JP2001515493A - 改変された親和性を有するアデノウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子治療に関する。特に、治療的薬剤、治療的遺伝子産物、および組成物が開示される。特定の細胞に対してネイティブではないヌクレオチド配列を標的化および送達するのに有用な種々の系および方法が開示され、ここで、ウイルス−抗体−リガンド結合体を使用して、標的化および送達を容易にする。

Description

【発明の詳細な説明】 改変された親和性を有するアデノウイルスベクター 技術分野 本発明は遺伝子治療に関する。特に、特定の細胞に対してより効率的に遺伝子 を標的化および送達するのに有用な治療的薬剤および方法が開示される。ここで 、表面上のリガンドを提示し、そして治療的遺伝子産物をコードするヌクレオチ ド配列を含む、再標的化され、親和性（tropism）が改変されたウイルスベクタ ーを使用して、標的化および送達を容易にする。 発明の背景 非ネイティブまたは外来性のDNAの哺乳動物細胞への移入に対する主要な障害 は、遺伝的物質が、それが宿主細胞核に侵入しそして遺伝子発現を開始する前に 複数の細胞の障壁を横切って輸送されねばならないことである。これまでに確立 された方法は、DNAを細胞に導入する人工手段を利用してきたが、これらの方法 は、有意な細胞傷害性を伴う（Grahamら、Virology 52：456-467(1973)；Felgne rら、PNAS USA 84：7413-7417（1987））。 より最近になって、DNA結合体の細胞への増強された移入は、種々の細胞型に 容易に感染するヒトDNAウイルスであるアデノウイルスを用いて達成されている （Horwitz、Adenoviridae and their replication、Virology、FieldsおよびKni pe編、Raven Press、NY(1990)、1679〜1740頁）。アデノウイルスは細胞内液胞 の膜を効率的に破壊するので、DNA結合体を有するウイルスの同時インターナリ ゼーションは、リソソーム分解に供され得る前に、結合体の細胞質への迅速な移 入を可能にする。アデノウイルスが選択的親和性を示すという事実はまた、ヒト 嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）（Rosenfeldら、Cel l 68；143-155(1992)）およびα1-抗トリプシン遺伝子（Rosenfeldら、Science2 52：431-434(1991)）を用いてインビボでこれらの細胞を再構成することに利用 されている。 多数の特徴によって、アデノウイルスは、遺伝子送達適用にとって非常に魅力 的となっている。アデノウイルス遺伝子系の知識は、かなり広範であり、これに は、ウイルスの生活環、DNA複製、転写、およびRNAプロセシング、ならびにウイ ルス遺伝子発現の調節が含まれる。さらに、アデノウイルス（Ad）ゲノムのサイ ズは、ほとんどのcDNAのウイルスゲノムへの挿入についての能力をなお有しなが ら、ウイルスDNAの比較的簡単な操作を可能にする。アデノウイルスベクターの さらなる利点には、分裂細胞および非分裂細胞の両方を効率的に感染する、ウイ ルスゲノムの複製も組込みもせずに高レベルの外来性タンパク質発現を誘導する 、および適切な補完細胞株において増殖する場合に高収量にまで増殖する、それ らの能力が含まれる。 しかし、標的組織が、ウイルス吸収を媒介する、アデノウイルス結合レセプタ ーを充分なレベルを有さない場合、これはまた、効率的な遺伝子送達にとって障 壁であり得る。ほとんどのウイルスによる感染は、その宿主細胞レセプターへの ウイルスの結合を必要とする。アデノウイルスは、そのファイバー(fiber)タン パク質を介してその宿主細胞レセプターに結合する（例えば、Wickhamら、Cell7 3：309-319(1993)）。 Adファイバータンパク質は、長い、三量体のタンパク質であり、これは、ビリ オンの表面から隆起する。ファイバータンパク質の遠位末端は、HeLa細胞および 他の上皮細胞由来のガン細胞株上に存在する同定されていない細胞レセプターと 相互作用する、ノブ様のC末端である（例えば、Deferら、J.Virol.64：3661-367 3(1990)）。レセプターは、一般にFibRとして同定され、これは、アデノウイル ス感染に対する通常の標的である細胞によって発現されると推測される。 従って、特定の組織への遺伝子送達の減少は、おそらく、アデノウイルスレセ プター（FibR）の低発現に起因し得る。従って、機能性レセプターの欠如は、遺 伝子送達効率における劇的な減少と直接相関するようである。 一般に、アデノウイルスベクターは、有効な遺伝子治療に重要である、インビ ボ遺伝子送達についての能力を有する。アデノウイルスベクターの投与の後、３ つの異なる連続的な工程が、標的細胞における治療的遺伝子の発現のために必要 である：(1)標的細胞の表面上の特定のレセプターへのアデノウイルスベクター の結合；(2)ウイルスのインターナリゼーション；および(3)遺伝子が発現され得 る核への遺伝子の移入。従って、アデノウイルスベクターの親和性（すなわち、 そのコグネートレセプターを標的化するそのネイティブな能力）の改変の試みは いずれも、これらの３つの機能を効率よく実施するその能力を保持しなければな らない。 研究者らは、この点に関して多少成功している。例えば、Krasnykhら（J.Viro l.70：6839-46(1996)によって提唱されている方法論は、あるAd血清型由来のフ ァイバーの軸および別のAd血清型由来のノブを有するキメラファイバーを有する 組換えアデノウイルスを生成し、それにより、アデノウイルスのレセプター認識 プロフィールを変更する。（Gallら、J.Virol．70：2116-2123(1996)（これは、 Ad5/7キャプシドキメラを記載する）もまた参照のこと。）しかし、このような 構築物は、限定された有用性を有するようである。なぜなら、それらがなお、標 的化について、非偏在性（less-than-ubiquitous）（および非効率的（less-tha n-efficient））のAdレセプターに、依存するからである。さらに、標的化（お よびおそらくインターナリゼーション）について、Adレセプターに依存するAdベ クターは、所望し得るのと同じくらい広範で種々の細胞を標的化し得ず、そして キメラファイバーの性質に依存して、そのコンフォメーションにおける変更が標 的化および／または送達にネガティブな影響を有し得る。 さらに、上記の文献に記載された改変は、本明細書において開示されるものと は異なり、核へのウイルスの輸送（traffic）を標的化または増加を増強する様 式にはウイルス親和性を変更していない。さらに、その技術は、本明細書におい て示される、予想外に高レベルの「感染性」および発現を達成する標的化構築物 および標的化系および送達構築物および送達系を開示しない。最後に、本発明の 構築物および方法は、ウイルスに媒介される送達に通常耐性である細胞への治療 的薬剤の送達を首尾よく達成した。 上記の問題に鑑み、本明細書中のベクターおよび結合体の設計および構築は、 本明細書においてさらに記載されるように、新規かつ巧緻な解決を提供する。本 発明の、レシピエント細胞へのインビトロおよびインビボの両方での外来遺伝子 の移入を媒介するための組換え配列およびベクターの使用は、上記の遺伝子移入 系の制限を克服する。本発明は、線維芽増殖因子を介してアデノウイルスへと標 的化する利点を付与する組換え構築物を、ファイバータンパク質を介する通常の アデノウイルスの標的化の代わりに利用し、従ってこれは、遺伝子治療のための 方法、遺伝子の送達を含むリボヌクレアーゼの治療的適用のための方法を代表す る。 発明の簡単な要旨 インタクトなアデノウイルス、ヘルパープラスミドまたはウイルスを要求する 改変アデノウイルスベクター、あるいはいわゆる複製欠損アデノウイルスを使用 する欠点とは対照的に、本発明の組換えアデノウイルス由来のベクターの使用は 、遺伝子送達について特定の利点を提供する。特に、それらのネイティブな親和 性を改変されているかまたは除去されている（次いで，標的化リガンドを再標的 化する）アデノウイルスベクターは、本明細書において、種々の遺伝子治療適用 についての利点として開示される。 本発明のAdに由来するベクターは、遺伝子治療に必要な機能的特性をすべて有 し、これには、特定の細胞レセプターへの結合および細胞内液胞の貫通が含まれ る。それらには、さらに、ファイバーの頭部または尾部のすべてまたは一部にお いて、リガンドコード遺伝子の代わりに存在するか、または結合体化されている ものが含まれる。本明細書において開示されたベクターおよび結合体の使用によ って、広範で種々の細胞を標的化し、そして治療的薬剤（それらの薬剤がタンパ タ質、ポリペプチド、ヌクレオチド配列、またはいくつかのほかの分子種に拘ら ず）を、特定の標的化細胞へ直接送達することが可能になる。 本明細書において開示された構築物、系、および方法によって、他の系および 方法ではみられなかった治療的アプローチにおけるレベルの柔軟性が可能になる 。従って、本発明のベクター、系、および方法は、広範で種々の治療的適用にお ける使用のために理想的である。 従って、１つの実施態様において、本発明は、予め選択したレセプターを発現 する細胞を特異的に標的化する、親和性を改変したアデノウイルスベクター系で あって、以下：アデノウイルスキャプシドタンパク質を結合する抗体またはその フラグメント；この予め選択したレセプターを結合する標的化リガンド；プロモ ーターの制御下にある治療的遺伝子産物をコードする核酸分子を含むアデノウイ ルスを含み、ここで、このリガンドが、この抗体またはそのフラグメントと結合 体化しており、そしてこの抗体またはそのフラグメントがこのアデノウイルスに 結合している、アデノウイルスベクター系を提供する。１つの改変において、リ ガンドは、抗体、またはそのフラグメントと融合物（例えば、融合sFv）として 結合体化されている。別の改変において、プロモーターは組織特異的プロモータ ーである。 別の実施態様において、この標的化リガンドがFGFレセプターと反応性のポリ ペプチドである、親和性を改変したアデノウイルスベクターが提供される。１つ の改変において、このFGFレセプターと反応性のポリペプチドが抗体またはその フラグメントである。別の改変において、この抗体は、単鎖抗体である。別の実 施態様において、この抗体は11A8である。別の実施態様において、このFGFレセ プターと反応性のポリペプチドは、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6 、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-11、FGF-13、FGF-14、FGF-15、およびこれらのい ずれかと20％以上の相同性を有する分子からなる群より選択される。なお別の実 施態様において、このFGFレセプターと反応性のポリペプチドはFGF-2である。さ らに別の改変は、この標的化リガンドが、VEGFレセプターと反応性のポリペプチ ド、PDGFレセプターと反応性のポリペプチド、およびEGFレセプターと反応性の ポリペプチドからなる群より選択される標的リガンドを提供する。 開示された本発明の１つの改変において、表面提示リガンドは、細胞表面レセ プターと反応性のポリペプチドである；増殖因子レセプターは、本発明の範囲内 に意図されるレセプターの１クラスである。本発明の範囲内に意図されるレセプ ターの別のクラスは、Her-2/neuまたはerbB2についてのレセプターである。従っ て、本発明に従う細胞表面レセプターと反応性のポリペプチドには、抗体または そのフラグメントが含まれ、これには、Her-2/neuまたはerbB2に対するレセプタ ーと反応する単鎖抗体が含まれる。 本発明はまた、ウイルスベクターのネイティブな親和性が改変されている実施 態様を開示し；さらに他の実施態様において，ウイルスベクターのネイティブな 親和性は除去されている。種々の好ましい実施態様において、ベクターは、アデ ノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターはまた、任意のアデノウイ ルス血清型から容易に選択される。 本発明のさらなる局面において、リボヌクレアーゼ治療的遺伝子産物が細胞は 解約またはプロドラッグである、親和性が改変されたベクターが開示される。１ セットの関連する実施態様において、細胞破壊薬はリボソーム不活化タンパク質 である。他の改変において、この遺伝子産物はチミジンキナーゼ、シトシンデア ミナーゼ、またはニトロレダクターゼである。 本発明の種々の実施態様に従って、治療的遺伝子産物は細胞増殖を増強する。 １つの改変において、治療的遺伝子産物は、内因性タンパク質を増強するかまた は補完する生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドである。別の改変に おいて、この治療的遺伝子産物は、細胞の分化を増強する。なお別の改変におい て、治療的遺伝子産物は、組織修復または再生を増強する分子である。さらに別 の改変は、治療的遺伝子産物が防御性免疫応答を刺激する分子を提供する。 本発明は、さらに、種々の薬学的組成物を開示する。１つの実施態様において 、本発明の薬学的組成物は、生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリ ガンドを提示する親和性が改変されたアデノウイルスベクターを含み、ここで、 このベクターはプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする核酸分子 を含む。１つの改変において、このリガンドは、FGFレセプターと反応性のポリ ペプチドである。種々の別の実施態様において、このFGFレセプターと反応性の ポリペプチドは、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、 FGF-9、FGF-11、FGF-13、FGF-14、およびFGF-15からなる群より選択される。１ つの好ましい改変において、このFGFレセプターと反応性のポリペプチドがFGF-2 である。他の実施態様において、このFGFレセプターと反応性のポリペプチドは 抗体またはそのフラグメントである。１つの別の改変において、この抗体は単鎖 抗体である。別の改変において、この抗体は11A8である。 開示される本発明の他の改変において，表面提示リガンドは、細胞表面レセプ ターと反応性のポリペプチドである；増殖因子レセプターは、本発明の範囲内に 意図されるレセプターの１つのクラスである。本発明の範囲内に意図される別の クラスのレセプターには、Her-2/neuまたはerbB2に対するレセプターが含まれる 。従って、本発明に従う細胞表面レセプターと反応性のポリペプチドには、抗体 またはそのフラグメントが含まれ、これには、Her-2/neuまたはerbB2に対するレ セプターと反応する単鎖抗体が含まれる。 本発明の種々の局面において、このリガンドは、アデノウイルスキャプシドタ ンパク質と遺伝的に融合されている。他の局面において、このリガンドは、アデ ノウイルスキャプシドタンパク質と化学的に結合体化されている。１つの改変に おいて、このリガンドは、アデノウイルスキャプシドタンパク質を結合する抗体 またはそのフラグメントと結合体化されている。別の改変において、このリガン ドは、融合物（例えば、融合sc-Fv）として抗体またはそのフラグメントと結合 体化されている。 他の改変は、この治療的遺伝子産物が、タンパク質、リボザイム、およびアン チセンスからなる群より選択されることを意図する。別の実施態様において、こ の治療的遺伝子産物は細胞破壊薬である。例示的な細胞破壊薬には、リボソーム 不活化タンパク質が含まれる。別の実施態様において、この治療的遺伝子産物は プロドラッグである。例示的なプロドラッグには、チミジンキナーゼ、シトシン デアミナーゼ、またはニトロレダクターゼが含まれる。他の実施態様は、広範な 種々の治療的遺伝子産物を開示し、これには、欠損した、不適切に調節される、 または機能しない遺伝子を置換するかまたは修復する産物が含まれる。種々の別 の実施態様において、本発明の状況内の治療的遺伝子産物は、創傷治癒、組織修 復、結合組織増殖、血管新生、または虚血の改善などを刺激する。他の実施態様 において、治療的遺伝子産物は、疾患のプロセス（例えば、細胞の過剰増殖、腫 瘍増殖、転移など）を処置、阻害、またはブロックする。 従って、本発明はまた、種々の処置方法を開示する。１つの実施態様において 、本発明は、生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示す る親和性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工 程を包含する、腫瘍を処置する方法であって、ここで、このベクターがプロモー ターの制御下に治療的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、そして この治療的遺伝子産物が、E-カドヘリン、BGP、Rb、p53、CDKN2/P16/MTS1、PTEN /M MAC1、APC、p33ING1、Smad4、マスピン、VHL、WT1、Men1、NF2、MXI1、およびFH ITからなる群より選択される、方法を意図する。本発明はまた、生理学的に受容 可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和性が改変されたアデノ ウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する、虚血を処置す る方法であって、ここで、このベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子 産物をコードするヌクレオチド配列を含み、そしてこの治療的遺伝子産物が、IG F、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、HGF、VEGF121、VEGF165、FGF1、FGF2、FGF4、FGF5 、PDGF-A、およびPDGF-Bからなる群より選択される、方法を提供する。 さらに他の改変において、本発明は、生理学的に受容可能な緩衝剤、およびそ の表面にリガンドを提示する親和性が改変されたアデノウイルスベクターを含む 薬学的組成物を投与する工程を包含する、結合組織傷害を処置する方法であって 、ここで、このベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードす るヌクレオチド配列を含み、そしてこの治療的遺伝子産物が、PTH、BMP1、BMP2 、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP10、BMP11、咄乳動物BMP、およびX enopus BMPからなる群より選択される、方法を提供する。別の方法は、生理学的 に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和性が改変された アデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、 このベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードするヌクレオ チド配列を含み、そしてこの治療的遺伝子産物が、ウシVEGF、VEGF、VEGF-B、VE GF-C、アンジオポイエチン（angiopoietin）-1、アンジオゲニン（angiogenin） 、IGF-1、IGF-II、HGF、PDGF A、PDGF B、TGFB1、TGFB2、およびTGFB3からなる 群より選択される。 本発明はまた、悪性疾患（ガンを含む）を処置する種々の方法を開示する。１ つの実施態様において、ガンを処置する方法が開示され、この方法は、ガン細胞 と、生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和性 が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物とを接触させる工程で あって、ここで、このベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコ ードするヌクレオチド配列を含み、そしてこの治療的遺伝子産物が、HSVTK、VZV TK、ニトロレダクターゼ、およびシトシンデアミナーゼからなる群より選択され る、を包含する、工程；ならびに基質とこのガンの細胞を接触させる工程を包含 する。種々の実施態様において、基質はガン細胞に対して細胞傷害性または細胞 増殖抑制性である分子を産生するように作用する分子である。 種々の開示された方法において、このリガンドはFGFレセプターと反応性のポ リペプチドである；この点に関して有用な種々のポリペプチドは、本明細書中上 記に列挙されている。種々の好ましい実施態様において、このレセプターはFGF レセプターである。１つの改変において，このFGFレセプターと反応性のポリぺ プチドはFGF-2である。他の改変において、このFGFレセプターと反応性のポリペ プチドは、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9 、FGF-11、FGF-13、FGF-14、およびFGF-15からなる群より選択される。 別の実施態様において、このリガンドは抗体またはそのフラグメントである。 別の実施態様において，この抗体は単鎖抗体である。さらに別の改変において、 このリガンドはウイルスキャプシドタンパク質を結合する抗体またはそのフラグ メントと結合体化されている。種々の実施態様において、このウイルスキャプシ ドタンパク質はアデノウイルスファイバータンパク質、例えば、アデノウイルス ノブタンパク質である。さらに他の実施態様において、このリガンドは、ウイル スベクターの表面上のタンパク質と化学的に結合体化されてい得るか、または融 合タンパク質の１成分としてキャプシドに結合されてい得る。 本明細書において開示される種々の方法において、この治療的遺伝子産物は、 タンパク質、リボザイム、およびアンチセンスからなる群より選択される。別の 実施態様において、この治療的遺伝子産物は、細胞破壊薬である。例示的な細胞 破壊薬には、リボソーム不活化タンパク質が含まれる。別の実施態様において、 この治療的遺伝子産物はプロドラッグである。例示的なプロドラッグは、チミジ ンキナーゼ、ニトロレダクターゼ、およびシトシンデアミナーゼである。他の実 施態様は、広範な種々の治療的遺伝子産物を開示し、これには、欠損、不適切に 調節されるか、または機能しない遺伝子を置換または修復する産物が含まれる。 種々の別の実施態様において、本発明の状況内の治療的遺伝子産物は、創傷治癒 、組織修復、結合組織増殖、血管新生、または虚血の改善などを刺激する。他の 実施態様において、治療的遺伝子産物は、疾患のプロセス（例えば、細胞の過剰 増 殖、腫瘍増殖、転移など）を処置、阻害、またはブロックする。 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参 照して明らかになる。さらに、種々の文献および文書が本明細書において参照さ れて、種々の手順、組成物、分子などのさらなる詳細を提供する。本明細書にお いて参照されたすべての刊行物の開示は、その全体があたかも本明細書中にすべ てが示されるかのように、参考として援用することが理解されることは明確であ る。 図面の簡単な説明 図１は、４つのKS細胞株についてのAdCMV-Luc形質導入の比較を示す。KS細胞 は、アデノウイルスノブ媒介性感染をブロックするFabフラグメントの非存在ま たは存在下でルシフェラーゼを発現する組換えアデノウイルスとインキュベート した。実験を三連で行った。相対光単位（RLU）を、垂直軸に示し；水平軸を横 切って、以下の細胞株を示す：KSY-1；RW376；KS-SLK；およびCVU-1。白（無色 ）の棒は、AdCMV-Lucを示し、一方、黒（暗色）棒は、AdCMV-Lucおよび抗ノブFa bを示す。 図２は、KS細胞株の、Fab-FGF2結合体によって増強された、増強されたAdCMV- Luc感染性を示す。Ad結合体複合体の増強した感染性を、抗FGF2抗血清の存在お よび非存在下で評価した。相対光単位（RLU）を、垂直軸にプロットし、一方、 関連するKS細胞株--KSY-1、RW376、KS-SLK、およびCVU-1を水平軸に示す。