JP2002107350A - ５−ヒドロキシクレアチニンの測定法 - Google Patents
５−ヒドロキシクレアチニンの測定法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】腎機能障害等の検査法として有用な５-ヒドロ
キシクレアチニンの高感度且つ実用的な測定法を提供す
る。 【解決手段】強酸性陽イオン交換樹脂を用いる高速液体
クロマトグラフィーにおいて、ｐＨが４．１乃至４．６
の分離溶媒を用いることを特徴とする５-ヒドロキシク
レアチニンの測定法。 【効果】本発明の５-ヒドロキシクレアチニン測定法は
検出感度が０．０２μＭと、健常人血中の５-ヒドロキ
シクレアチニンレベルも測定できるものであり、従来方
法よりも非常に高感度な測定法である。また、単一の分
離溶媒のみを用いればよく、分析時間も１サイクル約１
４分／件と従来方法よりも迅速で、１セットのＨＰＬＣ
で１００件／日の処理が可能であり、従来方法では実現
できなかった実用化を達成できる非常に効率的で有用な
測定法である。
キシクレアチニンの高感度且つ実用的な測定法を提供す
る。 【解決手段】強酸性陽イオン交換樹脂を用いる高速液体
クロマトグラフィーにおいて、ｐＨが４．１乃至４．６
の分離溶媒を用いることを特徴とする５-ヒドロキシク
レアチニンの測定法。 【効果】本発明の５-ヒドロキシクレアチニン測定法は
検出感度が０．０２μＭと、健常人血中の５-ヒドロキ
シクレアチニンレベルも測定できるものであり、従来方
法よりも非常に高感度な測定法である。また、単一の分
離溶媒のみを用いればよく、分析時間も１サイクル約１
４分／件と従来方法よりも迅速で、１セットのＨＰＬＣ
で１００件／日の処理が可能であり、従来方法では実現
できなかった実用化を達成できる非常に効率的で有用な
測定法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腎機能障害等の検査法
として有用な５-ヒドロキシクレアチニンの測定法に関
する。
として有用な５-ヒドロキシクレアチニンの測定法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】５-ヒドロキシクレアチニンは、腎不全
患者の血中に蓄積する主要な尿毒素の一つであるメチル
グアニジンが産生される際の中間体として見いだされた
物質であり、クレアチニンの非酵素的酸化により生成す
ることが明らかにされている。５-ヒドロキシクレアチ
ニンは、健常人血清中からは検出されないが、腎不全患
者の血清中に早期から検出され、症状の悪化に伴い増加
していることより、５-ヒドロキシクレアチニンは腎機
能障害マーカーとして注目され、その測定は腎不全患者
の病態把握や早期発見に有用であると重要視されつつあ
る。クレアチニンの非酵素的酸化には、反応性が極めて
高いことで知られるヒドロキシルラジカルが関与してい
ると考えられており、クレアチニンからメチルグアニジ
ンへの変換反応の中間体である５-ヒドロキシクレアチ
ニンは、尿毒素メチルグアニジンの前駆体としてだけで
はなく、生体内におけるヒドロキシルラジカル産生の指
標（酸素ストレス状態の指標）としても注目を集めてい
る。このように、現在では５-ヒドロキシクレアチニン
の測定値は、腎不全、糖尿病性腎症、腎炎などの腎機能
障害マーカー、更に全身の酸化ストレスマーカーとして
有用であると示唆されている。
患者の血中に蓄積する主要な尿毒素の一つであるメチル
グアニジンが産生される際の中間体として見いだされた
物質であり、クレアチニンの非酵素的酸化により生成す
ることが明らかにされている。５-ヒドロキシクレアチ
ニンは、健常人血清中からは検出されないが、腎不全患
者の血清中に早期から検出され、症状の悪化に伴い増加
していることより、５-ヒドロキシクレアチニンは腎機
能障害マーカーとして注目され、その測定は腎不全患者
の病態把握や早期発見に有用であると重要視されつつあ
る。クレアチニンの非酵素的酸化には、反応性が極めて
高いことで知られるヒドロキシルラジカルが関与してい
ると考えられており、クレアチニンからメチルグアニジ
ンへの変換反応の中間体である５-ヒドロキシクレアチ
ニンは、尿毒素メチルグアニジンの前駆体としてだけで
はなく、生体内におけるヒドロキシルラジカル産生の指
標（酸素ストレス状態の指標）としても注目を集めてい
る。このように、現在では５-ヒドロキシクレアチニン
の測定値は、腎不全、糖尿病性腎症、腎炎などの腎機能
障害マーカー、更に全身の酸化ストレスマーカーとして
有用であると示唆されている。
【０００３】このような腎障害マーカーなどの指標とな
