JP2002078495A - 酵素処理方法 - Google Patents
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- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 基質に酵素を作用させ、酵素反応生成物
を得る酵素反応において、当該反応を加圧下に行うこと
を特徴とする、酵素処理方法。 【効果】 本発明によれば、酵素反応を短時間に効率的
に行うことのできる酵素処理方法が提供される。本発明
方法においては、酵素が加圧によって活性化されるとと
もに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応温度
よりも高温での反応が可能となる。本発明方法によりセ
ルロースの酵素分解を行うと、大量に発生するセルロー
ス廃棄物を効果的に処理することができ、環境保全と資
源の有効活用の面で非常に有用である。
を得る酵素反応において、当該反応を加圧下に行うこと
を特徴とする、酵素処理方法。 【効果】 本発明によれば、酵素反応を短時間に効率的
に行うことのできる酵素処理方法が提供される。本発明
方法においては、酵素が加圧によって活性化されるとと
もに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応温度
よりも高温での反応が可能となる。本発明方法によりセ
ルロースの酵素分解を行うと、大量に発生するセルロー
ス廃棄物を効果的に処理することができ、環境保全と資
源の有効活用の面で非常に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素処理方法に関
し、詳しくは、加圧下に酵素反応を行うことを特徴とす
る、酵素処理方法に関する。
し、詳しくは、加圧下に酵素反応を行うことを特徴とす
る、酵素処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、海洋・湖沼・河川・土壌などの環
境汚染の改善、及びそれと関連してバイオマス資源など
の環境保全エネルギーの開発が大きな関心となってい
る。バイオマス資源として、もみがらや木材、サトウキ
ビなどの植物が利用されるが、これらに存在するセルロ
ースやリグニンが難分解性であるゆえ、植物の利用を阻
む原因となっており、これらを効率よく分解する手段が
必要である。セルロースを酵素により分解してグルコー
スを製造することは公知であり、このような酵素は一般
にセルラーゼと称されている。セルラーゼには、（１）
セルロースの固い結晶領域を非還元末端からエキソ型に
加水分解しセロビオースを生成するセロビオヒドロラー
ゼ（アビセラーゼ）活性、（２）セルロースの非結晶領
域をエンド型に加水分解しセルロース分子の低分子化と
各種のセロオリゴ糖を生成するエンドグルカナーゼ（CM
Case）活性、（３）セロビオースやセロオリゴ糖をグル
コースに分解するβ−グルコシダーゼ活性、の３種の酵
素活性が含まれており、この３種の活性によりセルロー
スはセロビオースやセロオリゴ糖を経てグルコースにま
で分解される。従来のセルラーゼを使用したセルロース
の分解反応は、常圧下に酵素の活性を損なわない温度で
行われるものであり、反応に時間がかかる。また酵素を
安定な状態で作用させることが困難であることから収率
も劣り、実用レベルに到達するものではなかった。
境汚染の改善、及びそれと関連してバイオマス資源など
の環境保全エネルギーの開発が大きな関心となってい
る。バイオマス資源として、もみがらや木材、サトウキ
ビなどの植物が利用されるが、これらに存在するセルロ
ースやリグニンが難分解性であるゆえ、植物の利用を阻
む原因となっており、これらを効率よく分解する手段が
必要である。セルロースを酵素により分解してグルコー
スを製造することは公知であり、このような酵素は一般
にセルラーゼと称されている。セルラーゼには、（１）
セルロースの固い結晶領域を非還元末端からエキソ型に
加水分解しセロビオースを生成するセロビオヒドロラー
ゼ（アビセラーゼ）活性、（２）セルロースの非結晶領
域をエンド型に加水分解しセルロース分子の低分子化と
各種のセロオリゴ糖を生成するエンドグルカナーゼ（CM
Case）活性、（３）セロビオースやセロオリゴ糖をグル
コースに分解するβ−グルコシダーゼ活性、の３種の酵
素活性が含まれており、この３種の活性によりセルロー
スはセロビオースやセロオリゴ糖を経てグルコースにま
で分解される。従来のセルラーゼを使用したセルロース
の分解反応は、常圧下に酵素の活性を損なわない温度で
行われるものであり、反応に時間がかかる。また酵素を
安定な状態で作用させることが困難であることから収率
も劣り、実用レベルに到達するものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、環境
保全と資源の有効活用の観点から、セルロース廃棄物の
効果的な処理法や再資源化法の開発が望まれるところで
ある。従って、本発明は、セルラーゼを使用したセルロ
ースの酵素分解処理を短時間で効率良く行う方法を提供
することにある。
保全と資源の有効活用の観点から、セルロース廃棄物の
効果的な処理法や再資源化法の開発が望まれるところで
ある。従って、本発明は、セルラーゼを使用したセルロ
ースの酵素分解処理を短時間で効率良く行う方法を提供
することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、セルラーゼによる
セルロースの酵素分解反応をはじめ、各種酵素による酵
素反応を加圧下に行うことにより、基質を効率よく変換
して酵素反応生成物を得ることができることを見出し、
本発明を完成させるに至った。
を解決するために鋭意検討した結果、セルラーゼによる
セルロースの酵素分解反応をはじめ、各種酵素による酵
素反応を加圧下に行うことにより、基質を効率よく変換
して酵素反応生成物を得ることができることを見出し、
