30% -60% sucrose gradient. Approximately 10 μg of viral protein was denatured with 0.5% SDS and 1% β-mercaptoethanol at 100 ° C. for 10 minutes, 50 mM sodium phosphate pH 7.5, 1% N
P40, and 5 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis,
400 u of PNGase F (New England) in a reaction buffer containing Indiana, U.S.A.
Biolabs, Inc., Beverly, Mass., USA) at 37 ° C. for 20 hours. P
Treatment with NGase F removes the carbohydrate chains attached to nitrogen from NA and HA. This improves the separation of NA bands migrating on the gel near NP and HA. Proteins were analyzed on 12% SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue.

【0073】 D2およびD1/2のどちらのウイルス粒子も野生型、またはD1およびD3トランスフ
ェクタントと比べNA含量の劇的な低減が認められた。
A dramatic reduction in NA content was observed for both D2 and D1 / 2 virus particles compared to wild type or D1 and D3 transfectants.

【0074】 D2およびD1/2ウイルスのNAレベルを定量するためにノイラミニダーゼ活性を測
定した。精製ウイルスから得たタンパク質の約2μg、0.5μg、0.125μg、および
0.031μg(4倍希釈)を、総量100μL中に150mMリン酸バッファー pH6.0、1mM CaCl 、および基質として50ナノモルの2'-(4-メチルウンベリフェリル)-α-D-N-ア
セチルノイラミン酸(MU-NANA)含有の液中で、37℃で10分間インキュベートした(
27)。次いで停止バッファー(0.5Mグリシン/NaOH、pH10.4)を2ml添加し、放出さ
れた4-メチルウンベリフェロンを分光蛍光法で測定した。0.1mMの4-メチルウン
ベリフェロン溶液を標準対照として用いた。NA活性は1μgのウイルスタンパク質
あたり1分間に放出される4-メチルウンベリフェロンのナノモル数として表現し
た。
Neuraminidase activity was measured to quantify NA levels of D2 and D1 / 2 viruses.
Specified. About 2 μg, 0.5 μg, 0.125 μg of protein from purified virus, and
0.031 μg (4 times dilution), 150 mM phosphate buffer pH 6.0, 1 mM CaCl2 in a total volume of 100 μL 2 And 50 nmol of 2 '-(4-methylumbelliferyl) -α-D-N-
Incubated at 37 ° C for 10 minutes in a solution containing cetylneuraminic acid (MU-NANA) (
27). Then 2 ml of stop buffer (0.5 M glycine / NaOH, pH 10.4) was added to release
4-Methylumbelliferone was measured by spectrofluorimetry. 0.1 mM 4-methylun
Veriferon solution was used as a standard control. NA activity is 1 μg of viral protein
Expressed as nanomoles of 4-methylumbelliferone released per minute per minute
Was.

【0075】 野生型ウイルスでのNA活性は2.18 ナノモル/min/μgであった。しかし、トラ
ンスフェクタントウイルスD2およびD1/2はそれぞれ0.24および0.25 ナノモル/mi
n/μgの活性を示すにすぎなかった。このように、トランスフェクタントウイル
スは野生型に比べると約1/10に低減したNA活性を示し、このことはSDS-PAGEで観
察されたNAレベルの低減と一致している。
The NA activity with the wild-type virus was 2.18 nmol / min / μg. However, transfectant viruses D2 and D1 / 2 were 0.24 and 0.25 nmol / mi, respectively.
It only showed n / μg activity. Thus, the transfectant virus showed about 1/10 reduced NA activity as compared to the wild type, which is consistent with the reduced NA levels observed on SDS-PAGE.

【0076】実施例6 精製トランスフェクタントウイルス中のNA特異的vRNAレベル 30%のスクロースクッションを通して精製した野生型ウイルスおよびトランス
フェクタントウイルス由来のウイルスRNAをフェノール/クロロホルムで抽出
した。野生型ウイルスおよびトランスフェクタントウイルスから精製したウイル
スRNAをPAGEで分析し、RNAセグメントを銀染色で可視化した。NAセグメン
トは全てのトランスフェクタントウイルスにおいて野生型ウイルスと同等のレベ
ルで存在した。NA特異的vRNAレベルを定量するために、精製ウイルスから抽
出したvRNAを用いてプライマー伸長分析を行った。
Example 6 NA-Specific vRNA Levels in Purified Transfectant Virus The virus RNA derived from wild-type virus and transfectant virus purified through a 30% sucrose cushion was extracted with phenol / chloroform. Viral RNA purified from wild-type and transfectant viruses was analyzed by PAGE and RNA segments were visualized by silver staining. The NA segment was present at the same level in all transfectant viruses as the wild-type virus. To quantify NA-specific vRNA levels, primer extension analysis was performed using vRNA extracted from purified virus.

【0077】 NAおよびNS vRNAレベルのプライマー伸長分析は既に報告されているとお
り行った(2)。簡潔に記せば、100ngのウイルスRNAを3 x 10cpmの32P-標
識NA特異的およびNS特異的プライマーの存在下で、200uのSuperScript(Gibco BR
L)を用いて42℃で1時間かけて転写した。NA特異的プライマー 5'-GTGGCAATAACT
AATCGGTCA-3' はNA vRNAのヌクレオチド1151〜1171と相補的なものである
。NS特異的プライマー 5'-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3'はNS vRNAのヌクレオ
チド695〜715の位置に相補的なものである。プライマー伸長反応は、当量の90%
ホルムアミドおよび10mM EDTAを添加し、95℃で3分間加熱することによって停止
させた。伸長産物を7M尿素の存在下で5%ポリアクリルアミドゲルで分析し、乾燥
させたゲルのphosphorimager分析で定量した(Molecular Dynamics)。
Primer extension analysis of NA and NS vRNA levels was performed as previously reported (2). Briefly, in the presence of 32 P- labeled NA-specific and NS-specific primers 3 x 10 5 cpm of viral RNA 100 ng, SuperScript of 200 u (Gibco BR
Using L), transfer was performed at 42 ° C. for 1 hour. NA-specific primer 5'-GTGGCAATAACT
AATCGGTCA-3 'is complementary to nucleotides 1151-1171 of NA vRNA. NS specific primer 5'-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3 'is complementary to nucleotides 695-715 of NS vRNA. Primer extension reaction is 90% of equivalent
Formamide and 10 mM EDTA were added and stopped by heating at 95 ° C. for 3 minutes. The extension products were analyzed on a 5% polyacrylamide gel in the presence of 7M urea and quantified by phosphorimager analysis of the dried gel (Molecular Dynamics).

【0078】 NS遺伝子を内部対照として用いた。2回の実験で、トランスフェクタントウイ
ルス中のNA特異的vRNAセグメントの量は、野生型ウイルスと同様(±20%)で
あった。
[0078] The NS gene was used as an internal control. In two experiments, the amount of NA-specific vRNA segments in the transfectant virus was similar (± 20%) as the wild-type virus.

【0079】実施例7 D2またはD1/2トランスフェクタントウイルスを感染させた細胞中のNA特異的vR NAレベル MDBK細胞に野生型またはトランスフェクタントウイルスをm.o.i.を2として感
染させ、感染後3.0、5.5、8.0、および10.5時間後にRNAzolB(Tel-Test)を用いて
細胞からRNAを単離した。総RNA中のNA特異的vRNAのレベルを上述の実
施例6に記載のプライマー伸長アッセイ法において総RNAを5μg用いて測定し
た。D2トランスフェクタントウイルスに感染させた細胞は野生型ウイルスで感染
させた細胞と同様の(±10%)NA特異的vRNAレベルを示した。D1/2を感染させ
た細胞ではNA特異的vRNAレベルの28%〜53%の低減(この結果は感染の5.5、8.
0、および10.5時間後にphosphorimager分析の2回の実験で得られたもの)が認め
られたとはいえ、この低減はNAタンパク質レベルの1/10への減少を説明できない
Example 7 NA-specific vRNA levels in cells infected with D2 or D1 / 2 transfectant virus MDBK cells were infected with wild-type or transfectant virus at moi of 2, and RNA was isolated from cells using RNAzolB (Tel-Test) after 3.0, 5.5, 8.0, and 10.5 hours. The level of NA-specific vRNA in total RNA was measured using 5 μg of total RNA in the primer extension assay described in Example 6 above. Cells infected with D2 transfectant virus showed similar (± 10%) NA-specific vRNA levels as cells infected with wild-type virus. 28% -53% reduction in NA-specific vRNA levels in cells infected with D1 / 2 (this result is 5.5, 8.
Although 0, and 10.5 hours later, which were obtained in two experiments of phosphorimager analysis), this reduction could not explain the reduction of NA protein levels to 1/10.