る５-ヒドロキシクレアチニンの測定法については、本
発明者の一人である中村らによる高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法（特開平４−１６１８
５４号公報及び特開平５−１１９０３８号公報）が知ら
れていた。この方法は、高速液体クロマトグラフィーに
より５-ヒドロキシクレアチニンを分離した後に、得ら
れた５-ヒドロキシクレアチニンを加水分解してメチル
グアニジンへ変換し、蛍光ラベルして定量する方法であ
る。前記公開特許公報に記載の方法では、陽イオン交換
カラムを用い、分離溶媒の組成は東舘らの方法（分析化
学、３３、ｐ．３６６−３７０（１９８４））に準じ
て、第１分離溶媒（クエン酸ナトリウム／塩酸、ｐＨ
３．００）４．５分、第２分離溶媒（クエン酸ナトリウ
ム／塩酸、ｐＨ３．５０）２．８分、第３分離溶媒（ク
エン酸ナトリウム／塩酸、ｐＨ５．２５）２．４分、第
４分離溶媒（クエン酸ナトリウム／ホウ酸／水酸化ナト
リウム、ｐＨ１０．００）２．３分、第５分離溶媒（１
Ｍ水酸化ナトリウム）３．０分、という５種類の分離溶
媒を用いて５-ヒドロキシクレアチニンの分離を行って
いる。また、同じく中村らによる論文（Ｎｅｐｈｒｏ
ｎ、６６、ｐ．１４０−１４６（１９９４））では、陽
イオン交換カラムを用い、分離溶媒として０．４Ｍクエ
ン酸９部にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１部を加
えてｐＨを５．２５に調整したものを用いて５-ヒドロ
キシクレアチニンの分離・測定を行う方法が開示されて
いる。
る５-ヒドロキシクレアチニンの測定法については、本
発明者の一人である中村らによる高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法（特開平４−１６１８
５４号公報及び特開平５−１１９０３８号公報）が知ら
れていた。この方法は、高速液体クロマトグラフィーに
より５-ヒドロキシクレアチニンを分離した後に、得ら
れた５-ヒドロキシクレアチニンを加水分解してメチル
グアニジンへ変換し、蛍光ラベルして定量する方法であ
る。前記公開特許公報に記載の方法では、陽イオン交換
カラムを用い、分離溶媒の組成は東舘らの方法（分析化
学、３３、ｐ．３６６−３７０（１９８４））に準じ
て、第１分離溶媒（クエン酸ナトリウム／塩酸、ｐＨ
３．００）４．５分、第２分離溶媒（クエン酸ナトリウ
ム／塩酸、ｐＨ３．５０）２．８分、第３分離溶媒（ク
エン酸ナトリウム／塩酸、ｐＨ５．２５）２．４分、第
４分離溶媒（クエン酸ナトリウム／ホウ酸／水酸化ナト
リウム、ｐＨ１０．００）２．３分、第５分離溶媒（１
Ｍ水酸化ナトリウム）３．０分、という５種類の分離溶
媒を用いて５-ヒドロキシクレアチニンの分離を行って
いる。また、同じく中村らによる論文（Ｎｅｐｈｒｏ
ｎ、６６、ｐ．１４０−１４６（１９９４））では、陽
イオン交換カラムを用い、分離溶媒として０．４Ｍクエ
ン酸９部にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１部を加
えてｐＨを５．２５に調整したものを用いて５-ヒドロ
キシクレアチニンの分離・測定を行う方法が開示されて
いる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前述の
公開特許公報に記載の分離方法では、グアニジノ化合物
に関する東舘らの公知方法に準じているため５種類もの
分離溶媒を調製しておかなくてはならず、また測定に際
しては、これら分離溶媒の切り替えや溶出時間の制御な
どのプログラム化など、非常に煩雑で手間がかかるばか
りでなく、測定感度も０．５〜１ｎｍｏｌ／ｍＬ（６．
５〜１３μｇ／ｄＬ）と、生体試料中の５-ヒドロキシ
クレアチニンの微量な変化を測定するには充分な感度を
有しているものではなかった。また、中村らの論文によ
る方法は、溶出時間が３０分と長く効率的な方法ではな
く、測定感度は約２μｇ／ｄＬであったが、腎機能障害
の初期における５-ヒドロキシクレアチニンの微量な変
化を測定する場合などにおいては充分な感度を有してい
るとは言えず、満足できるものではなかった。
公開特許公報に記載の分離方法では、グアニジノ化合物
に関する東舘らの公知方法に準じているため５種類もの
分離溶媒を調製しておかなくてはならず、また測定に際
しては、これら分離溶媒の切り替えや溶出時間の制御な
どのプログラム化など、非常に煩雑で手間がかかるばか
りでなく、測定感度も０．５〜１ｎｍｏｌ／ｍＬ（６．
５〜１３μｇ／ｄＬ）と、生体試料中の５-ヒドロキシ