本発明を完成させるに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、以下の（１）から
（１４）の発明に関する。 （１） 基質に酵素を作用させ、酵素反応生成物を得る
酵素反応において、当該反応を加圧下に行うことを特徴
とする、酵素処理方法。 （２） 酵素反応を、０．２〜１，０００ＭＰａの加圧
下に行うことを特徴とする、上記（１）の方法。 （３） 酵素反応を、常圧下での反応温度よりも高温で
行うことを特徴とする、上記（１）又は（２）の方法。 （４） 酵素が、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、タン
ナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、及びキチナーゼか
らなる群から選択される、上記（１）〜（３）いずれか
の方法。 （５） 基質の形状を粉末状、シート状、又は粒状にす
ることを特徴とする、上記（１）〜（４）いずれかの方
法。 （６） セルロースにセルラーゼを作用させ、酵素反応
生成物としてグルコースを得る酵素反応において、当該
反応を加圧下に行うことを特徴とする、酵素処理方法。 （７） セルラーゼが、Acremonium属の菌が生産するセ
ルラーゼ系であること特徴とする、上記（６）の方法。 （８） Acremonium属の菌がAcremonium sp. Y-94であ
ることを特徴とする、上記（７）の方法。 （９） Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、
さらにエンドグルカナーゼ（CMCase）活性が加圧状態で
向上する酵素を混合した酵素組成物を使用することを特
徴とする、上記（７）の方法。 （１０） CMCase活性が加圧状態で向上する酵素が、As
pergillus属の菌が生産する酵素であることを特徴とす
る、上記（９）の方法。 （１１） 酵素組成物中のAcremonium属の菌が生産する
酵素とCMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比
がCMCase活性当量として７：５０〜５０：７であること
を特徴とする、上記（９）の方法。 （１２） セルロースとセルラーゼを０．２〜１，００
０MPaに加圧することを特徴とする、上記（６）〜（１
１）いずれかの方法。 （１３） 粉末状、シート状又は粒状のセルロースを使
用することを特徴とする、上記（６）〜（１２）いずれ
かの方法。 （１４） セルロース１ｇに対して、CMCase活性当量と
して０．０００５〜１０，０００国際単位（IU）のセル
ラーゼを使用することを特徴とする、上記（６）〜（１
３）いずれかの方法。 以下、本発明を詳細に説明する。
（１４）の発明に関する。 （１） 基質に酵素を作用させ、酵素反応生成物を得る
酵素反応において、当該反応を加圧下に行うことを特徴
とする、酵素処理方法。 （２） 酵素反応を、０．２〜１，０００ＭＰａの加圧
下に行うことを特徴とする、上記（１）の方法。 （３） 酵素反応を、常圧下での反応温度よりも高温で
行うことを特徴とする、上記（１）又は（２）の方法。 （４） 酵素が、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、タン
ナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、及びキチナーゼか
らなる群から選択される、上記（１）〜（３）いずれか
の方法。 （５） 基質の形状を粉末状、シート状、又は粒状にす
ることを特徴とする、上記（１）〜（４）いずれかの方
法。 （６） セルロースにセルラーゼを作用させ、酵素反応
生成物としてグルコースを得る酵素反応において、当該
反応を加圧下に行うことを特徴とする、酵素処理方法。 （７） セルラーゼが、Acremonium属の菌が生産するセ
ルラーゼ系であること特徴とする、上記（６）の方法。 （８） Acremonium属の菌がAcremonium sp. Y-94であ
ることを特徴とする、上記（７）の方法。 （９） Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、
さらにエンドグルカナーゼ（CMCase）活性が加圧状態で
向上する酵素を混合した酵素組成物を使用することを特
徴とする、上記（７）の方法。 （１０） CMCase活性が加圧状態で向上する酵素が、As
pergillus属の菌が生産する酵素であることを特徴とす
る、上記（９）の方法。 （１１） 酵素組成物中のAcremonium属の菌が生産する
酵素とCMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比
がCMCase活性当量として７：５０〜５０：７であること
を特徴とする、上記（９）の方法。 （１２） セルロースとセルラーゼを０．２〜１，００
０MPaに加圧することを特徴とする、上記（６）〜（１
１）いずれかの方法。 （１３） 粉末状、シート状又は粒状のセルロースを使
用することを特徴とする、上記（６）〜（１２）いずれ
かの方法。 （１４） セルロース１ｇに対して、CMCase活性当量と
して０．０００５〜１０，０００国際単位（IU）のセル
ラーゼを使用することを特徴とする、上記（６）〜（１
３）いずれかの方法。 以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明においては、基質に酵素を
作用させ、酵素反応生成物を得る酵素反応を、加圧下に
行う。具体的には、酵素反応を０．２〜１，０００MP
a、好ましくは１０〜５００MPa、特に好ましくは１００
〜１５０Mpaの加圧下に行う。当該範囲の圧力に加圧す
ることにより、酵素が活性化されるとともに、酵素自体
の安定性も向上し、通常の酵素反応温度よりも高温での
反応が可能となる。圧力が上記範囲よりも高い場合に
