JP2002512782A

JP2002512782A - Ｇ−ｃｓｆレセプターアゴニスト抗体及びそのスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2002512782A
Application number: JP2000545893A
Authority: JP
Inventors: バオフニ; サン・ビル・エヌ・シー; サン・セシリー・アール・ワイ
Original assignee: タノックスインコーポレイテッド
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2019-04-30
Also published as: KR100479790B1; DE69929183T2; CN1298412A; ES2253887T3; ATE314396T1; EP1073683A1; WO1999055735A1; EP1073683B1; NZ507782A; BR9910568A; KR20010043112A; AU2003252863A1; CA2326755A1; CN101070344A; AU3673299A; DE69929183D1; AU764653B2; JP3979008B2; CN1326880C; EP1073683A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトG-CSFレセプターと特異的に結合し又はこれと相互作用して該レセプターを二量化し又は該レセプターに付随するキナーゼのリン酸化を活性化して細胞の増殖及び分化を刺激するアゴニスト分子に関する。このようなアゴニスト分子は、モノクローナル抗体並びにその断片、同族体及び類似体、並びにペプチド並びに有機化合物を包含する。マウスモノクローナルアゴニスト抗体の２つの実施例、mAb163-93及びmAb174-74-11が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願この出願は、１９９８年４月３０日に出願された米国仮出願第60/083,575号に
基づく優先権を主張する。

【０００２】発明の背景骨髄において血球細胞が生育し、分裂し及び分化する過程は、造血と呼ばれて
いる(Dexter, T.M.及びSpooner, E., annu. Rev. Cell Biol.,3:423,1987)。異
なる細胞系列に属する多くの異なる型の血球細胞が知られている。種々の血球細
胞の型のそれぞれは、自己更新することができ又は異なる成熟細胞型の全てを生
み出すことができる前駆細胞を与えることができる多分化能性幹細胞から生じる
。生体内では３つの群の細胞、すなわち、赤血球、血小板及び白血球が生産され
、後者の大部分は宿主免疫防御に関与している。

【０００３】造血前駆細胞の増殖及び分化は、コロニー刺激因子(CSFs)及びインターロイキ
ンを包含する一群のサイトカインにより制御される(Arai, K-I., et al., Annu.
Rev. Biochem. 1990, 59:783-836)。好中球及びマクロファージの生産には、少
なくとも４種類のサイトカイン、すなわち、インターロイキン-3(IL-3)、顆粒球
／マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)
及びマクロファージ刺激因子(M-CSF)が関与している。これらのうち、G-CSFは、
好中球性顆粒球系列の細胞にのみ特異的に作用する(Demetri, G.D.及びGriffin,
J.D., Blood, 1991, 78:2791-2808)。生体内でのG-CSFの主な生物学的効果は、
単分化能前駆細胞からの好中球の増殖及び分化を増大させることである(Cohen,
A.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:2484-2488)。G-CSFはまた、好中
球の移動、生存、並びに貪食作用及び殺菌を包含する機能を増強する(Crawford,
J., et al., N. Engl. J. Med., 1991, 325:164-170, Moore, M.A.S., Annu. R
ev. Immunol. 1991, 9:159)。この生理的過程は、重要な宿主防御システムの基
礎として働き、生体内において大規模に起きている。

【０００４】市販の組換えヒトG-CSF(Neupogen（登録商標）、Amgen,Inc.)の生体内におけ
る半減期は僅か3.5時間であり、好中球の生成を刺激するために必要なG-CSFの閾
濃度を維持するために毎日投与しなければならない。(Physician's Desk Refere
nce, 53^rd, 1999, 532-537)。高投与量における、組換えヒトG-CSF(「rhG-CSF」
)治療の主な副作用は骨の痛みであり、これはおそらく注射直後にrhG-CSFが一時
的に高濃度になることに起因するものと考えられる。もっとも、これは、投与量
の少ない患者では頻度がより低い。

【０００５】 rhG-CSFの生体内における半減期を長くするための種々の手段が研究されてお
り、このような手段として、ポリエチレングルコール(PEG)と結合させることが
含まれる。しかしながら、最近の報告により、PEG結合体は、非修飾タンパク質
よりも活性がかなり低く、タンパク質に結合されたPEG部分の分子量と生体外で
の活性とが反比例関係にあることが示された。Bowen S.,et al., Exp. Hemat.,
1999, 27: 425-432.さらに、動物実験により、PEGに結合されたrhG-CSFはその半
減期が１〜３日に延長されるが、それよりは長くはならないことが示された。

【０００６】 PEG結合rhG-CSFとは対照的に、モノクローナル抗体(「mAb」)の生体内におけ
る半減期は、抗体のアイソタイプに依存して約２〜３週間である。ヒトG-CSFレ
セプターに対するアゴニスト抗体の１回の注射により、G-CSF−様活性が数週間
に亘って得られるであろう。従って、化学療法を受けている重度慢性好中球減少
症患者は、アゴニストmAbの延長された生物学的活性の故に病院を訪れる頻度を
減らすことができるという利益を潜在的に受ける。さらに、血流中に維持される
アゴニスト抗体の濃度により、好中球前駆細胞の増殖及び分化が継続的に刺激さ
れ、従って、より高い効果が得られ、これによってNeupogen（登録商標）や他の
rhG-CSF誘導体よりも低い投与量でおそらく副作用も低くなるであろう。

【０００７】 G-CSFの種々の作用は、２つの異なる結合部位を通じて、そのレセプターと結
合し、1:2リガンド／レセプター複合体を形成することにより開始される。好中
球性顆粒球の前駆細胞及び成熟委任細胞上に発現されるG-CSFレセプターは、サ
イトカイン／造血レセプターのスーパーファミリーに属する。インターロイキン
-2(IL-2)ないしIL-7及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)のレ
セプターを包含する、このファミリーのメンバーの大部分は、α、β、及び時々
γサブユニットさえ含むヘテロメリック複合体の形成を通じて活性化されるが、
単一のポリペプチド鎖から成るG-CSFは、リガンドが結合するとホモ二量体を形
成すると信じられる(Fukunaga, R., et al., J. Biol. Chem., 1990, 265:24008
)。

【０００８】 G-CSFのホモ二量化は、信号伝達に必須であることが示されている(Wells, J.A
.,及びVos, A.M., Annu. Rev. Biochem., 1996, 65:609)。G-CSFレセプターは、
生来のタンパク質キナーゼ領域を含まないが、チロシンキナーゼ活性はG-CSF信
号の伝達に必須的であると思われる。G-CSFに誘導されるレセプターホモ二量化
を通じたG-CSFレセプター活性化の信号は、例えばJAK1及びJAK2のような種々の
チロシンキナーゼの非共有結合的結合 (Barge, R.M.Y.,et al, Blood, 1996, 87
:2148-2153)、及び、次いで、Stat3及びStat5のような転写因子Statのリン酸化
(Tian, S-S., et al., Blood, 1994, 84:1760-1764; Watowich, S.S., et al.,
Annu. Rev Cell Dev. biol., 1996, 12:91; Dong F., et al., J. Immunol., 19
98, 161: 6503-6509) により媒介される。これらのチロシンキナーゼは、G-CSF
に応答するG-CSFレセプターリン酸化及びStat活性化において必須的な役割を果
たす(Tian S-S. et al., blood, 1996, 88:4435-4444; Shimoda, K., et al., B
lood, 1997, 90:597-604)。

【０００９】 G-CSFレセプター以外にも、エリスロポイエチン(「EPO」)、成長ホルモン(「G
H」）、プロラクチンレセプター（「PRL」）及びトロンボポイエチン（「TPO」
）のレセプターの機能もまた、リガンドにより誘起されるレセプターの二量化に
より開始され、特定のキナーゼの組がリン酸化されるものと考えられる(Youssou
fian, H., et al., Blood, 1993, 81:2223; Alexander, W.S., et al., EMBO, 1
995, 14:5569; Heldin C.H., Cell, 1995, 83:213)。従って、ホモ二量化及びレ
セプター担持細胞の増殖に対する信号伝達を引き起こす能力に基づく、本発明に
おいて開示されるG-CSFレセプターアゴニストのスクリーニング方法は、これら
の他のレセプターに対するアゴニストのスクリーニングにも用いることができる
。

【００１０】発明の概要本発明は、G-CSFレセプター及び他のホモ二量体サイトカインレセプターに対
する相互作用的アゴニスト分子であって、これらのレセプターと結合しまたはこ
れらと相互作用することにより、リガンドと同じ生物学的役割を演じるものに関
する。本発明は、２つのサイトカインレセプタータンパク質、好ましくは、例え
ば２つのG-CSFレセプタータンパク質のような２つの同一のサイトカインレセプ
タータンパク質に結合し、又は相互作用することができるアゴニスト的分子を包
含する。これらのアゴニスト的分子は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル
抗体の全抗体分子、並びに、Fab、scFv及び２価F(ab')₂のような免疫グロブリン
断片、並びにネイティブG-CSFと同一又は類似のアゴニスト効果を発揮すること
ができるそれらの同族体又は類似体のような、これらの修飾又は誘導形態を包含
する。アゴニスト抗体及び断片は、動物由来、ヒト−マウスキメラ性、ヒト化、
DeImmunised（登録商標）、又は完全にヒト由来のものであってよい。

