JP2002512798A

JP2002512798A - 皮膚細胞から単離したポリヌクレオチドおよびその使用方法

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Publication number: JP2002512798A
Application number: JP2000546009A
Authority: JP
Inventors: ローナストレイチャン、; マシュースリーマン、; ジェームズダグラスワトソン、; ルネオンラスト、; アナンドクンブル、; ジェームズグレグムリスン、
Original assignee: ジェネシスリサーチアンドデベロップメントコーポレイションリミテッド
Priority date: 1998-04-29
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2002-05-08
Also published as: EP1073740A4; CA2327317A1; AU3961499A; WO1999055865A1; CN1307637A; EP1073740A1; NZ507728A; CN1158386C; AU758074B2

Abstract

(57)【要約】哺乳動物皮膚細胞で発現されるポリペプチドをコード化している単離ポリヌクレオチドが、該単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびホスト細胞と共に提供される。該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、皮膚細胞で発現さ
れるポリペプチド、および治療法におけるその使用に関する。

【０００２】（発明の背景）皮膚は、身体の最大の器官であり、保護被覆物としての機能を有する。皮膚を
失うと、これは重度のやけどを負った人に生じるが、外来微生物による感染に対
する障壁がなくなるため、並びに体温および体液の損失のために死亡することが
ある。

【０００３】皮膚組織は数層からなる。最外層は、基底膜により支持された表皮であり、真
皮の上にある。真皮の下には、疎性結合組織および骨組織または筋肉を覆う筋膜
がある。皮膚は、細胞が絶えず形成され剥離する自己再生組織である。表皮の最
も深い細胞は基底細胞であり、複製可能な細胞に富む。このような複製細胞は、
前駆細胞または幹細胞と呼ばれる。次に、複製細胞は、「一過性増殖(amplifyin
g)細胞」と呼ばれる娘細胞を生じる。これらの細胞は、基底層から表皮のより表
面層に移動するにつれて、分化および成熟を受けてケラチノサイト（成熟皮膚細
胞）となる。その過程で、ケラチノサイトは角質化し、最終的に皮膚表面から剥
離する。表皮中の他の細胞は、太陽光線に対する保護に関与する色素であるメラ
ニンを合成するメラノサイトを含む。ランゲルハンス細胞も、表皮に存在し、外
来タンパク質を処理して免疫系へ示す細胞として機能する。

【０００４】真皮は、神経、血管およびリンパ管、繊維および脂肪組織を含む。真皮内には
、繊維芽細胞、マクロファージおよび肥満細胞がある。表皮および真皮の両方に
、汗腺、皮脂腺、および毛包が貫通している。どの髪房も毛包から出ている。髪
が抜けると、髪は、毛包の真皮乳頭により指示された上皮細胞から再生する。

【０００５】皮膚表面が、例えば創傷で裂けると、幹細胞が増殖(proliferate)し、娘ケラ
チノサイトが創傷に移動してその組織を再び封じる。それ故、皮膚細胞は、外傷
に応答して活性化される遺伝子を有する。これらの遺伝子の産物は、皮膚細胞の
増殖を媒介する、表皮増殖(growth)因子などのいくつかの増殖因子を含む。皮膚
で活性化される遺伝子、並びに該遺伝子のタンパク質産物は、皮膚創傷の治療の
ための薬剤として開発し得る。皮膚細胞から誘導された他の増殖因子は、他の細
胞型の増殖にも影響を及ぼし得る。皮膚癌は皮膚細胞の増殖の異常であるので、
細胞増殖を調節する皮膚由来タンパク質を、皮膚癌の治療のための薬剤として開
発し得る。メラニンの産生を調節する皮膚由来タンパク質は、太陽光の望ましく
ない作用から皮膚を保護する薬剤として有用であり得る。

【０００６】ケラチノサイトは、サイトカインを分泌し、様々な細胞表面タンパク質を発現
することが知られている。サイトカインおよび細胞表面分子は、感染に対する炎
症応答並びに皮膚に悪影響を及ぼす自己免疫疾患にも重要な役割を果たすタンパ
ク質である。従って、皮膚細胞により発現される遺伝子およびそのタンパク質産
物を、皮膚に影響を及ぼす炎症疾患の治療のための薬剤に開発し得る。

【０００７】髪は、個々人の個性の重要な一部である。皮膚の疾患により、髪を失うことが
ある。円形脱毛症は、頭皮上の髪の斑点状喪失を特徴とする疾病である。完全禿
頭は癌の薬物治療の副作用の１つである。髪の発毛および発達は、皮膚および真
皮乳頭で発現される遺伝子の作用により媒介される。該遺伝子およびそのタンパ
ク質産物は、毛包の疾患の治療のための薬剤に有用に開発され得る。

【０００８】皮膚創傷の治癒を早め、髪の喪失を予防し、髪の再生または髪の除去を増強し
、また、より効果的に副作用なく自己免疫性および炎症性の皮膚疾病を治療する
ための、新規な治療法が必要である。より効果的な皮膚癌の治療法も必要である
。従って、皮膚に関連した疾患を含む疾患の治療のための治療剤の開発に使用す
るための、皮膚で発現されるタンパク質をコード化する遺伝子の同定および単離
が当該分野では依然として必要とされている。

【０００９】（発明の要約）本発明は、皮膚細胞で発現されるポリペプチドを、該ポリペプチドをコード化
しているポリヌクレオチドと共に、並びに、該ポリヌクレオチドを含む発現ベク
ターおよびホスト細胞、並びにその使用法を提供する。

【００１０】具体的な実施態様において、（ａ）配列番号１−１４、４５−４８、６４−６
８、７７−８９、１１８、１１９、１９８−２３１、２３９−２４９、２５４−
２７４、３４９−３７２および３９９−４０５に列挙した配列；（ｂ）配列番号
１−１４、４５−４８、６４−６８、７７−８９、１１８、１１９、１９８−２
３１、２３９−２４９、２５４−２７４、３４９−３７２および３９９−４０５
に列挙した配列の相補体；（ｃ）配列番号１−１４、４５−４８、６４−６８、
７７−８９、１１８、１１９、１９８−２３１、２３９−２４９、２５４−２７
４、３４９−３７２および３９９−４０５に列挙した配列の逆相補体；（ｄ）配
列番号１−１４、４５−４８、６４−６８、７７−８９、１１８、１１９、１９
８−２３１、２３９−２４９、２５４−２７４、３４９−３７２および３９９−
４０５に列挙した配列の逆配列；（ｅ）（ａ）−（ｄ）の配列と９９％同一であ
る確率を有する配列；並びに（ｆ）（ａ）−（ｄ）の配列に少なくとも５０％、
７５％または９０％の同一性を有する配列、からなる群から選択されたＤＮＡ配
列を含む、単離ポリヌクレオチドが提供される。

【００１１】さらなる実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１２０−１９７、２７
５−３４８、３７３−３９８および４０６−４０９で与えられた配列；および（
ｂ）配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８および４０６−
４０９で与えられた配列に少なくとも５０％、７５％または９０％同一性を有す
る配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを、該
ポリペプチドをコード化している単離ポリヌクレオチドと共に提供する。（ａ）
配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８および４０６−４０
９で与えられた配列；並びに（ｂ）配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、
３７３−３９８および４０６−４０９の配列に５０％、７５％または９０％の同
一性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
の少なくとも機能的部分を含む、単離ポリペプチドも提供される。

【００１２】関連した実施態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベク
ターを、該ベクターで形質転換するホスト細胞と共に提供する。

【００１３】さらなる態様において、本発明は、被検者に、単離ポリペプチドを含む組成物
を投与することを含む、ケラチノサイト増殖および運動性を刺激し、上皮由来癌
細胞の増殖を抑制し、腫瘍の血管形成および血管新生を抑制し、または該被検者
の血管の増殖を調節する方法を提供し、ここで、該ポリペプチドは、（ａ）配列
番号１８７、１９６、３４２、３４３、３９５、３９７および３９８で与えられ
た配列；並びに（ｂ）配列番号１８７、１９６、３４２、３４３、３９５、３９
７および３９８で与えられた配列に少なくとも５０％、７５％または９０％の同
一性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。

【００１４】被検者の皮膚炎症を和らげる方法も提供され、該方法は、被検者に、単離ポリ
ペプチドを含む組成物を投与することを含み、ここで、該ポリペプチドは、（ａ
）配列番号３３８および３４７で与えられた配列；並びに（ｂ）配列番号３３８
および３４７で与えられた配列に少なくとも５０％、７５％または９０％の同一
性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。追加の態様に
おいて、本発明は、被検者の上皮細胞の増殖を刺激する方法を提供する。該方法
は、被検者に、（ａ）配列番号１２９および３４８で与えられた配列；並びに（
ｂ）配列番号１２９および３４８で与えられた配列に少なくとも５０％、７５％
または９０％の同一性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を
含む単離ポリペプチドを含む組成物を投与することを含む。さらに別の態様にお
いて、被検者の炎症疾病の治療または癌の治療のための、白血球へのＨＩＶ−１
の結合を抑制する方法が提供され、該方法は、被検者に、（ａ）配列番号３４０
、３４４、３４５および３４６で与えられた配列；並びに（ｂ）配列番号３４０
、３４４、３４５および３４６で与えられた配列に少なくとも５０％、７５％ま
たは９０％の同一性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含
む単離ポリペプチドを含む組成物を投与することを含む。

【００１５】以下に詳述したように、本発明の単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは
、皮膚疾患の治療の治療剤の調製に有用に使用され得る。

【００１６】本発明の上記および追加の特徴は、それらを得る方法と共に、以下のより詳細
な説明を参照することによって最も良く理解されるだろう。本明細書に開示した
全ての文献を、その各々を個々に本明細書の記載の一部とするのと同様に、それ
らの全体を参照して本明細書の記載の一部とする。

【００１７】（発明の詳細な説明）１つの態様において、本発明は、哺乳動物皮膚細胞から単離したポリヌクレオ
チドを提供する。本明細書で使用した「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し
、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子（両方共センスおよびアンチセンス鎖）を含む。この
用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ並びに全または部分合成核酸分
子を包含する。ポリヌクレオチドは、全遺伝子からでも、その一部からなっても
よい。遺伝子は、機能的タンパク質をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ分子で
ある。実施可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチド
の断片を含み得、それ故、「ポリヌクレオチド」の定義は、全ての実施可能なア
ンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチド並びにアンチセンスポリ
ヌクレオチドに関する技術は、当分野で公知であり、例えば、ロビンソン−ベニ
オンら、「アンチセンス技術」、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．２５
４（２３）：３６３−３７５、１９９５；およびカワサキら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ２０（８）：８３６−８４８、１９９６に記載されている。

【００１８】ゲノムＤＮＡおよび非相同種ＤＮＡの同定は、標準的なＤＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッド化技術により、適切なストリンジェントな条件下で、プローブとしてｃＤ
ＮＡ配列の全部または一部を使用して、適切なライブラリをスクリーニングする
ことにより達成できる。別法として、既知のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびタン
パク質配列を基にして設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣ
Ｒ技術を用いて、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列を増幅および同定できる。同定した
配列および変種に対応する合成ＤＮＡを、慣用的な合成法により産生し得る。本
発明により提供される全てのポリヌクレオチドが、単離および精製され、この用
語は当分野では頻繁に使用される。

【００１９】具体的な実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１１
９、１９８−２７４、３４９−３７２および３９９−４０５で与えられた配列、
および配列番号１−１１９、１９８−２７４、３４９−３７２および３９９−４
０５の配列の変種、からなる群から選択されたＤＮＡ配列を含む。該ＤＮＡ配列
の相補体、該ＤＮＡ配列の逆相補体、または該ＤＮＡ配列の逆配列を、該配列の
変種と共に含むポリヌクレオチドも提供される。

【００２０】本明細書で使用した「相補体」、「逆相補体」および「逆配列」なる語の定義
は、以下の例により最も良く説明される。下記の配列

【００２１】

【化１】

【００２２】では、相補体、逆相補体、および逆配列は、以下の通りである：相補体

【００２３】

【化２】

【００２４】逆相補体

【００２５】

【化３】

【００２６】逆配列

【００２７】

【化４】

【００２８】別の態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドによりコード化された、
または部分的にコード化された、単離ポリペプチドを提供する。本明細書で使用
した「ポリペプチド」なる語は、全長タンパク質を含む、任意の鎖長のアミノ酸
を包含し、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結している。本明
細書で使用した「ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチド」なる語
は、本明細書で提供された部分的単離ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドにより
コード化されたポリペプチドを含む。具体的な実施態様において、本発明のポリ
ペプチドは、配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８および
４０６−４０９で与えられた配列、並びに該配列の変種、からなる群から選択さ
れたアミノ酸配列を含む。

【００２９】本発明のポリペプチドは、ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を、発現ベ
クターに挿入し、適切なホストでポリペプチドを発現することにより、組換え産
生され得る。当分野の通常の熟練者には公知の様々な発現ベクターのいずれを使
用してもよい。発現は、組換えポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子を含む発
現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切なホスト細胞で
達成され得る。適切なホスト細胞は、原核細胞、酵母、および高等真核細胞を含
む。好ましくは、使用するホスト細胞は、Ｅ．コリ、昆虫、酵母、またはＣＯＳ
またはＣＨＯなどの哺乳動物細胞系である。このように発現されるＤＮＡ配列は
、天然ポリペプチド、天然ポリペプチドの一部、または他のその変種をコード化
し得る。

【００３０】関連した態様において、配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−
３９８、４０６−４０９およびその変種で与えられた配列からなる群から選択さ
れたアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも機能的部分を含むポリペプ
チドが提供される。本明細書で使用したポリペプチドの「機能的部分」は、ポリ
ペプチドの機能を奏効するに必須な活性部位を含む部分、例えば、１つ以上の反
応物と結合できる分子の部分である。活性部位は、１つ以上のポリペプチド鎖上
に存在する離れた部分からなっていてもよく、一般に高い結合親和性を示す。

