JP2001526901A - 異種融合タンパク質を有する組変えラブドウイルス - Google Patents
異種融合タンパク質を有する組変えラブドウイルスInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、パラミキソウイルスＳＶ５株のＦタンパク質のような融合タンパク質を発現する組換え体または遺伝的に工作されたラブドウイルスを含む構成物と関係する。本組換え体ラブドウイルスは、多の非ラブドウイルス接着タンパク質および／またはエンハンサータンパク質を発現してよい。本発明はまた、Ｆタンパク質を発現する組換え体ラブドウイルスの作成法と関係する。これらの組換え体構成物は、疾患の治療のための診断および治療の構成物としてだけでなく、研究の目的で使用されてよい。
Description
【０００１】
本発明は組変えラブドウイルスの標的細胞への侵入および融合を促進する融合
タンパク質を少なくとも発現する組変えラブドウイルスに関するものである。本
発明はそのウイルス粒子の表面に融合タンパク質を発現する水疱性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）を含む。融合タンパク質を発現するこれらの組変えラブドウイルス
は、設計されたラブドウイルスには本来発見されないタンパク質の機能および特
異性を研究するために、および診断および治療の目的において異常および病気の
細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞または癌細胞）を標的とする方法として
使用することが可能である。本発明はまた組変えラブドウイルスの産生方法も開
示する。 連邦政府による援助 本発明は部分的に以下の連邦政府助成金から、および政府が３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．
§４０１の下に権利を授与された結果として生じたものである：ＮＩＨ ＧＭ５
３７２６。
タンパク質を少なくとも発現する組変えラブドウイルスに関するものである。本
発明はそのウイルス粒子の表面に融合タンパク質を発現する水疱性口内炎ウイル
ス（ＶＳＶ）を含む。融合タンパク質を発現するこれらの組変えラブドウイルス
は、設計されたラブドウイルスには本来発見されないタンパク質の機能および特
異性を研究するために、および診断および治療の目的において異常および病気の
細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞または癌細胞）を標的とする方法として
使用することが可能である。本発明はまた組変えラブドウイルスの産生方法も開
示する。 連邦政府による援助 本発明は部分的に以下の連邦政府助成金から、および政府が３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．
§４０１の下に権利を授与された結果として生じたものである：ＮＩＨ ＧＭ５
３７２６。
【０００２】
Ａ．ウイルスの標的細胞への利用 ウイルスは主に遺伝子治療の目的において、この１０年で標的細胞に適するよ
うに設計されてきた。遺伝子治療は、遺伝子およびしばしば病気の細胞の運搬を
含み、通常は宿主細胞のゲノムへの遺伝子の挿入をも含む。アデノウイルス科、
パルヴォウイルス科およびレトロウイルス科に属するウイルスが、細胞ゲノムへ
の遺伝子の挿入のためのみならず、特異的細胞または組織への遺伝子の運搬のた
めにも成功的に設計されてきた。
うに設計されてきた。遺伝子治療は、遺伝子およびしばしば病気の細胞の運搬を
含み、通常は宿主細胞のゲノムへの遺伝子の挿入をも含む。アデノウイルス科、
パルヴォウイルス科およびレトロウイルス科に属するウイルスが、細胞ゲノムへ
の遺伝子の挿入のためのみならず、特異的細胞または組織への遺伝子の運搬のた
めにも成功的に設計されてきた。
【０００３】 ウイルスを特異的細胞に運搬するためには、ウイルスはその型の細胞に感染す
ることが可能でなければならない。ウイルスは一般的には全ての細胞または全て
の生物にさえ感染可能というわけではない。ウイルスの細胞への感染能力は、そ
のウイルスがその宿主生物およびその生物のその細胞に対して有している「向性
(tropism)」に基づいている。ウイルスが細胞に感染可能であるためには、その 細胞は、ウイルスが認識して細胞の受容体に結合し、その上でエンドサイトーシ
ス、ファゴサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスのいずれかによって細胞
に侵入することを可能とするような、ウイルスタンパク質に対する受容体を有し
なければならない。細胞への侵入の直後に、ウイルスは複製を開始する。ウイル
スが組織向性を有しない細胞に感染するためには、ウイルスが興味の対象である
細胞または組織の表面に存在する受容体を認識および結合するようにウイルスを
加工しなければならない。その場合でさえ、ウイルスが依然として複製不可能で
ある可能性があり、その細胞で産生されていない細胞性の因子を付加的に必要と
する可能性がある。
ることが可能でなければならない。ウイルスは一般的には全ての細胞または全て
の生物にさえ感染可能というわけではない。ウイルスの細胞への感染能力は、そ
のウイルスがその宿主生物およびその生物のその細胞に対して有している「向性
(tropism)」に基づいている。ウイルスが細胞に感染可能であるためには、その 細胞は、ウイルスが認識して細胞の受容体に結合し、その上でエンドサイトーシ
ス、ファゴサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスのいずれかによって細胞
に侵入することを可能とするような、ウイルスタンパク質に対する受容体を有し
なければならない。細胞への侵入の直後に、ウイルスは複製を開始する。ウイル
スが組織向性を有しない細胞に感染するためには、ウイルスが興味の対象である
細胞または組織の表面に存在する受容体を認識および結合するようにウイルスを
加工しなければならない。その場合でさえ、ウイルスが依然として複製不可能で
ある可能性があり、その細胞で産生されていない細胞性の因子を付加的に必要と
する可能性がある。
【０００４】 遺伝子治療用ウイルスベクターは一般的に、それらが標的とする細胞を殺した
り、または溶解したりはしない。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、
薬剤のように治療上効果的なＤＮＡを運搬するために加工されている（例えば、
Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌら、米国特許第５，５４７，９３２号を参照せよ）。これ
らのベクターの中には、標的とした細胞内でのみ感染直後に複製することが可能
であるものがある（Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃ， 米国特許第５，６７７，１７８号
）。その他の遺伝子治療用ベクターはそれらが複製できないように加工されてい
る。非複製遺伝子治療ベクターは通常は補助プラスミドを用いて（例えば、Ｇ．
Ｎａｔｓｏｕｌｉｓ，米国特許第５，６２２，８５６号；Ｍ．Ｍａｒｎｏｕｎａ
ｓ，米国特許第５，６４６，０３４号を参照せよ）、またはウイルスゲノム内に
は存在しない遺伝因子を与えるパッケージング細胞を用いて産生される。
り、または溶解したりはしない。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、
薬剤のように治療上効果的なＤＮＡを運搬するために加工されている（例えば、
Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌら、米国特許第５，５４７，９３２号を参照せよ）。これ
らのベクターの中には、標的とした細胞内でのみ感染直後に複製することが可能
であるものがある（Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃ， 米国特許第５，６７７，１７８号
）。その他の遺伝子治療用ベクターはそれらが複製できないように加工されてい
る。非複製遺伝子治療ベクターは通常は補助プラスミドを用いて（例えば、Ｇ．
Ｎａｔｓｏｕｌｉｓ，米国特許第５，６２２，８５６号；Ｍ．Ｍａｒｎｏｕｎａ
ｓ，米国特許第５，６４６，０３４号を参照せよ）、またはウイルスゲノム内に
は存在しない遺伝因子を与えるパッケージング細胞を用いて産生される。
【０００５】 遺伝子治療用ベクターは、利用しているウイルスベクターが本来有している野
生型の向性を克服するための問題に直面している。これを克服するために、組織
または細胞標的に感染することが可能であるような異なるウイルス科または属に
由来する、他のウイルスに由来する外被タンパク質をコードするＤＮＡを有する
ようにウイルスゲノムを加工することによって偽型ウイルスが産生された。近年
、アデノウイルスベクター（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎら、米国特許第５，６９３，５０
９号）；アデノ関連ウイルスベクター（Ｊ．Ｓ．Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特
許第５，５８９，３７７号）；レトロウイルスベクター（Ｂ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏ
ｎら、米国特許第５，６１６，４８７号）；キメラ融合糖タンパク質を有するベ
クター（Ｓ．Ｋａｙｍａｎら、米国特許第５，６４３，７５６号）；ウイルスコ
ートタンパク質に対する抗体を有するベクター（Ｃｏｔｔｅｎら）；通常はＨＩ
Ｖ−１に感染し得ない種であるサルにおける１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
−１）の研究を可能にするために、ハイブリッドウイルスを産生することによっ
て加工されたウイルス（Ｊ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉら、米国特許第５，６５４，１９
５号）；および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質を有する偽型レ
トロウイルスベクター（Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓら、米国特許第５，５１２，４２１
号および第５，６７０，３５４号）について記述した多くの遺伝子治療特許が刊
行されている。これらの遺伝子治療用ベクターの中には、遺伝子治療における使
用のためのベクターの効力を維持すると同時に、直面した向性に関連する問題に
対して幾つかの局面における克服を試みる方法を用いるものも存在する。
生型の向性を克服するための問題に直面している。これを克服するために、組織
または細胞標的に感染することが可能であるような異なるウイルス科または属に
由来する、他のウイルスに由来する外被タンパク質をコードするＤＮＡを有する
ようにウイルスゲノムを加工することによって偽型ウイルスが産生された。近年
、アデノウイルスベクター（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎら、米国特許第５，６９３，５０
９号）；アデノ関連ウイルスベクター（Ｊ．Ｓ．Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特
許第５，５８９，３７７号）；レトロウイルスベクター（Ｂ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏ
ｎら、米国特許第５，６１６，４８７号）；キメラ融合糖タンパク質を有するベ
クター（Ｓ．Ｋａｙｍａｎら、米国特許第５，６４３，７５６号）；ウイルスコ
ートタンパク質に対する抗体を有するベクター（Ｃｏｔｔｅｎら）；通常はＨＩ
Ｖ−１に感染し得ない種であるサルにおける１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
−１）の研究を可能にするために、ハイブリッドウイルスを産生することによっ
て加工されたウイルス（Ｊ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉら、米国特許第５，６５４，１９
５号）；および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質を有する偽型レ
トロウイルスベクター（Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓら、米国特許第５，５１２，４２１
号および第５，６７０，３５４号）について記述した多くの遺伝子治療特許が刊
行されている。これらの遺伝子治療用ベクターの中には、遺伝子治療における使
用のためのベクターの効力を維持すると同時に、直面した向性に関連する問題に
対して幾つかの局面における克服を試みる方法を用いるものも存在する。
【０００６】 一時的な遺伝子治療のために、細胞に運搬された遺伝子の発現が一時的であり
永遠ではないウイルス運搬体もまた作製されている（Ｉ．Ｈ．Ｍａｘｗｅｌｌら
、米国特許第５，５８５，２５４号）。ジフテリア毒素の遺伝子（米国特許５，
５８５，２５４号）などの、ある特定の毒素をコードする遺伝子を選択的に発現
するベクターが作製されている。ウイルスベクターは、それらが感染する宿主細
胞の免疫原性をより高めるように加工することもまた可能である（米国特許第５
，５８０，５６４号）。 Ｂ．ラブドウイルスの細胞標的への使用 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）および狂犬病ウイルス（ＲＶ）はいずれもラ
ブドウイルス科に属する構成因子である。ＶＳＶはべシクロウイルス属に属し、
ＲＶはリッサウイルス属に属する。ラブドウイルス科の全ての構成因子は、ラブ
ドウイルス粒子の表面を形成する脂質膜エンベロープを有している。 （１）狂犬病ウイルス Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎらによる最近の論文には、Ｇタンパク質の全体が欠失
した、またはＧタンパク質の僅かな部分のみが発現しているような狂犬病ウイル
ス（ＲＶ）の加工について記載されている。この組変えＲＶはさらに、ＣＤ４ま
たはＣＤ４およびＣＸＣＲ４補助受容体が組変えＲＶ粒子のエンベロープに発現
するように加工された（Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ９
０：９４１−９５１）。これらの加工されたＲＶ偽型ウイルスの性質決定および
これらを用いた実験により、Ｇタンパク質の尾部を有するＣＤ４／ＣＸＣＲ４構
築物はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質であるｇｐ１２０を発現する細胞に感
染することが可能であることが示された。このウイルス系の欠点は、非ＲＶタン
パク質（例えば、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４）の効果的な取り込みが、Ｇタンパク
質の少なくとも尾部（４４アミノ酸からなる細胞質ドメイン）がＣＤ４（ＲＶ−
ＣＤ４）またはＣＸＣＲ４（ＲＶ−ＣＸＣＲ４）のいずれかに融合したキメラの
形状でウイルス粒子上に発現したときにのみ起こる点である。ＲＶ−ＣＤ４およ
び欠失型Ｇタンパク質キメラｃＤＮＡのみを発現する組変えＲＶはウイルス粒子
上に検出可能な量のＣＤ４を有していない。しかし、ＲＶ−ＣＤ４およびＲＶ−
ＣＸＣＲ４の両方を発現する組変えＲＶは、ウイルスエンベロープにＣＤ４およ
びＣＸＣＲ４の両方のタンパク質を有するウイルス粒子を産生した（Ｔ．Ｍｅｂ
ａｔｓｉｏｎら、１９９７）。著者らの結論はＣＤ４由来のタンパク質は異種性
の「キャリアー」タンパク質とともに複合体を形成した状態でのみ取り込まれる
というものであった。ＲＶ構築物におけるそのキャリアータンパク質はＣＸＣＲ
４補助受容体である。 （２）水疱性口内炎ウイルス ＣＤ４もＶＳＶ粒子内で５種類全てのＶＳＶ遺伝子産物：Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｇおよ
びＬ、とともに発現されている（Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３５９−１１３６５）。Ｓｃｈ
ｎｅｌｌらによる、さらに最近の出版では、Ｇタンパク質をコードする遺伝子の
全体が欠失していても（ΔＧ）、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４などの補助受容体はウ
イルス粒子内での発現が可能であることを示した（Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９
７）Ｃｅｌｌ ９０：８４９−８５７）。このＣＤ４／ＣＸＣＲ４組変え体はＧ
タンパク質をコードするＤＮＡを含む相補的なプラスミドを利用することによっ
て産生された。ΔＧ組変えＶＳＶにおいて、ＣＸＣＲ４をコードする遺伝子はＣ
Ｄ４をコードする遺伝子の下流に配置した。ΔＧ−ＣＤ４ウイルスの量はＧタン
パク質を有するＣＤ４構築物について報告されている量の２５％であった（Ｓｃ
ｈｎｅｌｌら、１９９７）。しかし、ＣＤ４はＧタンパク質の非存在下にも関わ
らず、その他のＶＳＶタンパク質と同様の効率で組変えウイルス粒子に取り込ま
れた。ΔＧ−ＣＤ４構築物がＨＩＶ−１感染させたジャーカット細胞に感染する
能力と、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４の両方を含むＶＳＶΔＧ構築物（ΔＧ−ＣＤ４
／ＣＸＣＲ４）の能力とを比較すると、ΔＧ−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４ ＶＳＶ組変
え体の１０％の割合でΔＧ−ＣＤ４構築物が感染した。さらに、ΔＧ−ＣＤ４／
ＣＸＣＲ４はＨＩＶ−１陽性細胞の数を減少させることが可能であった。これら
の構築物はＨＩＶ−１に感染した細胞またはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質
を発現する細胞に侵入および増殖する能力を有することが示された（Ｓｃｈｎｅ
ｌｌら、１９９７）。
永遠ではないウイルス運搬体もまた作製されている（Ｉ．Ｈ．Ｍａｘｗｅｌｌら
、米国特許第５，５８５，２５４号）。ジフテリア毒素の遺伝子（米国特許５，
５８５，２５４号）などの、ある特定の毒素をコードする遺伝子を選択的に発現
するベクターが作製されている。ウイルスベクターは、それらが感染する宿主細
胞の免疫原性をより高めるように加工することもまた可能である（米国特許第５
，５８０，５６４号）。 Ｂ．ラブドウイルスの細胞標的への使用 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）および狂犬病ウイルス（ＲＶ）はいずれもラ
ブドウイルス科に属する構成因子である。ＶＳＶはべシクロウイルス属に属し、
ＲＶはリッサウイルス属に属する。ラブドウイルス科の全ての構成因子は、ラブ
ドウイルス粒子の表面を形成する脂質膜エンベロープを有している。 （１）狂犬病ウイルス Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎらによる最近の論文には、Ｇタンパク質の全体が欠失
した、またはＧタンパク質の僅かな部分のみが発現しているような狂犬病ウイル
ス（ＲＶ）の加工について記載されている。この組変えＲＶはさらに、ＣＤ４ま
たはＣＤ４およびＣＸＣＲ４補助受容体が組変えＲＶ粒子のエンベロープに発現
するように加工された（Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ９
０：９４１−９５１）。これらの加工されたＲＶ偽型ウイルスの性質決定および
これらを用いた実験により、Ｇタンパク質の尾部を有するＣＤ４／ＣＸＣＲ４構
築物はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質であるｇｐ１２０を発現する細胞に感
染することが可能であることが示された。このウイルス系の欠点は、非ＲＶタン
パク質（例えば、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４）の効果的な取り込みが、Ｇタンパク
質の少なくとも尾部（４４アミノ酸からなる細胞質ドメイン）がＣＤ４（ＲＶ−
ＣＤ４）またはＣＸＣＲ４（ＲＶ−ＣＸＣＲ４）のいずれかに融合したキメラの
形状でウイルス粒子上に発現したときにのみ起こる点である。ＲＶ−ＣＤ４およ
び欠失型Ｇタンパク質キメラｃＤＮＡのみを発現する組変えＲＶはウイルス粒子
上に検出可能な量のＣＤ４を有していない。しかし、ＲＶ−ＣＤ４およびＲＶ−
ＣＸＣＲ４の両方を発現する組変えＲＶは、ウイルスエンベロープにＣＤ４およ
びＣＸＣＲ４の両方のタンパク質を有するウイルス粒子を産生した（Ｔ．Ｍｅｂ
ａｔｓｉｏｎら、１９９７）。著者らの結論はＣＤ４由来のタンパク質は異種性
の「キャリアー」タンパク質とともに複合体を形成した状態でのみ取り込まれる
というものであった。ＲＶ構築物におけるそのキャリアータンパク質はＣＸＣＲ
４補助受容体である。 （２）水疱性口内炎ウイルス ＣＤ４もＶＳＶ粒子内で５種類全てのＶＳＶ遺伝子産物：Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｇおよ
びＬ、とともに発現されている（Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３５９−１１３６５）。Ｓｃｈ
ｎｅｌｌらによる、さらに最近の出版では、Ｇタンパク質をコードする遺伝子の
全体が欠失していても（ΔＧ）、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４などの補助受容体はウ
イルス粒子内での発現が可能であることを示した（Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９
７）Ｃｅｌｌ ９０：８４９−８５７）。このＣＤ４／ＣＸＣＲ４組変え体はＧ
タンパク質をコードするＤＮＡを含む相補的なプラスミドを利用することによっ
て産生された。ΔＧ組変えＶＳＶにおいて、ＣＸＣＲ４をコードする遺伝子はＣ
Ｄ４をコードする遺伝子の下流に配置した。ΔＧ−ＣＤ４ウイルスの量はＧタン
パク質を有するＣＤ４構築物について報告されている量の２５％であった（Ｓｃ
ｈｎｅｌｌら、１９９７）。しかし、ＣＤ４はＧタンパク質の非存在下にも関わ
らず、その他のＶＳＶタンパク質と同様の効率で組変えウイルス粒子に取り込ま
れた。ΔＧ−ＣＤ４構築物がＨＩＶ−１感染させたジャーカット細胞に感染する
能力と、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４の両方を含むＶＳＶΔＧ構築物（ΔＧ−ＣＤ４
／ＣＸＣＲ４）の能力とを比較すると、ΔＧ−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４ ＶＳＶ組変
え体の１０％の割合でΔＧ−ＣＤ４構築物が感染した。さらに、ΔＧ−ＣＤ４／
ＣＸＣＲ４はＨＩＶ−１陽性細胞の数を減少させることが可能であった。これら
の構築物はＨＩＶ−１に感染した細胞またはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質
を発現する細胞に侵入および増殖する能力を有することが示された（Ｓｃｈｎｅ
ｌｌら、１９９７）。
【０００７】 ＶＳＶおよびＲＶは同一のウイルス科、すなわちラブドウイルス科の構成因子
であるが、ＶＳＶはあらゆるＧタンパク質の非存在下においても感染性のウイル
ス粒子を産生することが可能である。これに対して、ＲＶ組変え体は、非ＲＶタ
ンパク質が、非ＶＳＶタンパク質に融合したＧタンパク質尾部を有するキメラと
して提示された場合のみ機能することが可能である（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、１
９９７）。ＶＳＶウイルス粒子の脂質エンベロープに、それ自身でおよびキメラ
としてではなく非ＶＳＶタンパク質を発現する能力があるがゆえに、ＣＤ４など
の非ＶＳＶタンパク質が細胞表面におけるものと同一の３次元立体構造を形成す
るであろうという大きな見込みがなされる。 （３）非ＶＳＶ補助受容体タンパク質を有する組変えＶＳＶ Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら（１９９７）およびＳｃｈｎｅｌｌら（１９９７）によ
り記載されている組変えラブドウイルスの使用における一つの欠点は、いずれの
場合においてもＨＩＶ−１感染細胞に効果的に感染するためにはＣＸＣＲ４（ヒ
トＴリンパ球に由来する）などの補助受容体を必要とする点である。Ｍｅｂａｔ
ｓｉｏｎら（１９９７）の組変えＲＶウイルスは付加的にＧタンパク質の尾部を
必要とする。 （４）ウイルスエンベロープ融合タンパク質 外被を有するウイルスの細胞への侵入は、ウイルス外被が、細胞膜またはエン
ドサイトーシスに続くエンドソームまたはリソソームなどの細胞内区画へ融合し
た結果として起こる。パラミキソウイルスのサルウイルス５（ＳＶ５）の融合（
Ｆ）タンパク質はウイルスエンベロープと細胞膜との融合を媒介する。これは組
変え細胞内においてクローン化および発現されている。ＶＳＶのＧタンパク質を
含むその他のウイルスエンベロープタンパク質は、インビトロでの融合活性のた
めに酸性のｐＨを必要とし、およびこれとは対照的に、パラミキソウイルスＳＶ
５ Ｆタンパク質は中性のｐＨにおいて細胞融合を起こすことが可能である。野
生型のウイルスはＦタンパク質およびそれに結合するパラミキソウイルスのＨＮ
タンパク質の連係した挙動を通してその標的細胞と融合する。Ｆタンパク質およ
びＨＮタンパク質の両者を発現するように形質転換された細胞は隣接する細胞と
融合し、シンシチウムを形成する。しかし、インビトロで作製されてＦタンパク
質を含む小胞は、ウイルスＨＮタンパク質が共に存在するかまたはレクチン（す
なわちコムギ胚芽アグルチニン）などのある抗レセプター分子が存在しない限り
、標的細胞と融合を起こさない。Ｒ．Ｇ．Ｐａｔｅｒｓｏｎら、（１９８５）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７５２０−７５２４。
であるが、ＶＳＶはあらゆるＧタンパク質の非存在下においても感染性のウイル
ス粒子を産生することが可能である。これに対して、ＲＶ組変え体は、非ＲＶタ
ンパク質が、非ＶＳＶタンパク質に融合したＧタンパク質尾部を有するキメラと
して提示された場合のみ機能することが可能である（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、１
９９７）。ＶＳＶウイルス粒子の脂質エンベロープに、それ自身でおよびキメラ
としてではなく非ＶＳＶタンパク質を発現する能力があるがゆえに、ＣＤ４など
の非ＶＳＶタンパク質が細胞表面におけるものと同一の３次元立体構造を形成す
るであろうという大きな見込みがなされる。 （３）非ＶＳＶ補助受容体タンパク質を有する組変えＶＳＶ Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら（１９９７）およびＳｃｈｎｅｌｌら（１９９７）によ
り記載されている組変えラブドウイルスの使用における一つの欠点は、いずれの
場合においてもＨＩＶ−１感染細胞に効果的に感染するためにはＣＸＣＲ４（ヒ
トＴリンパ球に由来する）などの補助受容体を必要とする点である。Ｍｅｂａｔ
ｓｉｏｎら（１９９７）の組変えＲＶウイルスは付加的にＧタンパク質の尾部を
必要とする。 （４）ウイルスエンベロープ融合タンパク質 外被を有するウイルスの細胞への侵入は、ウイルス外被が、細胞膜またはエン
ドサイトーシスに続くエンドソームまたはリソソームなどの細胞内区画へ融合し
た結果として起こる。パラミキソウイルスのサルウイルス５（ＳＶ５）の融合（
Ｆ）タンパク質はウイルスエンベロープと細胞膜との融合を媒介する。これは組
変え細胞内においてクローン化および発現されている。ＶＳＶのＧタンパク質を
含むその他のウイルスエンベロープタンパク質は、インビトロでの融合活性のた
めに酸性のｐＨを必要とし、およびこれとは対照的に、パラミキソウイルスＳＶ
５ Ｆタンパク質は中性のｐＨにおいて細胞融合を起こすことが可能である。野
生型のウイルスはＦタンパク質およびそれに結合するパラミキソウイルスのＨＮ
タンパク質の連係した挙動を通してその標的細胞と融合する。Ｆタンパク質およ
びＨＮタンパク質の両者を発現するように形質転換された細胞は隣接する細胞と
融合し、シンシチウムを形成する。しかし、インビトロで作製されてＦタンパク
質を含む小胞は、ウイルスＨＮタンパク質が共に存在するかまたはレクチン（す
なわちコムギ胚芽アグルチニン）などのある抗レセプター分子が存在しない限り
、標的細胞と融合を起こさない。Ｒ．Ｇ．Ｐａｔｅｒｓｏｎら、（１９８５）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７５２０−７５２４。
【０００８】
