JP2002510207A - 拡張された開裂ルールを有するハンマーヘッドリボザイム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＲＮＡ切断活性を持っている組成物、ならびにインビトロおよびインビボにおいてＲＮＡ基質を切断するためのそれらの使用が開示されている。組成物は活性中心(そのサブユニットはヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体から選択される)、ならびにＲＮＡ基質との特異的なハイブリダイゼーションの形成に寄与する隣接領域を含んでいる。好適な組成物は、ＲＮＡ基質と組み合わされてハンマーヘッド構造に似ている構造を形成する。開示された組成物の活性中心は、Ｃ^16.1を持っているＲＮＡ基質の切断を可能にするＩ^15.1の存在により特徴付けられる。

Description

【発明の詳細な説明】 拡張された開裂ルールを有するハンマーヘッドリボザイム 発明の背景 本発明はＲＮＡ開裂活性を有する組成物の技術分野にある。 ハンマーヘッドリボザイムはある特定のＲＮＡ基質を認識して開裂することが できる触媒性ＲＮＡ分子の例である(Ｈｏｔｃｈｉｎｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３６２７(１９８６)；ＫｅｅｓｅとＳｙｍｏｎｓ，Ｖ ｉｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｉｄ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（Ｊ．Ｊ ．Ｓｅｍａｎｃｈｉｋ，ＣＲＣプレス、ボカレイトン、フロリダ、１９８７，１ 〜４７頁)。ハンマーヘッドリボザイムの触媒中心は３つのステムが側面に位置 し、近接したＲＮＡの配列領域又は多くのヌクレオチドによって互いに分離され た領域によって形成され得る。図１はそのような触媒活性のあるハンマーヘッド 構造の概略図を示す。ステムはＩ，ＩＩ及びＩＩＩと表示されている。ヌクレオ チドはハンマーヘッドリボザイムの標準的な命名法に準じて数えられる(Ｈｅｒ ｔｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３２５２(１９９２)) 。この命名法では、塩基は、開裂部位の５’側に関するその位置に関連する数に よって表記される。さらに、ステム又はループ領域に含まれる各塩基は、ステム 又はループ内部のその塩基の位置を定義する追加的な表記（小数点と別の数によ って表記される）を有する。Ｎ^11.3という表記は、この塩基が対合領域に含まれ ていて、コア領域から離れたステムの第３番目の塩基であるということを示す。 ハンマーヘッド由来のリボザイムを記載するこの受け入れられた約定によれば、 酵素のコア部分に含まれているヌクレオチドが、他のすべてのヌクレオチドに関 連して、いつでも同一のナンバーを有するようになる。基質結合又はコア形成に 関わるステムのサイズは任意のサイズ及び任意の配列であり得るし、例えばＡ⁹ という位置は、他のコアヌクレオチドのすべてに関して同一であろう。例えば、 Ｎ＾¹²又はＮ⁹＾と表記されたヌクレオチドは、挿入されたヌクレオチドを表し 、数字に関する脱字呼号（＾）の位置はその挿入が指定されたヌクレオチドの前 か後かを示す。従って、Ｎ＾¹²は、ヌクレオチド１２位の前に挿入されたヌクレ オチ ドを表し、Ｎ⁹＾はヌクレオチド９位の後に挿入されたヌクレオチドを表す。 この触媒コア構造のコンセンサス配列は、ＲｕｆｆｎｅｒとＵｈｌｅｎｂｅｃ ｋ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６０２５〜６０２９(１９９ ０)）に記載されている。一方Ｐｅｒｒｉｍａｎら（Ｇｅｎｅ １１３：１５７ 〜１６３(１９９２)）は、この構造が変異（例えばＮ⁹＾及びＮ＾¹²のような天 然に存在するヌクレオチド挿入）をも含有し得ることを示した。従って、タバコ 輪紋（ｒｉｎｇ-ｓｐｏｔ）ウイルスのサテライトＲＮＡのポジティブ（＋）鎖 がこの２つのヌクレオチド挿入を１つも含有しないのに対し、ル−セールン・ト ランジェント・ストリーク（ｌｕｃｅｒｎｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔｒｅａ ｋ）ウイルスのウイルソイド（ｖＬＴＳＶ）は、活性を失うことなくＣ又はＧへ 突然変異し得るＮ⁹＾＝Ｕの挿入を含有する(ＳｈｅｌｄｏｎとＳｙｍｏｎｓ，Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５６７９〜５６８５(１９８９))。 さらに、この特殊なケースでは、Ｎ⁷＝Ａであり、Ｒ^15.1＝Ａである。一方、カ ーネーション楼化病に関連するウイルソイド（−ＣａｒＳＶ）のマイナス鎖は、 Ｎ＾¹²＝Ａ及びＮ⁹＾＝Ｃという両方のヌクレオチド挿入を含有する点できわめ て珍しい(Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０ ：６３２３〜６３２９(１９９２))。このウイルソイドでは、Ｎ⁷＝Ａであり、Ｒ^15.1 ＝Ａである。さらに、この特別なハンマーヘッド構造は、中心ステムがより 開いているにもかかわらず、大変有効な自己触媒開裂を示す。 ハンマーヘッドリボザイムの可能な使用は、例えば、ＲＮＡ制限酵素の産生及 び、例えば動物、ヒト又は植物の細胞及び原核生物、酵母及びマラリア原虫にお ける遺伝子発現の特異的な不活性化を包含する。格別な生物医学的関心は、多く の形態の腫瘍を包含する多くの疾患が特定遺伝子の過剰発現に関連しているとい う事実に基づいている。関連するｍＲＮＡを開裂してそのような遺伝子を不活性 化することは、そのような疾患を抑制し、最終的には治療するための可能な方法 を具現化する。さらに、抗ウイルス薬、抗菌薬及び抗真菌薬を開発することに対 する高いニーズがある。リボザイムがそのような抗感染症薬として潜在価値を有 するのは、微生物の生存に必須であるＲＮＡ分子を選択的に破壊し得るからであ る。 ハンマーヘッドベースリボザイムの薬剤としての使用における最大の障害の１ つは、通常のゲルラッハ（Ｇｅｒｌａｃｈ）設計では、及び前もって形成された 半ハンマーヘッド構造をターゲットにするときには、受容されるターゲットのア ベイラビリティが限定されていることである(ＷＯ９７／１８３１２を参照のこ と)。ハンマーヘッドリボザイムの基質は、基質結合のために正確なハイブリダ イズ配列を必要とすることに加えて、トリプレットＮ^16.2Ｕ^16.1Ｈ¹⁷（Ｎは任意 のヌクレオチド、Ｕはウリジン、Ｈはアデノシン、シチジン又はウリジンである ）を強く選好することが示されている(Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ．２２８，２２８〜２３０(１９８８)；Ｒｕｆｆｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ２９，１０６９５〜１０７０２(１９９０)；Ｐｅｒｒｉｍａｎら、Ｇｅ ｎｅ １１３：１５７〜１６３(１９９２))。この基質特異性の一般則を変更す ると、非機能的な基質が生じるという事実は、上記の必要条件から逸脱した基質 が提供されるときに形成される「非コア適合性」の構造が存在することを示唆す る。このことに関連した証拠がＵｈｌｅｎｂｅｃｋと共同研究者によって最近報 告された(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１１０８〜１１１４(１９９７))。 １７位のＧを置換すると、Ｇ¹⁷とＣ³間に機能的に致命的な塩基対が形成され、 開裂のための切れやすい（ｓｃｉｓｓｉｌｅ）結合の正確な配向性とＣ³の相互 作用に必要な三次構造の形成が妨害されることを実証したのである(Ｍｕｒｒａ ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１：４８７〜４９４(１９９５))。同様の理由 で１６．１位のＵに対する強い選好性が存在し得る。１６．１位のＵ要求性を効 率的に軽減し得るリボザイムを単離することを試みた多くの実験がなされてきた が、１６．１位にＵ以外の塩基を有する基質を開裂し得るハンマーヘッド型リボ ザイムを見出そうとする試みは、不可能であることが証明された(Ｐｅｒｒｉｍ ａｎら、Ｇｅｎｅ １１３：１５７〜１６３(１９９２))。 開裂領域における要求性が減少又は変更した効率的な触媒分子が強く所望され るのは、それらが単離されればこのタイプの分子が開裂し得る利用可能なターゲ ット配列の数を大いに増加させるからである。例えば、Ｎ^16.2Ｕ^16.1Ｈ¹⁷以外の トリプレットを含有する基質を効率的に開裂し得るリボザイム変異体を得ること が所望されるのは、それが潜在的なターゲット開裂部位の数を増加し得るから である。 分子の中央領域にデオキシリボヌクレオチドの塊を含有する化学修飾されたオ リゴヌクレオチドは、遺伝子発現を特異的に不活性化する薬剤としての潜在可能 性を有する(Ｇｉｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：７６ ３〜７７０(１９９２))。これらオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡに結合したＲＮ Ａ鎖がＲＮアーゼＨによって分解されるハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形 成し得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの開裂を促進すると考えら れ、ＲＮＡ開裂活性を有するか又はＲＮＡ分子を開裂するものとして（開裂する のはＲＮアーゼＨである）は特徴づけられない。これらオリゴヌクレオチドのｉ ｎ ｖｉｖｏ応用に対する重要な欠点はその低い特異性であり、ハイブリッド形 成及び開裂がＲＮＡ分子上の所望されない部位でも起こり得ることである。 適切な遺伝子で細胞をトランスフェクトすることによって触媒活性のあるＲＮ Ａ分子を細胞内で組換え技術により発現させようとしたかつての試みは、特定の ＲＮＡ基質を不活性化するのに非常に高い発現量が必要とされるのであまり有効 でないことが証明された。さらに、今日市販されているベクター系は概して応用 し得ない。さらに、非修飾リボザイムは、ＲＮアーゼによる分解に対するＲＮＡ の感受性及びそのタンパク質との相互作用のために直接投与することはできない 。従って、ハンマーヘッドリボザイムを体外から投与するためには、化学的に修 飾した活性物質を使用しなければならない(例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１３１〜２１３８(１９９４)；Ｋｉｅｈ ｎｔｏｐｆら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４６４５〜４６５２(１９９４)；Ｐａｏｌ ｅｌｌａら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１９１３〜１９１９(１９９２)；及びＵｓｍ ａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３〜１６ ４（１９９４）によって論じられている)。 米国特許第５，３３４，７１１号は、核酸ターゲット配列を開裂するのに好適 で所望により置換された１〜１０の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又は アルキニル基をリボースの２'−Ｏ原子に含有する修飾ヌクレオチドを含有する 、３５〜４０ヌクレオチド長の合成触媒オリゴヌクレオチド構造に基づいた、そ のような化学修飾した活性物質を記載する。これらオリゴヌクレオチドは修飾ヌ ク レオチドの構築ブロックを含有し、ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。 これらオリゴヌクレオチドは特定のＲＮＡ基質を開裂することができる。 ハイブリダイゼーションアーム又は活性中心に数多くのデオキシリボヌクレオ チドを使用すると、所望のターゲット配列に関連した配列も開裂され得るので、 ＲＮアーゼＨの活性化により特異性の欠失につながる場合がある。さらに、触媒 性ＤＮＡオリゴマーは、タンパク質と相互作用し、ヌクレアーゼ分解に対する抵 抗性が無いために、ｉｎ ｖｉｖｏ応用に特に適してはいない。 従って、ＲＮＡを開裂する組成物を提供すること、特に、高い安定性、活性及 び特異性を同時に有するＲＮＡ開裂オリゴマーを提供することが本発明の目的で ある。 Ｎ^16.2Ｕ^16.1Ｈ¹⁷以外の開裂部位トリプレットを有するＲＮＡ基質を開裂する 組成物を提供することも本発明のもう１つの目的である。 発明の概要 開示されるのは、ＲＮＡ開裂活性を有する組成物、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及 びｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ基質を開裂するためのその使用である。この組成物は 、活性中心（このサブユニットはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ から選択される）及びＲＮＡ基質との特異的ハイブリダイゼーションの形成に寄 与するフランキング（flanking）領域を含有する。好ましい組成物は、ＲＮＡ基 質と組合わさって、ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。開示組成物の活 性中心は、Ｃ^16.1を有するＲＮＡ基質の開裂を可能にするＩ^15.1の存在によって 特徴付けられる。 図表の簡単な説明 図１は、ハンマーヘッド構造及び対応する命名法（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） の概略図である。Ｈ¹⁷とＮ^1.1の間で開裂が起こり、Ｈ¹⁷に２’，３’−サイク リックリン酸を産生する。 図２は、ＲＮＡ基質を開裂するオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の１例 と結合したＲＮＡ基質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の概略図である。このオリゴ マーと基質によって形成される構造はハンマーヘッドリボザイムの構造に似てい る。このケースでは、基質がステムＩ及びＩＩＩの半分を構成し、ループＩ及び ＩＩＩは存在していない。開裂はＨ¹⁷の３’で起こる。 図３は、ハンマーヘッドリボザイム（上）におけるＡ^15.1−Ｕ^16.1塩基対の相 互作用及び、Ａ^15.1−Ｕ^16.1塩基対を置換したＩ^15.1−Ｃ^16.1塩基対（下）の予 測されるイソ構造上の相互作用を示す概略図である。 図４Ａは、短い５’−フルオレセインで標識されておりＧＣＡ部位を含有する オリゴリボヌクレオチド基質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を、Ｎ⁷の位置に様々 なヌクレオ塩基（Ｕ、Ｃ、Ａ及びＧ；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２２ 、２３及び２４である）をそれぞれ含有する４種の２’−Ｏ−アリル化５−リボ 触媒オリゴマーの変異体で、開裂したときの時間（分）に対する開裂生成物分画 のグラフである。 図４Ｂは、短い５’−フルオレセインで標識されておりＧＣＡ部位を含有する ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のオリゴリボヌクレオチド基質を、Ｎ⁷の位置に様々な ヌクレオ塩基又は塩基アナログ（Ｕ、５−ニトロインドール、Ｉ及びキナゾリン −２，４−ジオン；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２７、２５及び２６で ある）をそれぞれ含有する４種の２’−Ｏ−アリル化５−リボ触媒オリゴマーの 変異体で、開裂したときの時間（分）に対する開裂生成物分画のグラフである。 発明の詳細な説明 開示されるのは、ＲＮＡ開裂活性を有する組成物、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及 びｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ基質を開裂するためのその使用である。この組成物は 、活性中心（このサブユニットはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ から選択される）及びＲＮＡ基質との特異的ハイブリダイゼーション形成に貢献 するフランキング領域を含有する。