JP2002087961A - 鏡像異性体ヒドロキシル化キサンチン化合物 - Google Patents
鏡像異性体ヒドロキシル化キサンチン化合物Info
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Abstract
た非常に多様な細胞において恒常性の維持に使用するこ
とができる化合物および医薬組成物を提供することを目
的とする。 【解決手段】 本発明の化合物および医薬組成物は、
3,7−二置換キサンチンの1位置において置換された
直鎖アルキル(C5-8)のωー1アル<ルの分離された
R又はS(好ましくはR)鏡像異性体である。本発明の
化合物は外部の又はin situの刺激に対する並び
にこのような刺激の特定の形式の投与に対する細胞反応
の調節に効果的である。
Description
キサンチン化合物の異性体(isomer)は立体特異
的な細胞二次伝達経路を介した刺激に対する細胞応答を
調節するのに有効な薬剤であるという発見に関する。具
体的には、本発明の化合物は、3,7−ジ置換キサンチ
ンの1位において置換された、直鎖アルキル(C5-8)
のω−1アルコールのRまたはS(好ましくはR)鏡像
異性体(enantiomer)である。本発明の化合
物は、特異的なsn−2不飽和ホスファチジン酸、およ
び細胞増殖刺激に応答してホスファチジン酸(PA)経
路を介して生産される対応するホスファチジン酸由来の
ジアシルグリセロールの細胞内レベルを制御するための
有効な拮抗薬である。
ヘキシル)−3,7−ジメチルキサンチン)(以下、P
TXと呼ぶ)は、キサンチン誘導体で、血流増加のため
の医薬用途に広く使用されている。PTXは米国特許第
3,422,307号および第3,737,433号に
開示されている。PTXの代謝物については、Davi
sらのApplied Environment Mi
crobiol. 48:327, 1984に総説が
述べられている。PTXの代謝物の一つは1−(5−ヒ
ドロキシヘキシル)−3,7−ジメチルキサンチン(以
下、M1と呼ばれている)であり、ラセミ混合物(ra
cemic mixture)として得られている。M
1(ラセミ混合物)もまた、(単に血流を増加するとい
うのではなく)大脳の血流を増加するものとして、米国
特許第4,515,795号および第4,576,94
7号に開示されている。さらに、米国特許第4,83
3,146号および第5,039,666号は、大脳血
流を増強するために、キサンチンのより短い炭素鎖を有
する第三アルコール類似体の使用を開示している。続く
代謝の研究では、PTXはS鏡像異性体に代謝されるこ
とが発見されている。
は、PTXおよびM1(ラセミ混合物)は走化性刺激因
子に応答して多形核白血球に化学走性を引き起こす能力
を有することが記載されている。PTXおよび関連する
第三アルコール−置換キサンチンはある種のサイトカイ
ンの活性を抑制し、化学走性に影響を与える(米国特許
第4,965,271号および米国特許第5,096,
906号)。同種異系骨髄移植を受けた患者にPTXお
よびGM−CSFを投与すると、患者の腫瘍壊死因子
(TNF)のレベルが下がる(Biancoら、 Bl
ood 76:Supplement 1(522
A),1990)。TNFの検出可能なレベルでの減少
に伴い、骨髄移植に関連する合併症も減少した。しか
し、健常な志願者では、PTX投与を受けた者のTNF
レベルは高かった。従って、TNFレベルの上昇はこれ
らの合併症の主要な要因ではない。
合物として販売される。どの開示を見てもM1代謝物は
立体特異性である。実際、(人体内の代謝により)M1
はS異性体のみまたは主にS異性体として生産されるよ
うである。薬剤をラセミ混合物として製造し服用するこ
とは、薬剤の各服用量に、通常は治療上の価値がなく予
想外の副作用を引き起こす可能性のある異性体が等量混
ざっていることを意味する。例えば、鎮静剤のサリドマ
イドはラセミ混合物として販売された。望みの鎮静活性
はR異性体が有していたが、混ざっているS異性体は催
奇物質で、この薬剤を使用している母親から生まれた赤
ん坊に先天的欠損症を引き起こす。結核菌抑制剤のエタ
ンブトールのR,R−鏡像異性体は失明を引き起こす可
能性がある。非ステロイド系抗炎症剤ベノキサプロフェ
ン(OraflexR)の致死に至らしめる副作用は、
もしこの薬剤が純粋な鏡像異性体として販売されていた
ならば避けられたかもしれない。
られない。例えば、ASANA(iPr=イソプロピル)
は二つの非対称中心を有する合成ピレスロイド殺昆虫剤
である。有効な殺昆虫活性の大半は、可能性のある4種
類の立体異性体のうちのただ一種類にのみ存在する。さ
らに、殺昆虫作用を有しない3種類の立体異性体はある
種の植物種に対して細胞毒性を示す。従って、ASAN
Aは、立体異性体の混合物は適当でないので、単一の立
体異性体としてのみ販売され得る。
物に安全かつ効果的に投与でき、種々の炎症性刺激に対
して恒常性(homeostasis)を維持でき、そ
して、単一の異性体に存在する活性を有するように鏡像
異性体として純粋な効果的な治療用の化合物を発見する
ことが、当該分野において必要である。本発明は、その
ような化合物を探す過程において行われた。
る化合物は、種々の炎症性および増殖刺激を受けた非常
に多様な細胞において恒常性の維持に使用することがで
きることを発見した。さらに、本発明の化合物および医
薬組成物は、通常の薬剤投与経路(例えば、経口投与、
局所投与、非経口投与など)に適しており、有効な投与
量を提供することができることを発見した。
7−ジ置換キサンチンの1位において置換された直鎖ア
ルキル(C5-8)のω−1アルコールの、分離されたR
またはS(好ましくはR)鏡像異性体である。本発明の
化合物は、このような化合物を有効量投与する特定の投
与方式と同様に、外部刺激またはin situ 一次
刺激に対する細胞応答を調節するのに有効である。
ールで置換されたアルキル(C5-8)の実質的に他の鏡
像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、R2
およびR3は独立に、所望により炭素原子の代わりに1
つ、または隣接しない2つの酸素原子を含んでいてもよ
いアルキル(C1-12)である]のキサンチンコアから成
る化合物および該化合物を有する医薬組成物を構成す
る。R1は、好ましくはR鏡像異性体として水酸基を有
するC6アルキルである。
学的に受容可能な助剤から成り、患者に経口的、非経口
的、または局所的な投与により処方される、医薬組成物
を提供する。
situの一次刺激に対する免疫応答若しくは(細胞
の細胞膜の内部葉状組織の隣接部で機能する、特異的な
リン脂質ベースの第二メッセンジャーによって媒介され
る)細胞性応答が抑制されることにより特徴付けられ
る、または、そのような抑制により治療される、種々の
病気を有する患者を治療する方法を提供する。第二伝達
経路は、種々の病状に特徴的な種々の有毒なまたは増殖
的な刺激に応答して活性化される。この第二伝達経路の
生化学について本明細書に記載する。より具体的には、
本発明は、ここに記載される第二伝達経路を介した細胞
シグナルを抑制することによって、種々の病状の臨床上
の症状を治療若しくは予防する、または他の治療による
毒性を緩和する方法に関する。病状または治療による毒
性は、下記のものからなるグループから選択される。
細胞減少治療(cytoreductive ther
apies)又は微生物性病原体の感染による血球細胞
欠損(hematocytopenia);T細胞応答
若しくはB細胞応答、および抗体の生産による自己免疫
疾患;敗血性ショック;腫瘍壊死因子(TNF)に対す
る間葉細胞の耐性;PDGF−AA,BB、FGF、E
GF等の成長因子に応答した平滑筋細胞、内皮細胞、繊
維芽細胞およびその他の細胞種の増殖のような、細胞増
殖または細胞活性の脱制御(例えば、アテローム硬化、
再狭窄、卒中および冠状動脈疾患);ヒト免疫不全ウイ
ルス感染(AIDSおよびAIDS関連合併症);IL
−1、mip−1α、PDGF、またはFGFに応答し
た腎糸球体間質細胞の、種々の炎症性腎臓疾患を引き起
こす増殖;炎症;シクロスポリンA(cyclospo
rin A)またはアムホテリシンB(amphote
ricin B)治療に応答する腎臓糸球体または腎臓
管の毒性;細胞減少治療(例えば、細胞毒性薬剤または
放射線)に反応した器官中毒(例えば、胃腸上皮または
肺上皮);非アルキル化抗癌剤の抗癌作用の増強;細胞
表面メタロプロテアーゼの生産またはIgEに反応した
マスト細胞および好塩基球の脱顆粒反応(degran
ulation)を特徴とする、炎症性刺激(例えば、
TNF、IL−1およびこれらに類するもの)への反応
したアレルギー;破骨細胞による破骨細胞活性化因子
(OAF)の過剰生産による骨の疾患;神経伝達物質エ
ピネフリンおよびアセチルコリンによるシグナル伝達の
減少による中枢神経系(CNS)疾患;並びにこれらの
組み合わせ。
たは、増殖刺激若しくは有毒な刺激に応答して増殖する
ように細胞が刺激される場合、この刺激は特異的なリン
脂質ベースの第二メッセンジャーシグナル伝達経路を介
して伝達される。この第二伝達経路により、sn−2非
アラキドン酸不飽和化合物を含む一群のホスファチジン
酸(PA)のレベルが上昇し、該ホスファチジン酸(P
A)は対応するジアシルグリセロール(DAG)に迅速
に変換される。本発明の化合物および医薬組成物は、ホ
スファチジルイノシトール(PI)経路のような、細胞
の正常な調節機能に関与する他の第二伝達経路に影響を
与えることなく、この第二伝達経路に関与する立体特異
的な酵素を特異的に抑制する。ここに記載する、該第二
伝達経路に関与する1つまたは複数の酵素の抑制による
効果は、刺激、特に有害な刺激に対する標的細胞の応答
を”調節”することである。この生化学な現象(即ち、
サイトカインのような一次刺激に応答する、第二伝達経
路酵素の活性の抑制)は細胞シグナルに影響を与え、異
常な、炎症性のまたは有害な細胞シグナル機構による多
くの多様な病状に効果を及ぼす。
ジャー伝達系(Burstenら.,J.Biol.C
hem.266:20732,1991)の特定の段階
において細胞の反応を制御することができる一群の特定
化合物に向けられている。第二メッセンジャーは脂質ま
たはリン脂質であり、以下の略語を使用する。
ラーゼ PAPH=ホスファチジン酸ホスフォヒドロラーゼ PLA2=ホスフォリパーゼA−2 PLD=ホスフォリパーゼD PAA=ホスフォアラキドン酸 PLA−2=ホスフォリパーゼA2 PC=ホスファチジルコリン ”再生成”PAサイクリック経路=所定のsn−1及び
sn−2位置において,L飽和の2−リノレオイルまた
は1,2−ジレオリル/1,2−sn−ジリノレオイル
で置換されたPAA、LPA、PAおよびDAG中間体 ”古典的PI経路”=1−ステアロイル,2−アラキド