本発明は、組変えウイルスの脂質エンベロープの標的細胞の細胞膜への融合を
促進するために異種性の「Ｆタンパク質」（本明細書において定義されている）
を発現する組変えまたは遺伝学的に加工されたラブドウイルスに関するものであ
る。このような構築物は、特異的補助受容体を必要とするかまたは特異的な細胞
向性を示すような当業者に既知であるシステムの限界を克服する。
促進するために異種性の「Ｆタンパク質」（本明細書において定義されている）
を発現する組変えまたは遺伝学的に加工されたラブドウイルスに関するものであ
る。このような構築物は、特異的補助受容体を必要とするかまたは特異的な細胞
向性を示すような当業者に既知であるシステムの限界を克服する。
【０００９】
本発明は、組変えウイルスの標的細胞表面への融合を促進するために効果的で
ある異種性のＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を少なくとも含む組変え
ラブドウイルスに関連する。本発明の好ましい態様はパラミキソウイルス株ＳＶ
５の融合タンパク質またはそのポリペプチド断片を本明細書で定義するＦタンパ
ク質として使用する。好ましい組変えラブドウイルスは水疱性口内炎ウイルス（
ＶＳＶ）または狂犬病ウイルス（ＲＶ）であり得る。狂犬病ウイルスの例では、
融合タンパク質をコードするＤＮＡは好ましくはＲＶのＧタンパク質の一部、特
にその「尾」の部分をコードするｃＤＮＡに融合させる。
ある異種性のＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を少なくとも含む組変え
ラブドウイルスに関連する。本発明の好ましい態様はパラミキソウイルス株ＳＶ
５の融合タンパク質またはそのポリペプチド断片を本明細書で定義するＦタンパ
ク質として使用する。好ましい組変えラブドウイルスは水疱性口内炎ウイルス（
ＶＳＶ）または狂犬病ウイルス（ＲＶ）であり得る。狂犬病ウイルスの例では、
融合タンパク質をコードするＤＮＡは好ましくはＲＶのＧタンパク質の一部、特
にその「尾」の部分をコードするｃＤＮＡに融合させる。
【００１０】 本発明によって企図された組変えラブドウイルスはさらに第二の異種性の（す
なわち、もう一つの非ラブドウイルス、非ＲＶまたは非ＶＳＶ）タンパク質を発
現することが可能である。この異種タンパク質は組変えウイルスが標的細胞の細
胞膜上に存在する特定の受容体を標的とするための接着タンパク質または抗受容
体として使用することが可能である。このような異種接着タンパク質は、好まし
くは病気の過程の一部として罹患したまたは異常を呈した細胞上に発現している
糖タンパク質またはタンパク質を特異的に認識または結合する。好ましい接着タ
ンパク質は、組変えラブドウイルスが細胞膜上にＧＰ１２０タンパク質を発現す
るＨＩＶ感染細胞を標的とするために機能するＣＤ４タンパク質またはその誘導
体である。対応する接着タンパク質が本発明に従って加工されたラブドウイルス
によって発現され得る、罹患または異常細胞上に発現するその他の受容体タンパ
ク質は、寄生感染、ウイルス感染、細菌感染、腫瘍症、前腫瘍症、白斑症、ポリ
ープ、皮膚科学上の病気（カフェオレ斑）および良性腫瘍に関連する病気から生
じ得る。
なわち、もう一つの非ラブドウイルス、非ＲＶまたは非ＶＳＶ）タンパク質を発
現することが可能である。この異種タンパク質は組変えウイルスが標的細胞の細
胞膜上に存在する特定の受容体を標的とするための接着タンパク質または抗受容
体として使用することが可能である。このような異種接着タンパク質は、好まし
くは病気の過程の一部として罹患したまたは異常を呈した細胞上に発現している
糖タンパク質またはタンパク質を特異的に認識または結合する。好ましい接着タ
ンパク質は、組変えラブドウイルスが細胞膜上にＧＰ１２０タンパク質を発現す
るＨＩＶ感染細胞を標的とするために機能するＣＤ４タンパク質またはその誘導
体である。対応する接着タンパク質が本発明に従って加工されたラブドウイルス
によって発現され得る、罹患または異常細胞上に発現するその他の受容体タンパ
ク質は、寄生感染、ウイルス感染、細菌感染、腫瘍症、前腫瘍症、白斑症、ポリ
ープ、皮膚科学上の病気（カフェオレ斑）および良性腫瘍に関連する病気から生
じ得る。
【００１１】 本発明はさらにラブドウイルスの細胞膜への融合を促進するために効果的であ
るＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を発現する組変えラブドウイルスの
産生方法に関連する。本方法は、以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルスＮ，
Ｐ，ＬおよびＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを適切な細胞に導入する；（Ｂ
）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルを含む少なくとも３’および５
’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を含むポリシストロニ
ックなｃＤＮＡコピー、Ｎ，Ｐ，Ｍ，およびＬラブドウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子、およびＦタンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺
伝子の適切な細胞への導入；（Ｃ）組変えラブドウイルスの産生を許可する条件
下での細胞の培養；および（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離。
るＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を発現する組変えラブドウイルスの
産生方法に関連する。本方法は、以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルスＮ，
Ｐ，ＬおよびＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを適切な細胞に導入する；（Ｂ
）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルを含む少なくとも３’および５
’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を含むポリシストロニ
ックなｃＤＮＡコピー、Ｎ，Ｐ，Ｍ，およびＬラブドウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子、およびＦタンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺
伝子の適切な細胞への導入；（Ｃ）組変えラブドウイルスの産生を許可する条件
下での細胞の培養；および（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離。
【００１２】 上述の方法はさらにもう一種類の非ラブドウイルスタンパク質またはそのペプ
チド断片の発現のための手段を含む。この付加的な異種タンパク質は通常は接着
タンパク質として機能し、それゆえに加工されたラブドウイルスが標的とすべき
細胞の表面に発現している受容体を認識および結合する能力を有するべきである
。本発明の一つの好ましい態様は、加工されたウイルスの融合タンパク質として
パラミキソウイルスＳＶ５株のＦタンパク質を発現することである。
チド断片の発現のための手段を含む。この付加的な異種タンパク質は通常は接着
タンパク質として機能し、それゆえに加工されたラブドウイルスが標的とすべき
細胞の表面に発現している受容体を認識および結合する能力を有するべきである
。本発明の一つの好ましい態様は、加工されたウイルスの融合タンパク質として
パラミキソウイルスＳＶ５株のＦタンパク質を発現することである。
【００１３】 本発明のもう一つの局面はラブドウイルスの細胞膜への融合を促進するために
効果的なＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を発現する組変えラブドウイ
ルスを産生する方法に関連する。本方法は以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイ
ルスの複製にシス作用するシグナルを含む少なくとも３’および５’末端のラブ
ドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を含むポリシストロニックなｃＤＮ
Ａコピー、Ｎ，Ｐ，およびＬラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子、お
よびＦタンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子の適切な細胞
への導入；（Ｂ）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルおよび少なくと
もラブドウイルスＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を含むミニウイルス
による細胞の感染；（Ｃ）組変えラブドウイルスを産生するためにｃＤＮＡの発
現を許可する条件下での細胞の培養；および（Ｄ）上述の組変えラブドウイルス
の単離。
効果的なＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を発現する組変えラブドウイ
ルスを産生する方法に関連する。本方法は以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイ
ルスの複製にシス作用するシグナルを含む少なくとも３’および５’末端のラブ
ドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を含むポリシストロニックなｃＤＮ
Ａコピー、Ｎ，Ｐ，およびＬラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子、お
よびＦタンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子の適切な細胞
への導入；（Ｂ）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルおよび少なくと
もラブドウイルスＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を含むミニウイルス
による細胞の感染；（Ｃ）組変えラブドウイルスを産生するためにｃＤＮＡの発
現を許可する条件下での細胞の培養；および（Ｄ）上述の組変えラブドウイルス
の単離。
【００１４】 好ましい組変えラブドウイルスはＶＳＶおよびＲＶである。
【００１５】 融合タンパク質を発現する組変えラブドウイルスを用いたインビボまたはイン
ビトロでの罹患細胞の標的法は、組変えウイルスによる感染を許可する条件下で
の、標的である罹患または異常細胞と組変えラブドウイルスの接着の工程を含む
。本態様は、接着タンパク質または抗受容体として機能するためのもう一種類の
非ラブドウイルスタンパク質のウイルス表面における付加的な発現を必要とし得
る。組変えラブドウイルスによって標的とする上述の細胞は、標的細胞に感染直
後のレポータータンパク質または蛍光タンパク質の発現をさらに含み得る。標的
細胞は付加的に罹患または感染され得る。企図された一つの組変えラブドウイル
スは融合工程の媒介としてパラミキソウイルスＳＶ５のＦタンパク質を発現する
ものである。
ビトロでの罹患細胞の標的法は、組変えウイルスによる感染を許可する条件下で
の、標的である罹患または異常細胞と組変えラブドウイルスの接着の工程を含む
。本態様は、接着タンパク質または抗受容体として機能するためのもう一種類の
非ラブドウイルスタンパク質のウイルス表面における付加的な発現を必要とし得
る。組変えラブドウイルスによって標的とする上述の細胞は、標的細胞に感染直
後のレポータータンパク質または蛍光タンパク質の発現をさらに含み得る。標的
細胞は付加的に罹患または感染され得る。企図された一つの組変えラブドウイル
スは融合工程の媒介としてパラミキソウイルスＳＶ５のＦタンパク質を発現する
ものである。
【００１６】 上記の組変えラブドウイルスはさらに、融合タンパク質を発現する治療上効果
的な量の組変えラブドウイルスの患者への投与を含めた、ウイルス、寄生生物ま
たは細菌感染に罹患した患者の治療のために企図される。本組変えラブドウイル
スは理想的にはウイルス、細菌または寄生生物に感染した細胞を未感染のものか
ら認識および識別することが可能である。本組変えラブドウイルスは、感染の結
果生じた細胞上に発現しているタンパク質に結合する。感染細胞に結合する機能
を担う非ラブドウイルス（接着）タンパク質は組変えラブドウイルス遺伝子の制
御配列に操作的に連結される。融合タンパク質を発現している組変えラブドウイ
ルスによって発現される非ラブドウイルスタンパク質は罹患または異常細胞の表
面に発現しているタンパク質を認識および結合することが可能であるような上述
の方法は同様に病気を罹患した患者を治療するために企図される。治療用に企図
された罹患したまたは異常の細胞または組織は腫瘍性細胞、前腫瘍性細胞、良性
腫瘍、ポリープ、カフェオレ斑、白斑症、その他の皮膚のあざまたは損傷、また
は皮膚科学上の病気を含む。
的な量の組変えラブドウイルスの患者への投与を含めた、ウイルス、寄生生物ま
たは細菌感染に罹患した患者の治療のために企図される。本組変えラブドウイル
スは理想的にはウイルス、細菌または寄生生物に感染した細胞を未感染のものか
ら認識および識別することが可能である。本組変えラブドウイルスは、感染の結
果生じた細胞上に発現しているタンパク質に結合する。感染細胞に結合する機能
を担う非ラブドウイルス（接着）タンパク質は組変えラブドウイルス遺伝子の制
御配列に操作的に連結される。融合タンパク質を発現している組変えラブドウイ
ルスによって発現される非ラブドウイルスタンパク質は罹患または異常細胞の表
面に発現しているタンパク質を認識および結合することが可能であるような上述
の方法は同様に病気を罹患した患者を治療するために企図される。治療用に企図
された罹患したまたは異常の細胞または組織は腫瘍性細胞、前腫瘍性細胞、良性
腫瘍、ポリープ、カフェオレ斑、白斑症、その他の皮膚のあざまたは損傷、また
は皮膚科学上の病気を含む。
【００１７】 本発明はまた本明細書にて定義される融合タンパク質の同定法に関連する。本
方法は以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルス複製にシス作用性に働くシグナ
ルを含む３’および５’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域
を少なくとも含むポリシストロニックな第一のｃＤＮＡ、Ｎ，Ｐ，およびＬタン
パク質をコードするラブドウイルス遺伝子、Ｆタンパク質候補および非ラブドウ
イルスタンパク質をコードする遺伝子の適切な細胞に導入；（Ｂ）ラブドウイル
ス複製にシス作用性に働くシグナルおよびレポータータンパク質をコードする第
二のｃＤＮＡを含むミニウイルスの細胞への感染；（Ｃ）組変えラブドウイルス
を産生するために第一のおよびミニウイルスの複製を許可する条件下での細胞の
培養；（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離；（Ｅ）上述の組変えラブドウ
イルスによる感染を許可する条件下での、単離した組変えラブドウイルスの未感
染細胞への接触；および（Ｆ）レポータータンパク質が発現しているか否かの決
定。 発明の詳細な説明 Ａ 組み変えラブドウィルスの作製 （１） 融合タンパク質 本明細書中で使用されている「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質」とい
う用語は（１）特性として脂質エンベロープを有するウィルスに由来し、（２）
遺伝的に操作されたウィルスの中で異型のタンパク質として発現された場合にウ
ィルスのエンベロープの細胞膜への融合を促進する（そのような融合はウィルス
のエンベロープ上の附加タンパク質（または「抗受容体」）が細胞膜上の受容体
に結合することによって媒介される）、タンパク質（およびその融合促進性ポリ
ペプチド断片）を意味する。故に本発明のFタンパク質が天然のウィルス性附加 タンパク質以外のウィルスエンベロープ上の附加タンパク質の結合を促進する際
に非特異的に機能することが可能であると予想される。本明細書中で意図されて
いるＦタンパク質の一例は、より総称的な「Ｆタンパク質」または「融合タンパ
ク質」ではなく本明細書中で特に「Ｆタンパク質」と呼称されるパラミキソウィ
ルスのＳＶ５株の「Ｆタンパク質」として文献で知られている、ウィルスエンベ
ロープ融合タンパク質である。
方法は以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルス複製にシス作用性に働くシグナ
ルを含む３’および５’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域
を少なくとも含むポリシストロニックな第一のｃＤＮＡ、Ｎ，Ｐ，およびＬタン
パク質をコードするラブドウイルス遺伝子、Ｆタンパク質候補および非ラブドウ
イルスタンパク質をコードする遺伝子の適切な細胞に導入；（Ｂ）ラブドウイル
ス複製にシス作用性に働くシグナルおよびレポータータンパク質をコードする第
二のｃＤＮＡを含むミニウイルスの細胞への感染；（Ｃ）組変えラブドウイルス
を産生するために第一のおよびミニウイルスの複製を許可する条件下での細胞の
培養；（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離；（Ｅ）上述の組変えラブドウ
イルスによる感染を許可する条件下での、単離した組変えラブドウイルスの未感
染細胞への接触；および（Ｆ）レポータータンパク質が発現しているか否かの決
定。 発明の詳細な説明 Ａ 組み変えラブドウィルスの作製 （１） 融合タンパク質 本明細書中で使用されている「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質」とい
う用語は（１）特性として脂質エンベロープを有するウィルスに由来し、（２）
遺伝的に操作されたウィルスの中で異型のタンパク質として発現された場合にウ
ィルスのエンベロープの細胞膜への融合を促進する（そのような融合はウィルス
のエンベロープ上の附加タンパク質（または「抗受容体」）が細胞膜上の受容体
に結合することによって媒介される）、タンパク質（およびその融合促進性ポリ
ペプチド断片）を意味する。故に本発明のFタンパク質が天然のウィルス性附加 タンパク質以外のウィルスエンベロープ上の附加タンパク質の結合を促進する際
に非特異的に機能することが可能であると予想される。本明細書中で意図されて
いるＦタンパク質の一例は、より総称的な「Ｆタンパク質」または「融合タンパ
ク質」ではなく本明細書中で特に「Ｆタンパク質」と呼称されるパラミキソウィ
ルスのＳＶ５株の「Ｆタンパク質」として文献で知られている、ウィルスエンベ
ロープ融合タンパク質である。
【００１８】 「附加タンパク質」とも呼称される「抗受容体」はウィルス粒子を細胞膜上の
対応する「受容体」に附加する段階に必要である、ウィルスエンベロープ上のタ
ンパク質を意味する。例えば、パラミキソウィルスのＳＶ５Ｆタンパク質の天然
の抗受容体はウィルス性ＨＮタンパク質である。
対応する「受容体」に附加する段階に必要である、ウィルスエンベロープ上のタ
ンパク質を意味する。例えば、パラミキソウィルスのＳＶ５Ｆタンパク質の天然
の抗受容体はウィルス性ＨＮタンパク質である。
【００１９】 「ウィルスの附加」は、感染の過程でウィルス粒子の脂質エンベロープ上の抗
受容体が細胞表面の「受容体」を認識して結合する段階を意味する。当業者はウ
ィルスの附加はウィルスエンベロープ膜の標的細胞の原形質膜との融合の前に先
行する段階であると認識すると考えられる。融合はウィルス粒子が細胞に侵入す
るのに先行する段階である。 （２）使用するラブドウィルス 本発明中で使用を企図される「ラブドウィルス」はＶｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ属およびＬｙｓｓａｖｉｒｕｓ属由来のウィルスを含む。Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ属は水胞性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）ニュージャージー血清型（ＶＳＶ NS ）、ＶＳＶ−インディアナ血清型（ＶＳＶIND ）、ＶＳＶ−アラゴアス株、コ
カルウィルス、ジュロナウィルス、カラジャスウィルス、マラバウィルス、ピリ
ウィルス、カルカクイウィルス、ユボダノヴァックウィルス、イスファハンウイ
ルス、シャンディプラウィルス、ペリネットウィルスおよびポルトン−Ｓウィル
ス（Ｒ．Ｒ．Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＩＮ Ｂ．Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ’ＶＩ
ＯＲＯＧＹ 第３版 第１巻（１９９６））を含む。Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ属は
狂犬病ウィルス（ＲＶ）、ラゴスバトウィルス、モコラウィルス、ドゥーベンヘ
ージウィルス、オボディアンウィルスおよびコトンカンウィルス（ＩＤ．）を含
む。好ましい組み変えラブドウィルスはＶＳＶ（血清型および株は問わない）お
よびＲＶ（ＩＤ．）である。
受容体が細胞表面の「受容体」を認識して結合する段階を意味する。当業者はウ
ィルスの附加はウィルスエンベロープ膜の標的細胞の原形質膜との融合の前に先
行する段階であると認識すると考えられる。融合はウィルス粒子が細胞に侵入す
るのに先行する段階である。 （２）使用するラブドウィルス 本発明中で使用を企図される「ラブドウィルス」はＶｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ属およびＬｙｓｓａｖｉｒｕｓ属由来のウィルスを含む。Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ属は水胞性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）ニュージャージー血清型（ＶＳＶ NS ）、ＶＳＶ−インディアナ血清型（ＶＳＶIND ）、ＶＳＶ−アラゴアス株、コ
カルウィルス、ジュロナウィルス、カラジャスウィルス、マラバウィルス、ピリ
ウィルス、カルカクイウィルス、ユボダノヴァックウィルス、イスファハンウイ
ルス、シャンディプラウィルス、ペリネットウィルスおよびポルトン−Ｓウィル
ス（Ｒ．Ｒ．Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＩＮ Ｂ．Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ’ＶＩ
ＯＲＯＧＹ 第３版 第１巻（１９９６））を含む。Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ属は
狂犬病ウィルス（ＲＶ）、ラゴスバトウィルス、モコラウィルス、ドゥーベンヘ
ージウィルス、オボディアンウィルスおよびコトンカンウィルス（ＩＤ．）を含
む。好ましい組み変えラブドウィルスはＶＳＶ（血清型および株は問わない）お
よびＲＶ（ＩＤ．）である。
【００２０】 すべてのラブドウィルスはヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、リン酸化タン
パク質（Ｐ、しかし当初はＮＳと表記されていた）、基質（Ｍ）タンパク質、糖
タンパク質（Ｇ）および巨大（Ｌ）タンパク質をコードする５遺伝子を含む。こ
れらの遺伝子はアンチセンスのゲノムＲＮＡ上に並んで存在し、３’−Ｎ−Ｐ−
Ｍ−Ｇ−（Ｘ）−Ｌ−５’のように配列している。遺伝子の順序は合成されるタ
ンパク質の比率を意味しているため重要である。ラブドウィルスのゲノムのいか
なる操作でも、感染および複製に十分な可能性を保持するためには少なくとも５
つの転写ドメインは保持されなければならない。ラブドウィルスはプラス鎖メッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を転写するＲＮＡポリメラーゼを内在する。Ｘ遺
伝子は全ラブドウィルスには存在しない。Ｘ遺伝子は魚類感染性造血壊死ウィル
ス、ウシ一過熱ウィルスの非構造糖タンパク質および狂犬病ウィルスの偽遺伝子
に見られる非構造タンパク質をコードする。エキストラ（Ｘ）遺伝子はラブドウ
ィルスゲノムの異なった位置で発見されている。感染細胞におけるＭタンパク質
の合成は細胞には細胞変性的であり、最終的には細胞死を引き起こす。
パク質（Ｐ、しかし当初はＮＳと表記されていた）、基質（Ｍ）タンパク質、糖
タンパク質（Ｇ）および巨大（Ｌ）タンパク質をコードする５遺伝子を含む。こ
れらの遺伝子はアンチセンスのゲノムＲＮＡ上に並んで存在し、３’−Ｎ−Ｐ−
Ｍ−Ｇ−（Ｘ）−Ｌ−５’のように配列している。遺伝子の順序は合成されるタ
ンパク質の比率を意味しているため重要である。ラブドウィルスのゲノムのいか
なる操作でも、感染および複製に十分な可能性を保持するためには少なくとも５
つの転写ドメインは保持されなければならない。ラブドウィルスはプラス鎖メッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を転写するＲＮＡポリメラーゼを内在する。Ｘ遺
伝子は全ラブドウィルスには存在しない。Ｘ遺伝子は魚類感染性造血壊死ウィル
ス、ウシ一過熱ウィルスの非構造糖タンパク質および狂犬病ウィルスの偽遺伝子
に見られる非構造タンパク質をコードする。エキストラ（Ｘ）遺伝子はラブドウ
ィルスゲノムの異なった位置で発見されている。感染細胞におけるＭタンパク質
の合成は細胞には細胞変性的であり、最終的には細胞死を引き起こす。
【００２１】 「組み変えラブドウィルス」は本来ラブドウィルス由来ではないタンパク質を
発現するウィルスを意味する。これは「偽型」または「キメラ」ウィルスを造る
。「ミニウィルス」は、Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ、Ｍ−Ｇ
、Ｇのみ、Ｍのみまたは４つ以下のＶＳＶ遺伝子のいかなる組み合わせをもコー
ドするポリシストロン核酸分子を含む不完全なウィルス粒子を意味する。この不
完全なウィルス粒子は複製能を持たない。
発現するウィルスを意味する。これは「偽型」または「キメラ」ウィルスを造る
。「ミニウィルス」は、Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ、Ｍ−Ｇ
、Ｇのみ、Ｍのみまたは４つ以下のＶＳＶ遺伝子のいかなる組み合わせをもコー
ドするポリシストロン核酸分子を含む不完全なウィルス粒子を意味する。この不
完全なウィルス粒子は複製能を持たない。
【００２２】 「組み変えラブドウィルス」または「組み変えＶＳＶ」または「組み変えＲＶ
」は、少なくとも融合タンパク質またはそのポリペプチド断片を含む単数または
複数のｃＤＮＡのトランスフェクションにより産生されるＶＳＶとＲＶを含む全
ての組み変えラブドウィルスを意味する。単数または複数のｃＤＮＡのトランス
フェクションにより産生される組み変えラブドウィルスはトランスで感染性ウィ
ルス粒子を作製するミニウィルスまたは他のｃＤＮＡによりトランスに相補可能
である。また、タンパク質は機能的なウィルス粒子産生に必要なタンパク質を安
定して発現するヘルパー細胞の使用により供給可能である。
」は、少なくとも融合タンパク質またはそのポリペプチド断片を含む単数または
複数のｃＤＮＡのトランスフェクションにより産生されるＶＳＶとＲＶを含む全
ての組み変えラブドウィルスを意味する。単数または複数のｃＤＮＡのトランス
フェクションにより産生される組み変えラブドウィルスはトランスで感染性ウィ
ルス粒子を作製するミニウィルスまたは他のｃＤＮＡによりトランスに相補可能
である。また、タンパク質は機能的なウィルス粒子産生に必要なタンパク質を安
定して発現するヘルパー細胞の使用により供給可能である。
【００２３】 「ポリペプチド断片」はウィルス粒子の融合を促進および／または増進する、
細胞の標的化を促進および／または増進する、ウィルスの力価および／または感
染力などを促進および／または増進するような生物活性を有するタンパク質、抗
体、抗受容体、受容体、ラブドウィルスタンパク質、ＶＳＶタンパク質などの断
片を意味する。
細胞の標的化を促進および／または増進する、ウィルスの力価および／または感
染力などを促進および／または増進するような生物活性を有するタンパク質、抗
体、抗受容体、受容体、ラブドウィルスタンパク質、ＶＳＶタンパク質などの断
片を意味する。
【００２４】 さらに「非ラブドウィルスタンパク質」または「非ＶＳＶタンパク質」または
「非ＲＶタンパク質」は融合タンパク質を発現するよう操作されている野生型の