【００３１】ポリペプチドの機能的部分は、初めに、ポリペプチドの化学的または酵素的消
化により、またはポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの変異分析によ
り、ポリペプチドの断片を調製し、続いて得られた突然変異ポリペプチドを発現
することにより同定し得る。次いで、ポリペプチド断片または変異ポリペプチド
を、例えば、以下に提供する代表的なアッセイを使用して試験し、どの部分が生
物学的活性を保持するかを決定する。

【００３２】本発明のポリペプチドの部分および他の変種は、合成または組換え手段によっ
ても製造され得る。約１００より少ないアミノ酸を有する、一般には約５０より
少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、当分野の通常の熟練者には公知の
技術を使用して製造され得る。例えば、該ポリペプチドは、アミノ酸を連続的に
伸長アミノ酸鎖に加えるメリフィールド固相合成法などの、商業的に入手できる
固相技術のいずれかを使用して合成され得る。メリフィールド、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３参照。ポリペプチドの自動
合成装置は、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）（フォスターシティー、カリフォル
ニア）などの業者から市販で入手でき、製造業者の指示に従って操作し得る。天
然ポリペプチドの変種は、オリゴヌクレオチド指示部位特異的変異誘発などの、
標準的な変異誘発技術を使用して調製し得る（クンケル・ティー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２、１９８５）。ＤＮ
Ａ配列の区分も、標準的な技術を使用して除去され得、切断短縮ポリペプチドの
調製が可能となる。

【００３３】一般に、本明細書で開示したポリペプチドは、単離形で、実質的に純粋な形で
調製される。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも約８０％純粋であり、よ
り好ましくは約９０％純粋であり、最も好ましくは約９９％純粋である。以下に
詳述する、ある好ましい実施態様において、単離ポリペプチドは、皮膚疾患の治
療に使用するために薬学的製剤組成物またはワクチンに取り込まれる。

【００３４】本明細書で使用した「変種」なる語は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ
酸残基が欠失、置換または付加した、具体的に同定した配列とは異なるヌクレオ
チドまたはアミノ酸配列を包含する。変種は、天然対立変種、または非天然変種
であり得る。変種配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、本発明の配
列に、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好
ましくは少なくとも９０％の同一性を示す。同一％は、下記したように比較する
２つの配列をアラインさせ、アラインした部分の同一残基の数を決定し、その数
を、本発明の（検索）配列の残基の全数で割り、その結果を１００倍することに
より決定する。

【００３５】ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をアラインさせ、特定領域の同一ヌ
クレオチド％を、公共に利用できるコンピューターアルゴリズムを使用して、別
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して決定し得る。ポリヌクレオチド
配列をアラインさせ、その類似性を同定する、２つの例示的なアルゴリズムは、
ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列のアライ
ンメントおよび類似性は、ＢＬＡＳＴＰおよびアルゴリズムを使用して調べ得る
。ＢＬＡＳＴＸおよびＦＡＳＴＸアルゴリズムは、全リーディングフレームで翻
訳されたヌクレオチド検索配列を、ポリペプチド配列に対して比較する。ＢＬＡ
ＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズムは、／ｂｌａｓｔ／実行
（ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅ）／でＮＣＢＩアノニマスＦＴＰサーバー上（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で入手できる。ＦＡＳＴＡおよびＦＡ
ＳＴＸアルゴリズムは、ｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／でインターネット上で入手できる。文書に記載のデフォールト
パラメータに設定し、アルゴリズムで分配した、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを、ポ
リヌクレオチド変種の決定に使用し得る。アルゴリズムで分配したＦＡＳＴＡお
よびＦＡＳＴＸｖ１．０ｘのｒｅａｄｍｅファイルは、アルゴリズムの使用を記
載し、デフォールトパラメータを記載する。ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＸアルゴ
リズムの使用は、ピアスン・ダブリューアールおよびリップマン・デージェイ、
「改善された生物学的配列解析の手段」」、ＰＮＡＳ８５：２４４４−２４４
８、１９８８；およびピアスン・ダブリューアール、「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳ
ＴＡによる迅速で高感度な配列比較」、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８３：６３−９８、１９９０にも記載されている。

【００３６】文書に記載のデフォールトパラメータに設定し、アルゴリズムで分配した、Ｂ
ＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．４［１９９８年２月２４日］が、本
発明に従うポリヌクレオチド変種の決定の使用に好ましい。文書に記載のデフォ
ールトパラメータに設定し、アルゴリズムで分配した、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズ
ムバージョン２．０．４が、本発明に従うポリペプチド変種の決定の使用に好ま
しい。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミ
リーのアルゴリズムの使用は、ＮＣＢＩのウェブサイトのＵＲＬｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ、およびアルツシュール・スティーヴン・エフら、「ギャップを入れた
ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース探索プ
ログラム」、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２
、１９９７に記載されている。

【００３７】以下の作動パラメータが、ポリヌクレオチドのＥ値および同一％を出す、ＢＬ
ＡＳＴＮを使用するアラインメントおよび類似性の決定に好ましい：従ってデフ
ォールトパラメータをもつＵｎｉｘ作動コマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ ‐ｐｂ
ｌａｓｔｎ ‐ｄｅｍｂｌｄｂ‐ｅ１０ ‐Ｇ０‐Ｅ０‐ｒ１‐ｖ
３０‐ｂ３０‐ｉ検索配列（ｑｕｅｒｙｓｅｑ）‐ｏ結果（ｒｅｓｕｌｔ
）；およびパラメータは：‐ｐプログラム名（Program Name）［文字列（Stri
ng）］；‐ｄデータベース（Database）［文字列］；‐ｅ期待値（Expectat
ion value）（Ｅ）［実数（Real）］；‐Ｇギャップを開けるコスト（Cost to
open a gap）（ゼロはデフォールト行動となる）［整数(Integer)］；‐Ｅギ
ャップを伸張するコスト(Cost to extend a gap)（ゼロはデフォールト行動とな
る）［整数］；‐ｒヌクレオチドマッチ獲得(Reward for a nucleotide match
)（ｂｌａｓｔｎのみ (only)）［整数］；‐ｖ一本線の記載数(Number of one
-line descriptions)（Ｖ）［整数］；‐ｂ示されるアラインメントの数(Numb
er of alignment to show)（Ｂ）［整数］；‐ｉ検索ファイル(Query File)［
ファイル読み込み(File In)］；‐ｏＢＬＡＳＴレポート出力ファイル (repor
t Output File)［ファイル読み出し(File Out)］任意選択(Optional)である。以
下の作動パラメータが、ポリペプチドのＥ値および同一％を出すＢＬＡＳＴＰを
使用するアラインメントおよび類似性の決定に好ましい：ｂｌａｓｔａｌｌ ‐
ｐｂｌａｓｔｐ ‐ｄｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ‐ｅ１０ ‐Ｇ１‐Ｅ
１１‐ｒ１‐ｖ３０‐ｂ３０‐ｉ検索配列（ｑｕｅｒｙｓｅｑ）‐ｏ結
果（ｒｅｓｕｌｔ）；及びパラメータは、‐ｐプログラム名［文字列］；‐ｄ
データベース［文字列］；‐ｅ期待値（Ｅ）［実数］；‐Ｇギャップを開
けるコスト（ゼロはデフォールト行動となる）［整数］；‐Ｅギャップを伸張
するコスト（ゼロはデフォールト行動となる）［整数］；‐ｖ一本線の記載数
（ｖ）［整数］；‐ｂ示されるアラインメントの数（ｂ）［整数］；‐Ｉ検
索ファイル［ファイル読み込み］；‐ｏＢＬＡＳＴレポート出力ファイル［フ
ァイル読み出し］任意選択である。

【００３８】ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、または類似のアルゴリズムにより
出される検索配列による１つ以上のデータベース配列に対する「ヒット」は、配
列の類似部分をアラインおよび同定する。ヒットは、類似度および配列重複の長
さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは一般に検索配列の一部分の
長さの配列のみとの重複を示す。

【００３９】ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の類似％は、それぞれデフォールト
パラメータに設定した、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰなどの適切なアルゴリ
ズムを使用して、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列をアラインさせ；ア
ラインした部分の同一核酸またはアミノ酸の数を同定し；同一核酸またはアミノ
酸の数を、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの核酸またはアミノ酸
の全数で割り；次いで、類似％を決定するため１００倍して決定する。例として
、２２０核酸を有する検索ポリヌクレオチドは、５２０核酸を有するＥＭＢＬデ
ータベースのポリヌクレオチド配列に対して、デフォールトパラメータを使用し
たＢＬＡＳＴＮアルゴリズムにより出されたアラインメントの２３ヌクレオチド
の伸展にかけて、ヒットを有する。２３ヌクレオチドヒットは、２１の同一のヌ
クレオチドを含み、１つはギャップであり、１つは異なるヌクレオチドである。
従って、ＥＭＢＬデータベース中のヒットに対する検索ポリヌクレオチドの同一
％は、２１／２２０×１００、すなわち９．５％である。ポリペプチド配列の類
似性も、同じように決定され得る。

【００４０】ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズムはまた、ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドアラインメントに関する「期待」値を算出する。期待値（Ｅ）は
、あるサイズのデータベースを探索する場合に、ある数の連続した配列に偶然に
出会うことが「期待」できるヒットの数を示す。期待値は、データベースに対す
るヒットが真の類似性を示すかどうかを決定するための有意閾値として使用する
。例えば、ポリヌクレオチドヒットに割り当てられたＥ値が０．１ということは
、ＥＭＢＬデータベースのサイズのデータベースでは、類似のスコアを有する配
列のアライン部分上に０．１のマッチを単に偶然に認めることが期待されるとい
う意味と解釈する。この基準により、配列のアラインおよびマッチ部分は、９０
％以上同一である確率を有する。アラインおよびマッチ部分上のＥ値が０．０１
またはそれ以下の配列では、ＥＭＢＬデータベースで偶然にマッチを発見する確
率は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用すると１％またはそれ以下である。ポリ
ペプチド配列のＥ値も、スイスプロットデータベースなどの様々なポリペプチド
データベースを使用して同じように決定し得る。

【００４１】１つの実施態様では、「変種」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発
明の各ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、好ましくは、本発明の各
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同数または少ない核酸またはアミノ酸を
有し、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較した場合、Ｅ値が０
．０１またはそれ以下である配列を含む。すなわち、変種ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、デフォールトパラメータに設定したＢＬＡＳＴＮまたはＢＬ
ＡＳＴＸアルゴリズムを使用して測定するとＥ値が０．０１またはそれ以下を有
し、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも９９％同一であ
る確率を有する、任意の配列である。

【００４２】好ましい実施態様では、変種ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド
と同数または少ない核酸を有する配列であり、デフォールトパラメータに設定し
たＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して測定するとＥ値が０．０１またはそれ以
下を有し、本発明のポリヌクレオチドと少なくとも９９％同一である確率を有す
る配列である。同じように、好ましい実施態様では、変種ポリペプチドは、本発
明のポリペプチドと同数または少ないアミノ酸を有する配列であり、デフォール
トパラメータに設定したＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して測定するとＥ値が
０．０１またはそれ以下を有し、本発明のポリペプチドと少なくとも９９％同一
である確率を有する配列である。

【００４３】変種ポリヌクレオチド配列は、一般に、ストリンジェントな条件下で列挙した
ポリヌクレオチド配列とハイブリッド化する。本明細書で使用した「ストリンジ
ェントな条件」は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液で前洗浄し；６５℃で、６
×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で一晩ハイブリッド化し；その後、３０分間６
５℃で２回各１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、３０分間６５℃で２回各０
．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄することを意味する。

【００４４】特定数値「ｘ」に関して本明細書に使用した「χ−ｍｅｒ」なる語は、配列番
号１−１１９、１９８−２７４、３４９−３７２および３９９−４０５で与えら
れたポリヌクレオチドのいずれかの；または配列番号１２０−１９７、２７５−
３４８、３７３−３９８および４０６−４０９に示されるポリペプチドのいずれ
か、の連続残基の少なくとも特定数（「χ」）をそれぞれ含む、ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを意味する。数値χは、特定の配列に応じて、約２０−約
６００であり得る。

【００４５】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１１９、１９８−２７４、３４９
−３７２および３９９−４０５として同定されるポリヌクレオチドのいずれかの
少なくとも特定数の連続残基（χ−ｍｅｒ）を含むポリヌクレオチド、またはそ
の変種を包含する。本発明のポリペプチドは、配列番号１２０−１９７、２７５
−３４８、３７３−３９８および４０６−４０９として同定されるポリペプチド
のいずれかの少なくとも特定数の連続残基（χ−ｍｅｒ）を含むポリペプチドを
包含する。好ましい実施態様では、数値χは少なくとも２０、より好ましくは少
なくとも４０、さらにより好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは少なくと
も８０である。

【００４６】従って、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１１９、１９８−２７４
、３４９−３７２および３９９−４０５で与えられたポリヌクレオチドの、２０
−ｍｅｒ、４０−ｍｅｒ、６０−ｍｅｒ、８０−ｍｅｒ、１００−ｍｅｒ、１２
０−ｍｅｒ、１５０−ｍｅｒ、１８０−ｍｅｒ、２２０−ｍｅｒ、２５０−ｍｅ
ｒ；または３００−ｍｅｒ、４００−ｍｅｒ、５００−ｍｅｒまたは６００−ｍ
ｅｒを含むポリヌクレオチド、または配列番号１−１１９、１９８−２７４、３
４９−３７２および３９９−４０５で与えられたポリヌクレオチドの１つの変種
を含む。本発明のポリペプチドは、配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、
３７３−３９８および４０６−４０９で与えられたポリペプチドの、２０−ｍｅ
ｒ、４０−ｍｅｒ、６０−ｍｅｒ、８０−ｍｅｒ、１００−ｍｅｒ、１２０−ｍ
ｅｒ、１５０−ｍｅｒ、１８０−ｍｅｒ、２２０−ｍｅｒ、２５０−ｍｅｒ；ま
たは３００−ｍｅｒ、４００−ｍｅｒ、５００−ｍｅｒまたは６００−ｍｅｒを
含むポリペプチド、または配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−
３９８および４０６−４０９で与えられたポリヌクレオチドの１つの変種を含む
。