好ましい組成物は、ＲＮＡ基質と組合わさっ て、ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。開示組成物の活性中心は、Ｃ^{16 .1} を有するＲＮＡ基質の開裂を可能にするＩ^15.1の存在によって特徴付けられる 。 天然に存在するハンマーヘッドリボザイムはすべてＡ^15.1−Ｕ^16.1塩基対を有 する。さらに、コンセンサスハンマーヘッド配列に基づいたリボザイムの基質 は、Ｎ^16.2Ｕ^16.1Ｈ¹⁷トリプレット（Ｈ¹⁷はグアノシンではない）を含有する基 質を強く選好することが知られている(Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ．２２８，２２８〜２３０(１９８８)；Ｒｕｆｆｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ２９，１０６９５〜１０７０２(１９９０)；Ｐｅｒｒｉｍａｎら、Ｇｅ ｎｅ １１３：１５７〜１６３(１９９２))。１６．１位のＵ要求性を効率的に 軽減し得るリボザイムを単離することを試みた多くの実験がなされてきたが、１ ６．１位にＵ以外の塩基を有する基質を開裂し得るリボザイムを見出そうとする 試みは不可能であることが証明された(Ｐｅｒｒｉｍａｎら、Ｇｅｎｅ １１３ ：１５７〜１６３(１９９２)；Ｓｉｎｇｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６５〜１ ６８(１９９６))。 しかしながら、最近公表されたＸ線結晶構造（Ｐｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３ ７２：６８〜７４(１９９４)、ｓｃｏｔｔら、Ｃｅｌｌ ８１：９９１〜１００ ２(１９９５)及びＳｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：２０６５〜２０６９ (１９９６))を検討すると、このＡ^15.1−Ｕ^16.1相互作用はアデノシンの環外ア ミン（Ｎ６）とウリジンの４−オキソ基とが単一の水素結合をした非標準的な塩 基対であることが理解された。次いで（結晶構造に基づいた）モデリング研究か ら、この野生型Ａ^15.1−Ｕ^16.1塩基対の相互作用は、イソ構造的な配向性をとり 、Ｃ^16.1の２−ケト基とウリジンターンのＡ⁶との要求される接触を保存するＩ^{1 5.1} −Ｃ^16.1塩基対での置換によって空間的に模倣し得ることが発見された。こ のモデルでは、１５．１位と１６．１位との間の安定化される水素結合の極性が Ｉ^15.1−Ｃ^16.1相互作用において逆転しているが、この結合付近にある塩基の正 確な配向性は維持される。 １５．１位にイノシンを含有するゲルラッハ型リボザイムアナログがＮ^16.2Ｃ^16.1 Ｈ¹⁷トリプレットを含有するＲＮＡ基質を容易に開裂することが発見されて いる。このことに基づいて、Ｎ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷トリプレットを含有する核酸のタ ーゲット配列を開裂する組成物、好ましくは合成オリゴマーが開示される。Ｈ¹⁷ はグアノシンでないことが好ましい。Ｎ^16.2Ｃ^16.1Ｘ¹⁷トリプレットを有する基 質を開裂する能力により、開示されるタイプの組成物により開裂されるタ ーゲットの数は効果的に倍となる。 ＲＮＡ開裂活性を有する組成物 特に開示されるのはＲＮＡ基質を開裂する組成物であり、ここでその組成物は 成分（ａ）及び（ｂ）を包含し、成分（ａ）は５’−Ｚ₁−Ｚ₂−３’という構造 を包含し、成分（ｂ）は５’−Ｚ₃−Ｚ₄−３’という構造を包含する。成分（ａ ）及び（ｂ）は別個の分子であり得るか又は共有結合され得る。成分（ａ）及び （ｂ）における要素Ｚ₁及びＺ₄は、それぞれヌクレオチド、ヌクレオチドアナロ グ又は両者の組み合わせからなるオリゴマー配列であるか、又はオリゴヌクレオ チドアナログである。要素Ｚ₁及びＺ₄のオリゴマー配列は、ＲＮＡ基質と好まし くはハイブリダイゼーションによって特異的に相互作用する。 これらの好ましい組成物において、要素Ｚ₂は以下のいずれかの構造を有し、 ５’−Ｘ³Ｘ⁴Ｘ⁵Ｘ⁶Ｘ⁷Ｘ⁸Ｘ⁹−３’又は ５’−Ｘ³Ｘ⁴Ｘ⁵Ｘ⁶Ｘ⁷Ｘ⁸Ｘ⁹Ｘ⁹＾−３’ 要素Ｚ₃は以下のいずれかの構造を有する： ５’−Ｘ¹²Ｘ¹³Ｘ¹⁴Ｘ^15.1−３’又は ５’−Ｘ＾¹²Ｘ¹²Ｘ¹³Ｘ¹⁴Ｘ^15.1−３’ これらの好ましい組成物における要素Ｚ₂及びＺ₃は、ヌクレオチド、ヌクレオ チドアナログ又は両者の組み合わせからなる。要素Ｚ₂及びＺ₃におけるヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログはそれぞれ以下の構造を有する。 構造式（Ｉ）において、各Ｂは、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、 グアニン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチ ン−９−イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジ アミノプリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、 ７−デアザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロ ピニルウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９− イル、６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリ ミドン−１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９− イル、Ｎ²−ジメチルグアニン−９−イル又はそれらの機能的同等物であり； 各Ｖは、Ｏ、Ｓ，ＮＨ又はＣＨ₂基であり得る。 各Ｗは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ₂、−ＣＯＮＨＲ¹、−ＣＯＮ Ｒ¹Ｒ²、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＣＯＲ¹、−ＳＨ、−ＳＲ¹、 −Ｆ、−ＯＮＨ₂、−ＯＮＨＲ¹、−ＯＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＯＲ¹、− ＮＲ²ＯＨ、−ＮＲ²ＯＲ¹、置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀の 直鎖又は分岐アルキル、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルケニル、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルキニル、置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルコキシ、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルケニルオキシ、及び置換されているか又は置換されていないＣ₂ 〜Ｃ₁₀の直鎖又は分岐アルキニルオキシであり得る。Ｗ基の置換基は、独立して ハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキサミド 、ヒドロキシ又はメルカプトである。Ｒ¹及びＲ²は置換されているか又は置換さ れていないアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり得て、ここで置換基は 独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボ キサミド、ヒドロキシ又はメルカプトである。 Ｄ及びＥは、隣接したヌクレオシド又はヌクレオシドアナログとの間にホスホ ジエステル又はホスホロチオエートジエステル結合を一緒に形成するか又はヌク レオシド間結合のアナログを一緒に形成する残基である。 Ｂは、Ｘ^15.1においてはヒポキサンチン−９−イル又はその機能的同等物であ り；Ｘ⁵、Ｘ⁸及びＸ¹²においてはグアニン−９−イル、ヒポキサンチン−９−イ ル又は７−デアザグアニン−９−イルでありえ；Ｘ⁶、Ｘ⁹、Ｘ¹³及びＸ¹⁴におい てはアデニン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、プリン−９−イ ル又は７−デアザアデニン−９−イルでありえ；Ｘ⁴においてはウラシル− １−イル、ウラシル−５−イル、チミン−１−イル又は５−プロピニルウラシル −１−イルでありえ；Ｘ³においてはシトシン−１−イル、５−メチルシトシン −１−イル又は５−プロピニルシトシン−１−イルでありえ；Ｘ⁷、Ｘ⁹＾及びＸ ＾¹²においてはアデニン−９−イル、シトシン−１−イル、グアニン−９−イル 、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、チミ ン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジアミノプリン−９− イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、７−デアザグアニン −９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロピニルウラシル−１ −イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル、６−メチルウ ラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリミドン−１−イル、 キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９−イル、Ｎ²−ジメチ ルグアニン−９−イル又はそれらの機能上の同等物でありえる。Ｘ^15.1のＢは、 好ましくはヒポキサンチン−９−イル、又はこの塩基の２位における任意の基と Ｃ^16.1の２−オキソ基との間に水素結合を形成し得ない類似体である。好ましく は、ＢはＸ^15.1においてグアニン−９−イルではない。 Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁵、Ｘ⁶、Ｘ⁷、Ｘ⁸、Ｘ⁹、Ｘ¹²、Ｘ¹³及びＸ¹⁴におけるＢは、ハ ンマーヘッドリボザイムの触媒中心に存在する機能的に同等なヌクレオ塩基でも あり得る。例えば、ハンマーヘッドリボザイムのＣ³、Ｕ⁴、Ｇ⁵及びＡ⁶は、ｔＲ ＮＡのウリジンターンに酷似した構造を形成する(Ｐｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６８〜７４(１９９４))。他のヌクレオチド基もウリジンターンを形成 し得るので、ヌクレオチドＸ³、Ｘ⁴、Ｘ⁵、Ｘ⁶は、ウリジンターンに似た構造を 形成する潜在可能性を有するヌクレオチド又はヌクレオチドアナログにより１つ のグループとして置換される可能性がある。同様に、ハンマーヘッドリボザイム の触媒コアにあるせん断された塩基対は、他の非標準的な塩基対の相互作用に似 ていてもよい相互作用を有する。ハンマーヘッドリボザイムの触媒コアに関する 結晶構造の知識は、非標準的な塩基対がイソ構造的な非標準塩基対で置換された ゲルラッハ型のハンマーヘッドリボザイムが活性であるという発見とともに、同 様のイソ構造的な塩基対置換が触媒コアのどこかで可能であることを示している 。 定義 本明細書で使用されるように、オリゴマーとは、同一のクラス（ヌクレオチド のような）又は異なるクラス（ヌクレオチドとエチレングリコールのような）の 混合物であり得るサブユニットからなるオリゴマー分子を呼ぶ。開示されるオリ ゴマーは、オリゴマー配列、非ヌクレオチドリンカー又はオリゴマー配列と非ヌ クレオチドリンカーとの組み合わせであることが好ましい。開示されるオリゴマ ーはオリゴマー配列であることがより好ましい。オリゴマー配列は、サブユニッ トのそれぞれが塩基特異的なやり方で他のオリゴマー配列と相互作用し得るヌク レオ塩基（即ち、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの塩基部分）を包含す るオリゴマー分子である。核酸鎖のハイブリダイゼーションはそのような塩基特 異的な相互作用の好ましい例である。オリゴマー配列は好ましくはヌクレオチド 、ヌクレオチドアナログ又はその両方から構成されるか又はオリゴヌクレオチド アナログである。 非ヌクレオチドリンカーは、オリゴマー配列ではなくて、オリゴマー配列と共 有結合し得る任意の分子であり得る。好ましい非ヌクレオチドリンカーは非ヌク レオチドサブユニットから形成されるオリゴマー分子である。そのような非ヌク レオチドリンカーの例は、ＬｅｔｓｉｎｇｅｒとＷｕ(Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ ｏｃ．１１７：７３２３〜７３２８(１９９５))、Ｂｅｎｓｅｌｅｒら(Ｊ．Ａｍ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８４８３〜８４８４(１９９３))及びＦｕら(Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４５９１〜４５９８(１９９４))によって記 載されている。好ましい非ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーの サブユニットは、置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀の直鎖又は 分岐アルキル、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直鎖又は分 岐アルケニル、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直鎖又は分 岐アルキニル、置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀の直鎖又は分 岐アルコキシ、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直鎖又は分 岐アルケニルオキシ、及び置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の 直鎖又は分岐アルキニルオキシを包含する。これらの好ましい非ヌクレオチドリ ンカー（又はサブユニット）の置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキ シ、エステル、エーテル、カルボキサミド、ヒドロキシ又はメルカプトであり得 る。 本明細書で使用されるように、ヌクレオシドとは、アデノシン、グアノシン、 シチジン、ウリジン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、 ２’−デオキシシチジン又はチミジンを呼ぶ。ヌクレオシドアナログとはヌクレ オシドの塩基又は糖部分のどこかの部位に化学修飾を含有するヌクレオシドの化 学修飾した形態である。本明細書で使用されるように、ヌクレオシドアナログと いう用語は、例えばイノシンやシュードウリジンのような天然に存在する修飾さ れたヌクレオシドに基づいたヌクレオシドアナログと、糖の２’位への修飾のよ うな他の修飾を有するヌクレオシドアナログの両方を網羅する。本明細書で使用 されるように、ヌクレオチドとは上記のようなヌクレオシドのリン酸誘導体をよ び、ヌクレオチドアナログは上記のようなヌクレオシドアナログのリン酸誘導体 である。ペプチド核酸のようなオリゴヌクレオチドアナログのサブユニットもヌ クレオチドアナログであると考えられる。 本明細書で使用されるように、リボヌクレオチドは、２’ヒドロキシル基を有 するヌクレオチドである。同様に、２’−デオキシリボヌクレオチドは、２’水 素のみを有するヌクレオチドである。従って、本明細書で使用されるリボヌクレ オチド及びデオキシリボヌクレオチドとは、化学修飾されていないヌクレオシド 成分のアデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジン、又は２’−デオキシア デノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン及びチミジンを それぞれ有する天然に存在するヌクレオチドをよぶ。リボヌクレオシド、デオキ シリボヌクレオシド、リボヌクレオシドアナログ及びデオキシリボヌクレオシド アナログは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログに見出されるリン酸基又は リン酸基のアナログを欠いたものとして同様に定義される。 