ラブドウィルス（またはＶＳＶまたはＲＶ）では本来発現されないタンパク質や
そのタンパク質のポリペプチド断片を意味する。
「非ＲＶタンパク質」は融合タンパク質を発現するよう操作されている野生型の
ラブドウィルス（またはＶＳＶまたはＲＶ）では本来発現されないタンパク質や
そのタンパク質のポリペプチド断片を意味する。
【００２５】 「感染性組み変え体」は、記載されているいずれかの方法により産生される、
細胞感染後に他の標的細胞に感染可能な新ウィルス粒子を複製することが可能で
ある組み変えラブドウィルスを意味する。「非感染性組み変え体」は、記載され
ているいずれかの方法により産生される、細胞感染後に新たなウィルス粒子を放
出または産生不可能な組み変えラブドウィルスを意味する。例えば、ある「非感
染性組み変え」ラブドウィルスはＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする遺伝子
を含むがＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を欠いている。
細胞感染後に他の標的細胞に感染可能な新ウィルス粒子を複製することが可能で
ある組み変えラブドウィルスを意味する。「非感染性組み変え体」は、記載され
ているいずれかの方法により産生される、細胞感染後に新たなウィルス粒子を放
出または産生不可能な組み変えラブドウィルスを意味する。例えば、ある「非感
染性組み変え」ラブドウィルスはＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする遺伝子
を含むがＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を欠いている。
【００２６】 記載されている組み変えラブドウィルスおよびＶＳＶ構築物はさらにウィルス
粒子のエンベロープ上で発現されている「エンハンサータンパク質」または「Ｇ
ステムポリペプチド」を含む。（「Ｇステム」、「Ｇステムポリペプチド」また
は「エンハンサータンパク質」は細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインおよび
ラブドウィルスＧタンパク質の膜隣接外部ドメインのカルボキシ末端のおよそ２
３アミノ酸から７０アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。）企図されている
その他のＧステムポリペプチドは他のラブドウィルスＧタンパク質由来の類似Ｇ
ステムポリペプチドだけでなく、全ＶＳＶ血清型およびその血清型の全株の全Ｇ
タンパク質由来の類似領域を含む。これらのＧステムポリペプチドは組み変えウ
ィルスの力価および感染力の増進に利用される。Ｇステムの機能性はエンベロー
プ感染力を査定することにより評価可能である。エンベロープ感染力はＦタンパ
ク質と抗受容体を発現するラブドウィルスの構築物とＦタンパク質とＧステムを
発現するラブドウィルスの構築物間で比較される。Ｇステムの付加はラブドウィ
ルスの構築物の感染力を１００から１０8 倍増進可能である。
粒子のエンベロープ上で発現されている「エンハンサータンパク質」または「Ｇ
ステムポリペプチド」を含む。（「Ｇステム」、「Ｇステムポリペプチド」また
は「エンハンサータンパク質」は細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインおよび
ラブドウィルスＧタンパク質の膜隣接外部ドメインのカルボキシ末端のおよそ２
３アミノ酸から７０アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。）企図されている
その他のＧステムポリペプチドは他のラブドウィルスＧタンパク質由来の類似Ｇ
ステムポリペプチドだけでなく、全ＶＳＶ血清型およびその血清型の全株の全Ｇ
タンパク質由来の類似領域を含む。これらのＧステムポリペプチドは組み変えウ
ィルスの力価および感染力の増進に利用される。Ｇステムの機能性はエンベロー
プ感染力を査定することにより評価可能である。エンベロープ感染力はＦタンパ
ク質と抗受容体を発現するラブドウィルスの構築物とＦタンパク質とＧステムを
発現するラブドウィルスの構築物間で比較される。Ｇステムの付加はラブドウィ
ルスの構築物の感染力を１００から１０8 倍増進可能である。
【００２７】 これらのＧステムポリペプチドは次の組み合わせでＦタンパク質および抗受容
体タンパク質と共に発現されうる。（１）各々単独に発現したＧステムポリペプ
チド、Ｆタンパク質および抗受容体タンパク質またはそのポリペプチド断片、（
２）単独に発現したＧステムポリペプチドおよび抗受容体タンパク質の読み取り
枠の共通コードＤＮＡから発現したＦタンパク質、または（３）単独に発現した
Ｆタンパク質および抗受容体タンパク質の読み取り枠の共通コードＤＮＡから発
現したＧステムポリペプチド。
体タンパク質と共に発現されうる。（１）各々単独に発現したＧステムポリペプ
チド、Ｆタンパク質および抗受容体タンパク質またはそのポリペプチド断片、（
２）単独に発現したＧステムポリペプチドおよび抗受容体タンパク質の読み取り
枠の共通コードＤＮＡから発現したＦタンパク質、または（３）単独に発現した
Ｆタンパク質および抗受容体タンパク質の読み取り枠の共通コードＤＮＡから発
現したＧステムポリペプチド。
【００２８】 ＶＳＶ Ｇステムポリペプチドの一例はＶＳＶ−Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ Ｇステムである（ＧｅｎＢａｎｋ 寄託番号６１３８４）。ＶＳＶIND 336Ｎから
始まるＧステムポリペプチドは本明細書中に企図されている。より好ましいＧス
テムポリペプチドはＶＳＶIND 392Ｔ残基の後に始まる。最も好ましいＧステムポ
リペプチドは 404Ｇｌｙから 511Ａｒｇ（404ｇｈｇｍｌｄｓ ｇｌｈｌｓｓｋ ａｑｖ ｆｅｈｐｈｉｑｄａａ ｓｑｌｐｄｄｅｉｌｆ ｆｇｄｔｇｌｓｋｎｐ
ｉｄｆｖｅｇｗｆｓｓ ｗｋｓｓｉａｓｆｆｆ ｉｉｇｌｉｉｇｌｆｌ ｖｌｒｖｇｉｙｌｙｉ ｋｌｋｈｔｋｋｒｑｉ ｙｔｄｉｅｍｎｒｌｇ ｒ511 ）を含みうる。別の好ましいＶＳＶIND Ｇステムは434Ｐｒｏから 511Ａｒｇ（4 34 ｐｄｄｅｉｌｆ ｆｇｄｔｇｌｓｋｎｐ ｉｄｆｖｅｇｗｆｓｓ ｗｋｓｓｉ
ａｓｆｆｆ ｉｉｇｌｉｉｇｌｆｌ ｖｌｒｖｇｉｙｌｙｉ ｋｌｋｈｔｋｋｒ
ｑｉ ｙｔｄｉｅｍｎｒｌｇ ｒ511）を含むポリペプチドを含む。他に企図さ れているＶＳＶIND ＧステムはＧタンパク質の 404Ｇｌｙの後に始まるＧステム
を含む。 440Ｐｈｅから下流で始まるＶＳＶIND Ｇステムは高凝集表現型（high
assembly phenotype)を有するが、 440Ｐｈｅより上流から始まるＧステム構築
物より感染の特異性が低いためあまり好ましくない。故に企図されているＶＳＶ IND Ｇステムは下に記載するように、、全細胞質尾部ドメイン（ＶＳＶ−Ｉｎｄ
ｉａｎａ Ｇタンパク質の二重下線部）および全膜貫通ドメイン（大文字の肉太
活字で表記）だけでなく、膜隣接外部ドメインのカルボキシ末端部（例えば、外
部ドメインのカルボキシ末端の少なくとも２３から１２７アミノ酸）も含む。
始まるＧステムポリペプチドは本明細書中に企図されている。より好ましいＧス
テムポリペプチドはＶＳＶIND 392Ｔ残基の後に始まる。最も好ましいＧステムポ
リペプチドは 404Ｇｌｙから 511Ａｒｇ（404ｇｈｇｍｌｄｓ ｇｌｈｌｓｓｋ ａｑｖ ｆｅｈｐｈｉｑｄａａ ｓｑｌｐｄｄｅｉｌｆ ｆｇｄｔｇｌｓｋｎｐ
ｉｄｆｖｅｇｗｆｓｓ ｗｋｓｓｉａｓｆｆｆ ｉｉｇｌｉｉｇｌｆｌ ｖｌｒｖｇｉｙｌｙｉ ｋｌｋｈｔｋｋｒｑｉ ｙｔｄｉｅｍｎｒｌｇ ｒ511 ）を含みうる。別の好ましいＶＳＶIND Ｇステムは434Ｐｒｏから 511Ａｒｇ（4 34 ｐｄｄｅｉｌｆ ｆｇｄｔｇｌｓｋｎｐ ｉｄｆｖｅｇｗｆｓｓ ｗｋｓｓｉ
ａｓｆｆｆ ｉｉｇｌｉｉｇｌｆｌ ｖｌｒｖｇｉｙｌｙｉ ｋｌｋｈｔｋｋｒ
ｑｉ ｙｔｄｉｅｍｎｒｌｇ ｒ511）を含むポリペプチドを含む。他に企図さ れているＶＳＶIND ＧステムはＧタンパク質の 404Ｇｌｙの後に始まるＧステム
を含む。 440Ｐｈｅから下流で始まるＶＳＶIND Ｇステムは高凝集表現型（high
assembly phenotype)を有するが、 440Ｐｈｅより上流から始まるＧステム構築
物より感染の特異性が低いためあまり好ましくない。故に企図されているＶＳＶ IND Ｇステムは下に記載するように、、全細胞質尾部ドメイン（ＶＳＶ−Ｉｎｄ
ｉａｎａ Ｇタンパク質の二重下線部）および全膜貫通ドメイン（大文字の肉太
活字で表記）だけでなく、膜隣接外部ドメインのカルボキシ末端部（例えば、外
部ドメインのカルボキシ末端の少なくとも２３から１２７アミノ酸）も含む。
【００２９】
【化１】
【００３０】 上記記載ドメインを含む他のラブドウィルスだけでなく他の血清型またはＶＳ
Ｖ株由来の他の類似Ｇステムポリペプチドは当業者に容易に明白だと考えられる
。 （３）ｃＤＮＡを用いた組み変えラブドウィルスの作製 （ｉ）組み変えラブドウィルス作製に必要なＤＮＡ 感染性ラブドウィルスまたは非感染性ラブドウィルスを産生するために「必要
なｃＤＮＡ」という語句は融合タンパク質を発現する感染性または非感染性のい
ずれかの組み変えラブドウィルス粒子の産生に必要な核酸分子を意味する。これ
らの組換えウィルスは（１）完全にｃＤＮＡを使用すること、または（２）ヘル
パー細胞にトランスフェクションしたｃＤＮＡとの組み合わせ、または（３）細
胞にトランスフェクションしたｃＤＮＡにより産生することが可能であり、さら
に感染性または非感染性いずれかの組み変えラブドウィルス粒子の産生に必要な
残存している構成要素または活性をトランスで供給するミニウィルスに感染され
る。これらの方法を使用する際に（例えば、ミニウィルス、ヘルパー細胞系また
はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）、必要な最小構成要素は（１）ラブドウ
ィルスＮタンパク質によるゲノム（またはアンチゲノム）ＲＮＡのカプシド中で
の包含、および（２）相当するゲノムまたはアンチゲノム（複製の中間生成物）
ＲＮＡの複製のためのシス作用シグナルを含むＲＮＡ分子である。
Ｖ株由来の他の類似Ｇステムポリペプチドは当業者に容易に明白だと考えられる
。 （３）ｃＤＮＡを用いた組み変えラブドウィルスの作製 （ｉ）組み変えラブドウィルス作製に必要なＤＮＡ 感染性ラブドウィルスまたは非感染性ラブドウィルスを産生するために「必要
なｃＤＮＡ」という語句は融合タンパク質を発現する感染性または非感染性のい
ずれかの組み変えラブドウィルス粒子の産生に必要な核酸分子を意味する。これ
らの組換えウィルスは（１）完全にｃＤＮＡを使用すること、または（２）ヘル
パー細胞にトランスフェクションしたｃＤＮＡとの組み合わせ、または（３）細
胞にトランスフェクションしたｃＤＮＡにより産生することが可能であり、さら
に感染性または非感染性いずれかの組み変えラブドウィルス粒子の産生に必要な
残存している構成要素または活性をトランスで供給するミニウィルスに感染され
る。これらの方法を使用する際に（例えば、ミニウィルス、ヘルパー細胞系また
はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）、必要な最小構成要素は（１）ラブドウ
ィルスＮタンパク質によるゲノム（またはアンチゲノム）ＲＮＡのカプシド中で
の包含、および（２）相当するゲノムまたはアンチゲノム（複製の中間生成物）
ＲＮＡの複製のためのシス作用シグナルを含むＲＮＡ分子である。
【００３１】 複製要素またはレプリコンとは、５’端および３’端にラブドウィルスのリー
ダー配列およびトレーラー配列を最小に含んでいるＲＮＡストランドを意味する
。ゲノム配列では、リーダーは３’端におよびトレーラーは５’端にある。これ
ら二つの複製シグナル間にあるＲＮＡは同様に複製される。リーダーおよびトレ
ーラー領域にはさらにＮタンパク質によるカプシドでの包含の目的および転写お
よび複製を開始するために必要なポリメラーゼの結合のための最小シス作用因子
を含まなければならない。
ダー配列およびトレーラー配列を最小に含んでいるＲＮＡストランドを意味する
。ゲノム配列では、リーダーは３’端におよびトレーラーは５’端にある。これ
ら二つの複製シグナル間にあるＲＮＡは同様に複製される。リーダーおよびトレ
ーラー領域にはさらにＮタンパク質によるカプシドでの包含の目的および転写お
よび複製を開始するために必要なポリメラーゼの結合のための最小シス作用因子
を含まなければならない。
【００３２】 ミニウィルスを使用して加工されたラブドウィルスまたはＶＳＶｓの調製のた
めには、Ｇ遺伝子を含むミニウィルスはまたＧタンパク質ｍＲＮＡを産生するた
めの適切な開始および終始シグナルを伴ったリーダー領域、トレーラー領域およ
びＧ遺伝子も含むと考えられる。もしミニウィルスがさらにＭ遺伝子を含むなら
ば、Ｍタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始および終始シグナルもま
た存在しなければならない。
めには、Ｇ遺伝子を含むミニウィルスはまたＧタンパク質ｍＲＮＡを産生するた
めの適切な開始および終始シグナルを伴ったリーダー領域、トレーラー領域およ
びＧ遺伝子も含むと考えられる。もしミニウィルスがさらにＭ遺伝子を含むなら
ば、Ｍタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始および終始シグナルもま
た存在しなければならない。
【００３３】 加工されたラブドウィルスゲノム内に含まれる全遺伝子にとって、遺伝子はそ
れらの遺伝子を発現およびタンパク産物の産生を許す適切な開始および終始シグ
ナルを側に置く。
れらの遺伝子を発現およびタンパク産物の産生を許す適切な開始および終始シグ
ナルを側に置く。
【００３４】 「非感染性」加工ラブドウィルスを産生するために、加工されたラブドウィル
スは最小レプリコン要素およびＮ、ＰおよびＬタンパク質を持たなければならな
い、およびＭ遺伝子を含まなければならない（一例は下記の例に記載されている
ΔＧ構築物である）。これは細胞から発芽するが、非感染性粒子であるウィルス
粒子を産生する。「感染性」粒子を産生するためには、ウィルス粒子は附加タン
パク質または抗受容体の使用を通じて、ウィルス粒子の結合および融合を媒介可
能であるタンパク質を付加的に含まなければならない。ラブドウィルス本来の抗
受容体はＧタンパク質である。
スは最小レプリコン要素およびＮ、ＰおよびＬタンパク質を持たなければならな
い、およびＭ遺伝子を含まなければならない（一例は下記の例に記載されている
ΔＧ構築物である）。これは細胞から発芽するが、非感染性粒子であるウィルス
粒子を産生する。「感染性」粒子を産生するためには、ウィルス粒子は附加タン
パク質または抗受容体の使用を通じて、ウィルス粒子の結合および融合を媒介可
能であるタンパク質を付加的に含まなければならない。ラブドウィルス本来の抗
受容体はＧタンパク質である。
【００３５】 「適当な細胞」は下記に明白にされる三方法のいずれかで組換えラブドウィル
スの集合を許すいかなる細胞を意味する。
スの集合を許すいかなる細胞を意味する。
【００３６】 感染性ウィルス粒子を調製するために、適切な細胞系（例えばＢＨＫ細胞）は
最初に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３またはＳＰ６ポリメラーゼ（Ｕｓｄ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２２
−２２４またはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．６４：４８５１−４８５７参照）のような他の適当なバクテリオファージポリ
メラーゼをコードする、種痘ウィルスｖＴＦ７−３（Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３：８１２２−２６）または、その相当物によって感染される。次に細胞はＧ、
Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭラブドウィルスタンパク質をコードする遺伝子を含む個々の
ｃＤＮＡに感染される。これらのｃＤＮＡは組み変えラブドウィルス粒子を構築
するタンパク質を供給すると考えられる。細胞は当該技術分野において知られた
いずれの方法でもトランスフェクションされうる（例えば、リポソームおよび電
気穿孔法など）。細胞系はまたパラミキソウィルスＳＶ５株のＦタンパク質のよ
うな融合タンパク質をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされる。融合
タンパク質をコードする遺伝子はそれ自身で細胞にトランスフェクションまたは
Ｇタンパク質尾部の一部をコードするＤＮＡに融合されうる。Ｍｅｂａｔｓｉｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）より記載されているＦタンパク質のＧタンパク
質尾部への融合は感染性または非感染性組み変えＲＶビリオンを調製する際に必
要と考えられる。
最初に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３またはＳＰ６ポリメラーゼ（Ｕｓｄ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２２
−２２４またはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．６４：４８５１−４８５７参照）のような他の適当なバクテリオファージポリ
メラーゼをコードする、種痘ウィルスｖＴＦ７−３（Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３：８１２２−２６）または、その相当物によって感染される。次に細胞はＧ、
Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭラブドウィルスタンパク質をコードする遺伝子を含む個々の
ｃＤＮＡに感染される。これらのｃＤＮＡは組み変えラブドウィルス粒子を構築
するタンパク質を供給すると考えられる。細胞は当該技術分野において知られた
いずれの方法でもトランスフェクションされうる（例えば、リポソームおよび電
気穿孔法など）。細胞系はまたパラミキソウィルスＳＶ５株のＦタンパク質のよ
うな融合タンパク質をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされる。融合
タンパク質をコードする遺伝子はそれ自身で細胞にトランスフェクションまたは
Ｇタンパク質尾部の一部をコードするＤＮＡに融合されうる。Ｍｅｂａｔｓｉｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）より記載されているＦタンパク質のＧタンパク
質尾部への融合は感染性または非感染性組み変えＲＶビリオンを調製する際に必
要と考えられる。
【００３７】 さらにまた、ラブドウィルスゲノムＲＮＡに等価なものを含む「ポリシストロ
ンｃＤＮＡ」も細胞系にトランスフェクションされる。もし感染性の組み変えラ
ブドウィルス粒子が感染細胞の中で細胞を溶解するべきであるならば、融合タン
パク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子だけでなくＮ、Ｐ、Ｍお
よびＬタンパク質をコードする遺伝子が存在しなければならない。もし感染性、
組み変えラブドウィルス粒子が細胞溶解性であることを予定しないならば、Ｍタ
ンパク質をコードする遺伝子はポリシストロンＤＮＡには含まれない。「ポリシ
ストロンｃＤＮＡ」は、少なくともＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする遺伝
子を含む転写単位を含むｃＤＮＡを意味する。組み変えラブドウィルスのポリシ
ストロンＤＮＡはまた融合タンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする
遺伝子を含んでもよい。あるいは、融合タンパク質またはその断片はトランスで
供給されてもよい。他の企図される態様はレポータータンパク質または蛍光タン
パク質（例えば、緑蛍光タンパク質およびその派生物、βーガラクトシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル基
転移酵素など）をコードする遺伝子、Ｎ−Ｐ−ＬまたはＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子、
および融合タンパク質を含むポリシストロンｃＤＮＡである。他の企図されるポ
リシストロンＤＮＡは、附加タンパク質をコードする遺伝子、並びに融合タンパ
ク質をコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、およびＮ−Ｐ−Ｌ遺
伝子とＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子のいずれか一つを含んでもよい。組み変えＲＶを加
工する際、融合タンパク質および附加タンパク質をコードする遺伝子は、Ｍｅｂ
ａｔｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）より記載されているようにＧ尾部に
融合させねばならないと考えられる。組み変えラブドウィルスを発生させる最初
の工程はｃＤＮＡ由来のゲノムまたはアンチゲノムに相当するＲＮＡの発現であ
る。それからＮタンパク質によりＲＮＡは包含されそしてＰ／Ｌタンパク質によ
り複製される。こうして生成されたウィルスを回収できる。もしＧタンパク質が
組み変えＲＮＡゲノムを欠いているならば、トランスで供給されなければならな
い。もしＧおよびＭタンパク質両方を欠いているならば、両方はトランスで供給
されなければならない。
ンｃＤＮＡ」も細胞系にトランスフェクションされる。もし感染性の組み変えラ
ブドウィルス粒子が感染細胞の中で細胞を溶解するべきであるならば、融合タン
パク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子だけでなくＮ、Ｐ、Ｍお
よびＬタンパク質をコードする遺伝子が存在しなければならない。もし感染性、
組み変えラブドウィルス粒子が細胞溶解性であることを予定しないならば、Ｍタ
ンパク質をコードする遺伝子はポリシストロンＤＮＡには含まれない。「ポリシ
ストロンｃＤＮＡ」は、少なくともＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする遺伝
子を含む転写単位を含むｃＤＮＡを意味する。組み変えラブドウィルスのポリシ
ストロンＤＮＡはまた融合タンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする
遺伝子を含んでもよい。あるいは、融合タンパク質またはその断片はトランスで
供給されてもよい。他の企図される態様はレポータータンパク質または蛍光タン
パク質（例えば、緑蛍光タンパク質およびその派生物、βーガラクトシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル基
転移酵素など）をコードする遺伝子、Ｎ−Ｐ−ＬまたはＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子、
および融合タンパク質を含むポリシストロンｃＤＮＡである。他の企図されるポ
リシストロンＤＮＡは、附加タンパク質をコードする遺伝子、並びに融合タンパ
ク質をコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、およびＮ−Ｐ−Ｌ遺
伝子とＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子のいずれか一つを含んでもよい。組み変えＲＶを加
工する際、融合タンパク質および附加タンパク質をコードする遺伝子は、Ｍｅｂ
ａｔｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）より記載されているようにＧ尾部に
融合させねばならないと考えられる。組み変えラブドウィルスを発生させる最初
の工程はｃＤＮＡ由来のゲノムまたはアンチゲノムに相当するＲＮＡの発現であ
る。それからＮタンパク質によりＲＮＡは包含されそしてＰ／Ｌタンパク質によ
り複製される。こうして生成されたウィルスを回収できる。もしＧタンパク質が
組み変えＲＮＡゲノムを欠いているならば、トランスで供給されなければならな
い。もしＧおよびＭタンパク質両方を欠いているならば、両方はトランスで供給
されなければならない。
【００３８】 ［非感染性ラブドウィルス」粒子の調製には、細胞にトランスフェクションさ
れるポリシストロンｃＤＮＡがラブドウィルスのみのＮ、ＰおよびＬ遺伝子を含
むことを除いて、方法は上記と同様でよい。非感染性ラブドウィルス粒子のポリ
シストロンｃＤＮＡは付加的にレポーター遺伝子をコードする遺伝子を付加的に
含んでもよい。Ｇタンパク質をコードする遺伝子を欠損した組み変えＶＳＶを産
生する方法に関する付加的な記載は、Ａ．Ｔａｋａｄａ ｅｔａｌ．，（１９９
７出版）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ参照。 （ｉｉ）ウィルスを産生する細胞の培養 トランスフェクションされる細胞は通常は望ましい温度、通常はおよそ３７℃
で少なくとも２４時間培養される。非感染性ウィルス粒子のためには、上清は集
められおよびウィルス粒子は分離される。感染性ウィルス粒子のためには、ウィ
ルスを含む上清は採集されおよび新鮮な細胞に移される。その新鮮な細胞はおよ
そ４８時間培養され、および上清は集められる。 （ｉｉｉ）組み変えラブドウィルスの精製 「分離」またはラブドウィルスを「分離すること」という用語は、細胞破片が
殆ど残らないようにウィルス粒子を培養および精製する過程を意味する。一例は
上清を含むビリオンをとりそして種痘ウィルスおよび細胞破片を除去するために
０．１−０．２μ孔サイズのフィルター（たとえば、ミレックス−ＧＳ、ミリポ
ア）にそれらを通過させることが考えられる（実施例１参照）。あるいは、ビリ
オンはショ糖勾配のような勾配を用いて精製可能である。組み変えラブドウィル
ス粒子はペレットに形成され、そしていずれかの望ましい賦形剤または担体に再
懸濁されうる。力価は例えば、抗Ｍ（２３Ｈ１２）または抗Ｎ（１０Ｇ４）タン
パク質特異的な抗体（Ｌ．Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）
Ｖｉｏｌｏｇｙ １２１：１５７−６７）を用いた間接的な免疫蛍光法により決
定可能である。 （４）ｃＤＮＡおよびミニウィルスまたはヘルパー細胞系を用いた組み変えラブ
ドウィルスの作製法 「ミニウィルス」および「ヘルパー細胞」（「ヘルパー細胞系」とも知られて
いる）の両方は同様のものを供給する。すなわち、ラブドウィルスビリオンの集
合のためのラブドウィルスタンパク質源を供給する。ラブドウィルスミニウィル
スの一例は、Ｅ．Ａ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６９：２９４６−５３により報告されているようにＧおよびＭタンパク質
のみを発現するＶＳＶミニウィルスである。ヘルパーウィルスおよびミニウィル
スはラブドウィルスタンパク質の遺伝子をコードするトランスフェクションされ
たＤＮＡから産生されないラブドウィルスタンパク質を供給する方法として用い
られている。
れるポリシストロンｃＤＮＡがラブドウィルスのみのＮ、ＰおよびＬ遺伝子を含
むことを除いて、方法は上記と同様でよい。非感染性ラブドウィルス粒子のポリ
シストロンｃＤＮＡは付加的にレポーター遺伝子をコードする遺伝子を付加的に
含んでもよい。Ｇタンパク質をコードする遺伝子を欠損した組み変えＶＳＶを産
生する方法に関する付加的な記載は、Ａ．Ｔａｋａｄａ ｅｔａｌ．，（１９９
７出版）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ参照。 （ｉｉ）ウィルスを産生する細胞の培養 トランスフェクションされる細胞は通常は望ましい温度、通常はおよそ３７℃
で少なくとも２４時間培養される。非感染性ウィルス粒子のためには、上清は集
められおよびウィルス粒子は分離される。感染性ウィルス粒子のためには、ウィ
ルスを含む上清は採集されおよび新鮮な細胞に移される。その新鮮な細胞はおよ
そ４８時間培養され、および上清は集められる。 （ｉｉｉ）組み変えラブドウィルスの精製 「分離」またはラブドウィルスを「分離すること」という用語は、細胞破片が
殆ど残らないようにウィルス粒子を培養および精製する過程を意味する。一例は
上清を含むビリオンをとりそして種痘ウィルスおよび細胞破片を除去するために
０．１−０．２μ孔サイズのフィルター（たとえば、ミレックス−ＧＳ、ミリポ
ア）にそれらを通過させることが考えられる（実施例１参照）。あるいは、ビリ
オンはショ糖勾配のような勾配を用いて精製可能である。組み変えラブドウィル
ス粒子はペレットに形成され、そしていずれかの望ましい賦形剤または担体に再