【００４７】本発明のポリヌクレオチドは、実施例１に下記したように、哺乳動物皮膚細胞
から調製したｃＤＮＡライブラリの高処理量シークエンスにより単離し得る。別
法として、配列番号１−１１９、１９８−２７４、３４９−３７２および３９９
−４０５で与えられた配列を基にしたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、ハ
イブリッド形成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、哺乳動物皮
膚細胞由来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリのいずれかの陽性クローン
を同定するために使用できる。プローブは、本明細書で与えられた配列よりも短
くてもよいが、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、最も好ましく
は少なくとも約２０のヌクレオチド長とする。該オリゴヌクレオチドプローブと
共に使用するに適切なハイブリッド形成およびＰＣＲ技術は、当分野で公知であ
る（例えば、ムリスら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１：２６３、１９８７；エーリッヒ編、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ストックトンプレス：ニューヨーク、１９８９；（サムブル
ック・ジェイ、フリッチェ・イーエフおよびマニアティス・ティー編、分子クロ
ーニング：実験マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリープレス、コールド・スプリング・ハーバー：ニューヨーク、１９８９参照
）。陽性クローンは、制限酵素消化、ＤＮＡシークエンスまたはその他により分
析し得る。

【００４８】さらに、本発明のＤＮＡ配列は、当分野で公知の技術を使用して合成手段によ
り製造し得る。オリゴヌクレオチドの自動合成装置は、パーキンエルマー／アプ
ライドバイオシステムズ部門（フォスターシティー、カリフォルニア）などの業
者から市販で入手でき、製造業者の指示に従って操作し得る。

【００４９】本発明のポリヌクレオチド配列は、皮膚由来であるので、皮膚の成長および発
達、および、組織損傷および炎症並びに疾病状態に対する皮膚の応答に重要な役
割を果たすタンパク質をコード化しているようである。いくつかのポリヌクレオ
チドは、シグナル配列、または、タンパク質産物を分泌分子または受容体として
同定するトランスメンブランドメインをコード化する配列を含む。該タンパク質
産物は、増殖因子、サイトカインまたはその同族受容体であるようである。いく
つかのポリペプチド配列が、既知の生物学的に重要なタンパク質に対して２５％
以上の類似性を有し、従って、類似の生物学的機能を有するタンパク質を提示す
るようである。

【００５０】特に、本発明のポリペプチドは、毛成長の誘導；皮膚幹細胞の特定の細胞型へ
の分化；細胞遊走；細胞増殖および細胞間相互作用などのプロセスに重要な役割
を果たす。該ポリペプチドは、組織完全性の維持に重要であり、従って、創傷治
癒などのプロセスに重要である。いくつかの開示されたポリペプチドは、免疫応
答の修飾因子として作用し、特に免疫細胞は、皮膚細胞の増殖および分化を引き
起こす組織傷害中に皮膚に浸潤することが知られているからである。さらに、多
くのポリペプチドが免疫学的に活性であり、皮膚内だけでなく生体の他の組織の
全範囲の疾病状態の重要な治療標的となっている。本発明のポリペプチドに対す
る抗体および本発明のポリペプチドに関連した小分子阻害剤も、免疫応答の修飾
および本発明に記載の疾病の治療に使用してよい。

【００５１】１つの態様において、本発明は、患者の疾患を治療するために、１つ以上の本
発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。本明細
書で使用した「患者」なる語は、任意の恒温動物、好ましくはヒトを意味する。

【００５２】この態様において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、一般に、医薬組
成物またはワクチン内に存在する。薬学的製剤組成物は、１つ以上のポリペプチ
ドを含み得、その各々は、１つ以上の上記配列（またはその変種）、および生理
学的に許容される担体を含み得る。ワクチンは、１つ以上の上記ポリペプチド、
並びにアジュバントなどの非特異的免疫応答増幅因子、またはポリペプチドを取
り込むリポソームを含み得る。

【００５３】別法として、本発明のワクチンまたは薬学的製剤組成物は、ポリペプチドがインサイツ (in situ)で産生されるように、上記の１つ以上のポリペプチドをコー
ド化しているＤＮＡを含み得る。該ワクチンおよび薬学的製剤組成物において、
ＤＮＡは、核酸発現系、並びに細菌およびウイルス発現系を含む、当分野の通常
の熟練者には公知の様々な送達系のいずれか内に存在し得る。適切な核酸発現系
は、患者内での発現に必要なＤＮＡ配列を含む（例えば、適切なプロモーターお
よび終結因子シグナル）。細菌送達系は、その細胞表面上でポリペプチドの免疫
原性部分を発現する細菌（例えば、バシラス−カルメット−ゲラン）の投与を含
む。

【００５４】好ましい実施態様において、ＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニア
または他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用
して導入し得、これは、非病原性、または欠陥複製コンピテントウイルスの使用
を含み得る。該発現系へのＤＮＡの取り込み技術は、当分野で公知である。ＤＮ
Ａは、例えば、ウルマーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９、１
９９３に記載され、コーエン、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１６９１−１６９２、
１９９３により論評されたように、「裸」でもあり得る。裸ＤＮＡの取り込みは
、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡをコーティングすること
により増加し得る。

【００５５】投与経路および頻度、並びに投与量は、個体に応じて変化する。一般に、薬学
的製剤組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮
下）、鼻腔内（例えば、吸引）または経口投与し得る。一般に、１投与量に存在
する（または１投与量のＤＮＡによりインサイツで産生される）ポリペプチドの
量は、ホスト１ｋｇあたり約１ｐｇから約１００ｍｇ、典型的にはホスト１ｋｇ
あたり約１０ｐｇから約１ｍｇ、好ましくはホスト１ｋｇあたり約１００ｐｇか
ら約１μｇの範囲である。適切な投与量サイズは、患者のサイズにより変化する
が、典型的には約０．１ｍｌから約５ｍｌの範囲である。

【００５６】当分野の通常の熟練者には公知の任意の適切な担体を本発明の薬学的製剤組成
物に使用してもよいが、担体の型は、投与形態に応じて変化する。皮下注射など
の非経口投与では、担体は、好ましくは、水、食塩水、アルコール、脂質、ワッ
クス、または緩衝液を含む。経口投与では、任意の上記担体または固体担体、例
えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッ
カリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸
マグネシウム、を使用し得る。生物分解可能なマイクロスフェア（例えば、ポリ
ラクチックガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃｇａｌａｃｔｉｄｅ））を本発
明の薬学的製剤組成物の担体として使用し得る。適切な生物分解可能なマイクロ
スフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１
０９号に開示されている。

【００５７】様々なアジュバントのいずれかを、本発明由来のワクチンに使用して、非特異
的に免疫応答を増強し得る。ほとんどのアジュバントには、水酸化アルミニウム
または鉱物油などの、抗原を急速な異化から保護するように設計された物質、お
よび脂質Ａ、百日咳菌、Ｍ．ツベルクローシスなどの、非特異的免疫応答刺激物
質が含まれる。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバント
およびフロイント完全アジュバント（ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン）およびメルクアジュバント６５（メルク・アンド・カンパニー社、ロ
ーウェー、ニュージャーシー）などのように市販で入手できる。他の適切なアジ
ュバントは、アルミニウム、生物分解可能なマイクロスフェア、モノホスホリル
脂質Ａおよびクイル（Ｑｕｉｌ）Ａを含む。

【００５８】本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子疾患の同定における、組織のマーカ
ーとして、染色体マーカーまたはタグとして、および、シンテニ（パロアルト、
カリフォルニア）から入手できるマイクロアレイ技術などの当分野で公知の技術
を使用した発現パターンの調査のためのオリゴヌクレオチドの設計に使用し得る
。本明細書で開示した部分的ポリヌクレオチド配列を使用して、本発明の配列を
基にしたハイブリッド形成プローブまたはＰＣＲプライマーを使用したＤＮＡ発
現ライブラリのスクリーニングなどにより、全長遺伝子が得られ得る。

【００５９】本発明により提供されるポリペプチドは、さらに、生物学的活性の決定のアッ
セイに、抗体をもたらすことに、対応するリガンドまたは受容体の単離に、タン
パク質または同族の対応リガンドまたは受容体のレベルの定量的決定のアッセイ
に、抗炎症剤として、並びに、皮膚、結合組織および／または神経組織増殖また
は再生のための組成物に使用し得る。

【００６０】実施例１皮膚細胞発現ライブラリからのｃＤＮＡ配列の単離本発明のｃＤＮＡ配列は、表１に示した特殊齧歯類またはヒト皮膚細胞から作
成したｃＤＮＡ発現ライブラリの高処理量シークエンスにより得られた。

【００６１】

【表１】

【００６２】これらのｃＤＮＡライブラリは、以下のように調製した。皮膚乳頭（ＤＥＰＡ）由来ｃＤＮＡライブラリラット鼻毛（頬髭）の皮膚乳頭細胞を培養液中で増殖させ、全ＲＮＡを、確立
されたプロトコルを使用してこれらの細胞から抽出した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｂ
ＲＬライフテクノロジーズ、ゲーサーズバーク、メリーランド）を使用して単離
した全ＲＮＡを用いて、製造業者の説明書に従って、ポリ（Ａ）クイックｍＲＮ
Ａ単離キット（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）を使用してｍＲ
ＮＡを得た。次いで、ｃＤＮＡ発現ライブラリを、λＺＡＰｃＤＮＡライブラリ
合成キット（ストラタジーン）を使用して逆転写酵素合成によりｍＲＮＡから調
製した。

【００６３】ケラチノサイト（ＳＫＴＣ）由来ｃＤＮＡライブラリヒト新生児包皮から得られたケラチノサイト（ミトラ・アールおよびニコロフ
・ビー、ケラチノサイト法のハンドブック、ｐ．１７−２４、１９９４）を、血
清非含有ＫＳＦＭ（ＢＲＬライフテクノロジーズ）中で増殖させ、分化細胞（１
０^８細胞）と共に収集した。ウシ胎児血清を最終濃度１０％で培養培地に添加す
ることによりケラチノサイトを分化させ、細胞を４８時間後に収集した。全ＲＮ
Ａを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＢＲＬライフテクノロジーズ）を使用して２つの細胞
群から単離し、ポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡ単離キット（ストラタジーン）を用
いてｍＲＮＡを得るために使用した。分化ケラチノサイトで発現されたｃＤＮＡ
を、ＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラクションキット（クロンテック、パロア
ルト、カリフォルニア）の使用により濃縮する。簡潔には、ｍＲＮＡは、未分化
ケラチノサイト（「ドライバーｍＲＮＡ」）または分化ケラチノサイト（「テス
ターｍＲＮＡ」）いずれかから得て、ｃＤＮＡの合成に使用した。２つの群のｃ
ＤＮＡをＲｓａＩで別々に消化して、より短い平滑末端分子を得た。ｃＤＮＡ末
端で異なるアダプターを連結することにより２つのテスター群をつくり、２回の
連続的なハイブリッド形成を、過剰のドライバーｃＤＮＡを用いて実施した。ア
ダプターにより、異なって発現されている配列のみのＰＣＲ増幅が可能となり、
次いでこれをＴテイルｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ハドジェブ・エヌおよびベルコ
ウィッツ・ジーエー、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０：２０−２２、１９
９６）に連結すると、挿入断片をもつベクターを含む細胞の青／白選択が可能と
なる。白色細胞を単離し、シークエンス用のプラスミドＤＮＡを得るために使用
した。

【００６４】ヒト新生児繊維芽細胞（ＨＮＦＦ）由来ｃＤＮＡライブラリヒト新生児包皮の外植体由来のヒト新生児繊維芽細胞を、培養液中で増殖させ
、全ＲＮＡを、確立されたプロトコルを使用してこれらの細胞から抽出した。Ｔ
ＲＩｚｏｌ試薬（ＢＲＬライフテクノロジーズ、ゲーサーズバーク、メリーラン
ド）を使用して単離した全ＲＮＡを用いて、製造業者の説明書に従って、ポリ（
Ａ）クイックｍＲＮＡ単離キット（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニ
ア）を使用してｍＲＮＡを得た。次いで、ｃＤＮＡ発現ライブラリを、λＺＡＰ
ｃＤＮＡライブラリ合成キット（ストラタジーン）を使用した逆転写酵素合成に
よりｍＲＮＡから調製した。

【００６５】マウス胚皮膚（ＭＥＭＳ）由来ｃＤＮＡライブラリ胚皮膚を、コイタム（coitum）後１３日目のＢａｌｂ／ｃマウスから顕微解剖
した。胚皮膚を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、ｍＲＮＡを、クイックプレップミ
クロｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア、スウェーデン）を使用して組織から直
接単離した。次いで、ｍＲＮＡを使用して、ＤＥＰＡライブラリで記載したよう
に、ｃＤＮＡライブラリを調製した。

【００６６】マウス幹細胞（ＫＳＣＬ）および一過性増殖（ＴＲＡＭ）細胞由来ｃＤＮＡライブラリパータム（partum）後１−２日目の新生児Ｂａｌｂ／ｃマウスから得た皮を洗
浄し、トリプシン（ＢＲＬライフテクノロジーズ）中でインキュベートし、皮膚
から表皮を分離した。表皮組織を破壊して細胞を分散させ、次いで、増殖培地中
に再度懸濁し、製造業者のプロトコル（ファルマシア、スウェーデン）に従って
、パーコール密度勾配で遠心分離した。ペレット化細胞を、ローダミン１２３（
バートンセロ・アイ、ホジソン・ジーエスおよびブラッドリー・ティーアール、ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ．１３：９９９−１００６、１９８５）を使用して標識
し、フローサイトメトリー（エピクス・エリート・コールター・サイトメトリー
、ハイアリーア、フロリダ）により分析した。次いで、ローダミン標識ネズミケ
ラチノサイトの単細胞懸濁液を、交差反応性抗ラットＣＤ２９ビオチンモノクロ
ーナル抗体（ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア；クローンＨａ２
／５）で標識した。細胞を洗浄し、抗マウスＣＤ４５フィコエリトリンコンジュ
ゲートモノクローナル抗体（ファーミンゲン；クローン３０Ｆ１１．１、１０u
ｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、次いで、ストレプトアビジンスペクトラル
レッド（サザンバイオテクノロジー、バーミンガム、アラバマ）で標識した。