【００１１】好ましい具体例では、G-CSFレセプターアゴニストは、G-CSFレセプターを発現
する細胞の増殖及び／又は分化を刺激する。これは、G-CSFレセプターの細胞外
領域に結合し、G-CSFレセプターを二量化し、及び／又はG-CSFレセプターに付随
するキナーゼのリン酸化を活性化することにより達成することができる。G-CSF
レセプターを発現する細胞は一般的に原始的幹／前駆造血細胞を含み、従って、
アゴニストは、原始的造血細胞の分化及び／又は増殖を促進して好中球的顆粒球
系列細胞の再増殖をもたらすであろう。

【００１２】本発明の他の局面は、生体外での細胞に基づくアッセイシステムを用いた、例
えばG-CSFレセプターアゴニスト抗体のような、ホモ二量化サイトカインレセプ
ターのアゴニストをスクリーニングするための方法に関する。後述のように、細
胞は、G-CSFレセプター又はアゴニストの結合により活性化されるG-CSFレセプタ
ーの部分でトランスフェクトすることができ、そして、アゴニスト分子の存在下
で細胞の増殖をモニターすることができる。

【００１３】本発明はまた、診断目的及び治療用途の両者のために、アゴニスト抗体を包含
するこれらのアゴニストを使用することを包含する。mAb163-93及びmAb174-24-1
1と命名された、例示的なアゴニスト抗体を産生するハイブリドーマが、それぞ
れ、＿＿＿及び＿＿＿の受託番号で、バージニア州20110-2209、マナサス、ユニ
バーシティブルバード 10801のアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（「ＡＴＣＣ」）に寄託されている。G-CSFレセプターアゴニスト活性を有
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインが、HB-12524の受
託番号でＡＴＣＣに寄託されている。

【００１４】配列表の概要配列番号１〜６は、G-CSFレセプターのクローニングに用いた種々のプライマ
ーを示す。配列番号７〜１４は、本発明の２つのアゴニスト抗体の可変領域のクローニン
グに用いた種々のプライマーを示す。配列番号１５〜２６は、本発明の２つのアゴニスト抗体のCDR（Ｌ鎖及びＨ鎖
の両方）のアミノ酸配列を示す。配列番号２７は、ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域のアミノ酸配列を示す。

【００１５】発明の製造及び使用１．本発明のアゴニストの製造ここに記載したG-CSFレセプターアゴニストは、好ましくはG-CSFレセプターの
細胞外領域中のエピトープを標的とする。アゴニストの例として、ハイブリドー
マセルライン163-93及び174-74-11により生産されるものを挙げることができる
。

【００１６】本発明のモノクローナルアゴニスト抗体は、免疫化及び融合（下記実施例４参
照）によって、又は単離されたリンパ球からEBVトランスフォーメーションを用
いて、又はヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされた昆虫若しくは哺乳動
物細胞から生産することができる。臨床使用のために、アゴニスト抗体は、好ま
しくは、キメラ性、DeImmunized（登録商標）、ヒト化又はヒト抗体である。こ
のような抗体は、免疫原性を低減させることができ、ひいてはヒト抗マウス抗体
(HAMA)応答が避けられる。抗体は、抗体依存性細胞性細胞障害(S.M. Canfield及
びS.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991:173: 1483-1492)及び補体媒介細胞溶解(
Y. Xu et al., J. Biol. Chem., 1994:269:3468-3474; V.L. Pulito et al., J.
Immunol. 1996; 156:2840-2850)を補強しないIgG4、IgG2又は他の遺伝的に変異
されたＩｇＧ若しくはＩｇＭであることが好ましい。

【００１７】キメラ性抗体は、周知の組換えＤＮＡ技術により生産され、動物の可変領域と
ヒト定常領域とを有する。ヒト化抗体は、キメラ性抗体よりもヒトペプチド配列
の割合が高い。ヒト化抗体では、抗原結合及び特異性を司る相補性決定領域(CDR
)のみが動物由来で動物抗体に対応するアミノ酸配列を有しており、分子の残り
の実質的に全ての部分（ある場合には、可変領域内のフレームワーク領域の小さ
な部分を除く）がヒト由来で、アミノ酸配列においてヒト抗体に対応する。L. R
iechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, 米国特許第5,225,
539; C. Queen et al.,米国特許第5,530,101参照。

【００１８】 DeImmunised（登録商標）抗体は、国際出願PCT/GB98/01473に記載されている
ように、潜在的Ｔ及びＢ細胞エピトープが排除されている抗体である。従って、
ヒトにおけるそれらの免疫原性は、それらが生体内で適用された場合、実質的に
減少されていると予想される。

【００１９】ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(Stratagene Corp.,カリフ
ォルニア州ラジョラ）を用いてヒト抗体の断片(V_H, V_L, Fv, Fd, Fab又は(Fab
')₂)を生産し、キメラ性抗体を製造するのに用いられる技術と同様な技術を使用
し、これらの断片を用いて全ヒト抗体を構築することを含む、数種類の異なる方
法により生産することができる。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリンゲノムを
有するトランスジェニックマウス中で生産することもできる。このようなマウス
は、カリフォルニア州フレモントのAbgenix, Inc.及びニュージャージー州ア
ナンデールのMedarex Inc.から市販されている。

【００２０】全体的又は部分的なヒト抗体は、全体的なマウスmAbよりも免疫原性が低い。
本発明にとってまた適当な、２価断片もまた、より免疫原性が低い。従って、こ
れらの型の抗体の全ては、ヒトにおいて免疫応答をより引き起こしにくい。従っ
て、本発明のアゴニスト抗体に対して予言されているように、それらは、全体的
な動物抗体よりもヒトに投与することにより適している。特に、抗体を繰り返し
または長期間に亘って投与しなければならない場合にそうである。

【００２１】患者に抗体を投与することの１つの代替手段は、遺伝子治療技術によりアゴニ
スト抗体を内発的に生成させることである。アデノウイルス、AAV及びレトロウ
イスルを包含する標準的なベクターを用い、又は非ベクターデリバリーシステム
により、アゴニスト抗体又はその断片、誘導体若しくは類似体をコードするＤＮ
Ａ配列を生体内で分配することができる。アゴニスト抗体又はその断片、誘導体
若しくは類似体が持続的に発現されることは、慢性的好中球減少症の臨床治療に
とってさらなる優位性を有するかもしれない。

【００２２】ここに記載するアゴニスト分子はまた、G-CSFレセプターに特異的に結合しま
たはこれと相互作用し、その二量化及び活性化をもたらす、ペプチド及び有機化
合物のような小さな分子をも包含する。このような小さな分子は、また、低減さ
れた免疫原性を示すかもしれない。

【００２３】ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域（本発明において、ヒトG-CSFレセプターに
対する抗体の生成に用いられる）は、この分野において周知の分子組換えＤＮＡ
技術を用いて生成することができる。細胞外領域は、成熟ヒトG-CSFレセプター
の、N-末端から1-603アミノ酸残基に亘って延びている（配列番号２７）。例え
ば米国特許第5,589,456号、第5,422,248号及び第5,574,136号参照）。しかしな
がら、ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域の一部は、精製された又は部分精製さ
れた形態で、免疫原として用いることができる。

【００２４】ヒトG-CSFレセプターのこの細胞外領域は、例えばマウスの様な動物を免疫す
る免疫原としてそのまま用いることができるし、あるいは、免疫化の前に、これ
を先ず、担体分子と結合させてその免疫原性を増大させることができる。適当な
担体分子は、例えばTag, Flag、ロイシン−ジップのようなペプチド、又は、例
えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)、アリカリフォスファターゼ(
AP)、インテイン又は免疫グロブリンの定常領域（後述するようにアゴニスト抗
体の作製に用いられた）のようなタンパク質を包含する。担体分子は、組換えＤ
ＮＡ技術によってG-CSFに結合することができる。免疫原性を増大させることに
加え、G-CSFレセプターの細胞外領域を含む、このようなキメラ性融合タンパク
質は、アフィニティクロマトグラフィーを用いた抗原の精製を容易にすることが
できる。G-CSFレセプターの細胞外領域を含む抗原をコードするＤＮＡ断片を発
現ベクターに入れ、これを次いで大腸菌、酵母、昆虫細胞並びにサルCOS細胞、
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はミエローマ細胞等の宿主細胞にトラ
ンスフェクトすることができる。この方法により生産した抗原は、周知の技術に
より精製することができる。