【0080】実施例8 D2またはD1/2トランスフェクタントウイルスで感染させた細胞中のNA特異的mR NAおよびcRNAのレベル D2およびD1/2トランスフェクタントウイルスにおける突然変異によっては、NA
特異的vRNAレベルは劇的な影響は受けなかったので、NAレベルの1/10への低
減(上記参照)はmRNAレベルにおける低減および/または翻訳の欠陥によりも
たらされたという可能性がある。これらの可能性を見分けるために、D2またはD1
/2トランスフェクタントウイルスを感染させた細胞中のNA特異的mRNAの量を
プライマー伸長アッセイを用いて調べた。MDBK細胞に野生型ウイルスまたはトラ
ンスフェクタントウイルスをm.o.i. 2で感染させ、感染後3.0、4.5、6.0、およ
び7.5時間後に総RNAを単離した。
Example 8 Levels of NA-Specific mRNA and cRNA in Cells Infected with D2 or D1 / 2 Transfectant Virus Depending on mutations in D2 and D1 / 2 transfectant viruses, NA
Because specific vRNA levels were not dramatically affected, it is possible that the reduction of NA levels to 1/10 (see above) was caused by a reduction in mRNA levels and / or translational defects. To identify these possibilities, use D2 or D1
The amount of NA-specific mRNA in cells infected with the / 2 transfectant virus was determined using a primer extension assay. MDBK cells were infected with wild type virus or transfectant virus at moi 2 and total RNA was isolated 3.0, 4.5, 6.0, and 7.5 hours after infection.

【0081】 感染細胞から得た総RNA中のNAおよびHAのmRNAおよびcRNAレベルの
プライマー伸長分析を、実施例6に記載の条件と同じ条件で行った。NA特異的m
RNAおよびcRNAのためのプライマー、5-GCGCAAGCTT TATTGAGATTATATTTCC-
3'はNA遺伝子の115〜98の位置に対応する18個のヌクレオチド(下線部)を含んで
いる。HA特異的mRNAおよびcRNAの伸長のためのプライマー、5'-CATATTG
TGTCTGCATCTGTAGCT-3'は、HA遺伝子の94〜71の位置に対応している。
Primer extension analysis of NA and HA mRNA and cRNA levels in total RNA from infected cells was performed under the same conditions as described in Example 6. NA specific m
Primer for RNA and cRNA, 5-GCGCAAGCTT TATTGAGATTATATTTCC-
3 'contains 18 nucleotides (underlined) corresponding to positions 115-98 of the NA gene. Primer for extension of HA-specific mRNA and cRNA, 5'-CATATTG
TGTCTGCATCTGTAGCT-3 'corresponds to positions 94 to 71 of the HA gene.

【0082】 感染細胞から得た総RNA中にはmRNAおよびcRNAの双方ともが含まれ
ており、その2つは末端が異なっているにすぎないので、この2種類のRNAのシ
グナルは同じプライマー伸長アッセイにおいて現れることが予想された。mRN
A分子の5'末端に10〜15個のヌクレオチド長さのキャップを有する異種プライマ
ーが存在することによって、ゲル上のmRNAのシグナルは異なるサイズのDN
A種を含んでいる1本の多重バンドとして現われる。他方、cRNAのシグナル
は単一のバンドとして現われ、それはmRNAのシグナルよりも約10〜15ヌクレ
オチドほど短い。
The total RNA obtained from the infected cells contains both mRNA and cRNA, and only the two ends are different, so that the signals of the two RNAs are the same primer extension. It was expected to appear in the assay. mRN
The presence of the heterologous primer, which has a cap of 10-15 nucleotides in length at the 5 'end of the A molecule, allows the signal of the mRNA on the gel to differ in the size of the DN.
Appears as one multiband containing species A. On the other hand, the cRNA signal appears as a single band, which is about 10-15 nucleotides shorter than the mRNA signal.

【0083】 D2またはD1/2トランスフェクタントウイルスのいずれかで感染させた細胞中の
NA特異的mRNAレベルは、検出限界以下であった。NA特異的cRNAレベルは
これらのトランスフェクタントウイルスにおいては明らかに影響を受けていなか
った。NA特異的cRNAバンドよりわずかに速く泳動する別のバンドが全サンプ
ルで検出されたが、これは非感染細胞から抽出したRNAでも検出されているの
で、非特異的シグナルを示す。
In cells infected with either D2 or D1 / 2 transfectant virus
NA-specific mRNA levels were below the limit of detection. NA-specific cRNA levels were clearly unaffected in these transfectant viruses. Another band that migrated slightly faster than the NA-specific cRNA band was detected in all samples, indicating a non-specific signal since it was also detected in RNA extracted from uninfected cells.

【0084】 ここで観察された、D2トランスフェクタントを感染させた細胞におけるNA特異
的mRNAレベルの減弱は、以前にKimら(14)によって報告された所見、すなわ
ちvRNA様CATレポーター遺伝子におけるA-U(11-12')塩基対突然変異は、野生
型の対照と比較するとわずか22%のレポーター活性しかもたらさないとの所見と
一致している。しかし、G-C(10-11')およびU-A(12-13')塩基対の突然変異は、D1
およびD3トランスフェクタントのノイラミニダーゼの発現レベルには影響を及ぼ
さないが、CATレポーター遺伝子系ではそれぞれわずか20%および31%の活性しか
示さない(14)。従って、CATレポーター遺伝子系での塩基対突然変異とvRNA
セグメントを含有する天然のNA遺伝子のレスキューとが異なる効果を持つことは
明らかである。
The attenuation of NA-specific mRNA levels observed in cells infected with D2 transfectants, which was observed here, was a finding previously reported by Kim et al. The (11-12 ') base pair mutation is consistent with the finding that it produces only 22% reporter activity when compared to the wild-type control. However, GC (10-11 ') and UA (12-13') base pair mutations
It does not affect the expression levels of neuraminidase of D3 and D3 transfectants, but shows only 20% and 31% activity in the CAT reporter gene system, respectively (14). Therefore, base pair mutations and vRNA in the CAT reporter gene system
It is clear that rescue of the native NA gene containing the segment has a different effect.

【0085】実施例9 NA特異的リボ核タンパク質複合体のin vitroでの転写 理論的には、上記で観察されたmRNAレベルの低減はmRNAの安定性の低
下またはmRNA合成の低下に起因するはずであった。mRNAの合成の妨害が
開始の時点で起こりうる。例えば、キャップを付されたRNAプライマーの結合
、またはエンドヌクレアーゼ活性が阻害されうる。あるいはまた、ウイルスmR
NAの終止反応またはポリアデニル酸付加が影響されうる。これら全ての可能性
を見分けるためにin vitro転写アッセイを行った。
Example 9 In Vitro Transcription of NA-Specific Ribonucleoprotein Complex In theory, the reduction in mRNA levels observed above should be due to reduced mRNA stability or reduced mRNA synthesis. Met. Interference with mRNA synthesis can occur at the onset. For example, binding of a capped RNA primer or endonuclease activity can be inhibited. Alternatively, the virus mR
The termination reaction of NA or polyadenylic acid addition can be affected. In vitro transcription assays were performed to identify all these possibilities.