【００６７】選別ゲートを、リストモードデータを使用して定義し、４つの群を同定した：Ｃ
Ｄ２９明ローダミン暗ＣＤ４５陰性細胞；ＣＤ２９明ローダミン明ＣＤ４５陰性
細胞；ＣＤ２９暗ローダミン明ＣＤ４５陰性細胞；およびＣＤ２９暗ローダミン
暗ＣＤ４５陰性細胞。細胞を、−８０℃で貯蔵する前に、選別し、ペレット化し
、スナップ凍結させた。このプロトコルを数回実施して、十分な細胞数の各調製
物を得て、ｃＤＮＡライブラリを調製した。

【００６８】皮膚幹細胞および一過性増殖細胞は、ＣＤ２９、インテグリンβ１鎖を発現する
ことが知られている。白血球特異的抗原のＣＤ４５は、皮膚幹細胞および一過性
増殖細胞の単離に排除される細胞のマーカーとして使用した。ケラチノサイト幹
細胞は、一過性増殖細胞よりも効率的にローダミンダイを排出する。ＣＤ２９明
、ローダミン暗、ＣＤ４５陰性群（推定ケラチノサイト幹細胞；ＫＳＣＬと呼ぶ
）、およびＣＤ２９明、ローダミン明、ＣＤ４５陰性群（ケラチノサイト一過性
増殖細胞；ＴＲＡＭと呼ぶ）を選別し、ｍＲＮＡを、クイックプレップミクロｍ
ＲＮＡ精製キット（ファルマシア、スウェーデン）を使用して各細胞群から直接
単離した。次いで、ｍＲＮＡを使用して、ＤＥＰＡライブラリで上記したように
、ｃＤＮＡライブラリを調製した。

【００６９】ｃＤＮＡ配列を、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ部門プリズ
ム３７７シークエンサーを使用して、上記のｃＤＮＡライブラリの高処理量シー
クエンスにより得た。

【００７０】実施例２単離ｃＤＮＡ配列の特徴づけ単離ｃＤＮＡ配列を、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡおよび／または
ＢＬＡＳＴＮを使用して、ＥＭＢＬＤＮＡデータベーズの配列と比較した。対
応する推定タンパク質配列（６つのリーディングフレームの各々でタンパク質に
翻訳されたＤＮＡ）を、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸおよび／または
ＢＬＡＳＴＰを使用して、スイスプロットデータベースの配列と比較した。

【００７１】ＥＭＢＬＤＮＡデータベースの配列との、配列番号１−１１９で与えられたＤ
ＮＡ配列の比較（ＦＡＳＴＡを使用）、並びに、スイスプロットデータベースの
配列との、配列番号１２０−１９７で与えられたアミノ酸配列の比較（ＦＡＳＴ
Ｘを使用）を、１９９８年３月２１日のように実施した。

【００７２】ＥＭＢＬＤＮＡデータベースの配列との、配列番号１９８−２７４で与えられ
たＤＮＡ配列の比較（ＢＬＡＳＴＮを使用）、並びに、スイスプロットデータベ
ースの配列との、配列番号２７５−３４８で与えられたアミノ酸配列の比較（Ｂ
ＬＡＳＴＰを使用）を、１９９８年１０月７日のように実施した。ＥＭＢＬＤ
ＮＡデータベースの配列との、配列番号３４９−３７２で与えられたＤＮＡ配列
の比較（ＢＬＡＳＴＮを使用）、並びに、スイスプロットデータベースの配列と
の、配列番号３７３−３９８で与えられたアミノ酸配列の比較（ＢＬＡＳＴＰを
使用）を、１９９９年１月２３日のように実施した。

【００７３】単離ｃＤＮＡ配列およびその対応する推定タンパク質配列を、分泌分子を同定
するシグナル配列の存在についてコンピューター解析した。配列内の推定開始部
位にシグナル配列を有する単離ｃＤＮＡ配列は、配列番号１−４４、１９８−２
３８、３４９−３５８、および３９９に提供する。

【００７４】配列番号１−６、１９８−１９９、３４９−３５２、３５４、および３５６−３
５８のｃＤＮＡ配列は、上記したように、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴ
ＡまたはＢＬＡＳＴＮを使用して、ＥＭＢＬデータベースの配列に対して、７５
％以下の同一性（上記のように決定）を有すると決定された。配列番号１２０−
１２５、２７５−２７６、３７３−３８０、および３８２の推定アミノ酸配列は
、上記のように、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸまたはＢＬＡＳＴＰを
使用して、スイスプロットデータベースの配列に対して、７５％以下の同一性（
上記のように決定）を有すると決定された。

【００７５】いくつかの単離部分ｃＤＮＡ配列のさらなるシークエンスにより、配列番号７
−１４、２００−２３１および３７２で与えられた全長ｃＤＮＡ配列が単離され
た。対応する推定アミノ酸配列は、配列番号１２６−１３３、２７７−３０８、
および３９６にそれぞれ提供される。

【００７６】上記したように、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＮを
使用して、全長ｃＤＮＡ配列とＥＭＢＬデータベースの配列の比較により、既知
配列に対する７５％より少ない同一性（上記のように決定）が判明した。上記し
たように、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＸまたはＢＬＡＳＴＰを使用し
て、配列番号１２６−１３３および２７７−３０８で与えられた推定アミノ酸配
列とスイスプロットデータベースの配列の比較により、既知配列に対する７５％
より少ない同一性（上記のように決定）が判明した。

【００７７】コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡデータベースを使用した、配列番号１
５−２３のｃＤＮＡ配列に対応する推定アミノ酸配列とＥＭＢＬの配列の比較に
より、既知配列に対する７５％より少ない同一性（上記のように決定）が示され
た。これらの推定アミノ酸配列は、配列番号１３４−１４２で与えられた。

【００７８】いくつかの単離部分ｃＤＮＡ配列のさらなるシークエンスにより、配列番号２
４−４４および２３２−２３８で与えられた全長ｃＤＮＡ配列が単離された。対
応する推定アミノ酸配列は、配列番号１４３−１６３および３０９−３１５にそ
れぞれ提供される。これらのアミノ酸配列は、コンピューターアルゴリズムＦＡ
ＳＴＸを使用して、スイスプロットデータベースの既知の配列に対して、７５％
より少ない同一性（上記のように決定）を有すると決定された。

【００７９】既知の発現配列タグ（ＥＳＴ）に対してまたは公共データベースの他のＤＮＡ
配列に対して７５％より少ない同一性を有し、またはその対応する推定タンパク
質配列が既知のタンパク質配列に対して７５％より少ない同一性を示す、単離ｃ
ＤＮＡ配列を、推定膜結合分子をコードしているトランスメンブランドメインの
存在についてコンピューター解析した。

【００８０】配列内に１つ以上のトランスメンブランドメイン（群）を有する単離ｃＤＮＡ配
列は、配列番号４５−６３、２３９−２５３、３５９−３６４、４００−４０２
で与えられた。配列番号４５−４８、２３９−２４９、３５９−３６１、および
３６３のｃＤＮＡ配列は、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＮコンピューターアルゴ
リズムを使用して、ＥＭＢＬデータベースの配列に対して、７５％より少ない同
一性（上記のように決定）を有することが判明した。

【００８１】配列番号１６４−１６７、３１６−３２６、３８３、３８５−３８８および４０
７−４０８で与えられたその推定アミノ酸配列は、ＦＡＳＴＸまたはＢＬＡＳＴ
Ｐデータベースを使用して、スイスプロットデータベースの配列に対して、７５
％より少ない同一性（上記のように決定）を有することが判明した。

【００８２】配列番号４９−６３および２５０−２５３のｃＤＮＡ配列に対応する推定アミ
ノ酸配列と、スイスプロットデータベースの配列の比較により、既知配列に対す
る７５％より少ない同一性（上記のように決定）が示された。これらの推定アミ
ノ酸配列は、配列番号１６８−１８２および３２７−３３０で与えられた。

【００８３】治療および／または診断に有用であると報告された分子をコードしている配列
に対してスクリーニングする自動探索プログラムを使用して、実施例１に上記の
ように単離したｃＤＮＡ配列のいくつかが、既知タンパク質ファミリーのファミ
リーメンバーであると思われる推定タンパク質配列をコード化していると決定さ
れた。ファミリーメンバーは、ここで、既知のタンパク質またはタンパク質ファ
ミリーのメンバーに対して、翻訳ポリペプチドにおいて少なくとも２５％の同一
性を有すると定義される。これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号６４−７６、２５
４−２６４、３６５−３６９および４０３に提供され、対応する推定アミノ酸配
列は、配列番号１８３−１９５、３３１−３４１、３８９−３９３および４０９
にそれぞれ提供される。

【００８４】配列番号６４−６８、２５４−２６４、および３６５−３６９のｃＤＮＡ配列は
、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＮコンピューターアルゴリズムを使用して、ＥＭ
ＢＬデータベースの配列に対して、７５％より少ない同一性（上記のように決定
）を示す。同じように、配列番号１８３−１９５、３３１−３４１、および３８
９−３９３のアミノ酸配列は、スイスプロットデータベースの配列に７５％より
少ない同一性を示す。

【００８５】既知タンパク質への類似性を基にした、配列番号６４−７６、２５４−２６４
、３６５−３６９、および４０３のＤＮＡ配列によりコード化される各タンパク
質のあり得る有用性は、下記に提供する。

【００８６】

【表２】

【００８７】

【表３】

【００８８】従って、これらの単離配列は、いくつかの細胞型の増殖、分化および活性化に
影響を及ぼすタンパク質をコード化する。それらは、皮膚創傷、癌、増殖および
発達欠陥、並びに炎症疾病の治療および診断の薬剤として有用に開発され得る。

【００８９】配列番号７７−１１７、２６５−２６７、および４０４−４０５のポリヌクレ
オチド配列は、ケラチノサイト幹細胞（ＫＳＣＬ）または一過性増殖細胞（ＴＲＡＭ）のいずれかで、これらの配列が上記の２つのライブラリのうちの１つで
もっぱら出現する回数に基づき、異なって発現され；１つでは９回より多く、他
方では０回である（アウディック・エスおよびクラブリー・ジェイ−エム、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ、７：９８６−９９５、１９９７）。

【００９０】配列番号７７−８９、２６５−２６７および３６５−３６９の配列は、上記のよ
うに、コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＮを使用して、
ＥＭＢＬおよびスイスプロットデータベースの配列に対して、７５％より少ない
同一性を有すると決定された。これらのポリヌクレオチド配列によりコード化さ
れるタンパク質は、これらの細胞型の同定および単離のマーカーとしての有用性
を有し、これらのタンパク質に対する抗体は、細胞の複雑な混合物からのこれら
の細胞の単離および濃縮に有用に使用され得る。幹細胞群に独占的な単離ポリヌ
クレオチドおよびその対応するタンパク質は、皮膚細胞の増殖および分化の調節
に、または皮膚幹細胞に特異的治療分子を輸送する遺伝子標的化に変化を引き起
こす薬物標的として使用できる。

【００９１】実施例３ｍｕＴＲ１のヒト相同体の単離および特徴づけ実施例１に上記したように得られた、ｍｕＴＲ１（配列番号６８）のヒト相同
体は、５０，０００ｐｆｕのオリゴｄＴ開始ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリの
スクリーニングにより単離された。プラーク拾い上げ、ハイブリッド形成、およ
びスクリーニングは、標準的な分子生物学技術を使用して実施した（サムブルッ
ク・ジェイ、フリッチェ・イーエフおよびマニアティス・ティー編、分子クロー
ニング：実験マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リープレス、コールド・スプリング・ハーバー：ニューヨーク、１９８９）。単
離ヒト相同体（ｈｕＴＲ１）の決定ｃＤＮＡ配列は、配列番号１１８に提供され
、対応するアミノ酸配列は、配列番号１９６で与えられた。ライブラリは、配列
番号１１８内のコード領域の１−４５９ヌクレオチドに対応する［α^３２Ｐ］−
ｄＣＴＰ標識二本鎖ｃＤＮＡプローブを使用してスクリーニングした。

【００９２】ｈｕＴＲ１のポリペプチド配列は、トランスフォーミング増殖因子αに類似し
た領域を有し、これは、このタンパク質が、表皮増殖因子（ＥＧＦ）のように機
能することを示唆する。このＥＧＦ様タンパク質は、ケラチノサイト増殖および
運動性を刺激し、上皮由来癌細胞の増殖を抑制するように作用する。この新規な
遺伝子およびそのコード化タンパク質は、従って、創傷の治癒剤および上皮由来
癌の制御因子として使用し得る。

【００９３】ノーザンブロットによるＲＮＡ転写物の解析ｈｕＴＲ１のｍＲＮＡのサイズおよび分布を決定するノーザン分析を、ヒト組
織ｍＲＮＡブロット（クロンテック）を、［α^３２Ｐ］−ｄＣＴＰで放射活性標
識した、配列番号１１８のヌクレオチド９３−６７３を含むプローブでプローブ
することにより実施した。プレハイブリッド形成、ハイブリッド形成、洗浄およ
びプローブ標識を、サムブルックら、同じ箇所に記載の通りに実施した。ｈｕＴ
Ｒ１のｍＲＮＡのサイズは、３．５−４ｋｂであり、心臓および胎盤で最も豊富
であることが観察され、脾臓、胸腺前立腺、および卵巣で低いレベルの発現が
観察された（図１）。

【００９４】心臓および胎盤でのｈｕＴＲ１のｍＲＮＡの量が高いことは、血管の形成また
は維持におけるｈｕＴＲ１の役割を示す。なぜなら、心臓および胎盤は、生体の
他の組織に比べて血管の量が多く、よって内皮細胞が多いからである。これは、
次に、腫瘍の血管形成および血管新生におけるｈｕＴＲ１の役割を実証する。こ
れは、トランスフォーミング増殖因子αおよびＥＧＦの、血管の新規発達誘導能
（シュライバーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：１２５０−１２５３、１９８６）
、および内皮細胞のＤＮＡ合成刺激能（シュライバーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３
２：１２５０−１２５３、１９８６）、および様々なヒト腫瘍でのその過剰発現
により支持される。