【００２５】適当な免疫原は、ネイティブ又は野生型G-CSFレセプター細胞外領域に人工的
又は自然に生成された、置換、欠失又は挿入を有する突然変異体を包含する。G-
CSFレセプター又はその類似体を発現する細胞もまた免疫原として用いることが
できる。このような細胞は、一次ヒト細胞、AML-193のようなセルライン、G-CSF
レセプターの全長若しくは一部又はG-CSFレセプターの細胞外領域を含むキメラ
性タンパク質(Takahashi, T., et al., J. Biol. Chem. 1996, 271: 17555-1756
0)でトランスフェクトされたヒト若しくはマウス細胞（あるいは、任意的に、発
現ベクターとしてバキュロウイルスを用いた昆虫細胞）を包含する。

【００２６】 G-CSFレセプターに対するアゴニスト抗体（ポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体）を生成させるために、ここに記載した免疫原を用いて、周知の方法
により、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット）又は
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、又はヒト免疫グロブリンを発現するトラ
ンスジェニックマウス、又はヒトＢ細胞若しくはヒト骨髄細胞を移植された、重
症複合免疫不全(SCID)マウスを免疫することができる。ハイブリドーマは、免疫
された動物からのＢ細胞と、ミエローマ細胞（例えばSp2/0及びNS0)を、G. Kohl
erとC. Milstein (Nature, 1975, 256:495-497)によって記載された常法により
融合することによって生成させることができる。G-CSFレセプターに対する抗体
はまた、ファージディスプレイシステム(Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol.
, 1991, 227:381; Marks et al. J. Mol. Biol., 1991,222:581)におけるヒトＢ
リンパ又はヒト骨髄からの組換え単鎖Fv又はFabライブラリーをスクリーニング
することによって生成させることもできる。

【００２７】 G-CSFレセプターに特異的な抗体の選択は、プレート上に抗原、すなわち好ま
しくはG-CSFレセプター/IgG4(Fc)キメラ性タンパク質が直接的又は間接的にコー
ティングされる、従来の酵素免疫分析(ELISA)法により行うことができる。ＥＬ
ＩＳＡにより検出される、キメラ性タンパク質への抗体mAb163-93のこのような
結合は、図３に示されている。エピトープがリガンドのエピトープと近い又は重
なる抗体を同定するために競合的ＥＬＩＳＡを用いることもできる(Current pro
tocols in molecular biology, Ausubel, F.M. et al.編、Wiley Intersccience
発行、1996)。

【００２８】 G-CSFレセプター/IgG4(Fc)キメラ性タンパク質を直接的又は間接的にコーティ
ングした後、rhG-CSF(R&D Biosystems, ミネソタ州ミネアポリス）を競合的ＥＬ
ＩＳＡに用いることができる。G-CSFレセプターへの抗体の結合は、ヤギ抗マウ
ス抗体のような、第二抗マウス抗体の添加により測定することができる。第二抗
体には、セイヨウワサビペルオキシダーゼを包含する、種々の化合物及びタンパ
ク質を検出のために結合することができる。

【００２９】後述するトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４のような、細胞の表面上に発
現されるヒトG-CSFレセプターに対する抗体の結合特異性は、FACS分析（実施例
６）により測定することができる。図4Aに示されるように、マウスモノクローナ
ル抗体mAb163-93は、ヒトG-CSFレセプターを発現するマウストランスフェクタン
ト細胞Ｄ４にに特異的に結合するが、コントロールmAbは結合しなかった。さら
に、mAb163-93は、ヒトG-CSFレセプターを発現するＤ４細胞には特異的に結合す
るが、その親細胞である32D-c123には結合しなかった（図４Ｂ）。

【００３０】生体外での細胞系生物学的機能分析によりG-CSFレセプターアゴニストをスク
リーニングする方法もまた本発明に包含される。アゴニストの大規模なスクリー
ニングのために、このような方法の１つは、G-CSF−応答性遺伝子のプロモータ
ーの制御下においてレポーター遺伝子を発現するためのカセットの構築物を導入
した、NFS60のようなG-CSF応答性セルライン(Schindler, C及びDarnell, J.E.,
Annu. Rev. Biochem., 1995, 64:621)を構築することを包含する。ここで用いら
れるレポーターは、ルシフェラーゼ、−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパ
ク質又はジヒドロ葉酸リダクターゼ(Pelletier, J.N., et al., Proc. Natl.Ada
d. Sci. USA, 1998,95:5290)であり得る。刺激後、細胞内の酵素活性又は蛍光密
度を測定することにより、高効率スクリーニングによりG-CSFレポーターに対す
るアゴニストをスクリーニングすることができる。

【００３１】アゴニスト抗体を含むアゴニストのための生体外細胞系生物学的機能分析はま
た、生体外細胞増殖試験を包含する。本発明の好ましい具体例として、ヒトG-CS
Fレセプターの全長を発現するマウスセルラインＤ４を構築し、MTT-系比色分析
と組み合わせて大規模にアゴニスト抗体をスクリーニングするために用いた。MT
Tを用いた比色分析システムは、放射性同位体を用いることなく、サイトカイン
及びそれらのアゴニストに応答した細胞増殖を分光光度的に定量するように設計
される。BaF3及びFDC-P1、又は好ましくは本発明の実施例７の32D-C123のような
親マウスセルラインは、mIL-3依存的で、ヒトG-CSFレセプターの全長を発現する
ための宿主細胞として適当である(Hapel, A.J. et al., Blood, 1984, 64: 786-
790)。構成性hCMVプロモーターの制御下においてヒトG-CSFレセプターの全長を
発現するベクターでトランスフェクトし、次いで選択すると、下記実施例７及び
図１に示されるように、MTT分析及び³Ｈ−チミジン取り込み分析によって示され
るように、Ｄ４のようなトランスフェクタントもまたG-CSFに反応するようにな
る。

【００３２】マウストランスフェクタントセルラインＤ４中でのチロシンキナーゼJAK1のリ
ン酸化は、内発性ヒトG-CSFレセプターを発現するヒトセルラインAML-193と同様
に、rhG-CSF(R&D Biosystems)により誘起される（図２）。実施例７に記載され
るように、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウスセルラインＤ
４をMTTアッセイと組み合わせて用いることにより、アゴニスト、特にアゴニス
ト抗体のスクリーニングが大幅に容易になる。このスクリーニング法はまた、AM
L-193のようなネイティブのG-CSF−依存性ヒトセルライン、ヒトG-CSFレセプタ
ー突然変異体を発現するマウスセルライン、又は、エリスロポイエチンレセプタ
ー(Goldsmith, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 7006-70
11)若しくはFasレセプター(Takahashi, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271
: 17555-17560)のような他のサイトカインレセプターの細胞内領域と融合させた
ヒトG-CSFの細胞外領域を包含するキメラ性タンパク質を採用することもできる
。

【００３３】ヒト骨髄を用いた顆粒球コロニー形成アッセイも又、本発明のアゴニスト抗体
のスクリーニングに用いることができる。さらに、このアッセイはまた、ヒト骨
髄からの好中球性顆粒球の増殖及び分化を刺激するアゴニスト抗体の能力、効率
及び特性の決定、並びに非ヒト霊長類との種特異性の決定に用いることができる
。このアッセイの結果は、本発明のアゴニスト抗体が、組換えヒトG-CSFと同様
に作用し、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球の分化及び増殖を、濃度依存的に特異
的に刺激することを示している。更に、アゴニスト抗体mAb163-93は、このアッ
セイにおいて、rhG-CSFと本質的に同じ効率を示した（図７）。さらに、アゴニ
ストmAbで刺激された、ヒト骨髄からのコロニーから採取された細胞は、典型的
な好中球の形態を示す（図８Ｄ）。rhG-CSFは、注射後、主として腎臓の働きに
より、生体内では循環から迅速に排除され、このため、その薬理効果の持続時間
は短いことを理解すべきである(Tanaka, H., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther
. 1989,251:1198-1203; Layton, J.E., et al., blood, 1989, 74: 1303-1307)
。一方、本発明で記載する顆粒球コロニー形成アッセイでは、このような排除機
能が存在しないので、生体内に比べ、rhG-CSFは、ヒト骨髄からの好中球の増殖
及び分化を刺激する活性を持続的に示す。長半減期のPEG化(Pegylated)ヒト成長
ホルモンとヒト成長ホルモンの比較(Clark, R.,et al., J. Bio. Chem., 1996,
271:21969-21977)から示唆されるように、アゴニスト抗体mAb163-93の能力は、
その長い生体内での半減期の故に、rhG-CSFと同等かそれよりも高いであろう。

