JP2001520740A - Ｔ細胞媒介疾患の治療の効力を検出又は監視する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩＤＤＭモデルを免疫寛容性担体中のｐ２７７自己抗原で治療すると，ＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトを誘発することが発見された。Ｔ細胞媒介疾患用に提案されたワクチンの効力は，かようなＴＨ１→ＴＨ２のＴ細胞応答のシフトを測定することによって，検出又は監視することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞媒介疾患の治療の効力を検出又は監視する方法発明の技術分野 この発明は，Ｔ細胞媒介疾患，例えば，Ｉ型糖尿病即ちインシュリン依存性糖 尿病（ＩＤＤＭ）としても知られている疾患の治療方法及びその治療の効力を検 出及び／又は監視する方法に関する。発明の背景 Ｉ型糖尿病即ちＩＤＤＭは，膵島中に位置しているインシュリン産生細胞を攻 撃し破壊するＴ細胞によって起こる自己免疫疾患である（ＣａｓｔａｎｏとＥｉ ｓｅｎｂａｒｔｈの１９９０年の報告）。最終的に，ＩＤＤＭになる自己免疫プ ロセスは，症状なしで始まり進行する。この疾患は，β−細胞の損失が累積して 残りのβ細胞のインシュリンを供給する容量を超えたときに初めて臨床上発症す る。実のところ，グルコースの恒常性の崩壊と臨床的ＩＤＤＭは，β−細胞の８ ０〜９０％が免疫系によって不活性化された後に初めて発症すると考えられてい る。従って，ＩＤＤＭにかかっていると確認できる患者は，β-細胞の自己免疫 による破壊が進行した段階にある患者に限定される。更に，初期の前臨床糖尿病 を，β−細胞の自己免疫の免疫学的マーカーの検出によって診断することは，自 己免疫プロセスが発症した後しか行うことができない。従って，治療の目標は， すでに十分進行している自己免疫プロセスを排除するのに安全且つ特異的で有効 な方法を見つけることである。 この発明の発明者らは，以前に，ＮＯＤ系のマウス（ヒトＩＤＤＭの忠実なモ デルと考えられている）に発生する自然発症糖尿病を試験することによって上記 問題を研究したことがある（ＣａｓｔａｎｏとＥｉｓｅｎｂａｒｔｈの１９９０ 年の報告）。ＮＯＤ系マウスが糖尿病になるこの自然発症自己免疫プロセスは， 最初，約１ヶ月齢で始まる軽度のインシュリン炎として検出することができる。 大部分の雌のマウスでは，このインシュリン炎が貫通性島内浸潤（ｐｅｎｅｔ− ｒａｔｉｎｇ ｉｎｔｒａ−ｉｓｌｅｔ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）まで進行して ，β−細胞が損傷し，約４〜５ヶ月齢で明白なインシュリン依存性糖尿病が発症 する（Ｂａｃｈの１９９１年の報告）。インシュリン炎は，Ｔ細胞の自己反応性 及び各種の自己抗原に対する自己抗体が関連している（Ｈａｒｒｉｓｏｎの１９ ９２年の報告）。これら自己抗原のうちの一つが，追加の二次自己抗原に対する 自己免疫を活性化するインシュリン炎の一次標的であると考えられている。グル タミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対するＴ細胞の応答は，Ｔ細胞がｈｓ ｐ６０や他の抗原に応答する前に検出可能であることが報告されており（Ｋａｕ ｆｍａｎらの１９９３年の報告；Ｔｉｓｃｈらの１９９３年の報告），そして３ 日齢でＧＡＤを胸腺内注射して投与するか（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報 告）又は３週齢で静脈注射を行うことによって，ｈｓｐ６０をはじめとして他の 自己抗原に対するＴ細胞の反応性が発生するのを阻害され糖尿病が防止されるこ とが発見されている。これらの研究者らは，ＧＡＤに対する自己免疫が糖尿病を もたらす最初の現象であると結論した。しかし，インシュリン炎の過程で早期に ，各種の外観上“非特異的”な処置を適用すると，糖尿病の後期発生（ｌａｔｅ ｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を防止し，又は遅らせることができる（Ｂｏｗｍ ａｎらの１９９４年の報告）。 ＧＡＤ抗原に加えて，ｈｓｐ６０に対する自己免疫が，ＮＯＤ糖尿病において 機能的役割をもっていることが発表されている（ＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９０／ １０４４９号）。ｈｓｐ６０ペプチドのｐ２７７に応答するＴ細胞は，糖尿病を 養子移入することが可能であり，又は弱毒化すれば，マウスに対し糖尿病の予防 接種を行うことができ（Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告），そして自己免疫プ ロセスの早期（Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告）又は非常に後期（Ｅｌｉａｓ らの１９９４年の報告）に，ペプチドｐ２７７を含有する油を皮下に一回投与す ると糖尿病の進行を止めることができる。 ＣＤ４“ヘルパー”型のＴ細胞は，活性化されたときに分泌する独特のサイト カイン類によって二つのグループに分割されている（Ｍｏｓｍａｎｎらの１９８ ９年の報告）。ＴＨ１細胞は，Ｔ細胞の増殖を誘発するＩＬ−２及び組織の炎症 を媒介するＩＦＮγなどのサイトカイン類を分泌し，対照的に，ＴＨ２細 胞はＩＬ−４とＩＬ−１０を分泌する。ＩＬ−４はβ−細胞が特定のＩｇＧアイ ソタイプの抗体を分泌するのを助け，ＴＨ１炎症サイトカインの産生を抑制する （Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕらの１９９４年の報告）。