【００９５】ｍｕＴＲ１およびｈｕＴＲ１の精製ｍｕＴＲ１のアミノ酸５３−１０３（配列番号３４２）をコード化しているｍ
ｕＴＲ１のポリヌクレオチド１７７−３２９（配列番号２６８）、並びに、ｈｕ
ＴＲ１のアミノ酸５４−１０４（配列番号３４３）をコード化しているｈｕＴＲ
１のポリヌクレオチド２０８−３６０（配列番号２６９）を、細菌リーダー配列
およびＮ末端６×ヒスチジンタグを含む、細菌発現ベクターｐＰｒｏＥＸＨＴ
（ＢＲＬライフテクノロジーズ）にクローン化した。これらの作成物を、サムブ
ルックら、同じ箇所に記載のように、コンピテントＸＬ１−ＢｌｕｅＥ．コリに
形質転換した。

【００９６】これらの組換えＸＬ１−ＢｌｕｅＥ．コリの開始培養物を、３７℃で、１００
μｇ／ｍｌアンピシリンを含むテリフィックブロスで一晩増殖させた。この培養
物を遠心沈降させ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むテリフィックブロス５
００ｍｌ培養物の接種に使用した。培養物を、細胞のＯＤ_５９５が０．４ないし
０．８になるまで増殖させ、この時にＩＰＴＧを１ｍＭまで加えた。細胞を一晩
誘導し、細菌を遠心分離により収集した。

【００９７】ｍｕＴＲ１のポリペプチド（配列番号３４２；ｍｕＴＲ１ａと呼ぶ）およびｈ
ｕＴＲ１のポリペプチド（配列番号３４３；ｈｕＴＲ１ａと呼ぶ）の両方が、不
溶性封入体で発現された。ポリペプチドｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａを精製
するために、細菌細胞ペレットを、溶解緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８
．０、１０ｍＭβメルカプトエタノール、１ｍＭＰＭＳＦ）に再度懸濁した。
溶解した細胞に、１％ＮＰ４０を加え、混合物を１０分間氷上でインキュベート
した。溶解液を、さらに氷上で９５Ｗで４×１５秒間音波処理することにより破
壊し、次いで、１５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、封入体をペレット化
した。

【００９８】得られたペレットを、０．５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液中に再度懸
濁し、氷上で５−１０秒間音波処理した。この混合物を氷上で１時間貯蔵し、１
４，０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、
０．５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液中にさらに一度再度懸濁し、音波処
理し、遠心分離し、上清を前のように除去した。ペレットを、可溶化緩衝液（６
ＭグアニジンＨＣｌ、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０
）に再度懸濁し、９５Ｗで４×１５秒間音波処理し、次いで、２０分間、１４，
０００ｒｐｍで４℃で遠心分離して、破片を除去する。上清を使用するまで４℃
にて貯蔵した。

【００９９】ポリペプチドｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａは、ニッケルキレートセファロ
ースカラム（アマシャムファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を使用して製
造業者の推奨プロトコルに従って、細菌リーダー配列内に含まれるＮ末端６×ヒ
スチジンタグの効能により精製した。一旦精製したタンパク質を再度折り畳むた
めに、タンパク質溶液を、４℃で１時間かけて、５×その容量のリフォールディ
ング緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１．２５ｍＭ還元グルタチオン、０．２５ｍＭ
酸化グルタチオン、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に加えた。リフォー
ルディング緩衝液をこの期間中に迅速に撹拌し、４℃で一晩撹拌し続けた。次い
で、再度折り畳まれたタンパク質を標準的なプロトコルを使用して限外濾過によ
り濃縮した。

【０１００】ポリペプチドｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａの生物学的活性ｍｕＴＲ１およびｈｕＴＲ１は、ＥＧＦ、ＴＧＦα、エピレグリンおよびその
他を含む、ＥＧＦファミリーの新規なメンバーである。これらの増殖因子は、Ｅ
ＧＦ受容体のリガンドとして作用することが知られている。ＥＧＦ受容体活性化
の経路は十分に文書化されている。ＥＧＦ受容体へのリガンドの結合時に、ＭＡ
Ｐキナーゼとして知られるタンパク質のリン酸化を含む、諸現象のカスケードが
起こる。従って、ＭＡＰキナーゼのリン酸化を、ＥＧＦ受容体活性化のマーカー
として使用できる。２ＭＡＰキナーゼタンパク質のリン酸化形−ＥＲＫ１および
ＥＲＫ２を認識するモノクローナル抗体が存在する。

【０１０１】ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａの精製ポリペプチドがＥＧＦ受容体のリガン
ドとして作用するかを調べるために、ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１由来の細胞（ア
メリカンタイプカルチャーコレクション、ＣＲＬ−１５５５、マナッサス、バー
ジニア）を、６穴プレートに接種し、血清を２４時間不足させ、次いで、精製ｍ
ｕＴＲ１ａまたはｈｕＴＲ１ａで５分間血清非含有条件で刺激した。陽性対照と
して、細胞を、同じように、１０−１００ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−αまたはＥＧＦで
刺激した。陰性対照として、細胞を、様々な量のＬＰＳを含むＰＢＳで刺激した
。細胞を直ちに溶解し、溶解液のタンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイ
により概算した。各サンプル由来の１５μｇのタンパク質を、１２％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルに充填した。次いで、タンパク質を、標準的な技術を使用して、ＰＶ
ＤＦ膜に転写した。

【０１０２】ウエスタンブロットのために、膜を、遮断緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．６、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％脱脂乳）中
で１時間室温でインキュベートした。ウサギ抗活性ＭＡＰキナーゼｐＡｂ（プロ
メガ、マジソン、ウィスコンシン）を、遮断緩衝液中５０ｎｇ／ｍｌまで加え、
一晩４℃でインキュベートした。膜を、室温で１時間、遮断緩衝液中１：３５０
０希釈で、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体と共にインキュベートする前に、脱脂乳
を除いた遮断緩衝液中で３０分間洗浄した。膜を、３０分間、脱脂乳を除いた遮
断緩衝液中で洗浄し、次いで、５分間、脱脂乳を除いた遮断緩衝液および０．１
％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１回洗浄した。次いで、膜を、２分間ＥＣＬ試薬に曝露
し、次いで５−３０分間オートラジオグラフィーにかけた。

【０１０３】図２に示すように、ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａの両方が、バックグラウ
ンドレベル以上に、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化を誘導することが判明し
、これは、ｍｕＴＲ１およびｈｕＴＲ１が、ＭＡＰキナーゼシグナル経路を活性
化する細胞表面受容体、おそらくＥＧＦ受容体のリガンドとして作用することを
示唆する。図１１に示すように、ｈｕＴＲ１ａもまた、陰性対照と比較して、培
養液中でＣＶ１／ＥＢＮＡ腎臓上皮細胞のＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化を
誘導することが実証された。これらのアッセイは、上記の通りに実施した。これ
は、ｈｕＴＲ１ａが、ＨｅＬａおよびＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞において、ＭＡＰキ
ナーゼシグナル経路を活性化する細胞表面受容体、おそらくＥＧＦ受容体のリガ
ンドとして作用することを示唆する。

【０１０４】ｍｕＴＲ１ａの、新生児包皮（ＮＦ）ケラチノサイト増殖刺激能は、以下のよ
うに決定した。手術廃棄物由来のＮＦケラチノサイトを、ウシ下垂体抽出物（Ｂ
ＰＥ）および表皮増殖因子（ＥＧＦ）で補充したＫＳＦＭ（ＢＲＬライフテクノ
ロジーズ）中で培養した。アッセイは、０．１ｍｌ非補充ＫＳＦＭ中、９６穴平
底プレートで実施した。ＭｕＴＲ１ａ、ヒトトランスフォーミング増殖因子α（
ｈｕＴＧＦα）またはＰＢＳ−ＢＳＡを、プレートに滴定し、１×１０^３ＮＦケ
ラチノサイトを各穴に加えた。プレートを、５日間、５％ＣＯ_２の雰囲気下、３
７℃でインキュベートした。細胞増殖の程度は、以前に記載のＭＴＴダイ還元に
より決定した（Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．９３：１５７−１６５、１９８６）。図
３に示すように、ｍｕＴＲ１ａおよび陽性対照ヒトＴＧＦαの両方が、ＮＦケラ
チノサイトの増殖を刺激し、一方、陰性対照のＰＢＳ−ＢＳＡは刺激しなかった
。

【０１０５】ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａの、形質転換ヒトケラチノサイト細胞系Ｈａ
ＣａＴの増殖を刺激する能力は、以下のように決定した。アッセイを、０．２％
ＦＣＳを補充した０．１ｍｌＤＭＥＭ（ＢＲＬライフテクノロジーズ）中、９６
穴平底プレート中で実施した。ＭｕＴＲ１ａ、ｈｕＴＲ１ａおよびＰＢＳ−ＢＳ
Ａをプレートに滴定し、１×１０^３ＨａＣａＴ細胞を各穴に加えた。プレートを
、５日間、１０％ＣＯ_２を含む雰囲気下、３７℃でインキュベートした。細胞増
殖の程度は、以前に記載のＭＴＴダイ還元により決定した（Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．９３：１５７−１６５、１９８６）。図４に示すように、ｍｕＴＲ１ａおよ
びｈｕＴＲ１ａの両方が、ＨａＣａＴ細胞の増殖を刺激し、一方、陰性対照ＰＢ
Ｓ−ＢＳＡは刺激しなかった。

【０１０６】ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａの、Ａ４３１細胞の増殖を抑制する能力は、
以下のように決定した。ポリペプチドｍｕＴＲ１ａ（配列番号３４２）およびｈ
ｕＴＲ１ａ（配列番号３４３）およびＰＢＳ−ＢＳＡを、以前に記載のように滴
定し（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３：１−４、１９８２）、細胞死を、以前に
記載のようにＭＴＴダイ還元を使用して決定した（Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．９３
：１５７−１６５、１９８６）。ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａの両方が、Ａ
４３１細胞の増殖を抑制することが判明し、一方、陰性対照ＰＢＳ−ＢＳＡは抑
制しなかった（図５）。

【０１０７】これらの結果は、ｍｕＴＲ１およびｈｕＴＲ１は、ケラチノサイト増殖および
運動性を刺激し、上皮由来癌細胞の増殖を抑制し、腫瘍の血管形成および血管新
生に役割を果たすことを示す。従って、この新規な遺伝子およびそのコード化タ
ンパク質は、創傷治癒、血管形成および上皮由来癌の制御因子の薬剤として開発
され得る。

【０１０８】ｈｕＴＲ１およびｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションＨｅＬａ細胞（ヒト頸部腺癌）を、１０ｃｍ皿に、１×１０^６細胞／皿の濃度
で接種した。一晩インキュベートした後、培地を取り除き、１００ｎｇ／ｍｌの
ｍｕＴＲ１、ｈｕＴＲ１、ｈｕＴＧＦα、または陰性対照としてＰＢＳを含む培
地と交換した。１８時間後、培地を取り除き、２ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブ
コＢＲＬライフテクノロジーズ、ゲーサーズバーク、メリーランド）に細胞を溶
解した。全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って単離した。ｃＤＮＡサンプル由来
のｈｕＴＲ１のｍＲＮＡレベルを同定するために、１μｌのｃＤＮＡを、標準的
なＰＣＲ反応に使用した。３０サイクル回転した後、５μｌの各ＰＣＲ反応物を
取り出し、１．５％アガロースゲルで分離した。バンドは臭化エチジウム染色に
より可視化した。図１２から分かるように、マウスおよびヒトのＴＲ１の両方が
、ＰＢＳの陰性対照で刺激した細胞と比較して、ｈｕＴＲ１のｍＲＮＡレベルを
アップレギュレートする。さらに、ＴＧＦαはまた、ｈｕＴＲ１のｍＲＮＡレベ
ルもアップレギュレートできる。

【０１０９】これらの結果は、ＴＲ１は、それ自体のｍＲＮＡ発現および続くタンパク質発
現を維持でき、従って、高レベルのサイトカイン発現が疾病の病理に関与してい
る乾癬などの疾病の進行に寄与できることが期待される。さらに、ＴＧＦαは、
ｈｕＴＲ１の発現をアップレギュレートできるので、ＴＲ１ｍＲＮＡのアップレ
ギュレーションは、ＴＧＦαの作用形態に重要であり得る。

【０１１０】血清応答エレメントリポーター遺伝子アッセイ血清応答エレメント（ＳＲＥ）は、増殖による多くの細胞の最初期遺伝子の調
節に必要なプロモーターエレメントである。研究により、ＳＲＥの活性は、ＭＡ
Ｐキナーゼシグナル経路により調節できることが実証された。ＳＶ４０プロモー
ターの上流に８つのＳＲＥおよびルシフェラーゼリポーター遺伝子を含む、ＰＣ
１２（ラットクロム親和細胞腫−神経腫瘍）およびＨａＣａＴ（ヒト形質転換ケ
ラチノサイト）の２つの細胞系を、インハウスで発達させた。９６穴プレートの
１穴あたり５×１０^３細胞を分取し、それぞれの培地中で２４時間増殖させた。