ノイル脂肪酸アシル側鎖で置換されたPI、DAG、P
A中間体 ”PLDによって生成されるPA”=例えば、1,2−
sn−ジオレオイル、1−アルキル、2−リノレオイ
ル、および1−アルキル,2−ドコサヘキサノイル側鎖
によって置換されているPE、PC、LPA、PA、お
よびDAG中間体 リソホスファチジン酸トランスフェ
ラーゼ(LPAAT)は,アシルCoAからアシル基を
導入することによって、リソホスファチジン酸(LP
A)からのホスファチジン酸(PA)への合成に関与す
る。PAホスフォヒドロラーゼ(PAPH)によるホス
フェート部分の加水分解によってDAGが生成される。
経路のこれらの現象は、細胞表面上の受容体に働く一次
刺激(例えば、IL−1、IL−2またはTNFなどの
サイトカイン)による刺激によって直ちに(1分以内)
誘導されると思われる。迅速な検出可能な効果として
は、PAおよびDAGレベルの上昇がある。本発明の化
合物の投与によってこの上昇が抑制される。
2−ジ不飽和および1−アルキル,2−不飽和亜種を有
する中間体に対する基質特異性を有する、PAPH酵素
のLPAAT亜種のインヒビターを含む。そのようなイ
ンヒビターの代表的な例の1つは(本発明の化合物には
含まれないが)PTXである。PIは含まず、主に1,
2−ジ不飽和および1−アルキル,2−不飽和亜種から
なるPAに由来する特異的な活性経路において、PTX
はPAPHをブロックする。これは、例えば、TNFで
刺激されたヒト糸球体間質細胞はPIからDAGを生産
し、PTX非存在下および存在下でPIを再生する現象
によって示される。後者の機構でPAまたはDAGがP
I以外のソース(source)から由来することを示
唆する証拠は何もない。本発明の化合物は、sn−2位
置にアラキドン酸以外の不飽和脂肪酸を有する基質に関
与する一群のPAPHおよびLPAATに影響を与える
が、これらの酵素のPI経路に関与する調節機能型には
与えないことを強調したい。
A、PI、PE、PCおよびPS)は、各サブクラスの
代謝回転(trunover)と共に原形質膜の循環再
生産によって、一定量の特徴的な脂肪性アシル側鎖を有
する。PAはおおむね安定であるが、比較的少量しか存
在しない。休止細胞中のPAは、主に、通常ミリスチン
酸、ステアリン酸およびパルミチン酸からなる飽和アシ
ル側鎖から構成される。休止細胞では、PCのアシル側
鎖は、sn−1位置のアシルパルミチン酸およsn−2
位置のオレイン酸からなる。PEおよびPIは主に、s
n−1ステアリン酸およびsn−2アラキドン酸からな
る。
びsn−2の位置に有することから、PA種の由来は、
sn−1およびsn−2の位置のアシル基の化学的性質
から導き出すことができる。例えば、PAが酵素PLD
の働きによってPCに由来する場合には、第二伝達経路
を経由したPC基質に特徴的なアシル側鎖を含むであろ
う。さらに、全ての1,2sn−基質種の由来は、その
由来に従って識別されるであろう。しかし、各リン脂質
種がDAGに加水分解される前にPAの型を経由するか
否かを知ることが重要である。PAに、続いてDAGに
変換されるリソ−PAが示されるであろう。この第二伝
達経路の複雑さについては、第二メッセンジャーの刺激
の後、所定の時間経過後の細胞における中間体の脂肪性
アシル側鎖化学(即ち、薄層クロマトグラフィーまたは
高圧液体クロマトグラフィー)の適切な分析によって解
決することができる。
体間質細胞のようなある種の糸球体間質細胞において
は、数種のシグナル伝達経路が直列的に、同時に、また
はその両方で活性化されると考えられる。例えば、好中
球においては、F−Met−Leu−PheはPLDの
作用を介してPAの形成を刺激し、やがて、ひき続いて
PAPHの作用を介してDAGが形成される。数分後、
古典的ホスフォイノシトール経路を通してPIからDA
Gが生成される。多くの細胞では、DAGは、PAAが
PLA−2によってsn−2加水分解され続いてLPA
ATによってsn−2トランスアシル化されるサイクル
によって再生成されたPA、並びにPLDによってP
E、PCまたはその双方の基質から生成されたPAから
のPLD経路の両方から生成される。
Gの多様な亜種をアシル鎖組成に基づいて識別すること
を可能にする。この方法によって、本発明の第二伝達経
路を古典的PI経路のような他の経路と区別して活性化
する(および活性を抑制する)化合物を区別することが
できる。本発明の第二伝達経路は、sn−2位置にアラ
キドン酸塩以外の不飽和脂肪酸を有する基質、並びに、
古典的PI経路の一部である正常な細胞調節機構に関与
しないPAPHおよびLPAATの亜種を含む。本発明
の第二伝達経路に関与するPAPHおよびLPAAT酵
素は、基質の異なるアシル側鎖および異性体型に対し精
密に立体特異的である。従って、本発明の化合物は、実
質的に純粋な鏡像異性体であり、好ましくは水酸基に結
合したキラル炭素原子においてR鏡像異性体である。例
えば、CT1501のRとSの異性体は、図12に示し
たように異なるLPAAT抑制活性を持っている。さら
に、CT1501のR鏡像異性体(例えば、CT150
1R)は、ラセミ混合物(以下、M1と呼ぶ)より2−
3倍、そして、対応するS鏡像異性体よりさらにその何
倍もの効果を及ぼす。さらにまた、PTXはヒト体内で
代謝されると、ほとんどがM1のSエナチオマー、また
はCT1501Sに変換される。
副作用を起こさずに患者に与えられる濃度を越えた)高
い濃度において、LPAATにおけるPA亜種の生成を
阻害することによってPA/DAG経路を介した再生成
PAの形成を阻害する。PTXの存在下においてさえ
も、細胞はPLDの働きによってPAを生産し続け、ま
たDAGもホスフォリパーゼCの作用によってPCおよ
びPIから生成される。後者の経路は本発明の化合物ま
たはPTXによって抑制されない。PTX処理した細胞
では、再生成またはPLAによって生成されるPAに由
来するDAG(例えば、1,2−sn−ジオレオイルD
AG、1−アルキル,2−リノレオイルDAG、および
1−アルキル,2−ドコサヘキサンオリルDAG)は消
失する。従って、本発明の化合物およびPTXは、有害
な刺激によって細胞内で活性化されるが、正常な細胞調
節機構のシグナル伝達には利用されない、特異的な第二
伝達経路を選択的に抑制することによって、特定の種の
PAおよびDAGの生成のみを抑制する。
二伝達経路の活性化の特異的な抑制は、本発明の化合物
に多様な臨床適応症を治療するのに使用できる可能性を
提供する。さらに、例えば炎症性サイトカインを介した
有害刺激によって活性化されるが、本発明の化合物によ
って特異的に抑制される、特異的な第二メッセンジャー
の活性化という共通点を共にする、多様な臨床適応症の
予想データが、ここに示されたin vitroおよび
in vivoのデータによって提供される。実際、本
発明の化合物が多様な異なる臨床適応を有することがで
きる理由は、本発明の化合物のこの活性機構によって説
明される。本発明の第二伝達経路の活性化は、有害な刺
激に対する応答の主要な媒体であり、例えば、炎症、免
疫応答、血球細胞の再生の抑制および癌細胞の増殖を引
き起こす細胞シグナルとなる。しかし、全てのインヒビ
ターがこの第二伝達経路の全ての酵素を阻害するわけで
はない。本発明の化合物は、炎症および血球細胞再生抑
制の最も効果的な媒体である。本発明の第二伝達経路に
よって伝達されるシグナルには、例えば、LPSによる
直接の細胞応答、抗原によるT細胞活性化、抗原による
B細胞活性化、IL−1 タイプ1受容体によって伝達
される(IL−1 タイプ2受容体によっては伝達され
ない)IL−1に対する細胞応答、TNF タイプ1受
容体、活性化癌遺伝子(例えば、ras,abl,he
r2−neu等)、低親和性GM−CSF(顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子)受容体、並びに、PDG
F、b−FGFおよびIL−1によって刺激された平滑
筋細胞増殖が含まれる。本発明の第二伝達経路を介して
は伝達されないシグナルもあり、これらのシグナルに
は、例えば、G−CSF(顆粒球コロニー刺激因子)、
インターロイキン−3(IL−3)、SCF(幹細胞因
子)およびGM−CSFによって誘導された造血細胞の
増殖;インターロイキン−8(IL−8)またはロイコ
トリエンB4によって誘導された好中球活性;IL−2
に応答したT細胞増殖;並びに酸性FGF(繊維芽細胞
成長因子)に応答した上皮細胞増殖、が含まれる。
記の機能を有する: (1)例えば、IL−1、およびPDGF(血小板由来
成長因子)を加えたIL−1によって誘導される平滑筋
細胞および腎臓糸球体間質細胞の増殖の抑制によって示
されるように、IL−1シグナルのタイプ1 受容体を
介した伝達を阻止する; (2)例えば、好中球のCD18の上皮細胞における管
細胞接着分子(VCAM)の阻止によって示されるよう
に、接着分子の調節を抑制する; (3)TNFおよびIL−1によって誘導されるメタロ
プロテアーゼを抑制する(炎症のモデル); (4)LPS誘導細胞活性化を阻止する(敗血症ショッ
クの予防および治療); (5)抗原または架橋CD複合体によるT細胞およびB
細胞の活性化を抑制する; (6)IgGによるマスト細胞活性化を抑制する;そし
て (7)形質転換細胞および癌細胞系の悪性表現型を抑制
する。
ようなin vivo生物学的効果が得られる。該in
vivo生物学的効果には、内毒素ショックの予防お
よび治療、癌細胞増殖の抑制、細胞減少治療後の造血細
胞の刺激、GVHD(移植細胞対宿主病)予防のための
相乗的免疫抑制、および細胞枯死過程(apoptot
ic process)の抑制を介した育毛の刺激が含
まれるがこれらに限られない。内毒素ショックの治療お
よび予防、細胞減少治療後の造血細胞の刺激、およびヌ
ードマウスにおける育毛の刺激に関するin vivo
のデータをここに示す。本発明の化合物、特にCT15
01Rは、造血の刺激、敗血症ショックの予防および治
療、並びに局所的に育毛の刺激に利用するために適用し
た場合に最も効果がある。本発明の第二伝達経路の抑制
剤は免疫抑制、急性炎症、慢性炎症およびGVHDに対
しても活性を有するが、本発明の化合物は、これらに対
しては前述の症状に対する程有効でなく、より高い分子
濃度を必要とする。
達経路を通じて伝達される薬剤の副作用を抑制する補助
剤として有用である。これらの副作用には、例えば、イ
ンターロイキン−2(IL−2)の副作用、シクロスポ
リンAおよびFK506の腎臓副作用、並びにアンホテ
リシンBの副作用が含まれる。本発明の化合物は、抗原
誘導されるT細胞の活性化を抑制する点はシクロスポリ
ンまたはFK506と共通するが、NKおよびLAK細
胞の生成を阻害せず、T細胞からのIL−2の遊離およ
びIL−8の遊離を抑制しない点は異なることに注目す
べきである。
節炎による関節破壊、および気腫による肺破壊のような
組織破壊を媒介し、癌転移に関与する。メタロプロテア