本明細書で使用されるように、オリゴヌクレオチドアナログとは、配列依存的 なハイブリダイゼーションのような核酸様の性質を有し、標準的なＲＮＡ又はＤ ＮＡヌクレオチドから離れる修飾を１つ又はそれ以上の部位に含有する、核酸様 物質のポリマーである。オリゴヌクレオチドアナログの好ましい例はペプチド核 酸である。 本明細書で使用されるように、塩基対とは１つ又はそれ以上の水素結合を介し て相互作用するヌクレオチド又とはヌクレオチドアナログの対を呼ぶ。塩基対と いう用語は、ワトソン−クリック型塩基対として一般に特徴付けられる相互作用 に限定されず、非標準的な又はせん断された塩基対の相互作用を包含する(Ｔｏ ｐａｌとＦｒｅｓｃｏ、Ｎａｔｕｒｅ ２６３：２８５(１９７６)；Ｌｏｍａｎ ｔとＦｒｅｓｃｏ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．１５：１８５(１９７５))。従って、ヌクレオチドＡ^15.1及びＵ^16.1はハンマ ーヘッドリボザイムにおいて塩基対を形成する（図１参照）が、この塩基対は非 標準的である（図３参照）。 ２つのヌクレオシドのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合又はホス ホロチオエート基又は、例えば米国特許第５，３３４，７１１号に記載された他 の結合のような修飾されたホスホ結合によって達成され得る。 フランキング要素Ｚ₁及びＺ₄ （要素Ｚ₂及びＺ₃によって形成される）活性中心に隣接する要素Ｚ₁及びＺ₄の モノマーサブユニットは、好ましくはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナ ログである。要素Ｚ₁及びＺ₄は、所定のＲＮＡ基質と好ましくはハイブリダイゼ ーションによって特異的に相互作用し、活性中心のＺ₂及びＺ₃とともにＲＮＡ基 質を特異的に開裂する構造（好ましくはハンマーヘッドリボザイムに似た構造） を形成するように設計される。 一方、要素Ｚ₁及びＺ₄のサブユニットは、リボヌクレオチドであり得る。しか しながら、リボヌクレオチドが存在するとオリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏ安定性が 減少するので、リボヌクレオチドの数は可能な限り少ないことが好ましい。要素 Ｚ₁及びＺ₄（及びまた活性中心のＺ₂及びＺ₃）は、ピリミジンヌクレオ塩基を含 有する位置に好ましくはリボヌクレオチドを１つも含有しない。そのような位置 は、好ましくはヌクレオチドアナログを含有する。 要素Ｚ₁及びＺ₄における多数のデオキシリボヌクレオチドの使用もより好まし くないのは、タンパク質との望ましくない相互作用が起こり得るか、又は意図し ないＲＮアーゼＨ感受性のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成し得るためである 。従って、要素Ｚ₁及びＺ₄は、それぞれ好ましくは（１）リボヌクレオチドを含 有せず、（２）３つより多い連続したデオキシリボヌクレオチドの配列を含有し ない。 要素Ｚ₁及びＺ₄のサブユニットは、好ましくはヌクレオチド、ヌクレオチドア ナログ又はその組み合わせである。好ましくは、要素Ｚ₁及びＺ₄におけるヌクレ オチド及びヌクレオチドアナログはそれぞれ以下の構造を有する。 構造式（Ｉ）において、各Ｂは、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、 グアニン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチ ン−９−イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジ アミノプリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、 ７−デアザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロ ピニルウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９− イル、６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリ ミドン−１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９− イル、Ｎ²−ジメチルグアニン−９−イル又はそれらの機能的同等物でありえ； 各Ｖは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＣＨ₂基であり得る。 各Ｗは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ₂、−ＣＯＮＨＲ¹、−ＣＯＮ Ｒ¹Ｒ²、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＣＯＲ¹、−ＳＨ、−ＳＲ¹、 −Ｆ、−ＯＮＨ₂、−ＯＮＨＲ¹、−ＯＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＯＲ¹、− ＮＲ²ＯＨ、−ＮＲ²ＯＲ¹、置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀の 直鎖又は分岐アルキル、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルケニル、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルキニル、置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルコキシ、置換されているか又は置換されていないＣ₂〜Ｃ₁₀の直 鎖又は分岐アルケニルオキシ、及び置換されているか又は置換されていないＣ₂ 〜Ｃ₁₀の直鎖又は分岐アルキニルオキシであり得る。Ｗ基の置換基は、独立し てハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキサミ ド、ヒドロキシ又はメルカプトである。Ｒ¹及びＲ²は置換されているか又は置換 されていないアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり得て、ここで置換基 は独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カル ボキサミド、ヒドロキシ又はメルカプトである。 Ｄ及びＥは、隣接したヌクレオシド又はヌクレオシドアナログとの間に、ホス ホジエステル又はホスホロチオエートジエステル結合を一緒に形成するか、又は ヌクレオシド間結合のアナログを一緒に形成する残基である。 ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを有する構造式（Ｉ）の要素Ｚ₁ 及びＺ₄にとっては、各Ｗは置換されているか又は置換されていないＣ₁〜Ｃ₁₀ の直鎖又は分岐アルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₀の直鎖又は分岐アルケニルオキシ又はＣ₂ 〜Ｃ₁₀の直鎖又は分岐アルキニルオキシであることが好ましい。 さらに、フランキング要素Ｚ，及びＺ₁は₄ペプチド核酸（ペプチド性核酸とも 言及される；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜 １５００（１９９１）及びＤｕｅｈｏｌｍら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５ ７６７〜５７７３（１９９４）を参照のこと）のようなヌクレオチドアナログも 含有し得る。この場合、各サブユニットのカップリングは、例えば、酸アミド結 合によって達成され得る。要素Ｚ₁及びＺ₄は、ペプチド核酸に基づいたとき、適 切なリンカー（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ ｔ．５：１１１９〜１１２１（１９９５）を参照のこと）又は直接的なカップリ ング（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：６８２ ３〜６８２６(１９９５))のいずれかを使用して、ヌクレオチド又はヌクレオチ ドアナログに基づいた要素Ｚ₂及びＺ₃とカップルされ得る。要素Ｚ₁及びＺ₄がヌ クレオチド（及び／又はヌクレオチドアナログ）とペプチド核酸の組み合わせを 含有する場合、異なる部分をカップルさせるために、同様の連結が使用され得る 。 フランキング要素Ｚ₁及びＺ₄のサブユニットは、ＲＮＡ分子において天然に存 在するヌクレオ塩基とハイブリダイズするか又は相互作用し得るヌクレオ塩基又 はヌクレオ塩基アナログを含有する。ヌクレオ塩基は、天然に存在する塩基（即 ち、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル）並びに２，６−ジア ミノプリン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、シュードウラシル、５−プ ロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンのような、ターゲットＲＮＡとの 特異的な結合を可能にするヌクレオ塩基アナログから好ましくは選択される。 ＲＮＡ基質と要素Ｚ₁及びＺ₄との間の強くて配列特異的な相互作用（即ち、Ｒ ＮＡ基質とオリゴマーとの間のより安定なハイブリッド）が好ましい。この目的 のために、要素Ｚ₁及びＺ₄のオリゴマー配列において、標準的なヌクレオ塩基に 代わる以下のヌクレオ塩基アナログが使用されることが好ましい：アデニンの代 わりに２，６−ジアミノプリン；ウラシルの代わりにチミン又は５−プロピニル ウラシル；及びシトシンの代わりに５−メチルシトシン又は５−プロピニルシト シン。２−アミノ−２’−Ｏ−アルキルアデノシンもまた好ましい(Ｌａｍｍら 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３１９３〜３１９８(１９９１) )。さらに、二本鎖の安定性を高め得るフェノキサジンのようなヌクレオ塩基ア ナ口グを産生するために、ウラシルの４位及び５位に芳香族系を連結し得る(Ｌ ｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８７３〜３８７４(１９９５) )。 開示組成物による開裂に好ましいＲＮＡ基質は以下の構造を有する： ５’−Ｚ₄’−Ｃ^16.1−Ｘ¹⁷−Ｚ₁’−３’ ここで、Ｚ₁’及びＺ₄’は、それぞれＺ₁及びＺ₄と相互作用し、Ｃ^16.1はシチジ ンであり、Ｘ¹⁷はアデノシン、グアノシン、シチジン又はウリジンである。開裂 はＸ¹⁷の３’で起こる。好ましくは、Ｘ¹⁷はアデノシン、シチジン又はウリジン であり、より好ましくは、Ｘ¹⁷はアデノシン又はシチジンであり、最も好ましく は、Ｘ¹⁷はアデノシンである。好ましくは、Ｘ^16.2（即ち、Ｚ₄’における３’ ヌクレオシド）はアデノシン又はグアノシンである。開示組成物によって開裂さ れ得る基質のターゲット部位は、これまでのハンマーヘッドリボザイムでは基質 の１６．１位にウリジンが要求されるので、従来のハンマーヘッドリボザイムの ターゲット部位とは異なっている。 Ｚ₄’に存在する３’位であるＮ^16.2位は、グアノシン、アデノシン、シチジ ン又はウリジンのいずれかであり得る。Ｎ^16.2はグアノシン、アデノシン又はシ チジンのいずれかであることが好ましい。Ｎ^16.2はグアノシン又はアデノシンの いずれかであることがより好ましい。Ｎ^16.2はグアノシンであることが最も好ま しい。開示化合物による開裂に好ましい基質は、Ｎ^16.2がグアノシン、アデノシ ン又はシチジンであり、Ｘ¹⁷がアデノシンであるものである。開示化合物による 開裂により好ましい基質は、Ｎ^16.2がグアノシン又はアデノシンであり、Ｘ¹⁷が アデノシンであるものである。開示化合物による開裂に最も好ましい基質は、Ｎ^16.2 がグアノシンであり、Ｘ¹⁷がアデノシンであるものである。 フランキング要素Ｚ₁及びＺ₄は、それぞれ独立に、好ましくは３〜４０、より 好ましくは５〜１０のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含有する。Ｚ₁ 及びＺ₁’が相互作用して少なくとも３つの塩基対のステムを形成し、Ｚ₄及びＺ₄ ’が相互作用して少なくとも３つの塩基対のステムを形成することが好ましい 。これらステムがそれぞれＺ₂及びＺ₃に隣接していることがより好ましい。Ｚ₁ 及びＺ₁’が相互作用して３つより多い塩基対のステムを形成し、Ｚ₄及びＺ₄’ が相互作用して３つより多い塩基対のステムを形成することが最も好ましい。 好ましいＲＮＡ基質は、ＲＮＡのターゲット領域に関連した阻害性の二次構造 をほとんど有さないものである。ＲＮＡ分子のどの領域が二次構造を含有し、そ れ故より好ましくないか、ＲＮＡ分子のどの領域が二次構造をほとんど有さず、 それ故より好ましいかを決定するための多くの方法がある。単鎖ＲＮＡの領域を 決定するための好ましい方法は、単鎖ＲＮＡの領域と選択的に反応させるか又は それを認識することによってこの領域をマッピングするものである。ヌクレオチ ドのワトソン−クリック面にある窒素と反応する多くの化学物質（硫酸ジメチル (ＤＭＳ)、ジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)、カトキサール(ＣＭＣＴ)、カ ルボジイミド）がある。ワトソン−クリック型の塩基対合に関与するヌクレオチ ドは、関与しないヌクレオチドよりもこれらの化学物質に対してより少ない反応 性を示す。化学修飾したＲＮＡとの（逆転写酵素、ＲＮアーゼＴ１、コブラ毒ヌ クレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１、ヌクレアーゼＶ１を使用する）酵素反応から、 その長さが化学反応の起こった塩基に依存する、短縮されたオリゴヌクレオチド が創出される。化学反応はＲＮＡの単鎖領域で選好的に起こるので、これらの技 術はＲＮＡの二次構造がどこにあるかを示す。例えば、硫酸ジメチル及び逆転写 酵素マッピングのような方法は、二本鎖ＲＮＡの領域がどこにあるかを示す。逆 転写酵素は、適切な条件下では、二本鎖ＲＮＡの領域を複製し得ないので、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって分析したときに、複製途中 で停止した（ａｂｏｒｔｉｖｅ）転写産物が存在し、これがどこに強い二次構造 のＲＮＡ領域があるかを示す。この方法の諸例は、Ｋａｍａｒら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ ３３(２)：５８３〜５９２(１９９４)、ＭａｎｄｉｙａｎとＢｏ ｕｂｌｉｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８(２３)：７０５５〜７ ０６２(１９９０)、ＢｅｒｎａｌとＧａｒｃｉａ−Ａｒｅｎａｌ、ＲＮＡ ３( ９)：１０５２〜１０６７(１９９７)及びＥｈｒｅｓｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５(２２)：９１０９〜９１２８（１９８７）に記載 されている。 ＲＮＡのどの領域が単鎖であるかを評価する別の方法はＲＮアーゼＨマッピン グである。この方法では、短いランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成され、 タ一ゲットＲＮＡと混合される。容易にアクセスできる領域がこの短いＤＮＡ分 子とハイブリダイズされる。次いでこのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド領域がＲＮ アーゼＨによって開裂される。次ぎに標識化したＲＮＡ分子がＰＡＧＥによって 分析され得る。開裂された分子を配列決定の梯子（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｌａ ｄｄｅｒ）と比較することにより、単鎖ＤＮＡの領域が推定され得る。この方法 の諸例は、Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５９〜 ６３（１９８８）及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎの米国特許第５，５２５，４６８号に 記載されている。 ＲＮＡのアクセス可能な単鎖領域を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選別実 験（Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ １９：８９〜９３(１９９２)）も実施され得る 。