【０１１１】ＨａＣａＴＳＲＥ細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン（シグマ、セントルイス、
ミズーリ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬライフテクノロジーズ）、０
．７７ｍＭＬ−アスパラギン（シグマ）、０．２ｍＭアルギニン（シグマ）、
１６０ｍＭペニシリンＧ（シグマ）、７０ｍＭジヒドロストレプトマイシン（ロ
ッシェモレキュラーバイオケミカルズ、バーゼル、スイス）、および０．５ｍｇ
／ｍｌジェネテシン（ＢＲＬライフテクノロジーズ）を補充したＤ−ＭＥＭの５
％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で増殖させた。ＰＣ１２ＳＲＥ細胞を、０．４ｍｇ
／ｍｌジェネテシン（ＢＲＬライフテクノロジーズ）を補充したＨａｍＦ１２培
地の５％ウシ胎児血清中で増殖させた。次いで、培地を、０．１％ＦＢＳに換え
て、さらに２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、１μｇ／ｍｌからの
ＴＲ１の滴定で刺激した。１回量の１００ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因
子（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ）または１０ｎｇ／ｍｌの表皮
増殖因子（ＢＲＬライフテクノロジーズ）を、陽性対照として使用した。細胞を
、ｍｕＴＲ１または陽性対照の存在下で６時間インキュベートし、２回ＰＢＳ中
で洗浄し、４０μｌの溶解緩衝液（プロメガ）で溶解した。１０μｌを、９６穴
プレートに移し、１０μｌのルシフェラーゼ基質（プロメガ）を、ビクター^２蛍
光光度計（ワラック）による各穴への直接注入により加え、プレートを振とうし
、各穴の発光を３×１秒間隔で読む。ＳＲＥの誘導倍数を、以下の式に従って計
算した：ＳＲＥの誘導倍数＝アゴニストの平均相対発光／陰性対照の平均相対発
光。

【０１１２】図１３に示すように、ｍｕＴＲ１は、ＰＣ−１２（図１３ａ）およびＨａＣａ
Ｔ（図１３ｂ）細胞の両方でＳＲＥを活性化する。これは、ＨａＣａＴおよびＰ
Ｃ−１２細胞は、ｍｕＴＲ１タンパク質に応答でき、応答を顕現できることを示
す。ＨａＣａＴ細胞の場合、これは増殖応答である。ＰＣ−１２細胞の場合、こ
れは、増殖、増殖抑制、分化、または移動応答であり得る。従って、ＴＲ１は、
神経細胞の発達、または特定の神経サブセットへのその分化に重要であり得る。
ＴＲ１はまた、神経腫瘍の発達および進行にも重要であり得る。

【０１１３】ＥＧＦ受容体アッセイによる抑制ＨａＣａＴ増殖アッセイは、以下のように修飾を行う以外は、以前に記載のよ
うに実施した。ＥＧＦおよびＴＲ１を培地に同時に加え、抗ＥＧＦ受容体（ＥＧ
ＦＲ）抗体（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）または陰性対照抗体のマウ
スＩｇＧ（ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）を、６２．５ｎｇ
／ｍｌの濃度で加えた。

【０１１４】図１４で分かるように、ＥＧＦＲの機能を遮断する抗体は、ＴＲ１のＨａＣａ
Ｔ細胞に対する分裂促進性を抑制する。これは、ＥＧＦＲは、ＨａＣａＴ細胞に
対するＴＲ１の分裂促進シグナルの伝達に重要であることを示す。ＴＲ１は直接
ＥＧＦ受容体に結合し得る。ＴＲ１はまた、ＥＧＦＲとヘテロダイマーを形成で
きるＥＧＦＲファミリーの任意の他のメンバー、ＥｒｂＢ−２、−３および／ま
たは−４に結合し得る。

【０１１５】ｈｕＴＲ１のスプライス変種ｈｕＴＲ１βの配列ｈｕＴＲ１の変種を、同プロトコルに従って、ｈｕＴＲ１（配列番号１１８）
と同じライブラリから単離した。この配列は、ｈｕＴＲ１のスプライス変種であ
り、アミノ酸８７−１３７を含まないｈｕＴＲ１のＯＲＦからなる。これは、Ｅ
ＧＦモチーフの３番目のシステイン残基およびトランスメンブランドメインを欠
失させる効果を有する。しかし、システイン残基１４７（ｈｕＴＲ１ＯＲＦナ
ンバリング）は、欠失システインを置換し得、従って、ジスルフィド架橋は影響
を受けないようである。それ故、ｈｕＴＲ１βは、ｈｕＴＲ１の分泌形である。
それは、ｈｕＴＲ１、またはＥＧＦおよびＴＧＦαを含む他のＥＧＦファミリー
メンバーに対して、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能する。ｈｕＴＲ
１βと呼ばれる、ＴＲ１のスプライス変種の決定ヌクレオチド配列は、配列番号
３７１に示し、対応する推定アミノ酸配列は配列番号３９５である。

【０１１６】実施例４ＤＰ３の同定、単離および特徴づけＤＰ３と呼ばれる、部分ｃＤＮＡ断片が、標準的な細胞生物学技術により単離
された、培養ラット真皮乳頭および足蹠繊維芽細胞由来のｍＲＮＡを使用して、
ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（リアング・ピーおよびパーディ
・エービー、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６７−９７１、１９９２から修飾）に
より同定された。この二本鎖ｃＤＮＡを、［α^３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識し、４
００，０００ｐｆｕのオリゴｄＴ開始ラット真皮乳頭ｃＤＮＡライブラリのスク
リーニングによる全長ＤＰ３クローンの同定に使用した。ＤＰ３の決定された全
長ｃＤＮＡ配列は配列番号１１９に提供し、対応するアミノ酸配列は配列番号１
９７に提供する。プラーク拾い上げ、ハイブリッド形成、およびスクリーニング
は、標準的な分子生物学技術を使用して実施した。

【０１１７】実施例５ｍｕＫＳ１のヒト相同体の単離および特徴づけノーザンブロットによるＲＮＡ転写物の解析ｍｕＫＳ１（配列番号２６３）のｍＲＮＡのサイズおよび分布を決定するノー
ザン分析を、ネズミ組織ｍＲＮＡブロットを、［α^３２Ｐ］−ｄＣＴＰで放射活
性標識した、ｍｕＫＳ１のヌクレオチド２６８−４９９からなるプローブでプロ
ーブすることにより実施した。プレハイブリッド形成、ハイブリッド形成、洗浄
およびプローブ標識を、サムブルックら、上記に記載の通りに実施した。ｍｕＫ
Ｓ１のｍＲＮＡのサイズは１．６ｋｂであり、脳、肺、筋肉、および心臓で最も
豊富であることが観察された。発現はまた、下腸、皮膚および腎臓でも検出でき
た。精巣、脾臓、肝臓、胸腺、胃では検出可能なシグナルは全く認められなかっ
た。

【０１１８】ｍｕＫＳ１のヒト相同体ＭｕＫＳ１（配列番号２６３）を使用してＥＭＢＬデータベース（リリース５
０、１９９８年６月にアップデート）を探索し、ヒトＥＳＴ相同体を同定した。
上位３つの相同体は、以下のＥＳＴであった：受託番号ＡＡ６４３９５２、ＨＳ
１３０１００３およびＡＡ８６５６４３。これらは、２８５ヌクレオチドに９２
．６３％、２８３ヌクレオチドに９３．６４％、並びに２８５ヌクレオチドに９
４．０３５％の同一性をそれぞれ示した。翻訳時にフレームシフトがＡＡ６４３
９５２およびＨＳ１３０１００３に同定された。全３つのＥＳＴの組合せにより
、ｈｕＫＳ１（配列番号２７０）および翻訳ポリペプチド配列番号３４４が同定
された。ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１ポリペプチドのアラインメントは、９６ア
ミノ酸に９５％の同一性を示した。

【０１１９】ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１の細菌発現および精製ポリペプチドｍｕＫＳ１のアミノ酸２３−９９（配列番号３４５）をコードし
ている、ｍｕＫＳ１のポリヌクレオチド２６９−５０２（配列番号２７１）、お
よびｈｕＫＳ１のアミノ酸１９−９５（配列番号３４６）をコードしている、ｈ
ｕＫＳ１のポリヌクレオチド５５−２８８（配列番号２７２）を、細菌リーダー
配列およびＮ末端６×ヒスチジンタグを含む、細菌発現ベクターｐＥＴ−１６ｂ
（ノバゲン、マジソン、ウィスコンシン）にクローン化した。これらの作成物を
、サムブルックら、上記に記載のように、コンピテントＸＬ１−ＢｌｕｅＥ．コリに形質転換した。

【０１２０】配列番号２７１（ｍｕＫＳ１ａ）および配列番号２７２（ｈｕＫＳ１ａ）を含
む、組換えＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．コリ（ノバゲン）の開始培養物を、１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリン（ギブコ−ＢＲＬライフテクノロジーズ）を含むＮＺＹブ
ロス中、３７℃で増殖させた。培養物を遠心沈降させ、８００ｍｌＮＺＹブロス
および１００μｇ／ｍｌアンピシリンの接種に使用した。培養物を、細胞のＯＤ _５９５が０．４ないし０．８になるまで増殖させた。細菌発現は、１ｍＭＩＰ
ＴＧで３時間誘導した。細菌発現により、ｍｕＫＳ１ａおよびｈｕＫＳ１ａの約
１５ｋＤａの誘導バンドが生じた。

【０１２１】ＭｕＫＳ１ａおよびｈｕＫＳ１ａは、不溶性封入体で発現した。ポリペプチド
を精製するために、細菌細胞ペレットを、溶解緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ
ｐＨ８．０、１０ｍＭβメルカプトエタノール、１ｍＭＰＭＳＦ）に再度懸濁
した。溶解した細胞に、１％ＮＰ−４０を加え、混合物を１０分間氷上でインキ
ュベートした。溶解液を、さらに氷上で９５Ｗで４×１５秒間超音波処理するこ
とにより破壊し、次いで、１０分間１８，０００ｒｐｍで遠心分離し、封入体を
ペレット化した。

【０１２２】封入体を含むペレットを、０．５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液中に再
度懸濁し、５−１０秒間超音波処理した。この混合物を氷上で１時間貯蔵し、１
４０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、０
．５％ｗ／ｖＣＨＡＰＳを含む溶解緩衝液中にさらに一度再度懸濁し、超音波処
理し、遠心分離し、上清を前のように除去した。ペレットを、可溶化緩衝液（６
ＭグアニジンＨＣｌ、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．
０）に再度懸濁し、９５Ｗで４×１５秒間超音波処理し、次いで、１０分間１８
０００ｒｐｍで４℃で遠心分離して、破片を除去する。上清を４℃に貯蔵した。
ＭｕＫＳ１ａおよびｈｕＫＳ１ａは、ニッケルキレートセファロースカラム（ア
マシャムファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を使用して製造業者のプロト
コルに従って、細菌リーダー配列内に含まれるＮ末端６×ヒスチジンタグにより
精製した。タンパク質をカラムで２回精製して、エンドトキシン混入を減少させ
た。一旦精製したタンパク質を再度折り畳むために、タンパク質溶液を、４℃で
一晩、２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５＋１０％グリセロール中４Ｍ−２Ｍ
の尿素勾配で透析した。次いで、タンパク質を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７
．５＋１０％グリセロール２リットルに対して２回透析した。

【０１２３】ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１のペプチドシークエンス細菌発現ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１を、ポリアクリルアミドゲル上で分離し
、１５ｋＤａの誘導バンドを同定した。ｍｕＫＳ１の推定サイズは９．４ｋＤａ
である。１５ｋＤａバンドのアミノ酸配列を得るために、２０μｇの組換えｍｕ
ＫＳ１およびｈｕＳＫ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、イモビロンＰＶＤ
Ｆ膜（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ）にエレクトロブロットし
た。内部アミノ酸シークエンスを、ニュージーランドのオークランド大学のタン
パク質シークエンス部門により、ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１のトリプシンペプ
チドで実施した。

【０１２４】ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１の推定アミノ酸配列は、配列番号３９７および３
９８にそれぞれ示す。これらのアミノ酸配列により、決定した配列は、ｃＤＮＡ
配列から推定された配列と同一であることが確認された。サイズ矛盾は、以前に
他のケモカインで報告された（リッチモンド・エー、バレンチエン・イー、トー
マス・エイチジー、フラッグズ・ジー、バートン・デーイー、シュピース・ジェ
イ、ボルドニ・アール、フランケ・ユー、デリンク・アール、「βトロンボグロ
ブリンに構造的に関連した増殖因子である、黒色腫増殖刺激活性の分子特徴づけ
および染色体マッピング」、ＥＭＢＯＪ．７：２０２５−２０３３、１９８８
；リヤオ・エフ、ラビン・アールエル、ヤネリ・ジェイアール、コニアリス・エ
ルジー、バングリ・ピー、ファーバー・ジェイエム、「ヒトＮｉｇケモカイン：
生化学的および機能的特徴づけ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３０１−１
３１４、１９９５）。これらのタンパク質の等電点電気泳動点は、ＤＮＡＳＩＳ
（日立ソフトウェアエンジニアリング、サンフランシスコ、カリフォルニア）を
使用して１０．２６であると推定された。

【０１２５】酸化的バーストアッセイ酸化的バーストアッセイを使用して、応答する細胞型を決定した。１×１０^７ＰＢＭＣ細胞を、５ｍｌのＨＢＳＳ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．５％ＢＳＡに
再度懸濁し、３０分間３７℃で、５μｌの５ｍＭジクロロ−ジヒドロフルオレセ
インジアセテート（Ｈ_２ＤＣＦＤＡ、モレキュラープローブズ、ユージーン、オ
レゴン）と共にインキュベートした。２×１０^５のＨ_２ＤＣＦＤＡ標識細胞を、
平底９６穴プレートの各穴に添加した。各アゴニスト１０μｌを、平底プレート
の穴に同時に加えて、最終濃度を１００ｎｇ／ｍｌとした（ｆＭＬＰを１０μＭ
で使用した）。次いで、プレートを、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３５
ｎｍで、ビクター^２１４２０マルチラベルカウンター（ワラック、トゥルク、フ
ィンランド）により解読した。相対蛍光は、５分間間隔で６０分間測定した。

【０１２６】対照処置細胞（ＴＲ１）および１００ｎｇ／ｍｌのｍｕＫＳ１で処置した細胞
の間に２．５倍の差異をもつ顕著な呼吸性バーストがＰＢＭＣで同定された（図
８）。ヒト間質由来因子−１α（ＳＤＦ１α）（１００ｎｇ／ｍｌ）および１０
μＭホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）を陽性対照として使用した
。