ーゼの3種類の例として、TNF、IL−1、およびP
DGF+bFGFによって誘導される92kDタイプV
ゼラチナーゼ、通常は構成酵素であり、TNF若しくは
IL−1によって誘導もされる72kDタイプIVコラ
ゲナーゼ、並びに、TNF若しくはIL−1によって誘
導されるストロメリシン/PUMP−1が挙げられる。
本発明の化合物は、TNFまたはIL−1による92k
DタイプVゼラチナーゼ誘導性メタロプロテアーゼを抑
制することができる。さらに、CT1501Rは100
U/mlのIL−1によって誘導されたPUMP−1活
性をコントール値の15%に減少させた。同じ実験によ
って対照してみると、PTXはコントール値の95%に
しか減少させず、この値は有意ではなかった。従って、
本発明の化合物は、IL−1若しくはTNFによって誘
導されるある種のメタロプロテアーゼの誘導を阻害する
が、正常な組織再生成に関与する構成性のプロテアーゼ
(例えば、72kDタイプIVコラゲナーゼ)には関与
しない。
を介したシグナル伝達を阻害するので、IL−1アンタ
ゴニストであると考えられる。”疾患におけるインター
ロイキン−1の機能”(Dinarello と Wo
lff N.Engl.J.Med.328,106,
Jan.14,1993)という題名の最近の総説に
は、IL−1の機能は”疾患の重要、迅速かつ直接的な
決定因子”であると記載されている。”例えば、敗血症
では、IL−1は血管に直接働きかけて血小板活性化因
子および一酸化窒素の迅速な生産を介して血管拡張を誘
導する。一方、自己免疫疾患では、他の細胞を刺激して
標的細胞に働くサイトカインまたは酵素を生産させ
る。”この総説は、IL−1によって媒介される一群の
病気について記載している。それらには、敗血症症候
群、関節リウマチ、炎症性腸疾患、急性および骨髄性白
血病、インシュリン依存性真性糖尿病、アテローム硬
化、並びに、移植拒絶、移植細胞対宿主病(GVH
D),乾癬、ぜん息、オステオポローシス、歯根膜疾
患、自己免疫甲状腺炎、アルコール性肝炎、子宮感染に
伴う早期分娩、さらに睡眠障害までも含むその他の病
気、が含まれる。本発明の化合物はIL−1 タイプI
受容体を介した細胞シグナルを抑制するIL−1アンタ
ゴニストなので、上述した全ての疾患の治療に有用であ
る。
導ショックの機構は、血小板活性化因子、プロスタグラ
ンジンおよび一酸化窒素のような小さな媒介分子の原形
質濃度を増加させることができるIL−1の機能による
と思われる。これらは、効果的な血管拡張因子であり、
研究用動物にショックを引き起こす。IL−1の活性を
阻止するとこれらの媒介分子の合成および放出が防止さ
れる。動物では、IL−1を一回静脈注入すると、平均
動脈圧が減少し、全身血管抵抗が下がり、そして白血球
減少および血小板減少が引き起こされる。ヒトにおいて
も、IL−1を静脈投与すると、同様に急速に血圧が下
がり、1日に体重1kgあたり300ng以上服用する
と著しい低血圧が引き起こされる。」「IL−1活性を
阻止する治療上の利点は、恒常性に関与する分子の生成
に影響を与えずに、有害な生物学的作用を防止できる点
にある。」本発明の化合物は、IL−1 タイプII受
容体を介した細胞シグナルに影響を与えずに、IL−1
タイプI受容体を介した細胞シグナルのみを抑制する
ことによって、Dinarelloによって見いだされ
た要求を満たしている。
loは以下のように述べている;「インターロイキン−
1が、関節リウマチの患者の滑膜(synovial
lining)および滑液に存在し、そのような患者由
来の滑膜組織の組織片はinvitroでIL−1を生
産する。関節内にインターロイキン−1を注入すると、
白血球浸潤、軟骨破壊、および関節周囲の骨の再生が動
物に誘導される。単離された軟骨細胞および骨細胞にお
いてin vitroで、インターロイキン−1は、ホ
スフォリパーゼおよびシクロオキシゲナーゼの遺伝子、
並びにコラゲナーゼの遺伝子の発現の引き金となり、そ
の活性を阻止することによって、ラットの細菌−細胞壁
誘導関節炎が減少される。」 従って、本発明の化合物
はIL−1アンタゴニストとして関節リウマチの治療お
よび予防に有用である。
よびクローン病(限局性回腸炎)は、活性化された好中
球およびマクロファージを含む、腸の浸潤性病巣によっ
て特徴付けられる。IL−1は、プロスタグランジンE
2(PGE2)およびロイコトリエンB4(LTB4)のよ
うな炎症性エイコサノイド(eicosanoid)、
並びにIL−8(好中球化学誘因機能および好中球刺激
機能を有する炎症性サイトカイン)の生成を誘導するこ
とができる。PGE2およびLTB4の組織内濃度は潰瘍
性大腸炎を病む患者の重病度と関連し、炎症性腸疾患を
病む患者ではIL−1およびIL−8の組織内濃度が高
い。従って、本発明の化合物のようなIL−1アンタゴ
ニストは炎症性腸疾患の治療に効果的であろう。
は、IL−1がこのような癌細胞に対する増殖因子とし
て機能することを示す証拠が次々と得られている。従っ
て、本発明の化合物は、急性および慢性の骨髄性白血病
が悪化するのを防止するのに効果的であると思われる。
M)は、ランゲルハンス島のβ細胞の破壊による自己免
疫疾患で、免疫担当細胞によって媒介されると考えられ
ている。自然発生のIDDM動物(BBラットまたはN
ODマウス)のランゲルハンス島は、IL−1を含む炎
症性細胞を有する。従って、本発明の化合物は、IDD
Mの予防および治療に有用であると思われる。
与している。内皮細胞はIL−1の標的である。IL−
1は管状平滑筋細胞の増殖を刺激する。高コレステロー
ル症ウサギ由来の脂肪性動脈プラークから単離された気
泡細胞は、IL−1βおよびIL−1βメッセンジャー
RNAを含んでいる。末梢血液単球に取り込まれると、
これらの細胞によるIL−1が生産が開始される。IL
−1はPDGFの生産も刺激する。これらのことを合わ
せて考えると、IL−1はアテローム硬化病変の進行に
関与しているといえる。従って、本発明の化合物のよう
なIL−1アンタゴニストは、アテローム硬化の予防お
よび治療に有用であると思われる。
効果のIn vitroアッセイ 本発明の化合物の、免疫活性を調節し抗癌活性を有する
作用についての測定には、様々の細胞系を用いた多様な
in vitro分析を用いることができる。例えば、
混合白血球反応(MLR)は本発明の各化合物の生物学
的活性を決定するための有効なスクリーニング法を提供
する。MLRにおいて、PBMCs(末梢血液単球細
胞)は、健常な志願者の全血液を凝血防止のためにヘパ
リンを含んだ容器に採血し、等量のハンクス塩平衡化溶
液(HBSS)で希釈することによって得る。この混合
物をFicoll−HypaqueR勾配(比重1.0
8)のようなショ糖密度勾配に上層し、室温または冷却
して1000×gで25分間遠心する。PBMCを血漿
−フィコール界面のバンドから得て分離し、HBSSな
どの塩溶液で少なくとも2回は洗浄する。混入している
赤血球細胞をACK溶解(37℃、10分)などによっ
て溶解し、PBMCsをHBSS中で2回洗浄する。精
製PBMCsのペレットを完全培地、例えばRPMI1
640に20%ヒト不活性化血清を加えたもの、に再懸
濁する。96穴マイクロタイタープレート中で行う2種
類のMLRによって、同種異系刺激に対するPBMCの
増殖反応を決定する。簡単に述べると、完全培地200
μl中の約105個のテスト用精製PBMC細胞を、約
105個の自己由来(コントロール培養物)またはHL
Aの異なる個体に由来する同種異系(刺激培養物)のP
BMC細胞と共培養する。細胞をマイクロタイタープレ
ートに加える時に、種々の用量の化合物(薬剤)を添加
する。培養物を5%CO2条件下、37℃で6日間イン
キュベートする。インキュベーションの最後にトリチウ
ム−チミジンを加え(例えば、40−60Ci/mmo
leのものを1μCi/ウェル)、液体シンチレーショ
ンカウンターで増殖を調べる。
1)またはインターロイキン−2(IL−2)の刺激に
よって誘導された胸腺細胞の活性化および増殖の、本発
明の化合物による抑制効果を評価するために胸腺細胞共
刺激因子分析を行う。マウス(例えば、Balb/Cマ
ウスのメス)の胸腺を回収し、培養培地(例えば血清を
加えないRPMI1640)に分離する。分離された胸
腺組織および細胞懸濁液を遠心管に移して静置し、HB
SS洗浄し、血清を加えた培養培地(例えば、10%胎
児ウシ血清を加えたRPMI1640)に再懸濁する。
混入している赤血球細胞を全て溶解させ、生存している
細胞を再懸濁して数を数える。胸腺細胞をプレートし
(例えば、96穴プレートに密度2×105細胞/
穴)、刺激剤、例えば、Con A、IL−1(例えば
IL−1α)またはIL−2、をウェルに加える。細胞
を37℃で4日間インキュベートする。4日目に細胞を
トリチウム−チミジンでパルスし、増殖を調べる。本発
明の化合物は刺激剤添加と共に加える。
活性の性質を調べるときのin vitro分析におけ
る細胞毒性反応を防ぐために、本発明の各化合物の細胞
毒性について調べた。細胞(例えば、NIH−3T3、
Ras形質転換3T3細胞、悪性メラノーマLD2細胞
等)をマイクロタイタープレートに加え、プレートの2
日後に薬剤を加えた。薬剤添加の24、48または72
時間後に、蛍光生存力染色(例えば、2’,7’−ビス
−(2−カルボキシエチル)−5−(および−6)−カ
ルボキシフルオレセイン アセトキシメチルエステル、
BCECF励起488nmおよび発光525nm)によ
って細胞生存力を調べる。
ト由来の間質細胞を用いたPDGF(血小板由来成長因
子)増殖反応を調べることを含む。ヒト間質細胞を所定
の培地(例えば、69%マックコイ培地、12.5%胎
児ウシ血清、12.5%ウマ血清。1%抗生物質、1%
グルタミン、1%添加ビタミン、0.8%必須アミノ
酸、1%ピルビン酸ナトリウム、1%重炭酸ナトリウ
ム、0.4%非必須アミノ酸、および0.36%ヒドロ
コルチゾン)にプレートする(例えば、2000細胞/
穴)。2−3日後、間質細胞を血清を含まない培地で枯
渇させる。24時間後に、IL−1α若しくはTNFを
加えた、若しくは加えていないPDGF−AA、PDG
F−BBまたは塩基性FGF(繊維芽細胞成長因子)の
ような増殖因子、およびトリチウム チミジンで細胞を
処理する。液体シンチレーションカウンターで細胞増殖
を測定する。
体(40μg/ml)、IL−4またはPMA(2.5
nM)で刺激されたB細胞の増殖を抑制する本発明の化
合物の効果を調べることができる。ラモス(Ramo
s)B細胞腫瘍細胞、またはマウス脾細胞を刺激剤、本
発明の化合物およびトリチウム チミジンと共にインキ
ュベートし、刺激剤によって誘導された細胞増殖の抑制
を測定することができる。
胞接着分子(VCAM)のレベルを調べることによって
測定することもできる。初期継代ヒト臍静脈内皮細胞
(HUVEC)(Cell Systems,Inc.