は、酵素が失活し、反応効率が低下し、また、圧力が上
記範囲よりも低い場合には、所望の程度にまで反応効率
が向上せず、好ましくない。
作用させ、酵素反応生成物を得る酵素反応を、加圧下に
行う。具体的には、酵素反応を０．２〜１，０００MP
a、好ましくは１０〜５００MPa、特に好ましくは１００
〜１５０Mpaの加圧下に行う。当該範囲の圧力に加圧す
ることにより、酵素が活性化されるとともに、酵素自体
の安定性も向上し、通常の酵素反応温度よりも高温での
反応が可能となる。圧力が上記範囲よりも高い場合に
は、酵素が失活し、反応効率が低下し、また、圧力が上
記範囲よりも低い場合には、所望の程度にまで反応効率
が向上せず、好ましくない。
【０００７】本発明において使用する酵素としては、代
表的にはセルラーゼを挙げることができるがこれに限定
されるわけではなく、グルコアミラーゼ、タンナーゼ、
フィターゼ、プロテアーゼ、キチナーゼ等の加水分解酵
素のほか、各種の酸化還元酵素、転移酵素、異性化酵
素、除去付加酵素、合成酵素をも同様に使用することが
できる。また、これらの酵素の起源は、微生物、植物、
動物由来のいずれであってもよく、市販品を利用しても
よい。
表的にはセルラーゼを挙げることができるがこれに限定
されるわけではなく、グルコアミラーゼ、タンナーゼ、
フィターゼ、プロテアーゼ、キチナーゼ等の加水分解酵
素のほか、各種の酸化還元酵素、転移酵素、異性化酵
素、除去付加酵素、合成酵素をも同様に使用することが
できる。また、これらの酵素の起源は、微生物、植物、
動物由来のいずれであってもよく、市販品を利用しても
よい。
【０００８】例えば、セルラーゼを使用する場合、一般
にセルラーゼとして知られた酵素であれば特に制限なく
使用できるが、Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ
系、特にAcremonium sp. Y-94が生産するセルラーゼ系
が好適に使用できる。
にセルラーゼとして知られた酵素であれば特に制限なく
使用できるが、Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ
系、特にAcremonium sp. Y-94が生産するセルラーゼ系
が好適に使用できる。
【０００９】また、上記Acremonium属の菌が生産するセ
ルラーゼ系に、CMCase活性が加圧状態で向上する酵素を
混合した酵素組成物を使用すると、セルロースの酵素分
解反応の効率が一段と向上するので好ましい。CMCase活
性が加圧状態で向上する酵素としては、例えばAspergil
lus属の菌が生産する酵素が挙げられる。
ルラーゼ系に、CMCase活性が加圧状態で向上する酵素を
混合した酵素組成物を使用すると、セルロースの酵素分
解反応の効率が一段と向上するので好ましい。CMCase活
性が加圧状態で向上する酵素としては、例えばAspergil
lus属の菌が生産する酵素が挙げられる。
【００１０】このような酵素混合物を使用する場合に
は、酵素組成物中のAcremonium属の菌が生産する酵素と
CMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比を、CM
Case活性当量として７：５０〜５０：７になるように混
合とすることが例示される。
は、酵素組成物中のAcremonium属の菌が生産する酵素と
CMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比を、CM
Case活性当量として７：５０〜５０：７になるように混
合とすることが例示される。
【００１１】本発明において、酵素を作用させる基質と
しては、酵素により加水分解、酸化還元、転移、異性
化、除去付加、合成反応を触媒され、酵素反応生成物を
生じるものであれば、特に制限はない。例えば、上記各
酵素に対応してセルロース、デンプン、タンニン酸、フ
ィチン酸、タンパク質、キチン等を挙げることができ
る。例えば、基質がセルロースの場合は、具体的には、
樹木、廃木材、紙、麦わら等各種の天然セルロース類を
使用することができる。
しては、酵素により加水分解、酸化還元、転移、異性
化、除去付加、合成反応を触媒され、酵素反応生成物を
生じるものであれば、特に制限はない。例えば、上記各
酵素に対応してセルロース、デンプン、タンニン酸、フ
ィチン酸、タンパク質、キチン等を挙げることができ
る。例えば、基質がセルロースの場合は、具体的には、
樹木、廃木材、紙、麦わら等各種の天然セルロース類を
使用することができる。
【００１２】また、基質の形状やサイズも特に制限はな
いが、酵素反応を効率良く行わせるためには、粉末状、
シート状又は粒状に加工したものを使用することが好ま
しい。
いが、酵素反応を効率良く行わせるためには、粉末状、
シート状又は粒状に加工したものを使用することが好ま
しい。
【００１３】基質と酵素の混合割合は、各酵素反応にお
いて任意に選択することができるが、例えばセルロース
の場合、濾紙等の分解すべき基質１ｇに対して、CMCase
活性当量として０．０００５〜１０，０００国際単位
（IU）程度の酵素を使用することができる。
いて任意に選択することができるが、例えばセルロース
の場合、濾紙等の分解すべき基質１ｇに対して、CMCase
活性当量として０．０００５〜１０，０００国際単位
（IU）程度の酵素を使用することができる。
【００１４】また、本発明による酵素処理は、通常の加
圧に耐える化学反応容器中でバッチ式、半連続式、連続
式等任意の状態で行うことができる。
圧に耐える化学反応容器中でバッチ式、半連続式、連続
式等任意の状態で行うことができる。
【００１５】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに説明する
が、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではな
い。 （活性測定）以下の実施例（比較例）１〜３では、酵素