黒棒 は、AdCMV-Lucを示し；斜線棒は、AdCMV-LucおよびFab-FGF2を示し；そして白（ 無色）棒は、AdCMV-LucおよびFab-FGF2および抗FGF2抗血清を示す。 図３は、KSY-1およびKS-SLK細胞のFab-FGF2結合体によるAdCMVHSVtk/GCVの細 胞殺傷の増強を示す。GCVのAdCMVHSVtkトランスフェクト細胞に対する効果を、 結合体の存在または非存在下で評価し、そしてGCVに曝露されていない細胞（す なわち、−GCV）と比較した、生存細胞のパーセンテージとして表現した。二連 のウェルにおける生存細胞を、三連で、トリパンブルー染色後に計数した。垂直 軸には、図3Aおよび図3Bの両方において、生存細胞の％を示す。図3Aにおいて、 AdCMVHSVtk、またはAdCMVHSVtkおよびFab-FGF2でトランスフェクトしたKSY-1細 胞を、水平軸に示す。図3Bにおいて、AdCMVHSVtkまたはAdCMVHSVtkおよびFab-FG F2でトランスフェクトしたKS-SLK細胞を水平軸に示す。 図４は、Fab-FGF2結合体の合成および精製についてのスキームを示す。このス キームが、任意のFab−リガンド結合体の合成および精製に適用され得、従って 、示されたものに限定されないことが明白に理解されるはずである。 図５は、非還元条件下のFab-FGF2のSDS-PAGEの結果を示す。等量（２μg）のF GF2（レーン２）、Fab（レーン３）、またはFab-FGF2（レーン４）をゲルに適用 し、そして分子量標準（レーン１、単位1000）と、クーマシーブルーで染色する ことによって比較した。図5Bにおいて、Fab−FGF2結合体のウェスタンブロット 分析を示す。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、抗FGF2ウサギポ リクローナル抗体、次いで¹²⁵I−プロテインＡでプローブし、そしてオートラジ オグラフィーで可視化した。バンドは、FGF2（レーン５）およびFab−FGF2結合 体（レーン７）について観察されたが、Fab抗体単独（レーン６）では観察され なかった。 図６は、Fab-FGF2結合体の機能的な検証を示す。図6Aにおいて、内皮細胞増殖 のFGF2およびFab-FGF2結合体による刺激を示す。ウシ大動脈内皮細胞を、種々の 濃度のFGF2またはFab-FGF2（30pg/ml〜6ng/ml）で処置し、そして細胞数を決定 した。細胞計数（×1000）を垂直軸にプロットし、一方、pg/mlを水平軸にプロ ットする。白丸はFGF2を示し、一方、黒丸は、Fab-FGF2を示す。 図6Bにおいて、ELISAにおけるFab-FGF2のAd5ノブへの結合を示す。組換えAd5 ノブをFab-FGF2（ブランクのコントロール）、またはFGF2を用いてプローブ下。 コントロールとして、Fab-FGF2を、Ad4の部を含んでいないプレートに添加した 。吸光度を垂直軸にプロットし、一方、以下を棒グラフの水平軸に示す：左から 右に、ノブなしおよびFab-FGF2；ノブおよびFab-FGF2；ノブ単独；ならびにノブ およびFGF2。 図７は、Fab-FGF2結合体を用いる、１群の細胞株のインビトロ感染の結果を示 す。図7Aにおいて、Fabによるルシフェラーゼ発現の阻害を示す。４つの細胞株 を、AdCMVLucまたは本明細書中に記載のようにFabと予め混合したAdCMVLucのい ずれかで感染させた。データを、AdCMVLuc単独を各細胞株に対して用いた場合 のルシフェラーゼ発現のパーセンテージとして表す。パーセンテージを垂直軸に プロットし、細胞株3T3、PANC-1、SKOV3.ip1、およびD54MGを水平軸に示す。白 棒は、AdCMVLucを示し、一方、黒棒は、AdCMVLucおよびFabを示す。 図7Bでは、AdCMVLuc、またはAdCMVLuc-Fab-FGF2結合体のいずれかで感染した 場合の４つの細胞株におけるルシフェラーゼ発現を示す。棒は、1μgのタンパク 質あたりの相対光単位（RLU）でのルシフェラーゼ発現を示し、そして三連の測 定±標準偏差を示す。RLU/μgのタンパク質を垂直軸にプロットする。水平軸に は、細胞株3T3、PANC-1、SKOV3.ip1、およびD54MGを示す。黒棒は、AdCMVLucを 示し、一方、斜線棒は、AdCMVLucおよびFab-FGF2を示す。 図7Cでは、抗FGF2抗体によるルシフェラーゼ発現の阻害を示す。４つの細胞株 に、上記のようなFab-FGF2結合体と予め混合したAdCMVLucまたはFab-FGF2結合体 および抗FDF2抗体と予め混合したAdCMVLucのいずれかを感染させた。データを、 ADCMVLuc-Fab-FGF2複合体を各細胞株に使用した場合に見られるルシフェラーゼ 発現のパーセンテージとして表す。パーセンテージを垂直軸にプロットし；細胞 株3T3、PANC-1、SKOV3.ip1、およびD54MGを水平軸に沿って示す。軽く斜線のあ る棒は、AdCMVLucおよびFab-FGF2を示し；一方、暗色の黒棒は、AdCMVLucおよび Fab-FGF2および抗FGF2 Abを示す。 図8A-Cは、AdβgalまたはFGF2-Aβgalでの処置後のマウスの肝臓におけるβガ ラクトシダーゼの発現を示す。図Aでは、賦形剤で処置したC57B1/6マウスの肝臓 におけるXgal染色細胞はみられない。図8Bでは、多数のXgal染色肝細胞が、マウ ス1匹あたり２×1010pfuの投与量でAdβgalでi.v.処置したC57B1/6マウスの肝臓 に存在する。図8Cでは、マウス1匹あたり２×10¹⁰pfuでのFGF2-Adβgalでのi.v. 処置が非常に少ない肝細胞を形質導入する。 図９は、AdβgalまたはFGF2-Adβgalで処置したマウスにおける血清トランス アミナーゼおよびアルカリホスファターゼレベルを示す。血清トランスアミナー ゼ（AST、ALT）およびアルカリホスファターゼを、７日目に、賦形剤；Adβgal 、２×10¹⁰pfu、i.v．；またはFGF2-Adβgal、２×10¹⁰pfu,i.v.のいずれかで処 置した後C57B1/6マウスにおいて測定した。 図10Aおよび図10Bは、AdβgalまたはFGF2-Adβgalでの処置後のマウスの肝臓 の組織染色を示す。ヘマトキシリンおよびエオシンは、Adβgal、２×10¹⁰pfu、 i.v.（図10A）；またはFGF2-Adβgal、２×10¹⁰pfu、i.v,（図10B）のいずれか で処置したC57B1/6マウスの肝臓のパラフィン切片を染色した。広範な肝細胞壊 死および炎症性侵襲が、Adβgalで処置したマウスの肝臓に存在する。FGF2-Adβ galで処置したマウスの肝臓において肝細胞壊死のほとんど完全な抑止が存在す る。また、炎症性侵襲はほとんど観察されない。 図11は、AdtkまたはFGF2-Adtkのいずれかで処置した腫瘍を有するマウスの生 存分析を示す。B16黒色肺細胞は、AdtkまたはFGF2-Adtkのいずれかでエキソビボ で1時間処置し、次いでマウス1匹あたり２×10⁶細胞でBDF1マウスヘ腹腔内に移 植した。次いで、マウスを、ガンシクロビル（GCV）またはＨ₂０（コントロール として）で14日間i.P.処置した。FGF2-Adtkで処置し、次いでガンシクロビルを 投与した、腫瘍を有するマウスの生存は延長されていた；このようなマウスは、 他の群すべてと比較して統計学的に延長された生存を有する（ｐ＜0.001）。 図12は、Fab-FGF2結合体によるAd媒介性遺伝子送達の増強を示す。AdCMVLuc（ 5×10⁷pfu）を、20μLのHBS中のFabフラグメント（1.44μg）またはFab-FGF2結 合体（1.94μg）の最適用量と、30分間室温で予めインキュベートした。次いで 、ベクターまたはベクター複合体を、DMEM/F-12および２％のFCS中に希釈し、そ して24ウェルプレート中の24,000 SK0V3.ipl細胞を、50pfu／細胞のMOIで感染さ せた。阻害実験を、ポリクローナル抗FGF2抗体（Sigma、St．Louis、MO）をAdCM VLuc-Fab-FGF2複合体に、感染前に添加することによって実施した。細胞溶解物 を、感染後24時間のルシフェラーゼ活性についてアッセイした。溶解物のタンパ ク質濃度を決定して、データの基準化を可能にした。これは、１μgの細胞タン パク質あたり相対光単位（RLU）として表す。結果は、三連の実験の平均±SDで ある。 図13は、生存実験における治療的利益を増強するHSV-TK遺伝子のAD媒介性発現 のFGF2増強の結果を示す。合計95の雌性SCIDマウス（６〜８週齢）に２×10⁷SKO V3.ipl細胞を０日目に腹腔内に接種した。５日目に、何匹かのマウスに、２×10⁸ または２×10⁹pfuのAdCMVHSV-TK単独またはFGF2と複合体化したAdCMVHSV-TKを 腹腔内注射した（n=20マウス／群）。48時間後、各群の半分のマウス（n=10） を、毎日ガンシクロビル（50mg/kg体重）の腹腔内注射で14日間処置した。コン トロール群は、ウイルスもGCVも受けないマウス(n=5)、またはGCVのみで処置し たマウス(n=10)からなった。マウスを毎日、生存についてモニターした。生存す る動物のパーセンテージを腫瘍細胞接種後の日数に対してプロットする。 図14は、賦形剤、アデノウイルス、またはFGF-Fab：Ad結合体の単回注射後の2 1日目の抗体応答を示す。光学密度（O.D.）×10³を垂直軸に対してプロットし、 一方、賦形剤、Ad、またはFGF-Fab：Ad結合体の単回注射に対応するデータ点を 水平軸に示す。白四角、白丸、および白菱形は、抗アデノウイルスタンパク質応 答に対応し、一方、黒四角、黒丸、および黒菱形は、抗ノブタンパク質応答に対 応する。 図15Aは、アデノウイルス感染のFGF2再標的化がトランスジーンの発現の増加 をもたらすことを示す。HUVECは、AdCMVLuc単独、AdCMVLucおよびFab、またはＡ dCMVLucおよびFab-FGF2で感染させ、そしてルシフェラーゼ発現を、24時間後に 測定した。３つの別個の実験の代表的なグラフを示す。データは、平均±SDであ る。^*ｐ＜0.001（対Ad単独）。図15Bは、FGF2再標的化のブロックを示す。HUVEC をAdCMVLucおよびFab-FGF2単独で感染するかまたは抗FGF抗体、ヘパリンまたは 過剰量の遊離FGFでブロックした。^*ｐ＜0.001（対AdおよびFab-FGF2単独）。図1 5Cは、遺伝子発現の増強がFGF2で見られることを示す。Ad単独またはFab-FGF2再 標的化のために使用された濃度と等モル濃度でのヘパリンまたはFGF2の存在下で HUVECを感染させた。図15Dは、三重水素結合アッセイの結果を示す。三重水素化 したAdCMVLuc単独またはFab、Fab-FGF2、もしくはFab-FGF2および抗FGF抗体との インキュベーション後のAdCMVLucを、４℃で１時間細胞に結合させた。洗浄後、 残りの結合した放射能（１分あたりの計数、cpm）をシンチレーションカウンタ ーで測定した。^*ｐ＜0.001（対Ad単独）。^**ｐ＜0.001（対AdおよびFab-FGF2） 。 図16A〜Bは、Fab-FGF2の再標的化がHCAECおよびHASMCでの遺伝子発現を増強す ることを示す。HCAEC（図16A）およびHASMC（図16B）にAdCMVLuc単独、AdCMVLuc およびFab、またはAdCMVLucおよびFab-FGF2を感染させ、そしてルシフェラーゼ 発現を24時間後に測定した。３つの実験の代表的なグラフを示す。データは平均 ±SDである。^*ｐ＜0.001。 図17は、異なるウイルス用量でのFGF2再標的化の増強効果の決定を記載する。 HUVECに、AdCMVLucを10、50、または100pfu／細胞の用量で、Fab-FGF2再標的化 を用いるかまたは用いないで感染させた。ルシフェラーゼアッセイを24時間後に 実施した。結果は平均±SDである。 図18A〜18Gは、βガラクトシダーゼ形質導入のフローサイトメトリー分析を示 す。HUVECに、AdCMVLacZ、またはAdCMVLacZおよびFab-FGFを、10、50または100p fu／細胞で感染させた。48時間後のFDG染色およびフローサイトメトリー分析に よる遺伝子発現の決定。代表的なプロフィールを示す。ポジティブシグナルは、 M2ゲート（gate）によって示す。 図19は、静止細胞における遺伝子送達のFGF2増強の減少を示す。HUVECをプレ ートし、そして１，５、または10日間培養状態に維持した。次いで、細胞に、Ad CMVLuc（50pfu／細胞）またはAdCMVLucおよびFab-FGF2を感染させ、そしてルシ フェラーゼアッセイを24時間後に行った。データを、同じ時点でプレートし、そ してAdCMVLuc単独で感染させた対応する細胞と比較した、Fab-FGF2再標的化を感 染させた細胞におけるルシフェラーゼ発現の比率として表す。棒は、３つの実験 の平均±SDを表す。^*＝ｐ＜0.01（対培養１日目）。 図20は、FGF2または11A8-Fabのいずれかを用いる、マーカー（Adβgal）に連 結したAdベクターの首尾よい再標的化ならびにHCT116細胞におけるマーカー配列 の首尾よい送達を示す。左から右へ、斜線の棒は、Adβgal；Fab;FGF2Fab；30× ；FGF2Fab、３×；11A8Fab、30×；および11A8Fab、３×を表す。過剰モル濃度 のリガンド−Fab：のブモノマーを後ろの４つのカテゴリーに示す。垂直軸には 、mUβgal/mgタンパク質を示す（条件：25K；72時間；300MOI。）。 図21は、FGF2で再標的化され、そして体内ペイロード（payload）を送達するA dベクターをSKOV3腫瘍を有するマウスに投与した場合の、インビボのマウス腫瘍 モデルにおいて見られた生存時間の増強を示す。生存パーセントを垂直軸に示す ；移植後の生存（日）を水平軸にプロットする。黒丸は、賦形剤単独（コントロ ール）を受けるマウスを表し；黒三角は、再標的化していないAd体内送達Her-2/ neuを受けるマウスを表し；および黒四角は、FGF2再標的化Ad体内送達Her-2/neu を受けるマウスを表す。示されるとおり、N=10；投与された用量は、１×10⁹A DVまたはFGF-2 ADVであった。 発明の詳細な説明 本明細書において開示された多くの知見および結果は、非常に予想外である。 例えば、本発明者らは、アデノウイルスのFGF再標的化（すなわち、線維芽増殖 因子を用いるアデノウイルスの親和性の変更）が、ベクターがそのネイティブな 親和性を保持する場合に見られるものよりを充分に超えるAdベクターの標的化効 率および核輸送を有意に増強することを見い出した。さらに、本発明者らは、FG F再標的化が、ネイティブなAd親和性単独の使用と比較して、種々の細胞（例え ば、カポージ肉腫を発現する細胞）におけるアデノウイルスの感染性を増加させ ることを観察した。興味深いことに、本発明者らは、このことが、Ad感染に耐性 であるそれらの細胞株においてさえも真実であることを見出した。 第三に、本発明者らは、FGFで再標的化したベクターの使用は、効力を増強す る；FGF再標的化ベクターが、より多くの標的細胞に治療的遺伝子を送達し、そ してそのように標的化された細胞の各々においてその発現を促進することを見い 出した。第四に、本発明のベクターは、肝臓に対して有意により少なく毒性であ り、そして他のAdベクターよりも、より少なく免疫原性である。最後に、本発明 者らは、FGFで再標的化されたウイルスベクターを再標的化することが治療的遺 伝子配列（例えば、HSV-tkのような細胞傷害性配列）が送達される場合、特定の 細胞型に対して細胞傷害性を誘発すること；従って、FGF再標的化ベクターがAd 感染に通常非感受性である細胞を形質導入し得ることを観察した。 従って、本発明のFGF再標的化ベクターならびに関連組成物および方法は、他 の遺伝子治療ベクター、特にウイルスベクターよりも予想外かつ有意に優れてい る。そして、Adベクターの再標的化が本明細書において例示として記載されてい るが、他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが本明細書に開示される 再標的化戦略から恩恵を受け得ることが理解されるべきである。 従って、本発明は、それが投与される被験体を危険に晒すことなく、種々の治 療適用において有効な使用のために、有効量の治療剤またはそれをコードする核 酸配列をパッケージし得そして送達し得る新規の構築物およびベクターを操作お よび産生することを可能にする。 Ａ．定義 本発明の開示の前に、本明細書において使用される特定の用語を定義すること は本発明の理解に役立つ。本明細書に現れる種々のアミノ酸配列に現れる「アミ ノ酸」を、それらの周知の３文字または１文字略語に従って示す。種々のDNAフ ラグメントに現れるヌクレオチドは、当該分野で日常的に使用される標準的な一 文字命名を用いて示す。 本明細書において用いる場合、「レセプターに結合する」とは、リガンドが、 標準的な（例えば、インビトロ）アッセイによってアッセイする場合、レセプタ ーを特異的に認識し、そして検出可能に結合する能力をいう。 本明細書において用いる場合、「結合体」とは、ともに連結されている２つ以 上の分子をいう。これらの分子は、直接またはリンカー（例えば、ペプチド）を 介して結合体化されてい得るか、またはそれらは、イオン性分子間力または他の 分子間力を介して一緒に保持されてい得る。結合体は、化学結合法または融合タ ンパク質を産生するキメラDNA分子の組換え発現によって生成され得る。 「細胞破壊薬コード薬剤」とは、細胞死をもたらし、そしてタンパク質合成を 阻害することによって一般的に作用する産物をコードする核酸分子である。この ような産物は、rRNAまたはリボ核タンパク質を切断すること、伸長因子を阻害す ること、mRNAを切断すること、または細胞が生存し得ないようなレベルにタンパ ク質合成を低減させる他の機構によって作用し得る。産物は、タンパク質、リボ ザイム、アンチセンスなどであり得る。核酸分子は、細胞破壊薬遺伝子のほかに さらなるエレメントを含み得る。このようなエレメントは、プロモーター、エン ハンサー、スプライス部位、転写ターミネーター、ポリ(A)シグナル配列、細菌 または哺乳動物の複製起点、選択マーカーなどを含む。 「ヘパリン結合増殖因子」とは、ヘパリン結合増殖因子タンパク質のファミリ ーの任意のメンバーをいい、ここで、このファミリーの少なくとも１つのメンバ ーはヘパリンに結合する。この点に関して、好ましい増殖因子は、線維芽増殖因 子（FGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、およびヘパリン結合EGF様因子（HBEG F）を含む。このような増殖因子は、イソ形態、ファミリーのメンバーに由来す るペプチドフラグメント、スプライス改変体、および単一または複数のエキソン （それらのいくつかの形態はヘパリンに結合しないかもしれない）を含む。 「核酸結合ドメイン」（NABD）とは、核酸（例えば、DNAまたはRNA）に結合す る分子（通常タンパク質、またはペプチド（しかし、また、ポリカチオンであり 得る）をいう。NABDは、RNAまたはDNAの一本鎖または二本鎖あるいはRNA/DNA混 合ハイブリッドに結合し得る。核酸結合ドメインは、特定の配列に結合し得るか 、または配列とは無関係に結合し得る。 本明細書において用いる場合、「核酸」とは、細胞にインターナリゼーション するために意図されるRNAまたはDNAをいい、そして治療的タンパク質、細胞傷害 性タンパク質、プロドラッグ、リボザイム、デオキシリボザイム、またはアンチ センスをコードするDNA、これらのNAの相補物、アンチセンス核酸、および他の このような分子を含むがこれらに限定されない。核酸との言及は、二重鎖DNA、 一本鎖DNA、任意の形態のRNA（三重鎖、二重鎖、または一本鎖を含む）、アンチ センスRNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単一ヌクレオチド、キメ ラ、およびそれらの誘導体を含む。核酸は、周知のデオキシヌクレオチドおよび リボヌクレオチド（すなわち、塩基アデノシン、シトシン、グアニン、チミジン 、およびウリジン）で構成され得る。種々のほかのヌクレオチド誘導体、非リン 酸骨格またはリン酸に由来する骨格もまた使用され得る。例えば、正常のホスホ ジエステルオリゴヌクレオチド（POオリゴヌクレオチドと言及する）は、DNA特 異的ヌクレアーゼおよびRNA特異的ヌクレアーゼに感受性であるので、切断に耐 性のオリゴヌクレオチド（例えば、リン酸基がホスホトリエステル、メチルホス ホネート、またはホスホロチオエートに変更したもの）が使用され得る（米国特 許第5,218,088号を参照のこと）。 本明細書において用いる場合、「レセプター結合インターナリゼーションした リガンド」または「リガンド」とは、細胞表面分子に結合しそしてインターナリ ゼーションし得る任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパ ク質（例えば、ペプチド模倣物）をいう。本発明の状況内では、レセプター結合 インターナリゼーションしたリガンドは、融合タンパク質として、または化学結 合体化を通じてのいずれかで核酸結合ドメインと結合体化され、そしてニューロ ン性治療剤コード薬剤を細胞に送達するのに使用される。１つの局面において、 リガンドは、核酸分子と直接結合体化される。これは、さらに、核酸分子結合ド メインと複合体化され得る。このようなリガンドは、増殖因子、サイトカイン、 抗体、ホルモンなどを含む。 本明細書において用いる場合、「標的化薬剤」とは、通常核酸分子であるが、 また、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の任意のクラスの化学薬剤であっ て、レセプター結合インターナリゼーションしたリガンドによって細胞に内部送 達され、そしてインターナリゼーションの際に、細胞の、細胞代謝、増殖、活性 、生存、または他の特性もしくは特徴を変更するかまたは影響を与えるものでも あり得る化学薬剤である。 本明細書において用いる場合、「治療的核酸」とは、本発明の状況において使 用される任意の核酸分子をいい、これは、通常、遺伝子転写または翻訳を改変す ることによって処置をもたらす。これは、以下の型の核酸が含まれるがこれらに 限定されない：タンパク質をコードする核酸、アンチセンスRNA、三重鎖分子を 形成するように意図されるDNA、タンパク質結合核酸、およびヌクレオチド低分 子。治療的核酸を使用して、欠損遺伝子に対する置換物として作用されること、 または腫瘍抑制薬剤、プロドラッグ、増殖エンハンサーまたは細胞破壊薬などの ような治療的産物をコードすることによって、遺伝子治療をもたらし得る。治療 的核酸は、遺伝子のすべてまたは一部を含み得、そして細胞にすでに存在するDN Aを用いて組換え、それによって、遺伝子の欠損部分を置換または補完すること によって機能し得る。これはまた、タンパク質の一部をコードし得、そして遺伝 子産物の同時抑制によってその効果を発揮し得る。 本明細書において用いる場合、２つのヌクレオチド配列の「作動可能な連結」 または作動可能の結合とは、このような配列間の機能的な関係をいう。ヌクレオ チド配列は、産物をコードするDNA、シグナル配列をコードするDNA、プロモータ ー、エンハンサー、転写終結部位、翻訳終結部位、およびポリアデニル化シグナ ルを含むがこれらに限定されない。例えば、治療的遺伝子産物をコードするDNA の、プロモーターへの作動可能な連結とは、このDNAの転写がプロモーターから 、 そのDNAを特異的に認識し、結合し、そして転写するRNAポリメラーゼによって開 始されるような、このDNAとプロモーターとの間の物理的および機能的な関係を いう。 本明細書において用いる場合、句「FGFレセプターと反応性のポリペプチド」 とは、FGFレセプター（例えば、高親和性FGFレセプター）と特異的に相互作用し 、そしてFGFレセプターとの相互作用によって細胞へと輸送される、任意のポリ ペプチドをいう。 本明細書において用いる場合、「プロドラッグ」とは、不活性、非毒性の化合 物が生物学的、薬学的、治療的、または毒性的に活性な形態の化合物へと代謝す るか、そうでなければ変換する化合物をいう。プロドラッグはまた、投与の際、 代謝または他のプロセスを通じて活性な化合物を得るために改変される薬学的に 不活性の化合物であり得る。