例えばターゲットＲＮＡは、ＰＣＲ増幅のために使用され得るプライマー結合 領域を含有するランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドと混合され得る。増幅及び再 選別を繰り返すことで、ＲＮＡと結合し得るＤＮＡ配列を濃縮することが可能に なる。これによってオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのためにアクセ スし得るＲＮＡの領域が同定される。この選択又は濃縮の工程は任意のサイズ選 別技術であるか又は二本鎖核酸の分離技術であり得る。例えば、セファデックス カラムクロマトグラフィーでは、大きい、結合性のＤＮＡ：ＲＮＡ複合体と小さ な 非結合性のＤＮＡ分子が分離され、またニトロセルロース濾過法では結合性のＲ ＮＡが保持される一方、非結合性のＤＮＡ分子は素通りする。 所定の基質に対するオリゴマーを最適化するための方法も数多くある。例えば 、特定の配列要求性を持たないオリゴマーのＮ⁷位を変更し、所定のターゲット 配列のために設計されたオリゴマーのなかに所望しない二次構造が発生する可能 性を最小化することに役立てることができる。また、７−デアザグアノシン又は ７−デアザアデノシンのような特定の塩基修飾は、所望しないプリン：プリン相 互作用を防ぐために、数多くのグアノシン又はアデノシンを有する領域に利用さ れ得る。同様の置換は、例えば触媒オリゴマーのＺ₁又はＺ₄領域に存在し得るグ アノシンリッチ領域へイノシンを導入することによって達成され得る。 触媒コア 要素Ｚ₂及びＺ₃は、開示組成物の触媒コアを形成すると考えられ、好ましくは ヌクレオチドアナログ及び少数のリボヌクレオチドから構成される。要素Ｚ₂及 びＺ₃においては、（構造式（Ｉ）の）各Ｗは、Ｃ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐アルキ ル、Ｃ₂〜Ｃ₅の直鎖又は分岐アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₅の直鎖又は分岐アルキニル、 Ｃ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐アルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₅の直鎖又は分岐アルケニルオキシ 、及びＣ₂〜Ｃ₅の直鎖又は分岐アルキニルオキシであることが好ましい。また、 各Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁷及びＸ＾¹²においては、ＷはＮＨ₂、ＯＨ−置換Ｃ₁〜Ｃ₄のアル キル、ＯＨ−置換Ｃ₂〜Ｃ₄のアルケニル、ＯＨ−置換Ｃ₁〜Ｃ₄のアルコキシ又は ＯＨ−置換Ｃ₂〜Ｃ₄のアルケニルオキシであることが好ましい。各Ｘ³、Ｘ⁴、Ｘ⁷ 及びＸ＾¹²においては、ＷはＮＨ₂、メトキシ、２−ヒドロキシエトキシ、アリ ルオキシ又はアリルであることがより好ましい。また、Ｘ¹²においては、Ｗは− Ｈ又は−ＯＨであることが好ましい。また、各Ｘ¹³及びＸ¹⁴においては、ＷはＣ₁ 〜Ｃ₄のアルキル、Ｃ₂〜Ｃ₄のアルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₄のアルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₄の アルケニルオキシ、ＯＨ−置換Ｃ₁〜Ｃ₄のアルキル、ＯＨ−置換Ｃ₂〜Ｃ₄のアル ケニル、ＯＨ−置換Ｃ₁〜Ｃ₄のアルコキシ又はＯＨ−置換Ｃ₂〜Ｃ₄のアルケニル オキシであることが好ましい。各Ｘ¹³及びＸ¹⁴においては、Ｗはメトキシ、２− ヒドロキシエトキシ又はアリルオキシであることがより好ましい。 要素Ｚ₂及びＺ₃におけるサブユニットは、好ましくはリボヌクレオチドと弱く だけハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログである。そのようなサブユニッ トの例は、リボースの２’位に好ましくは１〜５の炭素原子を有する置換されて いるか又は置換されていないアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、 アルケニルオキシ又はアルキニルオキシ基を含有するヌクレオチドアナログであ る。この目的のために要素Ｚ₂及びＺ₃において使用され得る好ましいヌクレオ塩 基は、アデニン−９−イル、プリン−９−イル、ウラシル−１−イル、シトシン −１−イル、グアニン−９−イル及びヒポキサンチン−９−イルである。 以下のヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが（構造式（Ｉ）の成分に関連 する）要素Ｚ₂に対して好ましい： Ｘ³位：Ｂ＝シトシン−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝シトシン −１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリル； Ｘ⁴位：Ｂ＝ウラシル−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝ウラシル −１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリル；Ｂ＝ウラシル−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ ； Ｘ⁵位：Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ，Ｗ＝アミノ；Ｂ＝グアニン−９− イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ⁶位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝Ｈ；Ｂ＝プリン−９−イル、 Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ⁷位：Ｂ＝ウラシル−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝シトシン −１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリル； Ｘ⁸位：Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アミノ；Ｂ＝ヒポキサンチン −９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ⁹位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝Ｈ；Ｂ＝プリン−９−イル、 Ｖ＝Ｏ，Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ。 以下のヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが（構造式（Ｉ）の成分に関連 する）要素Ｚ₃に対して好ましい： Ｘ¹²位：Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝Ｈ；Ｂ＝７−デアザグアニン −９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ¹³位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝アデニン −９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝２−ヒドロキシエトキシ；Ｂ＝プリン−９−イル、Ｖ ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ； Ｘ¹⁴位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝プリン− ９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝２−ヒド ロキシエトキシ；Ｂ＝プリン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ； Ｘ^15.1位：Ｂ＝ヒポキサンチン−９−イル又はその機能的同等物、Ｖ＝Ｏ、Ｗ ＝ＯＨ。 要素Ｚ₂及びＺ₃は、触媒構造の形成を可能にするようなやり方で相互作用する 。好ましい組成物では、Ｚ₂及びＺ₃は、ハンマーヘッド触媒構造に似た触媒構造 の形成を可能にするようなやり方で相互作用する。Ｚ₂及びＺ₃が相互作用して触 媒構造を形成し得る１つの方法は、Ｚ₂及びＺ₃を構成するヌクレオチド及び／又 はヌクレオチドアナログの相互作用を介してである。開示組成物はＲＮアーゼＨ から独立したＲＮＡ開裂活性を有する。即ち、開示組成物は、ＲＮアーゼＨに関 わらずにＲＮＡ基質の開裂を起こすことができる。開示組成物はＲＮアーゼＨに よるＲＮＡの開裂を促進し得る可能性があるが、そうしないことが好ましい。 Ｚ₂とＺ₃との所望の相互作用は、好ましくはＺ₂の３’末端及び／又はＺ₃の５ ’末端へ要素をカップリングすることによって強められる。単一の要素（本明細 書においてＺ₅と呼ばれる）は、要素Ｚ₂及びＺ₃をこのように共有結合させるた めに使用され得る。開示組成物のそのような形態の構造は、５’−Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₅ −Ｚ₃−Ｚ₄−３’となろう。別個の要素（本明細書においてＺ₆及びＺ₇と呼ば れる）は、Ｚ₂及びＺ₃にカップルされ得て、好ましくは相互作用（非共有的に） して、要素Ｚ₂とＺ₃の相互作用を安定化又は別のやり方で増強し得る。この形態 の組成物の成分（ａ）は、５’−Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₆−３’という構造を有し、成分 （ｂ）は、５’−Ｚ₇−Ｚ₃−Ｚ₄−３’という構造を有するだろう。 要素Ｚ₅、Ｚ₆及びＺ₇は、オリゴマー配列、非ヌクレオチドリンカー又はオリ ゴマー配列と非ヌクレオチドリンカーの組み合わせであることが好ましい。要素 Ｚ₅、Ｚ₆及びＺ₇は、オリゴマー配列であることがより好ましい。これらのオリ ゴマー配列は相互作用して分子内ステム（Ｚ₅の場合）又は分子間ステム（Ｚ₆及 びＺ₇の場合）を形成することが最も好ましい。そのようなステムは、好ましく は２〜３０の塩基対を含有し、好ましくは連続している(つまり、非対合性の塩 基がない)。要素Ｚ₅、Ｚ₆及びＺ₇は、好ましくはヌクレオチド、ヌクレオチドア ナログ又はその両方から構成されるか、又はオリゴヌクレオチドアナログである 。Ｚ₅は、Ｚ₂とＺ₃の相互作用を安定化させるようなやり方でそれ自身と相互作 用することが好ましい。同様に、Ｚ₆は、Ｚ₂とＺ₃の相互作用を安定化させるよ うなやり方でＺ₇と相互作用することが好ましい。要素は、ヌクレオチド及び／ 又はヌクレオチドアナログから構成されるオリゴマー配列、オリゴヌクレオチド アナログ又はその組み合わせであり、相互にハイブリダイズし得ることが好まし い。 要素Ｚ₅は、Ｚ₂の３’末端をＺ₃の５’末端へカップリングする共有リンカー として役立ち得る。要素Ｚ₅は、好ましくはポリエチレングリコールのような非 ヌクレオチド分子、又はヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びオリゴヌクレ オチドアナログを包含するオリゴマー配列、又はヌクレオチド、ヌクレオチドア ナログ及びオリゴマーヌクレオチドアナログの組み合わせのいずれかから構成さ れる。要素Ｚ₅の好ましい形態は、分子内で相互反応してステム−ループ構造を 形成し得る、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチドアナロ グ、又はヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの組み合わせから構成される。 要素Ｚ₅の好ましいステムール−プ構造は、２〜３０の塩基対を含有するもので ある。 開示組成物の好ましい態様は、ヌクレオチドがすべて２’−Ｏ−アリル−リボ ヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドである５’−Ｚ₁−Ｚ₂− Ｚ₅−Ｚ₃−Ｚ₄−３’であるが、Ｘ⁴、Ｘ⁵、Ｘ⁶、Ｘ⁸、Ｘ¹²、Ｘ^15.1位は、２’ 位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ）リボヌクレオチドである。 開示組成物の別の好ましい態様は、ヌクレオチドがすべて２’−Ｏ−アリル− リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドである５’−Ｚ₁− Ｚ₂−Ｚ₅−Ｚ₃−Ｚ₄−３’であるが、Ｘ⁵、Ｘ⁶、Ｘ⁸、Ｘ¹²、Ｘ^15.1位は、２’ 位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ）リボヌクレオチドである。 開示組成物の別の好ましい態様は、成分（ａ）が５’−Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₆−３’ であり、成分（ｂ）が５’−Ｚ₇−Ｚ₃−Ｚ₄−３’である上記の成分（ａ）及び （ｂ）から構成される組成物であり、ここでヌクレオチドはすべて２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドであるが、Ｘ⁴ 、Ｘ⁵、Ｘ⁶、Ｘ⁸、Ｘ¹²、Ｘ^15.1位は、２’位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ） リボヌクレオチドである。 開示組成物の別の好ましい態様は、成分（ａ）が５’−Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₆−３’ であり、成分（ｂ）が５’−Ｚ₇−Ｚ₃−Ｚ₄−３’である上記の成分（ａ）及び （ｂ）から構成される組成物であり、ここでヌクレオチドはすべて２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドであるが、Ｘ⁵ 、Ｘ⁶、Ｘ⁸、Ｘ¹²、Ｘ^15.1位は、２’位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ）リボ ヌクレオチドである。 開示組成物の好ましい形態は、Ｚ₂の３’末端にＧがついたものである。Ｔａ ｉｒａと共同研究者(ＡｍｏｎｔｏｖとＴａｉｒａ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ ｃ．１１８：１６２４〜１６２８(１９９６))は、ハンマーヘッド様リボザイム のＲ⁹に並置したグアノシンから得られるスタッキングエネルギーが触媒構造の 形成を安定化させることを示した。従って、Ｚ₆の５’ヌクレオチドはＧである ことが好ましい。 開示組成物の３’末端は、例えば、リボース糖の３’位が（例えば、上記に定 義したような置換されているか又は置換されていないアルキル、アルコキシ、ア ルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル又はアルキニルオキシ基を包含するこ とによって）修飾されたヌクレオチドアナログを使用することによって、エクソ ヌクレアーゼによる分解に対して保護され得る。開示組成物はまた、３’−３’ −連結ジヌクレオチド構造（Ｏｒｔｉｇａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２：１２９〜１４６(１９９２)） 及び／又は２つのホスホロチオエート結合のような２つの修飾されたホスホ結合 を包含することによって、エクソヌクレアーゼによる３’末端での分解に対して 安定化され得る。 開示組成物はまた、その細胞への取込みを向上させる及び／又は特定の細胞内 局在化を可能にするために、補欠分子族へ連結され得る。そのような補欠分子族 の例は、ポリアミノ酸(例えば、ポリリシン)、脂質、ホルモン又はペプチドであ る。これら補欠分子族は通常直接的に又は適切なリンカー（例えば、６−アミノ ヘキサノール又は６−メルカプトヘキサノールに基づいたリンカー）によってオ リゴマーの３’又は５’末端を介して連結される。これらリンカーは市販されて いて、補欠分子族をオリゴマーへ連結させるのに好適な技術は当業者に知られて いる。 ハイブリダイゼーション速度を高めることが開示組成物の生物学的な活性にと って重要であり得るのは、こうすれば低濃度の組成物でより高い活性を達成する ことが可能になるからである。このことは短命のＲＮＡ基質又はあまり頻繁には 生じないＲＮＡ基質にとって重要である。