またはCloneticsのような企業から入手した)
を10%胎児ウシ血清を含む培地(例えば、Hepes
緩衝培地、Cell Systems)に、繊維芽細胞
成長因子(酸性FGF、Cell Systems,I
nc.)またはTNFのような刺激剤を添加したもので
培養する。細胞をマイクロタイタープレートのウェルに
プレートし(例えば、5×104/穴)、37℃で72
時間インキュベートする。休止細胞を回収し(例えば、
0.4% EDTAで20−30分処理)、培地中(例
えば、0.01%ナトリウムアジドを含む、0.1%ウ
シ血清アルブミンを加えたリン酸塩緩衝液)で洗浄し、
氷冷下、ヒトVCAMを認識するモノクローナル抗
体(”一次抗体”)(例えば、ヒトVCAMを認識する
マウスモノクローナル抗体1μg、Genzyme)で
標識する。60分の氷冷後、細胞を冷却洗浄培地で洗浄
し(好ましくは2回)、一次抗体を認識する抗体(例え
ば、フィコエリトリンを結合したヤギ抗マウスIgG
1μg、CalTag,Inc.)と共にインキュベー
トする。氷冷30分後、細胞を2回洗浄し、フローサイ
トメーター(Coulter EliteR)を用い、
適当な励起波長および発光波長で(例えば、フィコエリ
トリンを用いた場合は、励起が488nm,発光が52
5nm)分析する。
酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)とホスファ
チジン酸ホスフォリルヒドロラーゼ(PAPH)の抑制
を、1つのin vitroアッセイによって調べるこ
とができる。このアッセイは、一次刺激(例えば、種々
のサイトカイン、成長因子、癌遺伝子産物、推定される
治療剤、放射線照射、ウイルス感染、毒素、細菌感染お
よびその産物、並びに標的細胞に(妨害まではしないと
しても)有害な影響を与えるあらゆる刺激)を加えた標
的細胞を、種々の用量の本発明の化合物の存在下または
非存在下でインキュベートすることを含む。標的細胞に
は、例えば、以下のような亜細胞性物質が含まれる。
ロソーム、特に骨髄間質細胞または、ヒト若しくはラッ
ト糸球体細胞由来のミクロソーム;脳由来のミクロソー
ムまたはシナプトソーム;富原形質膜ミクロソーム、B
urstenら(J.Biol.Chem.226:2
0732−20743,1991)に記載されたように
して得られた原形質膜、または界面活性剤で溶解させた
ミクロソーム;シナプトソーム、および、例えば、NP
−40、ミラナル(Miranal)、SDS若しくは
その他の中性界面活性剤を用いて溶解された膜またはそ
の他の細胞調製品;そして界面活性剤で溶解され、組み
換えられ、または、さらに精製された細胞蛋白質の調製
品(LPAATおよび/またはPAPH蛋白質を含む)
短時間インキュベートした後、細胞脂質を抽出し、標準
的な方法に従って薄層クロマトグラフィーで分析する。
簡単に述べると、例えばクロロホルム/メタノール
2:1(v/v)を用いて脂質を抽出し、抽出物を、B
ursten and Harris, Bioche
mistry 30:6195−6203,1991に
記載されたようにHPLCにかける。RaininR
mu−Porasilカラムを使用し、3:4 ヘキサ
ン:プロパノール有機担体を用い、および、分離の初め
の10分間は1−10%水勾配を用いて行った。溶出パ
ターンのピークの検出は離れた二重結合を検出する紫外
線範囲で行った。不飽和PAおよびDAGに相当するピ
ークが抽出パターンに示される。この方法はPAおよび
DAGの多様な型を区別できるので、本発明の(R)ま
たは(S)化合物によって影響を受ける経路における相
当する型も直接測定できることが重要である。これらの
化合物のアシル置換体の性質の確認は、ファスト−アト
ム ボンバードマス スペクトロスコピー(fast−
atom bombardmentmass spec
troscopy)によって行うことができる。このよ
うにして、関連する不飽和(非アラキドン酸)PAおよ
びDAG亜種を検出できる。使用する時間は、サイトカ
インなどの一次刺激による活性化から5−60秒であ
る。この技術によって、種々の脂質成分のレベルを時間
の関数として調べることができる。
の化合物による抑制活性を調べることができる。この分
析では、L929マウス繊維芽細胞(104細胞/穴)
を種々の用量の各化合物および培地コントロールと共に
2時間インキュベートする。TNF−α(R&D Sy
stems)を500pg/mlの濃度(TNFのLD
50(125pg/ml)の4倍)で添加する。細胞+
薬剤(または−薬剤)+TNFを37℃で40時間イン
キュベートする。培地を取り除いて2%血清および10
μg/mlのBCECF蛍光色素を含む新たな培地と交
換し、30分間インキュベートする。蛍光色素を含む培
地を取り除き、PBS(リン酸塩緩衝液)と交換し、各
ウェルの蛍光を分析した。
UVEC細胞に対するU937細胞の接着の、薬剤によ
る抑制の効果を調べることができる。この実験では、H
UVEC細胞をヒトTNF−α(20ng/ml)およ
び種々の濃度の薬剤と共に14−16時間インキュベー
トする。U937細胞(ヒト単核細胞系)を、蛍光色
素、BCECF(10μg/ml)と共にインキュベー
トして標識する。U937細胞調製品(2.5×104
細胞/穴)を活性化HUVEC細胞の上に上層する。細
胞を逆遠心して、部分的に接着していたり、全く接着し
ていないU937細胞を取り除く。蛍光プレートリーダ
ーを用い、接着したU937細胞の蛍光を測定する。
サンチンの1位において置換された直鎖アルキル(C
5-8)のω−1アルコールの分離されたRまたはS(好
ましくはR)鏡像異性体である。本発明の化合物は、こ
のような化合物を有効量投与する特定の投与方式と同様
に、外部刺激またはin situ 一次刺激に対する
細胞応答を調節するのに有効である。
ールで置換されたアルキル(C5-8)の実質的に他の鏡
像異性体を含まない分離された鏡像異性体であり、R2
およびR3は独立に、所望により炭素原子の代わりに1
つ、または隣接しない2つの酸素原子を含んでいてもよ
いアルキル(C1-12)である]のキサンチンコアから成
る化合物および医薬組成物を構成する。R1は、好まし
くはR鏡像異性体として水酸基を有するC6アルキルで
ある本発明はさらに、本発明の化合物および薬学的に受
容可能な助剤から成り、患者に経口的、非経口的、また
は局所的な投与により処方される、医薬組成物を提供す
る。
の化合物および薬学的に受容可能な担体若しくは賦形剤
からなる医薬組成物を含む。本発明の化合物または医薬
組成物を用いて患者を治療するには、体外療法としてi
n vitro培養で患者に接触させるか、または、治
療すべき細胞を有する患者に本発明の化合物または医薬
組成物を(経口的、非経口的、または局部的に)投与す
る。
3,7−ジメチルキサンチンの(R)または(S)鏡像
異性体は周知であり、以下のような当該分野において知
られている慣用技術によって調製される。
a,15:1001,1985およびDavisら.,
Applied and Enviromental
Microbiology 48:327,1984に
記載されている、例えばRhodotorula ru
braを用いた微生物学的技術;Davisら(198
4)(前述)の(R)−アルファ−メトキシ−アルファ
−トリフルオロメチル−フェニル酢酸((r)−MTF
PA)のような光学活性化酸、その他の光学活性化酸か
ら形成させたジアステレオマーエステルのラセミ体を分
離する;ヨーロッパ特許公開第0435153号に記載
されているように、(R)または(S)−5−ヒドロキ
シ−n−ヘキシル基をジメチルキサンチンの1位に導入
することによる直接的化学合成;鏡像異性体選択的変換
(例えば、鏡像異性体エステルを第三ホスフィン、アゾ
ジカルボン酸ジアルキルエステルおよびカルボン酸と共
に加熱するか、または鏡像異性体アルコールを、所望に
より塩基を含んだ中性溶媒中で有機スルホン酸エステル
に変換する。):得られた脂肪族カルボン酸エステルを
加熱し、塩基を含むアルコール性または水性の溶媒で加
溶媒分解(例えば、炭酸カリウムを含むメタノール分
解)を行い、ヨーロッパ特許公開第435153号また
は第435152号に記載されたような鏡像異性体アル
コールを得る。
の特に好ましい方法は、J.Org.Chem.55:
2274,1990に記載された方法の変型に基づく直
接合成である(図9)。この方法では、4−ブロモ−1
−ブテンを、ボロントリクロライドおよびトリエチルシ
ランと共にペンタンのような不活性炭化水素溶媒中で約
−10℃から−78℃の低温条件下で熱し、4−ブロモ
−1(ジクロロ)ボロブタンを得る。この産物を同程度
の低温下でジエチルエーテルまたはジグリム(digl
yme)のような不活性溶媒中、(R)−または(S)
−ピナンジオールで処理し、(R)−または(S)−ピ
ナンジオール 4−ブロモブチルボレートを得る。この
産物を、アルゴンのような不活性な雰囲気下、−100
℃(またはもう少し高い温度)において、テトラヒドロ
フランのような不活性な溶媒中、LiCHCl2で処理
し、つづいて無水塩化亜鉛を加えて(R)−または
(S)−ピナンジオール 5−ブロモ−1−クロロペン
チルボレートを得る。この産物を、テトラヒドロフラン
中、約−10℃から約−78℃において、メチルマグネ
シウム臭化物で処理し、RまたはS−ピナンジオール
5−ブロモ−1−メチルペンチルボレートを得る。この
産物を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中、約−1
0℃から約0℃において、テオブロミンで処理し、続い
て約28℃、5トルにおいてDMSOを留去し、約95
%の非常に高い収率で相当する1−N−アルキル化キサ
ンチンを得る。続いて過剰量の水酸化ナトリウム溶液の
ように強い塩基性溶液中で酸化加水分解を行うと、ホウ
素原子および(R)−または(S)−ピナンジオール残
基が取り除かれる。イソプロパノール等の溶媒からの再
結晶化といった慣用の回収法によって産物を得ることが
できる。下記にこの好ましい合成法を図示する。
4,1986Matteson,Sadhu&Pete
rson
キラルディレクターとして使用する。ピナンジオールは
以下の合成工程に従って合成できる。
るが、これは商業的スケールの量で入手できない場合が
しばしばある。しかし、下記の工程に従って、−(−)
−β−ピネンから−(−)−α−ピネンを合成すること
ができる。
し、この重要な、出発材料およびキラルディレクターを
再循環させて何回もの反応で繰り返し用いることが重要
である。ピナンジオールを再生成するための望ましい再
循環法を以下に示す:
タシスを、一次刺激後の数秒以内に招来される第2シグ
ナル伝達経路に対するこれらの一次刺激の影響を和らげ
ることによって、維持する機構を提供する。例えば、i
n vivo又はex vivoでの本発明の化合物の
投与は、その挙動を改良すべき細胞を本発明の化合物又
はその薬剤組成物の有効量と接触させることを含む細胞
挙動の改良方法を提供する、前記方法は: (1)腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であり、前記量は
前記増殖を抑制するために充分である;又は(2)造血
幹細胞から赤血球、血小板、リンパ球及び顆粒球への分
化を促進する方法であり、前記量は前記増殖を抑制する
ために充分である;又は(3)抗原もしくはIL−2刺
激によるT細胞の活性化を抑制する方法であり、前記量
は前記活性化を促進するために充分である;又は(4)
内毒素、TNF、IL−1もしくはGM−CSF刺激に
よる単球/マクロファージ細胞の活性化を抑制する方法
であり、前記量は前記活性化を抑制するために充分であ
る;又は(5)腫瘍壊死因子の細胞毒性効果に対する間
葉細胞の耐性を強化する方法であり、前記量は前記耐性
を強化するために充分である;又は(6)抗原、IL−
4もしくはCD40リガンドに反応したB細胞の抗体産
生を抑制する方法であり、前記量は前記抗体産生を抑制
するために充分である;又は(7)平滑筋細胞の増殖を
刺激することができる成長因子に反応した平滑筋細胞の
増殖を抑制する方法であり、前記量は前記増殖を抑制す
るために充分である;又は(8)内皮細胞によって与え
られる全身血管の抵抗を弱める方法であり、前記量は高
血圧誘導物質の放出を減ずるために充分である;又は
(9)内皮細胞によって与えられる全身血管の抵抗を弱
める方法であり、前記量は抗高血圧性誘導物質の放出を
強化するために充分である;又は(10)そのエンハン
サーによって誘導される接着分子の発現を減ずる方法で
あり、前記量は前記発現を減ずるために充分である;又
は(11)HIVによるT細胞の活性化を抑制する方法
であり、前記量は前記活性化を抑制し、従ってウイルス
複製を抑制するために充分である;又は(12)IL−
1及び/又はmip−1α及び/又はPDGF及び/又
はFGFによる刺激に反応した腎臓糸球体間質細胞の増
殖を抑制する方法であり、前記量は前記増殖を抑制する
ために充分である;又は(13)シクロスポリンAもし
くはアンホテリシンBに対する腎臓糸球体細胞又は尿細
管細胞の抵抗を強化する方法であり、前記量は前記抵抗
を強化するために充分である;又は(14)TNF処理
骨髄間質細胞における成長刺激因子産生の抑制を防止す
る方法であり、前記量は前記抑制を防止するために充分
である;又は(15)IL−1、TNF、もしくは内毒
素刺激単球及びマクロファージによるmipー1α放出
を防止する方法である;又は(16)IL−1、TN
F、もしくは内毒素処理巨核球、繊維芽細胞及びマクロ
ファージによる血小板活性化因子の放出を防止する方法
である;又は(17)TNF処理造血前駆細胞中のサイ
トカイン受容体のダウンレギュレーションを防止する方
法であり、前記量が前記ダウンレギュレーションを防止
するために充分である;又は(18)IL−1刺激され
たもしくはTNF刺激された糸球体上皮細胞又は滑膜細
胞におけるメタロプロテアーゼの産生を抑制する方法で
あり、前記量は前記産生を強化するために充分である;
又は(19)細胞毒性薬物もしくは放射線に対する胃腸
もしくは肺の上皮細胞の抵抗を強化する方法であり、前
記量は前記抵抗を強化するために充分である;又は(2
0)非アルキル化抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を強化する方法
であり、前記量は前記効果を強化するために充分であ
る;又は(21)IL−1に反応した破骨活性化因子の
産生を抑制する方法であり、前記量は前記産生を抑制す
るために充分である;又は(22)IgEに反応した脱
顆粒を抑制する方法であり、前記量は前記脱顆粒を抑制
するために充分である;又は(23)アドレナリン作動
性神経伝達物質、ドーパミン、ノルエピネフリンもしく
はエピネフリン、又は神経伝達物質であるアセチルコリ
ンの放出を強化する方法であり、前記量は前記放出を強
化するために充分である;又は(24)アドレナリン作
動性神経伝達物質、ドーパミン、ノルエピネフリンもし
くはエピネフリン、又は神経伝達物質であるアセチルコ
リンのシナプス後の“遅い電流(slow curre
nt)”効果を調節する方法であり、前記量はこのよう
な遅い電流を調節するために充分である。
T)を受ける患者に関して、BMTが適合同種異系、不
適合同種異系又は自己由来のいずれであるかに関係な
く、用いられる。自己由来移植片を受容する患者は、対
宿主移植片病(GVHD)を発現しないので必ずしも免
疫抑制剤を投与される必要がないとしても、本発明の化
合物による治療によって援助される。しかし、移植を実
施した対象の疾患に関連して用いられる化学療法又は放
射線療法の有害な効果は、患者の細胞に対する負の刺激
を構成する。
照射の有無に拘わらず、正常な骨髄回復のために致死量
を越える化学療法の投与を必要とする。このことは患者
を救うために貯蔵された患者骨髄又はドナー骨髄を用い
ることに合理的根拠を与える。一般に、新しい又は貯蔵