【００３４】上記スクリーニング技術を用い、mAb163-93及びmAb174-74-11を包含する、モ
ノクローナルアゴニスト抗体のパネルがヒトG-CSFレセプターに対して生成され
た。組換えヒトG-CSFとして作用するアゴニスト抗体mAb163-93は、G-CSFレセプ
ターを活性化し、JAKキナーゼのチロシンリン酸化を誘起し(図6A,左側のパネル
。リン酸化が抗pTyr抗体により検出されている）、転写因子のリン酸化を誘起す
る（図６Ｂ、左側のパネル。リン酸化が抗pTyr抗体により検出されている）。本
発明において生成された抗体のパネル中の数種類のアゴニスト抗体は、生体外に
おいてG-CSF応答性細胞の増殖を刺激することが示された（図5A-C)。mAb163-93
は、細胞表面上のG-CSFレセプターに特異的に結合することが示された（図4A及
び4B)。さらに、これらのヒトG-CSFレセプターアゴニスト抗体は、ヒト骨髄から
の好中球性顆粒球のコロニー形成を特異的に刺激する（図7A,7B及び8A-C)。これ
は、生体内での有効性をさらに示すものである。これは、ヒト骨髄からの好中球
性顆粒球のコロニー形成を刺激するモノクローナル抗体の最初の例である。

【００３５】ヒトG-CSFレセプターアゴニスト抗体の種交差反応性もまた、顆粒球コロニー
形成アッセイを用いて測定された。mAb163-93のような、これらのヒトG-CSFレセ
プターアゴニスト抗体は、種々の非ヒト霊長類の骨髄からの好中球性顆粒球の増
殖及び分化を、種々の程度で特異的に刺激することが示された（下記表１）。ア
ゴニスト抗体mAb163-93によって刺激された、チンパンジー骨髄からの顆粒球の
コロニー形成数は、濃度依存的に増加した（図９）。細胞染色の結果は、チンパ
ンジー骨髄からの好中球の増殖及び分化を刺激するこのアゴニストmAbの特異性
を示していいる（図１０）。このタイプの種交差反応性アッセイは、前臨床試験
のための適当な動物モデルの選択に用いることができる。

【００３６】

【表１】表１非ヒト霊長類の骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成

【００３７】上記のことは、２価アゴニスト抗体がG-CSFレセプターを活性化することがで
きること、すなわち、それらはG-CSFの能力を真似るようにG-CSFレセプターを架
橋して複合体を形成しレセプターを活性化することができることを示している。
さらに、Fv及びFabのような、１つのレセプター分子にのみ結合する、抗体の１
価部分は、以下にその適用を記載するように、G-CSFと競合するアンタゴニスト
として用いることができる。

【００３８】２．本発明のアゴニストの使用組換えヒトG-CSFは、組換えＤＮＡ技術によって生産され、治療への適用が成
功した最初のサイトカインの１つである。このサイトカインは、種々の類似遺伝
性(congenic)及び医原性好中球減少症に付随する感染症の発病率を減少させるた
めに広く用いられている。現在までに、米国FDAによって、rhG-CSF治療は、以下
の５つの疾病への適用が認可されている。(1)骨髄抑制性化学療法を受けている
癌患者、(2)急性骨髄性白血病誘導及び強化化学療法を受けている癌患者、(3)骨
髄移植を受けた癌患者、(4)末梢血前駆細胞回収及び治療を受けている癌患者及
び(5)重度慢性好中球減少症の患者(Physician's Desk Reference, 第５３版、19
99, 532-537)。好中球顆粒球系列の増殖及び分化に対するユニークな機能的特異
性は、HIV患者、全身性炎症反応症候群(SIRS)及び敗血症患者、並びに糖尿病性
足感染(diabetic foot infection)及び他の感染症患者を包含する他の疾病にも
有用である(Miles, S.A., et al., Blood 1990, 75; 2137-2142; Kuritzkes, D.
R. et al., AIDS 1998, 12:65-74; Weiss, M. et al., Bloob 1999, 93: 425-43
9; Lancet 1997, 350: 855-859; Deresinski, S.C., et al, Infect. Med. 1998
, 15:856-70)。

【００３９】ここで開示した、rhG-CSFとして作用するヒトG-CSFレセプターアゴニスト及び
抗体は、細胞表面上のG-CSFレセプターに特異的に結合し、JAKキナーゼ及び転写
因子のチロシンリン酸化を誘起するメカニズムにより、G-CSFレセプターを活性
化し、G-CSF応答性細胞の増殖を刺激する。さらに、ヒトG-CSFレセプターアゴニ
スト抗体は、rhG-CSFと同様、ヒト骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を
特異的に刺激する。従って、ここに開示したヒトG-CSFレセプターアゴニスト及
び抗体は、rhG-CSFと全ての同じ治療用途に有用であると一般的に予測される。
さらに、アゴニスト抗体の長い半減期及び生体内での安定性の故に、治療的処置
においてrhG-CSFよりも有意に潜在的に有利である。

【００４０】本発明のアゴニスト及びアゴニスト抗体は、適切な医薬製剤の形態で、筋肉内
注射、腹腔内注射及び皮下注射を包含するがこれらに限定されない種々の経路に
より投与することができる。用量は、動物モデルからの外挿及び臨床試験におけ
るルーチンな実験により決定することができる。

【００４１】これらの本発明のアゴニスト及び抗体はまた、組換え細胞培養物または天然源
からのG-CSFレセプターのアフィニティ精製に有用である。一般的なアフィニテ
ィ精製技術はこの分野において周知であり、これらのいずれをもこの目的のため
に用いることができる。

【００４２】本発明の抗体は、G-CSFレセプターの可溶性細胞外領域及びG-CSFレセプターを
その表面上に発現している細胞と免疫学的に反応する。従って、本発明はまた、
この分野において周知の免疫学的方法を用いて、可溶性の形態にあるG-CSFレセ
プターの存在及び／又は細胞表面上に存在するG-CSFレセプターの存在を検出及
び測定する方法をも提供する。さらに、Fab及びscFvのようなアゴニスト抗体の
１価断片及びそれらの誘導体は、G-CSFがG-CSFレセプターと相互作用することを
競合により防止するアンタゴニストとして作用し得、従って、G-CSFの生物学的
機能を阻害し得る。これは、ある種の腫瘍及び癌の治療において有用であり得る
。ここに開示した抗体を用いた免疫反応試験により、レセプター構造又はレセプ
ター発現が正常か、異常か又は突然変異したものかもまた決定することができる
。これらの結果は、診断及び治療目的に有用であり得る。

【００４３】

【実施例】

実施例１ヒトG-CSFレセプタータンパク質の細胞外部分のクローニング G-CSFレセプタータンパク質のクローニングは次のようにして行った。１ｎｇ
のヒト骨髄ｃＤＮＡ（Clontech,カリフォルニア州パロアルト）をＰＣＲにお
ける鋳型として用いた。プライマーとしてAAG TGG TGC TAT GGC AAG GCT G（配
列番号１）及びCAC TCC AGC TGT GCC CAG GTC TT（配列番号２）を500 nMの最終
濃度で含む１００μｌの反応混合物にこれを加えた。これらのプライマーは、ヒ
トG-CSFレセプターの細胞外部分をコードするｃＤＮＡの５‘及び３’末端に相
同的であることが知られている。反応条件は次の通りであった。９４℃、１分間
；６２℃、３０秒間；７２℃、３分間；４０サイクル繰り返し。

【００４４】ＰＣＲからのＤＮＡ断片（約1.6 kb)を、BIO Inc.（カリフォルニア州ビスタ
）からのプロトコールに従ってアガロースゲルから単離し、次いでTAクローニン
グベクター(Invitrogen,カリフォルニア州カールスバッド)に挿入し、組換えプ
ラスミドpT1-11を生成した。この挿入物のＤＮＡ配列は、United States Bioche
mical（オハイオ州クリーブランド）からのＤＮＡ配列決定キットを用いて、両
ストランドとも配列決定することにより決定した。ヒトG-CSFレセプターの細胞
外領域をコードする、pT1-11中のＤＮＡ断片（Fukunaga, R. et al., Proc.Nat'
l Acad. Sci. USA, 1990, 87:8702)によって規定された配列を用いて）をEcoR1
で消化し、末端をKlenow断片で平滑化した。これを次いで、IgG4(Fc)をコードす
るｃＤＮＡを含むプラスミドpFc1に挿入し、これをXba1で消化した。末端をKlen
ow断片で平滑化し、プラスミドpFT1-9を生成した。ヒトG-CSFレセプターの細胞
外領域及びIgG4(Fc)をコードするpFT1-9中のＤＮＡ断片をAseI及びHincIIで消化
し、Klenow断片で平滑化し、次いで哺乳動物発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)中
に挿入した。このベクターをEcoRV及びHincIIで消化し、次いでKlenow断片で平
滑化してプラスミドpCGC23を生成した。このプラスミドにおいて、ヒトG-CSFRの
細胞外領域／IgG4(Fc)の発現は、hCMVプロモーターの制御下にある。