【0086】 野生型インフルエンザA/WSN/33ウイルス、D2、およびD1/2トランスフェクタン
トをMDBK細胞中で増殖させ、30%スクロースクッション上で精製した。各ウイル
スについて15cmの皿を12個用いた。精製したウイルスは200μLのPBS中に再懸濁
し、50μLの5x 破壊バッファー(500mM Tris-HCl [pH7.4]、 500mM NaCl、 25mM
MgCl、5mM DTT、25% グリセロール、2.5% NP-40、2.5% Triton X-100、50mg/m
L リゾレシチン)を添加して37℃で30分間インキュベーションすることによって
破壊させた。破壊させたウイルスを、100mM Tris-HCl[pH7.4]、100mM NaCl、5mM
MgCl、および1mM DTT中の不連続なグリセロール濃度勾配(70%、50%、および3
0%、各150μL)で遠心することによって分画化した。その濃度勾配液を0.8mL遠心
管中で、Beckman SW55ローターにアダプターをつけて15℃で4時間、45,000rpmで
遠心した。遠心管の底部から集めた画分を12% SDS-PAGEで分析し、RNPに富んだ
画分を転写アッセイに用いた。
[0086] Wild-type influenza A / WSN / 33 virus, D2, and D1 / 2 transfectants were grown in MDBK cells and purified on a 30% sucrose cushion. Twelve 15 cm dishes were used for each virus. The purified virus was resuspended in 200 μL of PBS and 50 μL of 5x disruption buffer (500 mM Tris-HCl [pH 7.4], 500 mM NaCl, 25 mM
MgCl 2 , 5 mM DTT, 25% glycerol, 2.5% NP-40, 2.5% Triton X-100, 50 mg / m
(L-lysolecithin) was added and disrupted by incubation at 37 ° C. for 30 minutes. The disrupted virus was treated with 100 mM Tris-HCl [pH 7.4], 100 mM NaCl, 5 mM
Discontinuous glycerol concentration gradients (70%, 50%, and 3%) in MgCl 2 and 1 mM DTT
(0%, 150 μL each). The concentration gradient was centrifuged in a 0.8 mL centrifuge tube at 45,000 rpm for 4 hours at 15 ° C. with an adapter attached to a Beckman SW55 rotor. Fractions collected from the bottom of the centrifuge tube were analyzed by 12% SDS-PAGE, and the RNP-rich fraction was used for the transcription assay.

【0087】 in vitro転写活性は、グロビンmRNAをプライマーとして用いて測定した。
転写反応は、50mM Tris-HCl(pH7.8)、50μM KCl、10mM NaCl、5mM MgCl、5mM
DTT、1mM ATP、GTPおよびCTPを各0.5mM、50μM UTP、0.1μM [α-32P]UTP(3
,000 Ci/mmol)、20uのRNase阻害剤(Boehringer Mannheim Corporation, Indiana
polis, 米国インディアナ州)、0.6μgのウサギグロビンmRNA(Gibco BRL)を
含有する反応液の総量20μL中に6μLのRNPを含有する液を用いて行った。31℃で
1.5時間インキュベーションした後、転写産物をフェノール/クロロホルムで抽出
し、5μgのキャリア酵母RNAの存在下で沈殿させた。
The in vitro transcription activity was measured using globin mRNA as a primer.
The transcription reaction was 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 μM KCl, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 5 mM
Each of DTT, 1 mM ATP, GTP and CTP was added to 0.5 mM, 50 μM UTP, 0.1 μM [α- 32 P] UTP (3
000 Ci / mmol), 20u RNase inhibitor (Boehringer Mannheim Corporation, Indiana
polis, Indiana, USA), using a solution containing 6 μL of RNP in a total reaction volume of 20 μL containing 0.6 μg of rabbit globin mRNA (Gibco BRL). At 31 ° C
After a 1.5 hour incubation, the transcript was extracted with phenol / chloroform and precipitated in the presence of 5 μg of carrier yeast RNA.

【0088】 NA特異的転写産物は野生型およびトランスフェクタントRNPの双方から合成し
た。しかし、バンドのパターンには顕著な相異があった。野生型NA特異的転写産
物はサイズの異なるポリ(A)テイルを有するRNA種に対応する広いバンドとし
て現れた。他方、D2およびD1/2トランスフェクタントの双方のNA特異的転写産物
によるバンドは拡散のより少ないものであり、このことはこれらの産物がポリア
デニル酸付加されていない可能性を意味している。転写産物の特徴を調べるため
に、これらをオリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーで分析した。
[0088] NA-specific transcripts were synthesized from both wild-type and transfectant RNPs. However, there were significant differences in the band patterns. Wild-type NA-specific transcripts appeared as broad bands corresponding to RNA species with different sized poly (A) tails. On the other hand, bands due to NA-specific transcripts of both D2 and D1 / 2 transfectants were less diffuse, implying that these products may not have been polyadenylated. . To characterize the transcripts, they were analyzed by oligo (dT) cellulose chromatography.

【0089】 ポリ(A)含有分子を枯渇させた画分は、D2およびD1/2トランスフェクタントで
はより高レベルのNA特異的転写産物を示したが、野生型の対照ではより低いレベ
ルであった。他方、ポリ(A)含有分子に富んだ画分では、D2およびD1/2トランス
フェクタントではNA特異的転写産物はより低いレベルを示したが、野生型ウイル
スではより高いレベルであった。このことはポリ(A)テイルを欠くD2およびD1/2
トランスフェクタントのNA特異的転写産物が大きな比率を占めることを確証する
ものと考えられる。
The fractions depleted of poly (A) -containing molecules showed higher levels of NA-specific transcripts for D2 and D1 / 2 transfectants, but lower levels for wild-type controls. there were. On the other hand, fractions rich in poly (A) -containing molecules showed lower levels of NA-specific transcripts for D2 and D1 / 2 transfectants, but higher levels for wild-type virus. This indicates that D2 and D1 / 2 lack the poly (A) tail.
This would confirm that the transfectant NA-specific transcripts account for a large proportion.

【0090】 このような結果から、D2およびD1/2のNA特異的vRNA中の突然変異がmRN
A転写物のポリアデニル酸付加を妨害するものと考えられる。ポリアデニル酸付
加されていないキャップされた転写物は細胞中で最も急速に分解され易いので(3
0)、これらのウイルスによる感染をうけた細胞中でmRNAの低レベルが観察さ
れたことはこの結論と全く一致するものである。
From these results, it can be seen that mutations in the D2- and D1 / 2 NA-specific vRNAs
It is believed that it interferes with polyadenylation of the A transcript. Capped transcripts that are not polyadenylated are most readily degraded in cells (3
0) The low levels of mRNA observed in cells infected with these viruses are entirely consistent with this conclusion.

【0091】実施例10 MDCK細胞でのトランスフェクタントウイルスの増殖 96ウエルのプレート中のMDCK細胞を、野生型インフルエンザA/WSN/33ウイルス
、もしくはトランスフェクタントD1、D2、D3、およびD1/2ウイルスの5x10 pfu
および10倍希釈で感染させた。各ウイルスに4つのウエルを用いた。感染させた
細胞は、10% ウシ血清アルブミン、および1μg/mLのトリプシンを補給した100μ
Lのダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で維持した。72時間後に、50μLの培地を取
り50μLの1.5%赤血球液を用いて赤血球凝集反応を調べ、各ウイルスについてID
50値を算出した。ID50値は感染細胞の培地の50%が陽性の赤血球凝集シグナ
ルを示す投与量として定義される。野生型ウイルスとD1トランスフェクタントの
ID50は5 pfuであった。他方、D3トランスフェクタントのID50は20倍高かっ
た。D2およびD1/2トランスフェクタントのID50は野生型またはD1トランスフェ
クタントより約3000倍高かった。
[0091]Example 10 Propagation of transfectant virus in MDCK cells MDCK cells in a 96-well plate were transferred to wild-type influenza A / WSN / 33 virus.
Or 5x10 of the transfectants D1, D2, D3, and D1 / 2 viruses4 pfu
And a 10-fold dilution. Four wells were used for each virus. Infected
Cells were 100 μl supplemented with 10% bovine serum albumin and 1 μg / mL trypsin.
L of Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) was maintained. After 72 hours, remove 50 μL of medium.
Hemagglutination was examined using 50 μL of 1.5% erythrocyte fluid.
50Values were calculated. ID50Hemagglutination signal is positive for 50% of the infected cell's medium.
Is defined as the dose showing Of wild-type virus and D1 transfectants
ID50Was 5 pfu. On the other hand, D3 transfectant ID50Is 20 times higher
Was. D2 and D1 / 2 transfectant IDs50Is wild-type or D1 transfer
About 3000 times higher than Coutant.