された骨髄を注入する前の連続した7〜10日間、患者
に化学療法又は放射線療法を行う。患者に骨髄を投与す
る日は移植の0日と表される。患者が化学/放射線療法
(chemo/radiation)を受容する、その
前の日々は負数で表される。その後の日々は正数で表さ
れる。
間の中央値(median time)は移植後の最初
の100日間内である。それ故、統計的には、患者が1
00日目まで生存するならば、これらの患者が生存し続
けるチャンスは有意に強化される。本発明の化合物は患
者の生存率を高めることができる。受容可能と考えられ
る、最初の100日間の致死率は“良好な危険性(go
od risk)”患者の15〜20%であり、“高危
険性”患者の30〜40%である。これらの致死率は化
学/放射線療法の高い投与量の直接的な影響によるもの
である。さらに、GVHDは同種異系の骨髄受容者にお
ける死亡率にも寄与する。
応症には、腫瘍に伴う苦痛の存在、ホルモン関連障害、
神経障害、自己免疫疾患、炎症、再狭窄、冠状動脈疾
患、アテローム硬化症、高血圧、望ましくない免疫応
答、ウイルス感染症、腎炎、粘膜炎(mucositi
s)、及び種々なアレルギー反応がある。アレルギー反
応の予防は急性アレルギー反応の予防、並びに、鼻漏、
シナスドレナージ(sinus drainage)、
散在性組織浮腫及び全身化そう痒症の緩和又は予防を含
む。慢性アレルギー反応の他の症状は、上記症状の他
に、めまい感、下痢、組織充血及び、局在化白血球浸潤
を伴う涙腺腫脹(lacrimal swellin
g)を含む。アレルギー反応はまた、ロイコトリエン放
出とその遠位効果をも付随し、気道閉塞の発現を含む喘
息症状、FEVIの減少、生体能力の変化及び大量の粘
液産生を含む。
は例えば化学療法剤又は照射療法のような腫瘍の治療の
ための細胞減少(cytoreductive)剤を投
与され、並びに例えばIL−2のような生物学的反応調
節剤及び例えばリンホカイン活性化キラー細胞(LA
K)と腫瘍浸潤リンパ球(TIL細胞)とのような腫瘍
抑制細胞による治療を受ける患者;他の方法で治療され
たか否かに拘わらず、急性及び慢性の骨髄性白血病、ヘ
アリー・セル白血病、リンパ種、巨核球白血病等を含め
た、一般に新生物に罹患した患者;細菌、真菌類、原生
動物もしくはウイルス感染によって生ずる疾患状態に罹
患した患者;心臓手術を受けた患者のような、例えば再
狭窄としての不快な平滑筋細胞増殖を示す患者;自己免
疫疾患に罹患し、T細胞及びB細胞の不活化を必要とす
る患者;及び神経障害を有する患者を含む。
及び/またはエピネフリンによるシナプトソームの刺激
に起因する関連したPA及びDAGの強化されたレベル
を減ずることができる。このことは、本発明の化合物の
効果が例えばドーパミンのような抑制的神経伝達物質の
放出を強化することと、このような神経伝達物質の遠位
の“遅い電流”効果を調節することの両方であることを
示唆する。
め、例えばストリキニーネのような神経毒に対してシナ
プスを安定化し、例えばL−ドーパのような抗パーキン
ソン病薬の効果を強化し、催眠性化合物の効果を強化
し、トランキライザーの投与に起因する運動障害を軽減
し、例えば発作(stroke)のような脳血管イベン
ト後の進行性神経死を付随するニューロン過度燃焼を軽
減又は防止するためにも有用である。さらに、本発明の
化合物はノルエピネフリン欠乏うつ病及び内因性グルコ
コルチコイドの放出に関連したうつ病の治療に有用であ
り、デキサメタゾン又はメチルプレドニソロンの中枢神
経系に対する毒性を防止し、この薬物への嗜癖なしに慢
性疼痛を治療することができる。さらに、本発明の化合
物は学習及び注意力欠陥を有する小児の治療に有用であ
り、一般に、例えばアルツハイマー病患者を含めた器官
的欠陥を有する対象における記憶を改良する。
のような治療を必要とするヒト対象に、患者の体重に依
存して、約200mg〜約5000mg/日の、有効な
経口、非経口、又は静脈内の致死下投与量として投与す
る場合には、治療効果が達せられる。白血病の治療にお
ける特に好ましい使用計画(regimen)は4〜5
0mg/体重kgである。しかし、如何なる特定の対象
に対しても、個人のニーズと、本発明の化合物を投与す
る又は本発明の化合物の投与を指図する人の専門的判定
とに合わせて特定の投与計画を調節しなければならない
ことを理解すべきである。
o同時投与することは、本発明の化合物の長い半減期に
よる効果の強化を生ずる。このin vivo効果は本
発明の化合物の分解経路の阻害による;特に、キサンチ
ン環のN7位置における脱アルキル化によるものであ
る。例えば、NIH3T3−D5C3細胞を用いて、形
質転換の表現型制御、本発明の化合物単独によるインキ
ュベーション、及び本発明の化合物とP−450抑制剤
との同時インキュベーションを比較することによって、
本発明の化合物単独又はP−450抑制剤との併用との
効果を比較することができる。
ば、(mg範囲の一日投与量)で、プロプラノール(2
0−100)、メタプロロール(20−100);ヴェ
ラパミル(100−400)、ディルチアゼム(100
−400)、ニフェジピン(60−100);シメチジ
ン(400−2,400);シプロフロキサシン(50
0−2,000)、エノキサシン(500−2,00
0)、ノルフロキサシン(500−2,000)、オフ
ロキサシン(500−2,000)、パーフロキサシン
(500−2,000);エリスロマイシン(100−
1,000)、トロレアンドマイシン(100−1,0
00);ケトコニゾール(100−2,000)、チア
ベンザドール(100−1,000);イソニアジド
(100−1,000);メキシレチン(100−1,
000)及びデキサメタゾン(1−100mg)があ
る。
した薬物の性質、及び主治医(attending p
hysician)の判定に依存する。一般に、本発明
の化合物は注射用又は経口投与用のいずれかのために処
方されるが、例えば経粘膜もしくは経皮経路のような、
他の投与形式も使用可能である。これらの化合物の適当
な処方は、例えばRemington’s Pharm
aceuticalScience(最新版),マック
パブリッシュイング カンパニー(Mack Pub
lishing Company)、イーストン、PA
に見い出すことができる。
ばキノロンのようなP−450抑制剤の同時投与によっ
て、投与量レベルをかなり減ずることができる。或い
は、このようなキノロンによって強い相乗効果を得るこ
とができる。
これらの実施例を、本発明を限定するものと見なすべき
ではない。これらの実施例において、PTXはペントキ
シフィリンを意味する。
合成を説明する。反応バイアル中のMIによって飽和さ
れたエーテルに、3.0当量のピリジン(水素化カルシ
ウムから新たに蒸留したもの)及び3.0当量のR−
(+)−1−メトキシ−1−トリフルオロメチル−フェ
ニル酢酸((+)−MTFPA)の酸塩化物を加えた。
この反応バイアルを密封し、50℃に1時間加温し、乾
燥するまで窒素流下に置き、次に75%MeOH/H2
O中で再構成した。(75%MeOH/H2O)90
%、アセトニトリル(AcN)3%、水7%から成るイ
ソクラチック(isocratic)系を3.0ml/
分の流量で250x10mmウルトレメックス(Ult
remex)5C−18カラム[フェノメネックス(P
henomenex),カリフォルニア州,トーラン
ス,90501]に通すことによって、分離を行った。
サンプルを75%MeOH/H2O中のMTFPAーM
Iの10%溶液として調製して、100μlアリコート
を7分間毎に21分間注入した(4回注入)。化合物は
29.8分間目[(S−MI)−MTFPA]、及び3
1.4分間目[(R−MI)−MTFPA]に溶離し
て、95%分離した。ダール(Dale)等が述べてい
るように(J.Org.Chem.34:2543,1
969年)、NMRに基づいて無水構造を割り当てた。
回収された画分を一緒にし、回転蒸発(rotova
p)によって量を減じた。最初に、サンプルをMeOH
とAcNとを除去するためにのみ蒸発させ、その後にこ
れらをクロロホルムによって抽出した。この溶媒を乾燥
させ、真空下で除去した。後に、該エステルが水の除去
に必要な軽度の(minor)温度上昇に安定であるこ
とが研究によって示された後に、この抽出工程は省略し
た。
水分解 MTFPAエステルの加水分解の進行を監視するため
に、直接MIと、存在する総エステルとを定量する分析
法を開発することが必要であった。傾斜プログラムを用
いて、注入後1.0〜8.0分間から可動相を(75%
MeOH/水)40%,AcN40%,水10%から
(75%MeOH/水)40%,AcN60%までに変
えた。最終条件を3分間維持し、その後、カラムを再平
衡化した。溶出液を280nmにおいて監視し、遊離M
Iと誘導体化MIとの保持時間はそれぞれ6.5分間と
12.3分間であった。この系を用いて、誘導体化MI
の立体異性体は分離されなかったので、この系はMTF
PAエステルの加水分解を監視するための分析手段とし
て用いることができた。
−MIエステル(R又はS誘導体)30mgに、水素化
ホウ素ナトリウム(NaBH)約40mgを加え、この
混合物を油浴中で70℃に加熱した。日中4時間毎にさ
らに水素化ホウ素ナトリウム(20mg)を加えた。5
4時間後に反応は、MI+MIエステルの総ピーク面積
の損失なく、約90%完成した(HPLCによる)。反
応を一塩基性リン酸ナトリウム/水によって停止させ、
HClによってpH3.5に調節し、EtOHを真空下
で除去し、未反応エステルとMIとをクロロホルム中に
抽出した。このクロロホルムを硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、真空下で除去した。粗生成物を分取クロマトグラ
フィーを用いて、250x10mmカラムによって3.
0ml/分の流量を用いる、MIに関して上述した溶媒
傾斜法(solvent gradient)によっ
て、精製した。回収した画分を真空下で蒸発乾固させ、
エーテルを加えて磨砕し、鏡像異性体の過剰度(ena
ntiomeric excess)に関して分析した
(両異性体に関して>95%)。エーテルを窒素下で除
去し、得られた結晶を最少量の標準生理食塩水中に溶解
した。この標準化溶液を標準生理食塩水によって希釈し
て、各鏡像異性体の10mM溶液を調製した。再形成M
TFPAエステルのHPLCによって鏡像異性体のアイ
デンティティ(identity)を確認した。
(chiral director)としてRピナンジ
オールを用いる(R)−1−(5−ヒドロキシヘキシ
ル)−3,7−ジメチルキサンチン(CT1501R)
の製造方法を説明する。500ml丸底フラスコ中でト
リエチルシラン(83.49g,0.718モル)と4
−ブロモー1−ブテン(97g,0.718モル)とを
混合し、−78℃に冷却した。1リットル丸底フラスコ
中で三塩化ホウ素(84.13g,0.718モル)ガ
スを−78℃において凝縮させ、ペンタン400mlを
加えた。シラン/ブテン混合物を三塩化ホウ素溶液に、
アルゴン下で撹拌しながら、カニューレを介して滴加
し、この間内部温度を−78℃に維持した。添加の終了
時に、3当量のメタノールを溶液に滴加した。次に、溶
液を室温に加温し、ペンタン、HCl及び過剰なメタノ
ールを大気圧においてアルゴン下で留去した。残渣を真
空蒸留して、ジメチル 4−ブロモブチルボロネート
(0.9torrにおいてbp70−79℃,収量12
7.5g,収率85%)を得た。
ナンジオール(62g,0.365モル)とジメチル
4−ブロモブチルボロネート(75g,0.359モ
ル)とを200mlのジエチルエーテルと共に撹拌し
た。30分間後に、エーテルを真空下で除去して、残渣
を蒸留して、(R)−ピナンジオール−4−ブロモブチ
ルボロネート(1.6−1.9torrにおいてbp1
34−141℃,110.85g,収率98%)を得
た。
レン(31.47g,0.370モル)と無水THF5
00mlとをサイドアーム付き1リットル丸底フラスコ
中でアルゴン下において、撹拌しながら−100℃に冷
却した。この冷却した溶液に、アルゴン下で撹拌しなが
ら、n−ブチルリチウム(ヘキサン中1.4N)212
mlをフラスコの側面に沿って45分間かけて滴加し、
この間内部温度を−100℃に維持した。添加の終了
後、溶液を20分間撹拌させた。ピナンジオール−4−
ブロモブチルボロネート(77.82g,0.247モ
ル)に、無水THF100mlを混合し、−78℃に冷
却し、次に内部温度を100℃に維持しながら、リチウ
ムメチルジクロリド溶液に加えた。添加の終了時に、完
全に乾燥した塩化亜鉛(30.29g,0.222モ
ル)を加えた。この溶液をアルゴン下で10時間撹拌
し、室温に加温した。溶媒を真空下で除去した。この残
渣に、石油エーテル500mlと飽和塩化アンモニウム
水溶液300mlとを加えた。有機相を分離し、飽和塩
化アンモニウム溶液(2x250ml)によって洗浄し
た。水層を一緒にし、石油エーテル(2x250ml)
で洗浄した。有機相を一緒にし、硫酸ナトリウムによっ
て乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗ピナンジオール
(R)ブロモペンチルボロネート,粗重量92.13g
(102%)を得た。
300mlと前の反応からの粗ピナンジオール(R)−
1−クロロー5−ブロモペンチルボロネート(推定89
g,0.247モル)とを混合し、アルゴン下で撹拌し
ながらー78℃に冷却した。この溶液に臭化メチルマグ
ネシウム(3.26N,79.6ml)を加えた。この
溶液を一晩かけて室温に加温した。石油エーテル(50
0ml)と飽和塩化アンモニウム(250ml)とを加
えて、エマルジョンを形成した。水相を分離した。有機
相を飽和塩化アンモニウム溶液(2x250ml)で洗
浄し、エマルジョンを消失させた。一緒にした水相を石
油エーテル(2x250ml)によって洗浄した。一緒
にした有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、
真空下で蒸発させて、粗ピナンジオール(R)−5−ブ
ロモ−1−メチルペンチルボロネート85.85gを得
た。
リットルのDMSOとテオブロミン(44.51g,
0.247モル)とをアルゴン下で撹拌しながら混合し
た。この溶液に水素化ナトリウム(9.9g,0.24
7モル)を2アリコートとして加え、テオブロミンが溶
解するまで撹拌させた。3時間後に、この溶液に前の反
応からのピナンジオール(R)−5−ブロモー1−メチ
ルペンチルボロネート(84.75g,0.247モ
ル)を正確に(neat)滴加し、12時間撹拌させ
た。
能)。残渣を塩化メチレン500mlと水500mlと
によって処理した。水相を除去し、有機相を水(3x7
50ml)によって洗浄した。水相を一緒にし、塩化メ
チレン2x500mlによって洗浄した。有機相を一緒
にして、硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濾過して、
溶媒を真空下で除去し、ピナンジオール(R)−5−
(3,7−ジメチルキサンチン)−1−メチルペンチル
ボロネート(88.14g,収率80%)を得た。
0ml)中に溶解し、混合物をアルゴン下で撹拌しなが
ら0℃に冷却した。内部温度を0℃に維持しながら、3
N水酸化カリウム95mlを滴加し、その後に30%過
酸化水素32.3mlを滴加した。混合物を2時間撹拌
し、固形物を濾別した。水と塩化メチレン(各300m
l)を加えた。相を分離し、水相を塩化メチレン(4x
100ml)によって洗浄した。一緒にした有機相を硫
酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣
を少量の塩化メチレンとそれより多量のエーテルとによ
って再結晶させた。収量は(R)−1−(5−ヒドロキ
シヘキシル)−3,7−ジメチルキサンチン(m.p.