クレアチニンの微量な変化を測定するには充分な感度を
有しているものではなかった。また、中村らの論文によ
る方法は、溶出時間が３０分と長く効率的な方法ではな
く、測定感度は約２μｇ／ｄＬであったが、腎機能障害
の初期における５-ヒドロキシクレアチニンの微量な変
化を測定する場合などにおいては充分な感度を有してい
るとは言えず、満足できるものではなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、５
-ヒドロキシクレアチニンの測定法について更に鋭意研
究を行った結果、従来技術の問題点を克服した実用的な
本発明の５-ヒドロキシクレアチニンの測定法を見出
し、本発明を完成した。本発明の目的は、腎機能障害の
検査法として有用な、高速液体クロマトグラフィーを用
いた５-ヒドロキシクレアチニンの高感度且つ実用的な
測定法を提供することにある。
-ヒドロキシクレアチニンの測定法について更に鋭意研
究を行った結果、従来技術の問題点を克服した実用的な
本発明の５-ヒドロキシクレアチニンの測定法を見出
し、本発明を完成した。本発明の目的は、腎機能障害の
検査法として有用な、高速液体クロマトグラフィーを用
いた５-ヒドロキシクレアチニンの高感度且つ実用的な
測定法を提供することにある。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明は、強酸性陽イオン交換樹
脂を用いる高速液体クロマトグラフィーにおいて、ｐＨ
が４．１乃至４．６の分離溶媒を用いることを特徴とす
る５-ヒドロキシクレアチニンの測定法に関する。
脂を用いる高速液体クロマトグラフィーにおいて、ｐＨ
が４．１乃至４．６の分離溶媒を用いることを特徴とす
る５-ヒドロキシクレアチニンの測定法に関する。
【０００７】以下に本発明について詳細に説明する。本
発明測定法で用いられる強酸性陽イオン交換樹脂は、好
ましくはスチレン−ジビニルベンゼン系スルホン酸型陽
イオン交換樹脂であり、これはスチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体にスルホン酸基が導入された強酸性の陽イ
オン交換樹脂であって種々市販されており、例えば日本
分光株式会社のグアニジノパックII（商品名）を挙げる
ことができる。
発明測定法で用いられる強酸性陽イオン交換樹脂は、好
ましくはスチレン−ジビニルベンゼン系スルホン酸型陽
イオン交換樹脂であり、これはスチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体にスルホン酸基が導入された強酸性の陽イ
オン交換樹脂であって種々市販されており、例えば日本
分光株式会社のグアニジノパックII（商品名）を挙げる
ことができる。
【０００８】本発明測定法のＨＰＬＣで用いる分離溶媒
は、クエン酸バッファーやリン酸バッファーなど適宜使
用できるが、好ましくはクエン酸バッファーであり、ク
エン酸ナトリウムやクエン酸カリウム等を用いて調製で
きる。濃度は適宜設定できるが、クエン酸ナトリウムを
用いた場合は、ナトリウムイオン濃度で０．３０〜０．
４５Ｍの溶液濃度が好ましい。本発明の目的を達成する
ための高い分離能を得るためには、クエン酸ナトリウム
／ジメチルスルホキシド系の分離溶媒を用いるのが好ま
しい。クエン酸ナトリウム／ジメチルスルホキシド系の
分離溶媒とは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をク
エン酸バッファーに適宜添加した混合溶媒であり、ＤＭ
ＳＯを加えることによって、蛍光強度の増強並びに好ま
しい各溶出ピークの分離が得られるなどの効果があるた
め、例えば１０％程度の割合でＤＭＳＯを混合させた分
離溶媒が好ましい。分離溶媒のｐＨは４．１〜４．６の
範囲で用いることができ、上記クエン酸バッファーやリ
ン酸バッファー又はクエン酸ナトリウム／ジメチルスル
ホキシド系の分離溶媒に、塩酸等の酸を添加してｐＨを
調整する。ヒトの尿や血清等の動物由来の試料中の５-
ヒドロキシクレアチニンを測定するに際しては、５-ヒ
ドロキシクレアチニンが他の來雑物と最も明確に分離す
るｐＨを選ぶことが必要であり、後記の実験結果（図
３）で明らかなように、前後に溶出される大きな共雑物
ピークを考慮すると、ｐＨ４．２〜４．３の分離溶媒を
用いるのが好ましい。
は、クエン酸バッファーやリン酸バッファーなど適宜使
用できるが、好ましくはクエン酸バッファーであり、ク
エン酸ナトリウムやクエン酸カリウム等を用いて調製で
きる。濃度は適宜設定できるが、クエン酸ナトリウムを