【００４５】実施例２動物細胞中でのhG-CSFRの細胞外領域／IgG4(Fc)の発現以下のようにして、線状化したpCGC23でNSO細胞をトランスフェクトした。4 x
10⁷個の対数期のNSO細胞を回収し、2% FBS添加IMDM培地0.8 ml中に再懸濁した
。１０μｇの線状化プラスミドＤＮＡと１０分間氷上でインキュベートした後、
BioRad装置を用いて、細胞混合物を、２００ボルト、９６０μＦでエレクトロポ
レーションにかけた。氷上で２０分間後、１００μｌの希釈細胞浮遊液を約２０
枚の９６−ウェルプレートの各ウェルに加えた。２日後、G418(Gibco BRL,メリ
ーランド州ガイサースバーグ）を含む１００μＬの同じIMDM培地を各ウェルに加
えてG418の濃度を0.8 mg/mlとした。１０日後、次のようにしてＥＬＩＳＡによ
りヒトG-CSFレセプターの細胞外領域／IgG4(Fc)融合タンパク質の発現をスクリ
ーニングするために培養上清を吸引した。

【００４６】 Immulon 2プレート（Dynatech Laboratories, バージニア州チャンティリー）
のウェルを濃度１μｇ／ｍｌの、５０μＬの抗ヒトIgG(Fc)抗体でコーティング
し、室温で一夜インキュベートした。プレートを軽くたたいてコーティング溶液
を除去した後、２００μＬのBLOTTO(5%脱脂乾燥牛乳含有PBS)を室温で各ウェル
に加えて非特異的結合をブロックした。１時間後、ウェルをPBSTバッファ(0.05%
Tween 20含有PBS)で洗浄した。トランスフェクションプレート中の各ウェルか
らの培養上清の５０μｌを回収し、５０μｌのBLOTTOと混合し、マイクロプレー
トの個々のウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ウェルをPBST
で洗浄した。結合したヒトG-CSFレセプターの細胞外領域／ＩｇＧ４（Ｆｃ）融
合タンパク質を、1:2000にBLOTTOで希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ(H+L)結合セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, ペンシル
ベニア州ウェストグローブ）との反応により検出した。0.1% 3,3',5,5'テトラ
メチルベンジジンを含むペルオキシダーゼ基質溶液(Sigma,ミズーリー州セント
ルイス）及び0.0003%過酸化水素(Sigma)を発色のために各ウェルに加え、３０
分間放置した。反応は、５０μｌの0.2M H₂SO₄を各ウェルに加えることによって
終了した。BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, バーモント州ウィノー
スキー）を用いて、反応混合物のOD_450-570を測定した。

【００４７】 OD_450-570が高かったトランスフェクタントをピックアップし、限界希釈法に
より単一細胞クローニングを行った。上の段落に記載したのと同じＥＬＩＳＡ及
び検出を行って、ヒトG-CSFレセプターの細胞外領域及びＩｇＧ４（Ｆｃ）キメ
ラ性タンパク質を含む融合タンパク質を高発現しているセルラインを同定した。

【００４８】実施例３ヒトG-CSFRの細胞外部分／ＩｇＧ４（Ｆｃ）キメラ性タンパク質の
精製ヒトG-CSFRの細胞外部分／ＩｇＧ４（Ｆｃ）キメラ性タンパク質を発現してい
るトランスフェクタント細胞からの培養上清１リットルを回収し、製造者の指示
書(Biopresessing Inc.,ニュージャージー州プリンストン）に従い、Prosep-Aア
フィニティクロマトグラフィーによってキメラ性タンパク質を精製した。このタ
ンパク質を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）アフィニティカラム上でさらに精製した
。このキメラ性タンパク質の純度をSDS-PAGE及び免疫ブロットの両方により測定
した。

【００４９】実施例４ハイブリドーマ生成精製された５０μｇのヒトG-CSFレセプターの細胞外領域及びＩｇＧ４（Ｆｃ
）キメラ性タンパク質を、フロインドの完全アジュバント（Difico Laboratorie
s,ミシシッピー州デトロイト）及び２００μｌのリン酸緩衝塩溶液(PBS, pH7.4)
中に含むものをBALB/cマウス(Harlan,テキサス州ヒューストン）に皮下注射した
。２週間及び４週間後に、フロインドの不完全アジュバント中に含まれた同じ量
の融合タンパク質でマウスをブースターした。２週間後、かつ、屠殺の３日前に
、マウスに最後のブースターを腹腔内投与した。それらの脾細胞をSp2/0ミエロ
ーマ細胞と融合させた。５０％ポリエチレングリコール(MW 1450)(Kodak,ニュー
ヨーク州ロチェスター）及び５％ジメチルスルホキシド(Sigma,ミズーリー州セ
ントルイス）を含む培地中で5 x 10⁸個のSp2/0と5 x 10⁸個の脾細胞を融合さ
せた。5% FBS、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプト
マイシン、0.1 mMヒポキサンチン、0.4μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジ
ンを添加したIscove培地(Gibco BRL,メリーランド州ガイサースバーグ）２００
μｌ当たり脾細胞が5 x 10⁴個になるように細胞濃度を調整した。１００枚のマ
イクロプレートの各ウェルに２００μｌの細胞浮遊液を加えた。１０日後、実施
例７に記載された生体外細胞増殖アッセイを用いたスクリーニングのために培養
上清を吸引した。

【００５０】実施例５ヒトG-CSFレセプターの全長をコードするｃＤＮＡのクローニング Ultraspec-3 ＲＮＡ単離キットを用い、製造者の方法(Biotex Laboratories
Inc.,テキサス州ヒューストン）を用い、ヒトセルラインAML-193(ATCCカタログN
o. CRL-9589)から全ＲＮＡを調製した。AML-193セルラインからの全ＲＮＡ１０
μｇを、製造者のプロトコール(Gibco BRL、メリーランド州ガイサースバーグ）
に従う逆転写反応における第一鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型として用いた。ヒ
トG-CSFレセプターのＣ末端側半分をコードするｃＤＮＡを増幅するために、得
られた第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、２つのプライマー、NheI: CCC CCC CA
G CGC TAG CAA TAG CAA CAA GAC CTG GAG G（配列番号３）及びR10: GGA ATT CC
T AGA AGC TCC CCA GCG CCT CC（配列番号４）を含む５０μｌの反応混合物中で
ＰＣＲを行った。反応条件は次の通りであった。９４℃、１分間；６０℃、１分
間；７２℃、３分間で４０サイクル。ＰＣＲ産物を、SmaIで消化したクローニン
グベクターpUC19にクローニングし、プラスミドpC3を精製した。ヒトG-CSFレセ
プターのＮ−末端側半分をコードするｃＤＮＡ断片の末端に新たな制限酵素部位
Nhe1を生成するために、ＰＣＲにおいて、２つのプライマーを用い、プラスミド
pCGC23ＤＮＡを鋳型として用いた。これらのプライマーは、T7P: AAT ACG ACT C
AC TAT AG（配列番号５）及びNhe2: AGG TCT TGT TGC TAT TGC TAG CGC TGG GGG
GGC CCA GG（配列番号６）であった。このＰＣＲ反応からの、ヒトG-CSFレセプ
ターのＮ−末端側半分をコードするＤＮＡ断片を、ベクターpCR-Blunt(Invitrog
en,カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングしてプラスミドpB12を生
成した。ヒトG-CSFレセプターの全長を組み立てるために、プラスミドpB12から
のG-CSFレセプターＮ−末端側半分のＤＮＡ断片を、Nhe1及びHincIIで消化した
プラスミドpC3に挿入し、プラスミドpCB1を生成した。ヒトG-CSFレセプターの全
長をコードするｃＤＮＡ断片を、哺乳動物発現プラスミドpcDNA3（Invitrogen,
カリフォルニア州カールスバッド）に挿入し、プラスミドpCGF4を生成した。

【００５１】実施例６ G-CSF−依存性マウス及びヒトセルラインの確立及び特徴付けヒト全長G-CSFレセプターを発現するプラスミドpCGF4をBspC1消化により線状
化した後、実施例２において上記したエレクトロポレーションにより、マウスセ
ルライン32D-c123又はヒトセルラインTF-1(ATCC,バージニア州）にトランスフェ
クトした。10% FBS, 0.8 mg/mlのG418、及び1 ng/mlのmIL-3又は1 ng/mlのヒトG
M-CSF（R&D Systems, ミネソタ州ミネアポリス）を添加したRPMI 1640中での増
殖によってトランスフェクタントを選択し、さらに、10% FBS, 0.6 mg/mlのG418
及び1 ng/mlのrhG-CSF(R&D Systems)を含むRPMI培地を用いた、実施例７に記載
するMTTアッセイによってさらに選択した。ヒトG-CSFによって増殖が刺激された
トランスフェクタントは、限界希釈法により単一細胞クローニングした。