薬物動態的なプロセスおよびインビボ薬物代謝の知 見によって、一旦薬学的に活性の化合物が公知となると、この化合物の不活性形 態が、合成され得るかまたは単離され得る（例えば、Nogrady、Medicinal Chemi stry ABiochemical Approach、Oxford Unlversity Press、New York、388〜392 頁、1985を参照のこと）。 本明細書において用いる場合、「レセプター結合インターナリゼーションされ たリガンドまたは「リガンド」とは、細胞表面分子に結合しそしてインターナリ ゼーションし得る任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパ ク質（例えば、ペプチド模倣物）をいう。本発明の状況内では、レセプター結合 インターナリゼーションしたリガンドは、融合タンパク質として、または化学結 合体化を通じてのいずれかで、直接または間接（例えば、二重特異性抗体を介し て）で、ウイルスキャプシドタンパク質と結合体化される。さらなる例として、 リガンドは、抗体またはそのフラグメントと、融合物（例えば、融合sFv）とし て結合体化され得る。従って、レセプター結合インターナリゼーションしたリガ ンドは、細胞へ治療的産物をコードする薬剤を送達するのに使用され得る。この ようなリガンドは、増殖因子、サイトカイン、抗体、ホルモンなどを含む。 「創傷部位」とは、本明細書において用いる場合、外傷組織損傷から、あるい は、外科的手順によって誘発されるまたはそれからもたらされる組織損傷から生 じる宿主における任意の位置として定義される。 Ｂ．変更された親和性を有するウイルスベクター ウイルス（特に、アデノウイルス）は、臨床的に有用なベクターについての理 想的な候補であるとはそれほど頻繁にはみなされてこなかった。なぜなら、それ らのネイティブな親和性が、それらを大いに感染性、ならびに非常に免疫原性お よび毒性にさせるからである。これらの主要な困難、およびウイルスのネイティ ブな親和性に関連する他の困難に、他の当業者が遭遇しており、そしてこれらの 困難は、首尾よく克服されてはいない。 例えば、ほとんど（すべてではないにせよ）のウイルスおよびレトロウイルス のベクターのネイティブな形態（すなわち、それらのネイティブな親和性を有す るベクター）は、潜在的な宿主細胞を効率的に標的化し得ない。この低い標的化 効率は、適切なレセプターを発現するかまたは充分な量のこれらのレセプターを 発現することを細胞がし得ないことに起因し得る。多くの場合、エンドソームが 核へ到達することから逃れさせることをベクターがし得ないこともまた、関連要 因である。 しかし、ベクターの親和性の単なる変更（それ以上何もない）では、上記の問 題を克服するには充分ではないかもしれない。例えば、Douglasらは、葉酸レセ プターポジティブ細胞へAdを標的化するために葉酸に結合体化された抗ノブ抗体 の使用を介して新たな親和性を付与しつつ、ネイティブAd親和性を除去するため の方法を記載した（Douglasら、Nature Biotech．14：1574-1578（1996））。親 和性が改変されたAdは、インビトロで葉酸レセプターポジティブ細胞を形質導入 し得る一方で、標的化の効率は、本明細書において開示される構築物および方法 を用いてにみられるほどは顕著ではなかった。さらに、ウイルス「ペイロード」 の核への送達は、最適ではなかった。 従って、改変(変更)されたまたは除去（ブロック）されたネイティブな親和性 を有するウイルス構築物を設計および構築することが、本発明の１つの目標であ る。さらなる目標は、新たな標的をウイルスに提供するための、いくつかの様式 −例えば、遺伝学的または免疫学的−でのウイルスの改変を含む。例えば、本 発明の好ましいウイルス構築物は、特定の細胞型を標的化する能力を有する。 従って、本明細書中で使用される用語「親和性」は、レセプターに対するウイ ルスベクター（ウイルスおよびウイルス粒子を含む）の運動または標的化を指す 。前出と一致して、ウイルスベクターがネイティブな親和性を示している場合、 これは、コグネートレセプターを標的化している。 アデノウイルス（Ad）の状況において、これは、インテグリンレセプターに結 合する傾向にある。この結合は、後の宿主細胞へのアデノウイルスのインターナ リゼーションに必要であると考えられている。アデノウイルスは、ペントンファ イバー糖タンパク質を介して宿主細胞レセプターに付着し、ペントンベースによ り媒介されるレセプター媒介エンドサイトーシスのプロセスを通じて細胞に侵入 する。Adは、明らかに、包膜ヒトウイルスに類似の様式で付着および侵入のため に別個のタンパク質を利用する。 用語「再標識化された」、「再プログラムされた」、「親和性が改変された」 または「変更された親和性」とは、特にウイルスおよびウイルスベクターに適用 される場合、本明細書中で交換可能にしばしば使用され、そして内因性（または ネイティブ）の親和性が除去または改変されたウイルスベクターを同定すること が意味される。１つの変型では、ウイルスベクターのネイティブ親和性は変化さ れないか、またはそれは改変されるかもしくは除去さえされるかのいずれかであ る；しかし、このウイルスベクターはまた、変更された（すなわち、非ネイティ ブ）親和性を有するリガンドを含む。留意されるように、このような改変は、部 分的−すなわち、ウイルスベクターは、そのネイティブ親和性の少なくとも一部 を保持する−か、またはそれは、完全であり得る（これにより、ウイルスベクタ −のネイティブ親和性は完全に除去される）。 また、用語「親和性が改変された」、「変更された親和性」、および「再プロ グラムされた」はまた、ウイルスおよびウイルスベクターに適用される場合、そ のネイティブ親和性がいく通りかに変更された（例えば、部分的に改変された、 または十分に除去された）が、ベクターに新たな親和性を与えるリガンドを含み 得ないウイルスおよびベクターを包含する。そして用語「再標的化された」は、 時折このようなベクターを記載するために使用されるが、ベクターに新たな親和 性を与えるリガンドを含むベクターを記載するために、より適切に使用される。 当業者は、本明細書中の記載の状況から、変型が本明細書中に任意の所定の個所 に記載されることを、容易に認識し得るべきである。 １．ウイルス親和性の変更 特異的な細胞型に対して標的化されるウイルスベクターの開発は、ヒト遺伝子 治療の分野においてその臨床適用を増強する。この目的のために、いくつかの研 究は、親和性を拡張するかまたは制限するかのいずれかにより、ネイティブな細 胞レセプター外の細胞レセプターにウイルスを指向させるように、アデノウイル ス（Ad）親和性を変更させることに集中した。前者の概念は、そうでなければAd 感染に対して不応性の細胞において遺伝子移入を促進するために調査されるが、 後者のアプローチは、Adベクターを特異的な細胞型に標的化し、そして非標的組 織において遺伝子移入を制限する。（例えば、Wickhamら、Nature Biotech．14: 1570-1573(1996)；Wickhamら、J．Virol．70:6831-6838(1996)を参照のこと。） このような研究は、Ad親和性を拡張するために異なるアプローチを用いるが、 それらは、ネイティブAd親和性を改変するか、またはネイティブAd親和性を完全 に除去するのに適切であり得るか否か（例えば、このことがガン遺伝子治療の状 況において有効な臨床用途に十分に必要であり得るか）との問題点には取り組ん でいない。本発明は、Adベクターをそのネイティブ親和性を全く変更させること なく再標的化することを望み得る状況（Adベクターを再標的化することにより、 かつそのネイティブ親和性を減少させることにより、Ad親和性を改変することを 望み得る場合；およびAdを再標的化し、そしてそのネイティブ親和性を完全に除 去することを望み得る場合）に、さらに取り組んでいる。 本発明者らは、特異的な細胞型を標的化する顕著でかつ無類の能力を有する新 規なリガンドを発見した。さらにより驚くべきことに、これらの同じリガンドは 、一貫して、有意な量で細胞核に輸送される。結果として、これらのリガンドは 、広範な種々の「ペイロード」（例えば、治療的遺伝子産物をコードする治療的 ヌクレオチド配列、核機能および細胞機能に影響を与え得る他の分子および因子 ）の標的化および送達において使用するために特に望ましい。 例えば、効率的な標的化および送達因子としてのFGFリガンドおよび関連部分 の使用は、本明細書中に開示される。このようなリガンドは、いくつかの様式で 、ネイティブ親和性がブロックされるかまたはそうでなければ除去されたウイル スベクターに連結される場合、標的化効率は、核へのリガンド（およびそれに結 合体化されたかまたはそうでなければ連結された任意のもの）の輸送と同様に、 劇的に増加する。FGFリガンドは、広範な種々の疾患と関連し、そしてそれらの コグネートレセプターが種々の細胞型で発現されるので、このようなリガンドは 、インビトロおよびインビボでの毒素の送達において使用するために理想的であ る。 さらに、FGFリガンドがウイルスベクターと併用して用いられる場合−−すな わち、このようなベクターに新たな親和性を与える場合−−それらは同様に、治 療的ヌクレオチド配列の送達において使用するために理想的である。ウイルスベ クターがインビトロおよびインビボで遺伝子物質を効率的に送達する能力を有す る場合−−そしてAdベクターは１つのこのような例である−−、FGF関連リガン ドと改変された親和性を有するウイルスベクターとの組み合わせは、実際、強力 な組み合わせである。 以下により詳述されるように、現在、FGF関連リガンドを含む結合体を用いるA d媒介遺伝子移入が、Adが単独で用いられる場合の遺伝子移入のレベルより大き いことが観察されている。他の結合体−−例えば、Douglasら（同書、1996）の Ｆab-葉酸結合体は、FGF関連リガンドを含む結合体と同程度には効率的にAd媒介 遺伝子移入を促進し得なかった。実際に、多くのこのような結合体（Fab-葉酸結 合体を含む）は、Ad単独を用いて達成されたレベルに到達すらし得ない。 FGF関連リガンドの特異的細胞への極度に効率的な標的化および送達を達成す る顕著な能力に関する説明にも関わらず、この能力の探索が、新たな親和性およ び増強された遺伝子送達潜在能を有するウイルスベクターの開発をもたらす。 ２．例示的ウイルス：アデノウイルス 1953年におけるその発見以来、アデノウイルスは、分子生物学および細胞形質 転換のモデルとして役立っている。アデノウイルス正二十面体の頂上の五角形キ ャプソメア（ペントン）は、キャプシド中に固定されたペントンベースに非共有 結合により連結されたファイバー突出からなる。（例えば、NovelliおよびBoula nger、Virology 185:365-376(1991)；Nermut、「The Adenoviruses」、Ginsberg 編、Plenum，NY，5〜34頁(1984)；およびPettersson、「The Adenoviruses」、G insberg編、Plenum，NY，205〜207頁(1984)を参照のこと。） アデノウイルスは、直径約65〜80nm（約1400オングストローム(Å)）である非 包膜の正二十面体（20の三角形表面および12の頂点）である。ファイバーと呼ば れる構造物が、頂点のそれぞれから突出している。ファイバーの長さは、アデノ ウイルス血清型とともに変動する。タンパク質コートまたはキャプシドは、252 のサブユニット（キャプソメア）で構成され、これらのうち240がヘキソンであ り、12がペントンである。ペントンのそれぞれが、キャプシドの表面上のペント ンベース、およびベースから突出しているファイバー（これは、５つのヘキソン によって囲まれている）を含む。ペントンとの名称は、これらの幾何学的関係に 由来する。 ビリオンキャプシドポリペプチドに関して、アデノウイルスポリペプチドの詳 細な構造研究のほとんどは、Ad２型およびAd５型について行われている。従って 、本明細書中に開示される親和性が改変されたベクターの多くは、「より良好に 特徴付けられた」Ad血清型（例えば、Ad２、Ad５、およびAd21）に由来する。し かし、種々のヒトAd血清型間での相対的類似性および相同性に起因して、現在同 定されている血清型のいずれかに由来するAdベクターは、本明細書中に開示され るように改変され得る。1〜47型のヒトアデノウイルス血清型は、アメリカンタ イプカルチャーコレクション（ATCC）、Rockville，MDから現在、入手可能であ り、そして従って、特に開示された範囲内の発明に従って改変された場合、ベク ターとして有効に機能し得る。 本発明のウイルスベクターは、任意の適切および有用なウイルス血清型を用い て構築され得ることが、理解されるべきである。従って、本発明は、特定の血清 型に限定されない。 これまで試験したすべてのヒトアデノウイルスは、Ad40およびAd41（これらは 、２つのファイバータンパク質をコードし、それらのビリオンに両ポリペプチド を取り込む）を除いて単ファイバータンパク質をコードする。ファイバーは、細 胞 レセプタータンパク質と相互作用するので、これらのウイルスは、２つの独立し たレセプターを認識し得る。ファイバーは、ウイルスを細胞表面上の特異的レセ プターに付着することにより、アデノウイルス感染において決定的な役割を果た す。 アデノウイルス２（Ad２）DNAは、完全に配列決定されている最初のアデノウ イルスゲノムである；その配列は、全部で35,937bpを含む。Ad５DNAの配列は、 より最近に完了した；その配列は、全部で35,935bpを含む。多くの他のアデノウ イルスゲノムの部分もまた配列決定されている。アデノウイルスビリオンのパッ ケージング上限は、野生型ゲノム長の約105％であると、現在、理解されている 。（例えば、Bettら、J．Virol．67(10):5911-21(1993)を参照のこと。）従って 、Ad２およびAd５について、これは、DNAの約38kbのパッケージング上限である 。 複製コンピテントベクターが安全性の問題点を生じさせる恐れがあるため、複 製欠損Adウイルスベクターを使用することがいくらか好ましいが、本発明のウイ ルスベクターは、その中にパッケージングされたゲノムを発現させるウイルスベ クターの能力を保持し得る（すなわち、ウイルスはその感染性を保持し得る）が 、治療目的のために投与される被験体に疾患を引き起こす程度には感染因子とし て作用しない。 本明細書中に開示されたAd誘導ウイルスベクターは、組換えDNA技術または免 疫学的手段によって、ファイバータンパク質上に他のレセプター（例えば、FGF ）のための付着配列を取り込み、従って、キメラ分子または結合体を産生するこ とにより、遺伝子を特異的細胞に標的化および送達するために使用され得る。こ れは、宿主免疫系による認識を回避する利点とともに、広範な細胞型に遺伝子を 標的化および送達する能力を生じるべきである。開示された範囲内の標的化およ び送達系はまた、以下にさらに例示するように、それらのネイティブ親和性を利 用するウイルスベクターより、標的化および送達においてずっとより効率的であ る。従って、開示された範囲内での送達系および構築物は、増殖細胞型および非 増殖細胞型への選択した分子の安定な組み込みを可能にする、遺伝子設計におけ る増大した可動性を提供する。 例えば、公開された国際出願第WO95/26412号、米国特許第5,543,328号、およ びKrasnykhら（J．Virol．70:6839-46(1996)）（これらの開示内容は、本明細書 中に参考として援用される）は、アデノウイルスファイバータンパク質に対して 作製され得る改変を記載する。このような改変は、アデノウイルスの標的化機構 および特異性を変更させることにおいて有用であり、そして本明細書中に開示さ れた新規なウイルスベクターを異なるレセプターおよび異なる細胞に標的化する ために、本発明の構築物と併用して容易に利用され得る。さらに、その親和性を 変更させるファイバータンパク質に対する改変は、治療適用において、ウイルス ベクターの局在化より、より大きな制御を可能にし得る。 同様に、本発明の細胞株への種々の構造タンパク質の取り込みもまた、これら のタンパク質が改変されるか否かに関わらず、本発明によって意図される。従っ て、例えば、改変ペントンベースポリペプチド（例えば、Wickhamら（J.Virol.7 0:6831-8(1996)）に記載のポリペプチド）は、開示された範囲内の方法に従って 使用された場合、治療有用性を有し得る。 Ｃ．ウイルス親和性の免疫学的改変 ウイルス親和性を改変する１つの有用な方法は、免疫学的構築物を利用するこ とである。種々の開示された実施態様において、ウイルスのネイティブ親和性を 改変することおよびウイルスベクターをリガンド−特にレセプター結合、インタ ーナライジングリガンド−に連結することにより、再標的化することが好ましい 。他の実施態様において、ウイルスのネイティブ親和性を完全に除去することお よびそれを完全に新しい親和性に置き換えることが好ましい。ウイルスネイティ ブ親和性の改変の任意の程度（部分的な改変から完全な除去を含むまで）が、本 明細書中に記載のように、免疫学的手段を用いて容易に達成され得る。 例えば、ウイルスベクターを免疫学的に改変する１つの手段は、１つの「末端 」上でウイルスキャプシドタンパク質に結合し、かつ他方で標的化部分（リガン ド）に結合する二重特異的抗体の構築による。このようにして、ウイルスベクタ ーは、標的化リガンドを介して再標的化され得る。抗体の一部分が結合されるキ ャプシドタンパク質が図らずも、代表的にウイルスが細胞に結合および／または 侵入する場合に経由するタンパク質である場合、ウイルスのネイティブ親和性 も同様に影響を受ける。 他の免疫学的手段もまた利用可能である。融合タンパク質の構築−例えば、リ ガンド-sFv融合−は、ウイルスベクターを免疫学的に改変する別の方法である。 前出の例に類似して、融合物のリガンド部分は、ベクターに新規な親和性を与え 、一方、抗体部分はリガンドをベクターに連結させる。前と同様に、抗体部分が 結合するウイルスキャプシドタンパク質の機能に依存して、抗体の付着もまた、 ウイルスのネイティブ親和性に干渉し得るか、または除去し得る。 さらに、これらの方法はむしろより非効率的であるが、当業者は、多重抗体ま たはそれらのフラグメント−例えば、ウイルスのネイティブ親和性を改変または 除去するが、再標的化目的のためにリガンドに結合しない抗体、および再標的化 リガンドに結合し、そしてウイルスキャプシドにこれを付着する抗体−を容易に 産生し得る。当業者はまた、類似の目的−すなわち、新たなリガンドをウイルス ベクターに連結させる、および／またはウイルスのネイティブ親和性を改変する −のために、抗イディオタイプ抗体を産生し得る。 しかし、当業者が想起し得るように、遺伝子標的化および送達目的のためにウ イルスベクターを使用することを意図する場合、構築物がより「バルク状」でな いほど、これは細胞へ、および細胞中により容易に送達され得る。従って、標的 化リガンドをウイルスキャプシドに連結するように機能し、そしてウイルスのネ イティブ親和性を同時に改変する抗体フラグメントを用いる構築物は、遺伝子治 療適用において使用するために、より理想的である。 １．リガンドに結合体化された抗ウイルス抗体 本明細書中で議論するように、増殖因子レセプター結合リガンド−−特にFGF レセプターと反応性のポリペプチド−−は、特に有用な再標的化因子である。 ウイルスを中和し、またはそのネイティブ親和性を用いて細胞を標的化しそし て細胞へ結合することからウイルスをブロックする任意の抗体が、本明細書中で 意図されるが、アデノウイルス抗ノブ抗体およびそれらのフラグメントを例示と して本明細書中に記載する。抗ノブ抗体およびそれらの免疫学的に活性なフラグ メントを調製および使用する方法を、続く実施例において、さらに記載する。同 様に、抗体−リガンド結合体を調製および使用する方法もまた記載する。 抗ウイルス抗体を調製する他の方法（およびそのように調製された抗体）は、 利用可能であり、そして同様に、開示された範囲内の方法に従って有用である。 例えば、米国特許第5,521,291号（その開示内容は、本明細書中に参考として援 用される）は、そのヘキソンタンパク質の外部ドメインに曝露された異種エピト ープを有するキメラアデノウイルスを調製する方法を記載する。使用される方法 に依存して、ネイティブウイルス親和性の改変の程度−無変更から完全な除去ま でのすべての範囲であり得る−、本明細書中に開示のように調整され得る。 以前に議論したように、アデノウイルスベクターは、有効な遺伝子治療に決定 的である開示された範囲内の標的化および送達適用と一致したインビボ遺伝子移 入特徴を有する。アデノウイルスベクターの投与後、３つの異なる連続的な工程 が、一般に、標的細胞における治療遺伝子の発現のために必要であると理解され る：（１）標的細胞の表面上の特異的レセプターへのアデノウイルスベクターの 付着；（２）ウイルスのインターナリゼーション；および（３）遺伝子を発現し 得る核への遺伝子の移入。従って、アデノウイルスベタターの親和性を改変する いかなる試みも、これらの３つの機能を効率的に行うベクターの能力を好ましく 維持する。アデノウイルス侵入経路の理解もまた、特異的細胞型の標的化を可能 にするためのアデノウイルスベクターの親和性を改変する試みを促進するべきで ある。 例えば、治療目標が、腫瘍細胞特異的標的化についてのAd親和性の改変である 場合、２つの関連した要件が関与する。第一に、遺伝子移入を腫瘍標的にもっぱ ら制限するために、内因性ウイルス親和性の除去が好ましくは達成される。第二 に、新たな結合特異性が、新生物細胞を特徴付ける細胞表面マーカーの認識を可 能にするために、アデノウイルスファイバータンパク質に導入されなければなら ない。中和抗ノブモノクローナル抗体（Mab）による内因性アデノウイルス親和 性の除去、それにより、このMabへの細胞特異的リガンドの結合体化による新規 な親和性の導入を可能にすることを、以下の実施例１においてさらに議論する。 ２．二重特異的抗体 ａ．背景 前出の方法に加えて、Adキャプシドタンパク質（例えば、ノブタンパク質）お よび標的細胞特異的レセプターを認識する二重特異的抗体を産生することにより 、内因性アデノウイルス親和性を除去することもまた可能である。FGFレセプタ ーと反応性のポリペプチドは、以下により詳細に議論するように、この点におい て有用である例示の標的化リガンドである。 FGF2および細胞毒素をコードする融合されたcDNAを用いる本発明者らの以前の 研究は、FGF2が、DNAを特異性を伴い細胞に導入するビヒクルとして役立ち得る ことを確立した。これらの研究に基づいて、FGF2抗ノブFab複合体は、現在、開 示された範囲内のアデノウイルスベクターをFGFレセプター保有細胞に特異的に 標的化するそれらの能力について探索されている（以下の実施例を参照のこと） 。 組換えアデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボで遺伝子を広範 な細胞型に効率的に移入する能力を有する。このために、アデノウイルスベクタ ーは、多くの異なる遺伝子治療アプローチにおいて使用されている。しかし、ア デノウイルスは、親アデノウイルスの親和性がとても広いので、細胞特異的標的 化遺伝子送達を達成する能力を欠損し、全身性インビボ送達後の種々の終末器の 広範な形質導入を可能にする。この広範な親和性は、アデノウイルスについての 細胞結合レセプターが偏在的に発現されるという事実に基づく。アデノウイルス のこの特性が、散在する腫瘍細胞の特異的形質導入を達成するための候補系とし てのアデノウイルスベクターの潜在的な有用性を害する。アデノウイルスベクタ ーが腫瘍特異的標的化ができないことにより、送達された抗ガン遺伝子構築物は 異所で発現される。従って、血管経路を介して高効率のインビボ遺伝子送達を達 成するアデノウイルスベクターの能力にも関わらず、手段は、その親和性を腫瘍 標的に特異的に再指向させるように開発されなければならない。このことは、内 因性ウイルス親和性の除去および新規な親和性の導入の両方を必要とする。 上記の考慮に基づいて、本発明者らは、アデノウイルス親和性の改変が、腫瘍 細胞特異的形質導入を達成し得ると仮定した。 多くの研究は、レトロウイルス細胞結合活性または親和性が、細胞表面上の特 異的レセプターと相互作用するウイルス包膜糖タンパク質の改変により変更され 得ることを示している。１つのアプローチは、「偽型」（ここで、レトロウイル スゲノムは、別のウイルスの包膜タンパク質によりコートされている）の構築を 包含した（例えば、Weissら、Virology 76:808-25(1977)を参照のこと）。従っ て、偽型粒子の宿主範囲は、包膜タンパク質を提供するウイルスにより指示され る。 ｂ．