懸濁されうる。力価は例えば、抗Ｍ（２３Ｈ１２）または抗Ｎ（１０Ｇ４）タン
パク質特異的な抗体（Ｌ．Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）
Ｖｉｏｌｏｇｙ １２１：１５７−６７）を用いた間接的な免疫蛍光法により決
定可能である。 （４）ｃＤＮＡおよびミニウィルスまたはヘルパー細胞系を用いた組み変えラブ
ドウィルスの作製法 「ミニウィルス」および「ヘルパー細胞」（「ヘルパー細胞系」とも知られて
いる）の両方は同様のものを供給する。すなわち、ラブドウィルスビリオンの集
合のためのラブドウィルスタンパク質源を供給する。ラブドウィルスミニウィル
スの一例は、Ｅ．Ａ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６９：２９４６−５３により報告されているようにＧおよびＭタンパク質
のみを発現するＶＳＶミニウィルスである。ヘルパーウィルスおよびミニウィル
スはラブドウィルスタンパク質の遺伝子をコードするトランスフェクションされ
たＤＮＡから産生されないラブドウィルスタンパク質を供給する方法として用い
られている。
【００３９】 ミニウィルスを使用する際には、細胞はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを供給する目
的の為に上記記載のように種痘ウィルスにより感染される。好ましいポリシスト
ロンＲＮＡ、およびＮ、ＰおよびＬ遺伝子を含むプラスミドが細胞にトランスフ
ェクションされる。トランスフェクション混合物はおよそ３時間後に除去され、
そして細胞は、約１ ｍ．ｏ．ｉ．でミニウィルスに感染される。ミニウィルス
は欠損しているＧおよび／またはＭタンパク質を供給する（Ｓｔｉｌｌｍａｎ ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９４６−５３参照）。細胞
にトランスフェクションされるポリシストロンＲＮＡは感染性または非感染性組
み変えラブドウィルスのどちらが望まれるかに依存すると考えられる。
的の為に上記記載のように種痘ウィルスにより感染される。好ましいポリシスト
ロンＲＮＡ、およびＮ、ＰおよびＬ遺伝子を含むプラスミドが細胞にトランスフ
ェクションされる。トランスフェクション混合物はおよそ３時間後に除去され、
そして細胞は、約１ ｍ．ｏ．ｉ．でミニウィルスに感染される。ミニウィルス
は欠損しているＧおよび／またはＭタンパク質を供給する（Ｓｔｉｌｌｍａｎ ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９４６−５３参照）。細胞
にトランスフェクションされるポリシストロンＲＮＡは感染性または非感染性組
み変えラブドウィルスのどちらが望まれるかに依存すると考えられる。
【００４０】 あるいは、ミニウィルスはＮ、ＰおよびＬ遺伝子を供給するために使用されう
る。ミニウィルスはまたＮ、ＰおよびＬに加えてＭタンパク質の産生にも使用可
能である。ミニウィルスはまたＧタンパク質を産生可能である。
る。ミニウィルスはまたＮ、ＰおよびＬに加えてＭタンパク質の産生にも使用可
能である。ミニウィルスはまたＧタンパク質を産生可能である。
【００４１】 ヘルパー細胞系を使用する際に、欠損しているラブドウィルスタンパク質をコ
ードする遺伝子はヘルパー細胞系により産生される。ヘルパー細胞系は野生型Ｇ
タンパク質をコードしない組み変えラブドウィルス粒子を産生するためにＮ、Ｐ
、ＬおよびＧタンパク質を有する。タンパク質は組み変えウィルスゲノムの一部
ではない遺伝子またはＤＮＡから発現される。これらのプラスミドまたは他のベ
クターシステムは細胞系のゲノムに安定して組み込まれる。タンパク質はそれで
細胞質のレプリコンではなく細胞のゲノムから産生される。ヘルパー細胞系はヘ
ルパーウィルスにより発現されない他のラブドウィルス遺伝子を含むポリシスト
ロンＤＮＡおよびプラスミドｃＤＮＡにより感染可能である。使用されるポリシ
ストロンＲＮＡは感染性または非感染性組み変えラブドウィルスのどちらが望ま
れるかに依存すると考えられる。さもなければ、欠損している遺伝子産物（例え
ば、Ｇおよび／またはＭ）の供給は上記記載のように遂行されると考えられる。 Ｂ．組み変えラブドウィルスの使用法 上記記載のように産生された組み変えラブドウィルスは（１）感染病原体（例
えば、バクテリア、寄生虫またはウィルス）に感染された細胞を標的、（２）疾
病したまたは異常な細胞を標的、（３）研究目的のため他のウィルスのエンベロ
ープタンパク質の研究、（４）疾病または感染の治療および異常細胞の除去、（
５）診断目的のため特異的な細胞また組織の想像および（６）診断および／また
は疾病追跡のためのキットとして使用に使用されることが可能である。 （１）感染病原体に感染された細胞の標的化 融合タンパク質を発現する組み変えラブドウィルスはさらに何らかの感染病原体
（例えば、バクテリア、寄生虫またはウィルス）による感染に起因する細胞表面
に位置するタンパク質を認識する附加タンパク質もまた発現するよう加工されう
る。そのような組み変えラブドウィルスは（１）もし組み変えウィルスによる感
染が生じるならばレポータータンパク質の産生により感染病原体の存在を診断す
ることまたは（２）感染を治療することに利用されうると考えられる。
ードする遺伝子はヘルパー細胞系により産生される。ヘルパー細胞系は野生型Ｇ
タンパク質をコードしない組み変えラブドウィルス粒子を産生するためにＮ、Ｐ
、ＬおよびＧタンパク質を有する。タンパク質は組み変えウィルスゲノムの一部
ではない遺伝子またはＤＮＡから発現される。これらのプラスミドまたは他のベ
クターシステムは細胞系のゲノムに安定して組み込まれる。タンパク質はそれで
細胞質のレプリコンではなく細胞のゲノムから産生される。ヘルパー細胞系はヘ
ルパーウィルスにより発現されない他のラブドウィルス遺伝子を含むポリシスト
ロンＤＮＡおよびプラスミドｃＤＮＡにより感染可能である。使用されるポリシ
ストロンＲＮＡは感染性または非感染性組み変えラブドウィルスのどちらが望ま
れるかに依存すると考えられる。さもなければ、欠損している遺伝子産物（例え
ば、Ｇおよび／またはＭ）の供給は上記記載のように遂行されると考えられる。 Ｂ．組み変えラブドウィルスの使用法 上記記載のように産生された組み変えラブドウィルスは（１）感染病原体（例
えば、バクテリア、寄生虫またはウィルス）に感染された細胞を標的、（２）疾
病したまたは異常な細胞を標的、（３）研究目的のため他のウィルスのエンベロ
ープタンパク質の研究、（４）疾病または感染の治療および異常細胞の除去、（
５）診断目的のため特異的な細胞また組織の想像および（６）診断および／また
は疾病追跡のためのキットとして使用に使用されることが可能である。 （１）感染病原体に感染された細胞の標的化 融合タンパク質を発現する組み変えラブドウィルスはさらに何らかの感染病原体
（例えば、バクテリア、寄生虫またはウィルス）による感染に起因する細胞表面
に位置するタンパク質を認識する附加タンパク質もまた発現するよう加工されう
る。そのような組み変えラブドウィルスは（１）もし組み変えウィルスによる感
染が生じるならばレポータータンパク質の産生により感染病原体の存在を診断す
ることまたは（２）感染を治療することに利用されうると考えられる。
【００４２】 企図される一例は融合タンパク質と共にＣＤ４タンパク質を発現するラブドウ
ィルスである。ＲＶを使用する際は、ＣＤ４および融合タンパク質の双方はプラ
スミドにより創造されると考えられるが、そこにはこれらのタンパク質をコード
する遺伝子はＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔａｌ．，１９９７に記載されているよう
にＧタンパク質尾部をコードする遺伝子に融合されている。ＲＶ構築物における
Ｇタンパク質尾部の欠損は組み変えＲＶ構築物の表面にＣＤ４および融合タンパ
ク質の発現を妨げると考えられる。ＶＳＶを使用する際は、ＣＤ４および融合タ
ンパク質はＧタンパク質の一部に融合されずに単独で発現されてもよい。ＣＤ４
および融合タンパク質をコードする遺伝子はＮおよびＰ遺伝子の下流に、しかし
Ｌ遺伝子の前に配置されると考えられる。Ｌ遺伝子はこれらの構築物における最
終遺伝子である。適切な凝集が生じるためにはラブドウィルスタンパク質の比が
全構築物において十分同等に残存することが重要である。
ィルスである。ＲＶを使用する際は、ＣＤ４および融合タンパク質の双方はプラ
スミドにより創造されると考えられるが、そこにはこれらのタンパク質をコード
する遺伝子はＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔａｌ．，１９９７に記載されているよう
にＧタンパク質尾部をコードする遺伝子に融合されている。ＲＶ構築物における
Ｇタンパク質尾部の欠損は組み変えＲＶ構築物の表面にＣＤ４および融合タンパ
ク質の発現を妨げると考えられる。ＶＳＶを使用する際は、ＣＤ４および融合タ
ンパク質はＧタンパク質の一部に融合されずに単独で発現されてもよい。ＣＤ４
および融合タンパク質をコードする遺伝子はＮおよびＰ遺伝子の下流に、しかし
Ｌ遺伝子の前に配置されると考えられる。Ｌ遺伝子はこれらの構築物における最
終遺伝子である。適切な凝集が生じるためにはラブドウィルスタンパク質の比が
全構築物において十分同等に残存することが重要である。
【００４３】 パラミキソウィルスＳＶ５株のＦタンパク質およびＣＤ４を発現するＶＳＶは
ＨＩＶ−１が感染したマクロファージおよびＴ細胞双方に感染可能と考えられる
。そのような組み変えＶＳＶはさらにＨＩＶ−１が感染した細胞に侵入するレポ
ータータンパク質を発現するよう加工されうる。この構築物はＳｃｈｎｅｌｌ ｅｔａｌ．，１９９７およびＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔａｌ．，１９９７により
記載されている構築物、これは補受容体ＣＸＣＲ４が存在するためＴ細胞のみに
感染可能であるが、に対比している。ＣＤ４／ＣＸＣＲ４構築物はＨＩＶ−１が
感染したマクロファージではなくＨＩＶ−１が感染したＴ細胞のみに付加する。
インビトロで細胞を標的する（組織培養細胞またはバイオプシーのような組織試
料由来の細胞）目的には、分離した組み変えラブドウィルスは当該技術分野にお
いて知られている技術を用いて細胞と培養される。組み変えラブドウィルスによ
る感染の検出は緑蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子の存在を決定するこ
とにより行われる。
ＨＩＶ−１が感染したマクロファージおよびＴ細胞双方に感染可能と考えられる
。そのような組み変えＶＳＶはさらにＨＩＶ−１が感染した細胞に侵入するレポ
ータータンパク質を発現するよう加工されうる。この構築物はＳｃｈｎｅｌｌ ｅｔａｌ．，１９９７およびＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔａｌ．，１９９７により
記載されている構築物、これは補受容体ＣＸＣＲ４が存在するためＴ細胞のみに
感染可能であるが、に対比している。ＣＤ４／ＣＸＣＲ４構築物はＨＩＶ−１が
感染したマクロファージではなくＨＩＶ−１が感染したＴ細胞のみに付加する。
インビトロで細胞を標的する（組織培養細胞またはバイオプシーのような組織試
料由来の細胞）目的には、分離した組み変えラブドウィルスは当該技術分野にお
いて知られている技術を用いて細胞と培養される。組み変えラブドウィルスによ
る感染の検出は緑蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子の存在を決定するこ
とにより行われる。
【００４４】 インビボで細胞を標的する目的には、分離した組み変えラブドウィルスは血管
内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経口または組み変え
ウィルスが組織に射出されうるいずれかの方法で（例えば、針またはカテーテル
）投与されることが可能である。あるいは、組み変えラブドウィルスは上皮細胞
への挿入により特異的に投与されることも可能である。投与の他の方法は吸引が
考えられる。組み変えウィルスは循環、付加、感染およびレポーター遺伝子を産
生する十分な時間を与えられると考えられる。レポータータンパク質は２４時間
以内および３６時間以内では必ず検出可能と考えられる。
内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経口または組み変え
ウィルスが組織に射出されうるいずれかの方法で（例えば、針またはカテーテル
）投与されることが可能である。あるいは、組み変えラブドウィルスは上皮細胞
への挿入により特異的に投与されることも可能である。投与の他の方法は吸引が
考えられる。組み変えウィルスは循環、付加、感染およびレポーター遺伝子を産
生する十分な時間を与えられると考えられる。レポータータンパク質は２４時間
以内および３６時間以内では必ず検出可能と考えられる。
【００４５】 企図される標的にされる細胞に感染したウィルス病原体は次のウィルス科の一
部を含む。Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎ
ａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ
ｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒ
ｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅおよびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ。付加的な組み変え
ラブドウィルスにより標的にされるウィルス病原体は、アフリカ豚コレラウィル
ス、ボルナ病ウィルス、Ｘ肝炎、ＨＩＶ−１、１型ヒトＴリンパ細胞ウィルス（
ＨＴＬＶ−１），ＨＴＬＶ−２、レンチウィルス、エプスタインバールウィルス
、乳頭腫ウィルス、単純疱疹ウィルス、Ｂ肝炎およびＣ肝炎を含む。
部を含む。Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎ
ａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ
ｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒ
ｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅおよびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ。付加的な組み変え
ラブドウィルスにより標的にされるウィルス病原体は、アフリカ豚コレラウィル
ス、ボルナ病ウィルス、Ｘ肝炎、ＨＩＶ−１、１型ヒトＴリンパ細胞ウィルス（
ＨＴＬＶ−１），ＨＴＬＶ−２、レンチウィルス、エプスタインバールウィルス
、乳頭腫ウィルス、単純疱疹ウィルス、Ｂ肝炎およびＣ肝炎を含む。
【００４６】 感染宿主に細胞内に存することが可能なバクテリア病原体のタンパク質はまた
組み変えラブドウィルスにより感染を企図される潜在的な標的である。企図され
る細胞内バクテリアは、他の中で、Ｓｈｉｎｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、ミコバクテリウム
およびクラミジアを含む（Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌｌ，”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ”ＩＮ ＣＥＣＩＬ ＴＥＸＴ
ＢＯＯＫ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，１
９９６）１５５６−７参照）。これらのバクテリアは組み変えラブドウィルスが
付加すると考えられる感染細胞の表面にバクテリア関連タンパク質を発現するこ
とを予期されると考えられる。
組み変えラブドウィルスにより感染を企図される潜在的な標的である。企図され
る細胞内バクテリアは、他の中で、Ｓｈｉｎｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、ミコバクテリウム
およびクラミジアを含む（Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌｌ，”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ”ＩＮ ＣＥＣＩＬ ＴＥＸＴ
ＢＯＯＫ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，１
９９６）１５５６−７参照）。これらのバクテリアは組み変えラブドウィルスが
付加すると考えられる感染細胞の表面にバクテリア関連タンパク質を発現するこ
とを予期されると考えられる。
【００４７】 細胞内に存する寄生虫病原体のタンパク質はまた組み変えラブドウィルスによ
る感染を企図される標的である。企図される細胞内寄生虫は例えば原虫類を含む
。細胞に感染する原虫類はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．Ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅおよびＰ．ｍａｌａ
ｒｉａｅ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍ属の寄生虫を含む。 疾病の及び／または異常な細胞は、先に記載された通りの同一の投与方法によ
り先に記載された組換えラブドウイルスを使用することにより標的となる。疾病
のまたは異常な細胞は、ネオプラスティック細胞、プレネオプラスティック細胞
、良性腫瘍、またはポリープ、カフェオレスポット、白斑症、及びその他の皮膚
のあざを完全に含む。
る感染を企図される標的である。企図される細胞内寄生虫は例えば原虫類を含む
。細胞に感染する原虫類はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．Ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅおよびＰ．ｍａｌａ
ｒｉａｅ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍ属の寄生虫を含む。 疾病の及び／または異常な細胞は、先に記載された通りの同一の投与方法によ
り先に記載された組換えラブドウイルスを使用することにより標的となる。疾病
のまたは異常な細胞は、ネオプラスティック細胞、プレネオプラスティック細胞
、良性腫瘍、またはポリープ、カフェオレスポット、白斑症、及びその他の皮膚
のあざを完全に含む。
【００４８】 組換えラブドウイルスは、疾病のまたは異常な細胞に発現する受容体を認識及
び結合する、抗受容体を使用することにより標的となる。組換えラブドウイルス
ビリオンの融合体は、先に記載された通りの融合タンパク質により媒介される。
組換えラブドウイルスにおいて可能性のある抗受容体は、あらゆる特定の細胞受
容体に対する自然の抗受容体を含む。
び結合する、抗受容体を使用することにより標的となる。組換えラブドウイルス
ビリオンの融合体は、先に記載された通りの融合タンパク質により媒介される。
組換えラブドウイルスにおいて可能性のある抗受容体は、あらゆる特定の細胞受
容体に対する自然の抗受容体を含む。
【００４９】 選択的には、組換えラブドウイルスは抗体またはそのポリペプチド断片、つま
り二重機能抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆｃ、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓ
ｃＦｖ）を、それらの付着タンパク質を発現するように設計することが可能であ
る。そのような抗体断片は、特定の受容体を同一と認識及び結合するように構築
される。これらの抗体は人間、またはキメラ抗体（以下を参照。Ｓ． Ｌ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ 「抗体分子、遺伝子工学の」、分子生物学及び生物工学；Ａ
ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ １９９５； Ｓ． Ｄ． Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９０）Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ１（１）： ４７−５４； Ｅ． ＪＡＲＬＯＷ 及びＤ． Ｌ
ＡＮＥ、抗体； 研究室マニュアル（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、の考察及び追加参照）を人間化することが可能で
ある。機能のある一本鎖抗体をウイルスの表面の発現させることは、バッカニア
ウイルスを用い、報告された（Ｍ． Ｃ． Ｇａｌｍｉｃｈｅら（１９９７） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｏｌ． ７８：３０１９−３０２７）。同様の方法が、融
合タンパク質及び抗体または抗体断片を発現する組換えラブドウイルスを作成す
ることにより利用された。例えば、細胞表面に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ
）（例えば、ＰＭＡまたはＰＳＡ）を標的とするモノクローナル抗体の遺伝子は
、単離され、当該技術修得者に知られるとおりの、望まれる組換えラブドウイル
ス生産するために使用することが可能である。
り二重機能抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆｃ、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓ
ｃＦｖ）を、それらの付着タンパク質を発現するように設計することが可能であ
る。そのような抗体断片は、特定の受容体を同一と認識及び結合するように構築
される。これらの抗体は人間、またはキメラ抗体（以下を参照。Ｓ． Ｌ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ 「抗体分子、遺伝子工学の」、分子生物学及び生物工学；Ａ
ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ １９９５； Ｓ． Ｄ． Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９０）Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ１（１）： ４７−５４； Ｅ． ＪＡＲＬＯＷ 及びＤ． Ｌ
ＡＮＥ、抗体； 研究室マニュアル（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、の考察及び追加参照）を人間化することが可能で
ある。機能のある一本鎖抗体をウイルスの表面の発現させることは、バッカニア
ウイルスを用い、報告された（Ｍ． Ｃ． Ｇａｌｍｉｃｈｅら（１９９７） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｏｌ． ７８：３０１９−３０２７）。同様の方法が、融
合タンパク質及び抗体または抗体断片を発現する組換えラブドウイルスを作成す
ることにより利用された。例えば、細胞表面に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ
）（例えば、ＰＭＡまたはＰＳＡ）を標的とするモノクローナル抗体の遺伝子は
、単離され、当該技術修得者に知られるとおりの、望まれる組換えラブドウイル
ス生産するために使用することが可能である。
【００５０】 例えば、ＴＡＡを認識する抗体の遺伝子は、Ｆタンパク質、完全なＧタンパク
質またはＧステムのいずれかを融合または、Ｆタンパク質及びＧタンパク質また
はＧステムの組み合わせにおける発現を可能にする。抗体の例は、悪性前立腺上
皮細胞と反応するが良性前立腺組織（例えばＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ−９１１９
； ＡＴＣＣ ＨＢ−９１２０； 及びＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ−１１４３０）
とは反応しない、または悪性乳癌細胞とは反応するが通常乳細胞（例えばＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ． ＨＢ−８６９１； ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−１０８０７； 及びＨ
Ｂ−１０８０１１）とは反応しない抗体を含む。その他の疾病組織と反応するが
通常組織とは反応しない抗体またはその断片は、当業者には明白である。 （３）その他のウイルスの外被タンパク質の研究 脂質膜外被を発現するウイルスの外被タンパク質は、組換えラブドウイルスを
使用することにより研究可能である。そのような組換えウイルスは、（１）特定
のウイルス外被タンパク質の向性；及び（２）ウイルス外被タンパク質により標
的とされる細胞受容体（抗受容体）の研究を許諾する。ある危険なウイルスのた
め、実験法は高度封じ込め領域に対する通常の必要性以外で進めることが可能で
ある。この研究における興味のウイルス外被タンパク質は、以下のウイルスファ
ミリーのものである、例えば：Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、 Ｂｕｎｙａｖｉｒ
ｉｄａｅ、 Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、 Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、 Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、 Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖ
ｒｉｄａｅ、 Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｙｖｉｒｉｄａｅ、 Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉ
ｒｉｄａｅ、 Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、 Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＲｈ
ａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ。タンパク質を発現する脂質外被を有する追加のウイル
スは以下を含む、アフリカ豚熱ウイルス、ボルナ病ウイルス、及び肝炎Ｘ。組換
えラブドウイルスを利用した研究の完了した危険なウイルスは、その他の全てを
含む：エボラウイルス（ザイール、レストン、スーダンのサブタイプ）、マール
ブルグウイルス、ラッサ熱、デング熱、ハンタウイルス、韓国易性出血熱、キャ
サヌール森ウイルス、プームラウイルス、ソウルウイルス、サル易性出血熱ウイ
ルス、ＨＩＶ、ＨＬＴＶ、及び南アメリカ易性出血熱ウイルス（Ｂ． Ｎ． ＦＩＥＬＤＳ’ ＶＩＲＯＬＯＧＹ 一巻及び二巻、ニューヨーク、ＮＹ １９
９６）。
質またはＧステムのいずれかを融合または、Ｆタンパク質及びＧタンパク質また
はＧステムの組み合わせにおける発現を可能にする。抗体の例は、悪性前立腺上
皮細胞と反応するが良性前立腺組織（例えばＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ−９１１９
； ＡＴＣＣ ＨＢ−９１２０； 及びＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ−１１４３０）
とは反応しない、または悪性乳癌細胞とは反応するが通常乳細胞（例えばＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ． ＨＢ−８６９１； ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−１０８０７； 及びＨ
Ｂ−１０８０１１）とは反応しない抗体を含む。その他の疾病組織と反応するが
通常組織とは反応しない抗体またはその断片は、当業者には明白である。 （３）その他のウイルスの外被タンパク質の研究 脂質膜外被を発現するウイルスの外被タンパク質は、組換えラブドウイルスを
使用することにより研究可能である。そのような組換えウイルスは、（１）特定
のウイルス外被タンパク質の向性；及び（２）ウイルス外被タンパク質により標
的とされる細胞受容体（抗受容体）の研究を許諾する。ある危険なウイルスのた
め、実験法は高度封じ込め領域に対する通常の必要性以外で進めることが可能で
ある。この研究における興味のウイルス外被タンパク質は、以下のウイルスファ