【０１２７】走化性アッセイｍｕＫＳ１に応答した細胞移動を、製造業者のプロトコルに記載のように、４
８穴ボイデンチャンバー（ニューロプローブ社、キャビン・ジョン、メリーラン
ド）を使用して試験した。簡潔には、アゴニストを、ＨＢＳＳ、２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ、０．５％ＢＳＡで希釈し、走化性チャンバーの底の穴に加える。ＴＨＰ
−１細胞を同緩衝液に３×１０^５細胞／５０μｌで再度懸濁した。上端および底
の穴は、単球では５μｍの孔サイズまたはリンパ球では３μｍの孔サイズを有す
るＰＶＰ非含有ポリカーボネートフィルターにより分離した。細胞を上端の穴に
加え、チャンバーを、３７℃の５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中、単球では２
時間、リンパ球では４時間インキュベートした。インキュベート後、フィルター
を固定し、細胞を上表面から廃棄した。次いで、フィルターを、ディフ−クイッ
ク（ダデ・インターナショナル社、マイアミ、フロリダ）で染色し、移動細胞数
を、５つの無作為に選択した高電場で計測した。結果は、移動係数として表現し
た（試験移動細胞数を、対照移動細胞数で割る）。

【０１２８】このアッセイを使用して、ｍｕＫＳ１を、Ｔ細胞およびＴＨＰ−１細胞に対し
て試験した。ＭｕＫＳ１は、０．０１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌで、ＴＨ
Ｐ−１細胞に対して滴定可能な走化性作用を誘導した（図９）。ヒトＳＤＦ１α
は、陽性対照として使用し、等価な移動を与えた。ＭｕＫＳ１はまたＩＬ−２活
性化細胞に対しても試験した。しかし、高濃度のｍｕＫＳ１でも移動の証拠はな
く、一方、ＳＤＦ−１αは、明らかな滴定可能な走化性刺激を与えた。それ故、
ｍｕＫＳ１は、ＴＨＰ−１細胞には走化性であるが、試験した濃度ではＩＬ−２
活性化Ｔ細胞には走化性ではないようであった。

【０１２９】ｍｕＫＳ１クローンの全長配列ｍｕＫＳ１のヌクレオチド配列は、追加のＥＳＴの塩基配列を決定することに
より伸長した。全てのＥＳＴの組合せにより、全長ｍｕＫＳ１（配列番号３７０
）および配列番号３９４の対応する翻訳ポリペプチド配列が同定された。

【０１３０】ノーザンブロットによるヒトＲＮＡ転写物の解析ｍｕＫＳ１のヒト相同体のｍＲＮＡのサイズおよび分布を決定するノーザンブ
ロット解析を、ヒト組織ブロット（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア
）を、ｈｕＫＳ１（配列番号２７０）のヌクレオチド１−２８８からなる放射活
性標識プローブでプローブすることにより実施した。プレハイブリッド形成、ハ
イブリッド形成、洗浄およびプローブ標識を、サムブルックら、上記に記載の通
りに実施した。ｈｕＫＳ１のｍＲＮＡのサイズは、１．６ｋｂであり、腎臓、肝
臓、結腸、小腸、および脾臓で最も豊富であることが観察された。発現は、膵臓
、骨格筋、胎盤、脳、心臓、前立腺、および胸腺でも検出できた。肺、卵巣、お
よび精巣では検出可能なシグナルは全く認められなかった。

【０１３１】ノーザンブロットによる腫瘍組織でのヒトＲＮＡ転写物の解析癌組織のｈｕＫＳ１の分布を決定するノーザンブロット解析を、腫瘍パネルブ
ロット（インビトロゲン、カールズバッド、カリフォルニア）をプローブするこ
とにより以前に記載のように実施した。これらのブロットは、正常ないし腫瘍組
織の直接的な比較を行う。ＭＲＮＡが正常な子宮および頸部組織で観察されたが
、それぞれの腫瘍組織では観察されなかった。これに対し、発現は、乳房腫瘍で
アップレギュレートされたが、正常な乳房組織ではダウンレギュレートしていた
。卵巣または卵巣腫瘍のいずれにも検出可能なシグナルは全く認められなかった
。

【０１３２】細菌発現ｍｕＫＳ１αのヌードマウスへの注射２匹のヌードマウスに、リン酸緩衝食塩水で１／１０希釈したハイプノーン（
ジャンセン・ファーマソイティカルズ、バッキンガムシャー州、英国）７５μｌ
を腹腔内麻酔した。２０μｇの細菌発現ｍｕＫＳ１ａ（配列番号３４５）を、左
後足、耳、および背中の左手側に皮下注射した。同量のリン酸緩衝食塩水を、同
部位に、しかし同動物の右手側に注射した。マウスを１８時間放置し、次いで炎
症について調べた。両方のマウスの、細菌発現タンパク質を注射した耳および足
部位に赤い腫脹が示された。どちらの背中側にも明らかな炎症は同定できなかっ
た。マウスを抜粋し、生検を、耳、背中および足部位からとり、３．７％ホルマ
リン食塩水に固定した。生検を包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシ
ンで染色した。ｍｕＫＳ１ａを注射した部位は、多形核顆粒球が顕著に増加し、
一方、リン酸緩衝食塩水を注射した部位は、多形核顆粒球の浸潤物バックグラウ
ンドが低かった。

【０１３３】細菌組換えｍｕＫＳ１のＣ３Ｈ／ＨｅＪへの注射１８匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを３グループに分け、ｍｕＫＳ１、ＧＶ１４Ｂ
、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内注射した。ＧＶ１４Ｂは、陰性対
照として使用した細菌発現組換えタンパク質である。グループ１のマウスには、
１ｍｌＰＢＳ中５０μｇのｍｕＫＳ１を注射し；グループ２のマウスには、１ｍ
ｌＰＢＳ中５０μｇのＧＶ１４Ｂを注射し；グループ３のマウスには、１ｍｌＰ
ＢＳを注射した。１８時間後、マウスの腹腔の細胞を、収集溶液（ＰＢＳ中０．
０２％ＥＤＴＡ）４ｍｌの洗浄液で２回腹腔内洗浄して単離した。生細胞を、各
グループの個々のマウスから計測した。５０μｇのｍｕＫＳ１を注射したマウス
は、平均して細胞数が３倍増加していた（図１０）。

【０１３４】２０μｇの細菌組換えｍｕＫＳ１を、３匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの左後足に
皮下注射した。同量のＰＢＳを、同動物の右手側の同部位に注射した。１８時間
後、マウスを炎症について調べた。全マウスが、細菌組換えＫＳ１を注射した足
蹠に赤い腫脹を示した。組織像から、ｍｕＫＳ１を注射した部位は、単核および
多形核細胞が存在する、混合した表現型の炎症応答を有した。

【０１３５】ケモカインは、広範囲の機能をもつ、高度に塩基性の分泌タンパク質の大きな
スーパーファミリーである（バギオリニら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６７５−７０５、１９９７；ワードら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、９：１−１
１、１９９８；ホラック、Ｎａｔｕｒｅ、３９３：５２４−５２５、１９９８）
。ｍｕＫＳ１およびｈｕＫＳ１のポリペプチド配列は、ＣＸＣケモカインに類似
性を示し、これは、このタンパク質が他のＣＸＣケモカインと同じように作用す
ることを示唆する。ヌードマウスのインビボデータはこの仮説を支持する。それ
故、このケモカイン様タンパク質は、白血球、上皮、間質、および神経細胞移動
を刺激し；血管形成および血管発達を促進し；神経パターン、造血幹細胞移動、
ケラチノサイトおよび上皮幹細胞パターンおよび発達、白血球の活性化および増
殖を促進し；創傷治癒事象の移動を促進すると期待され得る。

【０１３６】近年、ケモカインに対する受容体は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の共受容体
として作用することが示され（ケルンら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、４
：５６３−５６８、１９９８）、高い循環レベルのケモカインは、ＨＩＶウイル
スに曝露した患者に免疫度を与えることができる（ザグリーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３８５７−３８６１、１９９８）こと
が示された。従って、この新規な遺伝子およびそのコードタンパク質は、上皮、
リンパ球、骨髄、間質および神経細胞移動および癌の制御因子として；癌、神経
変性疾患、乾癬、喘息およびクローン病などの炎症自己免疫疾患の治療の、創傷
治癒の使用の薬剤として；および白血球のＨＩＶ−１結合および感染を予防する
薬剤として有用に使用され得る。

【０１３７】我々はまた、ｍｕＫＳ１は、ｍｕＫＳ１を注射したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹
腔の細胞数の定量化可能な増加を促進できることを示した。さらに、我々は、ｍ
ｕＫＳ１は、ヒト末梢血単核細胞の酸化的バーストおよびヒト単球白血病細胞系
ＴＨＰ−１の移動を誘導できることを示し、これは、単球／マクロファージは、
ＫＳ１に対する応答細胞型の１つであることを示唆する。これに加えて、我々は
、ｈｕＫＳ１は、結腸および小腸などの多くの非リンパ組織並びに乳房腫瘍で高
レベルで発現されることを実証した。正常子宮および頸部組織でも発現されてい
たが、そのそれぞれの腫瘍では完全にダウンレギュレートされていた。

【０１３８】近年、非ＥＬＲケモカインは血管静止特性を実証することが示された。２つの非
ＥＬＲケモカインである、ＩＰ−１０およびＭｉｇは、腫瘍の退行中にアップレ
ギュレートすることが以前に示され（タネンバウム・シーエス、タブズ・アール
、アームストロング・デー、フィンケ・ジェイエイチ、ブコウィスキ・アールエ
ム、ハミルトン・ティーエー、「ＣＸＣケモカインＩＰ−１０およびＭｉｇは、
マウスＲＥＮＣＡ腫瘍のＩＬ−１２媒介退行に必要である」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：９２７−９３２、１９９８）、発現レベルは、腫瘍サイズに反比例
する（カネガン・シー、スガダリ・シー、カネガン・エイチ、テルヤ−フェルド
スティン・ジェイ、ヤオ・オー、グプタ・ジー、ファーバー・ジェイエム、リヤ
オ・エフ、リュー・エル、トサト・ジー、「ＩＬ−１２の抗腫瘍効果に対する、
ＣＸＣケモカインＩＰ−１０およびＭｉｇの寄与」、Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ．６４：３８４−３９２、１９９８）。さらに、ＩＰ−１０およびＭｉｇに対す
る中和抗体は抗腫瘍効果を減少させ、これは、これらの分子が抗腫瘍効果に対し
て行う寄与を示す。それ故、頸部および子宮腫瘍の場合、ＫＳ１は類似の特性を
有することが期待される。

【０１３９】データは、ＫＳ１が、細胞移動に関与することを実証し、応答性細胞型の１つ
は単球／マクロファージであることを示す。インビトロおよびインビボ生物学と
合わせてヒト発現データにより、この分子は、細胞移動の有用な制御因子であり
得、および、クローン病、潰瘍性大腸炎、および関節リウマチなどの炎症疾病；
および頸部腺癌、子宮平滑筋腫、および乳房浸潤管癌などの癌の治療の薬剤とな
り得ることが実証される。

【０１４０】実施例６ＫＳ２の特徴づけＫＳ２は、トランスメンブランドメインを含み、膜結合リガンドまたは受容体
として機能し得る。ノーザン分析により、ＫＳ２のｍＲＮＡが、マウスケラチノ
サイト細胞系Ｐａｍ２１２に発現され、これは、マウスケラチノサイトで同定さ
れたｃＤＮＡと一致することが示された。

【０１４１】哺乳動物発現ＫＳ２を発現するために、細胞外ドメインを、Ｃ末端６×ヒスチジンタグを有
する免疫グロブリンＧ（Ｆｃ）の定常ドメインのアミノ末端に融合させた。これ
は、ポリペプチドＫＳのアミノ酸１−２１５（配列番号３４７）をコード化して
いる、ＫＳ２のポリヌクレオチド２０−６６４（配列番号２７３）を、哺乳動物
発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、エヌブイリーク、オランダ）
に、Ｃ末端６×ヒスチジンタグを有する免疫グロブリンＧ（Ｆｃ）の定常ドメイ
ンのアミノ末端に、クローニングすることにより実施した。これらの作成物を、
サムブルックら、同じ箇所に記載のように、コンピテントＸＬ１−ＢｌｕｅＥ．コリに形質転換した。ＫＳ２ａのＦｃ融合作成物は、ＤＥＡＥデキストランを使
用して、５×Ｔ１７５フラスコ中のＣｏｓ−１細胞を１８０μｇのＫＳ１ａでト
ランスフェクトすることにより発現された。上清を７日後に収集し、Ｎｉ−ＮＴ
Ａカラムに通過させた。結合したＫＳ２ａはカラムから溶出し、ＰＢＳに対して
透析した。

【０１４２】ＫＳ２ａのＦｃ融合ポリペプチドの、コンカナバリンＡ刺激ネズミ脾細胞のＩ
Ｌ−２誘導増殖を抑制する能力は、以下のように決定した。単細胞懸濁液を、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から調製し、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン
酸ナトリウム、０．７７ｍＭＬ−アスパラギン、０．２ｍＭＬ−アルガニン
、１６０ｍＭペニシリンＧ、７０ｍＭジヒドロストレプトマイシンスルフェート
、５×１０^−２ｍＭβメルカプトエタノールおよび５％ＦＣＳ（ｃＤＭＥＭ）を
補充したＤＭＥＭ（ギブコ−ＢＲＬ）に洗浄した。脾細胞（４×１０^−６／ｍｌ
）を、１０％ＣＯ_２中、３７℃で、２４時間、２ｕｇ／ｍｌコンカナバリンＡで
刺激した。細胞を、培養物から収集し、ｃＤＭＥＭ中で３回洗浄し、１０ｎｇ／
ｍｌのｒｈｕＩＬ−２を補充したｃＤＭＥＭ中で１×１０^５細胞／ｍｌで再度懸
濁した。アッセイは、０．２ｍｌｃＤＭＥＭ中、９６穴丸底プレートで実施した
。ＫＳ２ａ、ＰＢＳ、ＬＰＳおよびＢＳＡのＦｃ融合ポリペプチドをプレートに
滴定し、１×１０^４活性化Ｔ細胞（０．１ｍｌ）を各穴に加えた。プレートを、
２日間、１０％ＣＯ_２を含む雰囲気下、３７℃でインキュベートした。増殖の程
度は、細胞に、０．２５ｕＣｉ／ｍｌのトリチウム化チミジンを、培養の最終４
時間中に適用することにより決定し、その後、細胞をガラス繊維フィルターマッ
トに収集し、チミジン取り込み度を、標準的な液体シンチレーション技術により
決定した。図６に示すように、ＫＳ２ａのＦｕ融合ポリペプチドは、コンカナバ
リンＡ刺激ネズミ脾細胞のＩＬ−２誘導増殖を抑制したが、陰性対照ＰＢＳ、Ｂ
ＳＡおよびＬＰＳは抑制しないことが判明した。