活性の測定は、酵素反応によってセルロースが、ｐＨ
４．５，５０℃，０．１MPa（常圧）の条件下で、１分
間に１マイクロモルの還元糖を遊離せしめる酵素量を１
国際単位（IU）と定め、反応終了後加熱失活させた反応
上清液を一部採り、一定倍率に希釈し酵素反応により遊
離した還元糖をSomogyi-Nelson法で定量することによっ
て行った。
が、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではな
い。 （活性測定）以下の実施例（比較例）１〜３では、酵素
活性の測定は、酵素反応によってセルロースが、ｐＨ
４．５，５０℃，０．１MPa（常圧）の条件下で、１分
間に１マイクロモルの還元糖を遊離せしめる酵素量を１
国際単位（IU）と定め、反応終了後加熱失活させた反応
上清液を一部採り、一定倍率に希釈し酵素反応により遊
離した還元糖をSomogyi-Nelson法で定量することによっ
て行った。
【００１６】（実施例１及び比較例１）短冊状にカット
したWhatman No.1濾紙（FP）約１５０ｍｇを基質とし、
酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセル
ラーゼ製剤（商品名：アクレモザイム）をFP糖化活性と
して０．００７８IU使用して、恒温バス中のステンレス
製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することによ
り、セルロースの酵素分解反応を行った。４０mM Britt
on-Robinson広域緩衝液（以下、B-R bufferと略す）２m
l（pH４．５）に酵素及び基質を添加し、６０℃で１、
２４、４８、７２時間、０．１MPa（常圧：比較例１）
と１５０MPa（実施例１）に加圧下、それぞれ反応を行
った結果を表１に示す。表１の各反応時間における数値
は還元糖の生成量（μｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比
率（％）は０．１MPaにおける生成還元糖量に対する１
５０ＭＰａにおける生成還元糖量の比率で表した。
したWhatman No.1濾紙（FP）約１５０ｍｇを基質とし、
酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセル
ラーゼ製剤（商品名：アクレモザイム）をFP糖化活性と
して０．００７８IU使用して、恒温バス中のステンレス
製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することによ
り、セルロースの酵素分解反応を行った。４０mM Britt
on-Robinson広域緩衝液（以下、B-R bufferと略す）２m
l（pH４．５）に酵素及び基質を添加し、６０℃で１、
２４、４８、７２時間、０．１MPa（常圧：比較例１）
と１５０MPa（実施例１）に加圧下、それぞれ反応を行
った結果を表１に示す。表１の各反応時間における数値
は還元糖の生成量（μｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比
率（％）は０．１MPaにおける生成還元糖量に対する１
５０ＭＰａにおける生成還元糖量の比率で表した。
【００１７】
【表１】
【００１８】（実施例２及び比較例２）反応温度を６５
℃とした他は、実施例１と同様にしてセルロースの酵素
分解反応を行った。結果を表２に示す。
℃とした他は、実施例１と同様にしてセルロースの酵素
分解反応を行った。結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】（実施例３及び比較例３）短冊状にカット
したWhatman No.1濾紙（FP）約１５０ｍｇを基質とし、
酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセル
ラーゼ製剤（商品名：アクレモザイム）をFP糖化活性と
して０．００７８IU及びAspergillus属の生産するセル
ラーゼ製剤（商品名：セルソフトウルトラ）をCMCase活
性として０．０１８８IUを混合使用して、恒温バス中の
ステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧する
ことにより、セルロースの酵素分解反応を行った。４０
mM B-R buffer ２ｍｌ（pH４．５）に酵素及び基質を添
加し、６５℃で１、８、２４、４８時間、０．１MPa
（常圧：比較例３）と１５０MPa（実施例３）に加圧
下、それぞれ反応を行った結果を表３に示す。
したWhatman No.1濾紙（FP）約１５０ｍｇを基質とし、
酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセル
ラーゼ製剤（商品名：アクレモザイム）をFP糖化活性と
して０．００７８IU及びAspergillus属の生産するセル
ラーゼ製剤（商品名：セルソフトウルトラ）をCMCase活
性として０．０１８８IUを混合使用して、恒温バス中の
ステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧する
ことにより、セルロースの酵素分解反応を行った。４０
mM B-R buffer ２ｍｌ（pH４．５）に酵素及び基質を添
加し、６５℃で１、８、２４、４８時間、０．１MPa
（常圧：比較例３）と１５０MPa（実施例３）に加圧
下、それぞれ反応を行った結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】（実施例4及び比較例4）酵素としてRhizop
us Niveusの生産するグルコアミラーゼ（生化学工業
（株）製）１ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer（ｐＨ４．