ミリーのものである、例えば：Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、 Ｂｕｎｙａｖｉｒ
ｉｄａｅ、 Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、 Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、 Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、 Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖ
ｒｉｄａｅ、 Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｙｖｉｒｉｄａｅ、 Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉ
ｒｉｄａｅ、 Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、 Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＲｈ
ａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ。タンパク質を発現する脂質外被を有する追加のウイル
スは以下を含む、アフリカ豚熱ウイルス、ボルナ病ウイルス、及び肝炎Ｘ。組換
えラブドウイルスを利用した研究の完了した危険なウイルスは、その他の全てを
含む：エボラウイルス（ザイール、レストン、スーダンのサブタイプ）、マール
ブルグウイルス、ラッサ熱、デング熱、ハンタウイルス、韓国易性出血熱、キャ
サヌール森ウイルス、プームラウイルス、ソウルウイルス、サル易性出血熱ウイ
ルス、ＨＩＶ、ＨＬＴＶ、及び南アメリカ易性出血熱ウイルス（Ｂ． Ｎ． ＦＩＥＬＤＳ’ ＶＩＲＯＬＯＧＹ 一巻及び二巻、ニューヨーク、ＮＹ １９
９６）。
【００５１】 他のウイルスの外被タンパク質を発現するラブドウイルスの生産は、上記記載
と同一の技法により成し遂げられた。標的細胞に対する組換えラブドウイルスの
投与はまた、先に記載されたとおりの技法により行われた。実施例６は、エボラ
ウイルスレストン株の外被タンパク質を発現する組換えＶＳＶを記載する。 （４）組換えラブドウイルスを利用した疾病または感染の治療法 「疾病細胞」により、ウイルス、バクテリア、寄生虫に感染した細胞、または
、組織学的または遺伝学的に組織型に対し異常な細胞を意味する。上記記載の組
換えラブドウイルス顆粒は、疾病または感染の結果の状況を治療または回復する
ために、使用することが可能である。もし、疾病または異常な細胞が標的となり
組換えラブドウイルスに感染しＭタンパク質が発現すると、感染した細胞はＭタ
ンパク質の細胞毒性の結果として結局は死ぬであろう。融合タンパク質を発現し
ない組換えＶＳＶ構築物は、この理由によりＨＩＶ−１に感染した細胞を殺し、
数を減少させる（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９７参照）。
と同一の技法により成し遂げられた。標的細胞に対する組換えラブドウイルスの
投与はまた、先に記載されたとおりの技法により行われた。実施例６は、エボラ
ウイルスレストン株の外被タンパク質を発現する組換えＶＳＶを記載する。 （４）組換えラブドウイルスを利用した疾病または感染の治療法 「疾病細胞」により、ウイルス、バクテリア、寄生虫に感染した細胞、または
、組織学的または遺伝学的に組織型に対し異常な細胞を意味する。上記記載の組
換えラブドウイルス顆粒は、疾病または感染の結果の状況を治療または回復する
ために、使用することが可能である。もし、疾病または異常な細胞が標的となり
組換えラブドウイルスに感染しＭタンパク質が発現すると、感染した細胞はＭタ
ンパク質の細胞毒性の結果として結局は死ぬであろう。融合タンパク質を発現し
ない組換えＶＳＶ構築物は、この理由によりＨＩＶ−１に感染した細胞を殺し、
数を減少させる（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９７参照）。
【００５２】 例えば特定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する抗体または抗体断片を発現す
る組換えラブドウイルスは、少なくとも一つのＴＡＡを発現するある癌細胞を標
的とする（Ｖ． Ｔ． ＤＥＶＩＴＡら、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ
ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ（１９９６））。修飾さ
れたラブドウイルスの標的として働く潜在的ＴＡＡは、以下を含む：脳腫瘍にお
いて発現するβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（β−ＨＣＧ）及びα−フ
ェトタンパク質（ＡＦＰ）；乳癌において発現するＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２の産
物及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；メラノーマに関連するチロシナーゼ及びＭＡＲ
Ｔ−１抗原；ｃ−ｅｒｂＢファミリー；乳癌組織において発現するＭＵＣ１／Ｒ
ＥＰ；ＴｕＡｇ−１；及び肺ガンにおいて発現する上皮細胞成長因子受容体（Ｅ
ＧＦＲ）（Ｖ． Ｔ． ＤＥＶＩＴＡら、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ
ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ（１９９６））。この様
なラブドウイルス偽型は、癌細胞を標的として感染の後には癌細胞を溶解し殺す
組換えラブドウイルスを、治療に効果的な量を個人に感染させることにより癌を
治療するための使用が完了している。組換えラブドウイルスの発現のための他の
ＴＡＡは当業者に知られている。
る組換えラブドウイルスは、少なくとも一つのＴＡＡを発現するある癌細胞を標
的とする（Ｖ． Ｔ． ＤＥＶＩＴＡら、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ
ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ（１９９６））。修飾さ
れたラブドウイルスの標的として働く潜在的ＴＡＡは、以下を含む：脳腫瘍にお
いて発現するβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（β−ＨＣＧ）及びα−フ
ェトタンパク質（ＡＦＰ）；乳癌において発現するＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２の産
物及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；メラノーマに関連するチロシナーゼ及びＭＡＲ
Ｔ−１抗原；ｃ−ｅｒｂＢファミリー；乳癌組織において発現するＭＵＣ１／Ｒ
ＥＰ；ＴｕＡｇ−１；及び肺ガンにおいて発現する上皮細胞成長因子受容体（Ｅ
ＧＦＲ）（Ｖ． Ｔ． ＤＥＶＩＴＡら、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ
ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ（１９９６））。この様
なラブドウイルス偽型は、癌細胞を標的として感染の後には癌細胞を溶解し殺す
組換えラブドウイルスを、治療に効果的な量を個人に感染させることにより癌を
治療するための使用が完了している。組換えラブドウイルスの発現のための他の
ＴＡＡは当業者に知られている。
【００５３】 本発明の組換えラブドウイルスは、侵入後標的細胞において複製し、他の標的
細胞に再感染することが可能となるよう設計されている。これらの組換えラブド
ウイルスは健康な細胞に感染することは不可能である。 （５）細胞のイメージング法 診断のため、疾病の進行または退化の決定、または特定の組換えラブドウイル
スが細胞に感染可能か否か研究するために、組換えラブドウイルスはレポーター
タンパク質または蛍光タンパク質を発現するよう構築することが可能である。こ
れらのレポータータンパク質は、組換えラブドウイルスが成功裏に細胞に感染し
たときだけ、転写、翻訳される。レポータータンパク質の存在あるいは不在が、
組換えラブドウイルスが細胞に感染可能か否かを決定する。あるいは、レポータ
ータンパク質を発現する組換えラブドウイルスは、ウイルス外被タンパク質の向
性または他のタンパク質−タンパク質（例えば、受容体−リガンド）の相互作用
を研究するとき用いられる。レポータータンパク質の検出は疾病の存在を指示す
る。実施例５及び７は、細胞のイメージに使用される代表的組換えラブドウイル
スを記載する。 （６）疾病細胞検出のための診断キット 上記記載の通り、疾病または異常な細胞に感染可能であり、感染に成功すると
レポータータンパク質を生産する組換えラブドウイルスを含むキットが準備可能
である。組換えラブドウイルスは、疾病に関連した細胞受容体を認識するよう準
備される。例えば、組換えラブドウイルスにより発現される付着タンパク質は、
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識し、癌あるいは特定の型の癌を検知することが可
能である。これらのキットは、より早く検出する、及びいかなる疾病が存在する
かより正確に検出するために、存在する組織学的染色技術と結びつけて使用する
ことが可能である。キットは追加的には、疾病の段階を確認するために使用可能
である（例えば、癌の１段階に対し癌の４段階）。これは、いかなる診断法また
は診断法らが、特定の目的の疾病を治療するのに適切であるかを診断及び決定す
る目的に対し有用である。
細胞に再感染することが可能となるよう設計されている。これらの組換えラブド
ウイルスは健康な細胞に感染することは不可能である。 （５）細胞のイメージング法 診断のため、疾病の進行または退化の決定、または特定の組換えラブドウイル
スが細胞に感染可能か否か研究するために、組換えラブドウイルスはレポーター
タンパク質または蛍光タンパク質を発現するよう構築することが可能である。こ
れらのレポータータンパク質は、組換えラブドウイルスが成功裏に細胞に感染し
たときだけ、転写、翻訳される。レポータータンパク質の存在あるいは不在が、
組換えラブドウイルスが細胞に感染可能か否かを決定する。あるいは、レポータ
ータンパク質を発現する組換えラブドウイルスは、ウイルス外被タンパク質の向
性または他のタンパク質−タンパク質（例えば、受容体−リガンド）の相互作用
を研究するとき用いられる。レポータータンパク質の検出は疾病の存在を指示す
る。実施例５及び７は、細胞のイメージに使用される代表的組換えラブドウイル
スを記載する。 （６）疾病細胞検出のための診断キット 上記記載の通り、疾病または異常な細胞に感染可能であり、感染に成功すると
レポータータンパク質を生産する組換えラブドウイルスを含むキットが準備可能
である。組換えラブドウイルスは、疾病に関連した細胞受容体を認識するよう準
備される。例えば、組換えラブドウイルスにより発現される付着タンパク質は、
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識し、癌あるいは特定の型の癌を検知することが可
能である。これらのキットは、より早く検出する、及びいかなる疾病が存在する
かより正確に検出するために、存在する組織学的染色技術と結びつけて使用する
ことが可能である。キットは追加的には、疾病の段階を確認するために使用可能
である（例えば、癌の１段階に対し癌の４段階）。これは、いかなる診断法また
は診断法らが、特定の目的の疾病を治療するのに適切であるかを診断及び決定す
る目的に対し有用である。
【００５４】 所望のキットは、例えば生研由来の組織標本に結合するよう準備された組換え
ラブドウイルスを有する。この組織標本または吸引された細胞は、当業者の知る
とおり、組換えラブドウイルスと共に培養される。キットラブドウイルスと共に
保温した後、細胞及び／または組織は受容体タンパク質の存在または不在を試験
される。
ラブドウイルスを有する。この組織標本または吸引された細胞は、当業者の知る
とおり、組換えラブドウイルスと共に培養される。キットラブドウイルスと共に
保温した後、細胞及び／または組織は受容体タンパク質の存在または不在を試験
される。
【００５５】 キットは上記の通りインビボ使用のためにも準備される。準備前の組換えラブ
ドウイルスは、以前に考察された投与法の一つにより、目標に投与されうる。受
容体遺伝子の発現は皮膚細胞において、または外科的診断の最中に検出される。
手術のために、疾病または異常な細胞に対し、健康な（または通常の）細胞を検
出することは、外科医にどの程度の量の疾病組織が切除を必要としているかを、
ラブドウイルスにより感染された細胞におけるレポータータンパク質の発現を試
験することにより外縁を決定することにより、決定させることを許容する。
ドウイルスは、以前に考察された投与法の一つにより、目標に投与されうる。受
容体遺伝子の発現は皮膚細胞において、または外科的診断の最中に検出される。
手術のために、疾病または異常な細胞に対し、健康な（または通常の）細胞を検
出することは、外科医にどの程度の量の疾病組織が切除を必要としているかを、
ラブドウイルスにより感染された細胞におけるレポータータンパク質の発現を試
験することにより外縁を決定することにより、決定させることを許容する。
【００５６】 従って以下の実施例は、特に所望される本発明の態様を注意し、いかなる方法
においても発表の残部を限定するよう解釈すべきではない。他の一般的な配置は
当業者には明らかである。
においても発表の残部を限定するよう解釈すべきではない。他の一般的な配置は
当業者には明らかである。
【００５７】
実施例１ 修飾されたラブドウイルスの作成 組換えＶＳＶ ｃＤＮＡの構築。本実施例においてパラミキソウイルスＳＶ５
のＦタンパク質を発現する組換えＶＳＶを構築するために使用した方法の図は、
図５において示す。切断型細胞質領域を有するＧタンパク質をコードする全長Ｖ
ＳＶ ｃＤＮＡは、ｐＶＳＶＦＬ（＋）INJGにおける野生型Ｇタンパク質をコー
ドする遺伝子を置き換えることにより作成された（Ｎ． Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２：４
４７７−４４８１）。ＣＴ−１の他のバージョンもまた構築された、これは３つ
の継続した停止コドンを有し、細胞質尾部コード領域のＮｈｅＩ認識部除去の残
りの部分を有した。この変異体はＣＴ−１ＴＳ（ＣＴ−１ ＴｒｉｐｌｅＳ ｔｏｐ）と呼称され、ヌクレオチド９７５−９９７（ＶＳＶ−インディアナの
完全なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０２４２８を参照）に相補的なセン
ス鎖プライマー（ＭＷ−３６）を用いた標準的ＰＣＲ仲介型変異導入法により作
成された、このヌクレオチドはＧタンパク質ｃＤＮＡにおけるＫｐｎＩ認識部の
５’であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’-TATATＧＣＴＡＧＣＴＴＡ
ＴＴＡＴＴＡTCGGAGAACCAAGAATAGTCCAATG - ３’）である。導入された３つの停
止コドンは、太字で示し、クローニングに用いたＮｈｅＩ認識部は下線で示した
。
のＦタンパク質を発現する組換えＶＳＶを構築するために使用した方法の図は、
図５において示す。切断型細胞質領域を有するＧタンパク質をコードする全長Ｖ
ＳＶ ｃＤＮＡは、ｐＶＳＶＦＬ（＋）INJGにおける野生型Ｇタンパク質をコー
ドする遺伝子を置き換えることにより作成された（Ｎ． Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２：４
４７７−４４８１）。ＣＴ−１の他のバージョンもまた構築された、これは３つ
の継続した停止コドンを有し、細胞質尾部コード領域のＮｈｅＩ認識部除去の残
りの部分を有した。この変異体はＣＴ−１ＴＳ（ＣＴ−１ ＴｒｉｐｌｅＳ ｔｏｐ）と呼称され、ヌクレオチド９７５−９９７（ＶＳＶ−インディアナの
完全なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０２４２８を参照）に相補的なセン
ス鎖プライマー（ＭＷ−３６）を用いた標準的ＰＣＲ仲介型変異導入法により作
成された、このヌクレオチドはＧタンパク質ｃＤＮＡにおけるＫｐｎＩ認識部の
５’であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’-TATATＧＣＴＡＧＣＴＴＡ
ＴＴＡＴＴＡTCGGAGAACCAAGAATAGTCCAATG - ３’）である。導入された３つの停
止コドンは、太字で示し、クローニングに用いたＮｈｅＩ認識部は下線で示した
。
【００５８】 Ｇタンパク質欠損変異体をコードするプラスミド（ｐＶＳＶ−ΔＧ）は、ｐＶ
ＳＶＦＬ（＋）−２よりＭｌｕＩからＮｈｅＩ断片を除去し（Ｌａｗｓｏｎら、
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２
：４４７７−８１）、クレノー断片により埋め、その後プラスミドを再結合する
ことにより作成された。そのため、ｐＶＳＶ−ΔＧは、Ｇタンパク質遺伝子の転
写制御配列及び３’非転写領域部分を保った、しかし、Ｇタンパク質のコード領
域の読み取り枠（ＯＲＦ）を欠いていた。オリゴヌクレオチド由来のポリリンカ
ー領域（５’−ＭｌｕＩ−ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ−ＥａｇＩ−ＮｈｅＩ
−３’）も、異種遺伝子のＧタンパク質遺伝子転写単位に対する挿入を容易にす
るため、ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ認識部の間に導入された。このプラスミド（ｐＶ
ＳＶ ΔＧ−ＰＬ）は、ヒトＣＤ４（ｐＶＳＶ ΔＧ−ＣＤ４）または、ＣＤ４
の膜貫通及び細胞質領域がＶＳＶ Ｇタンパク質の対応する領域と置き換えられ
たキメラＣＤ４タンパク質（ΔＧ−ＣＤ４Ｇ）のいずれかをコードする組換えＶ
ＳＶ ｃＤＮＡを生産するために使用された。
ＳＶＦＬ（＋）−２よりＭｌｕＩからＮｈｅＩ断片を除去し（Ｌａｗｓｏｎら、
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２
：４４７７−８１）、クレノー断片により埋め、その後プラスミドを再結合する
ことにより作成された。そのため、ｐＶＳＶ−ΔＧは、Ｇタンパク質遺伝子の転
写制御配列及び３’非転写領域部分を保った、しかし、Ｇタンパク質のコード領
域の読み取り枠（ＯＲＦ）を欠いていた。オリゴヌクレオチド由来のポリリンカ
ー領域（５’−ＭｌｕＩ−ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ−ＥａｇＩ−ＮｈｅＩ
−３’）も、異種遺伝子のＧタンパク質遺伝子転写単位に対する挿入を容易にす
るため、ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ認識部の間に導入された。このプラスミド（ｐＶ
ＳＶ ΔＧ−ＰＬ）は、ヒトＣＤ４（ｐＶＳＶ ΔＧ−ＣＤ４）または、ＣＤ４
の膜貫通及び細胞質領域がＶＳＶ Ｇタンパク質の対応する領域と置き換えられ
たキメラＣＤ４タンパク質（ΔＧ−ＣＤ４Ｇ）のいずれかをコードする組換えＶ
ＳＶ ｃＤＮＡを生産するために使用された。
【００５９】 ＨＡＧＳ構築物（ＨＡタグ付きＧステム）はＶＳＶ Ｇタンパク質の欠損型を
コードし、ｐＶＳＶＦＬ（＋）−２のＧタンパク質遺伝子の５’非翻訳領域にお
けるＭｌｕＩ認識部に重なるプライマー及び、アンチセンスオリゴヌクレオチド
（５’-AGGATGＴＴＣＧＡＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧ ＧＡＴＡｃｔｔｇｃａａｔｔｃａｃｃｃｃｔｔａｇ−３’）を用いたＰＣＲ仲介
型変異導入により作成された、これはＶＳＶ Ｇタンパク質における１２８０部
のＮｓｐＶ認識部（下線）に重なり、Ｇタンパク質のシグナルペプチド（小文字
）とＨＡ抗原決定基（太字）に相補的な配列を融合し、Ｇタンパク質外部領域の
膜近位「ステム」領域が続いた。同様の構築物（Ｇステム）もまた、ＨＡ抗原決
定基を含んでいないが、適切な変異導入プライマーを使用することにより作成さ
れた。
コードし、ｐＶＳＶＦＬ（＋）−２のＧタンパク質遺伝子の５’非翻訳領域にお
けるＭｌｕＩ認識部に重なるプライマー及び、アンチセンスオリゴヌクレオチド
（５’-AGGATGＴＴＣＧＡＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧ ＧＡＴＡｃｔｔｇｃａａｔｔｃａｃｃｃｃｔｔａｇ−３’）を用いたＰＣＲ仲介
型変異導入により作成された、これはＶＳＶ Ｇタンパク質における１２８０部
のＮｓｐＶ認識部（下線）に重なり、Ｇタンパク質のシグナルペプチド（小文字
）とＨＡ抗原決定基（太字）に相補的な配列を融合し、Ｇタンパク質外部領域の
膜近位「ステム」領域が続いた。同様の構築物（Ｇステム）もまた、ＨＡ抗原決
定基を含んでいないが、適切な変異導入プライマーを使用することにより作成さ
れた。
【００６０】 組換えＶＳＶの回収と生産。変異体Ｇタンパク質をコードする感染能のあるウ
イルスは、約３×１０6 のＢＳＫ−２１細胞にバッカニアウイルスｖＴＦ７−３
を感染させることによりプラスミドから回収した（Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔら、（
１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８
１２２−８１２６）、このバッカニアウイルスはＴ７ポリメラーゼをコードする
。一時間の後、種菌は除去され、細胞は、５μｇの適切なｐＶＳＶ−Ｇ変異体プ
ラスミド及び、各々５μｇ、３μｇ、５μｇ及び１μｇのＶＳＶのインディアナ
セロ型（ＶＳＶIND ）由来の野生型Ｇ、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子からなるＤＮＡリポ
ソーム懸濁液により、形質転換された。細胞形質転換は、重量比が各１：２．５
のジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）及びＬ−α−ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる（Ｒｏｓｅら、（１
９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５２０−５２５）リポソーム懸濁
液を用い、リポソーム形質転換試薬はエタノール導入（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，（１
９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１０２７−１０３２）により準備
されたのを除けば、先に記載のとおりに（Ｗｈｉｔｔら（１９９１）Ｆｏｃｕｓ
１３：８−１２）行われた。形質転換した培養液は２４時間保温し、上清を５
×１０6 の新鮮なＢＨＫ細胞に置いた。４８時間の保温の後、上清を１２５０×
ｇで１０分間遠心し、０．２μ孔サイズのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ，Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、バッカニアウイルスを除去した。
イルスは、約３×１０6 のＢＳＫ−２１細胞にバッカニアウイルスｖＴＦ７−３
を感染させることによりプラスミドから回収した（Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔら、（
１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８
１２２−８１２６）、このバッカニアウイルスはＴ７ポリメラーゼをコードする
。一時間の後、種菌は除去され、細胞は、５μｇの適切なｐＶＳＶ−Ｇ変異体プ
ラスミド及び、各々５μｇ、３μｇ、５μｇ及び１μｇのＶＳＶのインディアナ
セロ型（ＶＳＶIND ）由来の野生型Ｇ、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子からなるＤＮＡリポ
ソーム懸濁液により、形質転換された。細胞形質転換は、重量比が各１：２．５
のジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）及びＬ−α−ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる（Ｒｏｓｅら、（１
９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５２０−５２５）リポソーム懸濁
液を用い、リポソーム形質転換試薬はエタノール導入（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，（１
９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１０２７−１０３２）により準備
されたのを除けば、先に記載のとおりに（Ｗｈｉｔｔら（１９９１）Ｆｏｃｕｓ
１３：８−１２）行われた。形質転換した培養液は２４時間保温し、上清を５
×１０6 の新鮮なＢＨＫ細胞に置いた。４８時間の保温の後、上清を１２５０×
ｇで１０分間遠心し、０．２μ孔サイズのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ，Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、バッカニアウイルスを除去した。
【００６１】 ＶＳＶ−ΔＧ、ΔＧ−ＣＤ４／Ｇ及びΔＧ−ＣＤ４の回収は、一次形質転換体
由来の上清を２×１０６のＢＨＫ細胞を含む皿に直接移したことを除けば、ＣＴ
変異体のために記載したとおりに行われた、このＢＨＫ細胞はｖＴＦ７−３によ
り前感染され、１０μｇのＧタンパク質発現プラスミドｐＢＳ−Ｇ−φＴにより
形質転換されていた。２４時間の保温の後、上清を集め、細胞は３％パラホルム
アルデヒドにより固定し、抗Ｍタンパク質特異的（２３Ｈ１２）またはＮタンパ
ク質特異的（１０Ｇ４）モノクローナル抗体（Ｌ． Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓら、
（１９８２）１２１：１５７−１６７）を用いた間接蛍光抗体により試験した。
成功した回収物由来の上清は、１−β−Ｄアラビノフラノシルシトシン（Ａｒａ
Ｃ、２５μｇ／μｌ）存在下で一過的にＧタンパク質を発現するＢＨＫ細胞に感
染させるために使用された。Ｇ相補ウイルスの機能する原液は残存するバッカニ
アウイルスを除去するために０．２μフィルターで濾過し、感染後１０から１６
時間の後、上記記載の抗体またはＮＩＨ ＡＩＤＳ 研究及び参照試薬プログラ
ムより得た抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｓｉｍ．２（Ｄ． Ｅ． ＭｃＣａｌｌ
ｕｓら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏ．（１９９２） ５：１６３−１７２）を用
い、間接蛍光抗体顕微鏡により力価を決定した。
由来の上清を２×１０６のＢＨＫ細胞を含む皿に直接移したことを除けば、ＣＴ
変異体のために記載したとおりに行われた、このＢＨＫ細胞はｖＴＦ７−３によ
り前感染され、１０μｇのＧタンパク質発現プラスミドｐＢＳ−Ｇ−φＴにより
形質転換されていた。２４時間の保温の後、上清を集め、細胞は３％パラホルム
アルデヒドにより固定し、抗Ｍタンパク質特異的（２３Ｈ１２）またはＮタンパ
ク質特異的（１０Ｇ４）モノクローナル抗体（Ｌ． Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓら、
（１９８２）１２１：１５７−１６７）を用いた間接蛍光抗体により試験した。
成功した回収物由来の上清は、１−β−Ｄアラビノフラノシルシトシン（Ａｒａ
Ｃ、２５μｇ／μｌ）存在下で一過的にＧタンパク質を発現するＢＨＫ細胞に感
染させるために使用された。Ｇ相補ウイルスの機能する原液は残存するバッカニ
アウイルスを除去するために０．２μフィルターで濾過し、感染後１０から１６
時間の後、上記記載の抗体またはＮＩＨ ＡＩＤＳ 研究及び参照試薬プログラ
ムより得た抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｓｉｍ．２（Ｄ． Ｅ． ＭｃＣａｌｌ
ｕｓら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏ．（１９９２） ５：１６３−１７２）を用
い、間接蛍光抗体顕微鏡により力価を決定した。