ハイブリダイゼーションの実質的な加 速は、例えば、（例えばいくつかのリジン残基を含有する）正電荷のペプチドを オリゴヌクレオチドの末端へカップリングさせることによって達成され得る(Ｃ ｏｒｅｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：９３７３〜９３７４(１９９ ５))。開示化合物は上記のリンカーを使用するこのやり方で平易に修飾され得る 。別のやり方では、ハイブリダイゼーション速度は、スペルミニル残基を含有す るサブユニットを取込むことによっても高められ得る(ＳｃｈｍｉｄとＢｅｈｒ 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：１４４７〜１４５０)。開示化合 物のそのような修飾は二次構造を有するＲＮＡ基質に結合する能力も向上させる 。 オリゴマーの合成 開示化合物は任意の適切な方法を使用して合成され得る。多くの合成法が知ら れている。開示化合物の合成には以下の技術が好ましい。プリンリボヌクレオチ ド残基を含有し、転換したチミジン残基のような適切な３’末端（Ｏｒｔｉｇａ ｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ ２：１２９〜１４６(１９９２)）又は３’−エクソヌクレアーゼによる起こ り得る分解を防ぐ３’末端の２つのホスホロチオエート連結を有する、２’−Ｏ −アリル修飾オリゴマーが、任意の市販ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いた固相β− シアノエチルホスホロアミダイト化学によって合成され得る(Ｓｉｎｈａら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９〜４５５７(１９８４))。 好ましい方法は、リボヌクレオチドのための２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチ ルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護戦略（Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．１０９：７８４５〜７８５４(１９８７)）であり、必要とされる３’−Ｏ−ホ スホロアミダイトはすべて市販されている。さらに、アミノメチルポリスチレン の 支持物質としての使用がその有利な性質のために好ましい(ＭｃＣｏｌｌｕｍと Ａｎｄｒｕｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３２：４０６９〜４ ０７２(１９９１))。市販のフルオレセインホスホロアミダイトを使用して、合 成中に基質ＲＮＡの５’末端へフルオレセインを付けることができる。一般に、 標準的なＲＮＡサイクルを使用して所望のオリゴマーが合成され得る。アセンブ リーが完了したら、密封バイアルにて濃縮水性アンモニア水／エタノール（３： １ｖ／ｖ）で５５℃、８時間処置することにより、不安定な塩基保護基をすべて 除去する。エタノールは２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳが早めに除去されるのを抑制する が、そうしないと脱保護の基本条件下で得られるリボヌクレオチドの位置でかな りの鎖開裂が起こってしまう(Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１ ０９：７８４５〜７８５４(１９８７))。凍結乾燥した後に、ＴＢＤＭＳ保護化 オリゴマーは、６０℃で２時間、トリエチルアミントリヒドロフルオリド／トリ エチルアミン／Ｎ−メチルピロリドンの混合物で処置し、中性的な条件下でシリ ル保護基を迅速的かつ効率的に除去する(Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７〜２６８４(１９９５))。次いで、完全に 脱保護化したオリゴマーは、ＣａｔｈａｌａとＢｒｕｎｅｌの方法(Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２０１(１９９０))によりブタノール沈殿さ れ得る。精製は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はイオン交換ＨＰＬ Ｃ(Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓ １４：２５５〜２７３(１９９５))と逆相ＨＰＬＣの組み合わせのいずれか により実施され得る。細胞内で使用するには、合成されたオリゴマーをアセトン 中の過塩素酸ナトリウムで沈殿してそのナトリウム塩へ変換することが好ましい 。次いで残った微量の塩は、好ましくは市販の小さな使い捨てゲル濾過カラムを 使用して除去される。最終工程として、この単離オリゴマーの真性をマトリック ス介助レーザーデソープション質量分析法（Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３１９１〜３１９６(１９９３)）及びヌクレオシド 塩基組成分析によって確認する。さらに、対応する化学合成された短いオリゴリ ボヌクレオチド基質に対するこのオリゴマーを用いた開裂機能テストも好ましい 。 ＲＮＡ基質の開裂 ＲＮＡ切断は細胞の核または細胞質に存在するタンパク質因子により促進され るので、開示された化合物は非常に高いインビボ活性を持っている。ハンマーヘ ッドリボザイムの活性を増大できるそのようなタンパク質因子の例は、例えば、 ＨＩＶ１のヌクレオカプシドタンパク質ＮＣｐ７(Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．２４２：４２２−４２９(１９９４))および異種核リボ 核タンパク質Ａ１（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２３：２２２３−２２２８(１９９５)）である。従って、 長いＲＮＡ転写体は開示された化合物により細胞内で効率的に切断される。 開示された化合物は、活性物質として一つまたはいくつかのオリゴマーおよび 、随意に医薬として受容可能な補助物質、添加物および担体を含んでいる医薬組 成物に使用できる。そのような医薬組成物は、真核生物、原核生物およびウイル ス、特に細胞中の腫瘍遺伝子またはウイルス遺伝子またはＲＮＡ分子のようなヒ ト遺伝子の発現を特異的に不活性化する薬剤の製造に適している。応用のさらな る範囲は植物遺伝子または昆虫遺伝子発現の不活性化である。従って、開示され た組成物はヒトおよび動物のための薬剤ならびに植物のための殺虫剤に使用でき る。 細胞へ開示された化合物を送達するためには種々の方法が利用可能である。例 えば、一般的に開示された化合物はマイクロパーティクル内または上に取り込む ことができる。本明細書で使用される場合、マイクロパーティクルには合成およ び／または天然ポリマーで形成されたリポソーム、ビロソーム、マイクロスフェ アおよびマイクロカプセルが含まれる。マイクロカプセルおよびマイクロスフェ アを作成する方法は当業者には既知であり、溶剤蒸発、溶剤鋳造、噴霧乾燥およ び溶剤伸長が含まれる。種々のマイクロパーティクル内へ取り込むことができる 有用なポリマーの例としてはポリサッカライド、ポリ無水物、ポリオルトエステ ル、ポリ水酸化物およびタンパク質およびペプチドが挙げられる。 リポソームはＫｉｍ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ ，７２８：３３９−３４８(１９８３)；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃ ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ，１１０４：９５−１０１(１９９２)；およ びＬｅｅ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ.，１１０ ３：１８５−１９７(１９９２)；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｅｍ.，２ ８： ９５０８−９５１４（１９８９）により報告されているような標準法により作成 できる。そのような方法は核酸分子のＭＯＬＴ−３白血病細胞株細胞核および細 胞質への送達に使用されている(Ｔｈｉｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌ ｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，２０：５６９１−５６９８(１９９２))。 もしくは、開示された化合物はイオン的かまたは共有結合でマイクロパーティク ル内へ取り込ませるか、またはマイクロパーティクルの外側に結合することがで きる。 カチオンリポソームまたはマイクロカプセルは、開示された化合物のような陰 性に荷電した化合物を送達するのに特に有用であるマイクロパーティクルであり 、化合物はリポソームの陽性に荷電した外側表面へイオン的に結合できる。Ｆｅ ｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７(１９８７)；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄ ｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ，５：１６３−１８７(１９９０)； Ｃｌａｒｅｎｃ ｅｔ ａｌ.，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉ ｇｎ ，８：８１−９４（１９９３）により報告されているように、種々のカチオ ンリポソームはインビトロおよびインビボの両方で細胞への核酸または核酸−タ ンパク質複合体の送達に非常に有効であることが示されている。混合物から形成 されたリポソームまたはマイクロカプセルが、陰性に荷電した化合物をイオン的 に結合するであろう正味の陽性電荷を持つように、カチオンリポソームまたはマ イクロカプセルは十分な量の一つまたはそれ以上のカチオン側鎖を含んでいる脂 質からなる混合物を用いて製造できる。カチオンリポソームを製造するために使 用される陽性に荷電した脂質の例には、アミノ脂質ジオレオイルホスファチジル エタノールアミン(ＰＥ、陽性に荷電した一級アミノ頭部を持つ);ホスファチジ ルコリン(ＰＣ、一級アミンではない陽性に荷電した頭部を持つ);およびＮ[１− （２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウ ム（”ＤＯＴＭＡ,”Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ，８４：７４１３−７４１７(１９８７)；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：３８７−３８８(１９８９)；Ｆｅｌｇ ｎｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５ ：１６３ −１８７（１９９０）を参照されたい)が含まれる。 開示された組成物送達のためのマイクロパーティクルの好適な形はヘムを持つ マイクロパーティクルである。これらのマイクロパーティクルにおいて、ヘムは マイクロパーティクルの外側表面内へインターカレートされているかまたは共有 結合で結合されている。ヘムを持つマイクロパーティクルは、肝細胞のようなヘ ムレセプターを発現する細胞により優先的に結合および取り込まれるので、有効 投与量に必要とされる薬剤量が著しく少なくてもよいという利点を持っている。 そのような標的化送達はまた、非標的化送達法において相対的に高薬剤濃度使用 する場合に起こりうる全身的副作用も減少させる。ヘムを持つマイクロパーティ クルの形成に好適な脂質は１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアン モニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノー ルアミン（ＤＯＰＥ）である。ヘムを持つマイクロパーティクルの製造および使 用はＩｎｎｏｖｉｒによるＰＣＴ出願ＷＯ９５／２７４８０に記載されている。 開示された組成物はまたカチオンリポソームによりカプセル化またはカチオン リポソーム上を被覆でき、それは哺乳類に静脈注射できる。この系は内皮および 造血細胞が存在する骨髄を含む成体マウスの多様な組織の細胞内へＤＮＡを導入 するために使用されている(例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ６１：２０９−２１１（１９９３）を参照されたい)。 開示された組成物を含んでいるリポソームは、標的細胞への開示された化合物 送達のための有効量で、例えば、静脈内または腹腔内投与により全身的に投与で きる。他の可能な経路には、適切なマイクロパーティクルとともに使用された場 合の経皮または経口が含まれる。一般的に、個体に投与されるリポソーム結合オ リゴマーの総量は、同一の所望されるまたは意図される効果のために投与されな ければならない非結合オリゴマー量よりも少ないであろう。 ポリ乳酸およびポリグリコール酸コポリマー、ポリエチレンおよびポリオルト エステルのような種々のポリマーを含んでいる組成物および開示された組成物は 、カテーテルまたは注射器を使用して適切な細胞に局所的に送達できる。そのよ うな組成物を細胞へ局所的に送達する他の手段には、注入ポンプの使用（例えば 、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ ｉ ａからのもの）または移植物に隣接した領域への治療組成物の徐放性放出を達成 できるポリマー性移植物内への組成物の取り込み（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａ ｎｄ Ｌｌｏｙｄ−Ｊｏｎｅｓ，ｅｄｓ.，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙ ｓｔｅｍｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏ ｏｄ Ｌｔｄ.，１９８７を参照されたい）が含まれる。 治療的応用には、活性物質は好適には０．０１から１０，０００μｇ／ｋｇ体 重、より好適には０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。投与 は、例えば、注射、スプレーとして吸入(例えばエアロゾルとして)、経口的(例 えば、錠剤、カプセル、被覆錠剤その他として)、局所的または直腸的（例えば 座薬として）により実施できる。 開示された組成物は遺伝子発現の特異的不活性化のための方法に使用でき、組 成物が細胞内に存在する前もって決められたＲＮＡ分子を切断するように(切断 は好適には触媒的に起こる)、活性濃度の組成物が細胞に取り込まれる。米国特 許第５，３３４，７１１号に記載されている類似の組成物はマウスでの遺伝子不 活性化に成功している(Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ et ａｌ.，ＥＭＢＯ Ｊ．１ ４：５２２４−５２２９(１９９５))。この方法は培養細胞に対してインビトロ で、ならびに生きている生物体（原核生物またはヒト、動物または植物のような 真核生物）に対してインビボで実施できる。 開示された組成物はまた、ＲＮＡ分子を切断するためのＲＮＡ制限酵素として 使用できる(例えば、細胞なしのインビトロ反応)。開示された組成物はまたＲＮ Ａ分子の制限切断のための反応キットにも使用でき、例えばそれには、オリゴマ ーおよび適した緩衝化物質が含まれている。この場合、オリゴマーおよび緩衝化 物質は溶液、懸濁液または散剤または凍結乾燥物のような固形物の形で存在でき る。試薬は一緒に、お互いに分離されてまたは随意に適した担体上にも存在でき る。開示された組成物はまた、診断試薬としてまたは未知遺伝子の機能を同定す るためにも使用できる。 本発明は以下の非制限的な実施例を参考にしてさらに理解されるであろう。実施例 実施例１：１５．１位でのイノシン置換は効果的にＮ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷を切断でき ることを示している切断反応 Ｎ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷モチーフ（式中、Ｈ¹⁷はグアノシンではない）の各々の順列 を含む１２の基質の組が合成された。切断アッセイに使用されたオリゴマーおよ び対応する基質は表１に示されている。基質の各々は５’末端がフルオレセイン で標識されており、および３’末端に逆方向チミジンキャップが使用された。