用いた場合は、ナトリウムイオン濃度で０．３０〜０．
４５Ｍの溶液濃度が好ましい。本発明の目的を達成する
ための高い分離能を得るためには、クエン酸ナトリウム
／ジメチルスルホキシド系の分離溶媒を用いるのが好ま
しい。クエン酸ナトリウム／ジメチルスルホキシド系の
分離溶媒とは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をク
エン酸バッファーに適宜添加した混合溶媒であり、ＤＭ
ＳＯを加えることによって、蛍光強度の増強並びに好ま
しい各溶出ピークの分離が得られるなどの効果があるた
め、例えば１０％程度の割合でＤＭＳＯを混合させた分
離溶媒が好ましい。分離溶媒のｐＨは４．１〜４．６の
範囲で用いることができ、上記クエン酸バッファーやリ
ン酸バッファー又はクエン酸ナトリウム／ジメチルスル
ホキシド系の分離溶媒に、塩酸等の酸を添加してｐＨを
調整する。ヒトの尿や血清等の動物由来の試料中の５-
ヒドロキシクレアチニンを測定するに際しては、５-ヒ
ドロキシクレアチニンが他の來雑物と最も明確に分離す
るｐＨを選ぶことが必要であり、後記の実験結果（図
３）で明らかなように、前後に溶出される大きな共雑物
ピークを考慮すると、ｐＨ４．２〜４．３の分離溶媒を
用いるのが好ましい。
【０００９】本願発明における測定の対象としては、動
物由来の体液又は尿、例えば、血液、血清、血漿、尿な
どが挙げられ、好ましくはヒト由来の血液、血清、血
漿、尿などであり、臨床検査項目として有用となる可能
性がある。
物由来の体液又は尿、例えば、血液、血清、血漿、尿な
どが挙げられ、好ましくはヒト由来の血液、血清、血
漿、尿などであり、臨床検査項目として有用となる可能
性がある。
【００１０】本発明の好ましい実施態様を以下に挙げ
る。 （１）強酸性陽イオン交換樹脂を用いる高速液体クロマ
トグラフィーにおいて、ｐＨが４．１乃至４．６の分離
溶媒を用いることを特徴とする５-ヒドロキシクレアチ
ニンの測定法。 （２）強酸性陽イオン交換樹脂がスチレン−ジビニルベ
ンゼン系スルホン酸型陽イオン交換樹脂である上記
（１）記載の５-ヒドロキシクレアチニンの測定法。 （３）分離溶媒がクエン酸ナトリウム／ジメチルスルホ
キシド系である上記（１）又は（２）に記載の５-ヒド
ロキシクレアチニンの測定法。 （４）動物由来の体液又は尿中の５-ヒドロキシクレア
チニンを測定する上記（１）乃至（３）の一つに記載の
５-ヒドロキシクレアチニンの測定法。 （５）ヒト由来の体液又は尿中の５-ヒドロキシクレア
チニンを測定する上記（４）記載の５-ヒドロキシクレ
アチニンの測定法。 （６）血液中の５-ヒドロキシクレアチニンを測定する
上記（４）又は（５）記載の５-ヒドロキシクレアチニ
ンの測定法。 （７）血清中の５-ヒドロキシクレアチニンを測定する
上記（６）記載の５-ヒドロキシクレアチニンの測定
法。 （８）尿中の５-ヒドロキシクレアチニンを測定する上
記（４）又は（５）記載の５-ヒドロキシクレアチニン
の測定法。
る。 （１）強酸性陽イオン交換樹脂を用いる高速液体クロマ
トグラフィーにおいて、ｐＨが４．１乃至４．６の分離
溶媒を用いることを特徴とする５-ヒドロキシクレアチ
ニンの測定法。 （２）強酸性陽イオン交換樹脂がスチレン−ジビニルベ
ンゼン系スルホン酸型陽イオン交換樹脂である上記
（１）記載の５-ヒドロキシクレアチニンの測定法。 （３）分離溶媒がクエン酸ナトリウム／ジメチルスルホ
キシド系である上記（１）又は（２）に記載の５-ヒド
ロキシクレアチニンの測定法。 （４）動物由来の体液又は尿中の５-ヒドロキシクレア
チニンを測定する上記（１）乃至（３）の一つに記載の
５-ヒドロキシクレアチニンの測定法。 （５）ヒト由来の体液又は尿中の５-ヒドロキシクレア
チニンを測定する上記（４）記載の５-ヒドロキシクレ
アチニンの測定法。 （６）血液中の５-ヒドロキシクレアチニンを測定する
上記（４）又は（５）記載の５-ヒドロキシクレアチニ
ンの測定法。 （７）血清中の５-ヒドロキシクレアチニンを測定する
上記（６）記載の５-ヒドロキシクレアチニンの測定
法。 （８）尿中の５-ヒドロキシクレアチニンを測定する上
記（４）又は（５）記載の５-ヒドロキシクレアチニン
の測定法。
【００１１】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。
【００１２】
【実施例】以下の実施例において、本発明測定法の一例
をより詳細に示す。尚、以下の実験においては、図１記
載のシステムを使用した。図１記載のシステムの概略構
造を図２に示す。また、強酸性陽イオン交換樹脂とし
て、グアニジノパックII（日本分光株式会社製）を用い