二機能性scFv-FGF2融合タンパク質の構築 中和抗ノブmAbである1D6.14を、Douglasら（同書(1996)）により記載されるよ うに産生した。この手順は、本質的には以下のように記載され得る。mbのFabフ ラグメントもまた、本明細書中に記載のように、種々の構築物において使用する ために調製される。融合タンパク質の構築におけるその使用に加えて、mAbおよ びそれらのフラグメントも同様に、FGF-Fab構築物を調製するために使用される （以下の実施例１、A.4節を参照のこと）。 中和抗ノブmAbを開発するために、ハイブリドーマを、マウスをインタクトな Ａd5で免疫し、その後２回精製組換えAd5ノブで免疫した後、標準技術により産 生した。BABL/cマウスをAd5で免疫した後、２回組換えAd5ノブ（R.D．Gerard（U niv．of Texas）からの贈与物）で免疫した。（Henryら、J．Virol．68:5239-52 46(1994)もまた参照のこと。）感作したリンパ球をP3-X63-Ag8.653細胞と融合し た。ハイブリドーマ上清のトリマーAd5ノブとの反応性をELISAで決定した。ハイ ブリドーマ上清がAd5感染を中和する能力を、終点CPEによってアッセイした。 組換えAd5ノブへのその高親和性結合およびHeLa細胞のAd5感染を中和するその 能力に基づいて、１つのクローン（1D6.14と称する）をさらなる研究のために選 択した。選択されたmAbを、固定プロテインＡカラムを用いるアフィニティーク ロマトグラフィーによって腹水液から精製した。 Fabフラグメントを、インタクトな1D6.14をパパインで消化した後、調製およ び精製した。親抗体およびFabフラグメントの両方が、用量依存様式でアデノウ イルス感染を中和し得た。（Douglasら、同書(1996)）。 単鎖ScFvを産生するために、標準技術を用いて、mRNAをハイブリドーマから単 離し、ScFvをスプライス部位重複伸長PCRによって産生した（Miller、R.ら、原 稿準備中）。この抗ノブscFv01D6は、二重特異的再標的化融合タンパク質を産生 するために用いられる。これは、01D6 pET25 E.coil発現ベクターへのPCRに基づ くクローニングによるFGF2リガンドの遺伝子挿入によって達成される。便宜的な 制限部位であるNcoおよびNhelを、簡易なクローニングのためにそれぞれ5'およ び3'に付加した。 増幅された重鎖および軽鎖産物をpET25発現ベクター（Novagen，Milwaukee，W I）にクローニングした。発現ベクターpET25は、T7 RNAポリメラーゼのプロモー ター、Iacオペレーター、pelBリーダー配列、pelBとインフレームなNcol制限部 位、HSVTag配列、およびHis Tag配列を含む。FGF2は、Ｎ末端およびＣ末端の両 方の融合タンパク質として発現される。 さらに、可撓性リンカーが、scFvとFGF2との間に付加され得、適切なタンパク 質折り畳みに有利になるのを助ける。FGF2をscFvの下流にクローニングする１つ のストラテジーを以下に記載する。ScFv-FGF2融合タンパク質をクローニングす るために、ScFvにおける終止コドンを除去し、そしてヒトFGF2をScFvの下流にSc Fvとインフレームでクローニングする。終止コドンを除去し、そしてScFvに制限 部位を付加するために使用され得るオリゴは、以下を含む（5'〜3'で）： これらのプライマーを使用するPCR増幅は、465bpフラグメントを生じる。PCR 産物は、Eco RIおよびNde 1部位を5'および3'末端に有する。増幅されたフラグ メントを、好ましくは、Eco R1およびNde 1で消化し、ゲル電気泳動によって単 離し、そしてGENECLEAN（Bio 101，Vista，CA）を使用して精製する。FGF2を、 制限酵素Nde 1およびBam H1で消化することによって、pET 11a FGF2発現ベクタ ー（PRIZM，San Diego，CAで以前に生成された）から得る。 ScFvの残りの部分を、pET25 ScFvのNco 1およびEco R1での消化によって単離 する。消化されたフラグメントを、アガロースゲルによって単離し、そしてGENE CLEANを使用して精製する。精製したフラグメントを、Nco 1およびBam H1消化pE T25とともに４ウェイ連結(4-way ligation)で連結する。連結物は、Novablue（N ovagen）に形質転換され得、そしてクローンを、フラグメントの挿入について 評価し、そしてさらに正確な制限マップについて分析する。正確な制限マップを 有するクローンのグリセロールストックをまた、好ましくは生成する。DNAを精 製し、そして評価のために配列決定する。 c．ScFv-FGF2 融合タンパク質の発現、精製、および評価 コンピテント細菌細胞であるBL21(DE3)を、pET25 pelB ScFv-FGF2およびpET25 pelB ScFv構築物で形質転換する。発現のために、プラスミドで形質転換した宿 主細胞を、25〜30℃で0.7のOD600まで増殖させ、そしてIPTGで誘導する。培養物 を誘導後３〜４時間で収集する。懸濁液を遠心分離する；上清を明澄化し、そし てScFv-FGF2またはScFvタンパク質のいずれかについてELISAによってアッセイす る。ScFvおよびScFv-FGF2融合タンパタ質は、重鎖および軽鎖の両方に対する抗 血清ならびにFGF2に対する抗血清によって認識され得る。ペレットおよび上清の サンプルを、SDS-PAGE、ならびにFGF2および重鎖および軽鎖に対する抗体を使用 するウエスタン分析によって分析し、各画分内の融合タンパク質のパーセントを 決定する。融合タンパク質がペレットに分画されたら、次いで、再折り畳みの方 法（例えば、６Ｍグアニジン溶液中での溶解、および非変性緩衝液中への緩やか な透析）を試みる。あるいは、ペリプラズムタンパク質が、浸透圧ショックによ って単離され得、そして融合タンパク質についてアッセイされ得る。精製を、ヘ パリンクロマトグラフィーか、または金属キレート樹脂アフィニティークロマト グラフィーを使用して融合タンパタ質のN末端でのHis Tagを介してのいずれかで 達成する。精製された融合タンパク質を、ELISAによってFGF2抗体被覆プレート かまたは重鎖および軽鎖抗体被覆プレートのいずれかを使用して結合活性につい て試験し、そしてアルカリホスファターゼで検出する。本発明者らは、はじめに この構築物をE.coliにおける発現のために設計した。しかし、ScFv-FGF2融合タ ンパク質の発現が、細菌において非常に低い場合、融合タンパク質は、容易に制 限酵素で切り出され得、そしてVhリーダー配列を使用して哺乳動物発現ベクター 中に連結され得る。 アデノウイルスの再標的化において有用であるために、組換え融合タンパク質 は、アデノウイルスノブ（knob）およびコグネートレセプターの両方に結合しな ければならない。従って、これらのタンパク質は、ELISAにおけるそのノブ結合 能力について分析される。これらがその天然の３量体形態のノブに結合すること を確証するために、各タンパク質を使用して、免疫ブロットにおいて煮沸したお よび煮沸していない組換えAd5ノブをプローブする。最後に、中和アッセイをAdC MVLucを使用して行う。レセプター結合ドメインの機能性を試験するために、結 合およびインターナリゼーションアッセイをレセプター陽性細胞において行う。 精製されたScFvを、予備結果にて概説したように内皮細胞においてレセプター結 合について試験する。さらに、結合およびインターナリゼーション研究を、融合 タンパク質について完了する。これは、レセプター陽性細胞を、インターナリゼ ーションを防止するために、[¹²⁵I]放射標識scFv-FGF2融合タンパク質とともに ４℃でインキュベートすることによって行われる。非結合のタンパク質を除去し た後に、遊離したそして細胞に結合した画分における放射能の量を、シンチレー ションカウンターにて決定する。結合特異性を、非標識の融合タンパク質をコン ペティターとして含めることによって決定する。融合タンパク質のインターナリ ゼーションは、レセプター陽性細胞を標識した融合タンパク質と４℃でプレイン キュベートし、細胞を洗浄して非結合の標識タンパク質を除去し、種々の時間間 隔で37℃まで温め、レセプターのインターナリゼーションを可能にすることによ って決定される。表面結合放射標識タンパク質を除去するための２Ｍ塩抽出の後 に、細胞を溶解し、そして放射能を細胞溶解物において決定する。この分析は、 組換え二重特異的融合タンパク質の、Ad5ノブ、および融合タンパク質の状況で のFGFレセプターに結合する能力、ならびに内因性アデノウイルス親和性を除去 する能力を決定する。次いで、これらの分子を、そのアデノウイルス感染を上記 のようにFGFレセプターを介して標的化する能力について評価する。 Ｄ．ウイルスタンパク質の遺伝子改変または化学的改変 ウイルス粒子--例えば、アデノウイルスタンパク質--は、分子レベルで選択的 に改変され得る。従って、例えば、リガンド分子をコードするヌクレオチド配列 は、発現のためにウイルスヌクレオチド配列に（特に、構造タンパク質をコード する配列に）作動可能に連結され得る。 従って、融合タンパク質、およびウイルスタンパク質の他の改変を構築し得る 。例えば、アデノウイルスのファイバータンパク質は、アデノウイルスファイバ ータンパク質をコードする遺伝子のC末端への異種ヌクレオチド配列の付着を介 して改変され得る。あるいは、１つ以上の異種配列が内部部位で（すなわち、ウ イルスファイバータンパク質配列内に）挿入され得る。 このような融合物を調製する種々の方法は、当該分野で利用可能であり、そし て本発明によって意図される。例えば、米国特許第5,543,328号（その開示が本 明細書中で参考として援用される）は、アデノウイルスファイバータンパク質の 全部または一部を除去し、そして除去された部分を特定の細胞レセプターに特異 的なリガンドで置換するための方法を記載する。 同様に、Michaelらは、ガストリン放出ペプチド（GRP）の末端デカペプチドを コードする配列をAd5ファイバー遺伝子のコード配列の3'末端に置くことによる 、Adファイバータンパク質への短いペプチドリガンドの付加を提唱した(Gene Th erapy 2:660-668(1995)（本明細書中で援用される）を参照のこと)。Wickhamら は、ヘパリン結合ドメインをAd5ファイバータンパク質に付加し、そしてAdベク ターが新たな親和性を示すことを観察した。(Nature Biotech．14:1570-1573(19 96)（本明細書中で援用される）を参照のこと）。前述の構築物が本明細書中で 開示されるように有用であり得るが、これらのうちのどれも、本発明の構築物で 得られる標的化効率および核トラフィッキングにおける予期しない、劇的な増大 を生成しなかった。 最後に、ウイルスタンパク質が、正確には「免疫学的」または「遺伝子的」で はない手段によって改変され得ることもまた理解されるべきである。ウイルスタ ンパク質の、本明細書中で例示される以外の手段による改変は、本発明の範囲内 に完全にある。例えば、本発明の有用な再プログラム化ベクターは、その天然の 親和性の化学的改変（例えば、ウイルスの化学的不活化による）を行い得、そし て引き続いてこれらは別の分子、またはウイルスベクターを再標的化するために 設計されたプロセスによって「再活性化」され得る。 従って、熱不活化は、本発明のウイルスベクターになされ得る化学的改変の範 囲内に指向される１つの方法である。ベクターの内因性の親和性の除去を破壊す る様式での分子部分（例えば、ファイバータンパク質）の化学的改変もまた、本 明細書中で意図される。化学的手段によるウイルスタンパク質の改変の方法は、 当業者に公知であり、そして関連する文献において容易に確認され得る。 Ｅ．リガンド 上記のように、本発明は、ベクターの再標的化を補助するための、ウイルス（ またはウイルスベクター）の親和性を「再プログラミングする」種々の方法（FG Fタンパク質、ポリペプチド、アナログ、または模倣物のようなリガンドを利用 する方法を含む）を提供する。特定のリガンドが例示として記載されているが、 広範な種々の分子が開示される方法論の範囲内によるリガンドとして適切に使用 され得ることが当業者に理解される。以下のリストは、網羅的ではないが、予め 選択された細胞を特異的に標的化し、そしてベクター、結合体、または複合体（ これとともにリガンドが細胞中へと付随する）を、理想的には、核へ指向させる ための使用のための種々の有効なリガンドのより良い理解を提供する。 １．細胞に結合し、インターナリゼーションするタンパク質 リガンドは、ウイルス（例えば、アデノウイルス）タンパク質への付着のため の調製において組換えまたは他の手段により産生され得る。これらのリガンドの 配列を得るためのDNA配列および方法は周知である（GenBankを参照のこと）。DN A配列に基づいて、遺伝子は、合成的に（低分子について）合成されるか、細胞 ゲノムもしくはcDNAから増幅されるか、ゲノムもしくはcDNAライブラリーなどか ら単離されるかのいずれかであり得る。ウイルスベクターへのクローニングを容 易にするための制限部位が、例えば、増幅のためのプライマーに組み込まれ得る 。 このような分子には（限定することなく）、癌細胞、内皮細胞、心血管細胞、 眼内の細胞などに結合するタンパク質が含まれる。このようなリガンドには、増 殖因子およびサイトカインが含まれる。多くの増殖因子および増殖因子のファミ リーは、構造的および機能的特徴を共有し、そして本発明において使用され得る 。増殖因子のファミリーには、線維芽細胞増殖因子FGF-1からFGF-15、および血 管内皮増殖因子（VEGF）が含まれる。他の増殖因子（例えば、PDGF（血小板由来 増 殖因子）、TGF-α（トランスホーミング増殖因子）、TGF-β、HB-EGF、アンギオ ゲニン、ボンベシン（bombesis）、エリスロポエチン、幹細胞因子、M-CSF、G-C SF、GM-CSF、およびエンドグリンもまた、細胞表面で特異的に同定されたレセプ ターに結合し、そして本発明において使用され得る。サイトカイン（インターロ イキン、CSF（コロニー刺激因子）、およびインターフェロンを含む）は、特異 的なレセプターを有し、そして本明細書中で記載されるように使用され得る。 例えば、リガンドおよびリガンド/レセプター対には、ウロキナーゼ/ウロキナ ーゼレセプター（GenBank登録番号X02760/X74309）；α-1,3フコシルトランスフ ェラーゼ、α1-アンチトリプシン/E-セレクチン（GenBank登録番号M98825，D382 57/M87862）；P-セレクチン糖タンパク質リガンド、P-セレクチンリガンド/P-セ レクチン（GenBank登録番号U25955，U02297/L23088）、VCAM1/VLA-4（GenBank登 録番号X53051/X16983）；E9抗原(Blannら、Atherosclerosis 120;221，1996)/TG Fβレセプター；フィブロネクチン（GenBank登録番号X02761）；Ｉ型α1-コラー ゲン（GenBank登録番号Z74615）、Ｉ型β２コラーゲン（GenBank登録番号Z74616 ）、ヒアルロン酸/CD44（GenBank登録番号M59040）；CD40リガンド(GenBank登録 番号L07414)/CD40(Genbank登録番号M83312);elk-1（GenBank登録番号M25269）に ついてのELF-3、LERTK-2リガンド（GenBank登録番号L37361、U09304)；VEカドヘ リン（GenBank登録番号X79981）;カテニンについてのリガンド；LFA-1、および フォンビルブランド因子（GenBank登録番号X04385）についてのICAM-3（GenBank 登録番号X69819）リガンド、ならびにα_vβ₃インテグリン（GenBank登録番号U07 375、L28832）についてのフィブリノーゲンおよびフィブロネクチン（GenBank登 録番号X92461）リガンドが含まれる。 他のリガンドには、CSF-1（GenBank登録番号M11038，M37435）；GM-CSF(GenBa nk登録番号X03021）；IFN-α（インターフェロン）(GenBank登録番号A02076;WO8 502862-A)；IFN-γ(GenBank登録番号A02137;W08502624-A)；IL-1-α（インター ロイキン１α）(GenBank登録番号X02531，M15329);IL-1-β（インターロイキン1 β）(GenBank登録番号X02532，M15330，M15840);IL-1(GenBank登録番号K02770， M54933，M38756);IL-2(GenBank登録番号A14844，A21785，X00695，X00200，X002 01，X00202);IL-3(GenBank登録番号M14743，M20137);IL-4(GenBank登 録番号M13982);IL-5(GenBank登録番号X04688，J03478);IL-6(GenBank登録番号Y0 0081，X04602，M54894，M38669，M14584);IL-7(GenBank登録番号J04156);IL-8（ GenBank登録番号Z11686）；IL-10（GenBank登録番号X78437，M57627）IL-11(Gen Bank登録番号M57765，M37006);IL−13(GenBank登録番号X69079，U10307);TNF-α （腫瘍壊死因子）(GenBank登録番号A21522);TNF-β(GenBank登録番号D12614);ウ ロキナーゼ/ウロキナーゼレセプター(GenBank登録番号X02760/X74309);α-1,3フ コシルトランスフェラーゼ、α1-アンチトリプシン/E-セレクチン(GenBank登録 番号M98825，D38257/M87862);P-セレクチン糖タンパク質リガンド、P-セレクチ ンリガンド/P-セレクチン(GenBank登録番号U25955，U02297/LO1574);VCAM1/VLA- 4インテグリンレセプター(GenBank登録番号X53051/X16983およびL12002);E9(Bla nnら、Atherosclerosis 120:221，1996)/TGFβレセプター；フィブロネクチン(G enBank登録番号X02761);Ｉ型^α1コラーゲン(GenBank登録番号Z74615)、Ｉ型β２ コラーゲン(GenBank登録番号Z74616)、ヒアルロン酸/CD44(GenBank登録番号M590 40);CD40リガンド(GenBank登録番号L07414)/CD40(GenBank登録番号M83312);elk- 1(GanBank登録番号M25269)についてのEFL-3、LERTK-2リガンド（GenBank登録番 号L37361，U09304）；カテニンについてのVE-カドヘリン(GenBank登録番号X7998 1)リガンド；LFA-1、およびフォンビルブランド因子（GenBank登録番号X04385） についてのICAM-3（GenBank登録番号X69819）リガンド、α_vβ₃インテグリン（G enBank登録番号U07375，L28832）についてのフィブリノーゲンおよびフィブロネ クチン（GenBank登録番号X92461）リガンド、ならびにerbB2についてのGP30リガ ンド（S68256）が含まれる。 なお他のリガンドには、PDGF(GenBank登録番号X03795，X02811)、アンギオテ ンシン(GenBank登録番号K02215)、および全てのRGD含有ペプチドおよびタンパク 質（例えば、インテグリンレセプターに結合するICAM-1(GenBank登録番号X06990 )およびVCAM−1(GenBank登録番号X53051)）が含まれる。他のリガンドには、TNF α(GenBank登録番号A21522，X01394)、IFN-γ（GenBank登録番号A11033，A11034 ）、IGF-I(GenBank登録番号A29117，X56773，S61841，X56774，S61860)、IGF-II (GenBank登録番号A00738，X06159，Y00693)、心房性ナトリウム利尿ペプチド（G enBank登録番号X54669）、エンドセリン-1（GenBank登録番号Y00749）、凝 固因子Xa(GenBank登録番号L00395，L00396，L29433，N00045，M14327)、TGF-β1 （GenBank登録番号A23751）、IL-1α(GenBank登録番号X03833)、IL-1β（GenBan k登録番号M15330）、およびエンドグリン(endoglin)（GenBank登録番号X72012） が含まれる。 a．増殖因子 1)線維芽細胞増殖因子 本発明の状況内で使用され得る増殖因子の１つのファミリーは、線維芽細胞増 殖因子（FGF）ファミリーである。FGFファミリーのメンバーは、高度のアミノ酸 配列類似性および共通の物理的および生物学的特性（１つ以上のFGFレセプター に結合する能力を含む）を有する。 タンパク質のこのファミリーには、FGF-1（酸性FGF（aFGF））、FGF-2(塩基性 FGF(bFGF))、FGF-3(int-2)(例えば、Mooreら、EMBO J.5:919-924，1986を参照の こと)，FGF-4(hst-1/K-FGF)(例えば、Sakamotoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1836-1840，1986;米国特許第5,126,323号を参照のこと)、FGF-5(例えば、米 国特許第5,155,217号を参照のこと)、FGF-6(hst-2)(例えば、公開された欧州特 許出願EP 0 488 196A2; Udaら、Oncogene 7:303-309，1992を参照のこと)、FGF- 7(ケラチノサイト増殖因子)(KGF)(例えば、Finchら、Science 245:752-755，198 5;Rubinら、Proc.Natl.Acad．Sci．USA 86:802-806，1989;および国際特許出願W O90/08771を参照のこと)、FGF-8(例えば、Tanakaら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 89:8528-8532，1992を参照のこと);FGF-9(Miyamotoら、Mol．Cell．Biol．13 :4251-4259，1993を参照のこと);FGF−11(WO96/39507);FGF-13(WO96/39508);FGF -14(WO96/39506);FGF-15(WO96/39509)と命名されたFGFが含まれる。FGFレセプタ ーと反応性であり、FGFレセプター（好ましくは、高親和性FGFレセプター）と特 異的に相互作用する任意のポリペプチドであり、FGFレセプターとの相互作用に よってエンドソームを経由して細胞内に輸送される他のポリペプチドが、本発明 の範囲内で適切である。 FGFペプチドおよび/またはFGFのアミノ酸配列をコードするDNAは周知である。 例えば、ヒトFGF-1(Jayeら、Science 233:541-545，1986；米国特許第5,223,4 83号)、ウシFGF-2(Abrahamら、Science 233:545-548，1986;Eschら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 82:6507-6511，1985;および米国特許第4,956,455号)、ヒトFG F-2(Abrahamら、EMBO J．5:2523-2528，1986;米国特許第4,994,559号；米国特許 第5,155,214号、EP470,183B;およびAbrahamら、Quant．Biol．51:657-668，1986 )、ラットFGF-2(Shimasakiら、Biochem．Biophys．Res．Comm.，1988、およびKu rokawaら、Nucleic Acids Res．16:5201，1988を参照のこと）、FGF-3、FGF-6、 FGF-7、およびFGF-9をコードするDNAは、公知である（米国特許第5,155,214号； 米国特許第4,956,455号：米国特許第5,026,839号；米国特許第4,994,559号、EP0 ,488,196A2、EMBLまたはGenBankデータベース、ならびに本明細書中で議論され る参考文献もまた参照のこと）。 FGFは、広範な種々の間葉細胞、内分泌細胞、および神経細胞に対して分裂促 進的な効果を示し、そしてまた分化および発生において重要である。