四 つの触媒オリゴマーの組が合成され、基質の各々に対して適切に一致した触媒オ リゴマーを提供している。これらの触媒オリゴマーの各々は１５．１位にイノシ ンを持っている。基質の１６．１位にＵおよび触媒オリゴマーの１５．１位にＡ がある対照基質および触媒オリゴマーも合成された。 Ｆｌ＝フルオレセイン標識 ＊Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｕ＝リボヌクレオチド（Ｉはイノシンである） ａ，ｃ，ｇ，ｕ＝２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド 上記の基質および触媒オリゴマーは、切断のために１６．１位のＵを必要とす ることを克服するための１５．１位のイノシンの能力を決定するための切断反応 で使用された。すべての反応は以下のプロトコールを使用して実施された。反応 は典型的には１００μｌで行われ、反応液には蒸留およびオートクレーブ処理さ れたＨ₂Ｏ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５ μＭリボザイムおよび０．２５μＭ基質が含まれている。触媒オリゴマー、基質 および緩衝液は一緒に加えられ、９５℃で５分間加熱された。５分以上かけて室 温まで冷却後、反応液を１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂に加え、混合して３７℃に置かれ た。特定の時間間隔（１０、３０、６０および１２０分）で１０μｌを採り、反 応を停止させるために３μｌの充填緩衝液(９５％ホルムアミド、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．０５％ブロモフェノールブル−）に加えた。試料は ２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。ゲルはＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅｒで分析さ れた。表１に示された基質および触媒オリゴマーを使用したこの型の切断反応の 結果は表２に示されている。 数字は示された時間点（反応を開始して０，１０、３０、６０および１２０分 後）で切断された基質のパーセントを示している。結果は、１６．１位にＣを持 つ基質は１５．１位にＩを含んでいる触媒オリゴマーにより切断されうることを 示している。１２０分の時点で種々の基質間に相違はあるものの、１６．１位に Ｃを持つ基質は１５．１位にＩを持つ触媒オリゴマーに関して、すべての場合で 効率よく切断できることをデータは示しており、１５．１位でのＩの置換はＮ^{16 .2} Ｃ^16.1Ｈ¹⁷部位を含んでいる適当な基質の切断を実際に可能にすることを示し ている。 Ｃ^16.1を持っている１２の基質およびＵ^16.1を持っている対照基質の対応する 触媒オリゴマー（すべて表１に示されている）による切断初速度は単一ターンオ ーバー速度論を用いて決定された。単一ターンオーバー速度論は２．５μｌの１ ００μＭリボザイム溶液、２．５μｌの１０μＭ ５’フルオレセイン標識基質 溶液および１０μｌの１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４溶液を混合するこ とにより算定された。混合物は９０μｌの最終容量に希釈し、９５℃に５分間加 熱した後、３７℃に冷却した。１０μｌの１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂溶液を添加す ることにより反応を開始させた。反応成分の最終濃度は、２５０ｎＭ基質、２． ５μＭリボザイムおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂であった。種々の時間に１０マイ クロリットルの試料を採り、反応を停止させるために１０μｌの１００ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、ブロモフェノールブルー溶液と混合した。切断生成物はＰＡＧＥにより 未反応基質から分離し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｆｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅｒで定量された。 時間に対する切断された基質の分画として測定されたデータはＪａｎｋｏｗｓ ｋｙ ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４ ３３（１９９６）により記載されているように式 分画［Ｐ］＝Ｈ₀（１−ｅ^k21）／Ｓ₀ に適合させた。種々のリボザイムについて計算されたｋ₂の値は表３に示されて いる。 Ｆｌ＝フルオレセイン標識 ^*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｕ＝リボヌクレオチド（Ｉはイノシンである） ａ，ｃ，ｇ，ｕ＝２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド この結果はＡ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷およびＧ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷トリプレットを持つ基質 は速い速度で切断されることを示している。１５．１位にＡを持っている対照触 媒オリゴマーとの比較（Ｇ^16.2Ｕ^16.1Ｃ¹⁷トリプレットを持つ基質の切断） は、Ａ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷およびＧ^16.2Ｃ^16.1Ｈ¹⁷トリプレットを持つ基質（１５． １位にＩを持つ触媒オリゴマーにより切断される）が、標準Ａ^15.1−Ｕ^16.1塩基 対を持つ反応体を含む対応する対照反応よりも速い切断初速度を持っていること を示している。実施例２：リボヌクレオチドのみを含んでいる触媒オリゴマーによるＧＣＨおよ びＡＣＨトリプレットでの切断速度 ＧＣＨおよびＡＣＨトリプレットを切断するために設計された、すべてリボヌ クレオチドからなるオリゴマー（修飾なし）による基質ＲＮＡの切断が評価され た。使用されたオリゴマーは配列ＩＤ番号：１７（ＡＣＨトリプレット後を切断 ）（表１）および配列ＩＤ番号：１８（ＧＣＨトリプレット後を切断）（表１） であった。対応する短い蛍光標識基質、配列ＩＤ番号：４、５および６（ＡＣＨ トリプレットを含んでいる）(表１)および配列ＩＤ番号：７、８および９（ＧＣ Ｈトリプレットを含んでいる）(表１)、を各々配列ＩＤ番号：１７および配列Ｉ Ｄ番号：１８の触媒オリゴマーと共に使用した。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭ Ｍｇ2+存在下のｐＨ６．０で、および１ｍＭ Ｍｇ²⁺存在下のｐＨ７．４の両方で実施された。他のすべての条件は実施例１ で使用されたものと同一であった。 データは実施例１のように分析された。全リボヌクレオチド触媒オリゴマーお よび対応する基質の６つの組み合わせのｋ₂値は表４に示されている。 ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＡＣＡおよびＡＣＣ部位を標的とするすべてのリボヌクレオチ ドオリゴマーは、ＧＣＵまたはＡＣＵ部位を標的とするすべてのリボヌクレオチ ドオリゴマーよりも速い切断速度を持っている。さらに、切断活性は１ｍＭ Ｍ ｇ²⁺存在下で非常に速いことを表４は示している。このレベルのＭｇ²⁺はインビ ボにおけるＭｇ²⁺濃度に類似している。実施例３：６つのみのリボヌクレオチドを含んでいる触媒オリゴマーによるＧＣ ＨおよびＡＣＨトリプレットでの切断速度 ＧＣＨおよびＡＣＨトリプレットを切断するように設計された６−リボヌクレ オチドオリゴマーによる基質ＲＮＡの切断が評価された。これらのオリゴマーに おいて、リボヌクレオチドはＵ⁴、Ｇ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^15.1位に存在し ており、他のすべての位置は２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドであった(番 号付けは図２を参照されたい)。使用されたオリゴマーは配列ＩＤ番号：１７（ ＡＣＨトリプレット後を切断）(表１)および配列ＩＤ番号：１８（ＧＣＨトリプ レット後を切断）(表１)であった。対応する短い蛍光標識基質、配列ＩＤ番号： ４、５および６(ＡＣＨトリプレットを含んでいる)(表１)および配列ＩＤ番号： ７、８および９（ＧＣＨトリプレットを含んでいる）(表１)、が各々配列ＩＤ番 号：１７および配列ＩＤ番号：１８の触媒オリゴマーと共に使用された。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭ Ｍｇ²⁺存在下のｐＨ６．０で、および１ｍＭ Ｍｇ²⁺存在下のｐＨ７．４の両方で実施された。他のすべての条件は実施例１ で使用されたものと同一であった。 データは実施例１のように分析された。６−リボ触媒オリゴマーおよび対応す る基質の６つの組み合わせにおいて計算されたｋ₂値は表５に示されている。 これらの結果は、Ｕ⁴、Ｇ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^15.1位以外のすべてのリ ボヌクレオチドが修飾されている場合は、配列ＩＤ番号：１７（ＡＣＨトリプレ ット後を切断）(表１)および配列ＩＤ番号：１８（ＧＣＨトリプレット後を切断 ）(表１)のような触媒オリゴマーに活性が残っていることを示している。これら の結果はまた、触媒オリゴマーは生理学的濃度のＭｇ²⁺で基質を切断できること も示している。実施例４：Ｕ⁴位の糖修飾が異なっている触媒オリゴマーによるＧＣＡトリプレ ットでの切断速度 Ｕ⁴位に修飾を持つオリゴマーによる基質ＲＮＡの切断が評価された。これら のアッセイはヌクレアーゼ耐性修飾を含むオリゴマーが活性を保持し、活性を保 ったままで触媒オリゴマーの与えられた位置に異なった修飾ができることを示し ている。触媒オリゴマーは配列ＩＤ番号：１８に基づいたものであった。変異体 Ｉは配列ＩＤ番号：１８から作製され、５つ以外のヌクレオチドが２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチドで修飾されていた(リボヌクレオチドはＧ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、 Ｇ¹²およびＩ^15.1位に存在し、他の位置はすべて２’−Ｏ−アリル−リボヌクレ オチドであった；番号付けは図２を参照されたい)。変異体IIは配列ＩＤ番号： １８から作製され、６つのヌクレオチド以外はすべて２’−Ｏ−アリル−リボヌ クレオチドで修飾されていた(リボヌクレオチドはＵ⁴、Ｇ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²お よびＩ^15.1位に存在し、他の位置はすべて２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド であった)。変異体IIIはＧ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^15.1位にリボヌクレオチ ドを、およびＵ⁴位に２’−アミノ−２’−デオキシウリジンを含んでいた。他 の すべての塩基は２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドであった。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１ｍＭ Ｍｇ²⁺存在下のｐＨ７．４で実施された。他の すべての条件は実施例１で使用されたものと同一であった。 データは実施例１のように分析された。計算されたｋ₂値は各々全リボヌクレ オチド体に対して２．３２ｍｉｎ^-1、変異体Ｉに対して０．１０ｍｉｎ^-1、変異 体IIに対して０．８７ｍｉｎ^-1、および変異体・に対して０．５６ｍｉｎ^-1であ った。これらの結果は、ＲＮａｓｅ Ａ活性を阻害する異なった修飾が、高度に ＲＮａｓｅ Ａ感受性であるＵ⁴部位に活性を保持しながら行えることを示して いる。Ｕ⁴位に２’−アミノ−２’−デオキシウリジンを含んでいるヌクレアー ゼ耐性変異体は、この位置にリボウリジンを含む、ＲＮａｓｅ Ａ感受性である が高度に活性な変異体よりもほんの少しばかり活性が低い。このことは、非修飾 全リボヌクレオチド体に近い活性を持つヌクレアーゼ耐性触媒オリゴマーを発生 させることが可能であること、および活性を保ちながら与えられた部位で異なっ た修飾をすることができることを示している。実施例５：１２の可能なＮＣＨトリプレットすべてでの２’−Ｏ−メチル−およ び２’−Ｏ−アリル修飾触媒オリゴマーの切断活性の比較 Ｇ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^15.1を除くすべての位置のヌクレオチドに修飾 を持つオリゴマーによる基質ＲＮＡの切断が、すべてのＮＣＨ部位での切断を示 すために評価された。Ｇ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^15.1以外のすべてに位置に ２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドかまたは２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオ チドを含んでいる配列ＩＤ番号：１７(ＡＣＨトリプレット後を切断)、配列ＩＤ 番号：１８(ＧＣＨトリプレット後を切断)、配列ＩＤ番号：１９（ＣＣＨトリプ レット後を切断）および配列ＩＤ番号：２０（ＵＣＨトリプレット後を切断）に 基づく触媒オリゴマーが合成された。配列ＩＤ番号：４、５および６(ＡＣＨト リプレットを含んでいる、配列ＩＤ番号：１７により切断される)、配列ＩＤ番 号：７、８および９(ＧＣＨトリプレットを含んでいる、配列ＩＤ番号：１８に より切断される)、配列ＩＤ番号：１０、１１および１２（ＣＣＨトリプレット を含ん でいる、配列ＩＤ番号：１９により切断される）および配列ＩＤ番号：１３、１ ４および１５（ＵＣＨトリプレットを含んでいる、配列ＩＤ番号：２０により切 断される）もまた合成された。配列ＩＤ番号：４−２０は表１に示されている。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭマグネシウムイオン存在下のｐＨ７．４で実施 された。他のすべての条件は実施例１で使用されたものと同一であった。データ は実施例１のように分析された。 これらのアッセイからのデータはＧＣＨ、ＡＣＨ、ＣＣＨおよびＵＣＨ基質に 対する触媒オリゴマーはそれらの各々の標的を切断できることを示した。結果は また多くの触媒オリゴマー：基質の組み台わせに対し、２’−Ｏ−アリル−リボ ヌクレオチド修飾触媒オリゴマーおよび対応する２’−Ｏ−メチル−リボヌクレ オチド触媒オリゴマーとの間には実際的な相違がないことも示している。さらに 、どの組み合わせに対してもこれら二つの型の修飾間には２倍を超える相違はな かった。実施例６：Ｎ⁷位の核塩基が異なった触媒オリゴマーによるＧＣＡトリプレット での切断速度 切断アッセイは、異なった修飾を持つ異なった塩基がＮ⁷位に置換でき、およ びそれでも活性を保持していることを示すために実施された。すべての触媒オリ ゴマーはＧ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^15.1（それらはリボヌクレオチドである ）を除くすべての位置に２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドを含んでいた。す べての触媒オリゴマーはＧＣＨトリプレット後を切断するように設計された。触 媒オリゴマーの配列は以下のようであった(Ｎ⁷位はボールド体で示されている) ： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー ^*Ｔ=３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇ，ｕおよびｉは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオ チドである。 ｑは１−（２−Ｏ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）キナゾリン−２，４− ジオンである。 ｎは５−ニトロ−１−（２−Ｏ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）インドー ルである。 