た。グアニジノパックIIは６．０ｍｍ（φ）×３５．０
ｍｍの大きさのカラムであり、本願発明において好まし
い態様のカラムである。
をより詳細に示す。尚、以下の実験においては、図１記
載のシステムを使用した。図１記載のシステムの概略構
造を図２に示す。また、強酸性陽イオン交換樹脂とし
て、グアニジノパックII（日本分光株式会社製）を用い
た。グアニジノパックIIは６．０ｍｍ（φ）×３５．０
ｍｍの大きさのカラムであり、本願発明において好まし
い態様のカラムである。
【００１３】実施例１：５−ヒドロキシクレアチニンの
分離条件（ｐＨによる溶出時間の変化）の検討 強酸性陽イオン交換樹脂カラムは、主としてイオン濃
度、ｐＨで目的物の溶出時間が異なる。そこで、分離溶
媒（９部の０．４Ｍクエン酸ナトリウム溶液と１部のＤ
ＭＳＯの混合溶媒）への塩酸添加量を変え、ｐＨを変化
させ、５−ヒドロキシクレアチニンの溶出パターンの変
化を調べた。
分離条件（ｐＨによる溶出時間の変化）の検討 強酸性陽イオン交換樹脂カラムは、主としてイオン濃
度、ｐＨで目的物の溶出時間が異なる。そこで、分離溶
媒（９部の０．４Ｍクエン酸ナトリウム溶液と１部のＤ
ＭＳＯの混合溶媒）への塩酸添加量を変え、ｐＨを変化
させ、５−ヒドロキシクレアチニンの溶出パターンの変
化を調べた。
【００１４】（１）方法 健常人尿を用い、除蛋白処理しサンプルとした。分離溶
媒への塩酸添加量のみを変えることによりｐＨを３〜５
まで変化させ、溶出液とした。１Ｎ水酸化ナトリウムへ
の切り替えは行わず、分離溶媒のみを用いた。５−ヒド
ロキシクレアチニンのピーク以外の來雑物のピークにｇ
１〜ｇ７まで番号を付け、それらピークの挙動を調べ
た。
媒への塩酸添加量のみを変えることによりｐＨを３〜５
まで変化させ、溶出液とした。１Ｎ水酸化ナトリウムへ
の切り替えは行わず、分離溶媒のみを用いた。５−ヒド
ロキシクレアチニンのピーク以外の來雑物のピークにｇ
１〜ｇ７まで番号を付け、それらピークの挙動を調べ
た。
【００１５】（２）結果 ｐＨ４〜５の結果を図３に示した。図中の太い線は、大
きなピークであることを示している。ｐＨが高いほど溶
出時間が早くなるピークと、ほとんど変化しないものと
の二つに分けられた。本実験の結果、５−ヒドロキシク
レアチニンのピークと他の交雑ピークとが最も分離する
のは、ｐＨ３．６と４．３付近であったが、ｐＨ４．３
の方が５−ヒドロキシクレアチニンの溶出時間が早いた
め、実用的であり好ましいと考えられた。従って、以下
の実験においてはｐＨ４．３に調整した分離溶媒を用い
た。
きなピークであることを示している。ｐＨが高いほど溶
出時間が早くなるピークと、ほとんど変化しないものと
の二つに分けられた。本実験の結果、５−ヒドロキシク
レアチニンのピークと他の交雑ピークとが最も分離する
のは、ｐＨ３．６と４．３付近であったが、ｐＨ４．３
の方が５−ヒドロキシクレアチニンの溶出時間が早いた
め、実用的であり好ましいと考えられた。従って、以下
の実験においてはｐＨ４．３に調整した分離溶媒を用い
た。
【００１６】実施例２：５−ヒドロキシクレアチニン検
量線の安定性および検量限界 （１）方法 ５−ヒドロキシクレアチニン標品を１０％トリクロル酢
酸（ＴＣＡ）にて希釈し、２０、１０、４、２、１、
０．４、０．２及び０μＭに調製した。注入量は、各々
０．１ｍＬとした。これらを、各々繰り返し測定し、検
量線の安定性を調べた。変動係数（ＣＶ）２０％未満を
測定範囲とした。
量線の安定性および検量限界 （１）方法 ５−ヒドロキシクレアチニン標品を１０％トリクロル酢
酸（ＴＣＡ）にて希釈し、２０、１０、４、２、１、
０．４、０．２及び０μＭに調製した。注入量は、各々
０．１ｍＬとした。これらを、各々繰り返し測定し、検
量線の安定性を調べた。変動係数（ＣＶ）２０％未満を
測定範囲とした。
【００１７】（２）結果 表１に結果を示した。
【表１】 本発明方法では、２０ｐＭ／０．１ｍＬ注入（０．２μ
Ｍ）において読みとり値のＣＶ２０％未満と安定した測
定ができており、更に低濃度まで安定した値が得られる
と考えられた。
Ｍ）において読みとり値のＣＶ２０％未満と安定した測
定ができており、更に低濃度まで安定した値が得られる
と考えられた。
【００１８】実施例３：低濃度域における５−ヒドロキ
シクレアチニン検量線の安定性および検量限界 （１）方法 ５−ヒドロキシクレアチニン標品を１０％ＴＣＡにて希
釈し、２、０．８、０．４、０．２、０．０８、０．０
４、０．０２及び０μＭに調製した。注入量は、各々
０．１ｍＬとした。これらを、各々繰り返し測定し、検