５）１ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質として可溶
性デンプンを５％（w/v）濃度となるように、B-R buffe
rに加え、加温して溶解した。上記基質溶液１１．８８
ｍｌに、上記酵素原液の１２８倍希釈酵素液１２０μｌ
を加えて混合し、４５℃、５５℃、６５℃で、０．１MP
a（常圧：比較例４）と１５０MPa（実施例４）に加圧
下、ｐＨ４．５にてそれぞれ２４時間反応を行った。反
応終了後、沸騰水中で酵素を１０分間加熱失活させた。
反応上清液を適当な倍率に希釈し、その１ｍｌを用いて
Somogyi-Nelson法で本上清液中の還元糖量（反応生成
物）を算出した。結果を表４に示す。表４の各反応温度
における数値は還元糖の生成量（μｇ／ｍｌ反応液）を
表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける生成還元糖
量に対する１５０ＭＰａにおける生成還元糖量の比率で
表した。
us Niveusの生産するグルコアミラーゼ（生化学工業
（株）製）１ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer（ｐＨ４．
５）１ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質として可溶
性デンプンを５％（w/v）濃度となるように、B-R buffe
rに加え、加温して溶解した。上記基質溶液１１．８８
ｍｌに、上記酵素原液の１２８倍希釈酵素液１２０μｌ
を加えて混合し、４５℃、５５℃、６５℃で、０．１MP
a（常圧：比較例４）と１５０MPa（実施例４）に加圧
下、ｐＨ４．５にてそれぞれ２４時間反応を行った。反
応終了後、沸騰水中で酵素を１０分間加熱失活させた。
反応上清液を適当な倍率に希釈し、その１ｍｌを用いて
Somogyi-Nelson法で本上清液中の還元糖量（反応生成
物）を算出した。結果を表４に示す。表４の各反応温度
における数値は還元糖の生成量（μｇ／ｍｌ反応液）を
表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける生成還元糖
量に対する１５０ＭＰａにおける生成還元糖量の比率で
表した。
【００２３】
【表４】
【００２４】（実施例５及び比較例５）酵素としてAspe
rgillus oryzaeの生産するタンナーゼ（和光純薬工業
（株）製）５ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer（ｐＨ５．
５）５ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質としてタン
ニン酸を２％（w/v）濃度となるように、蒸留水に溶解
した。B-R buffer ８．９ｍｌ、２％タンニン酸水溶液
１ｍｌおよび上記酵素原液の８０倍希釈酵素液１００μ
ｌを混合し、３０℃、５５℃で、０．１MPa（常圧：比
較例５）と１５０MPa（実施例５）に加圧下、ｐＨ５．
５にてそれぞれ６０時間反応を行った。反応終了後、酵
素を沸騰水中で１０分間加熱失活させた。反応液１ｍｌ
に８０％エタノール４ｍｌを加え、波長３１０ｎｍにお
ける吸光度の減少量を測定し、酵素反応によって分解さ
れた基質残存量から間接的に反応生成物の量を算出し
た。結果を表５に示す。表５の各反応温度における数値
は波長３１０ｎｍにおける吸光度を表し、加速比率
（％）は０．１MPaにおける吸光度に対する１５０ＭＰ
ａにおける吸光度の比率で表した。
rgillus oryzaeの生産するタンナーゼ（和光純薬工業
（株）製）５ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer（ｐＨ５．
５）５ｍｌに溶解し、酵素原液とした。基質としてタン
ニン酸を２％（w/v）濃度となるように、蒸留水に溶解
した。B-R buffer ８．９ｍｌ、２％タンニン酸水溶液
１ｍｌおよび上記酵素原液の８０倍希釈酵素液１００μ
ｌを混合し、３０℃、５５℃で、０．１MPa（常圧：比
較例５）と１５０MPa（実施例５）に加圧下、ｐＨ５．
５にてそれぞれ６０時間反応を行った。反応終了後、酵
素を沸騰水中で１０分間加熱失活させた。反応液１ｍｌ
に８０％エタノール４ｍｌを加え、波長３１０ｎｍにお
ける吸光度の減少量を測定し、酵素反応によって分解さ
れた基質残存量から間接的に反応生成物の量を算出し
た。結果を表５に示す。表５の各反応温度における数値
は波長３１０ｎｍにおける吸光度を表し、加速比率
（％）は０．１MPaにおける吸光度に対する１５０ＭＰ
ａにおける吸光度の比率で表した。
【００２５】
【表５】
【００２６】（実施例６及び比較例６）酵素として小麦
由来のフィターゼ（Sigma Chemicals 社製）２０ｍｇを
５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．１５）２ｍｌに溶解
し、酵素原液とした。基質として米由来のフィチン酸１
２ナトリウム塩（Inositol hexaphosphoric acid dodec
asodium salt）を２％（w/v）濃度となるように、上記
緩衝液に加え溶解した。上記基質溶液９．９ｍｌに、上
記酵素原液の８倍希釈酵素液１００μｌを加えて混合
し、５５℃、６５℃で、０．１MPa（常圧：比較例６）
と１５０MPa（実施例６）に加圧下、ｐＨ５．１５にて
それぞれ２４時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中
で１０分間酵素を加熱失活させた。酵素反応によって遊
離した無機リンの定量はFiske-Subbarrow法に準拠し
た。すなわち、上記反応液１ｍｌに蒸留水６．６ｍｌ、
２.５％モリブデン酸アンモニウム１ｍｌ、３N硫酸１ｍ
ｌ、アミノナフトールスルホン酸（０．５ｇの１，２，
４アミノナフトールスルホン酸に１５％亜硫酸水素ナト
リウム１９５ｍｌと２０％亜硫酸ナトリウム七水和物５