【００５２】完全長ヒトG-CSFレセプター発現プラスミドを含むヒト及びマウストランスフ
ェクタントのG-CSFに対する増殖依存性は、実施例７に記載するように、これら
のトランスフェクタントをヒトG-CSF、ヒトGM-CSF又はIL-3の存在下及び非存在
下で増殖させることにより測定した。これらのサイトカインによる、トランスフ
ェクタントの増殖依存性は、実施例７に記載するようにMTTアッセイ及び³H-チミ
ジン取り込みアッセイを用いて監視した。

【００５３】細胞膜表面上にヒトG-CSFRを発現するトランスフェクタントは、FACS分析によ
り確認した。1% BSA含有PBSで洗浄した後、50 lの精製モノクローナル抗体を、
終濃度５μｇ／ｍｌでトランスフェクタント細胞に加えた。細胞混合物を氷上で
３０分間インキュベートし、１５分毎に振盪した。冷PBSで３回洗浄後、FITC結
合ヤギ抗マウスIgG[F(ab')₂]を、1:50希釈でトランスフェクタント細胞に加え、
氷上で３０分間インキュベートした。冷PBSで３回洗浄した後、細胞を１％パラ
ホルムアルデヒドで一夜固定した。これらのmAbが結合するトランスフェクタン
ト細胞の細胞結合パーセンテージは、FACS分析によって分析した。

【００５４】実施例７生体外細胞増殖アッセイ MTT-系比色アッセイ(te Boekhorst P.A., et al., Leukemia 1993, 7:1637-44
)を用いて、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス又はヒトセル
ラインの増殖を刺激する、アゴニスト抗体の能力をスクリーニング及び測定した
。10% FBS及び1 ng/mlのmIL-3を含むRPMI培地中で前培養されたトランスフェク
タント細胞を、10% FBS含有RPMIで３回洗ってmIL-3を除去し、10% FBS含有RPMI
中で2.5 x 10⁴個／ウェルの密度でプレートした。ハイブリドーマプレートから
の上清又は精製抗体を各ウェルに添加した。３日間インキュベートした後、１０
μｌのMTT(ＰＢＳ中2.5 mg/ml、Boehringer-Maimheim Biochemical)を各ウェル
に添加した。６時間インキュベーション後、10% SDS及び0.01 N HClを含む１０
０μｌの溶解溶液を添加して細胞を溶解し、プレートを一夜インキュベートした
。アゴニスト抗体によって刺激されたこれらのG-CSF−依存性細胞の増殖は、OD₅ _40-690 を読むことによって監視することができる。精製抗体のアゴニスト活性を
測定するMTTアッセイでは、rhG-CSF及び抗体は、２倍低減希釈で２系列又は３系
列で希釈を行った。

【００５５】 hG-CSFレセプターでトランスフェクトされた細胞を刺激する、これらのアゴニ
スト抗体の能力は又、³H-チミジン取り込みアッセイを用いて測定することもで
きる。10% FBSを含み、サイトカインを含まない培地で３回洗浄した後、1-2 x 1
0⁴トランスフェクタント細胞（５０μｌ／ウェル）を、RPMI 1640及び10% 透析F
BSとを含む９６−ウェルプレート中で、種々の濃度のmIL-3, rhG-CSF(R&D Biosy
stems)、ハイブリドーマ培養上清又は精製抗体と混合した。４８時間インキュベ
ーション後、細胞を細胞を細胞回収機(Skatron, バージニア州）で回収し、³H-
チミジンの取り込みを、液体シンチレーション分析器で各３回測定した。

【００５６】実施例８ヒトG-CSFレセプターアゴニストモノクローナル抗体の精製ハイブリドーマから生成された抗体を、Prosep-Aアフィニティクロマトグラフ
ィーにより、製造者の指示書(Bioprocessing Inc.,ニュージャージー州プリンス
トン）に従って精製した。ヒトG-CSFアゴニスト抗体の純度を、SDS-PAGE及びウ
ェスタンブロットを用いてチェックした。モノクローナル抗体のうちの２つをmA
b163-93及びmAb174-24-11と命名した。

【００５７】実施例９骨髄コロニー形成アッセイ健康なボランティアから約１０ｍｌのヒト骨髄細胞を採取し、常法によりFico
ll-Paque分離を行った。界面の細胞を注意深くパスツールピペットで回収し、３
倍体積のIMDM+2% FBSに懸濁し、次いで400 gで５分間遠心した。この方法により
、原始細胞が２〜４倍に濃縮された最終の骨髄細胞浮遊液が得られた。なぜなら
、より成熟し、より密度の大きな骨髄細胞は、赤血球と共に除去されるからであ
る。これらのヒトG-CSFRアゴニスト抗体の特異性を測定するために、製造者によ
って提供されたプロトコール(StemCell Technologies Inc.,カナダ国バンクーバ
ー）に従って顆粒球コロニー形成アッセイを行う。ヒト又はチンパンジー骨髄か
らの好中球性顆粒球のコロニー形成を刺激する、アゴニスト抗体の能力及び効率
を定量的に測定するために、異なる濃度の系列のアゴニスト抗体又はrhG-CSFを
２つずつこのアッセイに適用した。図７及び図９に示されるように、アゴニスト
抗体mAb163-93は、rhG-CSF (R&D Biosystems)と同様に、ヒト又はチンパンジー
骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を濃度依存的に刺激する。細胞染色の
結果は、このアゴニストmAbが、どのようにヒト及びチンパンジー骨髄からの好
中球の増殖及び分化を刺激するのかを示している。

【００５８】実施例１０チロシンリン酸化アッセイサイトカイン及びアゴニスト抗体により誘起されるチロシンリン酸化を以下の
ようにして分析した。対数期の約2 x 10⁷個の細胞を回収し、無血清培地で３回
洗浄した後、無血清RPMI培地中で４時間培養して飢えさせた。飢えた細胞を、終
濃度2.6 nMのmIL-3、rhG-CSF(R&D Biosystems)又はアゴニストmAbで刺激し、次
いで、遠心で回収した。細胞を、1 mMのNa₃VO₄、1μＭのペプスタチン、５０μ
Ｍの3,4-ジクロロイソクプマリン(dichloroisocpumarin)、1 mMのフェニルメチ
ルスルホニルフロリド、1 mMの1,10-フェナンスロリン、ロイペプチン(10μg/ml
)及びアプロトニン(10 μg/ml)を添加した0.5 mlの溶解バッファ(50 mN Tris.HC
l, pH7.5/150 mM NaCl/1%(vol/vol)Triton X-100/1 mM EDTAで溶解した。氷上で
３０分間インキュベートした後、溶解物を14,000 rpmで１５分間遠心することに
よって清澄化した。免疫沈降のために、JAK1、JAK2又はStat3(Upstate Biotechn
ology, ニューヨーク州レイクプラシッド）に対するウサギポリクローナル抗体
を清澄化された溶解物に添加し、４℃で２時間インキュベートした。次いで５０
μｌのプロテインＡビーズ(Gibco BRL)を各溶解物に加え、インキュベーション
を４℃で２時間継続した。インキュベーション後、ビーズを溶解バッファで３回
洗浄し、３５μｌのレムリの試料バッファ(62.5 mM Tris:pH7.6, 2% SDS, 10%グ
リセロール及び5% 2-メルカプトエタノール）中に懸濁した。懸濁液を９５℃で
５分間加熱し、4%-7.5% SDS-PAGE上で電気泳動した。ブロッティング後、ブロッ
クされたフィルターを、製造者のプロトコールに従って、HRP-結合マウスモノク
ローナル抗フォスフォチロシン抗体4G10(Upstate Biotechnology)と共にインキ
ュベートした。ＰＢＳ及び0.05% Tween 20含有ＰＢＳで洗浄した後、フィルター
を、製造者の指示書に従ってSuperSignal Substrate kit (Pierce、イリノイ州
ロックフォード）で検出した。該ニトロセルロースフィルターを、抗体及びセイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合第二抗体で上記と同様に再プローブした
。

【００５９】実施例１１ハイブリドーマ細胞からのアゴニスト抗体の可変領域をコードする
ＤＮＡ断片の分析アゴニスト抗体を産生するハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製し、実施例
１に記載したように、RT-PCR反応の鋳型として用いた。これらのＰＣＲ反応に用
いたプライマーは、下記配列番号７〜１４に示されている。ＰＣＲ反応により生
成されたＤＮＡ断片は、クローニングベクターpCR-Blunt (Invitrogen)にクロー
ニングし、製造者の指示書に従って、自動ＤＮＡシーケンサーGenetic Analyzer
310(PE Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて分
析した。２つの別々のRT-PCR反応からの個々の組換えプラスミドを分析し、Ｈ鎖
及びＬ鎖の可変領域のＤＮＡ配列がアゴニスト抗体由来であることを確認した。