105−108℃)46.3g(87%)であった、
[α]D=−5.63,約96%ee。
を用いる(R)−1−(5−ヒドロキシヘキシル)−
3,7−ジメチルキサンチン(CT1501R)の製造
方法を説明する。実施例2に述べたピナンジオール キ
ラル ディレクターの代わりに(1S,2S)−(1,
2)−ジシクロヘキシルエタンジオール(DICHE
D)を用いることができる。このキラル ディレクター
はピナンジオールよりも容易に回収される(95%)。
DICHEDはシャープレス(Sharpless)
等,J.Org.Chem.57:2768,1992
年に述べられている方法に従って製造することができ
る。上述したように製造されたジメチル−4−ブロモブ
チルボロネート(10.1g,48.06ミリモル)
に、エーテル100ml中の(S,S)−DICHED
10.54g(46.6ミリモル)を混合した。30
分間後に、エーテルを除去し、残渣をシリカゲル10g
の短いカラムに通し、石油エーテル/エーテル(9:
1)で溶出し、(S,S)DICHED類似体4−ブロ
モブチルボロネート17.8gを得た。
HED4−ブロモブチルボロネート17.8g;塩化メ
チレン6.11g;1.4N n−ブチルリチウム4
1.2ml;THF100ml及び無水塩化亜鉛5.8
9gを用いて、同族体化反応を実施した。
HED(R)−1−クロロー5−ブロモペンチルボロネ
ート20.04g;3.0N臭化メチルマグネシウム1
6.7ml;及びTHF150mlを用いて、グリニャ
ール反応を実施した。 50mlフラスコにおいてTH
F(10ml)中にDICHED5−ブロモー1−メチ
ルペンチルボロネートを溶解することによって、(R)
−6−ブロモヘキサン−2−オールを得るためのDIC
HEDボロネートの酸化を実施した。水(10ml)を
溶液に加えた。この溶液をアルゴン下で撹拌しながら0
℃に冷却した。炭酸ナトリウム(3M溶液16.5m
l)を加えた後に、30%過酸化水素 8mlを加え
た。溶液を濾過し、ペンタン20mlを加え、再び濾過
した。水相を分離し、ペンタン(2x10ml)によっ
て洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾
過し、溶媒を蒸発させて、(R)−6−ブロモーヘキサ
ンー2−オールを粗収量8.9gで得た。真空蒸留によ
って、旋光度−13.89[α]549を有する純粋物質
を収量7.1g(84%)で得た。
に加えた。テオブロミン(2.02g,11.2ミリモ
ル)の混合物をDMSO(30ml)中で撹拌し、水素
化ナトリウム282mg(11.8ミリモル)を加え
た。この反応混合物を80分間、激しく撹拌した。ブロ
モアルコール(2.03g,11.2ミリモル)を滴加
し、撹拌を21時間続けた。DMSOを完全なポンプ真
空下で留去した。水(100ml)を加えた。混合物を
25%エタノール/塩化メチレン(3x50ml)によ
って抽出し、一緒にした抽出物を硫酸マグネシウム上で
乾燥させ、蒸発させた。残渣を塩化メチレン20ml中
に入れ、エーテル150mlを加えた。(R)−1−
(5−ヒドロキシヘキシル)−3,7−ジメチルキサン
チン(1.5g,5.36ミリモル,収率47.8%)
のベージュ色結晶が形成された。生成物の他の500m
gを次の24時間にわたって結晶化させて、キラル ク
ロマトグラフィーによって94%より大きいeeを有す
る総収量2g(全体で64%)を得た。
ヘプチル)−3,7−ジメチル−10−キサンチン又は
(RもしくはS)−7−ヒドロキシオクチル−3,7−
ジメチルキサンチンの合成法を説明する。これらの化合
物は上述の適当なピナンジオール/DICHED方法を
用いて、出発物質として長鎖ブロモーオレフィン,5−
ブロモ−1−ペンテン及び6−ブロモー1−ヘキセン,
15をそれぞれ用いることによって、製造した。
反応を説明する。この混合リンパ球反応は、ツーウェイ
(two−way)混合リンパ球反応において測定され
る、同種異系刺激に対するPBMC(末梢血単核細胞)
の増殖反応を示す。CT1501RとPTXとの両方は
図1に示した、この免疫調節活性分析法において活性を
示した。
及び/又はインターロイキン−4(IL−4)によって
刺激されたマウスB細胞増殖の抑制に対するCT150
1Rの効果を示す。図2は、指示された増殖シグナルに
よって惹起されるB細胞増殖をCT1501Rが抑制し
たことを示す。
びインターロイキンー1α(IL−1α)若しくはイン
ターロイキン−2(IL−2)によって惹起される増殖
を抑制するCT1501Rの効果を示す。CT1501
RはConA及びIL−1α若しくはIL−2による活
性化の2時間前に指示用量で細胞に加えた。CT150
1Rは、図3に示した用量−反応関係で胸腺細胞増殖を
抑制した。バックグラウンド カウントは200cpm
未満であった。
及びIL−1によって刺激された平滑筋増殖の抑制に対
するCT1501RとPTXとの効果を示す。PDGF
とIL−1とによる活性化の2時間前に、CT1501
RとPTXとを別々に細胞に加えた。両方の薬物は図4
に示したように高い試験用量で平滑筋細胞増殖を抑制
し、CT1501RはPTXよりも高活性であった。
めた、CT1501Rのin vitro効果を説明す
る。我々は内毒素、TNF−α又はIL−1αによって
刺激された、サイトカイン放出と活性化ヒト臍(umb
ilical)内皮細胞への接着とに対するCT150
1Rの効果を測定した。
C)をマウス腹腔の灌流によって単離し、96孔トレー
中において5x105細胞/孔で培養した。刺激物の添
加の1時間前に培養物にCT1501Rを添加して又は
添加せずに、細胞をサルモネラ アボルタス(Salm
onella abortus)に等しく由来する(e
qui−derived)内毒素[LPS;シグマケミ
カル社(SigmaChemical Co.),L−
1887]5μg/ml又はIL−1α[ゲンザイム
(Genzyme);マサチューセッツ州,ケンブリッ
ジ]50ng/mlによって刺激した。その後の種々な
時間に、上澄み液を取り出して、市販用の96孔マイク
ロタイター免疫検定キット[ゲンザイム;TNF;エン
ドゲン(Endogen),マサチューセッツ州,ボス
トン;IL−1α]を用いて、製造者の仕様書に従って
TNF−α又はIL−1αのレベルを分析した。接着検
査のためには、早期継代(early passag
e)ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を商業的供給者
[クローネチックス(Clonetics),カリフォ
ルニア州,サンジエゴ又はセル システムズ(Cell
Systems),ワシントン州,シアトル]から入
手して、酸性FGF(セル システムズ cat401
−111)を補充した、一定のヘペス(Hepes)緩
衝化無血清培地(セル システムズ cat301−1
80)中で培養した。96孔マイクロタイタープレート
の各孔中で4000細胞を培養し、37℃において72
時間インキュベートさせた。組織球白血病細胞ラインU
937を10%ウシ胎児血清補充RPMI 1640培
地中で刺激した。HUVEC又はU937細胞をLP
S、IL−1α又はTNF−αによって12時間刺激し
た。接着分析のために、U937細胞を蛍光生死判別
(viability)ステイン、2’,7’−ビスー
(2−カルボキシエチル)−5−(及びー6)−カルボ
キシフルオレセインアセトキシメチルエステル(BCE
CF)によって標識した。簡単には、細胞をRPMI−
1640培地+10%ウシ胎児血清中でBCECF10
μg/mlによって37℃において30分間標識した。
細胞を完全培地によって1回洗浄し、HUVEC培養物
に50,000細胞/孔を加えた。サンプルを37℃に
おいて30分間インキュベートし、インバートし(in
verted)、400xgで10分間遠心した。ハン
クス平衡塩類溶液(Hank’s Balanced
Salt Solution)(HBSS)100ml
を添加した後に、このマイクロタイタープレートを次に
ミリポアーサイトフルオール(MilliporeCy
tofluor)蛍光プレートリーダー上で分析した
(励起488nm;発光525nm)。細胞の連続希釈
物の蛍光は20〜100,000細胞/孔の広範囲な細
胞濃度にわたって直線的な濃度関係を示した(データを
示さず)。全ての実験は少なくとも2回繰り返し、全て
の結果は上述の実験の結果を実証した。
らのTNF−α放出を抑制した。細胞は250mM C
T1501Rによって前処理し、上澄み液をELISA
によってLPS刺激後の時間の関数としての放出TNR
−αに関して分析した。CT1501Rは、6〜24時
間目におけるLPS誘導レベルの約50%から48時間
目における約70%までの範囲にわたって、あらゆる時
点においてTNF−α放出を有意に抑制した。図18に
は、放出TNFに対するCT1501Rの効果の用量−
反応を示す。種々な濃度のCT1501Rによる処理の
1時間後に、PEC細胞をLPSによって刺激した。5
0%抑制のCT1501R濃度は約30μMであった。
500μMでは、CT1501Rの抑制効果は最大LP
S刺激(1428pg/ml)の約40%であった。
−1α放出を刺激し、IL−1α放出はLPS刺激後1
2時間までに24pg/mlレベルに増加し、48時間
までに31pg/mlに増加する(図19)。CT15
01Rの添加は12〜48時間目にIL−1α放出を有
意に減じ、24時間目に約50%の最大抑制を示した。
腹腔マクロファージをLPSではなくIL−1α50n
g/mlによって刺激した場合には(図20)、CT1
501RはTNF−αの放出をも抑制した(図20)。
CT1501Rの添加は試験した時点におけるTNF−
αの誘導レベルの50〜70%抑制を生じた。
結合することによって血液から出る。その後、免疫細胞
は内皮細胞と周囲の組織との間を移動する。免疫細胞の
内皮細胞接着と血管外溢出とのモデルは、炎症とアテロ
ーム発生反応とのin vivo処理(manipul
ation)の予測モデルを提供する。TNF−α、I
L−1α又はLPSによる内皮細胞の活性化はある種の
接着分子をアップーレギュレート(up−regula
te)して、リンパ球、単球、好酸球及び好中球へのそ
れらの接着性を高める。細胞ラインU937を用いて、
活性化HUVECへの接着の抑制に対するCT1501
Rの効果を試験した。U937細胞は、内皮細胞上に表
現される免疫グロブリン スーパーファミリー(sup
erfamily)のメンバーである血管接着分子1
(VCAM)を介する内皮細胞への単球接着を仲介する
インテグリンVLA−4の発現を含む、単球の特徴的
な、多くの表現型を表現する。HUVECをTNF−
α、IL−1α又はLPSから選択した活性剤によっ
て、活性剤の添加の1時間前に250μM CT150
1Rを添加して又は添加せずに、処理した。図21に示
すように、CT1501Rの添加によってHUVECへ