【0092】実施例11 Vero細胞でのD1/2トランスフェクタントの増殖 35mmの皿に入れたコンフルエントなVero細胞に、野生型A/WSN/33ウイルスまた
はD1/2トランスフェクタントをm.o.i.を0.01として2度感染させた。細胞は2% FB
Sを補給したDMEM中で72時間保持し、培地中に存在するウイルスをMDBK細胞上で
のプラークアッセイによって滴定した。感染性ウイルスは、野生型ウイルスでは
5x10 pfu/mLに達したが、D1/2トランスフェクタントを感染させた細胞の培地
中では5x10 pfu/mL未満であった。
Example 11 Propagation of D1 / 2 Transfectants in Vero Cells Confluent Vero cells in 35 mm dishes were treated with wild-type A / WSN / 33 virus or D1 / 2 transfectants by moi. Two infections were made at 0.01. Cells are 2% FB
The virus was maintained in DMEM supplemented with S for 72 hours and the virus present in the medium was titrated by plaque assay on MDBK cells. Infectious virus is a wild-type virus
It reached 5 × 10 7 pfu / mL but was less than 5 × 10 2 pfu / mL in the medium of cells infected with D1 / 2 transfectants.

【0093】 これらを総合して考慮すると、実施例4、10および11のデータは塩基対突然変
異がインフルエンザAウイルスのvRNAのプロモーターの二本鎖領域にあると
、組織培養におけるインフルエンザウイルスの増殖の低下につながりうることを
示している。上述のとおり、D2およびD1/2トランスフェクタントウイルスはMDBK
細胞中で約1 log低い増殖を示したのに対して、D1およびD3ウイルスは野生型と
同様に増殖した。D2およびD1/2ウイルスのMDCKおよびVero細胞での増殖ではより
劇的な増殖の低下が観察された。興味深いことに、D3トランスフェクタントは野
生型に比べMDCK細胞において増殖の低下を示した。D2およびD1/2トランスフェク
タントは双方ともMDCK細胞で約4 logの増殖の低下を示し、D1/2トランスフェク
タントはVero細胞で5 logの増殖低下を示した。このような結果はD2およびD1/2
突然変異を有するインフルエンザAウイルスがin vivoで効果的な弱毒化を示すで
あろうことを示唆している。
Taken together, the data in Examples 4, 10 and 11 indicate that the base pair mutation in the double stranded region of the promoter of the influenza A virus vRNA indicates that the influenza virus growth in tissue culture Indicates that it could lead to a decline. As mentioned above, the D2 and D1 / 2 transfectant viruses are MDBK
The D1 and D3 viruses grew as wild type, while showing about 1 log lower growth in the cells. A more dramatic decrease in growth was observed with the growth of D2 and D1 / 2 viruses on MDCK and Vero cells. Interestingly, D3 transfectants showed reduced proliferation in MDCK cells compared to wild type. Both D2 and D1 / 2 transfectants showed about 4 log growth reduction in MDCK cells, and D1 / 2 transfectants showed 5 log growth reduction in Vero cells. These results are similar to D2 and D1 / 2
It suggests that the influenza A virus with the mutation will show effective attenuation in vivo.

【0094】実施例12 トランスフェクタントウイルスの継代とD1、D2、およびD3突然変異の安定性の測 定のための配列決定 二重突然変異のあることが確認されたD1、D2、およびD3トランスフェクタント
ウイルスのストックをMDBK細胞上でプラークを作らせ、個々のプラークを低m.o.
i.でMDBK細胞で10回の継代を行った。10回の継代の後、ウイルスのプラークを作
らせ、単一のプラークを配列決定のためのウイルスストックを調製するために用
いた。継代を経たウイルスのストックを30%スクロースクッションを通して精製
し、ウイルスRNAをフェノール-クロロホルム抽出で単離した。NA遺伝子の3'
末端の配列決定するために、ポリ(A)ポリメラーゼ(Gibco BRL, Gaithersburg,
米国メリーランド州)を用いてウイルスRNAの3'末端にポリアデニル酸を付加
した。ポリアデニル酸付加したRNAを、プライマー5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTT
TTTTTTTT-3'を用いて逆転写し、cDNAをインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子
の115〜98(5'-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3')の位置に対応するヌクレオチ
ドを含有するプライマーおよび逆転写に用いたプライマーを用いてPCRで増幅し
た。HindIIIで消化したPCR産物をpUC18中にクローン化し、DNA配列決定キッ
ト(United States Biochemical, Corporation, Cleveland, 米国オハイオ州)で
配列決定した。
[0094] Example 12 Transfection passages and D1, D2 of tanto viruses, and D3 D1, that there is a sequencing double mutation was confirmed for the stability of the measurement mutation D2, and Plaque D3 transfectant virus stocks on MDBK cells and allow individual plaques to
In i., 10 passages were performed on MDBK cells. After 10 passages, viral plaques were generated and a single plaque was used to prepare a viral stock for sequencing. Passaged viral stock was purified through a 30% sucrose cushion and viral RNA was isolated by phenol-chloroform extraction. 3 'of NA gene
To sequence the ends, a poly (A) polymerase (Gibco BRL, Gaithersburg,
Polyadenylic acid was added to the 3 'end of the viral RNA using Maryland, USA. Polyadenylated RNA was added to primer 5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTT
Reverse-transcribed using TTTTTTTT-3 ′ and cDNA was used for primers and reverse transcription containing nucleotides corresponding to positions 115-98 (5′-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3 ′) of the NA gene of influenza A / WSN / 33. Amplified by PCR using primers. HindIII digested PCR products were cloned into pUC18 and sequenced with a DNA sequencing kit (United States Biochemical, Corporation, Cleveland, Ohio, USA).

【0095】 D1トランスフェクタントの3個の個々に継代したプラークに由来する3つのクロ
ーンはU→G10突然変異の存在を示した。D2トランスフェクタントの5個の個々に
継代したプラークから得たクローンは全て予期していたC→A11突然変異を有して
いた。さらに、それらのクローンのうちの2つは4の位置にU→C変化が認められた
が、これは別のインフルエンザAウイルス単離体にも観察される天然の変異であ
る。また、それらのクローンのうちの2つのクローンには、NAの2番目のアミノ酸
をアスパラギンからアスパラギン酸に変える、ノイラミニダーゼの開始コドンに
近接した23の位置におけるU→C突然変異が認められた。D3トランスフェクタント
から得られたクローンのうちC→U12突然変異を示したものは2つのクローンのみ
であった。第3のクローンは野生型配列を有しておりこれはこの塩基対突然変異
が安定ではない可能性を示している。A→G13'の逆行はU-G(12-13')塩基対を有す
る生存可能なウイルスをもたらし、それは次いでU→C12の変化によって野生型の
C-G(12-13')塩基対に復帰しうる。異なる残基の存在により、このような逆突然
変異は調査した他の2つの塩基対においては起こりえない。
[0095] Three clones from three individually passaged plaques of the D1 transfectant showed the presence of the U → G10 mutation. Clones obtained from five individually passaged plaques of the D2 transfectant all had the expected C → A11 mutation. In addition, two of those clones had a U → C change at position 4, which is a natural mutation also observed in another influenza A virus isolate. Two of those clones also showed a U → C mutation at position 23 close to the neuraminidase start codon, changing the second amino acid of NA from asparagine to aspartic acid. Only two clones obtained from the D3 transfectant showed the C → U12 mutation. The third clone has the wild type sequence, indicating that this base pair mutation may not be stable. Reversal of A → G13 ′ results in a viable virus with UG (12-13 ′) base pairs, which is then wild-type by a change in U → C12.
Can revert to CG (12-13 ') base pairs. Due to the presence of different residues, such a backmutation cannot occur at the other two base pairs investigated.