【００６０】可変領域のクローニングのために用いたプライマーのＤＮＡ配列 mAb163-93可変領域のクローニングのためのプライマーＬ鎖用 5':MKV7: ATG GGC WTC AAG ATG GAG TCA CAK WYY CWG G（配列番号７） 3':MKC: ACT GGA TGG TGG GAA GAT GG（配列番号８）Ｈ鎖用 5': MHV9: ATG GMT TGG GTG TGG AMC TTG CTA TTC CTG（配列番号９） 3': MHCG1: CAG TGG ATA GAC AGA TGG GGG（配列番号１０）

【００６１】 mAb174-74-11クローニング用プライマーＬ鎖用 5': MKV5: ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTC AGC TTC（配列番号１１） 3': MKC: ACT GGA TGG TGG GAA GAT GG（配列番号１２）Ｈ鎖用 5': MHV4: ATG RAC TTT GGG YTC AGC TTG RTT T（配列番号１３） 3': MHCG2a: CAG TGG ATA GAC CGA TGG GGC（配列番号１４）

【００６２】これらの抗体の可変領域の相補性決定領域は、以下の配列を有することが示さ
れた。 mAb163-93(IgG1サブクラス）、Ｈ鎖可変領域CDR配列： CDR1: Asn Tyr Gly Met Asn（配列番号１５） CDR2: Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys Gl
y（配列番号１６） CDR3: Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr（配列番号１７）

【００６３】 mAb163-93(IgG1サブクラス）、Ｌ鎖可変領域CDR配列： CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Al
a（配列番号１８） CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser（配列番号１９） CDR3: Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr（配列番号２０）

【００６４】 mAb174-74-11(IgG2aサブクラス）、Ｈ鎖可変領域CDR配列： CDR1: Ser Tyr Ala Met Ser（配列番号２１） CDR2: Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys Gl
y（配列番号２２） CDR3: Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr（配列番号２３）

【００６５】 mAb174-74-11(IgG2aサブクラス）、Ｌ鎖可変領域CDR配列： CDR1: Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His（配列番号２４） CDR2: Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser（配列番号２５） CDR3: Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr（配列番号２６）

【００６６】上記した用語、表現、実施例及び具体例は、例示のためだけのもので非限定的
なものであり、本発明の範囲は以下の請求の範囲に規定され、請求の範囲に記載
された発明の全ての均等物を包含する。

【００６７】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Baufu Ni Bill N.C. Sun Cedily R.Y. Sun <120> G-CSF Receptor Agonist Antibodies and Screening Method Therefor <130> 98-3 <140> 09/303,155 <141> 1998-04-30 <150> 60/083,575 <151> 1998-04-30 <160> 27 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

【００６８】 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 1 aagtggtgct atggcaaggc tg 2 2

【００６９】 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 2 cactccagct gtgcccaggt ctt 2 3

【００７０】 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 3 cccccccagc gctagcaata gcaacaagac ctggagg 3 7

【００７１】 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 4 ggaattccta gaagctcccc agcgcctcc 2 9

【００７２】 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 5 aatacgactc actatag 17

【００７３】 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 6 aggtcttgtt gctattgcta gcgctggggg ggcccagg 3 8

【００７４】 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> mouse <220> <223> Artificial primer sequence <400> 7 atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 3 1

【００７５】 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 8 actggatggt gggaagatgg 20

【００７６】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 9 atggmttggg tgtggamctt gctattcctg 3 0

【００７７】 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 10 cagtggatag acagatgggg g 2 1

【００７８】 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 11 atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 3 0

【００７９】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 12 actggatggt gggaagatgg 20

【００８０】 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 13 atgractttg ggytcagctt grttt 2 5

【００８１】 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence <400> 14 cagtggatag accgatgggg c 2 1

【００８２】 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 15 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5

【００８３】 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <400> 16 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly

【００８４】 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> mouse <400> 17 Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

【００８５】 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <400> 18 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15

【００８６】 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> mouse <400> 19 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5

【００８７】 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> mouse <400> 20 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr 1 5

【００８８】 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 21 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5

【００８９】 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <400> 22 Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys 1 5 10 15

【００９０】 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> mouse <400> 23 Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr 1 5 10

【００９１】 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> mouse <400> 24 Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His 1 5 10

【００９２】 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> mouse <400> 25 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

【００９３】 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <400> 26 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr 1 5

【００９４】 <210> 27 <211> 603 <212> PRT <213> human <400> 27 Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser Ala Pro Ile Val His Leu Gly 1 5 10 15 Asp Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile Lys Gln Asn Cys Ser His Leu 20 25 30 Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Glu Leu Gly Pro 35 40 45 Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile 50 55 60 Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu 65 70 75 80 Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala 85 90 95 Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu 100 105 110 Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His 115 120 125 Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys 130 135 140 Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln 145 150 155 160 Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met 165 170 175 Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro 180 185 190 Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met 195 200 205 Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly 210 215 220 Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn 225 230 235 240 Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp 245 250 255 Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys 260 265 270 Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg 275 280 285 Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu 290 295 300 Arg Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg 305 310 315 320 Gln Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val 325 330 335 Pro Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp 340 345 350 Arg Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr 355 360 365 Glu Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala 370 375 380 Leu Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Ser Arg Pro Thr Pro Val Val 385 390 395 400 Phe Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu Thr Arg Leu His Ala Met Ala 405 410 415 Arg Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp 420 425 430 Pro Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser 435 440 445 Asn Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly 450 455 460 Phe Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile 465 470 475 480 Val Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met Gly Pro Ser Gln His Val Tyr 485 490 495 Ala Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser His Ala Pro Glu Leu His Leu 500 505 510 Lys His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro 515 520 525 Pro Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr 530 535 540 Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg 545 550 555 560 Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Ile His 565 570 575 Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr 580 585 590 Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu 595 600

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、MTTアッセイにより測定すると、マウス細胞32D-c123の増殖は、rmI
L-3によってのみ刺激され、rhG-CSFによっては刺激されないことを示す。

【図２】図１Ｂは、32D-c123をヒトG-CSFレセプターの全長でトランスフェクトした後
では、MTTアッセイで測定すると、トランスフェクタントＤ４細胞の増殖は、rmI
L-3及びrhG-CSFにより別々に刺激することができることを示している。

【図３】図１Ｃは、トランスフェクタントＤ４による³H-チミジン取り込みは、mIL-3又
はrhG-CSFを含有する培地で増殖させた場合には濃度依存的に増加するが、コン
トロールmAbを含有する培地で増殖させた場合には増加しないことを示す。

【図４】図２は、rhG-CSFにより誘起された、ヒトG-CSFレセプターの全長でトランスフ
ェクトされたＤ４細胞中でのJAK1キナーゼのチロシンリン酸化を示す。同じJAK1
キナーゼのチロシンリン酸化は、rhG-CSF(R&D Biosystems)の存在下においてさ
え、親細胞32D-c123中では検出されなかった。ポジティブコントロールとしての
、内発性ヒトG-CSFレセプターを発現するヒトG-CSF−応答性細胞AML-193(ATCC N
o. CRL-9589)ではまた、rhG-CSFの刺激によってJAK1キナーゼのチロシンリン酸
化が示された。IP:図に示す抗体での免疫沈降。ブロット：示されるように、HRP
-結合抗体による検出。Anti-pTy: 抗フォスフォチロシン抗体4G10(Upstate Biot
echnology,ニューヨーク州レイクプラシッド）。

【図５】図３は、mAb163-93がG-CSFレセプター／ＩｇＧ４(Fc)キメラ性タンパク質に結
合することをＥＬＩＳＡにより示している。ヒトG-CSFレセプター／ＩｇＧ４(Fc
)は、Immulon 2プレート上にコートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ(Fc)抗体によって捕
捉される。マウス抗体mAb163-93のヒトG-CSFレセプター／ＩｇＧ４(Fc)キメラ
性タンパク質への結合は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ(Fc)の結合により検出された。

【図６】図４Ａは、FACS分析により測定すると、全長ヒトG-CSFレセプターでトランス
フェクトされたマウス細胞Ｄ４への結合パーセンテージは、mAb163-93では濃度
依存的に増加するが、同じアイソタイプのコントロールmAbG3-519では増加しな
いことを示す。

【図７】図４Ｂは、結合細胞パーセンテージにより示すと、mAb163-93は、全長ヒトG-C
SFレセプターを発現するマウス細胞Ｄ４に特異的に結合するが、その親細胞32D-
c123には結合しないことを示す。

【図８】図５Ａ及び図５Ｂは、MTTアッセイで測定した、mAb163-93及びmAb174-74-11を
包含する種々のマウスモノクローナルアゴニスト抗体によって刺激された、ヒト
G-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４の増殖を示す。同じ
アイソトープの、HIV-gpt120に対するmAb G3-519及びrhG-CSF(R&D Biosystems)
をネガティブ及びポジティブコントロールとして設定した。

【図９】図５Ａ及び図５Ｂは、MTTアッセイで測定した、mAb163-93及びmAb174-74-11を
包含する種々のマウスモノクローナルアゴニスト抗体によって刺激された、ヒト
G-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４の増殖を示す。同じ
アイソトープの、HIV-gpt120に対するmAb G3-519及びrhG-CSF(R&D Biosystems)
をネガティブ及びポジティブコントロールとして設定した。