量線の安定性を調べた。ＣＶ２０％未満を測定範囲とし
た。
シクレアチニン検量線の安定性および検量限界 （１）方法 ５−ヒドロキシクレアチニン標品を１０％ＴＣＡにて希
釈し、２、０．８、０．４、０．２、０．０８、０．０
４、０．０２及び０μＭに調製した。注入量は、各々
０．１ｍＬとした。これらを、各々繰り返し測定し、検
量線の安定性を調べた。ＣＶ２０％未満を測定範囲とし
た。
【００１９】（２）結果 表２に結果を示した。
【表２】 表２に示されているように、０．０２μＭでＣＶ２０％
未満と安定した測定が得られることが分かった。最小二
乗法による検量線は、 ｙ＝３１３３９ｘ−１４７．６３ Ｒ２＝０．９９８８ と良好な直線性が得られた。Ｙ切片が、−１４７．６３
ということで、０．０２μＭ読みとり値のほぼ１／５且
つ１ＳＤと、誤差範囲の値であった。
未満と安定した測定が得られることが分かった。最小二
乗法による検量線は、 ｙ＝３１３３９ｘ−１４７．６３ Ｒ２＝０．９９８８ と良好な直線性が得られた。Ｙ切片が、−１４７．６３
ということで、０．０２μＭ読みとり値のほぼ１／５且
つ１ＳＤと、誤差範囲の値であった。
【００２０】実施例４：測定感度の検討 上記実施例２及び３の結果より、本発明測定法の測定レ
ンジは、０．０２〜２０μＭ（２ｐＭ〜２ｎＭ／０．１
ｍＬ注入）となる。また、検量線は、最大測定濃度２０
μＭから最低測定濃度０．０２μＭ、更には０濃度まで
良好な直線性が得られており、細かく標品の希釈系列を
並べた検量線を求めることをせずとも、２０μＭの一点
絶対測定法により検量線を求めてもよい。更に、健常人
血清中５−ヒドロキシクレアチニンレベルを併せて検討
した結果、測定感度を０．０２μＭとすると、ほぼ全て
のサンプルが測定可能範囲に入ると考えられた。２０μ
Ｍ以上のサンプルは、希釈測定することにより測定が可
能である。
ンジは、０．０２〜２０μＭ（２ｐＭ〜２ｎＭ／０．１
ｍＬ注入）となる。また、検量線は、最大測定濃度２０
μＭから最低測定濃度０．０２μＭ、更には０濃度まで
良好な直線性が得られており、細かく標品の希釈系列を
並べた検量線を求めることをせずとも、２０μＭの一点
絶対測定法により検量線を求めてもよい。更に、健常人
血清中５−ヒドロキシクレアチニンレベルを併せて検討
した結果、測定感度を０．０２μＭとすると、ほぼ全て
のサンプルが測定可能範囲に入ると考えられた。２０μ
Ｍ以上のサンプルは、希釈測定することにより測定が可
能である。
【００２１】
【発明の効果】上記の結果より明らかなように、本発明
の５-ヒドロキシクレアチニン測定法は測定感度が０．
０２μＭ（０．２６μｇ／ｄＬ）と、健常人血中の５-
ヒドロキシクレアチニンレベルも測定できるものであ
り、従来方法よりも非常に高感度な測定法である。ま
た、本発明測定法では単一の分離溶媒のみを用いればよ
く、分析時間も１サイクル約１４分／件と従来方法より
も迅速で、１セットのＨＰＬＣで１００件／日の処理が
可能となり、前記中村らの論文に記載の方法と比べて約
２倍の処理能力、並びに格段の高感度化が達成できた。
高感度化できた理由としては、分析時間が短くなったこ
と、さらに分離溶媒がより酸性側になったことで、５-
ヒドロキシクレアチニンが分析中に分解され難くなった
ことが考えられる。以上のように、本発明５-ヒドロキ
シクレアチニン測定法は、従来方法では実現できなかっ
た実用化を達成できる非常に効率的で有用な測定法であ
る。
の５-ヒドロキシクレアチニン測定法は測定感度が０．
０２μＭ（０．２６μｇ／ｄＬ）と、健常人血中の５-
ヒドロキシクレアチニンレベルも測定できるものであ
り、従来方法よりも非常に高感度な測定法である。ま
た、本発明測定法では単一の分離溶媒のみを用いればよ
く、分析時間も１サイクル約１４分／件と従来方法より
も迅速で、１セットのＨＰＬＣで１００件／日の処理が
可能となり、前記中村らの論文に記載の方法と比べて約
２倍の処理能力、並びに格段の高感度化が達成できた。
高感度化できた理由としては、分析時間が短くなったこ
と、さらに分離溶媒がより酸性側になったことで、５-
ヒドロキシクレアチニンが分析中に分解され難くなった
ことが考えられる。以上のように、本発明５-ヒドロキ
シクレアチニン測定法は、従来方法では実現できなかっ
た実用化を達成できる非常に効率的で有用な測定法であ
る。
【図１】図１は本発明測定法の具体システムの一例であ
る。
る。
【図２】図２は図１に示した本発明測定法の具体システ
ムの概略構造図である。
ムの概略構造図である。
【図３】図３は、分離溶媒のｐＨ変化による、健常人尿
中の５−ヒドロキシクレアチニン及びそれ以外の來雑物