のU937細胞のバックグラウンド結合に対する有意な
影響は存在しなかった。しかし、CT1501Rによっ
て前処理した活性化HUVECの相対的接着性には顕著
な抑制が存在した。CT1501Rによるこの抑制はT
NF−α、IL−1α又はLPSのいずれかによるHU
VECの刺激によって観察された。
胞の活性化は非刺激HUVECへのそれらの接着性をも
高めた(図22)。250μM CT1501Rによる
U937細胞の前処理はHUVECへの接着のIL−1
α仲介増加をバックグラウンド レベル近くまで効果的
に阻止した。
ヒトU937組織球性白血病細胞ライン、及びヒト臍静
脈内皮細胞において、LPS、TNF−α及びIL−1
αー仲介炎症シグナル形成経路と、同時に生ずる細胞反
応とを抑制した。CT1501RはLPSによって刺激
された腹腔マクロファージからの炎症前サイトカインの
TNF−α及びIL−1αの放出を有意に減少させた。
LPS 10μg/ml刺激を用いたTNF−α抑制
のIC50は約30μMであった。CT1501RはI
L−1α活性化PECからのTNF−α放出を阻止し
た。CT1501RはTNF−α、IL−1α又はLP
S活性化HUVECへのU937細胞の接着増加を阻止
した。最後に、CT1501Rは、IL−1α誘導活性
化とU937細胞の非刺激HUVECへの接着性上昇と
を阻止した。
ドマウスのヘア試験を説明する。チャールス リバー
ラボラトリーズ(Charles RiverLabo
ratories)からの生後6〜8週間の雌のnu/
nuマウスをバイオサポート リサーチ サポート サ
ービス(Biosupport Research S
upport Services)(ワシントン州,シ
アトル)において加圧滅菌したマイクロアイソレーター
(micro isolator)装置に収容して、高
塩素処理した加圧滅菌水、照射した齧歯類食餌を与え、
層流フード下に保持した。ケージ(caging)は毎
週交換し、水は週2回交換した。各試験の開始前、5日
間マウスを順化させた。
01Rを1%濃度で加えることによって、最初の局所製
剤を調製し、凝固させた。この最初のCT1501R局
所製剤をヌードマウスの左わき腹に1日に2回、16日
間滅菌アプリケーターによって塗布し、右わき腹には同
じ基剤中の別の化合物を塗布した。マウスは層流フード
下で、顔面マスクと滅菌手袋を着用した塗布者によって
取り扱った。16日間後に、マウス1匹を頚部脱臼によ
って殺し、肩/わき腹の処置部分と背側骨盤(臀部)の
非処置部分とから皮膚生検材料(biopsy)を採取
した。試験片を10%緩衝化ホルマリン中に入れた。生
検材料は組織病理学のために獣医の皮膚病理学者に送っ
た。この処置の6週間後に、第2マウスを安楽死させ、
第1マウスと同様に生検材料を採取した。組織病理学の
ためにサンプルを送った。
部分よりも有意により正常な外観の毛包を有することを
示す。CT1501Rと他方の化合物との両方に関し
て、処置部分では無数の毛鞘が毛包から出ているのが見
られ、これに対して非処置部分では毛鞘が全く見られな
かった。
ている、市販の局所ミノキシジル(minoxidi
l)製剤[ロゲイン(Rogaine)(登録商標),
アプジョーン(Upjohn)]と共に、CT1501
Rの局所塗布を実施した。バンチン アンド キングマ
ン ユニバーサル(Bantin and Kingm
an Universal)からの生後5〜6週間の雌
のnu/nuマウスをバイオサポート リサーチ サポ
ート サービス(ワシントン州,シアトル)において加
圧滅菌したマイクロアイソレーター装置に収容して、高
塩素処理した加圧滅菌水、照射した齧歯類食餌を与え、
層流フード下に保持した。ケージは毎週交換し、水は週
2回交換した。試験の開始前、7日間マウスを順化させ
た。
TOH60%、水10%及びPEG30%の局所製剤と
して、ビヒクルのみと共に調製した。ミノキシジルは地
方の薬局から市販製剤ロゲイン(登録商標)として購入
した。ロゲイン(登録商標)は同一の製剤ベース(fo
rmulation base)で販売されている。マ
ウスは各供試品に特有の、固有尾標識によって確認し
た。マウス2匹/群はCT1501Rと他の1種の化合
物によって処置した。マウス1匹はビヒクルとミノキシ
ジルの各々によって処置した。マウスは層流フード下
で、顔面マスクと滅菌手袋を着用した塗布者によって取
り扱った。溶液又はマウスの汚染を避けるために、各マ
ウスは別々の滅菌アプリケーターによって1日に2回処
置した。全てのマウスに頭蓋骨の基部から尾の基部まで
背中の中心線に沿って、約1.5cm幅に、適当な供試
品をストリップ状に塗布した。34日間後に、全てのマ
ウスをハロタン麻酔薬の過剰量によって安楽死させた。
皮膚生検材料を肩甲骨の間の頚部の首筋に沿ってマウス
7匹の各々から採取した(およそのサイズは1x1.5
cmであった)。全ての試験片をガーゼ上に置いて血液
と流体を除去し、木製舌圧子の切片に固定し、側面を下
にして試験片を10%緩衝化ホルマリンを含む、別々に
標識した容器に入れた。定性的組織病理学的検査のため
に、試験片を獣医の皮膚病理学者に送った。
照)が最低に毛包を発現させたことを明らかにした。ミ
ノキシジル処置マウスでは処置に対するヘア反応が明ら
かであった。CT1501Rと他方の化合物によって処
置されたマウスは毛包の最大濃度を有した。さらに、マ
ウスの目視検査は、CT1501RマウスはCT150
1R、ミノキシジル及び対照から成る群の中で最大に
“毛深い”ことを示した。それ故、CT1501Rはこ
のモデルにおける育毛促進に少なくともミノキシジルと
同程度に良好であった。従って、1〜4%CT1501
R(重量による)の局所製剤は禿頭症を治療し、育毛を
促進するための有効な治療組成物である。
率(survival)に対するCT1501Rの効果
を説明する。我々は、CT1501Rがマウスモデルに
おける内毒素誘導致死を防止するかどうかを判定した。
バイオメンブラン インスチチュート(Biomemb
rane Institute)(ワシントン州,シア
トル)のアニマルユーズ コミティ(Animal U
seCommittee)によって認可されたプロトコ
ール下で、既に発表された報告[アシュケナジ(Ash
kenazi)等,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.88:10535−10539,1
991年]と同様に、生後6〜8週間の雌のBalb/
cマウスに内毒素を注入することによって、敗血症性シ
ョックをモデル化した。リン酸塩緩衝化生理食塩水(P
BS)中のサルモネラ アボルタス(Salmonel
la abortus)に等しく由来する内毒素(シグ
マケミカル社,L−1887)の約LD100量(10μ
g/g)を動物に静脈内注入(i.v.)した。100
μg/kgの用量のCT1501Rを1日3回腹腔内に
注入した(100ml/注入)。対照マウスには同時に
同量のビヒクル対照(PBS)を注入した。生存率を少
なくとも72時間追跡した。
A測定のために、麻酔したマウスの眼窩後方(retr
oorbital)又は心臓穿刺によって血液を回収
し、直ちに遠心し、EDTA血漿を−70℃において貯
蔵した。粒子を含まない血漿を氷上で解凍し、標準マウ
ス血漿を用いて標準曲線を形成して、商業的ELISA
検定法を用いてサイトカイン レベルを測定した。マウ
ス腫瘍壊死因子αキットとインターロイキン−1αキッ
トとは、ゲンザイム(マサチューセッツ州,ケンブリッ
ジ)とエンドゲン(マサチューセッツ州,ボストン)と
からそれぞれ購入した。各データ点はマウス3匹からプ
ールしたEDTA血清から得た、2つのELISA測定
値の平均値であった。表3に要約したデータは独立した
2回の実験から集めたものであり;表4と5からのデー
タは1データ点につきマウス3匹の単回実験から得たも
のである。
ールでPBS単独又はCT1501R単独でそれぞれ処
置した。不利な効果は認められず、生存率は実験の過程
を通して100%であった(データは示さず)。内毒素
の生存率データは全体で6回の独立した実験から要約し
た。要約の表1は6回の実験の各々の結果を列挙する。
累積生存率を表2に示し、図5としてプロットする。図
5において、各時点はマウス少なくとも20匹/群を含
む、少なくとも3回の実験を表す。フィッシャーの完全
片側検定を用いた生存データの確率分析は表3として示
す。LPS処置の直後にCT1501Rを投与した場合
には、有意な保護が与えられた。LPS処置後72時間
目の累積生存率は、LPS単独処置動物の7%に比べ
て、60%であった(p=<0.0005;表3)。
延の効果も図5に示す。動物をLPSで処置し、このL
PS処置の2時間後又は4時間後に、CT1501Rを
投与した。この場合にも、CT1501Rは有意な保護
を与えた。CT1501R処置マウスの生存率は、LP
S単独処置動物の7%に比べて、2時間目に55%であ
り、4時間目には37%であった(それぞれ、p=0.
0005とp=0.001;表3)。
の関数として、マウスの血漿内のTNF−α、IL−1
α及びIL−6のレベルを測定した。これらのデータを
内毒素による処置直後にCT1501Rの単回i.p.
注入によって処置した動物と比較した。TNF−αレベ
ルは内毒素処置の1時間以内にピークに達した(表4と
図6)。CT1501Rによるマウス処置は、測定した
あらゆる時点において内毒素処置マウスのEDTA血漿
中のTNF−αレベルを減じた。特に、内毒素後の0.
5時間目及び1時間目のTNF−αピークレベルは、C
T1501R処置マウスではそれぞれ2.5分の1と
2.6分の1に減少した。
T1501R処置によって減少した(表5;図7)。特
に、内毒素後の6、12及び18時間目に観察されたピ
ークレベルは、それぞれ1.2分の1、4.3分の1及
び3.2分の1に減少した。最後に、IL−6測定を同
じやり方で実施した(表6;図8)。3、6及び12時
間目におけるピーク血漿レベルもCT1501R処置動
物では減少した(それぞれ、1.7分の1、2.0分の
1及び4.1分の1に減少)。
た内毒素量を受容したマウスの生存率を,CT1501
Rは有意に強化した。CT1501Rを内毒素と同時
に、又は内毒素処置の2時間後又は4時間後に投与した
場合には、対照と比べて、生存率が改良された。内毒素
直後のCT1501Rの1回量の投与は、TNF−α、
IL−1α及びIL−6のピーク血漿レベルを有意に減
少した。
−FU)誘導骨髄抑圧に対するCT1501Rの効果を
説明する。我々は、マウスモデルにおける細胞毒性化学
療法後の造血再形成のために必要な時間にCT1501
Rが影響するか否かを判定した。雌のBalb/Cマウ
ス[VAF,チャールス リバー ラボラトリーズ(C
harles River Laboratorie
s),生後6〜8週間,約17.3〜18.5g]を5
−FUによって、実験1では200mg/kg又は実験
2では190μg/kgの用量で、腹腔内(i.p.)