ＩＬ−１０は，マクロファー ジによる抗原提示と炎症サイトカインの産生に作用することによってＴＨ１の活 性化を間接的に阻害する（Ｍｏｏｒｅらの１９９３年の報告）。 油中のペプチドｐ２７７を投与することによるＩＤＤＭにおける自己免疫プロ セスの治療が，いくつもの異なる抗原に対するＴＨ１型自己免疫を抑制し，代わ りにｐ２７７自己免疫を活性化してＴＨ２モードにするこの治療の効果によって 成功することがこの発明者らの研究所によって発見されたのである。従って，自 己反応性のスペクトルを有する疾患は，Ｔ細胞サイトカインのシフトを誘発でき る単一のペプチドで抑制することができる。発明の概要 この発明の目的は，適当な動物モデルで，Ｔ細胞の時間経過の応答におけるＴ Ｈ１細胞からＴＨ２への応答のシフトについて試験することによって，Ｔ細胞媒 介疾患の治療の効力を測定又は監視することである。このことは，ＩｇＧ２ａか らＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂのアイソタイプ抗体への抗体アイソタイプのシフトを検 出するか，又は増大するサイトカイン類がＩＬ−２とＩＦＮγからＩＬ−４とＩ Ｌ−１０へシフトするのを検出することによって達成される。 この発明の他の目的は，ＴＨ１−Ｔ細胞のサイトカイン応答をＴＨ２−Ｔ細胞 サイトカイン応答への最適のシフトについて測定することによって，最適のワク チン投与量とワクチン処方を決定することである。図面の簡単な説明 図１は，ＧＡＤとｈｓｐ６０のペプチドに対するＴ細胞の増殖応答がｐ２７７ で治療することによって特異的に減少することを示すグラフである。右側のパネ ルは，鉱油中に乳化されたペプチド２７７で治療されたＮＯＤマウスを示し，左 側のパネルは，鉱油中に乳化されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で治療したＮＯ Ｄマウスを示す。このグラフの各種のバーは，Ｔ細胞ミトゲンＣｏｎＡ（白 バー），ｐ２７７（垂直縞バー），ＧＡＤｐ３４（水平縞バー）及びＭＴ−ｐ２ ７８（点彩バー）へのそれぞれに対するＴ細胞増殖応答を示す。アステリスクは ，スチューデントのＴ検定法でｐ＜０．０１であることを示す。 図２は，ｐ２７７による治療が，ｐ２７７に対する抗体を誘発し且つＧＡＤ， インシュリン及び無傷のｈｓｐ６０に対する抗体を減少させることを示すグラフ である。右側のパネルは，ＮＯＤマウスを油中ｐ２７７で治療した結果を示し， 左側のパネルはＮＯＤマウスを油中のＰＢＳで治療した対照を示す。グラフのバ ーは，組み換えＧＡＤ６５（点彩バー），組み換えヒトｈｓｐ６０（斜め縞）， ウシインシュリン（白バー）又はペプチドｐ２７７（垂直縞）に対する抗体の発 生率を示す。アステリスクはカイ二乗検定法によってｐ＜０．０１であること示 す。 図３Ａと３Ｂは，ｐ２７７による治療の前後の抗体アイソタイプを示すグラフ である。図３Ａは，治療前のＮＯＤマウスの無傷ｈｓｐ６０（黒丸）又はＧＡＤ （白丸）に対する抗体のアイソタイプを検定した結果を示す。ＢＡＬＢ／Ｃマウ ス由来のの対照の血清は×印で示す。図３Ｂは，治療してから５週間後の，対照 の治療マウス（白丸）又はｐ２７７で治療したマウス（黒丸）のｐ２７７に対す る抗体のアイソタイプの検定結果を示す。各試験のコラムは，同数のマウスから 得た試験結果を示し，丸印の数が見掛け上減少しているのは重なっているためで ある。 図４Ａ〜４Ｄは，ｐ２７７ペプチドで治療する前後のＴ細胞のサイトカインの プロフィルを示すグラフである。３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，油 中ｐ２７７（黒バー）又は油中ＰＢＳ（白バー）で治療した。これらのマウス由 来の脾臓細胞をＣｏｎＡ，ｐ２７７又はＭＴ２７８とともにインキュベートした 結果，誘発された特定のサイトカインの量を示す。図４Ａは，２４時間インキュ ベートした結果，分泌されたＩＬ−２の量を示す。図４Ｂは，４８時間インキュ ベートした結果，分泌されたＩＦＮｒの量を示す。図４Ｃは，４８時間インキュ ベートした結果，分泌されたＩＬ−１０の量を示す。図４Ｄは，２４時間インキ ュベートした結果，分泌されたＩＬ−４の量を示す。アステリスクはスチューデ ントのＴ検定法によってｐ＜０．０１であることを示す。 図５Ａ〜５Ｂは，ｐ２７７／イントラリピド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）ペプチ ドによる治療の前後のＴ細胞のサイカインのプロフィルを示すグラフである。３ ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，イントラリピド中のｐ２７７（黒バー ）又はイントラリピド中のＰＢＳ（白バー）で治療した。これらマウス由来の脾 臓細胞をｐ２７７（図５Ａ）又はＣｏｎＡ（図５Ｂ）とともにインキュベートし た結果，誘発されたＩＬ−２，ＩＦＮγ，ＩＬ−４及びＩＬ−１０の量を示す。 アステリスクはＰ＜０．０１であることを示す。好ましい実施態様の詳細な説明 ＮＯＤマウスは，小島のインシュリン産生β−細胞を攻撃する自己免疫Ｔ細胞 によって起こるＩ型糖尿病を自然発症する。この自己免疫攻撃は，６０ＫＤａの 熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のペプチドとグルタミン酸デカルボキシラ ーゼ（ＧＡＤ）のペプチドを含む各種の自己抗原に対するＴ細胞の反応性に関連 がある。この発明の発明者らの研究所は，ｐ２７７と命名されたｈｓｐ６０のペ プチドが，インシュリン炎が進行して明白な糖尿病が発生した後でさえも，自己 免疫プロセスを抑制又は逆転させるのに利用できることを最近発表した。