【0096】 要約すれば、D1およびD2トランスフェクタントの3'末端における突然変異は10
回の継代の間保存された。予備的データでは継代を経たトランスフェクタントウ
イルスのNAセグメントの5'末端にも突然変異の存在が確認された。野生型配列へ
復帰するためには2つの特異的突然変異が同時に起こらねばならないので、二重
突然変異を有するトランスフェクタントウイルスは安定なはずであると仮定する
ことができる。C→A11またはG→U12'の単一突然変異を有するトランスフェクタ
ントウイルスはいかなるものもレスキューできるということは証明されず、この
ことはこのようなウイルスが高度に傷つけられているかもしくは全く生存できな
い可能性を示唆している。
In summary, mutations at the 3 ′ end of D1 and D2 transfectants
Stored between passages. Preliminary data confirmed the presence of a mutation at the 5 'end of the transfectant virus' NA segment after passage. Since two specific mutations must occur simultaneously to revert to the wild-type sequence, it can be assumed that transfectant viruses with double mutations should be stable. It has not been proven that any transfectant virus with a single mutation C → A11 or G → U12 ′ can rescue anything, which indicates that such a virus is highly damaged or completely alive Suggests that it may not be possible.

【0097】実施例13 マウスにおけるD2およびD1/2ウイルスの弱毒化 インフルエンザA/WSN/33野生型ウイルスおよびトランスフェクタントウイルス
D1、D2、D3およびD1/2を補強最小必須培地中でMadin-Darbyウシ腎(MDBK)細胞中
で37℃で増殖させた。プラークアッセイはMDBK細胞上で行った。
Example 13 Attenuation of D2 and D1 / 2 Viruses in Mice Influenza A / WSN / 33 Wild-type Virus and Transfectant Virus
D1, D2, D3 and D1 / 2 were grown at 37 ° C. in Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells in supplemented minimal essential medium. Plaque assays were performed on MDBK cells.

【0098】 6〜12週令の雌のBALB/cマウス5匹を1群としてインフルエンザウイルス感染に
用いた。マウスへの鼻腔内(i.n.)接種をエーテル麻酔下で10、3x10、または
10プラーク形成ユニット(pfu)のD1、D2、D3、またはD1/2ウイルスを含有する5
0μLのPBSを用いて行った。対照として、野生型インフルエンザA/WSN/33ウイル
スを同じpfuでマウスに感染させた。このウイルスをEnamiとPalese(4)によって
既に報告されているとおり、野生型NA遺伝子のリボ核タンパク質トランスフェク
ションによってレスキューした。マウスは連日モニターし、臨終状態が観察され
た場合には屠殺した。全ての操作はNIHの実験動物のケアと使用に関するガイド
ラインに従って行った。結果は図4〜9に示す。
Five 6- to 12-week-old female BALB / c mice were used as a group for influenza virus infection. Intranasal (in) inoculation of mice was performed under ether anesthesia at 10 6 , 3 × 10 4 , or
10 containing 3 plaque forming units (pfu) of D1, D2, D3, or D1 / 2 virus
This was performed using 0 μL of PBS. As a control, mice were infected with wild-type influenza A / WSN / 33 virus with the same pfu. The virus was rescued by ribonucleoprotein transfection of the wild-type NA gene as previously reported by Enami and Palese (4). Mice were monitored daily and sacrificed if near term status was observed. All procedures were performed according to NIH guidelines for care and use of laboratory animals. The results are shown in FIGS.

【0099】 野生型ウイルスを感染させたマウスは全て疾病の徴候が出現し、感染の15日後
までに死亡した。しかし、D2またはD1/2ウイルスを感染させたマウスはずべて生
存した。D2またはD1/2ウイルスの感染をうけた動物のうち、高投与量のウイルス
(10pfu)で感染させたもののみで体重の減少がみられた:それらでは感染の3日
後までに体重の10〜20%の減少が見られたが、その後急速に回復した。これらの
実験ではD1ウイルスの病原性は野生型ウイルスの病原性と区別し得ない。D3ウイ
ルスはマウスでわずかに弱毒化された表現型を示した。
All mice infected with the wild-type virus showed signs of disease and died by 15 days after infection. However, all mice infected with the D2 or D1 / 2 virus survived. High-dose virus among animals infected with the D2 or D1 / 2 virus
Only those infected with (10 6 pfu) lost weight: they had a 10-20% loss of body weight by 3 days post-infection, but then recovered rapidly. In these experiments, the pathogenicity of the D1 virus cannot be distinguished from that of the wild-type virus. D3 virus showed a slightly attenuated phenotype in mice.

【0100】実施例14 マウス肺におけるD2およびD1/2ウイルスの複製の損傷 1群6匹のBALB/cマウスを10pfuの野生型、D1、D2、D3、またはD1/2ウイルス
を用いて上述のとおり鼻腔内に感染させた。感染の3日後に1群あたり3匹を屠殺
し、肺を摘出し2mLのPBS中でホモゲナイズし、ウイルス力価をMDBK細胞中でのプ
ラークアッセイによって測定した。感染の6日後、残りのマウスも屠殺し、同じ
プロトコールでそれらの肺でのウイルス力価を測定した。結果は図10に示す。
[0100] Example 14 damage per group six BALB / c mice replication D2 and D1 / 2 virus in mouse lung 10 3 pfu of wild-type, by using the D1, D2, D3 or D1 / 2 virus, Infection was performed intranasally as described above. Three days after infection, three animals per group were sacrificed, lungs were removed and homogenized in 2 mL of PBS, and virus titers were determined by plaque assay in MDBK cells. Six days after infection, the remaining mice were also sacrificed and virus titers were measured in their lungs using the same protocol. The results are shown in FIG.

【0101】 野生型およびD1ウイルスは、感染マウスの肺で高い力価を示す程度まで増殖し
た(それぞれ感染後3および6日目に約10および10pfu/mL)。D3ウイルスを感染
させたマウスの肺での力価は約1.5 log低かった。これに対して、D2またはD1/2
を感染させたマウスの肺でウイルス力価は検出できなかったかあるいは非常に低
かった(10pfu/mL未満)。この結果はD2およびD1/2ウイルスの複製がマウスの肺
では高度に損なわれていることを示している。
[0102] Wild-type and D1 virus (about 106 and 10 7 pfu / mL in 3 and 6 days after each infection) that proliferated to the extent that exhibit high titers in the lungs of infected mice. The titers in the lungs of mice infected with the D3 virus were approximately 1.5 log lower. In contrast, D2 or D1 / 2
Virus titers in the lungs of mice infected with was low that could not or very detected (less than 10 3 pfu / mL). This result indicates that replication of the D2 and D1 / 2 viruses is highly impaired in the lungs of mice.

【0102】実施例15 D2およびD1/2ウイルスによる感染防御免疫の誘導 上述のとおりD2またはD1/2で鼻腔内感染させ生存したマウスの群から感染3週
間後に血清を採取しプールした。BurnetとStone(55)が既に報告しているとおり
に、血清を受容体破壊酵素(Sigma)で処理してインフルエンザウイルス媒介赤血
球凝集反応の非特異的阻害剤を除去した。赤血球凝集阻害(HI)力価はHA力価が8
のインフルエンザA/WSN/33ウイルス調製品の赤血球凝集活性を中和することので
きる最も高い血清希釈度で測定した。これらのアッセイでは0.5%のニワトリ赤血
球を用いた。
Example 15 Induction of Protective Immunity by D2 and D1 / 2 Viruses As described above, sera were collected and pooled 3 weeks after infection from a group of mice that had been infected intranasally with D2 or D1 / 2 and survived. Serum was treated with receptor-destroying enzyme (Sigma) to remove non-specific inhibitors of influenza virus-mediated hemagglutination, as previously reported by Burnet and Stone (55). Hemagglutination inhibition (HI) titer is HA titer of 8
Hemagglutination activity of the influenza A / WSN / 33 virus preparation was measured at the highest serum dilution capable of neutralizing. In these assays, 0.5% chicken erythrocytes were used.