ｍｌを加え溶解した）０．４ｍｌを加え、混合後３０分
間静置した後、波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定し
て無機リン酸量を算出した。結果を表６に示す。表６の
各反応温度における数値は無機リン酸量（μｇ/ｍｌ反
応液）を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける無
機リン酸量に対する１５０ＭＰａにおける無機リン酸量
の比率で表した。
由来のフィターゼ（Sigma Chemicals 社製）２０ｍｇを
５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．１５）２ｍｌに溶解
し、酵素原液とした。基質として米由来のフィチン酸１
２ナトリウム塩（Inositol hexaphosphoric acid dodec
asodium salt）を２％（w/v）濃度となるように、上記
緩衝液に加え溶解した。上記基質溶液９．９ｍｌに、上
記酵素原液の８倍希釈酵素液１００μｌを加えて混合
し、５５℃、６５℃で、０．１MPa（常圧：比較例６）
と１５０MPa（実施例６）に加圧下、ｐＨ５．１５にて
それぞれ２４時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中
で１０分間酵素を加熱失活させた。酵素反応によって遊
離した無機リンの定量はFiske-Subbarrow法に準拠し
た。すなわち、上記反応液１ｍｌに蒸留水６．６ｍｌ、
２.５％モリブデン酸アンモニウム１ｍｌ、３N硫酸１ｍ
ｌ、アミノナフトールスルホン酸（０．５ｇの１，２，
４アミノナフトールスルホン酸に１５％亜硫酸水素ナト
リウム１９５ｍｌと２０％亜硫酸ナトリウム七水和物５
ｍｌを加え溶解した）０．４ｍｌを加え、混合後３０分
間静置した後、波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定し
て無機リン酸量を算出した。結果を表６に示す。表６の
各反応温度における数値は無機リン酸量（μｇ/ｍｌ反
応液）を表し、加速比率（％）は０．１MPaにおける無
機リン酸量に対する１５０ＭＰａにおける無機リン酸量
の比率で表した。
【００２７】
【表６】
【００２８】（実施例７及び比較例７）酵素としてBaci
llus subtilis由来のプロテアーゼ製剤『「プロテアー
ゼN「アマノ」』（天野製薬（株）製）１０ｍｇを４０
ｍＭのB-R buffer (ｐＨ７．０)１ｍｌに溶解し、酵素
原液とした。基質としてナトロース[Nutrose；カゼイン
ナトリウム（和光純薬（株）製）]を１％（w/v）濃度と
なるように、４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ７．０)に懸
濁し、１５分間熱湯中で溶解した。上記基質溶液９．９
ｍｌに、上記酵素原液の７００倍希釈酵素液１００μｌ
を加えて混合し、５５℃、７０℃で、０．１MPa（常
圧：比較例７）と１５０MPa（実施例７）に加圧下、ｐ
Ｈ７．０にてそれぞれ２４時間反応を行った。反応終了
後、５％三塩化酢酸（TCA）３ｍｌを添加して酵素を失
活させた。反応上清液について波長２８０ｎｍにおける
吸光度を測定した。結果を表７に示す。表７の各反応温
度における数値は波長２８０ｎｍにおける吸光度を表
し、加速比率（％）は０．１MPaにおける吸光度に対す
る１５０ＭＰａにおける吸光度の比率で表した。
llus subtilis由来のプロテアーゼ製剤『「プロテアー
ゼN「アマノ」』（天野製薬（株）製）１０ｍｇを４０
ｍＭのB-R buffer (ｐＨ７．０)１ｍｌに溶解し、酵素
原液とした。基質としてナトロース[Nutrose；カゼイン
ナトリウム（和光純薬（株）製）]を１％（w/v）濃度と
なるように、４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ７．０)に懸
濁し、１５分間熱湯中で溶解した。上記基質溶液９．９
ｍｌに、上記酵素原液の７００倍希釈酵素液１００μｌ
を加えて混合し、５５℃、７０℃で、０．１MPa（常
圧：比較例７）と１５０MPa（実施例７）に加圧下、ｐ
Ｈ７．０にてそれぞれ２４時間反応を行った。反応終了
後、５％三塩化酢酸（TCA）３ｍｌを添加して酵素を失
活させた。反応上清液について波長２８０ｎｍにおける
吸光度を測定した。結果を表７に示す。表７の各反応温
度における数値は波長２８０ｎｍにおける吸光度を表
し、加速比率（％）は０．１MPaにおける吸光度に対す
る１５０ＭＰａにおける吸光度の比率で表した。
【００２９】
【表７】
【００３０】（実施例８及び比較例８）酵素としてStre
ptomyces griseus由来のキチナーゼ（Sigma Chemical社
製）５ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ６．０)３６
ｍｌに溶解し、酵素溶液とした。基質として２ｍｌ容量
のキュベットに２０ｍｇのキチンを秤量した。２０ｍｇ
のキチンを含む２ｍｌ容量のキュベットに２ｍｌの上記
酵素溶液を加えて混合し、３０℃、６０℃で、０．１MP
a（常圧：比較例８）と１５０MPa（実施例８）に加圧
下、ｐＨ６．０にてそれぞれ２４時間反応を行った。反
応終了後、沸騰水中で１０分間酵素を加熱失活させた。
反応上清液を適当に希釈し、ＴＯＣアナライザー（Tota
l Organic Carbon analyzer）で定量した。結果を表８
に示す。表８の各反応温度における数値はＴＯＣ（ＴＯ
Ｃｍｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比率（％）は０．１
MPaにおけるＴＯＣに対する１５０ＭＰａにおけるＴＯ
Ｃの比率で表した。
ptomyces griseus由来のキチナーゼ（Sigma Chemical社
製）５ｍｇを４０ｍＭのB-R buffer (ｐＨ６．０)３６