処置した。CT1501R又はビヒクル対照を5−FU
投与の1日前から出発して100μg/kgの用量で
i.p.投与して、実験1では13日目に、実験2では
15日目に最後のマウスを殺すまで続けた。対照には、
5−FUを含まないCT1501R又はビヒクルによっ
て処置したマウスを含めた。5−FU投与の2日間後か
ら出発して、マウス(4匹/群)をハロタン麻酔下での
心臓穿刺後の頚部脱臼によって殺し、総白血球算定と血
球分画(differential count)を実
施した。血小板算定は位相対比顕微鏡を用いて2回実施
した。大腿骨を回収し、大腿骨あたりの顆粒球−マクロ
ファージコロニー形成細胞(CFU−GM)数を成長因
子としてポークウィードマイトジェン(pokewee
dmitogen)脾臓ならし培地を用いる標準検定法
[テリー フォックス ラボラトリーズ(Terry
Fox Laboratories);ブリティッシュ
コロンビア州,ヴァンクーバー]を用いて測定した。各
大腿骨は別々に3回培養し、各実験時点の平均値を算出
した。統計分析に用いた標準偏差は各大腿骨に関して測
定された平均コロニー数の偏差であった。
処置したマウスは明らかな不利な影響を受けなかった。
ビヒクル対照のみで処置されたマウスは、時間と共に、
絶対好中球数(ANC)及び白血球数(WBC)の増加
を示したが、これはCT1501R処置マウスでは見ら
れなかった。これらの差は0日目の値と4日目及び8日
目の値とは有意に異なった(それぞれ、p=0.012
とp=0.016;両側スチューデント検定)。CT1
501R投与マウスに比較した場合に、対照処置マウス
は4日目に有意に高い白血球数を有し(p=0.00
9)、12日目に有意に高い好中球数を有した(p=
0.028)。対照処置マウスは0日目の値に比べて、
12日目の顆粒球数の有意な上昇を示した(p=0.0
28)。CT1501R処置マウスのWBCとANCは
対照値の1SD内に留まった。
び10日目に、CT1501R処置マウスにおけるより
もビヒクル処置対照マウスにおいて有意に低かった(そ
れぞれ、p=0.019とp=0.036)(図1
0)。血球分画では、全ての血球(cell)は6日目
と8日目に両群においてリンパ球の形状を有した。CT
1501R処置マウスでは10日目に幾つかの単球が認
められ、顆粒球は稀に認められた。13日目に、440
±17/mm3の平均値±SD ANCを有したが、対
照マウスは180±10/mm3を有した(p=0.0
5)(図10)。
腿骨の測定によって推定される。5−FU処置後に、ビ
ヒクル対照とCT1501R処置マウスの両方は、回復
の開始時の8日目までに測定不能なレベル近くにCFU
−GMを抑圧した(図13)。13日目までに、有意な
分散が存在した。CT1501R処置マウスはビヒクル
対照動物(p=0.024)及び0日目に処置前に殺し
た動物(p=0.05)よりも有意に多いCFU−GM
数/大腿骨を13日目に有し、このことは前駆細胞回復
のオーバーシュート(overshoot)が存在する
ことを実証した。
185mg/kgに減じた;(2)10日目から15日
目まで毎日採血(blood draw)を実施した;
及び(3)血小板算定を実施したことを除いて、実験1
と同様であった。実験2からの結果は、図10〜13に
グラフとして示す。第1実験と同様に、CT1501R
によって処置したマウスは有意に高いWBCを有した
(図10)。CT1501R処置マウスでは、好中球回
復が増進された(図12)。血小板最低数(nadi
r)と回復率もビヒクル対照動物に比べて増加した(図
11)。細胞数/大腿骨は造血回復中に、CFU−GM
数/大腿骨と同様に、対照動物に比べて増加した(図1
3)。
スでは、CT1501R処置が好中球数の上昇率と、関
連する骨髄性前駆細胞による骨髄再集団(marrow
repopulation)率とを増加させた。CT
1501Rは各測定時点において総WBCの5−FU誘
導抑制を阻止した。しかし、10日目までに、小リンパ
球の形態学的出現によって細胞は増加した。実験1では
13日目に、実験2では10日目にCT1501R処置
マウス中の好中球はビヒクル対照処置マウスにおけるよ
りも有意に増加した。CT1501Rによる造血回復の
刺激は巨核球系統にも影響を与えた。試験動物は対照動
物よりも有意に高い血小板最低数を有し、ビヒクル対照
よりも迅速な血小板数上昇と大きなオーバーシュートと
を示した。
w cellurality)の回復と骨髄前駆細胞の
定量化との両方によっても証明された。CT1501R
処置マウスは造血回復中に、対照動物に比べて、CFU
−GM数/大腿骨の約2倍の増加を示した。
1501Rによる処置がビヒクル対照に付随するANC
上昇とCFU−GM/大腿骨上昇の両方を阻止した。C
T1501R処置動物の全てが非注入対照の1標準偏差
以内にANCを維持した。CT1501Rが1日2回の
i.p.注入に対するストレス誘導反応と恐らくサイト
カイン誘導反応をも阻止したように思われる。
細胞減少治療後の造血再構成を促進するためのCT15
01Rと本発明化合物との使用方法を支持する。
ドロキシヘキシル)テオブロミン)およびPTXに対す
る混合リンパ球反応を示す。混合リンパ球反応は、ツー
ウェイ方式の混合リンパ球反応によって調べたところ、
同種異系刺激に対してPBMC(末梢血単核細胞)の増
殖反応を示す。CT1501RおよびPTXは共に、こ
の免疫調節活性測定方法において用量作用活性を示し
た。
ュー抗体にIL−4をクロスリンクしたものによって刺
激されたマウスB細胞の増殖のCT1501Rによる抑
制効果を示す。
ターロイキン−1α(IL−1α若しくはインターロイ
キン−2(IL−2)による増殖のCT1501Rによ
る抑制効果を示す。ConAとIL−1α若しくはIL
−2による活性化の2時間前に、CT1501Rを示し
た用量だけ加えた。図3に示されるように、CT150
1Rは胸腺細胞の増殖を用量依存的に抑制した。バック
グランドは200cpmより小さかった。
びIL−1によって刺激された平滑筋の増殖のCT15
01RおよびPTXによる抑制効果を示す。PDGFお
よびIL−1による活性化の2時間前にCT1501R
およびPTXを別々に加えた。図4に示されるように、
両薬剤共、テストした中で高い用量を用いた場合に平滑
筋細胞の増殖を抑制した。CT1501RはPTXより
も活性が高かった。
CT1501Rによる抑制を、最大6回の独立した実験
における生存マウスの累積パーセントで示す(N=実験
回数)。動物に10μg/gmのLPSを投与した(静
脈注射)。LPSを与えた直後(t=0)、2時間後
(t=2)、または4時間後(t=4)にマウスにCT
1501R(100mg/kg、腹腔内投与)の1回目
の投与を行った。その後、マウスにCT1501Rを1
日に3回投与し、動物の生存率をモニターした。
NF−αレベルを示す。各値は、2回のELISA測定
の平均からなる、2回の実験の平均値を示しており、各
点は3匹のマウスからプールした血漿について価を示
す。
のデータを示す。データは、2回のELISA測定の平
均からなる、1回の実験の平均値を示しており、各点は
3匹のマウスからプールした血漿について価を示す。
データを示す。データは、2回のELISA測定の平均
からなる、1回の実験の平均値を示しており、各点は3
匹のマウスからプールした血漿について価を示す。
図(フローチャート)を示す。
後(0日目)、1日目からCT1501Rまたは媒体コ
ントロールを2回/日投与したマウスの平均WBCを示
す。この実験は、図10−13で述べられるように造血
のin vivoモデルである。各時点において4匹の
マウスのグループを瀉血した。グラフの各値は平均値±
1SDを示す。
後(0日目)、0日目からCT1501Rまたは媒体コ
ントロールを2回/日投与したマウスの平均血小板数を
示す。各時点において4匹のマウスのグループを瀉血し
た。グラフの各値は平均値±1SDを示す。
媒体コントロールを2回/日投与したマウスの平均好中
球数を絶対値で示す。各時点において4匹のマウスのグ
ループを瀉血した。グラフの各値は平均値±1SDを示
す。
後(0日目)、0日目からCT1501Rまたは媒体コ
ントロールを2回/日投与したマウスの平均CFU−G
M/大腿骨を示す。各時点において4匹のマウスのグル
ープを殺し、一本の大腿骨を採集する。グラフの各値
は、三回の培養でテストした各個体当たりのコロニー数
の平均値±1SDを示す。
−1501Rの効果を示す。
ョック薬剤である、二官能性TNF受容体(Genen
tech社)(Ashkenaziら., Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 88:1053
5,1991)の公表されている値と比較したものであ
る。両薬剤は、致死量のLPS(エンドトキシン)投与
とほぼ同時に投与した。このin vivo実験の比較
シリーズでは、薬剤投与の時間に関係なく、CT150
1Rの方がGenentech社製TNF受容体よりも
一貫して生存率の増加を促進した。
ョック薬剤である、二官能性TNF受容体(Genen
tech社)(Ashkenaziら., Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 88:1053
5,1991)の公表されている値と比較したものであ
る。両薬剤は、致死量のLPS(エンドトキシン)投与
から2時間後に(図16)投与した。このin viv
o実験の比較シリーズでは、薬剤投与の時間に関係な
く、CT1501Rの方がGenentech社製TN
F受容体よりも一貫して生存率の増加を促進した。
あるCT1501S、およびPTXのリソホスファチジ
ン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)(第二メ
ッセンジャーシグナル伝達に関与する酵素)に対するi
n vivo抑制についての比較を示している。図から
わかるように、臨床現場で達成可能なIC50濃度にお
いてCT1501Rのみが酵素活性を著しく阻害した。
LPAAT活性はIL−1βで刺激した3T3 Ras
形質転換繊維芽細胞を用いて決定した。
ァージからのTNF−αの遊離のCT1501Rによる
抑制の用量作用曲線を示す。細胞を単離し、LPS活性
化(10mg/ml)の1時間前に種々の濃度のCT1
501Rの処理をするか、または処理を行わなかった。
24時間後に上清を集め、ELISAによってTNF−
αについて分析した(+/−SD)。
−1αの遊離のCT1501Rによる抑制を示す。細胞
を単離し、LPS活性化(10μg/ml)の1時間前
にCT1501R(250μM)の処理するか、または
処理を行わなかった。所定の時間経過後に上清を集め、
ELISAによってIL−1αについて分析した(+/
−SD)。
ロファージからのTNF−αの遊離の抑制を示す。細胞
を単離し、IL−1α活性化の1時間前にCT1501
R(250μM)の処理をするか、または処理を行わな
かった。活性化から24、48、または72時間経過後
に上清を集め、ELISAによってTNF−αについて
分析した(+/−SD)。
への接着の抑制を示す。HUVECに250μM CT
1501Rを加えた後1時間後に、または加えずに、I
L−1α(100ng/ml);TNF−α(10ng
/ml)若しくはLPS(10mg/ml)で刺激し
た。12時間後に、細胞のBCECFラベルしたU93
7細胞への接着について分析した。図21は、各処理グ
ループの相対BCECF蛍光(+/−SD)を示す。
への接着の抑制を示す。U937細胞に250μM C
T1501Rを加えた後1時間後に、または加えずに、
種々の濃度のIL−1αで刺激した。12時間後に、U
937細胞をBCECFで標識し、HUVECへ接着さ
せた。図21は、各処理グループの相対BCECF蛍光
(+/−SD)を示す。
Claims (2)
- 【請求項1】患者の経口投与、非経口投与、ex vi
vo投与又は局所投与用に処方された、以下の一般式: 【化1】 [式中、 R1は、ω−1第二アルコールで置換されたアルキル
(C5-8)の実質的に他の鏡像異性体を含まない分離さ
れた鏡像異性体であり;そしてR2およびR3は独立に、
所望により炭素原子の代りに1つ、又は隣接しない2つ
の酸素原子を含んでいてもよい、アルキル(C1-12)で
ある]で示される置換キサンチン化合物、および薬剤学
的に受容される助剤とを含む薬剤組成物であって、シク
ロスポリンA及びFK506を含めた免疫抑制剤療法に
よって惹起される副作用を治療及び予防するための薬剤
組成物。 - 【請求項2】化合物の経口投与量が500mg−150
0mg、1日2回又は3回であり、静脈内注射、腹腔内
投与、筋肉内投与又は皮下注射される場合の化合物の非
経口投与量が24時間の過程にわたって1.0g−5.
0gであり、局所製剤濃度が1重量%−4重量%であ
り、ex vivo培養濃度が10μM−500μMで
ある、請求項1に記載の薬剤組成物。
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