FGFは、副 行の（collateral）血管新生および新脈管形成を剌激し、これは引き続く節で考 察するように、それらを「有効荷重(payload)」としてもまた有用にする。いく つかの場合には、FGF-誘導分裂促進的刺激が有害であり得る。例えば、細胞増殖 および新脈管形成は、腫瘍増殖の不可欠な局面である。FGFファミリーのメンバ ー（FGF-2を含む）は、例えば、腫瘍発達、慢性関節リウマチ、増殖性糖尿病性 網膜症、および糖尿病の他の合併症において病態生理学的な役割を果たすと考え られている。有糸分裂誘発を低減または排除するために、FGFのムテインが以下 に記載のように使用および構築され得る。このようなムテインは、高親和性およ び低親和性レセプターに結合する能力を保持する。 FGFレセプターと反応性であるポリペプチドはまた、特に腫瘍および悪性細胞 を標的化するのに有用であるのみならず、過剰増殖する細胞一般を標的化するの に有用である。従って、一例を挙げれば、FGF-7（これはまたKGFとしても知られ る）は、本発明のベクターおよび構築物を、過剰増殖するSMCおよび種々の内皮 細胞に標的化するために使用され得る。KGFはまた、肝細胞および肺のII型肺胞 細胞を標的化するのに特に有用である。 FGFの効果は、FGF応答性細胞の細胞表面に存在する高親和性レセプターチロシ ンキナーゼによって媒介される(例えば、PCT WO91/00916，WO90/05522，PCT WO 92/12948;Imamuraら、Biochem．Biophys．Res．Comm．155:583-590，1988;Huang ら、J．Biol．Chem．261:9568-9571，1986;Partanenら、EMBO J．10:1347，1991 ;およびMoscatelli，J．Cell．Physiol．131:123，1987を参照のこと)。低親和 性レセプターはまた、FGF活性の媒介において役割を果たすようである。高親和 性レセプタータンパク質は、構造的に関連したFGFレセプターのファミリーを構 成する細胞型によって分子量が110〜l50kDの範囲にわたる一本鎖ポリペプチドで ある。４つのFGFレセプター遺伝子が同定されており、そのうち３つが一次転写 物のオルタナティブスプライシングを介して多数のmRNA転写物を生成する。いく つかのレセプターの特異性が開示されている。例えば、FGF-9は、内皮細胞およ び軟骨肋骨において発現されるFGFR3に特異的に結合し、内皮細胞は、FGFR3IIIb のみを発現し、一方、間葉細胞は、FGFR3IIIbおよびFGFR3IIIcを発現する。 リガンドとしてのその使用に加えて、種々の形態のFGFが、遺伝子療法適用の ための「有効荷重」として使用され得る。FGF cDNAまたはゲノムFGF DNAが、こ のような治療的使用のためにしばしば好ましいが、他の形態もまた有効に使用さ れ得る。FGF DNA使用の治療的局面は、以下のＦ節においてさらに詳細に記載さ れる。 ２）血管内皮細胞増殖因子 血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、細胞増殖を直接刺激し、新脈管形成を増強 し、グルコース輸送を増強し、そして血管の透過性において迅速でかつ可逆的な 増大を引き起こし得る。VEGFは、正常な発達の間に、そして特定の正常な成人器 官において発現される。精製されたVEGFは、塩基性であり、ヘパリン結合性であ り、熱安定性、酸安定性のホモ二量体糖タンパク質であり、そして還元剤によっ て不活化し得る。従って、VEGFレセプターと反応性であるポリペプチドは、本発 明の状況におけるリガンドとしての使用が意図される。 このファミリーのメンバーは、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、血管透過性因 子(VPF)、およびバスキュロトロピン（vasculotropin)(例えば、Plouetら、EMBO J．8:3801-3806，1989を参照のこと)として様々に呼ばれる。本明細書中では、 これらを集合的にVEGFと呼ぶ。 VEGFをコードするDNA配列およびこれらの配列を単離するための方法は、主に 米国特許第5,240,848号、米国特許第5,332,671号、米国特許第5,219,739号、米 国特許第5,194,596号、およびHouchら、Mol．Endocrin．5:180，1991に見出され 得る。 VEGFをコードするDNAは、VEGFファミリーの任意のこのようなメンバー（VEGF 遺伝子から転写されたRNAのオルタナティブスプライシングから生じるVEGFイソ 形態を含む（例えば、GENENTECH，INC.の米国特許出願第07/351,361号、同第07/ 369,424号、同第07/389,722号に基づく国際PCT出願第W090/13649号、および米国 特許出願第07/351,361号、同第07/369,424号、同第07/389,722号に基づく任意の 米国特許;Merck & Co.の欧州特許出願第EP 0 506 477 A1およびEP 0 476 983 A1 ；Houckら（1991）Mol．Endo．5:1806-1814を参照のこと）をコードするDNAをい う。遺伝子コードの縮重によるコドンにおける置換は、このようなVEGFをコード するDNAに包含されることもまた理解される。VEGFポリペプチドをコードするDNA は、当業者に公知の任意の供給源から得られ得る；これは、上記の任意の特許お よび特許出願に記載されるように調製された市販の供給源から、標準的なクロー ニング法を使用して単離され得るか、合成され得るか、または入手され得る。 VEGFの４つの分子種は、mRNAのオルタナティブスプライシングから生じ、そし て121、165、189、および206のアミノ酸を含有する。種々の正常な細胞および形 質転換された細胞によって分泌される主要なイソ形態はVEGF₁₆₅である。分泌さ れたイソ形態VEGF₁₂₁およびVEGF₁₆₅は、好ましいVEGFタンパク質である。より長 いイソ形態VEGF₁₈₉およびVEGF₂₀₆は、細胞外マトリックスに結合し、そしてスラ ミン、ヘパリンもしくはヘパリナーゼ、またはプラスミンのような薬剤によって 放出されることが必要である。VEGF₁₂₁は、ヘパリン結合ドメインを欠く弱酸性 のポリペプチドであり、そして結果としてヘパリンに結合しない。他の好ましい VEGFタンパク質は、タンパク質がなおVEGFレセプターに結合し、そしてインター ナリゼーションされるように、VEGFエキソンの種々の組み合わせを含有する。 本発明の状況においてリガンドとして使用されるVEGFタンパク質が、任意のイ ンビボでのその生物学的活性（例えば、内皮細胞増殖を刺激すること）を保持す ることも、細胞上のVEGFレセプターに結合する以外にヘパリンに結合し、そして インターナリゼーションされることもいずれも必要ではない。しかし、特定の状 況では、VEGFがその特定の生物学的活性を示すことが所望され得る。例えば、VE GFが、創傷治癒において有用な分子をコードするDNAについてのキャリアとして 用いられる場合、VEGFが血管透過性活性、ならびに線維芽細胞の移動および新脈 管形成の促進を示すことが所望される。以下の第Ｆ節にさらに記載するように、 VEGFがペイロード（payload）として用いられる場合、このような能力の保持も また所望される。VEGFのどの活性を保持することが所望されるかは、本願の中に 提供した教示から明らかである。 静止期および増殖中の内皮細胞は、VEGFに高親和性で結合し、そしてVEGFに対 する内皮細胞の応答は、高親和性の細胞表面レセプターにより媒介されるようで ある（例えば、PCT出願WO 92/14748、米国特許出願第08/657,236、de Vriesら， Science 255:989-91，1992;Termanら，Biochem．Biophys．Res．Commun．187:15 79-1586，1992;Kendallら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10705-10709，1993 ;およびPetersら,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8915-8919，1993を参照のこ と）。２つのチロシンキナーゼは、VEGFレセプターとして同定されている。fms 様チロシンキナーゼまたはFLTとして公知の第１のものは、VEGFに特異的なレセ プターチロシンキナーゼである。成体および胚の組織において、FLT mRNAの発現 は、内皮および内皮を生じる細胞集団に局在している。第２のレセプターである KDR（ヒトキナーゼインサートドメイン含有レセプター）およびそのマウスホモ ログFLK-1は、FLTに密接に関連している。KDR/FLK-1レセプターは、内皮におい て、胎児の成長段階の間に、胚発生の初期段階の間に、そして成体組織において 発現される。さらに、FLTおよびKDRをコードするメッセンジャーRNAは、腫瘍血 管において、そして特に神経膠芽腫を供絵する血管の内皮細胞により同定されて いる。同様に、FLTおよびKDRのmRNAは、侵襲性ヒト結腸腺ガンにおける腫瘍血管 においてアップレギュレートされるが、隣接する正常組織の血管においてはそう ではない。 3)ヘパリン結合上皮増殖因子 HBEGFは、ウシ大動脈平滑筋細胞およびヒトA431類表皮ガン細胞上のEGFと同じ 高親和性レセプターと相互作用する（Higashiyama，science 251:936-939，1991 ）。HBEGFは、BALB/c 3T3線維芽細胞および平滑筋細胞を含む広範囲な種々の細 胞にマイトジェン効果を示すが、内皮細胞に対してはマイトジェン性ではない（ Higashiyamaら，Science 251:936-939，1991）。しかし、HBEGFは、側副血管新 生および新脈管形成に対して刺激効果を有する。HBEGFファミリーのメンバーは 、病態生理学的な役割を、例えば、種々の腫瘍（例えば、膀胱ガン、乳房腫瘍お よび非小細胞肺腫瘍）において果たすと考えられる。従って、これらの細胞型は 、治療的遺伝子産物の送達のための有望な候補である。 U-937細胞から単離されたHBEGFは、構造が不均質であり、そして少なくとも86 個のアミノ酸およびO-結合型グリコシル基の２つの部位を含む（Higashiyamaら ，J．Biol．Chem．267:6205-6212，1992）。分泌HBEGFのカルボキシ末端側の半 分は、ヒトEGFと約35％の配列同一性（EGFタンパク質ファミリーのメンバーに特 有のパターンで隔てられた６個のシステインを含む）を共有する。対照的に、成 熟因子のアミノ末端部分は、親水性残基のストレッチにより特徴付けられ、そし てEGFにおいて構造的等価物を有さない。HBEGFの部位特異的変異誘発およびペプ チドフラグメントを用いての研究は、HBEGF残基のヘパリン結合配列が、EGF様ド メインの上流でかつわずかに重複する一続きの21アミノ酸に主に存在することを 示した。 HBEGFのペプチドまたはポリペプチドをコードするDNAとは、EGFレセプターに 結合し、そしてインターナリゼーションする、HBEGF、HBEGFフラグメント、また はHBEGFムテインをコードする任意のDNAフラグメントをいう。HBEGFフラグメン トをコードするこのようなDNA配列は、公にアクセス可能なデータベース（例え ば、EMBL、GenBank（登録番号M93012（サル）およびM60278（ヒト）））；プラ スミドpMTN-HBEGF（ATCC番号40900）およびpAX-HBEGF（ATCC番号40899）（PCT出 願WO/92/06705に記載される）；ならびにAbrahamら，Biochem．Biophys．Res．C omm．190:125-133，1993から利用可能である。 HBEGFの効果は、HBEGF応答性細胞の細胞表面上に発現されるEGFレセプターチ ロシンキナーゼにより媒介される（例えば、米国特許第5,183,884号および同第5 ,218,090号；ならびにUllrichら，Nature 309:4113-425，1984を参照のこと）。 分子量170kDを有する単鎖ポリペプチドであるEGFレセプタータンパク質は、構造 的に関連するEGFレセプターのファミリーを構成する。EGFレセプターを発現する ことが公知である細胞は、平滑筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、および多 数のヒトガン細胞株（例えば、A431（類表皮）；KB3-1（類表皮）；COLO 205（ 結腸）；CRL 1739（胃）；HEP G2（肝ガン）；LNCAP（前立腺）；MCF-7（乳房） ；MDA-MB-468（乳房）；NCI 417D（肺）；MG63（骨肉腫）；U-251（神経膠芽腫 ）；D-54MB（神経膠腫）；およびSW-13（副腎））を含む。 本発明の目的のために、HBEGF（そのフラグメントまたは誘導体を含む）がリ ガンドとして用いられる場合、HBEGFは、特定のEGFレセプターに結合し、そして インターナリゼーションされることのみを必要とする。HBEGFファミリーのメン バーは、通常のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするために充分なヌ クレオチド同一性（代表的には75％より高いヌクレオチド同一性）を有するメン バーである。全長HBEGFのサブフラグメントまたはサブ部分もまた、所望され得 る。当業者は、この中に提供された教示から、特定の生物学的活性が、適用に依 存して幾分所望されることを見出し得る。 ２．インターナリゼーションするレセプターに対する抗体 細胞表面に発現される分子に対する抗体は、その抗体が結合の後にインターナ リゼーションされる限り、本発明の状況において有用である。このような抗体は 、FGFレセプター、VEGFレセプター、ウロキナーゼレセプター、Ｅセレクチンお よびＰセレクチン、VCAM-1、PDGFレセプター、TGFレセプター、エンドシアリン （endosialin)、α_Vβ₃インテグリン、LFA-1、E9抗原、CD40、カドヘリン、およ びelk-1に対する抗体を含むがそれらに限定されない。細胞により発現される細 胞表面分子に特異的である抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗血清 として容易に生成される。このような多くの抗体が（例えば、アメリカンタイプ カルチャーコレクション，Rockville，MDから）入手可能である。あるいは、結 合/インターナリゼーションするリガンドに対する抗体もまた使用され得る。こ のようなストラテジーにおいて、ウイルス粒子は、その表面に抗体を有し、次い でこれはリガンドに複合体化される（以下のさらなる考察を参照のこと）。 本発明の状況では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イ ディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab'）₂、Ｆ_v可変領 域、または相補性決定領域）を含むと理解される。抗体は、一般に10^-7M以上、 好ましくは10^-8M以上のＫ_dで結合する場合、インドリシジン（indolicidin）ア ナログに対して特異的に受け入れられる。モノクローナル抗体または結合パート ナーの親和性は、当業者により容易に決定され得る（Scatchard，Ann．N.Y．Aca d．Sci．51:660-672，1949を参照のこと）。一旦適切な抗体が得られると、これ らは、当業者に周知の多くの技術により単離または精製され得る。 例えば、１つのこのようなインターナリゼーションするレセプター結合性抗体 は、本明細書中で「11A8」抗体として同定される。11A8抗体は、高親和性線維芽 細胞増殖因子レセプター（FGFR1）を認識するモノクローナル抗体である。レセ プターに結合し、そしてインターナリゼーションする他の有用な抗体を生成する ために用いられ得る、以下の一般的な手順は、11A8を生成するために用いられた 。 マウスを、肝臓腺ガン由来のインタクトなSK-HEP1細胞（これは、高親和性FGF レセプターを発現する）で免疫した。ハイブリドーマを、FGFR1の細胞外ドメイ ンを用いてスクリーニングした。得られた１つのモノクローナル11A8は、ウェス タンブロッティングにより高親和性FGFレセプターを認識し、細胞抽出物からのF GFレセプターを免疫沈降し、そして細胞表面のネイティブなレセプターを認識す る。免疫蛍光研究は、11A8が、SK-Hep-1およびSK-Mel-28（ヒト黒色腫）細胞（ これはまた、多数のFGFレセプターを発現する）の表面上の膜結合型タンパク質 と反応することを示す。 11A8がリボソーム不活化タンパク質であるサポリンに結合される場合、これは 、高親和性FGFレセプターを発現する細胞を標的化する、強力な細胞破壊薬とな る。生成した免疫毒素11A8-サポリンは、ヌードマウスに異種移植したヒト黒色 腫の固形腫瘍の増殖を阻害する。11A8が本発明の核酸またはウイルスベクターに 結合体化された場合、インターナリゼーションもし得るように、そのコグネート レセプターを発現する細胞を標的化し得、そして治療的遺伝子配列をそれらの細 胞に送達し得る。 細胞表面分子に対する市販の抗体はまた、これらがインターナリゼーションす るのであれば、本明細書中で教示されるように用いられ得る。用いられる１つの アッセイは、細胞を殺傷する抗体についての試験である。手短にいうと、試験ハ イブリドーマ抗体および試験細胞がインキュベートされる。結合していない抗体 は洗い流される。サポリンに結合体化された第２段階の抗体（例えば、抗IgG抗 体）が、試験細胞とともにインキュベートされる。細胞殺傷は、トリパンブルー 排除、MTT取込み、フルオレセインジアセテート染色などを含む任意の公知のア ッセイにより評価される。 他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（組換え 技術を記載する、Huseら，Science 246:1275-1281，1989;Sastryら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86:5728-5732，1989;Alting-Meesら，Strategies in Molecul ar Biology 3:1-9，1990を参照のこと）。これらの技術は、適切なベクター（例 えば、λImmunoZap(H）およびλImmnuoZap（L））中に重鎖および軽鎖の免疫グ ロブリンcDNAをクローニングすることを含む。これらの組換え体は、個々にスク リーニングされ得るかまたは同時発現されてFabフラグメントまたは抗体を形成 し得る（Huseら、前出；Sastryら、前出を参照のこと）。ポジティブプラークは 、続いて、E.coliからのモノクローナル抗体フラグメントの高レベルの発現を可 能にする非溶解性プラスミドに変換され得る。 同様に、抗体の部分またはフラグメント（例えば、FabおよびFvフラグメント ）もまた、従来の酵素消化または組換えDNA技術を利用して構築され、単離され た抗体可変領域を生じ得る。１つの実施態様では、目的のモノクローナル抗体を 生成するハイブリドーマからの可変領域をコードする遺伝子は、可変領域につい てのヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。 さらに、抗体の結合特異性を変更せずに、「マウス」抗体を「ヒト」抗体に変 更するための技術が利用され得る。抗体が生成され得るいくつかの特異的レセプ ターの例を以下に示す。 ａ．腫瘍細胞上の分子に対する抗体 腫瘍細胞の表面上に発現される分子に対する抗体は、この抗体が結合後にイン ターナリゼーションされる限り、本発明の状況において有用である。このような 抗体は、FGFレセプター、VEGFレセプター、および上記のレセプターに対する抗 体を含むがこれらに限定されない。 抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。いくつかの腫瘍細 胞表面の分子に対する市販の抗体は、これらがインターナリゼーションするので あれば、用いられ得る。用いられる１つのアッセイは、腫瘍細胞を殺傷する抗体 についての試験である。手短にいうと、試験ハイブリドーマ抗体および腫瘍細胞 がインキュベートされる。結合していない抗体は、洗い流される。サポリンに結 合体化された第２段階の抗体（例えば、抗IgG抗体）は、腫瘍細胞とともにイン キュベートされる。細胞殺傷は、トリパンブルー排除、MTT取込み、フルオレセ インジアセテート染色などを含む任意の公知のアッセイにより評価される。 ｂ．平滑筋細胞上の分子に対する抗体 平滑筋細胞の表面上に発現される分子に対する抗体は、この抗体が結合後にイ ンターナリセーションされる限り、本発明の状況において有用である。このよう な抗体は、FGFレセプター、EGFレセプター、TNFαレセプター、IFN-γレセプタ ー、TGFレセプター、エンドセリン１レセプターに対する抗体を含むがこれらに 限定されない。 抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。いくつかの平滑筋 細胞表面の分子に対する市販の抗体は、これらがインターナリゼーションするの であれば、用いられ得る。手短にいうと、抗体は、正常、腫瘍形成性、または培 養された平滑筋細胞でのマウス、ラット、ウサギ、または他の動物の免疫により 惹起される。種々の免疫プロトコルは、例えば、HarlowおよびLane（Antibodies :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988）およびColigan ら（Current Protocols in Immunology，Greene Publishing，1995）に見出され 得る。免疫後、脾臓またはリンパ節が、ハイブリドーマを生成するために採取さ れるか、または血清が、ポリクローナル抗体のために採取される。ハイブリドー マが好ましい。脾臓またはリンパ節からの細胞は、ミエローマ細胞株に融合され る（プロトコルについては、HarlowおよびLane、前出；ならびにColiganら、前 出を参照のこと）。抗体分泌ハイブリドーマが増殖され、そして抗体が、平滑 筋細胞への結合についてELISA、切片染色、フローサイトメトリー、共焦点顕微 鏡検査などにより試験される。抗体が、過剰増殖中の平滑筋細胞に用いられるべ きである場合、好ましくは、抗体は、静止期平滑筋細胞に結合しないか、または ほとんど結合しない。ポジティブ抗体は、インターナリゼーションについてさら に試験される。用いられる１つのアッセイは、平滑筋細胞を殺傷する抗体につい ての試験である。手短にいうと、試験ハイブリドーマ抗体および平滑筋細胞がイ ンキュベートされる。結合していない抗体は、洗い流される。サポリンに結合体 化された第２段階の抗体（例えば、抗IgG抗体）は、平滑筋細胞とともにインキ ュベートされる。細胞殺傷は、トリパンブルー排除、MTT取込み、フルオレセイ ンジアセテート染色などを含む任意の公知のアッセイにより評価される。 ｃ．内皮細胞および平滑筋細胞上の分子に対する抗体 内皮細胞および平滑筋細胞の表面上に発現される分子に対する抗体は、この抗 体が結合後にインターナリゼーションされる限り、本発明の状況において有用で ある。このような抗体は、FGFレセプター、VEGFレセプター、ウロキナーゼレセ プター、ＥセレクチンおよびＰセレクチン、VCAM-1、PDGFレセプター、TGFレセ プター、エンドシアリン、α_vβ₃インテグリン、LFA-1、E9抗原、CD40、カドヘ リン、ならびにelk-1に対する抗体を含むがこれらに限定されない。 抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。いくつかの内皮細 胞または平滑筋細胞表面の分子に対する市販の抗体は、これらがインターナリゼ ーションするのであれば、用いられ得る。用いられる１つのアッセイは、細胞を 殺傷する抗体についての試験である。手短にいうと、試験ハイブリドーマ抗体お よび試験細胞がインキュベートされる。結合していない抗体は、洗い流される。 サポリンに結合体化された第２段階の抗体（例えば、抗IgG抗体）は、試験細胞 とともにインキュベートされる。細胞殺傷は、トリパンブルー排除、MTT取込み 、フルオレセインジアセテート染色などを含む任意の公知のアッセイにより評価 される。 ３．他のリガンド ａ．内皮細胞および平滑筋細胞によりインターナリゼーションされるリガン ド 上記のように、レセプターに結合する、インターナリゼーションされるリガン ドは、核酸（治療剤をコードする因子を含む）を、その細胞表面に適切なレセプ ターを発現する細胞に送達するために用いられる。