の挙動を調べた結果の一例である。
中の５−ヒドロキシクレアチニン及びそれ以外の來雑物
の挙動を調べた結果の一例である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/70 Ｇ０１Ｎ 33/70
Claims (1)
- 【請求項１】強酸性陽イオン交換樹脂を用いる高速液体
クロマトグラフィーにおいて、ｐＨが４．１乃至４．６
の分離溶媒を用いることを特徴とする５-ヒドロキシク
レアチニンの測定法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000303172A JP2002107350A (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | ５−ヒドロキシクレアチニンの測定法 |
| US09/968,823 US6696301B2 (en) | 2000-10-03 | 2001-10-02 | Method for determination of 5-hydroxycreatinine |
| AT01123251T ATE291571T1 (de) | 2000-10-03 | 2001-10-02 | Verfahren zur trennung von 5-hydroxycreatinin |
| ES01123251T ES2236106T3 (es) | 2000-10-03 | 2001-10-02 | Metodo para la separacion de 5-hidroxicreatinina. |
| EP01123251A EP1195373B1 (en) | 2000-10-03 | 2001-10-02 | Method for separation of 5-hydroxycreatinine |
| DE60109549T DE60109549T2 (de) | 2000-10-03 | 2001-10-02 | Verfahren zur Trennung von 5-Hydroxycreatinin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000303172A JP2002107350A (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | ５−ヒドロキシクレアチニンの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002107350A true JP2002107350A (ja) | 2002-04-10 |
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ID=18784412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000303172A Withdrawn JP2002107350A (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | ５−ヒドロキシクレアチニンの測定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6696301B2 (ja) |
| EP (1) | EP1195373B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002107350A (ja) |
| AT (1) | ATE291571T1 (ja) |
| DE (1) | DE60109549T2 (ja) |
| ES (1) | ES2236106T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008522641A (ja) * | 2004-10-06 | 2008-07-03 | イー−ズィー−エム， インコーポレイテッド | 医用画像化手順の一部として造影剤を調剤する前に患者の腎臓機能を評価するための、医用画像化システム、調剤システム、方法およびコンピュータプログラム製品 |
| JP2011180130A (ja) * | 2010-02-08 | 2011-09-15 | Kanagawa Prefectural Hospital Organization | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL1931999T3 (pl) | 2005-09-29 | 2012-03-30 | Hoffmann La Roche | Reagent uwalniający dla związków witaminy D |