ｍｌに溶解し、酵素溶液とした。基質として２ｍｌ容量
のキュベットに２０ｍｇのキチンを秤量した。２０ｍｇ
のキチンを含む２ｍｌ容量のキュベットに２ｍｌの上記
酵素溶液を加えて混合し、３０℃、６０℃で、０．１MP
a（常圧：比較例８）と１５０MPa（実施例８）に加圧
下、ｐＨ６．０にてそれぞれ２４時間反応を行った。反
応終了後、沸騰水中で１０分間酵素を加熱失活させた。
反応上清液を適当に希釈し、ＴＯＣアナライザー（Tota
l Organic Carbon analyzer）で定量した。結果を表８
に示す。表８の各反応温度における数値はＴＯＣ（ＴＯ
Ｃｍｇ／ｍｌ反応液）を表し、加速比率（％）は０．１
MPaにおけるＴＯＣに対する１５０ＭＰａにおけるＴＯ
Ｃの比率で表した。
【００３１】
【表８】
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば、酵素反応を短時間に効
率的に行うことのできる酵素処理方法が提供される。本
発明方法においては、加圧によって酵素が活性化される
とともに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応
温度よりも高温での反応が可能となる。本発明方法によ
りセルロースの酵素分解を行うと、大量に発生するセル
ロース廃棄物を効果的に処理することができ、環境保全
と資源の有効活用の面で非常に有用である。
率的に行うことのできる酵素処理方法が提供される。本
発明方法においては、加圧によって酵素が活性化される
とともに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応
温度よりも高温での反応が可能となる。本発明方法によ
りセルロースの酵素分解を行うと、大量に発生するセル
ロース廃棄物を効果的に処理することができ、環境保全
と資源の有効活用の面で非常に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山辺 倫 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 大淵 薫 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AE01 AF02 AF22 CA21 CB01 CB05 CB07 CC03 CD19 CD20 DA10 DA16 4D004 AA02 AA12 CA18 CC07
Claims (14)
- 【請求項１】 基質に酵素を作用させ、酵素反応生成物
を得る酵素反応において、当該反応を加圧下に行うこと
を特徴とする、酵素処理方法。 - 【請求項２】 酵素反応を、０．２〜１，０００ＭＰａ
の加圧下に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 酵素反応を、常圧下での反応温度よりも
高温で行うことを特徴とする、請求項１又は２に記載の
方法。 - 【請求項４】 酵素が、セルラーゼ、グルコアミラー
ゼ、タンナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、及びキチ
ナーゼからなる群から選択される、請求項１〜３のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項５】 基質の形状を粉末状、シート状、又は粒
状とすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 セルロースにセルラーゼを作用させ、酵
素反応生成物としてグルコースを得る酵素反応におい
て、当該反応を加圧下に行うことを特徴とする、酵素処
理方法。 - 【請求項７】 セルラーゼが、Acremonium属の菌が生産
するセルラーゼ系であること特徴とする、請求項６に記
載の方法。 - 【請求項８】 Acremonium属の菌がAcremonium sp. Y-
94であることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ
系に、さらにエンドグルカナーゼ（CMCase）活性が加圧
状態で向上する酵素を混合した酵素組成物を使用するこ
とを特徴とする、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 CMCase活性が加圧状態で向上する酵素
が、Aspergillus属の菌が生産する酵素であることを特
徴とする、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 酵素組成物中のAcremonium属の菌が生
産する酵素とCMCase活性が加圧状態で向上する酵素との
混合比がCMCase活性当量として７：５０〜５０：７であ
ることを特徴とする、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 セルロースとセルラーゼを０．２〜
１，０００MPaに加圧することを特徴とする、請求項６
〜１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 粉末状、シート状又は粒状のセルロー
スを使用することを特徴とする、請求項６〜１２のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項１４】 セルロース１ｇに対して、CMCase活性
当量として０．０００５〜１０，０００国際単位（IU）
のセルラーゼを使用することを特徴とする、請求項６〜
１３のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP2000281876A JP4257403B2 (ja) | 2000-06-27 | 2000-09-18 | 酵素処理方法 |