特定のレセプターに結合する 多数の分子が同定されており、そして本発明における使用に適切である。内皮細 胞を標的化するリガンドに加えて、平滑筋細胞を標的化するリガンドは、本発明 の状況において有用である。平滑筋細胞（SMC）は、毛細管、細静脈、静脈、細 動脈、および動脈の収縮成分および構造成分を提供する、新生血管（neovessel ）形成の必須の必要条件である。それ自体、SMCを標的化することはまた、罹病 組織において新生血管形成のプロセスに影響を与える。このような分子は、増殖 因子、サイトカイン、および抗体を含む。多くの増殖因子および増殖因子のファ ミリーは、構造的および機能的特徴を共有し、そして本発明において用いられ得 る。増殖因子のファミリーは、線維芽細胞増殖因子FGF-1〜FGF-15、および血管 内皮増殖因子（VEGF）を含む。他の増殖因子（例えば、PDGF（血小板由来増殖因 子）、TGF-α（トランスフォーミング増殖因子）、TGF-β、HB-EGF、アンジオテ ンシン、およびエンドグリン）はまた、細胞表面上の特異的な同定されたレセプ ターに結合し、そして本発明において使用され得る。内皮細胞または平滑筋細胞 により発現される細胞表面分子に特異的である抗体は、モノクローナルまたはポ リクローナル抗血清として容易に生成される。このような抗体の多くは、（例え ば、アメリカンタイプカルチャーコレクション，Rockville，MDから）入手可能 である。サイトカイン（インターロイキン、CSF（コロニー刺激因子）、および インターフェロンを含む）は、内皮細胞上に特異的レセプターを有し、そして本 明細書中で記載される通りに使用され得る。これらおよび他のリガンドは、以下 で、より詳細に考察される。 これらのリガンドのフラグメントは、このフラグメントが適切な細胞表面分子 に結合する能力を保持する限り、本発明内で用いられ得る。同様に、置換または 他の改変を有するが、結合能力を保持するリガンドもまた用いられ得る。その上 、特定のリガンドとは、ネイティブなリガンドのアミノ酸配列を有するポリペプ チ ド、ならびにそのリガンドが、内皮細胞上のそのレセプターに結合し、そしてイ ンターナリゼーションされる能力を保持する限り、改変配列を有する（例えば、 ネイティブなタンパク質と比較して、アミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加 を有する）ポリペプチドをいう。 ｂ．腫瘍細胞に結合するリガンド 上記のように、レセプターに結合する、インターナリゼーションされるリガン ドは、核酸を、その細胞表面に適切なレセプターを発現する細胞に送達するため に用いられる。腫瘍細胞上の特定のレセプターに結合する多数の分子が同定され ており、そして本発明における使用に適切である。例えば、以下の表は、良好な 公知のリガンドおよび種々の腫瘍上の細胞表面分子のうちのいくつかを示す。 腫瘍 リガンド レセプター Ｔ細胞リンパ腫 IL-2 IL-2レセプター Ｂ細胞リンパ腫 抗体 免疫グロブリンイディオタイ プ 黒色腫 FGF MAGE；FGFレセプター 前立腺腫瘍 前立腺特異的抗原-1:プロバ シン 脈管形成性腫瘍 FGF；VEGF；PDGF FGFレセプター；VEGFレセプ ター；PDGFレセプター 乳房腫瘍 ヒレグリン；FGF erbB2；erbB3；erbB4；MUC- 1；HSP-27；int-1；int-2 結腸腫瘍、肺腫瘍 抗体;FGF;VEGF CEA:FGFレセプター；VEGFレ セプター 膀胱腫瘍 HBEGF；EGF/TGF； EGFレセプター；FGFレセプタ FGF ー 膵臓腫瘍 FGF FGFレセプター 骨髄性白血病 FGF；CD抗体 FGFレセプター；CD分子 子宮内膜ガン； VEGF VEGFレセプター 子宮頚ガン さらに、他のレセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）は、ほとん ど全ての腫瘍細胞上に優先的に発現される。腫瘍上の細胞表面分子に特異的であ る抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗血清として容易に生成される 。このような抗体の多くは、（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクショ ン，Rockville，MDから）入手可能である。 これらのリガンドのフラグメントは、このフラグメントが適切な細胞表面分子 に結合する能力を保持する限り、本発明において用いられ得る。同様に、置換ま たは他の改変を有するが、結合能力を保持するリガンドもまた用いられ得る。そ の上、特定のリガンドとは、ネイティブなリガンドのアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、ならびにそのリガンドが、腫瘍細胞上のそのレセプターに結合し、そ してインターナリゼーションされる能力を保持する限り、改変配列を有する（例 えば、ネイティブなタンパク質と比較して、アミノ酸の置換、欠失、挿入、また は付加を有する）ポリペプチドをいう。 本発明による、より有用なレセプターのいくつかは、リガンドに効率的に結合 し、そしてリガンドをインターナリゼーションするだけでなく、核へのリガンド の送達を増強する、レセプターである。したがって、このようなレセプターを特 異的に標的化するリガンドが特に好ましい。リガンドを高い効率で核に指向させ るレセプターを特異的に標的化するリガンドは、さらにより好ましい。 リガンドはまた、それらのレセプターを発現する細胞に結合し、そしてインタ ーナリゼーションされる能力を保有するムテインを含む。このようなムテインは 、本明細書中に記載のように、１つ以上のシステインをセリンで置換することに より生成されるムテインを含むがこれらに限定されない。代表的には、このよう なムテインは、保存的なアミノ酸変化を有する。このようなムテインをコードす るDNAは、縮重コドンの置換により改変されない限り、少なくとも低ストリンジ ェンシーの条件下で、野生型リガンドをコードするネイティブなDNA配列にハイ ブリダイズする。（FGFムテインを生成する例示的な方法は、実施例３に記載さ れる。） リガンドをコードするDNAは、公知のアミノ酸配列またはDNA配列に基いて合成 により調製され得るか、当業者に公知の方法（例えば、PCR増幅）を用いて単離 され得るか、または商業的供給源もしくは他の供給源から入手され得る。リガン ドをコードするDNAは、縮重コドンの置換により、または異なるアミノ酸をコー ドすることにより、上記の配列とは異なり得る。アミノ酸配列の相違（例えば、 異なる種の相同リガンド間で生じる相違、ならびに個々の生物もしくは種間で生 じる相違）は、リガンドがそのレセプターに結合する限りは許容される。リガン ドは、天然の供給源から単離され得るか、または例えば、組換え手段もしくは化 学合成により、合成的に作製され得る。 他のレセプター結合リガンドが、本発明において使用され得る。細胞表面レセ プターに結合し、そしてインターナリゼーションされる任意のタンパク質、ポリ ペプチド、アナログ、またはフラグメントが使用され得る。これらのリガンドは 、核酸結合ドメインへの結合のための調製において、組換えまたは他の手段によ って産生され得る。これらのレセプター結合インターナリゼーションリガンドの 配列を得るためのDNA配列および方法は、周知である。例えば、これらのリガン ドには、以下が挙げられる：CSF-1（GenBank登録番号M11038、M37435；Kawasaki ら、Science 230:291-296,1985；Wongら、Science 235:1504-1508,1987）GM-CSF （GenBank登録番号X03021；Miyatakeら、EMBO J．4:2561-2568,1985）；IFN-α （インターフェロン）（GenBank登録番号A02076；特許番号WO 8502862-A、1985 年７月４日)；IFN-γ（GenBank登録番号A02137；特許番号WO 850264-A、1985年 ６月20日)；IL-1-α（インターロイキン１α）（GenBank登録番号X02531、M1532 9；Marchら、Nature 315:641-647,1985；Nishidaら、Biochem.Biophys.Res.Comm um．143:345-352,1987）；IL-1-β(インターロイキン１β)（GenBank登録番号X0 2532、M15330、M15840；Marchら、Nature 315:641-647,1985；Nishidaら、Bioch em.Biophys.Res.Commun．143:.345-352,1987；Bensiら、Gene 52:95-101,1987） ；IL-1（Genbank登録番号K02770、M54933、M38756；Auronら、Proc.Natl.Acad.S cI.USA 81:7907-7911,1984；Webbら、Adv.Gene Technol.22:339-340,1985）；IL -2（GenBak登録番号A14844、A21785、X00695、X00200、X00201、X00202；Lupker ら、特許番号EP0307285-A、1989年３月15日；Perezら、特許番号EP0416673-A、1 991年３月13日；Holbrookら、Nucleic Acids Res．12:5005-5013,1984；Degrave ら、EMBO J．2:2349-2353,1983；Taniguchiら、Nature 302:305-310,1983）；IL -3（GenBank登録番号M14743、M20137；Yangら、Cell 47：3-10,1986；Otsukaら 、J.Immunol.140:2288-2295,1988）；IL-4（GenBank登録番号M13982；Yokotaら 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5854-5898,1986）；IL-5（GenBank登録番号X0468 8、J03478；Azumaら、Nucleic Acids Res.14:9149-9158,1986；Tanabeら、J.Bio l.Chem.262:16580-16584,1987）；IL-6（GenBank登録番号Y00081、X04602、M548 94、M38669、M14584；Yasukawaら、EMBO J.6:2939-2945,1987；Hiranoら、Natur e 324:73-76,1986；Wongら、Behring Inst.Mitt.83:40-47,1988；Mayら、Proc.N atl.Acad.Sci.USA 83:8957-8961,1986）；IL-7（GenBank登録番号 J04156；Goodwinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:302-306,1989）；IL-8（GenBa nk登録番号Z11686；Kusnerら、Kidney Int.39:1240-1248,1991）；IL-10（GenBa nk登録番号X78437、M57627;Vieiraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1172-1176,1 991）；IL-11（GenBank登録番号M57765、M37006；Paulら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:7512-7516,1990）；IL-13（GenBank登録番号X69079、U10307；Mintyら、 Nature 362:248-250,1993；Smirnov,Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,1994年６月２日）；TNF-α（腫瘍壊死因子）（GenBank登 録番号A21522；特許番号GB2246569-A1、1992年２月５）；TNF-β（GenBank登録 番号D12614；Matsuyamaら、FEBS LETTERS 302:141-144,1992）；ウロキナーゼ／ ウロキナーゼレセプター（GenBank登録番号X02760/X74309）；α-1,3フコシルト ランスフエラーゼ、α1-抗トリプシン/E-セレクチン（GenBank登録番号M98825、 D38257/M87862）；P-セレクチン糖タンパク質リガンド、P-セレクチンリガンド/ P-セレクチン（GenBank登録番号U25955、U02297/L01574）；VCAM1/VLA-4インテ グリンレセプター（GenBank登録番号X53051/X16983およびL12002）；E9（Blann ら、Atherosclerosis 120:221,1996）／TGFβレセプター；フィブロネクチン（G enBank登録番号X02761）；I型^α1コラーゲン（GenBank登録番号Z74615）、I型β ２コラーゲン（GenBank登録番号Z74616）、ヒアルロン酸／CD44（GenBank登録番 号M59040）；CD40リガンド（GenBank登録番号L07414）／CD40（GenBank登録番号 M83312）；EFL-3、elk-1（GenBank登録番号M25269）についてのLERTK-2リガンド （GenBanl登録番号L37361、U09304）；カテニンについてのVEカドヘリン(GenBan k登録番号X7998l)リガンド；LFA-1についてのICAM-3（GenBank登録番号X69819） リガンド、ならびにフォンビルブラント因子（GenBank登録番号X04385）、α_Vβ₃ インテグリンについてのフィブリノーゲンおよびフイブロネクチン(GenBank登 録番号X92461）リガンド（GenBank登録番号U07375、L28832）、ならびにerbB2に ついてのGP30リガンド（S68256）。他の適切なレセプター結合インターナリゼー ションリガンドのDNA配列は、GenBankまたはEMBL DNAデータベースから得られ得 るか、PIRデータベースから得られるタンパク質配列から逆合成され得るか、ま たは標準的な方法（Sambrookら、前出）によってcDNAライブラリーまたはゲノム ライブラリーから単離され得る。 c．細胞に結合する他のリガンド 他のレセプター結合リガンドは、本発明において使用され得る。平滑筋細胞表 面レセプターに結合し、そしてインターナリゼーションされる任意のタンパク質 、ポリペプチド、アナログ、またはフラグメントが使用され得る。これらのリガ ンドは、核酸結合ドメインへの結合のための調製において、組換えまたは他の手 段によって産生され得る。これらのレセプター結合インターナリゼーションリガ ンドの配列を得るためのDNA配列および方法は、周知である。例えば、これらの リガンドには、以下が挙げられる：PDGF（GenBank登録番号X03795、X02811）、 アンジオテンシン（GenBank登録番号K02215）ならびにインテグリンレセプター に結合するICAM-1（GenBank登録番号X06990）およびVCAM-1（GenBank登録番号X5 3051）のような全てのRGD含有ペプチドおよびタンパク質。他のリガンドには、 以下が挙げられる：TNFα（GenBank登録番号A21522、X01394）、INFγ（GenBank 登録番号A11033、A11034）、IGF-I（GenBank登録番号A29117、X56773、S61841、 X56774、S61860）、IGF-II（GenBank登録番号A00738、X06159、Y00693）心房性 ナトリウム利尿ペプチド（atrial naturietic peptide）（GenBank登録番号X546 69）、エンドセシン-1（GenBank登録番号Y00749）、凝固因子Xa（GenBank登録番 号L00395、L00396、L29433、N00045、M14327）TGF-β1（GenBank登録番号A23751 ）IL-1α（GenBank登録番号X03833）、IL-1β（GenBank登録番号M15330）、およ びエンドグリン（endoglin）（GenBank登録番号X72012）。他の適切なレセプタ ー結合インターナリゼーションリガンドのDNA配列は、GenBankまたはEMBL DNAデ ータベースから得られ得るか、PIRデータベースから得られるタンパク質配列か ら逆合成され得るか、または標準的な方法（Sambrookら、前出）によってcDNAラ イブラリーまたはゲノムライブラリーから単離され得る。 以前に示したように、細胞表面レセプターに結合し、そしてインターナリゼー ションされる任意のタンパク質、ポリペプチド、アナログ、またはフラグメント が使用され得る。核に輸送される細胞表面分子を模倣するかまたは細胞表面分子 と相互作用する分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。これらのリガンドは、 核酸結合ドメインへの結合のための調製において、組換えまたは他の手段によっ て産生され得る。これらのレセプター結合インターナリゼーションリガンドの配 列を得るためのDNA配列および手段は、周知である。例えば、これらのリガンド およびリガンド／レセプター対には、以下が挙げられる：ウロキナーゼ／ウロキ ナーゼレセプター（GenBank登録番号X02760/X74309）；α-1,3フコシルトランス フェラーゼ、α１-抗トリプシン/E-セレクチン（GenBank登録番号M98825、D3825 7/M87862）；P-セレクチン糖タンパク質リガンド、P-セレクチンリガンド/P−セ レクチン（GenBank登録番号U25955、U02297/L23088）、VCAM1/VLA-4（GenBank登 録番号X53051/X16983）；E9抗原（Blannら、Atherosclerosis 120:221,1996）/T GFβレセプター；フィブロネクチン（GenBank登録番号X02761）；I型α１コラー ゲン（GenBank登録番号Z74615）、I型β2コラーゲン(GenBank登録番号Z74616)、 ヒアルロン酸/CD44（GenBank登録番号M59040）；CD40リガンド（GenBank登録番 号L07414）/CD40（GenBank登録番号M83312）；ELF-3、elk-1（GenBank登録番号M 25269）についてのLERTK-2リガンド（GenBank登録番号L37361、U09304）；Ve-ca dherin（GenBank登録番号X79981）；カテニンについてのリガンド；LFA-1につい てのICAM-3（GenBank登録番号X69819）リガンド；ならびにフォンビルブラント 因子（GenBank登録番号X04385）、α_Vβ₃インテグリンについてのフィブリノー ゲンおよびフィブロネクチン（GenBank登録番号X92461）リガンド（GenBank登録 番号U07375、L28832）。他の適切なレセプター結合インターナリゼーションリガ ンドのDNA配列は、GenBankまたはEMBL DNAデータベースから得られ得るか、PIR データベースから得られるタンパク質配列から逆合成され得るか、または標準的 な方法（Sambrookら、前出）によってcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリ ーから単離され得る。 ｄ.ペプチド模倣（peptidomimetic）リガンド 細胞表面レセプターに結合し、そしてインターナリゼーションされるが、「真 の」ポリペプチドの模倣物であるリガンドまたはそのフラグメントもまた、本発 明における使用に意図される。従って、１つの局面において、本発明は、ペプチ ドの活性を模倣するのに有用な非ペプチドペプチド模倣物の調製および使用を意 図し、これらは、本発明のウイルスベクターに接着され得る標的リガンドのペプ チド模倣物のさらなる供給源を作製する。 本明細書中に記載されるように有用なペプチド模倣物を作製および同定する方 法は、当該分野で公知である（例えば、WO 93/17032を参照のこと）。例えば、 前述の明細書は、ペプチドの活性を模倣するのに有用なペプチド模倣性化合物を 調製するプロセスを記載し、そして１つのこのような模倣物のペプチド様活性を 記載した。同様に、抗体構造を模倣するように化学的に改変された部分の利用に よるペプチド模倣性薬物の産生（高次構造研究に基づく）は、米国特許第5,331, 573号に記載される。そのように調製された薬物を試験する方法もまた、その明 細書中に開始される。従って、抗体のペプチド模倣物は、本明細書中に開示され るように有用であり、リガンドとしてのみではなく、標的化リガンドへのウイル ス粒子の結合において有用な分子として有用である。 本明細書中でリガンドおよび／または「リンカー」として有用な他の有用なペ プチド模倣性分子は、公開された国際出願番号WO 9220704；Brandtら、Antimicr ob Agents Chemother，40:1078，1996；Sepp-Lorenzinoら、Cancer Res，55:530 2，1995；およびChanderら、J Pharm Sci，84:404，1995に記載される。このよ うな模倣物が真のペプチドではないという事実にかかわらず、このようなペプチ ド模倣性分子をウイルスタンパク質に結合する種々の共有結合的および非共有結 合的手段は、本明細書中に開始されるように使用され得る。 e.他の細胞表面分子と結合するリガンドの選択 本発明における使用のためのリガンドもまた、ファージディスプレイのような 方法によって選択され得る（例えば、米国特許第5,223,409を参照のこと）。簡 単には、この方法において、DNA配列は、繊維状ファージ（例えば、M13）の遺伝 子IIIまたは遺伝子VIII遺伝子に挿入される。挿入のためのマルチクローニング 部位を有するいくつかのベクターが、開発されている（McLaffertyら、Gene 128 :29-36,1993；ScottおよびSmith、Science 249:386-390,1990；SmithおよびScot t、Methods Enzymol.217:228-257,1993）。実施例のように標的化する腫瘍細胞 を使用することによって、挿入されたDNA配列は、ランダムに作製され得るか、 または腫瘍細胞を結合するための公知の結合ドメインの改変体であり得る。単鎖 抗体は、この方法を用いて容易に作製され得る。一般に、インサートは、６〜20 アミノ酸をコードする。挿入された配列によってコードされるペプチドは、バク テリオファージの表面に提示される。腫瘍細胞に対する結合ドメインを発現する バクテリオファージが、腫瘍細胞への結合によって選択される。未結合ファージ は、洗浄によって除去され、これは代表的には、10mM Tris、１mM EDTAを含み、 そして塩を含まないかまたは低塩濃度である。結合ファージは、例えば、塩含有 緩衝液で溶出される。NaCl濃度は、全てのファージが溶出されるまで、段階様式 において増加される。代表的には、高親和性で結合するファージは、高塩濃度に よって遊離される。 溶出したファージは、細菌宿主において増殖される。さらなる回の選択が、高 親和性で結合するいくつかのファージを選択するために実施され得る。次いで、 結合ファージ中のインサートのDNA配列が決定される。一旦結合ペプチドの推定 アミノ酸が公知になると、核酸結合ドメインとして本明細書中で使用するための 有意なペプチドは、組換え手段によって、または合成的にのいずれかで作製され 得る。組換え手段は、レセプター結合インターナリゼーションリガンド／核酸結 合ドメインが融合タンパク質として産生される場合に、使用される。ペプチドは 、親和性または結合を最大化するために、２つ以上のペプチドのタンデム整列と して作製され得る。 ｆ.インターナリゼーションする分子の同定および単離 核に輸送される細胞表面分子を模倣するか、または細胞表面分子と相互作用す る任意および全ての分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような分子を 同定および単離する１つの例示的な方法は、本質的に以下のようである。 第１に、目的の細胞または組織（例えば、治療用部分を標的するのに望ましい 細胞）を同定し得る。次に、推定標的細胞の細胞表面に対する抗体（好ましくは 、モノクローナル抗体）を作製する。細胞表面に対する抗体を分泌するハイブリ ドーマを同定および単離する。