反応は単一ターンオーバ一速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭマグネシウムイオン存在下のｐＨ７．４で実施 された。他のすべての条件は実施例１で使用されたものと同一であった。データ は実施例１のように分析された。 Ｎ⁷変異体オリゴマーの生成物分画に対する時間曲線を示しているグラフが図 ４Ａおよび４Ｂに示されている。データはＮ⁷でのすべての変異体は非常によく 切断できることを示している。触媒オリゴマーはウラシル類似体、キナゾリン− ２，４−ジオンのようなかさばった基を全く申し分なく許容している。与えられ た基質に触媒構造を最適化するために変形できる触媒オリゴマー中の部位が存在 していることを示しているので、このような情報は重要である。実施例７：肝炎Ｃウイルスから誘導される長い基質のインビトロ切断 プラスミドから転写された長いＲＮＡ基質が、開示された組成物を用いるその ような基質の切断を示すために使用された。プラスミドｐＮ（１−４７２８）は 肝炎Ｃウイルスゲノム（ＨＣＶ）の第一の１３５８塩基を含んでいる。配列は、 １３５８塩基転写体を生成するＢａｍＨＩ直線化プラスミドのランオフ転写体が 可能なように配向されている。ランオフ転写（３−５μｇ）は４０ｍＭトリス− ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭスペルミジン、５ｍＭ Ｄ ＴＴ、２０００Ｕ／ｍｌ胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤(Ｐｒｏｍｅｇａ)、各々３ｍＭの ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、５０μＣｉの［α−³²Ｐ］ＧＴＰ（Ｄｕ Ｐｏｎｔ ＮＥＮ）および３０００Ｕ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅ ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んでいる１００μｌの反応液で実施 された。反応液は３７℃で２−３時間インキュベートし、１００μｌのＲＮＡゲ ル添加緩衝液（９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％キシレ ンシアノールＦＦおよび０．０２５％ブロモフェノールブル−）を加えることに より反応を停止させる。混合物は次に９０℃で３分間加熱し、氷上で急冷して４ ％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動する。１３５８ヌクレオチド長 転写体はＵＶで影をつけることにより可視化し、バンドを切り出し、ＲＮＡは１ 時間の電気泳動により抽出した。ＲＮＡは一夜のエタノール沈殿により回収され た。遠心分離および７０％エタノールによる洗浄後、精製された転写体は２０μ ｌのＤＥＰＣ滅菌水に再懸濁し、濃度はＵＶ測定により決定された。 以下のオリゴマーがＨＣＶのランオフ転写体を標的にするために設計された。 Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー ^*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 これらの配列は転写体に存在するＨＣＶゲノムのＧＣＡ−３４５部位を標的に している。 切断反応は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３ ０ｎＭ放射標識転写体および３００ｎＭ触媒オリゴマー（配列ＩＤ番号：２８− ３１）を含んでいる１０μｌの反応容量で実施された。インキュベーションは３ ７℃で１０分間および各々の試験されたオリゴマーと６０分間実施され、反応は ２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むゲル添加緩衝液１０μｌを加えることにより停止させ 、９０℃で５分間加熱し、氷上で５分間冷却した。非切断転写体および切断生成 物は４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルでの電気泳動により分離した。電気 泳動後、ゲルをＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭフィルター濾紙上に移し、８０℃で２時 間乾燥させた。バンドはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーンへ暴露するこ とにより定量した。 これらのアッセイの結果は触媒オリゴマーの４つすべてがＨＣＶランオフ転写 体を切断できたことを示している。このことはＵ⁴、Ｇ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²および Ｉ^15.1位を除いて（配列ＩＤ番号：３０）およびＧ⁵、Ａ⁶、Ｇ⁸、Ｇ¹²およびＩ^{1 5.1} 位を除いて（配列ＩＤ番号：２８、２９および３１）すべてに２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチドを含んでいる標的触媒オリゴマーは長いＲＮＡを切断で きることを示している。実施例８：ＧＣＡおよびＧＵＡトリプレットを標的としている触媒オリゴマーを 用いる、肝炎Ｃウイルスから誘導された長い基質のインビトロ切断の比較 切断アッセイは、１３５８塩基ＨＣＶ基質を切断するために設計された触媒オ リゴマーが３０ｎＭほどの低い濃度で機能することを示すために実施された。ラ ンオフ転写体は実施例７のように製造された。これらのアッセイで使用されたオ リゴマーは以下のものである： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー^*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ，Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 これらの触媒オリゴマーはＧＣＡ３４５トリプレット（配列ＩＤ番号：２８の オリゴマー）およびＧＵＡ３７８トリプレット（配列ＩＤ番号：３２）を標的に している。ＨＣＶの１３５８ランオフ転写体の切断反応を分析するときに得られ る断片は、ＧＣＡ３４５部位での切断に対しては３４７および１０１１ヌクレオ チド長、およびＧＵＡ３７８部位での切断に対しては３８０および９７８ヌクレ オチド長である。触媒オリゴマーは１時間の反応時間では１および３μＭ、およ び３時間の反応時間では３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭおよび３μ Ｍの濃度で比較された。すべての他の反応および条件は実施例７と同じである。 試験された触媒オリゴマーのすべての濃度で３時間後には、オリゴマーがＨＣ Ｖ転写体を切断していることをデータの分析は示した。このことは３０ｎＭの触 媒オリゴマー濃度はＨＣＶゲノムの１３５８塩基ＲＮＡ断片を切断できることを 示している。実施例９：ジュルカット細胞溶解物中のヒトＩＬ−２ｍＲＮＡの切断 切断アッセイは、ＩＬ−２ｍＲＮＡを標的とする触媒オリゴマーが、細胞溶解 物溶液中の天然のままのｍＲＮＡを切断できることを示すために実施された。こ れらのアッセイは下記の配列を持つ触媒オリゴマーで実施された： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー ^*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 この配列はヒトインターロイキン−２ｍＲＮＡ（ＥＭＢＬヌクレオチド配列デー タベース４３版中の配列名ＨＳＩＬ２Ｒ）のＧＣＡ(ここでＡは１４０位である) 後を切断するように設計された。 ジュルカット細胞はＩＬ−２の発現を誘導するためにホルボール １２−ミリ ステート １３−アセテート（ＰＭＡ）／フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で５ 時間刺激された。粗細胞溶解物は以下のような凍結−融解により調製された：２ ｘ１０⁷細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない５００ μｌの脱イオン水に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした後、液体窒素 で急速冷凍し、３７℃で融解した。細胞破片は低速遠心分離により除去し、切断 アッセイで使用するための粗溶解物を残した。 各々の切断反応は、６２．５μｌの細胞溶解物、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１μＭ触媒オリゴマーを含んでいる１００μｌの反 応液中３７℃にて０、１０、３０、６０および１２０分の反応時間で実施された 。以下の対照実験が行われた、オリゴマーを含まない１２０分後の対照、ＩＬ− ２プローブ対照、ＩＬ−２およびβ−アクチンＲＮａｓｅ消化、およびオリゴマ ーを含まない１０分後の対照。ＲＮＡはＢｉｏＧｅｎｅ Ｘ−Ｃｅｌｌ溶液を用 いる反応から精製され、ＡｍｂｉｏｎからのＲＰＡ ＩＩキットを用い、使用説 明書のプロトコールに従ったリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）により分 析された。ＩＬ−２のためのビオチン標識アンチセンスＲＮＡプローブおよびβ −アクチンＲＮＡ（内部標準）はＳＰ６転写キットを使用して調製された。β− アクチンプローブのための鋳型はＡｍｂｉｏｎから購入され、３３４ヌクレオチ ドのＲＮＡプローブおよび２４５ヌクレオチド長の保護断片が生成された。 すべてのＩＬ−２プローブ鋳型がジュルカット細胞ＲＮＡからのＩＬ−２配列 の断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することにより作製された。一つの プライマーには得られるＤＮＡプローブがＰＣＲ反応で直接転写できるようにＳ Ｐ６転写プロモーター部位も含まれている。プローブは４８７ヌクレオチド長で あるように設計され、ＩＬ−２ＲＮＡのＲＰＡ分析後に４８７ヌクレオチドの保 護断片を導く。触媒オリゴマーによる切断後のＲＰＡ分析は完全長ＲＮＡに加え て４２８および５９ヌクレオチドの保護断片を同定しなければならない。 保護ＲＮＡ断片はポリアクリルアミドゲル電気泳動（５％）により分離し、ナ イロン膜上にブロットし、ＡｍｂｉｏｎからのＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｂｉｏｄ ｅｔｅｃｔキットを用いた化学発光検出により可視化した。５００、４００、３ ００および２００ヌクレオチド長のビオチニル化ＲＮＡマーカーが使用された。 細胞溶解物は前記のように調製され、細胞内転写により生成されたＩＬ−２ｍＲ ＮＡを含んでいる。この細胞溶解物は標的基質を含んでいる。基質および触媒オ リゴマー間の反応はＩＬ−２ｍＲＮＡの４２８塩基および５９塩基断片を生成す る。この配列のための標識プローブを使用することにより、切断生成物が検出で きる。ＩＬ−２ｍＲＮＡは細胞溶解物存在下で触媒オリゴマー、配列ＩＤ番号： ３３により切断された。このことは、インビボでｍＲＮＡに関連する細胞物質存 在下、触媒オリゴマーが長い天然のままのｍＲＮＡを切断できることを示してい る。実施例１０：ＣＨＯ細胞溶解物中のラットドーパミンＤ２レセプターＲＮＡの切 断 切断アッセイは、ラットドーパミンＤ２レセプターｍＲＮＡを標的とした触媒 オリゴマーが、ＣＨＯ細胞溶解物溶液中の天然のままのｍＲＮＡを切断できるこ とを示すために実施された。アッセイは下記の配列の触媒オリゴマーで実施され た： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー ^*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 この配列はラットドーパミンＤ２レセプターＲＮＡ（ＥＭＢＬヌクレオチド配列 データベース４３版中の配列名ＲＮＤ２ＤＯＰＲ）のＧＣＡ（ここでＡは８１１ 位である）後を切断するように設計された。 粗細胞溶解物は前記実施例９に記載したような凍結−融解法により、ラットド ーパミンＤ２レセプター遺伝子で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から作 製された。各々の切断反応は、６２．５μｌの細胞溶解物、５０ｍＭトリスｐＨ ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０．５μＭ触媒オリゴマーを含んでいる１ ００μｌの反応液中３７℃にて１０、３０、６０および１２０分の反応時間で実 施された。以下の対照実験が実施された：ＲＮａｓｅで切断したドーパミンＤ２ レセプターＲＮＡおよびβ−アクチン、ドーパミンＤ２レセプターＲＮＡおよび β−アクチン対照、ラットドーパミンＤ２レセプターＲＮＡプローブおよびβ− アクチン対照、オリゴマーを含まない１０分後の対照、オリゴマーを含まない３ ０分後の対照およびオリゴマーを含まない６０分後の対照。 ＲＮＡは反応液から精製され、ＡｍｂｉｏｎからのＲＰＡ ＩＩキットを用い 、使用説明書のプロトコールに従ったリボヌクレアーゼ保護アッセイにより分析 された。ラットドーパミンＤ２レセプターのためのビオチン標識アンチセンスＲ ＮＡプローブおよびマウスβ−アクチンＲＮＡ（内部標準）はＳＰ６転写キット を使用して調製された。β−アクチンプローブのための鋳型はＡｍｂｉｏｎから 購入され、３３４ヌクレオチドのＲＮＡプローブおよび２４５ヌクレオチド長の 保護断片が生成された。 ドーパミンＤ２レセプタープローブ鋳型が、ＣＨＯ細胞ＲＮＡからのドーパミ ンＤ２レセプター配列の断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することによ り作製された。一つのプライマーには、得られるＤＮＡプローブがＰＣＲ反応で 直接転写できるように、ＳＰ６転写プロモーター部位も含まれている。プローブ は、ドーパミンＤ２レセプターＲＮＡの分析後に６６３ヌクレオチドであるよう に設計された。触媒オリゴマーによる切断後のＲＰＡ分析は、完全長ＲＮＡに加 えて３９４および２６９ヌクレオチドの保護断片を同定しなければならない。保 護ＲＮＡ断片は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５％）により分離し、ナイ ロン膜上にブロットし、ＡｍｂｉｏｎからのＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｂｉｏｄｅ ｔｅｃｔキットを用いた化学発光検出により可視化した。 結果はＤ２レセプターＲＮＡは触媒オリゴマー、配列ＩＤ番号：３４により切 断されることを示している。切断生成物は１０分で検出可能で時間とともに増加 し、時間中、触媒オリゴマーは実質上分解されていないことを示している。実施例１１：Ａ５４９細胞溶解物中のヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの切断 切断アッセイは、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡを標的とする触媒オリゴマーが、Ａ５ ４９細胞溶解物溶液中の天然のままのｍＲＮＡを切断できることを示すために実 施された。これらのアッセイは下記の配列を持つ触媒オリゴマーで実施された： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー ^*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 これらの配列はＡＣＡ部位の後ろを切断するように設計されており、ここで第 一のＡはヒト細胞内接着分子−１ｍＲＮＡ（ＩＣＡＭ−１）(ＥＭＢＬヌクレオ チド配列データベース４３版中の配列名ＨＳＩＣＡＭ０１)の塩基１２０５（配 列ＩＤ番号：３５）および１５９２位（配列ＩＤ番号：３６）に位置している。 粗細胞溶解物は前記実施例９に記載したような凍結−融解法により、ＩＣＡＭ −１を誘導するために１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦαで５時間剌激した後のＡ５４ ９細胞から作製された。各々の切断反応は、６２．５μｌの細胞溶解物、５０ｍ ＭトリスｐＨ７．５、７０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および５００ｎＭオリゴマー、２０ ０ｎＭオリゴマー、１００ｎＭオリゴマー、５０ｎＭオリゴマーの最終濃度の触 媒オリゴマー、触媒オリゴマーを含まない対照、を含む１００μｌの反応液中で ３７℃で２時間実施された。