【００６２】 ＶＳＶミニウイルスを用いたＶＳＶ−ＨＡＧＳ回収。組換えＶＳＶ−ＨＡＧＳ
は、ＶＳＶのＧ及びＭタンパク質のみを発現する（Ｅ． Ａ． Ｓｔｉｌｌｍａ
ｎら、Ｊ． Ｂｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５） ６９：２９４６−２９５３）ＶＳ
Ｖミニウイルス（ＧＭＭＧ）が、相補するＧタンパク質の元を提供するために使
用された選択的戦略により回収された。約１０６のｖＴＦ７−３感染細胞が、１
０μｇのｐＶＳＶ−ＨＡＧＳ及び、各々３μｇ、５μｇ、及び１μｇの野生型Ｖ
ＳＶIND のＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドにより形質転換され
た。形質転換体混合物は３時間の後除去し、細胞は一つの、感染多重度のＧＭＭ
Ｇ粒子により超感染された。ＧＭＭＧミニウイルスを１時間吸収した後、新鮮な
培地を細胞に直接加えた。上清は１８時間後まで収穫し、その後バッカニアウイ
ルスを除去するために濾過した。 実施例２ 融合タンパク質を含む組換えＶＳＶの細胞へのインビトロ投与 濾過物を１０ｃｍ皿において細胞に投与した。１８から２４時間の後、細胞を
細胞変性効果（ＣＰＥ）試験した。ＣＰＥを示す培養液由来の上清は力価を測定
し、個々のプラークを精製した。精製単離したプラークはＢＨＫ細胞を一つの感
染多重度で、尾部変異体ウイルスの原液を生産するよう感染させるために使用さ
れた。各変異体より単離されたウイルスＲＮＡを直接配列を読むことが、回収さ
れたウイルスが適切な変異を含んでいるか確認するために行われた。
は、ＶＳＶのＧ及びＭタンパク質のみを発現する（Ｅ． Ａ． Ｓｔｉｌｌｍａ
ｎら、Ｊ． Ｂｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５） ６９：２９４６−２９５３）ＶＳ
Ｖミニウイルス（ＧＭＭＧ）が、相補するＧタンパク質の元を提供するために使
用された選択的戦略により回収された。約１０６のｖＴＦ７−３感染細胞が、１
０μｇのｐＶＳＶ−ＨＡＧＳ及び、各々３μｇ、５μｇ、及び１μｇの野生型Ｖ
ＳＶIND のＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドにより形質転換され
た。形質転換体混合物は３時間の後除去し、細胞は一つの、感染多重度のＧＭＭ
Ｇ粒子により超感染された。ＧＭＭＧミニウイルスを１時間吸収した後、新鮮な
培地を細胞に直接加えた。上清は１８時間後まで収穫し、その後バッカニアウイ
ルスを除去するために濾過した。 実施例２ 融合タンパク質を含む組換えＶＳＶの細胞へのインビトロ投与 濾過物を１０ｃｍ皿において細胞に投与した。１８から２４時間の後、細胞を
細胞変性効果（ＣＰＥ）試験した。ＣＰＥを示す培養液由来の上清は力価を測定
し、個々のプラークを精製した。精製単離したプラークはＢＨＫ細胞を一つの感
染多重度で、尾部変異体ウイルスの原液を生産するよう感染させるために使用さ
れた。各変異体より単離されたウイルスＲＮＡを直接配列を読むことが、回収さ
れたウイルスが適切な変異を含んでいるか確認するために行われた。
【００６３】 ＶＳＶ−ＨＡＧＳミニウイルス技術由来の濾過された各上清の二分の一は、新
鮮な細胞に感染させるために使用した。成功した回収物は、培養液が感染後１８
から２４時間で通常のＶＳＶ感染すると現れる特徴的な細胞変性効果を示したと
きに指摘された。これら培養液由来の上清は、力価を測定し、共相補ウイルスの
原液は新鮮な細胞に０．０１の感染多重度で感染させることにより生産された。
ＶＳＶ−ＨＡＧＳ及びＧＭＭＧの両方を含む上清は、２４時間収穫され、ＶＳＶ
−ＨＡＧＳ及びＧＭＭＧ粒子は遠心により集められた、その後、２０％−４５％
スクロース濃度勾配を用いたバンド形成により分離した。通常ＧＭＭＧの約３０
０倍のＶＳＶ−ＨＡＧＳを含む下部分画は横に穴を開けることにより回収し、Ｇ
ＭＭＧに対するＶＳＶ−ＨＡＧＳの量を、Ｎタンパク質特異的（ＶＳＶ−ＨＡＧ
Ｓ用）またはＧタンパク質特異的モノクローナル抗体を利用した免疫蛍光に基ず
く力価解析により決定した。ＧＭＭＧの存在しないＶＳＶ−ＨＡＧＳの原液を得
るため、部分的に精製したＶＳＶ−ＨＡＧＳはＶＳＶのニュージャージーセロ型
由来のＧタンパク質（ＧNJ）を発現することにより完了した。その後、ＶＳＶの
インディアナセロ型（ＶＳＶIND）に特異的な中和抗体を培養培地に加えた。使 用されたインディアナ特異的血清の量は、ＶＳＶ−ＨＡＧＳ／ＧＭＭＧ共感染細
胞により生産された全てのウイルスを中和した。ＧＮＪを発現する細胞及び抗Ｖ
ＳＶIND 中和抗体の存在下において３つの継続的経路の後、ＶＳＶ−ＨＡＧＳの
力価は約１０8 ＩＵ／ｍｌに達した、一方０．５ｍｌの上清は検知可能なＧＭＭ
Ｇを含んでいなかった。ＶＳＶ ＧINDタンパク質で補われた純粋なＶＳＶ−Ｈ ＡＧＳの高力価の原液は、上記記載の通りＶＳＶΔＧのために作成された。 実施例３ 修飾されたＶＳＶのインビボでの細胞への投与 上記記載のいずれかの方法により用意された組換えＶＳＶ粒子は、ＨＩＶ−１
に感染した対象に接種される。対象に投与されるウイルスの濃度は様々で良いが
、投与に望ましいウイルスの力価は、おおよそ１０6 から１０12ＩＵ／ｍｌのオ
ーダーに存在すべきである。使用されるウイルスの量は、もし患者が比較的多数
の感染細胞を有している場合多くても良い。実施例１において記載された収穫さ
れたウイルスは導入目的に適切な担体または賦形剤に再懸濁する。 実施例４ パラミキソウイルスＳＶ５ Ｆタンパク質及びエボラウイルスの外被
タンパク質を発現する組換えＶＳＶの感染力の解析 プラスミド。エボラレストンウイルスグリコタンパク質（ＲｅｓＧＰ）（Ａ．
Ｓａｎｃｈｅｚら、（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ９３：３６０２−３６０７）、ＶＳＶ Ｇタンパク質（Ｊ． Ｋ
． Ｒｏｓｅら、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０： ７５３−７６２）及びインフ
ルエンザＡ／トルコ／アイルランド／１３７８／８３（Ｈ． Ｎｉｗａら、（１
９９１）Ｇｅｎｅ １０８： １９３−２００）の全長をコードするｃＤＮＡは
、各々ｐＣＲｅｓＧＰ、ｐＣＶＳＶＧ及び、ｐＣＴＨに当てる。
鮮な細胞に感染させるために使用した。成功した回収物は、培養液が感染後１８
から２４時間で通常のＶＳＶ感染すると現れる特徴的な細胞変性効果を示したと
きに指摘された。これら培養液由来の上清は、力価を測定し、共相補ウイルスの
原液は新鮮な細胞に０．０１の感染多重度で感染させることにより生産された。
ＶＳＶ−ＨＡＧＳ及びＧＭＭＧの両方を含む上清は、２４時間収穫され、ＶＳＶ
−ＨＡＧＳ及びＧＭＭＧ粒子は遠心により集められた、その後、２０％−４５％
スクロース濃度勾配を用いたバンド形成により分離した。通常ＧＭＭＧの約３０
０倍のＶＳＶ−ＨＡＧＳを含む下部分画は横に穴を開けることにより回収し、Ｇ
ＭＭＧに対するＶＳＶ−ＨＡＧＳの量を、Ｎタンパク質特異的（ＶＳＶ−ＨＡＧ
Ｓ用）またはＧタンパク質特異的モノクローナル抗体を利用した免疫蛍光に基ず
く力価解析により決定した。ＧＭＭＧの存在しないＶＳＶ−ＨＡＧＳの原液を得
るため、部分的に精製したＶＳＶ−ＨＡＧＳはＶＳＶのニュージャージーセロ型
由来のＧタンパク質（ＧNJ）を発現することにより完了した。その後、ＶＳＶの
インディアナセロ型（ＶＳＶIND）に特異的な中和抗体を培養培地に加えた。使 用されたインディアナ特異的血清の量は、ＶＳＶ−ＨＡＧＳ／ＧＭＭＧ共感染細
胞により生産された全てのウイルスを中和した。ＧＮＪを発現する細胞及び抗Ｖ
ＳＶIND 中和抗体の存在下において３つの継続的経路の後、ＶＳＶ−ＨＡＧＳの
力価は約１０8 ＩＵ／ｍｌに達した、一方０．５ｍｌの上清は検知可能なＧＭＭ
Ｇを含んでいなかった。ＶＳＶ ＧINDタンパク質で補われた純粋なＶＳＶ−Ｈ ＡＧＳの高力価の原液は、上記記載の通りＶＳＶΔＧのために作成された。 実施例３ 修飾されたＶＳＶのインビボでの細胞への投与 上記記載のいずれかの方法により用意された組換えＶＳＶ粒子は、ＨＩＶ−１
に感染した対象に接種される。対象に投与されるウイルスの濃度は様々で良いが
、投与に望ましいウイルスの力価は、おおよそ１０6 から１０12ＩＵ／ｍｌのオ
ーダーに存在すべきである。使用されるウイルスの量は、もし患者が比較的多数
の感染細胞を有している場合多くても良い。実施例１において記載された収穫さ
れたウイルスは導入目的に適切な担体または賦形剤に再懸濁する。 実施例４ パラミキソウイルスＳＶ５ Ｆタンパク質及びエボラウイルスの外被
タンパク質を発現する組換えＶＳＶの感染力の解析 プラスミド。エボラレストンウイルスグリコタンパク質（ＲｅｓＧＰ）（Ａ．
Ｓａｎｃｈｅｚら、（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ９３：３６０２−３６０７）、ＶＳＶ Ｇタンパク質（Ｊ． Ｋ
． Ｒｏｓｅら、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０： ７５３−７６２）及びインフ
ルエンザＡ／トルコ／アイルランド／１３７８／８３（Ｈ． Ｎｉｗａら、（１
９９１）Ｇｅｎｅ １０８： １９３−２００）の全長をコードするｃＤＮＡは
、各々ｐＣＲｅｓＧＰ、ｐＣＶＳＶＧ及び、ｐＣＴＨに当てる。
【００６４】 細胞。ベロ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ及びＭＤＢＫ細胞は、１０％ウシ胎児血漿（Ｆ
ＣＳ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ビタミン及びアミノ酸溶液（Ｇｉｂｃ
ｏ）、及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ）を補ったＥａｇ
ｌｅの最小必須培地（ＭＥＭ）において成長させた。Ｌ−細胞のためには、ウマ
血清をＦＣＳの代わりに使用した。２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３及び
ＴｂｌＬｕ細胞は、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗体を含む、高グルコ
ースＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地において培養した。Ｅ． Ｒｕｓｌ
ｅｙ博士（ヴァンダービルト大学）により提供されたＣＨＯクローン２２細胞は
、５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗体を含むＨａｍのＦ−１２培地において
培養した。Ｓ． Ｍａｋｉｎｏ博士（テキサス大学）より提供されたネズミ星状
腫細胞系列であるＤＢＴ細胞は、１０％ウシ新生児血漿、リン酸トリプトースブ
ロス（Ｇｉｂｃｏ）及び抗体を補ったＭＥＭにおいて成長させた。蚊幼虫細胞系
列であるクローンＣ６／３６細胞は、ＥａｒｌのＢＳＳ、必須でないアミノ酸、
Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＣＳを補ったＭＥＭにおいて成長させた。
ＣＳ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ビタミン及びアミノ酸溶液（Ｇｉｂｃ
ｏ）、及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ）を補ったＥａｇ
ｌｅの最小必須培地（ＭＥＭ）において成長させた。Ｌ−細胞のためには、ウマ
血清をＦＣＳの代わりに使用した。２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３及び
ＴｂｌＬｕ細胞は、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗体を含む、高グルコ
ースＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地において培養した。Ｅ． Ｒｕｓｌ
ｅｙ博士（ヴァンダービルト大学）により提供されたＣＨＯクローン２２細胞は
、５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗体を含むＨａｍのＦ−１２培地において
培養した。Ｓ． Ｍａｋｉｎｏ博士（テキサス大学）より提供されたネズミ星状
腫細胞系列であるＤＢＴ細胞は、１０％ウシ新生児血漿、リン酸トリプトースブ
ロス（Ｇｉｂｃｏ）及び抗体を補ったＭＥＭにおいて成長させた。蚊幼虫細胞系
列であるクローンＣ６／３６細胞は、ＥａｒｌのＢＳＳ、必須でないアミノ酸、
Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＣＳを補ったＭＥＭにおいて成長させた。
【００６５】 組換えＶＳＶの生産。ＶＳＶゲノム（インディアナセロ型、ＶＳＶIND ）（Ｎ
． Ｄ． Ｌａｗｓｏｎら、１９９５）の全長ｃＤＮＡクローンにおけるＧタン
パク質遺伝子のコード領域は、セリン６５をトレオニンに置換した修飾型の緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅら、（１９９４）、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６３： ８０２−５）のコード領域に置き換えた。このプラスミドは
、ｐＶＳＶ−ΔＧ* を当てた。６０ｍｍ皿におけるＢＨＫ細胞は、感染効率１０
のバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えバッカニア
ウイルスｖＴＦ７−３（Ｔ． Ｒ． Ｆｕｅｒｓｔら、１９８６）に、３７℃で
１時間感染させた。感染した細胞は、ｐＶＳＶ−ΔＧ* 、ＶＳＶヌクレオキャプ
シドタンパク質（Ｎ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ
）及びグリコタンパク質（Ｇ）を発現するプラスミドをそれぞれ先に示されたと
おり（Ｅ． Ａ． Ｓｔｉｌｌｍａｎら、（１９９５）Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６９： ２９４６−２９５３）、１０、３、５、１、及び３μｇの重量比で共
形質転換させた。使用した形質転換効率は、通常ＶＳＶが複製するときに観察さ
れる転写及び翻訳効率に匹敵した。
． Ｄ． Ｌａｗｓｏｎら、１９９５）の全長ｃＤＮＡクローンにおけるＧタン
パク質遺伝子のコード領域は、セリン６５をトレオニンに置換した修飾型の緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅら、（１９９４）、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６３： ８０２−５）のコード領域に置き換えた。このプラスミドは
、ｐＶＳＶ−ΔＧ* を当てた。６０ｍｍ皿におけるＢＨＫ細胞は、感染効率１０
のバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えバッカニア
ウイルスｖＴＦ７−３（Ｔ． Ｒ． Ｆｕｅｒｓｔら、１９８６）に、３７℃で
１時間感染させた。感染した細胞は、ｐＶＳＶ−ΔＧ* 、ＶＳＶヌクレオキャプ
シドタンパク質（Ｎ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ
）及びグリコタンパク質（Ｇ）を発現するプラスミドをそれぞれ先に示されたと
おり（Ｅ． Ａ． Ｓｔｉｌｌｍａｎら、（１９９５）Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６９： ２９４６−２９５３）、１０、３、５、１、及び３μｇの重量比で共
形質転換させた。使用した形質転換効率は、通常ＶＳＶが複製するときに観察さ
れる転写及び翻訳効率に匹敵した。
【００６６】 上清液は形質転換後４８時間収穫し、上清の半分は、ｖＴＦ７−３に感染し５
μｇのＧタンパク質だけをコードするプラスミドで形質転換された細胞の、第二
のプレートに感染させるために使用した。細胞は感染後２４時間で、蛍光顕微鏡
によりＧＦＰ発現を試験した。蛍光細胞の存在は、ＶＳＶゲノムが成功裏に回収
されたことを示した。２５μｇ／ｍｌのシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド
存在下でプラスミドＤＮＡよりＧタンパク質を発現する細胞に対する、Ｇタンパ
ク質を補ったＶＳＶΔＧ* （ＶＳＶΔＧ* −Ｇ）を含む上清の追加経路は、高力
価のＶＳＶΔＧ* −Ｇ原液を得るために行われた。ウイルス原液は、バッカニア
ウイルスを除去するために、０．２μＭ孔の膜を経由する濾過を行った。上清液
におけるウイルス力価は、再びＢＨＫ細胞に感染させ、蛍光顕微鏡によりＧＦＰ
を発現する細胞の数を定量化することにより決定した。
μｇのＧタンパク質だけをコードするプラスミドで形質転換された細胞の、第二
のプレートに感染させるために使用した。細胞は感染後２４時間で、蛍光顕微鏡
によりＧＦＰ発現を試験した。蛍光細胞の存在は、ＶＳＶゲノムが成功裏に回収
されたことを示した。２５μｇ／ｍｌのシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド
存在下でプラスミドＤＮＡよりＧタンパク質を発現する細胞に対する、Ｇタンパ
ク質を補ったＶＳＶΔＧ* （ＶＳＶΔＧ* −Ｇ）を含む上清の追加経路は、高力
価のＶＳＶΔＧ* −Ｇ原液を得るために行われた。ウイルス原液は、バッカニア
ウイルスを除去するために、０．２μＭ孔の膜を経由する濾過を行った。上清液
におけるウイルス力価は、再びＢＨＫ細胞に感染させ、蛍光顕微鏡によりＧＦＰ
を発現する細胞の数を定量化することにより決定した。
【００６７】 ＶＳＶ ＧまたはＲｅｓＧＰを補った、または補わなかったＶＳＶΔＧ* の準
備。２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、ｐＣＶＳＶＧ
、ｐＲｅｓＧＰまたはｐＣＡＧＧＳにより形質転換した。形質転換後３６時間で
、細胞は上記記載のＶＳＶΔＧ−Ｇ* を、約１から４の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ
．）において３７℃で１時間感染させた。これらはその後、ＰＢＳで３回洗浄し
、培地を加えた。ＣＯ2 保温庫において３７℃で２４時間保温した後、培養液を
集め、細胞を除去するために遠心した。各ウイルス原液は使用まで−８０℃で保
存した。
備。２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、ｐＣＶＳＶＧ
、ｐＲｅｓＧＰまたはｐＣＡＧＧＳにより形質転換した。形質転換後３６時間で
、細胞は上記記載のＶＳＶΔＧ−Ｇ* を、約１から４の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ
．）において３７℃で１時間感染させた。これらはその後、ＰＢＳで３回洗浄し
、培地を加えた。ＣＯ2 保温庫において３７℃で２４時間保温した後、培養液を
集め、細胞を除去するために遠心した。各ウイルス原液は使用まで−８０℃で保
存した。
【００６８】 異なる細胞系列における受容体結合タンパク質を補った組換えＶＳＶの滴定。
単層細胞は、カバーガラスの上で成長させ、ＰＢＳで洗浄し、ウイルス希釈系列
を用い感染させた。３７℃での１時間吸引の後、種菌を吸引し成長培地を加えた
。細胞はＣＯ2 保温庫において３７℃で１２から１４時間保温し、ＰＢＳで洗浄
し、１０％ホルマリンＰＢＳで固定した。異なる細胞系列における組換えＶＳＶ
の感染単位は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の数を数えること
により決定した。 実施例５ ＶＳＶ−エボラレストン偽型の向性の決定法及び感染細胞の解析 本実施例は、Ａ． Ｔａｋａｄａら、「エボラレストンウイルスグリコタンパ
ク質の機能解析の新たなシステム」（印刷中１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡに由来する。上記記載の通り準備した組換えＶＳ
Ｖウイルス粒子を使用した細胞向性の決定は、以下の通りである。単層細胞は、
カバーガラスの上で成長させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ウイルス
希釈系列を用い感染させた。３７℃での１時間吸引の後、種菌を吸引し成長培地
を加えた。細胞はＣＯ2 保温庫において３７℃で１２から１４時間保温し、ＰＢ
Ｓで洗浄し、１０％ホルマリンＰＢＳで固定した。異なる細胞系列において発現
する組換えウイルスの感染単位は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細
胞の数を数えることにより決定した。組換えＶＳＶ構築物：ＶＳＶΔＧ* −Ｇ、
ＶＳＶΔＧ* −ＲｅｓＧＰ、及びＶＳＶΔＧ* により成功裏に感染した細胞の実
施例を図４に示す。これら組換えＶＳＶ構築物の感染力は表１において示す。
単層細胞は、カバーガラスの上で成長させ、ＰＢＳで洗浄し、ウイルス希釈系列
を用い感染させた。３７℃での１時間吸引の後、種菌を吸引し成長培地を加えた
。細胞はＣＯ2 保温庫において３７℃で１２から１４時間保温し、ＰＢＳで洗浄
し、１０％ホルマリンＰＢＳで固定した。異なる細胞系列における組換えＶＳＶ
の感染単位は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の数を数えること
により決定した。 実施例５ ＶＳＶ−エボラレストン偽型の向性の決定法及び感染細胞の解析 本実施例は、Ａ． Ｔａｋａｄａら、「エボラレストンウイルスグリコタンパ
ク質の機能解析の新たなシステム」（印刷中１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡに由来する。上記記載の通り準備した組換えＶＳ
Ｖウイルス粒子を使用した細胞向性の決定は、以下の通りである。単層細胞は、
カバーガラスの上で成長させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ウイルス
希釈系列を用い感染させた。３７℃での１時間吸引の後、種菌を吸引し成長培地
を加えた。細胞はＣＯ2 保温庫において３７℃で１２から１４時間保温し、ＰＢ
Ｓで洗浄し、１０％ホルマリンＰＢＳで固定した。異なる細胞系列において発現
する組換えウイルスの感染単位は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細
胞の数を数えることにより決定した。組換えＶＳＶ構築物：ＶＳＶΔＧ* −Ｇ、
ＶＳＶΔＧ* −ＲｅｓＧＰ、及びＶＳＶΔＧ* により成功裏に感染した細胞の実
施例を図４に示す。これら組換えＶＳＶ構築物の感染力は表１において示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】 結果。ＶＳＶ・G* ーGと比べ、ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰウイルスストックの 感染力は細胞株の種類に深く依存した。霊長類由来細胞（例えばＶｅｒｏ、２９
３ＴおよびＣＯＳー１）に由来するＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰの感染力価は、ハ ムスター、イヌ、畜牛、マウス、チキンまたはコウモリに由来する細胞の１００
倍高かった。ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰはＣ６／３６昆虫細胞には感染しなかっ た。これらの結果は、エボラウイルスの細胞への侵入の鍵となる決定基（例えば
抗受容体の特異的な親和特性）が動物種間で異なることを示唆する。
３ＴおよびＣＯＳー１）に由来するＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰの感染力価は、ハ ムスター、イヌ、畜牛、マウス、チキンまたはコウモリに由来する細胞の１００
倍高かった。ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰはＣ６／３６昆虫細胞には感染しなかっ た。これらの結果は、エボラウイルスの細胞への侵入の鍵となる決定基（例えば
抗受容体の特異的な親和特性）が動物種間で異なることを示唆する。
【００７１】 ＲｅｓＧＰの組変えＶＳＶ粒子への組み込み。ウイルスタンパク質はまた、１
０％ＳＤＳーＰＡＧＥにより還元条件下で解析された。図３はＶＳＶＧ遺伝子（
レーン１）、ＲｅｓＧＰ遺伝子（レーン２）、またはベクタープラスミドのみ（
レーン３）を含む発現ベクタープラスミドに感染した２９３Ｔ細胞の溶解物を示
す。２９３Ｔ細胞は組変え体ウイルスの感染３０時間後、［３５Ｓ］−メチオニ
ンで５時間標識した。細胞溶解物中のタンパク質は、ＶＳＶ Ｇタンパク質（図
３、レーン１）またはＲｅｓＧＰ（レーン２、レーン３）に特異的なモノクロー
ナル抗体を用い沈殿された。ＶＳＶ Ｇタンパク質（レーン４；ＶＳＶ・G≠ーG
）,ＲｅｓＧＰ（レーン５；ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰ）により相補された、また
相補されなかった（レーン６）ＶＳＶ・G* を含む組変えＶＳＶは、［３５Ｓ］ −メチオニンで標識され、および２５ー４５％スクロース勾配を通した微分遠心
および沈降分離によって精製された。 実施例６ 組変え体ＶＳＶに感染した細胞における緑蛍光プロテイン（ＧＦＰ）
発現の経時解析。
０％ＳＤＳーＰＡＧＥにより還元条件下で解析された。図３はＶＳＶＧ遺伝子（
レーン１）、ＲｅｓＧＰ遺伝子（レーン２）、またはベクタープラスミドのみ（
レーン３）を含む発現ベクタープラスミドに感染した２９３Ｔ細胞の溶解物を示
す。２９３Ｔ細胞は組変え体ウイルスの感染３０時間後、［３５Ｓ］−メチオニ
ンで５時間標識した。細胞溶解物中のタンパク質は、ＶＳＶ Ｇタンパク質（図
３、レーン１）またはＲｅｓＧＰ（レーン２、レーン３）に特異的なモノクロー
ナル抗体を用い沈殿された。ＶＳＶ Ｇタンパク質（レーン４；ＶＳＶ・G≠ーG
）,ＲｅｓＧＰ（レーン５；ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰ）により相補された、また
相補されなかった（レーン６）ＶＳＶ・G* を含む組変えＶＳＶは、［３５Ｓ］ −メチオニンで標識され、および２５ー４５％スクロース勾配を通した微分遠心
および沈降分離によって精製された。 実施例６ 組変え体ＶＳＶに感染した細胞における緑蛍光プロテイン（ＧＦＰ）
発現の経時解析。
【００７２】 プラスミドからの感染ウイルスの回収。感染粒子の回収は、１０６のＢＨＫー
２１細胞をｖＴＦ７ー３ワクシニアで６０分感染させ、およびその後１０μｇの
様々な全長ＶＳＶ構築物をコードするプラスミド、および３μｇ、５μｇ、およ
び１μｇのＶＳＶIND ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、りん酸化タンパク
質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）各々で形質転換することにより完了する。細
胞は二日間、ウイルス粒子の複製および組み立てが可能となるよう、培養された
。細胞の上清はその後新鮮なＢＨＫ細胞上で直接培養され、細胞はウイルスが増
幅可能となるよう２４時間培養された。これらの培養液からの上清は、その後上
記のように濾過膜を通された。濾過膜は新鮮なＢＨＫー２１細胞上に移された。
数時間の吸収に従い、上清はＦＣＳを含むＤＭＥＭで置換された。ＶＳＶ感染の
ＣＰＥを呈する培養物の培地は、その後除去されおよびウイルスはプラーク精製
された。ウイルスストックは、例えば単離プラークのおよそ１０５プラーク形成
単位で１０７細胞の感染による結果として調製された。これらの培養物からの上
清は、その後の全ての感染に用いられた。回収された全てのウイルスから単離さ
れたウイルスＲＮＡの直接の塩基配列決定は、ウイルスがプラスミド由来であっ
たことを保証するため実施される。
２１細胞をｖＴＦ７ー３ワクシニアで６０分感染させ、およびその後１０μｇの
様々な全長ＶＳＶ構築物をコードするプラスミド、および３μｇ、５μｇ、およ
び１μｇのＶＳＶIND ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、りん酸化タンパク
質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）各々で形質転換することにより完了する。細
胞は二日間、ウイルス粒子の複製および組み立てが可能となるよう、培養された
。細胞の上清はその後新鮮なＢＨＫ細胞上で直接培養され、細胞はウイルスが増
幅可能となるよう２４時間培養された。これらの培養液からの上清は、その後上
記のように濾過膜を通された。濾過膜は新鮮なＢＨＫー２１細胞上に移された。
数時間の吸収に従い、上清はＦＣＳを含むＤＭＥＭで置換された。ＶＳＶ感染の
ＣＰＥを呈する培養物の培地は、その後除去されおよびウイルスはプラーク精製