ここで ，ｐ２７７−ペプチドで治療すると，ｈｓｐ６０とＧＡＤの両者のエピトープに 対する自然発生のＴ細胞増殖応答が下方へ調節されて，ｈｓｐ６０，ＧＡＤ及び インシュリンに対する自己抗体の産生を消失させることが発見されたのである。 上記疾患のプロセスの抑制は，Ｔ細胞の免疫寛容又はアネルギーには関連がなく ，ｐ２７７に反応性の自己免疫Ｔ細胞によって産生されるサイトカイン類のＴＨ １様プロフィル（ＩＬ−２，ＩＦＮγ）からＴＨ２様プロフィル（ＩＬ−４，Ｉ Ｌ−１０）へのシフトに関連している。そのモジュレーションは免疫学的に特異 的である。即ち，治療されたマウスの細菌ｈｓｐ６０ペプチドに対する自然発生 Ｔ細胞応答はＴＨ１モードのままである。従って，いくつもの自己抗原に対する 自己免疫が特徴である糖尿病誘発プロセスは，抗原の一種であるｐ２７７を用い て治療することができる。 自己反応性のスペクトルを有する疾患がＴ細胞サイトカインのシフトを誘発で きる単一のペプチドによって抑制できるという現象の発見によってこの発明が生 まれたものであり，この発明は，破壊的な自己免疫を制御できるペプチドを見つ ける新しい手段を提供し，且つその原理は，あらゆる自己免疫疾患と，Ｔ細胞の 活性，特に，ＴＨ１細胞の活性で媒介される疾患に広く利用できる。 この発明の方法は，すべて，器官特異的自己免疫疾患にはほとんど例外なしに 見られるＴＨ１−Ｔ細胞応答から，時間の経過とともに起こるＴＨ２−Ｔ細胞サ イトカイン応答へのシフトを検出又は監視する。このサイトカインシフトが，予 防接種用ペプチドに対して応答性のＴＨ２細胞の相対的増加を反映しているのか どうか，又はＴＨ１型の抗−抗原細胞のクローンがそのクローンレベルでその挙 動を変えるかどうかは重要でない。出願人はいかなる特定の理論にも限定された くないが，かようなシフトを起こす抗原はＴＨ２細胞の産生を誘発し，このよう な優勢なＴＨ２細胞が産生するサイトカインによって，炎症の発作を起こした既 存のＴＨ１細胞が抑制される可能性が高いと考えられる。 いずれの場合も，自己免疫疾患にかかっている動物に，かようなシフトを起こ す治療法は好ましい治療法である。このような性能の検出，又は所定の自己免疫 疾患に対するかようなペプチドの効果の監視は，自己免疫疾患又は他のＴ細胞媒 介炎症症状，好ましくはヒト自己免疫疾患の容認されている実験室モデルが見ら れる動物に対し，提案された治療法を適用し，次に，治療された動物を，ＴＨ１ −Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトの徴候について試験することに より，この発明に従って容易に達成することができる。 ＴＨ１→ＴＨ２のシフトが存在していることとその程度は，その治療が有効で 且つ有利な応答を誘発した証拠として利用できる。換言すれば，ＴＨ１→ＴＨ２ のシフトは，治療に対する応答の代理マーカーとして利用できる。例えば，この シフトがなければ，第２の治療を行う必要があることを示している。 かような応答シフトのマーカーの例としては，Ｔ細胞によって誘発された抗体 応答の確認，又は，Ｔ細胞によって産生されるサイトカイン類の確認がある。例 えば，ＴＨ１型Ｔ細胞はＩｇＧ２ａクラスの抗体の産生を誘発するが，一方，Ｔ Ｈ２型の抗体はＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂのクラスの抗体の産生を誘発することが知 られている。従って，投与された抗原に対する抗体のアイソタイプについて，治 療の前後に検定することによって，ＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細胞応答 へのシフトの程度を監視することができる。 同様に，ＴＨ１細胞が，Ｔ細胞の増殖を誘発するＩＬ−２及び組織の炎症を媒 介するＩＦＮγのようなサイトカイン類を分泌することが知られている。一方， ＴＨ２細胞は，β−細胞がＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂクラスの抗体を分泌してＴＨ１ 炎症サイトカイン類の産生を抑制するのを助けるＩＬ−４，並びにマクロファー ジによる抗原提示及び免疫サイトカイン産生に作用することによってＴＨ１の活 性化を間接的に阻害するＩＬ−１０を分泌する。従って，治療された動物のＴ細 胞のサイトカインプロフィルの測定値は，ＴＨ１−Ｔ細胞応答からＴＨ２−Ｔ細 胞応答へのシフトの指標にもなる。従って，例えば，治療された動物から脾臓細 胞を取り出し，抗原を投与し，ともにインキュベートしてサイトカイン類の分泌 を誘発することができる。次に，培養物の上澄み液中のサイトカイン類は，例え ば，標準のサイトカインＥＬＩＳＡ法のプロトコルを用いＥＬＩＳＡ法によって 定量することができる。 あらゆる自己免疫疾患又は他のＴ細胞媒介疾患もしくはその症状の治療方法は この発明に従って検出又は監視することができる。これら疾患としては，限定さ れないが，ＩＤＤＭ，多発生硬化症，重症筋無力症，強皮症，多発生筋炎，移植 片宿主相関病，移植片拒否反応，グレーヴス病，アジソン病，自己免疫ユベオレ チニチス（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ），自己免疫甲 状腺炎，尋常性天疱瘡，リウマチ様関節炎，強直性脊椎炎，Ｔ細胞媒介アレルギ ー性応答などがある。しかし，好ましくは，かような疾患は，ＴＨ１細胞が媒介 する疾患である。 多くのこれらの疾患の公知の容認されている動物モデルは容易に入手できる。 