モノクローナル抗体を作製する方法およびこの抗 体を産生するハイブリドーマを同定する方法は、当該分野で公知である。 次の工程として、モノクローナル抗体は、標的細胞の培養物と混合し、そして あらかじめ決定された時間インキュベートさせる。続いて、第２の抗体を混合物 に添加する（すなわち、第１の抗体に対する抗体（抗イディオタイプ抗体））。 好ましくは、第２の抗体は、インターナリゼーションに基づく標的細胞に対して 毒性であり、そして核に送達される；この様式において、細胞死は、第１の抗体 のインターナリゼーションの指標であり、これに第２の抗体が結合される。 細胞培養物をスクリーニングすることによって、全ての殺傷抗体複合体を容易 に同定および単離し得、そして核へ転位する能力を有する抗体を選別し得る。次 いで、このような抗体は、本明細書中に開示される方法に従って使用され得る（ 例えば、細胞集団を標的するウイルスベクターを標的および送達するのに使用さ れ得る）。 前述の例は抗体の作製および同定を議論するが、本発明の有用なリガンドは、 抗体に制限されないことが理解される。例えば、核に直接輸送されるFGFおよび ／またはFGFRの能力を模倣する任意の分子は、本明細書中に開示されるような使 用が意図される。従って、核に輸送される細胞表面分子と相互作用する任意の分 子が、本開示によって意図される。 ２.レセプター結合インターナリゼーションリガンドの改変 本明細書における使用のためのリガンドは、特定の適用にあつらえられ得る。 タンパク質を改変するための手段が、以下に提供される。簡単には、アミノ酸の 付加、置換、および欠失が、任意の一般的に使用される組換えDNA方法によって 産生され得る。改変ペプチド（特に、増殖機能を欠くもの）およびキメラペプチ ド（これは、特異的結合およびインターナリゼーション活性を保持する）もまた 、本明細書における使用に意図される。改変にはまた、残基の付加または欠失（ 例えば、ポリペプチドの結合を促進しかつ規定されたモル比（例えば、1：1）を 含む結合体を形成するシステインの付加）も含む（例えば、米国特許第5,175,14 7号；PCT出願WO 89/00198、米国出願番号第07/070,797号；PCT出願WO 91/15229 ；および米国出願番号第07/505,124号を参照のこと）。なおほかに有用な改変に は、タンパク質の機能、安定性などを改善または改変する翻訳後改変（例えば、 ミリスチル化、掌状化（palmatylation）、リン酸化（phophorylation）、リボ シル 化）に供されるさらなる配列が挙げられる。 上記のように、細胞表面レセプターに結合し、そしてインターナリゼーション される任意のリガンドが、本発明の状況において使用され得る。このようなリガ ンドは、ポリペプチドまたはペプチドアナログ（ペプチド模倣物を含む）であり 得る。リガンドはまた、そのフラグメント、またはレセプターに結合しそして連 結された標的化剤をインターナリゼーションするこのようなペプチドの不自然な アナログを含む。FGFファミリー（FGF-1〜FGF-15を含む）が好ましい。改変ペプ チド（特に、増殖機能を欠くもの）およびキメラペプチド（これは、特異的な結 合およびインターナリゼーション活性を保持する）もまた、本明細書における使 用に意図される。 ポリペプチドの改変は、当業者に公知の任意の手段によってもたらされ得る。 本明細書中の好ましい方法は、ポリペプチドをコードするDNAの改変、および改 変DNAの発現に依存する。上記で議論したレセプター結合インターナリゼーショ ンリガンドの１つをコードするDNAは、標準的な方法論を用いて変異誘発され得 る。例えば、凝集体形成を担うシステイン残基は、欠失または置換され得る。必 要ならば、凝集体形成に寄与するシステイン残基の同定は、システイン残基の欠 失および／または置換、ならびに生理学的に受容可能な緩衝液および塩を含む溶 液においてタンパク質凝集体が生じるかどうかの確認によって、経験的に決定さ れ得る。さらに、これらのレセプター結合インターナリゼーションリガンドのフ ラグメントが構築され得、そして使用され得る。多くのこれらのリガンドの結合 領域は、描写されている。例えば、FGF2のレセプター結合領域は、変異分析、お よび155アミノ酸形態の残基33〜77および102〜129の残基に対するFGFペプチドア ゴニスト／アンタゴニストによって同定されている（Bairdら、PNAS 85:2324；E ricksonら、Biochem．88:3441）。VEGFのエキソン１〜４は、レセプター結合に 必要である。フラグメントはまた、本明細書中に記載される試験のいずれか１つ によって結合およびインターナリゼーションすることが示され得る。 変異は、当業者に公知の任意の方法によって作製され、これには部位特異的（ site-specific）またはタンパク質をコードするDNAの部位特異的（site-directe d）変異誘発、およびDNAテンプレートにおける改変を導入および増幅するプラ イマーを用いるDNA増幅法（例えば、重複慎重（SOE）によるPCRスプライシング ）の使用が含まれる。部位特異的変異湯発は、代表的には、M13ファージベクタ ー（これは周知であり、そして市販されている）のような一本鎖および二本鎖形 態を有するファージベクターを用いてもたらされる。一本鎖ファージ複製起点を 含むほかの適切なベクターが使用され得る（例えば、Veiraら、Meth.Enzymol.15 :3,1987を参照のこと）。一般的には、部位特異的変異誘発は、目的のタンパク 質（すなわち、FGFファミリーのメンバー、または体内（intrabody）のような治 療用分子）をコードする一本鎖ベクターを調製することによって実施される。一 本鎖ベクターにおいてDNAに対する相同性領域内の所望の変異を含むオリゴヌク レオチドプライマーは、ベクターにアニールされ、続いてDNAポリメラーゼ（例 えば、E.coli DNAポリメラーゼI（Klenowフラグメント）を添加される。これは 、一方の鎖が改変された配列をコードし、そして他方の鎖が本来の配列をコード する、ヘテロ二重鎖を産生するプライマーとして、二本鎖領域を使用する。ヘテ ロ二本鎖は、適切な細菌細胞に導入され、そして所望の変異を含むクローンが選 択される。得られる改変されたDNA分子は、適切な宿主細胞において組換え的に 発現されて、改変タンパク質を産生し得る。 アミノ酸の適切な保存的置換は周知であり、そして得られる分子の生物学的活 性を改変せずに、一般的に作製され得る。例えば、このような置換は、一般的に 、極性残基、荷電残基、疎水性残基、小残基などの群内で置き換えることによっ て作製される。必要であれば、このような置換は、適切なレセプターへの結合に 基づいて結合およびインターナリゼーションする能力について、得られる改変タ ンパク質を試験することによって、単に経験的に決定され得る。この能力を保持 するものは、本明細書における結合体および方法における使用に適切である。こ のように、レセプター結合インターナリゼーションリガンドのアミノ酸残基は、 残基の欠失または改変により改変されているポリペプチドが、そのレセプターに 結合する実質的に同じ能力、および未改変ポリペプチドとして連結された薬剤を インターナリゼーションする実質的に同じ能力を保有する場合、必須ではない。 本明細書中で使用されるように、「生物学的活性」は、一般的には、インビボ での化合物、組成物、または他の混合物の投与に基づいて得られる化合物または 生理学的応答の活性をいう。従って、生物学的活性は、このような化合物、組成 物、複合体、および混合物の治療用効果および薬学的活性を包含する。生物学的 活性はまた、分子の、細胞に結合し、インターナリゼーションし、そして核に局 在する能力をいう。生物学的活性は、規定されたアッセイにおいて測定されるよ うな、特定のインビトロでの活性を参照して決定され得る。例えば、本発明の状 況において、FGFまたはFGFのフラグメントの生物学的活性は、FGFの、FGFレセプ ターを保有する細胞に結合し、そして連結剤をインターナリゼーションする能力 である。この活性は、インビトロで、例えば、FGFを細胞傷害性薬剤（例えば、 サポリン（saporin））に結合させることによって、FGFレセプターを保有する細 胞（例えば、線維芽細胞）を結合体と接触させることによって、そして細胞増殖 または増殖の阻害を評価することによって、評価さされ得る。インビボ活性は、 抗腫瘍活性についてのマウス異種移植モデル（例えば、Beitzら、Cancer Rserch 52:227-230,1992；Houghtonら、Cancer Res.42:535-539,1982；Boydenら、Canc er（Philadelphia）48:10-20,1981；Hoogenhoutら、Int.J.Radiat.Oncol.,Biol. Phys.9:871-879,1983；Stastnyら、Cancer Res.53:5740-5744,1993を参照のこと ）のような認識された動物モデルを用いて決定され得る。 レセプターへの結合に続くインターナリゼーションは、本明細書中の使用に適 切なリガンドに必要な活性のみである。しかし、いくつかのリガンドは増殖因子 であり、そして有糸分裂誘発を引き起こす。例えば、全てのFGFタンパク質は、 広範な種々の正常な二倍体中胚葉由来細胞および神経冠由来細胞において、分裂 促進活性を誘導する。このような「FGF分裂促進活性」（これは、FGFレセプター に結合し、そしてインターナリゼーションされる能力を反映する）の試験は、培 養されたウシ大動脈内皮細胞の増殖を刺激する能力である。（例えば、Gospodar owiczら、J.Biol.Chem.257:12266-12278,1982：Gospodarowiczら、Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 73:4120-4124,1976を参照のこと）。減少された分裂促進活性を有す るムテインは、本明細書中に記載の方法によって作製される。実施例において、 減少された分裂促進活性を有するFGFムテインは、部位特異的変異誘発によって 構築されている。非分裂促進タンパク質または減少された分裂促進タンパク質も また、レセプター結合ドメインを関連タンパク質のレセプター結合ドメインと交 換することによって構築され得る。例示の目的で、FGF2のドメインは、FGF7のレ セプター結合ドメインと交換されて、増殖を引き起こさないFGFを作製し得、そ して結合プロフィールを改変し得る。 FGFまたは他のリガンドが、分裂促進活性またはほかの生物学的活性を欠くよ うに改変されている場合、結合およびインターナリゼーションはなお、以下の試 験または他の同等の試験のいずれか１つによって容易にアッセイされ得る。一般 に、これらの試験は、リガンドの標識、リガンドと標的細胞とのインキュベーシ ョン、および細胞内標識の可視化または測定を含む。例えば、簡単には、FGFは 、FITCで蛍光標識され得るか、または¹²⁵Iで放射性標識され得る。フルオレセイ ン結合体化FGFは、細胞とともにインキュベートされ、そして蛍光顕微鏡または 共焦点顕微鏡によって、インターナリセーションについて顕微鏡的に試験される 。FGFが¹²⁵Iで標識される場合、標識されたFGFは、細胞とともに４℃にてインキ ュベートされる。細胞は、37℃まで温度シフトされ、そして低いpHの２M NaClで 洗浄されて、いずれの細胞結合FGFも除去される。次いで、標識は計数され、そ してそれにより、FGFのインターナリゼーションが測定される。 あるいは、リガンドの結合およびインターナリゼーション能力をアッセイする 別の方法において、リガンドは、本明細書中に記載されるいずれかの方法によっ て核酸結合ドメインと結合体化され、そしてサポリンをコードするプラスミドと 複合体化されるか、またはサポリンもしくは他の細胞傷害性分子と結合体化され 、そして細胞傷害性についてアッセイされる。以下に議論されるように、複合体 は、細胞をトランスフェクトし、そして細胞毒性を測定するために使用され得る 。 最終的に、FGFのムテインは、当業者に公知である（例えば、米国特許第5,175 ,147号；PCT出願番号第WO 89/00198号、米国特許出願番号第07/070,797号；PCT 出願番号第WO 91/15229号；および米国特許出願番号07/505,124号を参照のこと ）。そのようなムテインはまた、本発明の教示に従って使用され得る。 Ｆ．ペイロード １．治療的産物をコードする分子 治療的産物をコードする分子（これはまた、本明細書中で治療的核酸という） は、一般的に翻訳の遺伝子転写を改変することによって、細胞への、または細胞 内の処理をもたらす分子である。本発明の治療的核酸は、達成したい効果に依存 して、「ポジティブ」または「ネガティブ」遺伝子治療の文脈において使用され 得る。 例えば、治療的ヌクレオチド配列は、遺伝子のすべてまたは一部をコードし得 る。治療的ヌクレオチド配列が遺伝子のすべて（または最も重要な機能的部分） をコードする場合、それは、欠損遺伝子の置換として作用することによって遺伝 子治療をもたらし得る。そのような配列はまた、すでに細胞内に存在するDNAで 組換え、それによって遺伝子の欠損部分を置き換えることによって機能し得る。 種々のポジティブ遺伝子治療適用および治療的遺伝子産物が本明細書中以下に 記載され、そして虚血の処置、創傷治癒の促進、骨成長および再生の刺激、血管 形成の増加などのような種々の適用を含む。所望の遺伝子産物を産生する遺伝子 での、欠損遺伝子または非機能的遺伝子の置換はまた、「ポジティブ」遺伝子治 療であると考えられるが、一方でこの置換は、機能障害的(disfunctional)もし くは非機能的調節配列または構造タンパク質をコードする配列を置換している。 同様に、「ネガティブ」遺伝子治療は、本発明に含まれる。従って、本発明の 治療的核酸は、いくつかの例を挙げると、過剰増殖性疾患（例えば、SMC；再狭 窄は１つの例である）、腫瘍形成および増殖、転移などを減少または停止する産 物をコードし得る。 ポジティブおよびネガティブの両方の遺伝子治療適用に関するさらなる詳細を 、以下の本明細書の続く節において示す。このように、以下の例示は、例示であ って、限定することを意図しない。 ａ．虚血の処置のための遺伝子産物 例えば、虚血において、内皮細胞および平滑筋細胞は増殖しない。FGFを発現 する構築物は、単独、または短期間の確実性を与え、そしてFGFレセプターを誘 導するためにFGFタンパク質と組み合わせて、虚血の効果と闘う（combat）する ために使用され得る。そのような場合において、分泌を促進するためのリーダー 配列を有するFGF遺伝子が好ましい。同様に、FGF遺伝子は、好ましくは構成プロ モーターによって駆動される。さらに、FGFのムテインは、当業者に公知であり 、そしてペイロード分子およびリガンドとして有用であり得る。（米国特許第5, 175,147号；PCT出願番号第WO 89/00198号、米国特許出願番号第07/070,797号；P CT出願番号第WO 91/15229号；および米国特許出願番号第07/505,124号を参照の こと）。 本発明のベクターを使用して送達され得る他の有用な配列は、ヒトスーパーオ キシドジスムターゼ(SOD)をコードする配列およびそのアナログ（例えば、米国 特許第5,455,029号、同第5,130,245号、および同第4,742,004号を参照のこと） 、ならびにopiodペプチド（例えば、米国特許第4,684,624号を参照のこと）を含 む。本明細書中に開示されるような有用な治療的産物をコードする他の配列（そ のGenBank番号は、以下のF.1.e節において提供される）は、IGF（例えば、米国 特許第5612198号および同第5324639号）；TGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3（例え ば、米国特許第5168051号、同第5482851号、同第4886747号、および同第5221620 号を参照のこと）；肝細胞増殖因子（HGF）（例えば、米国特許第5,547,856号； 同第5,328,837号；および同第5,316,921号を参照のこと）；PDGF A（例えば、米 国特許第5605816号および同第5219759号を参照のこと）；およびPDGF B（米国特 許第5272064号、同第5665567号を参照のこと）を含む。 次の治療的産物をコードする核酸配列はまた、本発明によるペイロードとして 有用である：VEGF 121、LVEGF 165、FGF1、FGF2、FGF4、およびFGF5。これらの 分子についての配列情報は、本明細書中の他の場所にて提供される。 最終的に、刊行物、特に特許出願および特許の参照におけるすべての例におい て、本明細書中に引用されるすべての特許文献の開示は、本明細書中に十分に示 されるように、参考として援用されることは一般に理解されるべきである。 さらに、特定の血管形成疾患を罹患する個体は、少量の血管形成因子に苦しみ 、従って微小血管において欠損し得る。排卵、月経後の子宮の修復、および胎盤 の発達のような生殖の特定の局面は、血管形成に依存する。潜在的な血管形成機 能不全を有する生殖障害について、FGF、VEGF、または他の血管形成因子を発現 する構築物は、有益であり得る。そのような血管形成因子をコードする有用な配 列は、E.1.a節およびE.1.b節を含む本明細書中の種々の節において記載される。 ｂ．オリゴヌクレオチド 本明細書中に提供される結合体はまた、リボザイム、デオキシリボザイム、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドなどを標的細胞に送達するために使用され得る。 これらの核酸は、リガンドと核酸結合ドメインの複合体中に存在し得るか、また は複合体中の核酸によってコードされ得る。あるいは、核酸は、リガンドに直接 連結され得る。そのような産物は、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザ イム、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびタンパク質に結合するオリゴヌク レオチドを含む。核酸はまた、RNA輸送シグナル、例えばウイルスパッケージン グ配列（例えば、Sullengerら（1994）Science 262:1566-1569を参照のこと）を 含み得る。 本明細書中に記載されるような使用のための核酸およびオリゴヌクレオチドは 、当業者に周知の任意の方法によって合成され得る（例えば、WO 93/01286、米 国特許出願番号第07/723,454号；米国特許第5,218,088号；米国特許第5,175,269 号；米国特許第5,109,124号を参照のこと）。アンチセンス剤としての使用のた めのオリゴヌクレオチドおよびリボザイム、ならびに遺伝子治療のための標的化 送達のための遺伝子をコードするDNAの同定は、当該分野において周知の方法を 含む。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さ、および他 の特徴は、周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には以下の ような連結剤を用いることによって内因性核分解(nucleolytic)酵素による分解 に耐えるように設計される：ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルフ ォン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、リン 酸エステル、および他の連結剤(例えば、Agrwalら、Tetrahedron Lett．28:3539 -3542(1987);Millerら、J．Am．Chem．Soc．93:6657-6665(1971);Stecら、Tetra hedron Lett．26:2191-2194(1985);Moodyら、Nucl．Acids Res．12:4769-4782(1 989);Uznanskiら、Nucl．Acids Res．(1989);Letsingerら、Tetrahedron 40:137 -143(1984);Eckstein，Annu．Rev．Biochem．54:367-402(1985);Eckstein，Tren ds Biol．Sci．14:97-100(1989);Stein，Oligodeoxynucleotides，Antisense In hibitors of Gene Expression，Cohen編，Macmillan Pre ss，London，97-117頁(1989);Jagerら、Biochemistry 27:7237-7246(1988)を参 照のこと)。 アンチセンスヌクレオチドは、核酸（例えば、mRNAまたはDNA）に配列特異的 様式で結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するmRNAに結合する 場合、アンチセンスは、mRNAの翻訳を妨げる（例えば、Altmanら、米国特許第5, 168,053号；Inouye、米国特許第5,190,931号；Burch、米国特許第5,135,917号； Smith、米国特許第5,087,617号、およびCluselら（1993）Nucl．Acids Res．21: 3405-3411、これはダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する、を参 照のこと）。三重鎖分子は、共直線性三重鎖分子を形成し、それによって転写を 阻害する、二重鎖DNAに結合する単一のDNA鎖をいう（例えば、Hoganら、米国特 許第5,176,996号、これは、二重鎖DNA上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレ オチドを作製するための方法を記載する、を参照のこと）。 特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三重鎖分子は、オンコジーンまた は増殖因子のような細胞増殖に関与するタンパク質（例えば、bFGF、int-2、hst -1/K-FGF、FGF-5、hst-2/FGF-6、FGF-8）をコードするDNAまたはmRNAのセンス鎖 に相補的またはそれに結合する分子である。他の有用なアンチセンスオリゴヌク レオチドは、IL-8（例えば、米国特許第5,241,049号を参照のこと）、c-src、c- fos、H-ras（肺ガン）、K-ras（乳ガン）、ウロキナーゼ（メラノーマ）、BCL2 （Ｔ細胞リンパ腫）、IGF-1（グリオブラストーマ）、IGF-1レセプター（グリオ ブラストーマ）、TGF-β1、よびCRIPTO EGFレセプター（結腸ガン）に特異的で あるオリゴヌクレオチドを含む。これらの特定のプラスミドは、胸腺欠損（athy mic）およびシンジェニック（syngenic）マウスにおける腫瘍形成を減少させる 。 これらの核酸またはアンチセンスをコードする核酸は、乾癬の処置のためにbF GFに連結され得る。非筋肉ミオシン重鎖および/もしくはc-mybに特異的なアンチ センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスをコードする核酸（例えば、Simo nsら、（1992）Circ．Res．70:835-843;PCT出願WO 93/01286、米国特許出願番号 第07/723，454号：LeClercら，（1991）J．Am．Coll．Cardiol．17(2 Suppl.A): 105A;Ebbeckeら、（1992）Basic Res．Cardiol．87:585-591を参照のこと）は、 例えば、血管形成術後に生じるような平滑筋細胞増殖を阻害するように、FG Fによって標的化され得る。 リボザイムは、RNA基質（例えば、mRNA）を特異的に切断し、細胞増殖または 発現を阻害または妨げる、RNA分子である。RNA鎖の切断および/または連結に関 与するリボザイムの、少なくとも５つの公知のクラスが存在する。リボザイムは 、任意のRNA転写物に標的化され得、そしてそのような転写物を触媒的に切断し 得る（例えば、米国特許第5,272,262号；米国特許第5,144,019号；および米国特 許第5,168,053号、同第5,180,818号、同第5,116,742号、および同第5,093,246号 （Cechら）を参照のこと）。任意のそのようなリボザイムまたはリボザイムをコ ードする核酸は、レセプター内在化結合リガンドについてのレセプターを保有す る細胞に送達され得る。 リボザイムなどは、核への導入の際にリボザイムが直接的に転写されるように 、真核生物細胞のウイルス性プロモーターのような真核生物プロモーターに連結 されたリボザイムをコードするDNAによって、標的細胞に送達され得る。