【０１４３】このデータにより、ＫＳ２は、皮膚ケラチノサイトで発現され、サイトカイン
誘導脾細胞の増殖を抑制することが実証される。これにより、皮膚炎症および悪
性腫瘍の調節におけるＫＳ２の役割が示唆される。

【０１４４】実施例７ＫＳ３の特徴づけＫＳ３は、４０アミノ酸（配列番号１２９）のポリペプチドをコード化する。
ＫＳ３は、１７アミノ酸（配列番号３４８；ＫＳ３ａと呼ぶ）の成熟ポリペプチ
ドを生じる、２３アミノ酸のシグナル配列を含む。

【０１４５】ＫＳ３ａは、合成で調製され（キロンテクノロジー、ビクトリア、オーストラ
リア）、ラット腸上皮細胞ＩＥＣ−１８細胞のトランスフェリン誘導増殖を増強
することが観察された。アッセイは、０．２％ＦＣＳを補充した０．１ｍｌＤＭ
ＥＭ（ギブコ−ＢＲＬライフテクノロジーズ）中、９６穴平底プレートで実施し
た。ＫＳ３ａ（配列番号３４８）、アポ−トランスフェリン、培地およびＰＢＳ
−ＢＳＡは、単独で、７５０ｎｇ／ｍｌアポ−トランスフェリンと共に、または
７５０ｎｇ／ｍｌＢＳＡと共に、のいずれかをプレートに滴定し、１×１０^３Ｉ
ＥＣ−１８細胞を各穴に加えた。プレートを、５日間３７℃で１０％ＣＯ_２を含
む雰囲気下でインキュベートした。細胞増殖の程度は、前に記載のようにＭＴＴ
ダイ還元により決定した（Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．９３：１５７−１６５、１９
８６）。図７に示すように、ＫＳ３ａとアポ−トラスフェリンは、ＩＥＣ−１８
細胞のトランスフェリン誘導増殖を増強するが、一方、ＫＳ３ａ単独またはＰＢ
Ｓ−ＢＳＡは増強しないことが判明し、これは、ＫＳ３ａおよびアポ−トランス
フェリンは相乗的に作用して、ＩＥＣ−１８細胞の増殖を誘導することを示唆す
る。

【０１４６】このデータにより、ＫＳ３は、上皮由来であり、腸の上皮細胞の増殖を刺激す
ることが示される。これは、創傷治癒、照射または薬物誘導腸疾患からの保護、
および腸の上皮の完全性におけるＫＳ３の役割を示唆する。

【０１４７】配列番号１−４０９は、添付の配列表に示す。添付の配列表に使用したポリヌ
クレオチドおよびポリペプチド配列のコードは、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９
８８）、付録２に準拠する。

【０１４８】特許文献および非特許文献を含む、本明細書中で引用した全ての文献は、その
全体を参照して本明細書の記載の一部とする。

【０１４９】本発明は、特定の実施態様に関して記載したが、添付の特許請求の範囲の範囲
によってのみ限定されると意図されている本発明の範囲から逸脱することなく、
変更及び変型を行うことができる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒト組織のｈｕＴＲ１ｍＲＮＡの分布のノーザン分析の結果を示す。
略語：Ｈｅ、心臓；Ｂｒ、脳；Ｐｌ、胎盤；Ｌｕ、肺；Ｌｉ、肝臓；ＳＭ、骨格
筋；Ｋｉ、腎臓；Ｓｐ、脾臓；Ｔｈ、胸腺；Ｐｒ、前立腺；Ｏｖ、卵巣。

【図２】図２は、ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａのＭＡＰキナーゼアッセイの結果を
示す。ＭｕＴＲ１ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）、ｈｕＴＲ１ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）
またはＬＰＳ（３ｐｇ／ｍｌ）をテキストに記載のように加えた。

【図３】図３は、ｍｕＴＲ１ａによる新生児包皮ケラチノサイトの増殖の刺激を示す。

【図４】図４は、ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａによる、形質転換したヒトケラチノ
サイト細胞系ＨａＣａＴの増殖の刺激を示す。

【図５】図５は、ｍｕＴＲ１ａおよびｈｕＴＲ１ａによる、ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１
の増殖の抑制を示す。

【図６】図６は、ＫＳ２ａによるコンカナバリンＡ刺激ネズミ脾細胞のＩＬ−２誘導増
殖の抑制を示す。

【図７】図７は、ＫＳ３ａとアポ−トランスフェリンの組合せによる、ラット腸上皮細
胞（ＩＥＣ−１８）の増殖の刺激を示す。

【図８】図８は、ヒトＰＢＭＣに対する、ＴＲ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｍｕＫＳ１
（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＤＦ１α（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびｆＭＬＰ（１
０μＭ）の酸化的バースト効果を示す。

【図９】図９は、ＴＨＰ−１細胞に対する、ｍｕＫＳ１およびＳＤＦ−１αの走化作用
を示す。

【図１０】図１０は、ｍｕＫＳ１（５０μｇ）、ＧＶ１４Ｂ（５０μｇ）およびＰＢＳで
腹腔内注射後の、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスでの細胞浸潤物の誘導を示す。

【図１１】図１１は、ｈｕＴＲ１ａによる、ＣＶ１／ＥＢＮＡおよびＨｅＬａ細胞系での
ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化の誘導を実証する。

【図１２】図１２は、ｍｕＴＲ１、ｈｕＴＲ１、ｈｕＴＧＦαおよびＰＢＳ（各１００ｎ
ｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＨｅＬａ細胞でのｈｕＴＲ１ｍＲＮＡ発現を示す。

【図１３Ａ】図１３は、ＰＣ−１２（図１３ａ）およびＨａＣａＴ（図１３ｂ）細胞でのｍ
ｕＴＲ１ａによるＳＲＥの活性化を示す。

【図１３Ｂ】図１３は、ＰＣ−１２（図１３ａ）およびＨａＣａＴ（図１３ｂ）細胞でのｍ
ｕＴＲ１ａによるＳＲＥの活性化を示す。

【図１４】図１４は、ＥＧＦ受容体に対する抗体による、ＨａＣａＴ細胞のｈｕＴＲ１ａ
媒介増殖の増殖を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ワトソン、ジェームズダグラスニュージーランドオークランドセントヘリアーズリデルロード 769 (72)発明者オンラスト、ルネニュージーランドオークランドマウントアルバートデュアートアヴェニュー 21 (72)発明者クンブル、アナンドニュージーランドオークランドリンフィールドスタントンテラス４ (72)発明者ムリスン、ジェームズグレグニュージーランドオークランドサンドリンガムカルガリーストリート 24 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 GA19 HA12 4B064 AG02 CA02 CA19 CC24 DA01 DA05 4B065 AA26X AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA22 CA25 CA53 DB52 ZA892 ZA922 ZB262 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA01 DA20 EA20 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）配列番号１−１１９、１９８−２７４、３４９−３７
２、および３９９−４０５に列挙した配列；（２）配列番号１−１１９、１９８
−２７４、３４９−３７２、および３９９−４０５に列挙した配列の相補体；（
３）配列番号１−１１９、１９８−２７４、３４９−３７２、および３９９−４
０５に列挙した配列の逆相補体；（４）配列番号１−１１９、１９８−２７４、
３４９−３７２、および３９９−４０５に列挙した配列の逆配列；（５）上記の
作動パラメータを使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定
で、上記の配列（１）−（４）のいずれかから選択された配列と少なくとも９９
％同一である確率を有する配列；並びに（６）上記で定義した作動パラメータお
よび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定で
、上記の配列（１）−（４）のいずれかに少なくとも５０％の同一性を有するヌ
クレオチド配列、からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、単離ポリ
ヌクレオチド。
【請求項２】請求項１の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】請求項２の発現ベクターで形質転換したホスト細胞。
【請求項４】（１）配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−
３９８、および４０６−４０９で与えられた配列；（２）上記の作動パラメータ
を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定で、配列番号１
２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８、および４０６−４０９の配列
と少なくとも９９％同一である確率を有する配列；並びに（３）上記で定義した
作動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳ
ＴＰによる測定で、配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８
、および４０６−４０９で与えられた配列に少なくとも５０％の同一性を有する
配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項５】請求項４のポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチ
ド。
【請求項６】請求項５の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】請求項６の発現ベクターで形質転換したホスト細胞。
【請求項８】（１）配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−
３９８、および４０６−４０９で与えられた配列；（２）上記の作動パラメータ
を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定で、配列番号１
２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８、および４０６−４０９の配列
と少なくとも９９％同一である確率を有する配列；並びに（３）上記で定義した
作動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳ
ＴＰによる測定で、配列番号１２０−１９７、２７５−３４８、３７３−３９８
、および４０６−４０９で与えられた配列に少なくとも５０％の同一性を有する
配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的部
分を少なくとも含む、単離ポリペプチド。
【請求項９】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含む
、患者のケラチノサイト増殖および運動性を刺激する方法であって、該ポリペプ
チドは請求項４のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１０】前記ポリペプチドは、（１）配列番号１８７、１９６、３
４２、３４３、３９７および３９８で与えられた配列；（２）上記で定義した作
動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ
Ｐによる測定で、配列番号１８７、１９６、３４２、３４３、３９７および３９
８の配列に少なくとも約５０％の同一性を有する配列、からなる群から選択され
たアミノ酸配列を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の癌細胞の増殖を抑制する方法であって、該ポリペプチドは請求項４の
アミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１２】前記ポリペプチドは、（１）配列番号１８７、１９６、３
４２、３４３、３９７および３９８で与えられた配列；並びに（２）上記で定義
した作動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬ
ＡＳＴＰによる測定で、配列番号１８７、１９６、３４２、３４３、３９７およ
び３９８の配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列、からなる群から選択
されたアミノ酸配列を含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の血管形成を調節する方法であって、該ポリペプチドは請求項４のアミ
ノ酸配列を含む、方法。
【請求項１４】前記ポリペプチドは、（１）配列番号１８７、１９６、３
４２、３４３、３９７および３９８で与えられた配列；並びに（２）上記で定義
した作動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬ
ＡＳＴＰによる測定で、配列番号１８７、１９６、３４２、３４３、３９７およ
び３９８の配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列、からなる群から選択
されたアミノ酸配列を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の腫瘍の血管形成および血管新生を抑制する方法であって、該ポリペプ
チドは請求項４のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１６】前記ポリペプチドは、（１）配列番号１８７、１９６、３
４２、３４３、３９７および３９８で与えられた配列；並びに（２）上記で定義
した作動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬ
ＡＳＴＰによる測定で、配列番号１８７、１９６、３４０、３４２−３４６、３
９７および３９８の配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列、からなる群
から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の皮膚炎症を和らげる方法であって、該ポリペプチドは請求項４のアミ
ノ酸配列を含む、方法。
【請求項１８】前記ポリペプチドは、（１）配列番号３３８および３４７
で与えられた配列；並びに（２）上記で定義した作動パラメータおよび同定試験
を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定で、配列番号３
３８および３４７の配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列、からなる群
から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の上皮細胞の増殖を刺激する方法であって、該ポリペプチドは請求項４
のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２０】前記ポリペプチドは、（１）配列番号１２９および３４８
で与えられた配列；並びに（２）上記で定義した作動パラメータおよび同定試験
を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定で、配列番号１
２９および３４８の配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列、からなる群
から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の白血球へのＨＩＶ−１の結合を抑制する方法であって、該ポリペプチ
ドは請求項４のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２２】前記ポリペプチドは、（１）配列番号３４０、３４４、３
４５および３４６で与えられた配列；（２）上記で定義した作動パラメータおよ
び同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測定で、
配列番号３４０、３４４、３４５および３４６の配列に少なくとも５０％の同一
性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項２１の
方法。
【請求項２３】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の炎症疾病を治療する方法であって、該ポリペプチドは請求項４のアミ
ノ酸配列を含む、方法。
【請求項２４】前記ポリペプチドは、（１）配列番号３４０、３４４、３
４５および３４６で与えられた配列；並びに（２）上記で定義した作動パラメー
タおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測
定で、配列番号３４０、３４４、３４５および３４６の配列に少なくとも５０％
の同一性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項
２３の方法。
【請求項２５】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の癌を治療する方法であって、該ポリペプチドは請求項４のアミノ酸配
列を含む、方法。
【請求項２６】前記ポリペプチドは、（１）配列番号３４０、３４４、３
４５および３４６で与えられた配列；並びに（２）上記で定義した作動パラメー
タおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰによる測
定で、配列番号３４０、３４４、３４５および３４６の配列に少なくとも５０％
の同一性を有する配列、からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項
２５の方法。
【請求項２７】単離ポリペプチドを含む組成物を患者に投与することを含
む、患者の神経学的疾病を治療する方法であって、該ポリペプチドは請求項４の
アミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２８】前記ポリペプチドは、（１）配列番号１８７、１９６、３
４０、３４２−３４６、および３９５で与えられた配列；並びに（２）上記で定
義した作動パラメータおよび同定試験を使用したコンピューターアルゴリズムＢ
ＬＡＳＴＰによる測定で、配列番号１８７、１９６、３４０、３４２−３４６、
および３９５の配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列、からなる群から
選択されたアミノ酸配列を含む、請求項２７の方法。