これらの動物としては，例えば，糖尿病のモデルとしてのＮＯＤマウス，多発性 硬化症のモデルとして実験的に誘発される実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を 有するマウス，自己免疫甲状腺炎のモデルとして実験的自己免疫甲状腺炎（ＥＡ Ｔ）を有するマウス，リウマチ様関節炎のモデルとしてアジュバント関節炎（Ａ Ａ）を有するマウスなどがある。 推定自己抗原（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ａｕｔｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）を含有する ワクチンは，自己免疫プロセスをそれ以上悪化させることを回避するため，免疫 寛容原性の担体を用いて投与しなければならない。このような担体としては，不 完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）又は完全フロイントアジュバント（ＣＦ Ａ）のような鉱油の担体がある。ＩＦＡは鉱油の乳濁液である。ＣＦＡは，マイ コバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の死菌を各種の量，含有して いる鉱油の製剤である。しかし，ＩＦＡとＣＦＡは，鉱油が代謝不能なので身体 が分解できないからヒトには使用できない。ヒト患者の静脈内栄養補給に永年に わたって使用されてきた特定の脂肪乳濁液が，この発明のペプチドを使用するペ プチド療法の賦形剤としての役割も果たすことができることが最近発見された。 このような乳濁液の２つの例は，イントラリピド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）及び リポフンジン（Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ）として知られている市販の脂肪乳濁液で ある。“イントラリピド”は，静脈内栄養補給用の脂肪乳濁液に対するスウェー デン所在Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の登録商標であり，この乳濁液につい ては米国特許第３１６９０９４号に記載されている。“リポフンジン”は，ドイ ツのＢ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌｓｕｇｅｎの登録商標である。両者ともに脂肪とし て大豆油を含有している（それぞれ１０００ｍｌの蒸留水中１００ｇ又は２００ ｇ即ち１０％又は２０％含有）。イントラリピドの乳化剤としては卵黄のリン脂 質が用いられ（１２ｇ／ｌ蒸留水），リポフンジンの乳化剤としては卵黄のレシ チンが用いられている（１２ｇ／ｌ蒸留水）。グリセリンを添加することによっ て（２５ｇ／ｌ），イントラリピドとリポフンジンの両者に等張性が得られる。 これらの賦形剤は，推定自己抗原と複合体を形成すると，自己免疫Ｔ細胞のＴ Ｈ１→ＴＨ２シフトを促進する。実際に生物学的に活性の担体であると考えられ る。従って，ヒトに使用することがある自己抗原を試験する場合，かような賦形 剤を使用することが好ましい。このような賦形剤として好ましいのは，植物及び ／又は動物が起源のトリグリセリド１０〜２０％，植物及び／又は動物が起源の リン脂質１．２〜２．４％，浸透圧調節剤２．２５〜４．５％及び酸化防止剤０ 〜０．０５％を含有し，滅菌水で１００％にした脂肪乳濁液である。かような賦 形剤としては，イントラリピド又はリポフンジンが最も好ましい。かような賦形 剤を使用することは，この発明の原イスラエル特許願（出願人の引用文献９５ ３６に挙げてある）の出願日と同じ日に，本願と同じ出願人（譲受人）が出願し たイスラエル特許願（出願人の引用文献９５２３に挙げてある）に記載されてお り，この特許願の全内容は本明細書に援用するものである。 しかし，この発明の方法は，使用される補助剤には依存せず，あらゆる抗原− 補助剤の複合体が，この発明によって試験できる。実験的動物モデルの自己抗原 に対するＴ細胞の応答が，この発明の試験法によって測定されたとき，ＴＨ１か らＴＨ２の応答へシフトしていたならば，対応するヒトの疾患を治療する可能性 のある有用な方法が確認されたわけである。 この発明の方法は，治療すべき疾患又は症状の発生機序に関連する炎症ＴＨ１ 細胞が認識する抗原と併用し，又は複合させて投与するとＴＨ１→ＴＨ２シフト を媒介する，生物学的効果を有する免疫寛容性助剤を選別するのにも使用できる 。従って，例えば，ｐ２７７を適当な抗原と併用すると，ＴＨ１→ＴＨ２シフト がこの発明の実施例に開示されている方法で検出できることが分かっている。 ｐ２７７と併用した場合，かようなＴＨ１→ＴＨ２シフトを媒介する性能につい て他の補助剤を選別するため，このような提案された助剤は，本願実施例の鉱油 又はイントラリピドの代わりに用いて，ＴＨ１→ＴＨ２のシフトの存在を判定す ることができる。このようなシフトが見出されたならば，その補助剤は，ＴＨ１ 媒介疾患にかかっている患者を治療するのに用いるワクチン中に，該疾患の発生 機序と関連するＴＨ１細胞が認識する抗原と併用して使用できる生物学的に活性 の免疫寛容性補助剤として分類することができる。この発明の方法を用いて見出 されたかような補助剤は，この発明の一部と見なされる。鉱油又はイントラリピ ドとともに投与すると，ＴＨ１→ＴＨ２シフトを媒介することが分かっている他 の抗原も，この試験のために使用することができる。 前記シフトは，ワクチンを投与した後，例えば，２〜１２週間にわたって測定 されなければならない。治療の効力は，関連するＴＨ１→ＴＨ２サイトカイン応 答について定期的に試験することによって，一層長期間にわたって監視できる。 