された。ウイルスストックは、例えば単離プラークのおよそ１０５プラーク形成
単位で１０７細胞の感染による結果として調製された。これらの培養物からの上
清は、その後の全ての感染に用いられた。回収された全てのウイルスから単離さ
れたウイルスＲＮＡの直接の塩基配列決定は、ウイルスがプラスミド由来であっ
たことを保証するため実施される。
【００７３】 ・GーＧＦＰ感染細胞におけるＧＦＰの経時発現。ＢＨＫー２１細胞は、ＶＳ Ｖ Ｇタンパク質のトランス型で偽型とされた・GーＧＦＰ粒子で感染された。 細胞は示された時間に蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発現を検出された。同平面の
位相差画像もまた収集され、図６の右手のパネルに示す。 実施例７ ウイルス、バクテリアまたは寄生生物により感染された個体の治療法
。
位相差画像もまた収集され、図６の右手のパネルに示す。 実施例７ ウイルス、バクテリアまたは寄生生物により感染された個体の治療法
。
【００７４】 対象は、感染因に由来するタンパク質の細胞表面への結合をもたらすウイルス
、寄生生物またはバクテリアのいずれかによって感染された標的細胞に対し、上
述のように工作された組変え体ラブドウイルスを用いて治療される。このタンパ
ク質は、組変え体ラブドウイルス剤の組変え体抗受容体によって標的とされ得る
受容体となる。 一実施例はＨＩＶー１によって感染された対象の治療であり得る。ＣＤ４タンパ
ク質は、組変え体ラブドウイルスの表面に異種由来の融合タンパク質と同様に発
現され得る。組変え体ラブドウイルスは、成熟ＨＩＶー１エンベロープタンパク
質であるｇｐ１２０を発現する細胞を、認識、結合および感染する能力がある。
組変え体ラブドウイルスは、Ｍタンパク質をコードする遺伝子を含む多シストロ
ン性の核酸を含み得る。このラブドウイルスは、感染した細胞を溶解可能であり
得る。結果的に、マクロファージおよびＴ細胞のようなＨＩＶー１感染細胞の数
は、減少し得、およびウイルスはそれにより抑制され得る。投薬された組変え体
ラブドウイルスの量は、ほとんどの遺伝子治療ベクターを用いる際投薬される量
とおよそ同様であり得る。 実施例８ 発癌対象の治療法 組変え体ＶＳＶは、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）またはＰＭＡのような
、組変え体がある型の癌に伴うタンパク質を識別し得る接着タンパク質（抗受容
体）を発現することを除き、上述のように調製される。 実施例９ 融合タンパク質のポリペプチド断片を含む組変え体ラブドウイルスの
作製。
、寄生生物またはバクテリアのいずれかによって感染された標的細胞に対し、上
述のように工作された組変え体ラブドウイルスを用いて治療される。このタンパ
ク質は、組変え体ラブドウイルス剤の組変え体抗受容体によって標的とされ得る
受容体となる。 一実施例はＨＩＶー１によって感染された対象の治療であり得る。ＣＤ４タンパ
ク質は、組変え体ラブドウイルスの表面に異種由来の融合タンパク質と同様に発
現され得る。組変え体ラブドウイルスは、成熟ＨＩＶー１エンベロープタンパク
質であるｇｐ１２０を発現する細胞を、認識、結合および感染する能力がある。
組変え体ラブドウイルスは、Ｍタンパク質をコードする遺伝子を含む多シストロ
ン性の核酸を含み得る。このラブドウイルスは、感染した細胞を溶解可能であり
得る。結果的に、マクロファージおよびＴ細胞のようなＨＩＶー１感染細胞の数
は、減少し得、およびウイルスはそれにより抑制され得る。投薬された組変え体
ラブドウイルスの量は、ほとんどの遺伝子治療ベクターを用いる際投薬される量
とおよそ同様であり得る。 実施例８ 発癌対象の治療法 組変え体ＶＳＶは、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）またはＰＭＡのような
、組変え体がある型の癌に伴うタンパク質を識別し得る接着タンパク質（抗受容
体）を発現することを除き、上述のように調製される。 実施例９ 融合タンパク質のポリペプチド断片を含む組変え体ラブドウイルスの
作製。
【００７５】 ＶＳＶのような組変え体ラブドウイルスは、ＳＶ５ Ｆタンパク質、またはＧ
タンパク質の推定多量体化ドメイン、膜貫通ドメインおよびＧタンパク質の細胞
内尾部を包囲するＶＳＶ Ｇタンパク質のステム領域に連結する融合タンパク質
断片のような融合タンパク質を発現するよう構築される。これらの構築物は、感
染細胞に用いられ、および結果となるウイルスの感染力が様々な細胞系で比較さ
れ得る。 実施例１０ ｃＤＮＡのみを用いる融合タンパク質の識別法 ＶＳＶのような組変え体ラブドウイルスは、接着タンパク質および融合タンパ
ク質の候補を発現するよう構築される。接着タンパク質はＣＤ４であり得、およ
び標的細胞はＨＩＶー１のエンベロープタンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ１６０を発
現する細胞であり得る。候補となる融合タンパク質を発現する構築物は、パラミ
キソウイルスＳＶ５およびＣＤ４（陽性対照）融合タンパク質を発現する構築物
、およびＣＤ４およびＶＳＶ Ｇタンパク質のみを発現するＶＳＶ構築物と比較
されてよい。これらの構築物による感染度は、上記および例５および６に記載さ
れた緑蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質を用いて比較され得る。
タンパク質の推定多量体化ドメイン、膜貫通ドメインおよびＧタンパク質の細胞
内尾部を包囲するＶＳＶ Ｇタンパク質のステム領域に連結する融合タンパク質
断片のような融合タンパク質を発現するよう構築される。これらの構築物は、感
染細胞に用いられ、および結果となるウイルスの感染力が様々な細胞系で比較さ
れ得る。 実施例１０ ｃＤＮＡのみを用いる融合タンパク質の識別法 ＶＳＶのような組変え体ラブドウイルスは、接着タンパク質および融合タンパ
ク質の候補を発現するよう構築される。接着タンパク質はＣＤ４であり得、およ
び標的細胞はＨＩＶー１のエンベロープタンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ１６０を発
現する細胞であり得る。候補となる融合タンパク質を発現する構築物は、パラミ
キソウイルスＳＶ５およびＣＤ４（陽性対照）融合タンパク質を発現する構築物
、およびＣＤ４およびＶＳＶ Ｇタンパク質のみを発現するＶＳＶ構築物と比較
されてよい。これらの構築物による感染度は、上記および例５および６に記載さ
れた緑蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質を用いて比較され得る。
【００７６】 構築物は明細書中で述べられたいかなる方法を用いて調製され得る。 実施例１１ ＳＶ５ Ｆタンパク質で偽型化された組変え体ＣＤ４ーＶＳＶのＨ
ＩＶ ｇｐ１６０発現細胞に対する感染力 パラミキソウイルスＳＶ５ Ｆタンパク質を用いたＣＤ４ーＶＳＶの偽型化。
ＳＶ５ Ｆタンパク質を（ワクシニアＴ７発現系を用い）発現するＢＨＫー２１
細胞は、野生型ＶＳＶ Ｇタンパク質で先に偽型化されたＣＤ４ーＶＳＶで感染
された。上清は感染後１８時間で収穫され、ワクシニアウイルスを除去するよう
濾過された。結果となる上清は、ＣＤ４およびＳＶ５の両方をウイルスエンベロ
ープ内に有するが、ＶＳＶ Ｇタンパク質を欠く組変え体ＶＳＶを含む。接種原
（例えばＧタンパク質偽型化ＣＤ４ウイルス）からの残留感染力は、ＶＳＶ Ｇ
タンパク質特異的な中和抗原の添加によって算出された。
ＩＶ ｇｐ１６０発現細胞に対する感染力 パラミキソウイルスＳＶ５ Ｆタンパク質を用いたＣＤ４ーＶＳＶの偽型化。
ＳＶ５ Ｆタンパク質を（ワクシニアＴ７発現系を用い）発現するＢＨＫー２１
細胞は、野生型ＶＳＶ Ｇタンパク質で先に偽型化されたＣＤ４ーＶＳＶで感染
された。上清は感染後１８時間で収穫され、ワクシニアウイルスを除去するよう
濾過された。結果となる上清は、ＣＤ４およびＳＶ５の両方をウイルスエンベロ
ープ内に有するが、ＶＳＶ Ｇタンパク質を欠く組変え体ＶＳＶを含む。接種原
（例えばＧタンパク質偽型化ＣＤ４ウイルス）からの残留感染力は、ＶＳＶ Ｇ
タンパク質特異的な中和抗原の添加によって算出された。
【００７７】 ＨＩＶ ｇｐ１６０発現細胞上のＳＶ５ Ｆタンパク質による偽型組変え体Ｃ
Ｄ４−ＶＳＶの感染力。ＢＨＫー２１細胞は、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを発
現する組変え体ワクシニアウイルスで感染され、およびＨＩＶ ｇｐ１６０タン
パク質をコードする様々な量の発現プラスミドで形質転換された。細胞表面への
ｇｐ１２０ーｇｐ４１の吸収が可能となる１０時間後、細胞はＣＤ４／ＦーＶＳ
Ｖで感染された。すべてのプレートは、等量のＣＤ４／Ｆウイルス接種源で感染
された。細胞は、さらに６時間、ＶＳＶ特異的タンパク質が発現可能となるまで
培養され、免疫蛍光顕微鏡によってＶＳＶ Ｎタンパク質の発現を調べられた。
一プレート当たりの感染細胞数は、ＶＳＶ Ｎタンパク質に対する免疫耐性のあ
る細胞を計測することにより決定された。図７は、ｇｐ１６０をコードする増加
量のプラスミドに感染した細胞中に、・G ＶＳＶ偽型ＣＤ４ーＳＶ５ Ｆに感染
され多細胞数の結果的な増加がある。
Ｄ４−ＶＳＶの感染力。ＢＨＫー２１細胞は、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを発
現する組変え体ワクシニアウイルスで感染され、およびＨＩＶ ｇｐ１６０タン
パク質をコードする様々な量の発現プラスミドで形質転換された。細胞表面への
ｇｐ１２０ーｇｐ４１の吸収が可能となる１０時間後、細胞はＣＤ４／ＦーＶＳ
Ｖで感染された。すべてのプレートは、等量のＣＤ４／Ｆウイルス接種源で感染
された。細胞は、さらに６時間、ＶＳＶ特異的タンパク質が発現可能となるまで
培養され、免疫蛍光顕微鏡によってＶＳＶ Ｎタンパク質の発現を調べられた。
一プレート当たりの感染細胞数は、ＶＳＶ Ｎタンパク質に対する免疫耐性のあ
る細胞を計測することにより決定された。図７は、ｇｐ１６０をコードする増加
量のプラスミドに感染した細胞中に、・G ＶＳＶ偽型ＣＤ４ーＳＶ５ Ｆに感染
され多細胞数の結果的な増加がある。
【００７８】 実施例１２ 前立腺ガンを標的とするＰＳＡ特異的ＳｃＦｖをコードする組変 え体ＶＳＶの産生 ＳｃＦｖーＧＳの構築。まず、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）または他の腫瘍特異
的抗原を産生するハイブリドーマ細胞系由来のＶーＨおよびＶーＬドメインは、
ＳｃＦｖーＧＳを構築する標準的な方法によりクローン化される。簡潔には、様
々なドメインの配列は、好ましいハイブリドーマ細胞から単離された、ポリＡを
含むｍＲＮＡのＲＴーＰＣＲ増幅により得られる。ポリＡ ＲＮＡは逆転写（Ｒ
Ｔ）反応の鋳型として用いられ、および使用されるプライマーは先に述べられた
ものに類似したものである（Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉ ら。（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３−３８３７）。 増幅されたＶドメインは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へクローン化され、および
増幅領域の配列は標準的な方法により決定される。配列は読み枠を解析されおよ
び既知のＶＨ（可変重鎖）およびＶＬ（可変軽鎖）配列と比較され得る。ひとた
び配列が確定されると、これらのクローンはＳｃＦｖ遺伝子構築に用いられる。
ＶＨおよびＶＬをコードする配列はオリゴヌクレオチドリンカーを用い連結され
る。リンカーは、最初のＶ領域のＣ末端および２番目のＶ（可変）領域のＮ末端
とをＶL −（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）−ＶH ポリペプチドへとつなぐ、短いＧｌｙ−Ｓ
ｅｒペプチドをコードする。全長ＳｃＦｖ遺伝子は、真核細胞中での後の発現に
おいてタンパク質が粗面小胞体を標的とし、および分泌されるように、ＶＳＶ Ｇタンパク質のシグナル配列をコードする配列に連結される。発現解析が、Ｓｃ
Ｆｖが機能的で、および好ましい抗原（例えばＰＳＡ）に結合可能であることを
保証するために用いられる。
的抗原を産生するハイブリドーマ細胞系由来のＶーＨおよびＶーＬドメインは、
ＳｃＦｖーＧＳを構築する標準的な方法によりクローン化される。簡潔には、様
々なドメインの配列は、好ましいハイブリドーマ細胞から単離された、ポリＡを
含むｍＲＮＡのＲＴーＰＣＲ増幅により得られる。ポリＡ ＲＮＡは逆転写（Ｒ
Ｔ）反応の鋳型として用いられ、および使用されるプライマーは先に述べられた
ものに類似したものである（Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉ ら。（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３−３８３７）。 増幅されたＶドメインは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へクローン化され、および
増幅領域の配列は標準的な方法により決定される。配列は読み枠を解析されおよ
び既知のＶＨ（可変重鎖）およびＶＬ（可変軽鎖）配列と比較され得る。ひとた
び配列が確定されると、これらのクローンはＳｃＦｖ遺伝子構築に用いられる。
ＶＨおよびＶＬをコードする配列はオリゴヌクレオチドリンカーを用い連結され
る。リンカーは、最初のＶ領域のＣ末端および２番目のＶ（可変）領域のＮ末端
とをＶL −（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）−ＶH ポリペプチドへとつなぐ、短いＧｌｙ−Ｓ
ｅｒペプチドをコードする。全長ＳｃＦｖ遺伝子は、真核細胞中での後の発現に
おいてタンパク質が粗面小胞体を標的とし、および分泌されるように、ＶＳＶ Ｇタンパク質のシグナル配列をコードする配列に連結される。発現解析が、Ｓｃ
Ｆｖが機能的で、および好ましい抗原（例えばＰＳＡ）に結合可能であることを
保証するために用いられる。
【００７９】 次にＳｃＦｖをコードする領域は、ＶＳＶ Ｇタンパク質の膜固定ステム領域
をコードする配列に連結される。Ｇステム配列へ導入された唯一の制限酵素認識
部位は、読み枠が損なわれないように、二つのコード領域を連結するのに用いら
れる。結果となる分子は、ＶＳＶ Ｇステム（ＳｃＦｖーＧＳ）のＥ４２２アミ
ノ酸に融合したＳｃＦｖドメインからなる。発現解析は、分子が発現されおよび
感染細胞の細胞膜に局在することを保証するのに用いられる。
をコードする配列に連結される。Ｇステム配列へ導入された唯一の制限酵素認識
部位は、読み枠が損なわれないように、二つのコード領域を連結するのに用いら
れる。結果となる分子は、ＶＳＶ Ｇステム（ＳｃＦｖーＧＳ）のＥ４２２アミ
ノ酸に融合したＳｃＦｖドメインからなる。発現解析は、分子が発現されおよび
感染細胞の細胞膜に局在することを保証するのに用いられる。
【００８０】 最後に、ＳｃＦｖーＧＳ遺伝子は、遺伝子がＶＳＶの転写制御下に置かれるよ
うにｐＶＳＶーＧーＦの多クローニング部位へとクローン化される。結果となる
構築物はｐＶＳＶーＳｃＦｖーＦと呼ばれる。組変え体ＳｃＦｖーＦウイルスは
標準的な手順によりｐＶＳＶーＳｃＦｖーＦプラスミドから回収される。未処理
ＶＳＶーＳｃＦｖーＦは、野生型ＶＳＶ Ｇタンパク質を発現しない細胞に運搬
され産生される。
うにｐＶＳＶーＧーＦの多クローニング部位へとクローン化される。結果となる
構築物はｐＶＳＶーＳｃＦｖーＦと呼ばれる。組変え体ＳｃＦｖーＦウイルスは
標準的な手順によりｐＶＳＶーＳｃＦｖーＦプラスミドから回収される。未処理
ＶＳＶーＳｃＦｖーＦは、野生型ＶＳＶ Ｇタンパク質を発現しない細胞に運搬
され産生される。
【００８１】 ＰＳＡを発現する腫瘍細胞の攻撃。ＬＮＣａＰ細胞株は前立腺癌のモデル細胞
株である。これらの細胞はＰＳＡを発現しおよび組変え体ＳｃＦｖーＦウイルス
の標的として振舞い得ることが知られる。ＬＮＣａＰ細胞は、標準的な培養条件
で生育されおよび組変え体ＳｃＦｖ−Ｆウイルスを含む上清が加えられる。細胞
は軽度に接着されおよび単細胞層は容易に破壊されるため、接種源は除去されな
い。感染は、典型的な免疫蛍光に基づく感染中枢測定を用い、接種１５時間後に
見積もられる。対照群は、野生型組変え体ＶＳＶ、膜固定Ｇステムのみを含む非
感染変異体ＶＳＶーＨＡＧＳ、および融合（Ｆ）タンパク質を除くＳｃＦｖーＧ
Ｓポリペプチドのみをコードする組変え体での感染を含む。特異性は、ＰＳＡを
発現しない正常細胞に対してＳｃＦｖーＦウイルスの感染力を査定することによ
って決定される。
株である。これらの細胞はＰＳＡを発現しおよび組変え体ＳｃＦｖーＦウイルス
の標的として振舞い得ることが知られる。ＬＮＣａＰ細胞は、標準的な培養条件
で生育されおよび組変え体ＳｃＦｖ−Ｆウイルスを含む上清が加えられる。細胞
は軽度に接着されおよび単細胞層は容易に破壊されるため、接種源は除去されな
い。感染は、典型的な免疫蛍光に基づく感染中枢測定を用い、接種１５時間後に
見積もられる。対照群は、野生型組変え体ＶＳＶ、膜固定Ｇステムのみを含む非
感染変異体ＶＳＶーＨＡＧＳ、および融合（Ｆ）タンパク質を除くＳｃＦｖーＧ
Ｓポリペプチドのみをコードする組変え体での感染を含む。特異性は、ＰＳＡを
発現しない正常細胞に対してＳｃＦｖーＦウイルスの感染力を査定することによ
って決定される。
【００８２】 同様に、これらの構築物は前立腺ガンの研究に用いられる動物モデルにおいて
解析され得る。ヒト前立腺癌のマウスモデル系が、開発されており、および記載
された研究の規範であり得る。純粋組変え体ＶＳＶ−ＳｃＦｖーＦは、ヒト前立
腺特異的腫瘍を有する動物に投与される。動物は、組変え体ウイルスの投与の結
果として、有害な効果が見られるか否か決定するため、数週間観察される。動物
は殺され、および腫瘍塊は大きさ、質量の変化、血管新生および転移を調べらる
。対照は、陰性対照となるＶＳＶーＨＡＧＳでの感染を含む。付加的対照は、融
合（Ｆ）タンパク質を含まない組変え体ＶＳＶ−ＳｃＦｖ−ＧＳの投与である。
ＶＳＶ−ＨＡＧＳ同様、このウイルスは非感染性であり得る。ＶＳＶ−ＨＡＧＳ
構築物は、ウイルスエンベロープにＳｃＦｖ−ＧＳポリペプチドを持つウイルス
の投与に伴う効果の評価を可能にする。 実施例１３ ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染力 ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染力を研究するため、ＢＨＫー２１細胞は、ＣＤ
４ーＧ、ＣＤ−４ＧＳの一方、またはＣＤ４ーＧおよびＨＡＧＳの両方をコード
する野生型Ｇタンパク質偽型組変え体・GーＶＳＶで感染された。偽型ウイルス は６０分間吸収され、接種源は除去され、および細胞単層は残留接種源を除去す
るため完全に洗浄された。続く感染で細胞は、５％ＦＣＳを含む培地で１６時間
培養された。培養後、純粋組変え体ＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇ、ＣＤ４ＧＳまたはＣＤ
４−ＧおよびＨＡＧＳウイルスの混合物を含む培地は、回収され、遊離細胞は２
，５００ｒｐｍで１０分遠心分離され除去された。上清のアリコートは、ＨＩＶ
−１エンベロープタンパク質の亜類型ＨＸＢを発現する細胞を感染するのに用い
られた。上清は６０分間無血清培地中で吸収された。すなわち接種源は除去され
および無血清培地へ移行された。感染力は、免疫蛍光顕微鏡により、ＶＳＶヌク
レオキャプシドタンパク質を発現する細胞数の解析により測定された。
解析され得る。ヒト前立腺癌のマウスモデル系が、開発されており、および記載
された研究の規範であり得る。純粋組変え体ＶＳＶ−ＳｃＦｖーＦは、ヒト前立
腺特異的腫瘍を有する動物に投与される。動物は、組変え体ウイルスの投与の結
果として、有害な効果が見られるか否か決定するため、数週間観察される。動物
は殺され、および腫瘍塊は大きさ、質量の変化、血管新生および転移を調べらる
。対照は、陰性対照となるＶＳＶーＨＡＧＳでの感染を含む。付加的対照は、融
合（Ｆ）タンパク質を含まない組変え体ＶＳＶ−ＳｃＦｖ−ＧＳの投与である。
ＶＳＶ−ＨＡＧＳ同様、このウイルスは非感染性であり得る。ＶＳＶ−ＨＡＧＳ
構築物は、ウイルスエンベロープにＳｃＦｖ−ＧＳポリペプチドを持つウイルス
の投与に伴う効果の評価を可能にする。 実施例１３ ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染力 ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染力を研究するため、ＢＨＫー２１細胞は、ＣＤ
４ーＧ、ＣＤ−４ＧＳの一方、またはＣＤ４ーＧおよびＨＡＧＳの両方をコード
する野生型Ｇタンパク質偽型組変え体・GーＶＳＶで感染された。偽型ウイルス は６０分間吸収され、接種源は除去され、および細胞単層は残留接種源を除去す
るため完全に洗浄された。続く感染で細胞は、５％ＦＣＳを含む培地で１６時間
培養された。培養後、純粋組変え体ＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇ、ＣＤ４ＧＳまたはＣＤ
４−ＧおよびＨＡＧＳウイルスの混合物を含む培地は、回収され、遊離細胞は２
，５００ｒｐｍで１０分遠心分離され除去された。上清のアリコートは、ＨＩＶ
−１エンベロープタンパク質の亜類型ＨＸＢを発現する細胞を感染するのに用い
られた。上清は６０分間無血清培地中で吸収された。すなわち接種源は除去され
および無血清培地へ移行された。感染力は、免疫蛍光顕微鏡により、ＶＳＶヌク
レオキャプシドタンパク質を発現する細胞数の解析により測定された。
【００８３】 １０μｌのみのＣＤ４−ＧＳまたはＣＤ４Ｇ＋ＨＡＧＳの上清が用いられた一
方、１００μｌのＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇの上清が感染力測定に用いられた。総数６
０のＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇ感染細胞が培養皿全体で見つけられた。この結果は、お
よそ１ｍｌあたり６００感染単位（ＩＵ／ｍｌ）の力価に相当する。対照的に、
ＣＤ４−ＧＳまたはＣＤ４Ｇ＋ＨＡＧＳの力価は、＞１０8 ＩＵ／ｍｌであった
。
方、１００μｌのＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇの上清が感染力測定に用いられた。総数６
０のＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇ感染細胞が培養皿全体で見つけられた。この結果は、お
よそ１ｍｌあたり６００感染単位（ＩＵ／ｍｌ）の力価に相当する。対照的に、
ＣＤ４−ＧＳまたはＣＤ４Ｇ＋ＨＡＧＳの力価は、＞１０8 ＩＵ／ｍｌであった
。
【００８４】 結果。図８で示されたデータは、ウイルスエンベロープ中にＣＤ４−Ｇを含み
ヒトケモカイン共役受容体を欠くウイルスが、Ｔ親和性ＨＩＶ−１エンベロープ
タンパク質（ＨＸＢ）を発現する細胞への感染力が極度に低いことを示す。対照
的に、ＣＤ４−ＧＳ（例えば”Ｇステム”といったＶＳＶ Ｇタンパク質外ドメ
インのＥ４２２アミノ酸に連結したＣＤ４外ドメイン）は、非常に高い特異的な
感染力を示した。ＣＤ４−ＧＳの特異的感染力は、野生型ＶＳＶの野生型標的宿
主細胞に対してみられる特異的な感染力にほぼ匹敵する。さらに、ＶＳＶ／ＣＤ
４−ＧＳによるＨＩＶ−１エンベロープ発現細胞への感染は、ケモカイン共役受
容体を必要としない。精製されたＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳビリオンの解析は、ＣＤ
４−ＧＳの一部（〜５０％）がＣＤ４／Ｇステム連結部、またはその近傍で切断
されることを明らかにした。感染細胞中でのタンパク質の細胞膜への輸送中に起
きるこの切断は、膜固定切断産物（Ｇステム）だけでなく全長ＣＤ４−ＧＳ分子
の両方を持つウイルス粒子の放出をもたらす（図９）。切断はＣＤ４−Ｇでは起
きず、および結果としてＶＳＶエンベロープはＣＤ４−Ｇのみで構成される。
ヒトケモカイン共役受容体を欠くウイルスが、Ｔ親和性ＨＩＶ−１エンベロープ
タンパク質（ＨＸＢ）を発現する細胞への感染力が極度に低いことを示す。対照
的に、ＣＤ４−ＧＳ（例えば”Ｇステム”といったＶＳＶ Ｇタンパク質外ドメ
インのＥ４２２アミノ酸に連結したＣＤ４外ドメイン）は、非常に高い特異的な
感染力を示した。ＣＤ４−ＧＳの特異的感染力は、野生型ＶＳＶの野生型標的宿
主細胞に対してみられる特異的な感染力にほぼ匹敵する。さらに、ＶＳＶ／ＣＤ
４−ＧＳによるＨＩＶ−１エンベロープ発現細胞への感染は、ケモカイン共役受
容体を必要としない。精製されたＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳビリオンの解析は、ＣＤ
４−ＧＳの一部（〜５０％）がＣＤ４／Ｇステム連結部、またはその近傍で切断
されることを明らかにした。感染細胞中でのタンパク質の細胞膜への輸送中に起
きるこの切断は、膜固定切断産物（Ｇステム）だけでなく全長ＣＤ４−ＧＳ分子
の両方を持つウイルス粒子の放出をもたらす（図９）。切断はＣＤ４−Ｇでは起
きず、および結果としてＶＳＶエンベロープはＣＤ４−Ｇのみで構成される。
【００８５】 Ｇステム（この場合ＨＡＧＳと呼ばれるＨＡ抗原認識部位標識型）がビリオン
の感染力を増大し得るかを決定するために、ＣＤ４−Ｇを含む細胞はＣＤ４−Ｇ
またはＨＡＧＳのいずれかをコードするウイルスで別々に共感染させた。これら
の細胞から産生されたウイルスは、エンベロープ中にＣＤ４−ＧおよびＨＡＧＳ
の両方を含んだ。ＣＤ４−Ｇ／ＨＡＧＳウイルスの感染力は、ＣＤ４−ＧＳの感
染力と実質的に同等であった。これらの結果は、ＶＳＶ Ｇステムが、この場合
ＣＤ４−Ｇである異種結合タンパク質とともにウイルスエンベロープへ編入され
たときウイルス粒子の感染力を増幅し得ることを示す。他の異種結合タンパク質
候補はすでに技術を有するものに知られている。 実施例１４ Ｇステムを含むＶＳＶ組変え体：感染力およびモデル ウイルス産生およびＧステム編入。ウイルスは、図８で実施された実験で示され
たように産生された。この上清は、感染後１６時間で回収された。ビリオンは超
遠心分離により濃縮され、ウイルス量およびビリオンのタンパク質含有量は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された。ビリオンタンパク質は、クマシーブルー染色
またはＶＳＶ Ｇタンパク質の細胞内ドメインに特異的な抗体を用いたウエスタ
ンブロット解析によって可視化された（図９参照）。 結果。ＶＳＶ／ＣＤ４ーＧ感染細胞は、ΔＧーＶＳＶとおよそ同量のウイルスを
産生する。これは野生型ＶＳＶの１０分の１に相当する。対照的に、ＶＳＶ／Ｃ
Ｄ４ＧＳは野生型とほぼ同量（野生型の〜７０ー７５％）のウイルスを産生する
。ＶＳＶーＧの細胞質ドメインの最後の１５アミノ酸を認識しおよび結合する抗
体を用いた、ＣＤ４ーＧおよびＣＤ４ーＧＳウイルスの同等量の免疫ブロット解
析（図９）は、ＣＤ４ーＧＳが切断され、相当するＧステム断片は、全長ＣＤ４
ーＧＳ分子とともに組変え体ＶＳＶビリオンへ編入されることを示す。 様々な細胞種から生産されたＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳの細胞に対する感染能力。
本質的には図８の実験において記載されたような、示された細胞種においてウィ
ルスが生産された。様々な細胞主のＶＳＶによる溶解に対する感受性に依存する
感染後の様々な時点において上清が回収された。上清の一部は感染能力試験に用
いられ、残りは超遠心分離され、ビリオンが沈殿された。各々の細胞種により生
産されたウィルスの量はSDS−PAGE によってタンパク質が分離された後、クマ シーブルーにより染色されたゲルの濃度測定によって決定された。図１０に示さ
れた相対的な感染力は、上清から沈澱化されたウィルスタンパク質に対して標準
化の後の感染能力の量を表す。相対的な感染能力はＩＵ／ｍｌには対応しない。
の感染力を増大し得るかを決定するために、ＣＤ４−Ｇを含む細胞はＣＤ４−Ｇ
またはＨＡＧＳのいずれかをコードするウイルスで別々に共感染させた。これら
の細胞から産生されたウイルスは、エンベロープ中にＣＤ４−ＧおよびＨＡＧＳ
の両方を含んだ。ＣＤ４−Ｇ／ＨＡＧＳウイルスの感染力は、ＣＤ４−ＧＳの感
染力と実質的に同等であった。これらの結果は、ＶＳＶ Ｇステムが、この場合
ＣＤ４−Ｇである異種結合タンパク質とともにウイルスエンベロープへ編入され
たときウイルス粒子の感染力を増幅し得ることを示す。他の異種結合タンパク質
候補はすでに技術を有するものに知られている。 実施例１４ Ｇステムを含むＶＳＶ組変え体：感染力およびモデル ウイルス産生およびＧステム編入。ウイルスは、図８で実施された実験で示され
たように産生された。この上清は、感染後１６時間で回収された。ビリオンは超