【0103】 試験に供した血清のプール全てがHI活性を有するインフルエンザA/WSN/33ウイ
ルスに対する抗体を含むことが認められた。HI力価は高いウイルス投与量で免疫
された動物ではより高かった(下記の表1参照)。
It was found that all pools of sera subjected to the test contained antibodies to influenza A / WSN / 33 virus with HI activity. HI titers were higher in animals immunized with higher virus doses (see Table 1 below).

【0104】 さらに、D2またはD1/2ウイルスを鼻腔内で感染させたマウスは全て、野生型の
A/WSN/33ウイルスを致死的感染投与量(1000 LD50を超える量)でチャレンジし
た場合に、死亡および疾病に対して防御されている(体重の減少の程度で見た場
合)ことが観察された(表1ならびに図11および12を参照せよ)。
In addition, all mice infected intranasally with the D2 or D1 / 2 virus were all wild-type
When challenged with A / WSN / 33 virus at a lethal infection dose (amount of more than 1000 LD 50), (when viewed in the degree of weight loss), which is protected against death and disease it is observed (See Table 1 and FIGS. 11 and 12).

【0105】 表1 D2およびD1/2ウイルスで免疫したマウスにおける 野生型インフルエンザウイルス感染に対する防御 実施例16 NA遺伝子をレスキューするためのヘルパーウイルスとしてのD1/2トランスフェク タントウイルスの使用 上述のとおり、D1/2トランスフェクタントウイルスのVero細胞での増殖は野生
型インフルエンザA/WSN/33に比べ約5 logの低減を示した。従ってインフルエン
ザAウイルスのNAコード化vRNAセグメントのレスキューのための別のレスキ
ューシステムを提供するためにこのウイルスを用いることができる。このための
適切なプロトコールは次のステップからなる。
TABLE 1 Protection against wild-type influenza virus infection in mice immunized with D2 and D1 / 2 viruses As used above D1 / 2 transfectant virus as helper virus to rescue EXAMPLE 16 NA gene, growth on Vero cells D1 / 2 transfectant virus wild type influenza A / WSN / It showed about 5 log reduction compared to 33. Thus, the virus can be used to provide another rescue system for rescue of the NA-encoded vRNA segment of the influenza A virus. A suitable protocol for this consists of the following steps.

【0106】 1. D1/2ヘルパーウイルスのMDBK細胞への感染 2. DEAE-デキストラン/DMSOトランスフェクション試薬での感染MDBK細胞の 処理 3. D1/2ヘルパーウイルスを感染させDEAE-デキストラン/DMSOで処理したMDBK
細胞への合成NAリボ核タンパク質複合体のトランスフェクション、 ならびに 4. Vero細胞上でのレスキューされたウイルスの選択。
1. Infection of MDBK cells with D1 / 2 helper virus 2. Treatment of infected MDBK cells with DEAE-dextran / DMSO transfection reagent 3. Infection with D1 / 2 helper virus and treatment with DEAE-dextran / DMSO MDBK
Transfection of synthetic NA ribonucleoprotein complex into cells, and 4. Selection of rescued virus on Vero cells.

【0107】 トランスフェクションされたNA遺伝子を獲得したウイルスのみがVero細胞上で高
力価となるまで増殖する。
Only the virus that has acquired the transfected NA gene will grow on Vero cells to high titers.

【0108】参照文献 1. Muster, T. Subbarao, E.K., Enami, M., Murphy, B.R.およびPalese, P. 19
91.「インフルエンザBウイルスの5’および3’非コード領域をノイラミニダーゼ
遺伝子上に含むインフルエンザAウイルスはマウス中で弱毒化されている(An inf
luenza A virus containing influenza B virus 5' and 3’ non-coding region
s on the neuraminidase gene is attenuated in mice.)」Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 88, 5177-5181. 2. Luo, G., Bergmann, M., Garcia-Sastre, A.およびPalese, P. 1992.「キメ
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エンザAウイルスセグメントの相対的な量は、そのセグメントの複製低下によっ
ては影響を受けない(The relative amount of an influenza A virus segment p
resent in the viral particle is not affected by a reduction in replicati
on of that segment.)」 J. Gen. Virol. 76, 3211-3215. 4. Enami, M., W. Luytjes, M. KrystalおよびP. Palese. 1990.「インフルエン
ザウイルスのゲノムへの、部位特異的突然変異の導入(Introduction of site sp
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cterization of the RNA-fork model of virion RNA in the initiation of tra
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換体インフルエンザウイルスポリメラーゼ:5’および3’ウイルス末端双方の、
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ase: requirement of both 5’ and 3’ viral ends for endonuclease activit
y.)」 J. Virol. 68: 1509-1515. 12. Honda, A.およびA. Ishihama. 1997.「インフルエンザウイルスRNAポリメラ
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ected cells by a terminal panhandle.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8
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ル化シグナルの特性決定(Characterization of the polyadenylation signal of
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ウイルスRNAのポリアデニル化シグナルは、パンハンドル構造のRNA二本鎖が後に
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influenza virus RNA involves a stretch of uridines followed by the RNA
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可能とする(Sequential addition of temperature-sensitive missense mutatio
ns into the PB2 gene of influenza A transfectant virus can effect an inc
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【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】 パンハンドル型/RNAフォーク型コンホメーションのインフルエンザAウイルス
vRNAの保存された配列を示す図である(7、13)。このRNAセグメントの5'および
3'末端の両方を有するRNAフォークの二本鎖領域内の、保存された塩基対を四角
で囲んでいる。残基の番号は3'末端および5'末端から始まる。5'末端からの番号
をダッシュ(')で区別している。実施例中の、D1、D2、D3およびD1/2と命名さ
れたトランスフェクタントウイルスの、改変体NAをコードするvRNAの保存された
二本鎖領域の塩基対を示す。変化した塩基対に影をつけて強調している。
[Figure 1] Panhandle / RNA fork conformational influenza A virus
FIG. 7 shows the conserved sequence of vRNA (7, 13). The 5 'and
Conserved base pairs in the double-stranded region of the RNA fork with both 3 'ends are boxed. Residue numbers begin at the 3 'and 5' ends. Numbers from the 5 'end are distinguished by a dash ('). 1 shows the base pairs of the conserved double-stranded region of the vRNA encoding the variant NA of the transfectant viruses named D1, D2, D3 and D1 / 2 in the examples. The changed base pairs are highlighted with shadows.

【図2】 MDBK細胞上のトランスフェクタントウイルスの増殖曲線を示す図である。35 m
mディッシュ中の集密的細胞に、野生型インフルエンザA/WSN/33(野生型;WT)
ウイルス、およびトランスフェクタントD1、D2、D3またはD1/2ウイルスを感染多
重度(m.o.i.)0.01で感染させた。指示した時点で、MDBK細胞中のプラークアッ
セイによって、培地中に存在する感染性粒子の力価を測定した。示した数値は二
重試験の平均である。
FIG. 2 is a diagram showing a growth curve of a transfectant virus on MDBK cells. 35 m
m Confluent cells in the dish, wild-type influenza A / WSN / 33 (wild-type; WT)
Virus and transfectants D1, D2, D3 or D1 / 2 virus were infected at a multiplicity of infection (moi) of 0.01. At the indicated times, the titer of infectious particles present in the medium was determined by plaque assay in MDBK cells. The values shown are the average of duplicate tests.