抗体のアイソタイプや各種のサイトカイン類の存在をそれぞれ検定する具体的 な方法は，それ自体，この発明の新規な部分ではない。抗体のアイソタイプ又は ＴＨ１とＴＨ２のＴ細胞が産生する各種サイトカインを検定する各種の方法は， 当該技術分野の当業者がよく知っている方法である。このような方法は，ＴＨ１ からＴＨ２へのシフトを検出するこの発明の過程で使用できる。本明細書で提供 する諸実施例は，この発明を実施する実施例を開示するが，この発明をそれに限 定されるものではない。例えば，脾臓細胞を用いずに，末梢循環Ｔ細胞を患者か ら入手してサイトカインの応答を試験してもよい。 〔実施例〕実施例１ ＧＡＤとｈｓｐ６０のペプチドに対する自然発生Ｔ細胞増殖応答のｐ２７７療 法による特異的な減少 この実験は，ｐ２７７療法による自己免疫プロセスの治癒に関連する免疫学的 機序を決定するために行った。進行したインシュリン炎にかかっている１２週齢 の雌のＮＯＤ／Ｌｔマウス１３３頭（Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告）を，Ｅ ｌｉａｓらの１９９４年の報告に記載されているように，鉱油（米国ミシガン州 デトロイト所在のＤｉｆｃｏ社から購入したＩＦＡ）中に乳化したｐ２７７（８ １頭のマウス）又は鉱油中に乳化した対照のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（５２ 頭のマウス）で治療した。対照の治療を行ったマウスのほとんどすべてが糖尿病 を発症し（９２％），２５週齢でほとんどが抑制されていない高血糖症で死んだ （５８％）（Ｅ１ｉａｓらの１９９４年の報告）。対照的にｐ２７７で治療した マウスは，２８％だけが糖尿病を発症し，死んだのは１７％に過ぎなかった（ｐ ＜０．０１）。１７週齢（治療してから５週間後）で平行群のマウスから脾臓細 胞を採取し試験して，ｈｓｐ６０のペプチドｐ２７７（１０μｇ／ｍｌ），ＧＡ Ｄのペプチドｐ３４（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報告）（１０μｇ／ｍｌ ），又はマイコバクテリアのｈｓｐ６０のペプチドＭＴ−ｐ２７８（１０μｇ／ ｍｌ）に対する該脾臓細胞のＴ細胞増殖応答を，標準の検定法（Ｅｌｉａｓらの １９９１年の報告）を用いて生体外で検定した。 この発明の発明者らの研究室のＮＯＤマウスはペプチドＭＴ−ｐ２７８に対す る自然発生Ｔ細胞反応性を示すので，このペプチドは便利なＴ細胞特異性の対照 として利用できる。また，Ｔ細胞培養物はＴ細胞ミトゲンＣｏｎＡ（１．２５ μｇ／ｍｌ）で活性化された。 これらのペプチドは，Ｅｌｉａｓらの１９９４年の報告に記載されているよう に自動ＡＢＩＭＥＤ合成機（ドイツ）を用い標準Ｆｍｏｃで合成した。これらペ プチドを逆相ＨＰＬＣで精製し，アミノ酸を分析することによってその組成を確 認した。ＧＡＤペプチド３４の配列（残基５０９〜５２８；ＧＡＤｐ３４）は， Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ− Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号：１）であった（Ｋａｕｆｍａｎらの１９９３年の報 告）。ＭＴ−ｐ２７８の配列は，Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔ ｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（配列番号：２）であった。本明細書に報告されたすベて の実験に使用されたｐ２７７の配列は，Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌ ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌ ｕ−Ａｓｐ（配列番号：３）であった。 このペプチドは，６位と１１位が，未変性配列のシステイン（Ｃｙｓ）の代わ りにバリン（Ｖａｌ）で置換されている。上記２つのＣｙｓ残基がＶａｌで置換 されたことによって，その免疫活性に影響することなしに該ペプチドの安定性が 著しく増強される。Ｖａｌで置換されたペプチドは，Ｔ細胞と抗体の検定法によ ってその未変性のペプチドと完全に交差反応性であるので療法のペプチドは糖尿 病に対して同じ治療効果を有している（１９９４年１２月２１日に出願されたイ スラエル特許願第１１２，０９１号，及びこの発明の原イスラエル特許願（出願 人の引用文献９５３６として挙げてある）の出願日と同じ日に出願された別のイ スラエル特許願（出願人の引用文献９４５１Ａとして挙げてある）参照。なお， これらの両出願は全体を本明細書に援用するものである）。本明細書で示すすベ ての効果はｐ２７７の変異体でも再現されている。 培養３日目の最後の１８時間で，４個の培養物のウェルに〔³Ｈ〕チミジンを 添加して組み込むことによってＴ細胞応答を検出した。刺激指数（ＳＩ）を，抗 原を含有するウェル：抗原又はＣｏｎＡなしで培養した対照のウェルのｃｐｍ平 均値の比率として算出した。ｃｐｍ平均値からの標準偏差は常に１０％未満であ った。抗原なしの場合のバックグラウンドのｃｐｍは８００〜１５００ｃｐｍで あった。 図１に示す結果は，油中ＰＢＳの乳濁液を注射した対照のＮＯＤマウスは，３ 種のペプチドすべてとＣｏｎＡに対して自然発生反応性を明示したことを示して いる。未治療の対照のマウスは類似の自然発生Ｔ細胞反応性を明示した（図示せ ず）。対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ｈｓｐ６０とＧＡＤのペプチド に対する該マウスの自己免疫Ｔ細胞増殖応答が特異的に低下することを示したが ，ＭＴ−２７８とＣｏｎＡに対するコントロール応答は元のままであった。