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| US10/312,611 US20030106655A1 (en) | 2000-06-27 | 2001-03-29 | Process for treating with enzyme |
| EP01917610A EP1298216A4 (en) | 2000-06-27 | 2001-03-29 | PROCESS FOR TREATMENT USING AN ENZYME |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| JP2000-192105 | 2000-06-27 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| JP2006296255A (ja) * | 2005-04-19 | 2006-11-02 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 穀物酵素分解物及びその製造方法、並びに機能性物品 |
| JP2007099718A (ja) * | 2005-10-06 | 2007-04-19 | Hakutsuru Shuzo Kk | 酒粕酵素分解物及びその製造方法、並びに機能性物品 |
| WO2011013721A1 (ja) | 2009-07-28 | 2011-02-03 | 三井化学株式会社 | 乳酸製造方法 |
| JP2011103880A (ja) * | 2009-11-13 | 2011-06-02 | Amorepacific Corp | 高圧酵素分解技法を利用した植物抽出物の製造方法及びこの抽出物を含有する化粧料組成物 |
| WO2012157734A1 (ja) * | 2011-05-18 | 2012-11-22 | 株式会社ニチレイバイオサイエンス | 胎盤由来成分を含有するシワ改善用組成物 |
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| DE102009024757B4 (de) * | 2009-06-12 | 2012-01-19 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verfahren und Vorrichtungen zur Steuerung einer chemischen Reaktion mittels Druck unter Verwendung von hochdruck-optimierten Biokomponenten |
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| US4461648A (en) * | 1980-07-11 | 1984-07-24 | Patrick Foody | Method for increasing the accessibility of cellulose in lignocellulosic materials, particularly hardwoods agricultural residues and the like |
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| US4562150A (en) * | 1983-03-09 | 1985-12-31 | Agency Of Industrial Science And Technolgy | Method for manufacture of cellulase |
| JPS6043954B2 (ja) * | 1983-03-09 | 1985-10-01 | 工業技術院長 | セルラ−ゼの製造法 |
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-
2000
- 2000-09-18 JP JP2000281876A patent/JP4257403B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-29 WO PCT/JP2001/002645 patent/WO2002000912A1/ja active Application Filing
- 2001-03-29 EP EP01917610A patent/EP1298216A4/en not_active Withdrawn
- 2001-03-29 US US10/312,611 patent/US20030106655A1/en not_active Abandoned
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|---|---|---|---|---|
| JP2006296255A (ja) * | 2005-04-19 | 2006-11-02 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 穀物酵素分解物及びその製造方法、並びに機能性物品 |
| JP2007099718A (ja) * | 2005-10-06 | 2007-04-19 | Hakutsuru Shuzo Kk | 酒粕酵素分解物及びその製造方法、並びに機能性物品 |
| WO2011013721A1 (ja) | 2009-07-28 | 2011-02-03 | 三井化学株式会社 | 乳酸製造方法 |
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| JP2011103880A (ja) * | 2009-11-13 | 2011-06-02 | Amorepacific Corp | 高圧酵素分解技法を利用した植物抽出物の製造方法及びこの抽出物を含有する化粧料組成物 |
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