【図１０】図５Ｃは、³H-チミジンの取り込みによって示されるように、mAb163-93及びmA
b174-74-11を包含するモノクローナル抗体のパネルは、ヒトG-CSFレセプターで
トランスフェクトされたマウス細胞Ｄ４の増殖を刺激することができることを示
す。

【図１１】図６Ａ及び６Ｂは、サイトカインrmIL-3、rhG-CSF、及びアゴニスト抗体mAb16
3-93により刺激された、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス
細胞Ｄ４中のキナーゼJAK2（図６Ａ）及び転写因子Stat3（図６Ｂ）のチロシン
リン酸化を示す。

【図１２】図６Ａ及び６Ｂは、サイトカインrmIL-3、rhG-CSF、及びアゴニスト抗体mAb16
3-93により刺激された、ヒトG-CSFレセプターでトランスフェクトされたマウス
細胞Ｄ４中のキナーゼJAK2（図６Ａ）及び転写因子Stat3（図６Ｂ）のチロシン
リン酸化を示す。

【図１３】図７Ａ及び図７Ｂは、ヒト骨髄からの顆粒球のコロニー形成の刺激の定量アッ
セイを示す。図７Ａ：rhG-CSF及びマウスmAb163-93（コントロールmAb G3-519は
、mAb163-93とアイソタイプが同じである）並びに図７Ｂ：他のマウスアゴニス
トmAb。

【図１４】図７Ａ及び図７Ｂは、ヒト骨髄からの顆粒球のコロニー形成の刺激の定量アッ
セイを示す。図７Ａ：rhG-CSF及びマウスmAb163-93（コントロールmAb G3-519は
、mAb163-93とアイソタイプが同じである）並びに図７Ｂ：他のマウスアゴニス
トmAb。

【図１５】図８は、8A:アイソタイプが同じコントロールmAb G3-519; 8B: rhG-CSF(R&D B
iosystems)； 8C: モノクローナルアゴニスト抗体mAb163-93により刺激されたヒ
ト骨髄からの好中球性顆粒球のコロニー形成を示し、8Dは、8Cのコロニーからピ
ックアップされた細胞の細胞染色後の形態を示す。

【図１６】図９は、mAb163-93が、チンパンジー骨髄からの顆粒球のコロニー形成を濃度
依存的に刺激することができることを示す。

【図１７】図１０は、10A: 濃度50 nMの同じアイソタイプのモノクローナル抗体G3-519;
10B: 濃度0.5 nMのrhG-CSF(R&D Biosystems); 10C: 濃度5 nMのモノクローナル
アゴニスト抗体mAb163-93により刺激された、チンパンジー骨髄からの好中球性
顆粒球のコロニー形成を示し、10Dは、Cのコロニーからピックアップされた細胞
の細胞染色後の形態を示す。

【図１８】図１１は、ヒトG-CSFレセプターに対するアゴニストmAb163-93が、内発性マウ
スG-CSFレセプターを発現するマウス細胞NFS60の増殖を刺激することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/535 Ｃ０７Ｋ 14/535 14/715 14/715 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｐ 21/08 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 (Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者サン・セシリー・アール・ワイアメリカ合衆国テキサス州 77041 ベルエアウェルフォードドライブ 4901

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトG-CSFレセプターに特異的に結合し又はこれと相互作用
し、細胞の増殖及び分化を刺激するアゴニスト分子。
【請求項２】好中球又はその前駆細胞の増殖及び分化を刺激する請求項１
記載のアゴニスト分子。
【請求項３】ヒトG-CSFレセプターに特異的に結合し又はこれと相互作用
し、該レセプターを二量化し又は該レセプターと関連するキナーゼのリン酸化を
活性化して細胞増殖及び分化を刺激するアゴニスト分子。
【請求項４】ネイティブヒトG-CSFレセプター又は置換、挿入若しくは欠
失を有するその突然変異体である請求項１記載のヒトG-CSFレセプター。
【請求項５】ヒトG-CSFレセプターの細胞外部分と相互作用する請求項１
又は３記載のアゴニスト分子。
【請求項６】 G-CSFレセプターのアミノ酸残基1-603（配列番号２７）の間
の領域と相互作用する請求項５記載のアゴニスト分子。
【請求項７】請求項４記載のヒトG-CSFレセプターの細胞外部分である、
請求５記載のヒトG-CSFレセプターの細胞外部分。
【請求項８】モノクローナル抗体若しくはその断片、同族体若しくは類似
体、又はペプチド又は有機化合物である請求項１又は３記載のアゴニスト分子。
【請求項９】 F(ab)'₂, Fab又はscFvである請求項６記載の断片。
【請求項１０】 mAb163-93及びmAb174-74-11を包含する請求項８のモノク
ローナルアゴニスト抗体。
【請求項１１】モノクローナル抗体mAb163-93又はmAb174-24-11のいずれ
かと同じエピトープに結合するアゴニスト分子。
【請求項１２】生体外増殖アッセイにより測定されるヒトG-CSFレセプタ
ーを発現するヒト又はマウス細胞の増殖を刺激することができる請求項１又は３
記載のアゴニスト分子。
【請求項１３】ＩｇＧ１サブクラスに属し、Ｈ鎖の可変領域のCDRが以下
の１若しくは複数のアミノ酸配列、 CDR1: Asn Tyr Gly Met Asn （配列番号１５） CDR2: Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Phe Lys Gl
y （配列番号１６） CDR3: Glu Gly Phe Tyr Gly Gly His Pro Gly Phe Asp Tyr （配列番号１７）又はＬ鎖の可変領域のCDRが以下の１若しくは複数のアミノ酸配列、 CDR1: Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
（配列番号１８） CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser （配列番号１９） CDR3: Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr （配列番号２０）を包含する、請求項１０のモノクローナルアゴニスト抗体mAb163-93。
【請求項１４】ＩｇＧ２ａサブクラスに属し、Ｈ鎖の可変領域のCDRが以
下の１若しくは複数のアミノ酸配列、 CDR1: Ser Tyr Ala Met Ser（配列番号２１） CDR2: Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Gly Thr Leu Lys（
配列番号２２） CDR3: Glu Ala Tyr Asn Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr（配列番号２３）又はＬ鎖の可変領域のCDRが以下の１若しくは複数のアミノ酸配列、 CDR1: Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Val His（配列番号２４） CDR2: Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser（配列番号２５） CDR3: Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr（配列番号２６）を包含する、請求項１０のモノクローナルアゴニスト抗体mAb174-74-11。
【請求項１５】請求項８記載のモノクローナルアゴニスト抗体若しくはそ
の断片、同族体若しくは類似体、又はペプチドを産生するハイブリドーマセルラ
イン。
【請求項１６】ハイブリドーマセルライン163-93又は174-74-11である請
求項１３記載のハイブリドーマセルライン。
【請求項１７】請求項８記載のモノクローナルアゴニスト抗体若しくはそ
の断片、同族体若しくは類似体、又はペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１８】請求項８記載のモノクローナルアゴニスト抗体若しくはそ
の断片、同族体若しくは類似体、又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を遺伝子
デリバリーシステム。
【請求項１９】配列番号１５ないし２６に示されるＤＮＡ配列の１又は複
数を含む遺伝子デリバリーシステム。
【請求項２０】前記システムは、ウイルスベクター、プラスミド又は非ベ
クターデリバリーシステムを包含する請求項１６記載の遺伝子デリバリーシステ
ム。
【請求項２１】請求項１ないし３のいずれか１項に記載された分子を投与
することを含む好中球減少症の治療方法。
【請求項２２】請求項５記載の分子を投与することを含む好中球減少症の
治療方法。
【請求項２３】請求項８記載の分子を投与することを含む好中球減少症の
治療方法。
【請求項２４】分子がG-CSF依存性細胞の増殖を刺激することができるか
否かを調べることを含む、分子のG-CSFアゴニスト活性をスクリーニングする方
法。
【請求項２５】生体外アッセイを用いて測定を行う請求項２２記載の方法
。
【請求項２６】アッセイ方法が、G-CSFレセプターを発現する細胞を用い
たMTT系比色アッセイ又は³H-チミジン取り込みアッセイである請求項２３記載の
方法。
【請求項２７】 G-CSFレセプターの細胞外領域又はその一部の配列を有す
るタンパク質又はその断片を細胞膜表面上に発現する請求項２２記載のG-CSF依
存性細胞。
【請求項２８】請求項８記載の抗体によりヒトG-CSFレセプターを免疫学
的に検出する方法。
【請求項２９】請求項８記載の抗体による、細胞表面上にヒトG-CSFレセ
プターを発現する細胞の免疫学的検出方法。
【請求項３０】請求項８記載の抗体により、可溶性ヒトF-CSFレセプター
を免疫学的に検出及び測定する方法。