従っ て，ｈｓｐ６０のペプチドｐ２７７で治療すると，糖尿病の進行が阻止されるが ，これはｈｓｐ６０とＧＡＤのペプチドの両者に対するＴ細胞応答が特異的に減 少したことが関連していたのである。しかし自己反応性のこの低下は，ある種の 他の機序とは対照的にＴ細胞の免疫寛容とアネルギーが原因である可能性を否定 できない。実施例２ ｐ２７７で治療した後の，ｐ２７７に対する抗体の誘発，並びにＧＡＤ，イン シュリン及び無傷のｈｓｐ６０に対する抗体の減少 Ｔ細胞の反応性に加えて，ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生も，例えば，ｈ ｓｐ６０（Ｅｌｉａｓらの１９９０年の報告），ＧＡＤ（Ｔｉｓｃｈらの１９９ ３年の報告）及びインシュリン（Ｅｌｉａｓらの１９９０年の報告）などの自己 抗原に対する自己抗体の自然出現と関連があった。この実施例では，かような抗 体類の発生に対するｐ２７７による治療の効果を試験する。 ３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群と，実施例１に記載したようにして， 油中ｐ２７７又は油中ＰＢＳで治療した。５週間後，これらマウスから個々に血 液を採取し，その血清を１：５０の比率で希釈して，組換えＧＡＤ６５（Ｋａｕ ｆｍａｎらの１９９３年の報告），組換えヒトｈｓｐ６０（Ｅｌｉａｓらの１９ ９１年の報告），ウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ社），又はペプチドｐ２７７そ れぞれに対する抗体について，Ｅｌｉａｓらの１９９１年の報告に記載されてい るようにしてＥＬＩＳＡ検定法で試験した。簡単に述べると，各種の 抗原１０μｇを検定プレートに塗布して（ｐ２７７が結合するのに適しているの でＭａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃプレートを使用した）試験血清とともにインキュ ベートした。粘着抗原に対する抗体の結合は，アルカリ性ホスファターゼを接合 した抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（米国ペンシルベニア州ウエストグローブ所在のＪ ａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社） を用いて検出した。抗体の有意な量はＯＤ４０５ｎｍの読取り値が０．２５１よ り大きい量と定義した。この値は，１０頭の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの血清に ついて得られたＥＬＩＳＡ法読取り値の平均値より３ＳＤ値だけ大きい値である 。試験結果は，各種抗原に対する抗体について陽性のマウスの発生率として図２ に示す。実際のＯＤ４０５ｎｍの読取り値は図３に示してある。 図２は，対照治療及びｐ２７７による治療の群におけるこれら自己抗体を有す るマウスの発生率を示す。対照治療がなされたＮＯＤマウスは，ＧＡＤ（８０％ ）とｈｓｐ６０（９０％）に対する抗体の高い発生率を示し，抗インシュリン抗 体（５０％）の中位の発生率を示したがペプチドｐ２７７に対する抗体は全くな いことが分かる。類似の結果が未治療の対照マウスで得られた（図示せず）。こ れとは対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ＧＡＤ，ｈｓｐ６０及びインシ ュリンに対する自己抗体の発生率が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。従って， 自己免疫糖尿病誘発プロセスのｐ２７７ペプチド療法は，ｈｓｐ６０とＧＡＤの タンパク質に対する自然発生Ｔ細胞増殖が特異的に低下することと，ＧＡＤ，ｈ ｓｐ６０及びインシュリンの分子に対する自己抗体が消失することが特徴である 。しかしｐ２７７に対するＴ細胞の免疫寛容又はアネルギーはこのような自己免 疫の低下の原因ではない。というのは，ｐ２７７で治療されたマウスが，ｐ２７ ７に対する抗体の発生率の著しい増大（８０％）を示した（ｐ＜０．０１）から である。ｐ２７７療法が抗体に対するＴ細胞の増殖からｐ２７７に対する反応性 への切換えに関連していることは，その治療効果が，治療されたマウス中で自己 免疫Ｔ細胞が産生する支配的なサイトカイン類のシフトによってもたらされるこ とを示唆している。実施例３ ｐ２７７による治療の前後に産生される抗体のアイソタイプの分析 ＴＨ１からＴＨ２様挙動へのシフトの起こる可能性が，ｐ２７７による治療の 前後に産生される抗体のアイソタイプを分析することによって裏付けられた。図 ３Ａは，ｐ２７７による治療を行う前に存在するＧＡＤと無傷のｈｓｐ６０に対 する自然発生自己抗体が，ＩｇＧ２ａのクラスの抗体で且つＩＦＮγを分泌する ＴＨ１タイプのＴ細胞に依存する抗体（ＳｎａｐｐｅｒとＭｏｎｄの１９９３年 の報告）であることを示している。これらのＩｇＧ２ａの自己抗体は，ｐ２７７ による治療後５週間以内に消失した。これとは対照的に，治療後に発生する抗ｐ ２７７抗体の抗体アイソタイプを分析したところ，これら抗体アイソタイプが， もっぱらＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂのクラスのものであり，ＩＬ−４を産生するＴＨ １−Ｔ細胞（ＳｎａｐｐｅｒとＭｏｎｄの１９９３年の報告）及びおそらくはＴ ＧＦβ（Ｓｎａｐｐｅｒらの１９９３年の報告）に依存していることが分かった 。ｐ２７７による治療によって誘発されるＴＨ１型のＩｇＧ２ａの抗体は全くな かった（図３Ｂ）。