【図3】 一方の末端(部位2404)で唯一のBbsI制限部位に隣接し、そして他方の末端(
部位3821-3836)でバクテリオファージT3RNAポリメラーゼプロモーターに隣接し
たインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子(位置2412-3820)の全長cDNAを、pUC19ク
ローニングベクターを背景としてEcoRI制限部位(位置2398)とHindIII(位置38
37)制限部位との間に含有するプラスミドpT3NAm1のヌクレオチド配列を示す図
である(9)。このプラスミドを使用して、D1、D2、D3およびD1/2ウイルス中に
存在するインフルエンザA/WSN/33のNAをコードするvRNAの突然変異体を取得した
(実施例1参照)。
FIG. 3 flanking a unique BbsI restriction site at one end (site 2404) and the other end (site 2404)
The full length cDNA of the influenza A / WSN / 33 NA gene (pos. 2412-3820) flanked by the bacteriophage T3 RNA polymerase promoter at sites 3821-3836) was ligated with the EcoRI restriction site (pos. 2398) and HindIII (pos. 2398) against a pUC19 cloning vector background. Position 38
37) It is a figure showing the nucleotide sequence of plasmid pT3NAm1 contained between restriction sites (9). Using this plasmid, mutants of the vRNA encoding the NA of influenza A / WSN / 33 present in the D1, D2, D3 and D1 / 2 viruses were obtained (see Example 1).

【図4】 103プラーク形成単位(pfu)を鼻腔内感染させたマウスにおける、野生型、D1
、D2、D3およびD1/2ウイルスの病原性の時間経過を示す図である(実施例13参照
)。
[4] 10 3 plaque forming units (pfu) in mice infected intranasally, wild-type, D1
FIG. 14 is a diagram showing the time course of the pathogenicity of the D2, D3, and D1 / 2 viruses (see Example 13).

【図5】 103 pfuで野生型、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスをマウスに鼻腔内感染させ
た後の体重を示す図である。
FIG. 5 shows the body weight after intranasal infection of mice with 10 3 pfu of wild-type, D1, D2, D3 and D1 / 2 viruses.

【図6】 3×104 pfuを鼻腔内感染させたマウスにおける、野生型、D1、D2、D3およびD1
/2ウイルスの病原性の時間経過を示す図である。
FIG. 6. Wild-type, D1, D2, D3 and D1 in mice infected intranasally with 3 × 10 4 pfu
FIG. 3 is a diagram showing the time course of the pathogenicity of the / 2 virus.

【図7】 3×104 pfuで野生型、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスをマウスに鼻腔内感染さ
せた後の体重を示す図である。
FIG. 7 shows the body weight after intranasal infection of mice with wild type, D1, D2, D3 and D1 / 2 viruses at 3 × 10 4 pfu.

【図8】 106 pfuを鼻腔内感染させたマウスにおける、野生型、D1、D2、D3およびD1/2
ウイルスの病原性の時間経過を示す図である。
FIG. 8. Wild-type, D1, D2, D3 and D1 / 2 in mice infected intranasally with 10 6 pfu
FIG. 3 is a diagram showing the time course of the pathogenicity of a virus.

【図9】 106 pfuで野生型、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスをマウスに鼻腔内感染させ
た後の体重を示す図である。
FIG. 9 shows the body weight after intranasal infection of mice with 10 6 pfu of wild-type, D1, D2, D3 and D1 / 2 viruses.

【図10】 103 pfuで野生型(WT)、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスを鼻腔内感染させた
後、感染後3日目(左)および6日目(右)のマウスの肺のウイルス力価(1mlあ
たりのlog pfu)を示す図である(実施例14参照)。
FIG. 10. Intranasal infection of wild type (WT), D1, D2, D3 and D1 / 2 viruses with 10 3 pfu, followed by 3 days (left) and 6 days (right) of mice after infection. FIG. 7 is a diagram showing virus titers (log pfu per ml) of lungs (see Example 14).

【図11】 D2(3用量レベル:106、3×104および103 pfu)で免疫したマウスの、106 pfu
野生型ウイルスでチャレンジした後の体重を示す図である(実施例15参照)。
FIG. 11. 10 6 pfu of mice immunized with D2 (3 dose levels: 10 6 , 3 × 10 4 and 10 3 pfu)
FIG. 9 is a diagram showing the body weight after challenge with a wild-type virus (see Example 15).

【図12】 D1/2(3用量レベル:106、3×104および103 pfu)で免疫したマウスの、106 p
fu野生型ウイルスでチャレンジした後の体重を示す図である。
FIG. 12. 10 6 p of mice immunized with D1 / 2 (3 dose levels: 10 6 , 3 × 10 4 and 10 3 pfu)
FIG. 3 is a diagram showing the body weight after challenge with the fu wild-type virus.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 フォドー,アーヴィン イギリス国 オーエックス1 3アールイ ー オックスフォード,ユニバーシティー オブ オックスフォード,サー ウィリ アム ダン スクール オブ パソロジー (72)発明者 パレッセ,ピーター アメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州, ニューヨーク,ガステイヴ エル.レヴィ ー プレイス 1,マウント シナイ ス クール オブ メディシン,デパートメン ト オブ マイクロバイオロジー (72)発明者 ガルシア−サストレ,アドルフォ アメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州, ニューヨーク,ガステイヴ エル.レヴィ ー プレイス 1,マウント シナイ ス クール オブ メディシン,デパートメン ト オブ マイクロバイオロジー Fターム(参考) 4B024 AA01 BA32 CA04 CA05 CA12 DA02 EA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA97X AA97Y AC20 BA02 BA14 CA24 CA44 CA45 4C085 AA03 BA55 CC08 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Fodor, Irvine United Kingdom 13 Aallie Oxford, University of Oxford, Sir William Dunn School of Pathology (72) Inventor Paresse, Peter United States 10029 New York, New York, Gustave El. Levi Place 1, Mount Sinais Cool of Medicine, Department of Microbiology (72) Inventor Garcia-Sastre, Adolfo United States 10029 New York, New York, Gustave El. Revive Place 1, Mount Sinais Cool of Medicine, Department of Microbiology F Term (Reference) 4B024 AA01 BA32 CA04 CA05 CA12 DA02 EA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA97X AA97Y AC20 BA02 BA14 CA24 CA44 CA45 4C085 AA03 BA55 CC08