| CN101776653B (zh) * | 2010-01-20 | 2012-11-21 | 谱尼测试科技股份有限公司 | 一种通过气相色谱法（gc）测定水中邻氟硝基苯的方法 |
| JP5711811B2 (ja) | 2010-05-20 | 2015-05-07 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ビタミンｄ化合物の解離試薬 |
| CN103946710B (zh) | 2011-11-18 | 2015-08-26 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 维生素d化合物的释放制剂 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2948649B2 (ja) | 1990-10-26 | 1999-09-13 | 日本臓器製薬株式会社 | 生体内物質測定法 |
| JP3147953B2 (ja) | 1991-10-23 | 2001-03-19 | 日本臓器製薬株式会社 | 生体内物質測定法 |
| JPH0623279A (ja) | 1992-07-10 | 1994-02-01 | Babcock Hitachi Kk | 液体クロマトグラフィー用強酸性陽イオン交換樹脂 |
| JP2000352564A (ja) | 1999-06-11 | 2000-12-19 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | ５−ヒドロキシクレアチニンの定量法 |
-
2000
- 2000-10-03 JP JP2000303172A patent/JP2002107350A/ja not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-10-02 ES ES01123251T patent/ES2236106T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 EP EP01123251A patent/EP1195373B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 DE DE60109549T patent/DE60109549T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 US US09/968,823 patent/US6696301B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 AT AT01123251T patent/ATE291571T1/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008522641A (ja) * | 2004-10-06 | 2008-07-03 | イー−ズィー−エム， インコーポレイテッド | 医用画像化手順の一部として造影剤を調剤する前に患者の腎臓機能を評価するための、医用画像化システム、調剤システム、方法およびコンピュータプログラム製品 |
| JP2011180130A (ja) * | 2010-02-08 | 2011-09-15 | Kanagawa Prefectural Hospital Organization | 生体試料中のアミンの測定方法およびその方法を用いる患者のスクリーニング方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1195373B1 (en) | 2005-03-23 |
| EP1195373A2 (en) | 2002-04-10 |
| DE60109549D1 (de) | 2005-04-28 |
| ES2236106T3 (es) | 2005-07-16 |
| US6696301B2 (en) | 2004-02-24 |
| EP1195373A3 (en) | 2002-04-17 |
| ATE291571T1 (de) | 2005-04-15 |
| US20020137224A1 (en) | 2002-09-26 |
| DE60109549T2 (de) | 2006-04-06 |
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