ＲＮＡは反応液から精製され、Ａｍｂｉｏｎからの ＲＰＡ ＩＩキットを用い、使用説明書のプロトコールに従ったリボヌクレアー ゼ保護アッセイにより分析された。ヒトＩＣＡＭ−１およびＧＡＰＤＨ ＲＮＡ （内部標準）のためのビオチン標識アンチセンスＲＮＡプローブはＳＰ６転写キ ットを使用して調製された。ＧＡＰＤＨのための鋳型はＡｍｂｉｏｎから購入さ れ、３１６ヌクレオチド長の保護断片が生成された。 ＩＣＡＭ−１プローブ鋳型は、Ａ５４９細胞ＲＮＡからのＩＣＡＭ−１配列の 断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することにより作製された。一つのプ ライマーには、得られるＤＮＡプローブがＰＣＲ反応で直接転写できるように、 ＳＰ６転写プロモーター部位も含まれている。プローブは５９８ヌクレオチド長 であるように設計され、ＩＣＡＭ−１ ＲＮＡのＲＰＡ分析後に５９８ヌクレオ チドの保護断片を導く。触媒オリゴマーによる切断後のＲＰＡ分析は、完全長Ｒ ＮＡに加えて５５２および４６ヌクレオチド（１２０５ＡＣＡ部位）および４３ ３および１６５ヌクレオチド（１５９２ＡＣＡ部位）の保護断片を同定しなけれ ばならない。 保護ＲＮＡ断片は、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ナイ ロン膜上にブロットし、ＡｍｂｉｏｎからのＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｂｉｏｄｅ ｔｅｃｔキットを用いた化学発光検出により可視化した。５００、４００、３０ ０および２００ヌクレオチド長のビオチニル化ＲＮＡマーカーが使用された。切 断生成物は試験されたオリゴマーのすべての濃度で生成された。１５９２ＡＣＡ 部位での切断は、５０ｎＭのみの触媒オリゴマーを使用しても特に有効であった 。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＲＮＡ基質を切断する組成物であって、成分（ａ）および（ｂ）を含 み、 成分（ａ）は５’−Ｚ₁−Ｚ₂−３’を含み、および成分（ｂ）は５’−Ｚ₃− Ｚ₄−３’を含み、成分（ａ）および（ｂ）は別々の分子でも共有結合で結合さ れていてもよく、 式中、Ｚ₁およびＺ₄は（１）ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはその両 方を含むか、または（２）オリゴヌクレオチド類似体であるオリゴマー配列であ り、ここでオリゴマー配列はハイブリダイゼーションによりＲＮＡ基質と特異的 に相互作用する、 式中、Ｚ₂は ５’−Ｘ³Ｘ⁴Ｘ⁵Ｘ⁶Ｘ⁷Ｘ⁸Ｘ⁹−３’または ５’−Ｘ³Ｘ⁴Ｘ⁵Ｘ⁶Ｘ⁷Ｘ⁸Ｘ⁹Ｘ⁹＾−３’であり、 式中、Ｚ₃は ５’−Ｘ¹²Ｘ¹³Ｘ¹⁴Ｘ^15.1−３’または ５’−Ｘ＾¹²Ｘ¹²Ｘ¹³Ｘ¹⁴Ｘ^15.1−３’であり、 式中Ｚ₂およびＺ₃はヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはその両方を含み 、ここでヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は各々下記の構造を持っている ： 式中、各々のＢは独立してアデニン−９−イル、シトシン−１−イル、グアニ ン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９ −イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジアミノ プリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、７−デ アザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロピニル ウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル、 ６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリミドン −１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９−イル、 Ｎ²−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的等価物であり、 式中、各々のＶは独立してＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ₂基であり、 式中、各々のＷは独立してＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ₂、−ＣＯＮ ＨＲ¹、−ＣＯＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＣＯＲ¹、− ＳＨ、−ＳＲ¹、−Ｆ、−ＯＮＨ₂、−ＯＮＨＲ¹、−ＯＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＯＨ、 −ＮＨＯＲ¹、−ＮＲ²ＯＨ、−ＮＲ²ＯＲ¹、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₁₀直鎖ま たは分岐鎖アルキル、置換または非置換Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルケニル 、置換または非置換Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルキニル、置換または非置換 Ｃ₁−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルコキシ、置換または非置換Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または 分岐鎖アルケニルオキシ、置換または非置換Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルキ ニルオキシ、（ここで置換基は独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ 、エステル、エーテル、カルボキサミド、ヒドロキシまたはメルカプトであり、 式中、Ｒ¹およびＲ²は独立して置換または非置換アルキル、アルケニル、または アルキニル基であり、ここで置換基は独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カル ボキシ、エステル、エーテル、カルボキサミド、ヒドロキシまたはメルカプトで ある）から成る群より選択され、 式中、ＤおよびＥは、隣接するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体との間 で一緒にホスホジエステルまたはホスホロチオエートジエステル結合を形成する か、または一緒になってヌクレオシド間結合の類似結合を形成する残基であり、 Ｘ^15.1においてＢはヒポキサンチン−９−イルまたはその機能的等価物であり 、 Ｘ⁵、Ｘ⁸およびＸ¹²においてＢは独立してグアニン−９−イル、ヒポキサンチ ン−９−イルまたは７−デアザグアニン−９−イルであり； Ｘ⁶、Ｘ⁹、Ｘ¹³およびＸ¹⁴においてＢは独立してアデニン−９−イル、２，６ −ジアミノプリン−９−イル、プリン−９−イルまたは７−デアザアデニン−９ −イルであり； Ｘ⁴においてＢはウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、チミン−１−イ ルまたは５−プロピルニルウラシル−１−イルであり； Ｘ³においてＢシトシン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イルまたは５ −プロピニルシトシン−１−イルであり； Ｘ⁷、Ｘ⁹＾およびＸ＾¹²においてＢは独立してアデニン−９−イル、シトシン −１−イル、グアニン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、 ヒポキサンチン−９−イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル 、２，６−ジアミノプリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン −９−イル、７−デアザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イ ル、５−プロピニルウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノ プリン−９−イル、６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イ ル、２−ピリミドン−１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサ ンチン−９−イル、Ｎ²−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的等 価物である組成物。 ２． ＲＮＡ基質が ５’−Ｚ₄’−Ｃ^16.1−Ｘ¹⁷−Ｚ₁’−３’ （式中、Ｚ₁’およびＺ₄’はＺ₁およびＺ₄と相互作用し、式中はＣ^16.1シチ ジンであり、式中Ｘ¹⁷はアデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンであ り、切断はＸ¹⁷の３’リン酸で起こる）から成る請求項第１項に記載の組成物。 ３． Ｘ¹⁷がアデノシン、シチジンまたはウリジンである請求項第２項に記 載の組成物。 ４． 成分（ａ）および（ｂ）が共有結合で結合されて構造５’−Ｚ₁−Ｚ₂ −Ｚ₅−Ｚ₃−Ｚ₄−３’（式中Ｚ₅はリンカーである）を形成する請求項第１項に 記載の組成物。 ５． リンカーがオリゴマー配列、非ヌクレオチドリンカーおよびオリゴマ ー配列および非ヌクレオチドリンカーの組み合わせから成る群より選択される請 求項第４項に記載の組成物。 ６． オリゴマー配列が独立して（ａ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド類 似体を含んでいるかまたは（ｂ）オリゴヌクレオチド類似体である請求項第５項 に記載の組成物。 ７． 成分（ａ）および（ｂ）が別々の分子である請求項第１項に記載の組 成物、 ここで成分（ａ）は５’−Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₆−３’を含み、 ここで成分（ｂ）は５’−Ｚ₇−Ｚ₃−Ｚ₄−３’を含み、 式中、Ｚ₆およびＺ₇は（１）ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはその両 方から成っているか、または（２）オリゴヌクレオチド類似体であるオリゴマー 配列であり、ここでオリゴマー配列はお互いに特異的に相互作用する。 ８． Ｚ₁およびＺ₄がリボヌクレオチドであるどんなピリミジンも含んでい ない請求項第１項に記載の組成物。 ９． Ｚ₁およびＺ₄がどんなリボヌクレオチドも含んでいない請求項第１項 に記載の組成物。 １０． Ｚ₁およびＺ₄がヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはそれらの両 方から成る請求項第１項に記載の組成物、ここでヌクレオチド、ヌクレオチド類 似体は各々下記の構造を持っている： 式中、各々のＢは独立してアデニン−９−イル、シトシン−１−イル、グアニ ン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９ −イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジアミノ プリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、７−デ アザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロピニル ウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル、 ６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリミドン −１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９−イル、 Ｎ²−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的等価物であり、 式中、各々のＶは独立してＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ₂基であり、 式中、各々のＷは独立して置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アル キル、Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アル キニル、Ｃ₁−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルコキシ、Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖ア ルケニルオキシ、Ｃ₂−Ｃ₁₀直鎖または分岐鎖アルキニルオキシから成る群より 選択され、 式中、ＤおよびＥは、隣接するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体との間 で一緒にホスホジエステルまたはホスホロチオエートジエステル結合を形成する か、または一緒になってヌクレオシド間結合の類似結合を形成する残基である。 １１． Ｚ₁およびＺ₄が各々独立して３から４０のヌクレオチド、ヌクレオチ ド類似体またはその組み合わせを含んでいる請求項第１項に記載の組成物。 １２． Ｚ₂、Ｚ₃またはその両方が、一つまたはいくつかのヌクレオチド類似 体を含んでいる組成物であって、ここで各々のＷはＣ₁−Ｃ₅直鎖または分岐鎖ア ルキル、Ｃ₂−Ｃ₅直鎖または分岐鎖アルケニル、Ｃ₂−Ｃ₅直鎖または分岐鎖アル キニル、Ｃ₁−Ｃ₅直鎖または分岐鎖アルコキシ、Ｃ₂−Ｃ₅直鎖または分岐鎖アル ケニルオキシまたはＣ₂−Ｃ₅直鎖または分岐鎖Ｃ₂−Ｃ₅アルキニルオキシから成 る群より選択される請求項第１項に記載の組成物。 １３． 各々の遊離３’末端がエキソヌクレアーゼ分解に対して保護されてい る請求項第１項に記載の組成物。 １４． 各々のＸ³、Ｘ⁴、Ｘ⁷およびＸ＾¹²において、Ｗが独立してＮＨ₂、Ｏ Ｈ−置換Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ＯＨ−置換Ｃ₂−Ｃ₄アルケニル、ＯＨ−置換Ｃ₁− Ｃ₄アルコキシまたはＯＨ−置換Ｃ₂−Ｃ₄アルケニルオキシである請求項第１項 に記載の組成物。 １５． 各々のＸ³、Ｘ⁴、Ｘ⁷およびＸ＾¹²において、Ｗが独立してＮＨ₂、メ トキシ、２−ヒドロキシエトキシ、アリルオキシまたはアリルである請求項第１ ４項に記載の組成物。 １６． Ｘ¹²がリボヌクレオチドである請求項第１項に記載の組成物。 １７． Ｘ¹³およびＸ¹⁴またはその組み合わせがヌクレオチド類似体（式中、 各々のＷは独立してＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₂−Ｃ₄アルケニル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキ シ、Ｃ₂−Ｃ₄アルケニルオキシ、ＯＨ−置換Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、ＯＨ−置換Ｃ₂ −Ｃ₄アルケニル、ＯＨ−置換Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシまたはＯＨ−置換Ｃ₂−Ｃ₄ア ルケニルオキシである）である請求項第１項に記載の組成物。 １８． Ｘ¹³およびＸ¹⁴またはその組み合わせがヌクレオチド類似体（式中、 各々のＷは独立してメトキシ、２−ヒドロキシエトキシ、アリルオキシである） である請求項第１項に記載の組成物。 １９． Ｘ^15.1がリボヌクレオチドである請求項第１項に記載の組成物。 ２０． ＲＮＡ基質の特異的切断のための方法であって、請求項第１項に記載 の組成物をＲＮＡ基質と接触させることを含む方法。 ２１． 遺伝子の機能を同定するための方法であって、 請求項第１項に記載の組成物および遺伝子を含んでいる細胞を接触 させること、ここで組成物は遺伝子の発現を減少させる、および 細胞中の変化を観察することを含む方法。 ２２． ＲＮＡ分子に関連する疾患を処置する方法であって、疾患を持つ患者 に請求項第１項に記載の組成物を投与することを含み、ここでＲＮＡ基質はその 疾患に関係するＲＮＡ分子である方法。 ２３． ＲＮＡ分子が過剰発現されているＲＮＡ分子である請求項第２２項に 記載の方法。