Claims (27)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 インフルエンザウイルスタンパク質またはその機能性改変体
のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフルエンザウイルスRNAゲ
ノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3'非コード領域を含む、
ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイルスであって、該二本鎖領
域が少なくとも1つの塩基対置換を有し、その結果として、該ウイルスに感染し
た細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱毒化された表現型
を与えることを特徴とする弱毒インフルエンザウイルス。
Claims 1. A 5 'and 3' non-coding region providing a mutant double-stranded region of an influenza virus RNA genomic segment operably linked to a protein coding sequence of an influenza virus protein or a functional variant thereof. Including,
An attenuated influenza virus carrying a genomic nucleic acid segment, wherein said double-stranded region has at least one base pair substitution, resulting in reduced expression of said protein coding sequence in cells infected with said virus; An attenuated influenza virus, which confers an attenuated phenotype.
【請求項2】 Madin-Darbyウシ腎(MDBK)細胞、Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細
胞およびVero細胞から選択される1種以上の細胞上でのプラーク力価が、親野生
型ウイルスと比べたとき、低下している、請求項1記載のウイルス。
2. The plaque titer on one or more cells selected from Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells, Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and Vero cells as compared to the parent wild-type virus. 2. The virus of claim 1, wherein said virus is reduced when said virus is detected.
【請求項3】 MDBK細胞上でのプラーク力価が、親野生型ウイルスと比べた
とき、少なくとも約1log低下している、請求項2記載のウイルス。
3. The virus of claim 2, wherein the plaque titer on MDBK cells is reduced by at least about 1 log when compared to the parent wild-type virus.
【請求項4】 MDCK細胞およびVero細胞上でのプラーク力価が、親野生型ウ
イルスと比べたとき、少なくとも約3〜4log低下している、請求項2記載のウ
イルス。
4. The virus of claim 2, wherein the plaque titer on MDCK cells and Vero cells is reduced by at least about 3-4 logs when compared to the parent wild-type virus.
【請求項5】 前記ゲノム核酸セグメントが変異型の天然インフルエンザウ
イルスゲノムRNAセグメントである、請求項1〜4のいずれか1項記載のウイル
ス。
5. The virus according to claim 1, wherein the genomic nucleic acid segment is a mutant natural influenza virus genomic RNA segment.
【請求項6】 A型の弱毒インフルエンザウイルスであり、ここで、前記核
酸セグメントは、非コード二本鎖領域中に弱毒化性の塩基対置換をもたらすよう
に、天然親セグメントの3'末端から11位にCからAへの突然変異を有しかつ天然
親セグメントの5'末端から12'位にGからUへの突然変異を有するか、または同
一位置に機能的に等価の置換を有する、変異型のインフルエンザAウイルスゲノ
ムRNAセグメントである、請求項1〜5のいずれか1項記載のウイルス。
6. An attenuated influenza virus of type A, wherein said nucleic acid segment is from the 3 'end of the native parent segment so as to effect an attenuating base pair substitution in the non-coding double stranded region. Has a C to A mutation at position 11 and a G to U mutation at position 12 'from the 5' end of the native parent segment, or has a functionally equivalent substitution at the same position; The virus according to any one of claims 1 to 5, which is a mutant influenza A virus genomic RNA segment.
【請求項7】 前記核酸セグメントがさらに、非コード二本鎖領域中に追加
の塩基対置換をもたらすように、天然親セグメントの3'末端から10位にUからG
への突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から11'位にAからCへの突
然変異を有するか、または同一位置に機能的に等価の置換を有する、請求項6記
載のウイルス。
7. The nucleic acid segment further comprises U to G at position 10 from the 3 'end of the native parent segment, such that it introduces additional base pair substitutions in the non-coding duplex region.
7. The virus of claim 6, which has a mutation to A and a mutation from A to C at position 11 'from the 5' end of the native parent segment, or has a functionally equivalent substitution at the same position. .
【請求項8】 前記核酸セグメントがノイラミニダーゼ(NA)またはその機能
性改変体をコードする、請求項6または7記載のウイルス。
8. The virus according to claim 6, wherein the nucleic acid segment encodes neuraminidase (NA) or a functional variant thereof.
【請求項9】 1つ以上の前記塩基対置換によって弱毒化されている野生型
ウイルスである、請求項1〜8のいずれか1項記載のウイルス。
9. The virus according to any one of claims 1 to 8, which is a wild-type virus attenuated by one or more of said base pair substitutions.
【請求項10】 標的細胞内での発現が可能な異種コード配列をさらに含む
、請求項1〜8のいずれか1項記載のウイルス。
10. The virus according to claim 1, further comprising a heterologous coding sequence capable of being expressed in a target cell.
【請求項11】 前記異種コード配列が病原体に対する免疫応答を刺激しう
る抗原性のペプチドまたはポリペプチドをコードする、請求項10記載のウイルス
11. The virus of claim 10, wherein said heterologous coding sequence encodes an antigenic peptide or polypeptide capable of stimulating an immune response against a pathogen.
【請求項12】 請求項8で定義したNAコード化核酸セグメントを有する弱
毒インフルエンザA/WSN/33である、請求項9記載のウイルス。
12. The virus of claim 9, which is an attenuated influenza A / WSN / 33 having an NA-encoding nucleic acid segment as defined in claim 8.
【請求項13】 請求項1または請求項5〜8のいずれか1項で定義した核
酸。
13. A nucleic acid as defined in claim 1 or any one of claims 5 to 8.
【請求項14】 請求項13記載の核酸を提供する転写可能なDNA。14. A transcribable DNA which provides the nucleic acid according to claim 13. 【請求項15】 請求項14記載のDNAを含有するプラスミド。15. A plasmid containing the DNA according to claim 14. 【請求項16】 請求項13記載の核酸がインフルエンザウイルスの核タンパ
ク質およびポリメラーゼタンパク質と複合体を形成している、請求項1〜12のい
ずれか1項記載の弱毒ウイルスの作製に使用するためのリボ核タンパク質(RNP)
複合体。
16. The nucleic acid according to claim 13, which forms a complex with a nucleoprotein and a polymerase protein of an influenza virus, for use in producing an attenuated virus according to any one of claims 1 to 12. Ribonucleoprotein (RNP)
Complex.
【請求項17】 請求項1〜12のいずれか1項記載のウイルスを感染させた
ex vivo細胞。
17. A virus infected with the virus according to any one of claims 1 to 12.
ex vivo cells.
【請求項18】 請求項1〜11のいずれか1項記載のウイルスを含むワクチ
ン。
A vaccine comprising the virus according to any one of claims 1 to 11.
【請求項19】 請求項11記載のウイルスを含み、インフルエンザウイルス
とインフルエンザウイルス以外の第2の病原体に対する免疫応答を刺激しうる、
請求項18記載のワクチン。
19. The method according to claim 11, wherein the virus is capable of stimulating an immune response against influenza virus and a second pathogen other than influenza virus.
19. The vaccine according to claim 18.
【請求項20】 請求項10記載のウイルスを、標的細胞へ前記異種コード配
列を送達するための製薬上許容される担体または希釈剤と共に含有する医薬組成
物。
20. A pharmaceutical composition comprising the virus of claim 10 together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent for delivering said heterologous coding sequence to target cells.
【請求項21】 請求項10または11記載のウイルスを感染させた細胞を、製
薬上許容される担体または希釈剤と共に含有する医薬組成物。
21. A pharmaceutical composition comprising cells infected with the virus according to claim 10 or 11 together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
【請求項22】 宿主細胞中に、請求項1〜12のいずれか1項記載のウイル
スのゲノム核酸セグメントを、該セグメントがウイルス粒子へとパッケージング
される条件下で供給することを含む、請求項1〜12のいずれか1項記載のウイル
スの作製方法。
22. Providing a host cell with a genomic nucleic acid segment of a virus according to any one of claims 1 to 12 under conditions where said segment is packaged into a virus particle. Item 13. The method for producing a virus according to any one of Items 1 to 12.
【請求項23】 細胞内のインフルエンザウイルスゲノム核酸セグメントを
レスキューするヘルパーウイルスとしての請求項1〜12のいずれか1項記載のウ
イルスの使用であって、該核酸セグメントを含む産生されたウイルスが、所定の
型の細胞上で、該ヘルパーウイルスと比べて増大した増殖を示すことに基づいて
選択されることを特徴とする、上記使用。
23. Use of a virus according to any one of claims 1 to 12 as a helper virus to rescue an influenza virus genomic nucleic acid segment in a cell, wherein the produced virus comprising said nucleic acid segment comprises: Use according to the preceding claims, characterized in that it is selected on the basis of showing increased proliferation on said type of cells compared to said helper virus.
【請求項24】 NAをコードするインフルエンザAウイルスゲノム核酸セグ
メントまたはその機能性改変体をレスキューする請求項23記載のヘルパーウイル
スとしての請求項8記載のインフルエンザAウイルスの使用。
24. Use of the influenza A virus according to claim 8 as a helper virus according to claim 23 for rescuing an influenza A virus genomic nucleic acid segment encoding NA or a functional variant thereof.
【請求項25】 レスキューされるべき前記核酸セグメントを担うウイルス
の選択がVero細胞上で実施される、NAコード化ゲノムRNAセグメント中に請求項
7で定義した突然変異を有する弱毒インフルエンザA/WSN/33の請求項24記載の使
用。
25. The attenuated influenza A / WSN / having a mutation as defined in claim 7 in the NA-encoding genomic RNA segment, wherein the selection of the virus carrying said nucleic acid segment to be rescued is performed on Vero cells. 33. Use according to claim 24.
【請求項26】 請求項1〜11のいずれか1項記載の弱毒インフルエンザウ
イルスを免疫化の方法で投与することを含む、インフルエンザウイルスに対する
免疫応答を、場合により1以上の他の病原体に対する免疫応答と共に、刺激する
方法。
26. An immune response against an influenza virus comprising administering an attenuated influenza virus according to any one of claims 1 to 11 in a method of immunization, optionally against one or more other pathogens. How to stimulate with.
【請求項27】 異種コード配列を担う請求項10記載のウイルスを細胞に感
染させることを含む、細胞への異種コード配列の送達方法。
27. A method for delivering a heterologous coding sequence to a cell, comprising infecting the cell with the virus according to claim 10, which carries the heterologous coding sequence.
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