遠心分離により濃縮され、ウイルス量およびビリオンのタンパク質含有量は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された。ビリオンタンパク質は、クマシーブルー染色
またはＶＳＶ Ｇタンパク質の細胞内ドメインに特異的な抗体を用いたウエスタ
ンブロット解析によって可視化された（図９参照）。 結果。ＶＳＶ／ＣＤ４ーＧ感染細胞は、ΔＧーＶＳＶとおよそ同量のウイルスを
産生する。これは野生型ＶＳＶの１０分の１に相当する。対照的に、ＶＳＶ／Ｃ
Ｄ４ＧＳは野生型とほぼ同量（野生型の〜７０ー７５％）のウイルスを産生する
。ＶＳＶーＧの細胞質ドメインの最後の１５アミノ酸を認識しおよび結合する抗
体を用いた、ＣＤ４ーＧおよびＣＤ４ーＧＳウイルスの同等量の免疫ブロット解
析（図９）は、ＣＤ４ーＧＳが切断され、相当するＧステム断片は、全長ＣＤ４
ーＧＳ分子とともに組変え体ＶＳＶビリオンへ編入されることを示す。 様々な細胞種から生産されたＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳの細胞に対する感染能力。
本質的には図８の実験において記載されたような、示された細胞種においてウィ
ルスが生産された。様々な細胞主のＶＳＶによる溶解に対する感受性に依存する
感染後の様々な時点において上清が回収された。上清の一部は感染能力試験に用
いられ、残りは超遠心分離され、ビリオンが沈殿された。各々の細胞種により生
産されたウィルスの量はSDS−PAGE によってタンパク質が分離された後、クマ シーブルーにより染色されたゲルの濃度測定によって決定された。図１０に示さ
れた相対的な感染力は、上清から沈澱化されたウィルスタンパク質に対して標準
化の後の感染能力の量を表す。相対的な感染能力はＩＵ／ｍｌには対応しない。
【００８６】
【表２】
【００８７】 Ｘ４（Ｔ細胞反応性外殻）およびＲ５特異的外殻（マクロファージ反応性外殻
）に対するＶＳＶ／ＣＤ４−Ｑ４２７構築物の感染能力を評価するために、ＢＨ
Ｋ−２４細胞が、５１１アミノ酸Ｇタンパク質のＱ４２７において融合されたＣ
Ｄ４−ＧＳをコードする、野生型Ｇタンパク質の偽型組変えＧ−ＶＳＶによって
感染された。この偽型ウィルスは６０分間吸収され、接種物が除去され、接種物
の残留がないように単層細胞はよく洗浄された。感染された培養物は５％ＦＣＳ
を含む培養液中で１６時間放置された。放置の後に、純粋な組変えＶＳＶ／ＣＤ
４−ＧＳ（Ｑ４２７）ウィルスを含む、感染された培養物由来の培養液が採集さ
れ、剥離した細胞は２５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去された。１
００μｌの上清の一部が示されたＨＩＶ−１外殻タンパク質を発現するＨｅＬａ
細胞に、以下のように感染させるために用いられた。ＨＩＶ−１外殻タンパク質
は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＲｅａｇｅ
ｎｔＰｒｏｇｒａｍによって供給された牛痘ウィルスベクターを用いて発現され
た。発現のためには、無血清培地中で６０分間吸収されることにより、示された
牛痘ウィルスベクターにより、ＨｅＬａ細胞が感染された。接種物は除去され、
５％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌのＡｒａＣ培養液によって置換された。細胞
は３０分間放置され、１００μｌのＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ（Ｑ４２７）上清が培
養液に直接加えられ、培養物は４時間放置されてＨＩＶ−１外殻の発現およびＣ
Ｄ４−ＧＳ（Ｑ４２７）ウィルスの吸収が行われた。４時間後、接種物をを含む
培養液が除かれ、ＡｒａＣおよび血清を含む培養液により置換された。培養物は
さらに１０時間放置され、細胞は３％パラホルムアルデヒドによって固定された
。ＶＳＶヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質を発現している細胞の数を、Ｎ−
特異的モノクローナル抗体を用い、免疫蛍光顕微鏡により検出することで調べる
ことで、感染能力が試験された。
）に対するＶＳＶ／ＣＤ４−Ｑ４２７構築物の感染能力を評価するために、ＢＨ
Ｋ−２４細胞が、５１１アミノ酸Ｇタンパク質のＱ４２７において融合されたＣ
Ｄ４−ＧＳをコードする、野生型Ｇタンパク質の偽型組変えＧ−ＶＳＶによって
感染された。この偽型ウィルスは６０分間吸収され、接種物が除去され、接種物
の残留がないように単層細胞はよく洗浄された。感染された培養物は５％ＦＣＳ
を含む培養液中で１６時間放置された。放置の後に、純粋な組変えＶＳＶ／ＣＤ
４−ＧＳ（Ｑ４２７）ウィルスを含む、感染された培養物由来の培養液が採集さ
れ、剥離した細胞は２５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去された。１
００μｌの上清の一部が示されたＨＩＶ−１外殻タンパク質を発現するＨｅＬａ
細胞に、以下のように感染させるために用いられた。ＨＩＶ−１外殻タンパク質
は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＲｅａｇｅ
ｎｔＰｒｏｇｒａｍによって供給された牛痘ウィルスベクターを用いて発現され
た。発現のためには、無血清培地中で６０分間吸収されることにより、示された
牛痘ウィルスベクターにより、ＨｅＬａ細胞が感染された。接種物は除去され、
５％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌのＡｒａＣ培養液によって置換された。細胞
は３０分間放置され、１００μｌのＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ（Ｑ４２７）上清が培
養液に直接加えられ、培養物は４時間放置されてＨＩＶ−１外殻の発現およびＣ
Ｄ４−ＧＳ（Ｑ４２７）ウィルスの吸収が行われた。４時間後、接種物をを含む
培養液が除かれ、ＡｒａＣおよび血清を含む培養液により置換された。培養物は
さらに１０時間放置され、細胞は３％パラホルムアルデヒドによって固定された
。ＶＳＶヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質を発現している細胞の数を、Ｎ−
特異的モノクローナル抗体を用い、免疫蛍光顕微鏡により検出することで調べる
ことで、感染能力が試験された。
【００８８】 表２のデータはＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳが、Ｔ−およびＭ−反応性ＨＩＶ−１外
殻タンパク質の両方を発現している細胞に感染できることを示す。この感染能力
はケモカイン受容体に依存しない様式で起こる、なぜなら、組変えウィルスは、
ヒトケモカイン受容体を発現していないハムスター細胞株（ＢＨＫ−２１）中で
生産されたからである。感染能力は明らかにＨＩＶ−１外殻タンパク質の発現に
依存する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする組変え牛痘ウィルス（ｖＴＦ７
−３）に感染した細胞または正常なＨｅＬａ細胞（牛痘ウィルスに感染していな
いがＡｒａＣの存在下で生育させられた）はＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ感染に感受性
がない。加えて、解裂していない（例えばｇｐ１６０）融合欠損型突然変異の（
ｖＣＢ−１６により発現された）ＬＡＩ ＩＩＩＢを発現する細胞は、このタン
パク質が細胞表面に発現されていても（データは示されない）、感染に対して感
受性を持たないから、感染能力は機能的なＨＩＶ−１外殻タンパク質（例えばｇ
ｐ１２０−ｇｐ４１）を必要とする。牛痘ベクターはＣ．Ｃ．Ｂｒｏｄｅｒｅｔ
ａｌ．、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２
：９００４−９００８に記載されたものと同様である。
殻タンパク質の両方を発現している細胞に感染できることを示す。この感染能力
はケモカイン受容体に依存しない様式で起こる、なぜなら、組変えウィルスは、
ヒトケモカイン受容体を発現していないハムスター細胞株（ＢＨＫ−２１）中で
生産されたからである。感染能力は明らかにＨＩＶ−１外殻タンパク質の発現に
依存する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする組変え牛痘ウィルス（ｖＴＦ７
−３）に感染した細胞または正常なＨｅＬａ細胞（牛痘ウィルスに感染していな
いがＡｒａＣの存在下で生育させられた）はＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ感染に感受性
がない。加えて、解裂していない（例えばｇｐ１６０）融合欠損型突然変異の（
ｖＣＢ−１６により発現された）ＬＡＩ ＩＩＩＢを発現する細胞は、このタン
パク質が細胞表面に発現されていても（データは示されない）、感染に対して感
受性を持たないから、感染能力は機能的なＨＩＶ−１外殻タンパク質（例えばｇ
ｐ１２０−ｇｐ４１）を必要とする。牛痘ベクターはＣ．Ｃ．Ｂｒｏｄｅｒｅｔ
ａｌ．、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２
：９００４−９００８に記載されたものと同様である。
【００８９】 短縮型のＶＳＶ Ｇタンパク質はＧタンパク質の細胞外ドメインの膜に近接し
た４２アミノ酸、膜貫通ドメインの２０アミノ酸および細胞質側尾部の２９アミ
ノ酸からなる。翻訳と共に小胞体に挿入された後にシグナルペプチダーゼにより
解裂されるＶＳＶ−Ｇタンパク質シグナル配列を含む前駆体から、このタンパク
質は作られる。我々が解析したうち最長のステムは膜に近接する細胞外ドメイン
の５９アミノ酸をもち、（融合活性の増強を示す）最短のものは細胞外ドメイン
の２９アミノ酸を持つ。
た４２アミノ酸、膜貫通ドメインの２０アミノ酸および細胞質側尾部の２９アミ
ノ酸からなる。翻訳と共に小胞体に挿入された後にシグナルペプチダーゼにより
解裂されるＶＳＶ−Ｇタンパク質シグナル配列を含む前駆体から、このタンパク
質は作られる。我々が解析したうち最長のステムは膜に近接する細胞外ドメイン
の５９アミノ酸をもち、（融合活性の増強を示す）最短のものは細胞外ドメイン
の２９アミノ酸を持つ。
【００９０】 膜に結合されたＧステムは、様々なウィルスヘテロ融合タンパク質の融合活性
を増強するように見える。これはＴ−およびＭ−反応性ウィルスの両方由来のＨ
ＩＶ−１ ｇｐ１２０−ｇｐ４１、パラミキソウィルス ＳＶ５のＦタンパク質
、およびＶＳＶのＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ セロタイプ糖タンパク質の融合活性を
含む。我々は、これらの融合タンパク質により形成された融合孔をステムが何ら
かの方法で安定化させることで増強すると仮定する。融合孔の存在は普通、これ
らのタンパク質の全体の融合活性を明確に示す他の補因子の存在を必要とする。
ＨＩＶ−１外殻タンパク質の場合は、補因子はケモカイン共受容体であり、パラ
ミキソウィルスのＦタンパク質についてはその同族のＨＮタンパク質であり、Ｖ
ＳＶＧタンパク質については酸性ｐＨによる活性化である。
を増強するように見える。これはＴ−およびＭ−反応性ウィルスの両方由来のＨ
ＩＶ−１ ｇｐ１２０−ｇｐ４１、パラミキソウィルス ＳＶ５のＦタンパク質
、およびＶＳＶのＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ セロタイプ糖タンパク質の融合活性を
含む。我々は、これらの融合タンパク質により形成された融合孔をステムが何ら
かの方法で安定化させることで増強すると仮定する。融合孔の存在は普通、これ
らのタンパク質の全体の融合活性を明確に示す他の補因子の存在を必要とする。
ＨＩＶ−１外殻タンパク質の場合は、補因子はケモカイン共受容体であり、パラ
ミキソウィルスのＦタンパク質についてはその同族のＨＮタンパク質であり、Ｖ
ＳＶＧタンパク質については酸性ｐＨによる活性化である。
【００９１】 後の議論および実施例は、単に望ましい態様の詳細な記載を提示するものであ
ると理解されるべきである。当該技術分野において通常の技能を有する者にとっ
て、本発明の精神および展望から離れることなく、多様な修飾および等価物が作
製され得ることは明らかである。上記に論じられたまたは引用された全ての特許
、雑誌記事およびその他の事項は、その全体が参考文献として本明細書に含まれ
る。この申請書はその全体が本明細書に参考文献として含まれる、１９９７年１
２月２２日に提出されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｓｅｒｉａｌ 番号６０／０６８、４７２からの優先権を主張する。
ると理解されるべきである。当該技術分野において通常の技能を有する者にとっ
て、本発明の精神および展望から離れることなく、多様な修飾および等価物が作
製され得ることは明らかである。上記に論じられたまたは引用された全ての特許
、雑誌記事およびその他の事項は、その全体が参考文献として本明細書に含まれ
る。この申請書はその全体が本明細書に参考文献として含まれる、１９９７年１
２月２２日に提出されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｓｅｒｉａｌ 番号６０／０６８、４７２からの優先権を主張する。
【図１ＡおよびＢ】 粒子産生の定量化およびウエスタンブロット解析による
糖タンパク質の取り込み。
糖タンパク質の取り込み。
【図２ＡおよびＢ】 ｗｔ−ＶＳＶ，ＣＴ−１およびΔＧウイルスの出芽の図
式化。
式化。
【図３】 ＲｅｓＧＰのＶＳＶ粒子への取り込み。
【図４】 組変えＶＳＶによる感染直後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発
現。ＶＳＶ ΔＧ* −Ｇ、ＶＳＶ ΔＧ* −ＲｅｓＧＰまたはＶＳＶ ΔＧ* を
ベロ細胞に感染させ、感染から１２時間後に蛍光顕微鏡下で観察した。
現。ＶＳＶ ΔＧ* −Ｇ、ＶＳＶ ΔＧ* −ＲｅｓＧＰまたはＶＳＶ ΔＧ* を
ベロ細胞に感染させ、感染から１２時間後に蛍光顕微鏡下で観察した。
【図５】 感染性組変えＶＳＶのプラスミドからの回収法を示した図。感染性
粒子の回収は、１０６個のＢＨＫ−２１細胞をｖＴＦ７−３により６０分間感染
させ、次に細胞を様々な全長のＶＳＶ構築物をコードする１０μｇのプラスミド
、ＶＳＶｉｎｄヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、
およびポリメラーゼ（Ｌ）をコードする、各々３μｇ、５μｇ、および１μｇの
プラスミドによりトランスフェクションさせる。ウイルス粒子の複製および構築
のために細胞を二日間保温する。細胞の上清を新鮮なＢＨＫ細胞の上に直接乗せ
、ウイルス複製を起こすために細胞を２４時間保温する。ワクシニアウイルスを
除去するために、これらの培養から回収した上清を０．２μ濾紙（Ｍｉｌｌｅｘ
−ＧＳ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通過させ、１ｍｌの濾過上清を新鮮なＢＨＫ
の上に乗せる。１時間の吸収の後、上清をＤＭＥＭ−ＦＣＳで置換する。細胞壊
死効果（ＣＰＥ）を示す培養培地を取り出し、ウイルスをプラーク精製する。ウ
イルスの保存液は、引き続き１０７個の細胞をおよそ１０５プラーク形成単位（
ｐ．ｆ．ｕ．）のプラーク単離物に感染させることによって調製する。これらの
培養から得た上清を以降の全ての感染に使用する。回収したウイルスがプラスミ
ドに由来することを確認するために、各々の回収されたウイルスから単離したウ
イルスＲＮＡの直接配列決定を実行する（実施例１を参照せよ）。
粒子の回収は、１０６個のＢＨＫ−２１細胞をｖＴＦ７−３により６０分間感染
させ、次に細胞を様々な全長のＶＳＶ構築物をコードする１０μｇのプラスミド
、ＶＳＶｉｎｄヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、
およびポリメラーゼ（Ｌ）をコードする、各々３μｇ、５μｇ、および１μｇの
プラスミドによりトランスフェクションさせる。ウイルス粒子の複製および構築
のために細胞を二日間保温する。細胞の上清を新鮮なＢＨＫ細胞の上に直接乗せ
、ウイルス複製を起こすために細胞を２４時間保温する。ワクシニアウイルスを
除去するために、これらの培養から回収した上清を０．２μ濾紙（Ｍｉｌｌｅｘ
−ＧＳ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通過させ、１ｍｌの濾過上清を新鮮なＢＨＫ
の上に乗せる。１時間の吸収の後、上清をＤＭＥＭ−ＦＣＳで置換する。細胞壊
死効果（ＣＰＥ）を示す培養培地を取り出し、ウイルスをプラーク精製する。ウ
イルスの保存液は、引き続き１０７個の細胞をおよそ１０５プラーク形成単位（
ｐ．ｆ．ｕ．）のプラーク単離物に感染させることによって調製する。これらの
培養から得た上清を以降の全ての感染に使用する。回収したウイルスがプラスミ
ドに由来することを確認するために、各々の回収されたウイルスから単離したウ
イルスＲＮＡの直接配列決定を実行する（実施例１を参照せよ）。
【図６】 ΔＧ−ＧＦＰ感染細胞におけるＧＦＰ発現の経時変化およびＳＶ５
Ｆタンパク質により偽型化した組変えＣＤ４−ＶＳＶの、ＨＩＶ ｇｐ１６０
発現細胞への感染性。
Ｆタンパク質により偽型化した組変えＣＤ４−ＶＳＶの、ＨＩＶ ｇｐ１６０
発現細胞への感染性。
【図７】 ＳＶ５ Ｆタンパク質により偽型化した組変えＣＤ４−ＶＳＶの、
ＨＩＶ ｇｐ１６０発現細胞への感染性。
ＨＩＶ ｇｐ１６０発現細胞への感染性。
【図８】 ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染性。右側の列は位相差顕微鏡下の細
胞を示す。左側の列は、免疫蛍光顕微鏡下で抗ＶＳＶ Ｎタンパク質抗体を用い
て検出されたＶＳＶ−ＣＤ４組変え体感染細胞を示す。上段の図はＶＳＶＣＤ４
−Ｇに曝された細胞である。中段の図はＶＳＶ／ＣＤ４−Ｑ４２７組変え体に曝
されている細胞である。下段の図はＶＳＶ／ＨＡＧＳ／ＣＤ４−Ｇに曝されてい
る細胞である。
胞を示す。左側の列は、免疫蛍光顕微鏡下で抗ＶＳＶ Ｎタンパク質抗体を用い
て検出されたＶＳＶ−ＣＤ４組変え体感染細胞を示す。上段の図はＶＳＶＣＤ４
−Ｇに曝された細胞である。中段の図はＶＳＶ／ＣＤ４−Ｑ４２７組変え体に曝
されている細胞である。下段の図はＶＳＶ／ＨＡＧＳ／ＣＤ４−Ｇに曝されてい
る細胞である。
【図９】 ウイルス産生およびＧ−ステムの取り込み。左側の図は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびクマシーブルーにより染色した様々な組変えＶＳＶ構築物のタン
パク質を示す。右側の図は、ＶＳＶ Ｇタンパク質の細胞質ドメインを認識する
抗体を用いてＧタンパク質を検出したウエスタンブロット解析である。それゆえ
に、Ｇ ステム、異種タンパク質ＣＤ４−ＧおよびＣＤ４−ＧＳが本抗体により
すべて検出される。
ＰＡＧＥおよびクマシーブルーにより染色した様々な組変えＶＳＶ構築物のタン
パク質を示す。右側の図は、ＶＳＶ Ｇタンパク質の細胞質ドメインを認識する
抗体を用いてＧタンパク質を検出したウエスタンブロット解析である。それゆえ
に、Ｇ ステム、異種タンパク質ＣＤ４−ＧおよびＣＤ４−ＧＳが本抗体により
すべて検出される。
【図１０】 ＨＸＢ２細胞の感染のための様々な株化細胞から作製したＶＳＶ
／ＣＤ４−ＧＳウイルス粒子の感染性。ＣＤ４−Ｑ４２７およびＣＤ４−Ｇ組変
え体の感染性はＢＨＫ、ＨｅＬａ（Ｈｅｌａ）、Ｄ−１７、ＱＴ−６、Ｌおよび
Ｓｆ９細胞において試験した。相対感染性は、ＶＳＶ Ｇタンパク質全体を発現
するＣＤ４−Ｇ構築物における値よりもＧ ステム構築物（例えば、ＣＤ４−Ｑ
４２７）に対する値の方がより高かった。
／ＣＤ４−ＧＳウイルス粒子の感染性。ＣＤ４−Ｑ４２７およびＣＤ４−Ｇ組変
え体の感染性はＢＨＫ、ＨｅＬａ（Ｈｅｌａ）、Ｄ−１７、ＱＴ−６、Ｌおよび
Ｓｆ９細胞において試験した。相対感染性は、ＶＳＶ Ｇタンパク質全体を発現
するＣＤ４−Ｇ構築物における値よりもＧ ステム構築物（例えば、ＣＤ４−Ｑ
４２７）に対する値の方がより高かった。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２日（２００１．３．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/115 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 GA18 HA17 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA01 BA25 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 NA14 ZA892 ZB262 ZB332 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZA89 ZB26 ZB33 4H045 AA10 AA30 BA50 CA01 DA76 EA28 EA51 FA74
Claims (31)
- 【請求項１】 ラブドウィルスの標的細胞膜に対する融合を可能にするのに効果的な、異種Ｆ
タンパク質またはそのポリペプチド断片およびラブドウィルスＮ、Ｐ、およびＬ
タンパク質を含む、遺伝的に操作されたラブドウィルス。 - 【請求項２】 さらにラブドウィルスＭタンパク質を含む、請求項１の遺伝的に操作されたラ
ブドウィルス。 - 【請求項３】 さらにラブドウィルスＧステムポリペプチドを含む、請求項１および２のいず
れかの遺伝的に操作されたラブドウィルス。 - 【請求項４】 さらに抗受容体タンパク質を含む、請求項３の遺伝的に操作されたラブドウィ
ルス。 - 【請求項５】 Ｇステムポリペプチドおよび抗受容体タンパク質が共通のｃＤＮＡ配列から発
現される、請求項４の組変えラブドウィルス。 - 【請求項６】 Ｆタンパク質がパラミキソウィルス株ＳＶ５の融合タンパク質である、請求項
１および２のいずれかの組変えラブドウィルス。 - 【請求項７】 ＧステムポリペプチドがＶＳＶ Ｇステムポリペプチドである、請求項３の組
変えラブドウィルス。 - 【請求項８】 ＶＳＶ Ｇステムポリペプチドが 404Ｇｌｙおよび４４０ｐｈｅの間の任意の
残基から始まり、およそ 511Ａｒｇまで続くＶＳＶIND ポリペプチド断片を含む
、請求項７の組変えラブドウィルス。 - 【請求項９】 （Ａ）ラブドウィルスＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを
適切な細胞に挿入する； （Ｂ）少なくともラブドウィルスの複製のためのｃｉｓ作用シグナルを含む３
’および５’ラブドウィルスのリーダーおよびトレーラー領域、Ｎ、Ｐ、Ｍおよ
びＬラブドウィルスタンパク質をコードする遺伝子群および、Ｆタンパク質また
はそのポリペプチド断片をコードする遺伝子を含む、ラブドウィルスゲノムのポ
リシストロニックｃＤＮＡコピーを適切な細胞に挿入する； （Ｃ）組変えラブドウィルスの生産を可能にする条件下で細胞を培養する； （Ｄ）前述の組変えラブドウィルスを単離する；段階を含む、ラブドウィルス
の細胞膜への融合を可能にするために有効なＦタンパク質またはその断片を発現
する組変えラブドウィルスを生産する方法。 - 【請求項１０】 ポリシストロニックｃＤＮＡがさらに、組変えラブドウィルスが細胞を標的と
するのに効果的な、抗受容体タンパク質またはそのポリペプチド断片をコードす
る遺伝子を含む、請求項９の方法。 - 【請求項１１】 抗受容体タンパク質がＣＤ４、ＣＤ４誘導体、および細胞膜上に発現されたＴ
ＡＡを認識する抗体または抗体断片からなる群から選択される請求項１０の方法
。 - 【請求項１２】 ポリシストロニックｃＤＮＡがさらにＧステムポリペプチドをコードする遺伝
子を含む請求項９の方法。 - 【請求項１３】 組変えラブドウィルスがＶＳＶである、請求項９の方法。
- 【請求項１４】 Ｆタンパク質がパラミキソウィルス株ＳＶ５Ｆタンパク質である請求項９の方
法。 - 【請求項１５】 （Ａ）少なくともラブドウィルスの複製のためのｃｉｓ作用シグナルを含む３
’および５’ラブドウィルスリーダー、およびトレーラー領域を、ラブドウィル
スＮ、Ｐ、およびＬタンパク質をコードする遺伝子および、Ｆタンパク質または
そのポリペプチド断片をコードする遺伝子含むポリシストロニックｃＤＮＡを適
切な細胞に挿入する； （Ｂ）ラブドウィルスの複製のためのｃｉｓ作用シグナルおよび少なくともラ
ブドウィルスＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を含むミニウィルスによ
り細胞を感染させる； （Ｃ）ｃＤＮＡの発現を可能にし、組変えウィルスを生産させる条件下で細胞
を培養する； （Ｄ）前述の組変えラブドウィルスを単離する段階を含む、ラブドウィルスの
細胞膜への融合を可能にするのに効果的なＦタンパク質またはそのポリペプチド
断片を発現する組変えラブドウィルスを生産する方法。 - 【請求項１６】 組変えラブドウィルスがＶＳＶである請求項１５の方法。
- 【請求項１７】 Ｆタンパク質がパラミキソウィルス株ＳＶ５Ｆタンパク質またはそのポリペプ
チド断片である、請求項１６の方法。 - 【請求項１８】 ポリシストロニックｃＤＮＡまたはミニウィルスがさらに抗受容体タンパク質
をコードするｃＤＮＡを含む、請求項９または１５のいずれかの方法。 - 【請求項１９】 ポリシストロニックｃＤＮＡまたはミニウィルスがさらにレポータータンパク
質をコードするｃＤＮＡを含む、請求項９または１５のいずれかの方法。 - 【請求項２０】 遺伝的に操作されたラブドウィルスのウィルス外殻が標的細胞の細胞膜に融合
する条件下で、請求項４の遺伝的に操作されたラブドウィルスを標的細胞に接触
させる段階を含む、標的細胞を遺伝的に操作されたラブドウィルスに融合する方
法。 - 【請求項２１】 標的細胞がＨＩＶ−１感染細胞であり、抗受容体タンパク質がＣＤ４またはＣ
Ｄ４誘導体である、請求項２０の方法。 - 【請求項２２】 抗受容体がウィルス、寄生虫、または細菌により感染した細胞の表面に発現し
たウィルス、寄生虫、または細菌タンパク質に結合するのに効果的な量の請求項
４の遺伝的に操作されたラブドウィルスを患者に投与する段階を含む、ウィルス
、寄生虫または細菌感染を患った患者を治療する方法。 - 【請求項２３】 抗受容体が疾患に関連する、または疾患を持つ細胞の表面に発現するタンパク
質に結合するのに効果的な量の請求項１から４のいずれかの組変えラブドウィル
スを、患者に投与する過程を含む、疾患を持つ患者を治療する方法。 - 【請求項２４】 疾患を持つ細胞または組織が、腫瘍細胞、前腫瘍細胞、良性腫瘍、ポリープ、
カフェオレ斑、白斑、および皮膚母斑からなる群から選択される、請求項２３の
方法。 - 【請求項２５】 （Ａ）少なくともラブドウィルスの複製のためのｃｉｓ作用シグナルを含む３
’および５’ラブドウィルスリーダーおよびトレーラー領域、Ｎ、Ｐ、およびＬ
タンパク質を含むラブドウィルス遺伝子群、Ｆタンパク質候補および非ラブドウ
ィルスタンパク質を含む、第一のポリシストロニックｃＤＮＡを適切な細胞に挿
入する； （Ｂ）ラブドウィルスの複製のためのｃｉｓ作用シグナルおよびレポータータ
ンパク質をコードする第二のｃＤＮＡを含むミニウィルスを細胞に感染させる； （Ｃ）第一のｃＤＮＡおよびミニウィルスの複製による組変えラブドウィルス
の生産を可能にする条件下で細胞を培養する； （Ｄ）前述の組変えラブドウィルスを単離する； （Ｅ）前述の組変えラブドウィルスによる感染を可能にする条件下で、単離さ
れたラブドウィルスを感染していない細胞に接触させる； および、 （Ｆ）レポータータンパク質が発現しているかどうかを決定する段階を含む、
Ｆタンパク質を同定する方法。 - 【請求項２６】 組変えラブドウィルスがＶＳＶである請求項２５のＦタンパク質を同定する方
法。 - 【請求項２７】 Ｆタンパク質を発現し、疾患または異常細胞に感染することができる組変えラ
ブドウィルスを含む、疾患の進行または退行を診断、検出、または決定するため
の診断キット。 - 【請求項２８】 Ｇタンパク質以外の全てのラブドウィルスタンパク質およびＦタンパク質をコ
ードする遺伝子を全体として含む、一つまたはそれ以上のＤＮＡ分子のセット。 - 【請求項２９】 Ｆタンパク質およびラブドウィルスＮ、Ｐ、ＬおよびＭタンパク質をコードす
る遺伝子を全体として含む、一つまたはそれ以上のＤＮＡ分子のセット。 - 【請求項３０】 Ｆタンパク質およびＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＭタンパク質をコードする遺伝
子を全体として含む、一つまたはそれ以上のＤＮＡ分子のセット。 - 【請求項３１】 さらにＧステムポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、請求項２８、２９ま
たは３０のいずれかの、一つまたはそれ以上のＤＮＡ分のセット。
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