実施例４ ペプチドｐ２７７による治療の前後でのサイトカインプロフィルの測定 サイトカイン切り換えの概念を確認するため，ｐ２７７で治療したマウス及び 対照のマウス中の，ｐ２７７とＭＴ−ｐ２７８のペプチドに対して反応性のＴ細 胞が産生したサイトカイン類を検定した。３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの 群を，油中ｐ２７７又は油中ＰＢＳで治療した（実施例１参照）。３週間後，こ れらマウスの脾臓を取り出して脾臓細胞を集めた。これら脾臓細胞を３組ずつ， ＣｏｎＡ，ｐ２７７又はＭＴ−ｐ２７８とともに，２４時間（ＩＬ−２とＩＬ− ４の分泌のため）又は４８時間（ＩＬ−１０とＩＦＮγの分泌のため）インキュ ベートした。培養物の上澄み液中のサイトカイン類の存在を，Ｐｈａｒｍｉｎ− ｇｅｎのサイトカインＥＬＩＳＡのプロトコルに従いＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのペ アード抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で定量した。Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの組換えマ ウスサイトカイン類を，校正曲線用の標準として使用した。簡単に述べると，平 底９６−ウェルの微量滴定プレートを，ラット抗マウスサイトカインｍＡｂｓで コートし，４℃で１８時間後に，上記培養物の上澄み液即ち組換えマウスのサイ トカイン類を添加し，４℃で１８時間後にプレートを洗浄した。次に，ビオチニ ル化ラット抗マウスサイトカインｍＡｂを添加し，室温で４５分後，十分に洗浄 してアビジン−アルカリ性ホスファターゼを添加した。３０分後，プレートを洗 浄し，色素原基質を添加して試料をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍにおいて読 み取りを行った。サイトカイン類の濃度は，標準として組換えサイトカイン類を 使用し校正曲線から得た単位／ｍｌの平均値として示してある。試験結果を図４ Ａ〜４Ｄに示す。 図４Ａと４Ｂは，対照マウスの脾臓細胞が，ｐ２７７，ＭＴ−ｐ２７８又はＴ 細胞ミトゲンＣｏｎＡのいずれか一方で培養された時に，ＩＬ−２とＩＦＮγの 両者を分泌したことを示している。対照的に，ｐ２７７で治療したマウスは，ペ プチドｐ２７７とのインキュベーションに応答して，有意に少ない量（ｐ＜０． ０１）のＩＬ−２とＩＦＮγを産生した。ＴＨ１サイトカイン類のこの減少は特 異的であり，ｐ２７７で治療したマウスは，ＭＴ−ｐ２７８に対するそれらのＩ Ｌ−２とＴＦＮγのサイトカイン応答を維持した。 図４Ｃと４Ｄは，マウスの脾臓細胞が産生したＩＬ−１０とＩＬ−４の量を示 す。対象のマウスは，ｐ２７７，ＭＴ−ｐ２７８又はＣｏｎＡに応答してＩＬ− ４をほとんど産生せず，そして，ｐ２７７に応答してＩＬ−１０をごく少量産生 した。対照的に，ｐ２７７にのみ応答し且つｐ２７７で治療したマウスにのみＩ Ｌ−１０とＩＬ−４が有意に増大した（ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１０(５ＩＬ− ４の増加とあいまってＩＬ−２とＩＦＮγが減少することは，ＴＨ１様挙動から ＴＨ２様挙動へのシフトを裏付けている。このようなシフトは，ｐ２７７に対す るＴ細胞の増殖の減少及びｐ２７７に対するＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂの抗体の出現 の両者を説明できる。従って，ｐ２７７ペプチド療法の有利な効果は，自己免疫 応答を不活性化することによっては起こらず，自己免疫を活性化して異なるサイ トカイン挙動モードにすることによって起こる（Ｃｏｈｅｎの１９９５年の報告 ；Ｌｉｂｌａｕらの１９９５年の報告）。実施例５ 脂質乳濁液中のｐ２７７を用いるＩ型糖尿病のペプチド療法 （ｉ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；並びに（ii）１０％の大豆油，１．２％ の卵リン脂質及び２．２５％のグリセリンで構成された１０％脂質乳濁液（イン トラリピド，スウェーデン所在のＫａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ）の各々 ０．１ｍｌにペプチドｐ２７７，１００μｇを含有させて１頭のマウスの皮下に 投与することによって雌のＮＯＤマウスを治療した。 ６ヶ月齢での糖尿病の発生率と抗ｐ２７７抗体の産生を追跡した。 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ ＡｎａｌｙｚｅｒIIで２週間間隔で少なくと も２回測定して血糖濃度が２００ｍｇ／ｄｌを超えている持続性高血糖症を糖尿 病と診断した。ペプチドによる治療の成功については，正常な血糖濃度（２００ ｍｇ／ｄｌ未満）の維持，膵島の島内炎症（インシュリン炎）の軽減及びＴＨ２ 型免疫応答の指標としての治療ペプチドに対する抗体の誘発で検定した。試験結 果を表１に示す。 ＃ 未治療ＮＯＤマウスと比較してｐ＜０．０１ 表１から分かるように，イントラリピド中に含有させて投与するｐ２７７によ る治療が糖尿病と死亡の発生率を減少させるのに有効であった。一方，ＰＢＳに 含有させて投与する治療は効果がなかった。実施例６ ペプチドｐ２７７／イントラリピド療法はサイトカインプロフィルの特異的切 換えを誘発する 補助剤としてイントラリピドを用いると，ｐ２７７によってＴＨ１→ＴＨ２サ イトカインの切換えが起こることを確認するため，ｐ２７７／イントラリピドで 治療したマウスと対照のマウス中に，ｐ２７７に対し反応性のＴ細胞が産生した サイトカイン類を検定した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）すなわちＴ細胞ミト ゲンを用いて，対照としての全脾臓Ｔ細胞を活性化した。 ３ヶ月齢のＮＯＤマウス１０頭ずつの群を，イントラリピド中ｐ２７７又はイ ントラリピド中ＰＢＳで治療した（実施例１参照）。５週間後，マウスの脾臓を 取り出し，脾臓細胞を集めた。その脾臓細胞をＣｏｎＡ又はｐ２７７と共に２４ 時間（ＩＬ−２とＩＬ−４の分泌のため）又は４８時間（ＩＬ−１０とＩＦＮγ の分泌のため）インキュベートした。培養物の上澄み液中のサイトカイン類の存 在は，ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのサイトカインＥＬＩＳＡ法のプロトコルに従いＰ ｈａｒｍｉｎｇｅｎのペアード抗体を用い，ＥＬＩＳＡ法で定量した。 Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの組換えマウスサイトカイン類を校正曲線用の標準として 使用した。簡単に述べると，平底９６ウェル微量滴定プレートをラット抗マウス サイトカインｍＡｂでコートし，４℃で１８時間後に，上記培養物上澄み液又は 組換えマウスサイトカインを添加した。４℃で１８時間後，プレートを洗浄し， ビオチニル化ラット抗マウスサイトカインｍＡｂを添加した。室温で４５分後， 十分に洗浄し，アビジン−アルカリ性ホスファターゼを添加した。これらプレー トを洗浄し，色素原基質を加え，試料の４０５ｎｍにおける読取りをＥＬＩＳＡ リーダーで行った。試験結果を図５Ａと５Ｂに示す。サイトカイン類の濃度は， ＯＤ読取り値で示してある。 図５Ａは，対照マウスの脾臓細胞をｐ２７７とともにインキュベートしたとこ ろＩＬ−２とＩＦＮγの両方を分泌したことを示している。これとは対照的に， ｐ２７７で治療したマウスは，ペプチドｐ２７７とともにインキュベートしたの に応答して，ＩＬ−２とＩＦＮγの産生量は有意に少なかった（ｐ＜０．０１） 。ＴＨ１サイトカイン類のこの減少は特異的であった。即ち，ｐ２７７で治療し たマウスは，ＣｏｎＡに対するそのＩＬ−２とＩＦＮγのサイトカイン応答を維 持した（図５Ｂ）。図５Ａと図５Ｂはマウスの脾臓細胞が産生したＩＬ−１０と ＩＬ−４の量を示す。対照のマウスはｐ２７７又はＣｏｎＡに応答してＩＬ−４ 又はＩＬ−１０をほとんど産生しなかった。対照的に，ｐ２７７に対してのみ応 答し且つｐ２７７／イントラリピドで治療したマウスにのみＩＬ−１０とＩＬ− ４が有意に増大した（ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１０とＩＬ−４が増大するのと相 まってＩＬ−１０とＩＬ−４が減少しているのは，ＴＨ１様挙動からＴＨ２様挙 動へのシフトを裏付けている。 本明細書に引用したすべての引用文献は，定期刊行物もしくは論文抄録，公開 されたか，もしくは対応する米国もしくは外国の特許願，発行された米国もしく は外国の特許又はその外の引用文献を含めて，これら引用文献中に記載されてい るすべてのデータ，表，図及び本文を含む全体を本明細書に援用するものである 。更に，本明細書に引用された引用文献中に引用された引用文献の全内容もすべ て本明細書に援用するものである。 公知の方法のステップ，従来の方法のステップ，公知の方法又は従来の方法に 言及していることは，いずれにしろ，この発明の態様，性状又は実施態様が関連 技術分野で開示され教示され又は示唆されていると容認しているわけではない。 具体的実施態様の上記説明によって，この発明の一般的な性質は十分明らかに なっているので，他人は，当該技術分野の技倆内の知識（本明細書に引用した引 用文献の内容を含めて）を利用することによって，過度な実験を行うことなく且 つこの発明の一般概念から逸脱することなしに，かような特定の実施態様を，容 易に変形し及び／又は各種用途に採用することができる。それ故，このような採 用及び変形は，本明細書に記載の教示とガイドラインに基づいて，開示された実 施態様の均等物の意味と範囲内にあるとする。本明細書の表現法又は専門用語は 説明を目的とするものであって限定を目的とするものではないと解すべきである から，当該技術分野の当業者は，本明細書の専門用語と表現法を，当業者の知識 と組み合わせで本明細書に記載の教示とガイドラインに照らして解すべきである 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｔ細胞媒介疾患の治療の効力を検出又は監視する方法であって；治療を行 う前のＴＨ１−Ｔ細胞応答から，治療後のＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトを検出 することからなる方法。 ２．前記治療法が，免疫寛容性担体中の提案された自己抗原のワクチンによる 方法であり，前記検出ステップが， 治療される動物のＴ細胞のＴ細胞応答の性質を，治療を行う前に測定し； 自己抗原に対するＴ細胞応答の性質を，治療を行った後に測定し；次いで治療 を行う前のＴＨ１−Ｔ細胞応答から治療後のＴＨ２−Ｔ細胞応答へのシフトがあ ったかどうかを決定し，このようなシフトが陽性であることが見出されれば有効 な治療である可能性が高いことを示す； ことからなる請求の範囲１記載の方法。 ３．前記Ｔ細胞応答の性質を測定する前記ステップが，産生されている抗体の アイソタイプを検定することからなる請求の範囲２記載の方法。 ４．Ｔ細胞応答の性質を測定する前記ステップが，前記Ｔ細胞と前記抗原の生 体外でのインキュベーションに対するサイトカインの応答を測定することからな る請求の範囲２記載の方法。