そのよ うな場合において、構築物はまた、一般的にリガンドの部分、またはリガンドと 核酸結合ドメインとの間のリンカーの部分として、核転位配列を含む。 Ｃ．プロドラッグ あるいは、プロドラッグをコードする核酸分子は、本発明の文脈において使用 され得る。プロドラッグは、基質または活性化分子のいずれかが提供されるまで 、宿主細胞において不活性である。最も代表的には、プロドラッグは、細胞傷害 性をほとんどまたは全く有さない化合物を、毒性化合物に活性化させる。より頻 繁に使用されるプロドラッグ分子のうちの３つ（これらはすべて、本発明におけ る使用のために適切である）は、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼ（Hsvt k）、およびシトシンデアミナーゼ（例えば、E．coli CD）である。 手短には、細胞傷害性をほとんどまたはまったく有さない化合物を、毒性産物 に、直接的または間接的に活性化させる、広範な種々の化合物は、本発明の文脈 において利用され得る。そのような遺伝子産物の代表的な例は、HSVTK（単純ヘ ルペスウイルスチミジンキナーゼ）、およびVZVTK（varicella zosterウイルス チミジンキナーゼ）であり、これらは、特定のプリンアラビノシドおよびピリミ ジン置換された化合物を選択的にリン酸化する。リン酸化は、これらの基質（化 合物）を、細胞傷害性または細胞分裂性である代謝産物に変換させる。例えば、 薬物のガンシクロビル、アシクロビル、または任意のそれらのアナログ（例えば 、FIAU、FIAC、DHPG）の、HSVTKを発現する細胞への曝露は、薬物の、それに対 応する活性なヌクレオチド三リン酸形態への変換を可能にする。 本発明の文脈において利用され得る他の遺伝子産物は、E．coliグアニンホス ホリボシルトランスフェラーゼ、これはチオキサンチンを毒性チオキサンチン一 リン酸に変換する(Besnardら、Mol．Cell．Biol．7:4139-4144，1987)；アルカ リホスファターゼ、これは不活性なリン酸化化合物（例えば、マイトマイシンリ ン酸およびドキソルビシンリン酸）を、脱リン酸化化合物に変換する；真菌性( 例えば、Fusarium oxysporum)または細菌性シトシンデアミナーゼ、これは5-フ ルオロシトシンを毒性化合物5-フルオロウラシルに変換する(Mullen，PNAS 89:3 3，1992)；カルボキシペプチダーゼG2、これは、パラ-N-ビス（2-クロロエチル ）アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を切断し、それによって毒性 安息香酸マスタードを作製する；およびPenicillin-vアミダーゼ、これは、ドキ ソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセトアビド誘導体を毒性化合物に 変換する(一般に、Vrudhulaら、J．Med．Chem．36:919-923，1993;Kernら、Canc ．Immun，Immunother．31:202-206，1990を参照のこと)を含む。さらに、種々の 広範なHerpesviridaeチミジンキナーゼ（霊長類ヘルペスウイルスおよび非霊長 類ヘルペスウイルスの両方を含む）は、適切である。そのようなヘルペスウイル スは、単純ヘルペスウイルス１型(McKnightら、Nuc．Acids Res 8:5929-5964，1 980)、単純ヘルペスウイルス２型(SwainおよびGalloway，J．Virol.46:1045-105 0，1983)、Varicella Zosterウイルス(DavisonおよびScott，J．Gen，Virol．67 :1759-1816，1986)、マーモセットヘルペスウイルス(OtsukaおよびKit，Virolog y 135:316-330，1984)、ネコヘルペスウイルス１型(Nunbergら、J．Virol．63:3 240-3249，1989)、仮性狂犬病ウイルス(Kit and Kit，米国特許第4,514,497号， 1987)、ウマヘルペスウイルス１型(RobertsonおよびWhalley，Nuc．Acids Res． 16:11303-11317，1988)、ウシヘルペスウイルス１型(MittalおよびField，J．Vi rol 70:2901-2918，1989)、シチメンチョウヘルペ スウイルス(Martinら、J．Virol．63:2847-2852，1989)、マレック病ウイルス(S cottら、J．Gen．Virol．70:3055-3065，1989)、ヘルペスsaimiri(Honessら、J ．Gen．Virol．70:3003-3013，1989)、およびエプスタイン−バーウイルス(Baer ら、Nature（London）310:207-311，1984)。このようなヘルペスウイルスは、ア メリカンタイプカルチャーコレクション(「ATCC」，Rockville，Maryland)のよ うな商業的な供給源から容易に入手され得る。 さらに、先に示されるように、広範な種々の不活性前駆体は、活性なインヒビ ターに変換され得る。例えば、チミジンキナーゼは、ヌクレオシド（例えば、dT ）、およびガンシクロビル(9-{[2-ヒドロキシ-1-(ヒドロキシメチル)エトキシル メチル}グアノシン)、ファムシクロビル、ブシクロビル、ペンシクロビル、バル シクロビル(valciclovir)、アシクロビル(9-[2-ヒドロキシエトキシ)メチル]グ アノシン)、トリフロオロチミジン、1-[2-デオキシ、2-フルオロ、β-D-アラビ ノフラノシル]-5-ヨードウラシル、ara-A（アデノシンアラビノシド、ビバラビ ン(vivarabine)）、1-β-D-アラビノフラノキシルチミジン、5-メチル-2'-デオ キシウリジン、5-ヨード-5'-アミノ-2,5'-ジデオキシウリジン、イドクスウリジ ン(5-ヨード-2'-デオキシウリジン)、AZT（3'アジド-3'チミジン）、ddC（ジデ オキシシチジン）、AIU(5-ヨード-5'アミノ2',5'-ジデオキシウリジン)、および AraC（シチジンアラビノシド）のようなヌクレオシドアナログをリン酸化し得る 。 他の遺伝子産物は、細胞を、毒性薬剤に対して感受性にし得る。そのような産 物は、腫瘍壊死因子、ウイルス性タンパク質、および薬物を輸送するチャンネル タンパク質を含む。 細胞破壊薬をコードする薬剤は、適切な細胞型において発現される場合、活性 形態にプロセシングまたは改変されるプロドラッグとして構築され得る。例えば 、サポリン遺伝子は、プロテアーゼ感受性部位を含むＮまたはＣ末端伸長を有す るように構築され得る。伸長は、タンパク質を不活性にし、そして適切なプロテ アーゼを発現する細胞における引き続く切断は、酵素活性を回復させる。 ｄ．腫瘍抑制遺伝子 腫瘍抑制遺伝子の定義は、近年、変異の欠失にもかかわらず重要な腫瘍抑制活 性を示唆する、ガンにおける頻繁なダウンレギュレーションを受けやすい遺伝子 （およびその産物）を含むように拡大されている。前述の例は、E-カドヘリンの ような細胞接着分子(GenBank登録番号Z18923)を含み、これは、組織発達および 上皮細胞分化において役割を果たす。E-カドヘリン発現は、上皮分化に相関する が、E-カドヘリン発現の欠失は、上皮脱分化およびヒトガン細胞の侵襲性を促進 する。従って、E-カドヘリンの回復は、上皮腫瘍細胞の侵襲性を妨げる。 ヒトBGP(胆汁糖タンパク質)はまた、カドヘリンと類似の様式で細胞接着を媒 介する。従って、BGP(GenBank登録番号J03858)は、本発明の文脈において使用さ れ得る別の遺伝子である。 本発明による有用な他の腫瘍抑制遺伝子は、以下を含む。しかし、この列挙は 網羅ではなく、例示にすぎないことに注意されるべきである：Rb（GenBank登録 番号M15400）；p53(GenBank登録番号X02469、M60950)；CDKN2/P16/MTS1（GenBan k登録番号S78535、U12818）；PTEN/MMAC1(GenBank登録番号U92436)；APC(GenBan k登録番号M74088)；p33ING1(GenBank登録番号AF001954)；Smad4(GenBank登録番 号U59914)；マスピン（maspin）(GenBank登録番号U04313)；von Hippel-Lindau( VHL)(GenBank登録番号AF010238，U19763，U68055，U687176，U49746)；Wilms腫 瘍(WT1)(GenBank登録番号X69950)；Binl(GenBank登録番号U68485);Menl(GenBank 登録番号U93237，U93326)；Neurofibromatosis 2(NF2)(GenBank登録番号L27065) ;MXI1(GenBank登録番号L07648);およびFHIT(GenBank登録番号U46922)。 ｅ．血管新生および組織修復 血管新生、創傷治癒（例えば、慢性潰瘍の治癒）、および組織修復（結合組織 （例えば、骨）の修復を含む）に関与する治療的遺伝子産物をコードする種々の 広範な治療的核酸配列は、本発明の構築物、ベクター、および方法と組み合わせ ての使用に適切である。以下のVEGFならびにVEGF関連タンパク質およびポリペプ チドをコードする配列は、そのような適用に特に有用であり、そして以下を含む ：VEGE(ウシ；GenBank登録番号M32976)；VEGF(ウシ；GenBank登録番号M31836)； VEGF-C(GenBank登録番号X94216);VEGF-B(GenBank登録番号U48801)；VEGF (GenBank登録番号X62568)；Angiopoietin-1（GenBank登録番号U83508）；Angiog enin(GenBank登録番号M11567)；IGF-1(GenBank登録番号X03563)；IGF-II(GenBan k登録番号X03562，M13970，M14116，m14117，M14118)；HGF(GenBank登録番号X16 323，S80567)；PDGF A(GenBank登録番号X03795);PDGF B(GenBank登録番号X02744 ，X02811);TGFB1（GenBank登録番号A23751）；TGFB2(GenBank登録番号A23752)； およびTGFB3(GenBank登録番号A23753)。 さらに他の有用な治療的ヌクレオチド配列は、以下の分子（その多くは、骨の ような結合組織の修復において特に有用である）をコードする：PTII(GenBank登 録番号J00301，V00597)；BMP1（GenBank登録番号M22488，Y08723；米国特許第5, 108,922号もまた参照のこと）；BMP2（GenBank登録番号M22489；米国特許第5,01 3,649号もまた参照のこと）；BMP3（GenBank登録番号M22491；米国特許第5,116, 738号もまた参照のこと）；BMP5（米国特許第5,635,373号および同第5,106,748 号を参照のこと）；BMP6（米国特許第5,187,076号を参照のこと）；BMP7（米国 特許第15,187,076号を参照のこと）；BMP7（米国特許第5,141,905号を参照のこ と）；BMP８（米国特許第5,688,678号を参照のこと）；BMP10（米国特許第56374 80号を参照のこと）；BMP11（米国特許第5639638号を参照のこと）；哺乳動物BM P（米国特許第5,620,867号を参照のこと）；組織分化に影響を及ぼす因子（米国 特許第5679783号を参照のこと）；形態形成タンパク質OP-3(米国特許第5652118 号を参照のこと)；骨誘導(osteoinductive)因子(米国特許第4877864号を参照の こと)；骨形成タンパク質(米国特許第5,106,626号、同第4,968,590号、およびRE 35694を参照のこと)；およびXenopus BMP（米国特許第5,670,338号を参照のこと ）。 前述は、組織修復および再血管新生において利用され得る有用な治療的配列お よび遺伝子産物を表すが、いくつかの例である。以下に記載するように、これら の同じ配列の多くは、骨のような結合組織および他の組織損傷の修復において有 用である。 骨修復のために、骨形態形成タンパク質（BMP）、副甲状腺ホルモン(PTH)、お よびインスリン様増殖因子(IGF)をコードする配列は、特に有用である。従って 、以下の遺伝子は、本発明の教示によりペイロードとしての使用に適切であ る：PTH(GenBank登録番号J00301，V00597)；BMP1(GenBank登録番号M22488，Y087 23)；BMP2(GenBank登録番号M22489);BMP3(GenBank登録番号M22491)；IGF-1（Gen Bank登録番号X03563）；およびIGF-II(GenBank登録番号X03562，MI3970，M14116 ，M14117，M14118)。他のBMP(例えば、BMP4、BMP5、BMP6など)をコードする配列 はまた、本明細書中において開示されるように有用である。 ｆ．アポトーシス誘導剤 アポトーシスを誘導し得る、化学性質およびタンパク質様性質の両方を有する 多くの薬剤が存在する。従って、アポトーシス誘導薬剤はまた、本発明の文脈内 の治療的薬剤である。配列が、本発明のベクターを用いて高い特異性で送達され 得る、そのような薬剤をコードするヌクレオチド配列の例は、以下を含む。上記 のように、この列挙は、例示であり、本発明の網羅でも限定でもない：p53(GenB ank登録番号X02469、M60950)；c-myc（GenBank登録番号E01841）；TNF-α（GenB ank登録番号E02870）；Fasリガンド（GenBank登録番号U08137；米国特許第56630 70号もまた参照のこと）；Fasリガンド（GenBank登録番号U08137；米国特許第56 63070号および同第5652210号もまた参照のこと）；p38-マイトジェン活性化タン パク質(MAP)キナーゼ（GenBank登録番号L35253）；およびIFN-γ（GenBank登録 番号E6017、A11033）。 ｇ．細胞破壊遺伝子産物 細胞破壊薬をコードする薬剤は、細胞によるインターナリゼーション、続く転 写（DNAの場合）および[/または]細胞破壊剤への翻訳の際に、例えばタンパク質 合成の妨害または細胞周期の破壊を介して細胞増殖を阻害することによって、細 胞に対して細胞傷害性または細胞増殖抑制性である核酸分子(例えば、DNAまたは RNA)である。 細胞破壊薬は、サポリン、リシン、ゲロニン、他のリボソーム不活化タンパク 質、Pseudomonas体外毒素、ジフテリア毒素、アンジオゲニン（angiogenin）、 トリチン、ジアンチン(dianthin)32および33、モモルジン（momordin）、ヤマゴ ボウ抗ウイルスタンパク質、オシロイバナ(mirabilis)抗ウイルスタンパク質、 ブリオジン（bryodin）、アンジオゲニン、およびshiga体外毒素、ならびに当業 者に公知の他の細胞破壊薬を含む。細胞周期のインヒビターは、周知である。 別の産物の添加の際に細胞死を生じるか、または細胞死に対して細胞を感受性 にする酵素をコードするDNA分子は、好ましい。例えば、サポリンは、rRNAを切 断し、そしてタンパク質合成を阻害する酵素である。タンパク質合成を阻害する 他の酵素は、本発明における使用のために特によく適している。あるいは、産物 は、細胞死を引き起こすリボザイム、アンチセンス、または他の核酸分子であり 得る。 リシン、アブリン、およびサポリンを含むリボソーム不活化タンパク質(RIP) は、真核生物リボソームを触媒的に不活化する植物タンパク質である。リボソー ム不活化タンパク質は、タンパク質合成のタンパク質伸長工程を妨げることによ ってリボソームを不活化する。例えば、リボソーム不活化タンパク質であるサポ リン(SAPとも称される)は、ラット28SリボソームRNA(rRNA)における4324位での アデニンのＮグリコシド結合の切断によって60Sリボソームを不活化することを 示した。 いくつかの構造的に関連したリボソーム不活化タンパク質は、植物Saponaria officinalis(シャボンソウ)の種子および葉から単離されている(GB特許第2,194, 241 B号；GP特許第2,216,891号；欧州特許第89306016号)。本発明における使用 のためのサポリンタンパク質は、天然の植物宿主Saponaria of ficinalisにおい て見出されるアミノ酸配列(例えば、配列番号22)または改変された配列(例えば 、アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加)を有するが、実質的なリボソーム不 活化活性を依然として発現するアミノ酸配列を有する。タンパク質のいくつかの 分子のイソ形態もまた公知である。任意のこれらのサポリンタンパク質または細 胞傷害性である改変タンパク質は、本発明において使用され得る。他の適切なサ ポリンポリペプチドは、SO-1およびSO-3(Fordham-Skeltonら、Mol.Gen.Genet.22 1:134-138,1990)、SO-2(例えば、米国特許出願第07/885,242号；GB2,216,891号 を参照のこと；Fordham-Skeltonら、Mol.Gen.Genet.229:460-466,1991もまた参 照のこと)、SO-4(例えば、GB2,194,241 B号を参照のこと；Lappiら、Biochem.Bi ophys.Res.Commun.129:934-942,1985もまた参照のこと)およびSO-5(例えば、GB 2,194,241B号を参照のこと；Montecucchiら、Int.J.Peptide Protein Res.33:26 3-267,1989もまた参照のこと)を含む、サポリン型リボソーム不活化タンパク質 のイソ形態をコードする多重遺伝子族の他のメンバーを含む。標準的なインビト ロまたはインビボアッセイにおいて、本明細書中に記載されるサポリン結合体に 関する大きさの少なくとも約１桁の範囲内の細胞傷害性を示す、このような任意 のタンパク質またはその一部は、本明細書中における使用が意図される。 リボソーム不活化タンパク質をコードするDNA配列は、哺乳動物に好適なコド ン(配列番号23)を使用し得る。哺乳動物、酵母、Drosophila、E.coli、および霊 長類についてCurrent Protocols in Molecular Biology(後出)およびZhangら(Ge ne 105:61,1991)に例示されるような、好適なコドン使用頻度は、サポリン配列 について確立される。 上記で議論したサポリンに加えて、タンパク質合成を阻害する他の細胞破壊薬 は、本発明において有用である。これらの細胞破壊薬についての遺伝子配列は、 標準的な方法(例えば、PCR、ゲノムまたはcDNAライブラリーのプローブのハイブ リダイゼーション、発現ライブラリーの抗体スクリーニングにより単離され得る か、またはクローンが商業的もしくは他の供給源から得られ得る。多くのこれら の細胞破壊薬のDNA配列は周知であり、これには、リシンＡ鎖(GenBank受託番号 第X02388号）；トウモロコシリボソーム不活化タンパク質(GenBank受託番号第L2 6305号)；ゲロニン(gelonin)(GenBank受託番号第L12243号)；PCT出願W092/03155 ；米国特許第5,376,546号；ジフテリア毒素(GenBank受託番号第K01722号)；トリ コサンチン(tricosanthin)(GenBank受託番号第M34858号)；トリチン(tritin)(Ge nBank受託番号第D13795号)；アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(GenBank 受託番号第X78628号)；ミラビリス(mirabilis)抗ウイルスタンパク質(GenBank受 託番号第D90347号)；ジアンチン(dianthin)30(GenBank受託番号第X59260号)；ア ブリン(GenBank受託番号第X55667号)；シガ(GenBank受託番号第M19437号)および Pseudomonas外毒素(GenBank受託番号第K01397号および同第M23348号)が含まれる 。DNA配列またはアミノ酸配列が公知である場合、これらのタンパク質をコード するDNA分子は、合成され得、そして哺乳動物に好適なコドンを含み得る。 サポリンDNA配列のような治療的産物をコードする薬剤は、生物におけるポリ ペプチドの発現に適切なプロモーターと作動可能に連結してプラスミドに導入さ れる。プラスミドは、必要に応じてサポニン含有プラスミドの染色体外の維持を 可能にする複製起点のような配列を含み得るか、または(宿主における安定な維 持を確実にする別の手段として)宿主のゲノムに組み込むように設計され得る。 上記で議論したサポリンに加えて、タンパク質合成を阻害する他の細胞破壊薬 は、本発明に有用である。これらの細胞破壊薬についての遺伝子配列は、標準的 な方法(例えば、PCR、ゲノムまたはcDNAライブラリーのプローブハイブリダイゼ ーション、発現ライブラリーの抗体スクリーニングにより単離され得るか、また はクローンが商業的もしくは他の供給源から得られ得る。多くのこれらの細胞破 壊薬のDNA配列は周知であり、これには、リシンＡ鎖(GenBank受託番号第X02388 号)；トウモロコシリボソーム不活化タンパク質(GenBank受託番号第L26305号)； ゲロニン(GenBank受託番号第L12243号)；PCT出願WO92/03155；米国特許第5,376, 546号；ジフテリア毒素(GenBank受託番号第K01722号)；トリコサンチン(GenBank 受託番号第M34858号)；トリチン(GenBank受託番号第D13795号)；アメリカヤマゴ ボウ抗ウイルスタンパク質(GenBank受託番号第X78628号)；ミラビリス抗ウイル スタンパク質(GenBank受託番号第D90347号)；ジアンチン30(GenBank受託番号第X 59260号)；アブリン(GenBank受託番号第X55667号）；シガ(GenBank受託番号第Ml 9437号)およびPseudomonas外毒素(GenBank受託番号第K01397号および同第M23348 号)が含まれる。DNA配列またはアミノ酸配列が公知である場合、これらのタンパ ク質をコードするDNA分子は、合成され得、そして哺乳動物に好適なコドンを含 み得る。 ２．プロモーターおよびさらなるエレメント DNA配列のような本発明の治療的産物をコードする薬剤は、一般的に、レシピ エント細胞におけるポリペプチドの発現に適切なプロモーターと作動可能に連結 してプラスミドに導入される。プラスミドは、必要に応じてサポニン含有プラス ミドの染色体外の維持を可能にする複製起点のような配列を含み得るか、または (宿主における安定な維持を確実にする別の手段として)宿主のゲノムに組み込む ように設計され得る。 一般的に、構築物はまた、転写および翻訳に必要なエレメントを含む。プロモ ーターの選択は、形質転換される細胞型ならびに所望される制御の程度または型 に依存する。プロモーターは、構成性であり得るか、または任意の細胞型、組織 特異的、細胞特異的、事象特異的、時間特異的または誘導性において活性であり 得る。細胞型特異的プロモーターおよび事象型特異的プロモーターが好ましい。 構成性または非特異的プロモーターの例には、SV40初期プロモーター(米国特許 第5,118,627号)、SV40後期プロモーター(米国特許第5,118,627号)、CMV初期遺伝 子プロモーター(米国特許第5,168,062号)、およびアデノウイルスプロモーター が挙げられる。ウイルスプロモーターに加えて、細胞性プロモーターもまた、本 発明の状況において受け入れられる。特に、いわゆるハウスキーピング遺伝子に ついての細胞性プロモーターが有用である。ウイルスプロモーターが好ましい。 なぜなら、それらは、一般的に細胞性プロモーターより強力なプロモーターであ るからである。 組織特異的プロモーターは、広範な種々の細胞(内皮および平滑筋細胞を含む) における発現に特に有用である。このクラスのプロモーターの１つを使用するこ とによって、特異性という特別の利点を獲得し得る。SMC特異的プロモーターは 、SMCに関与する増殖性疾患を標的化することに特に有用である。例えば、FGFR プロモーター、EGFRプロモーター、PDGFレセプタープロモーター、インテグリン レセプタープロモーター、αアクチンプロモーター、SM1およびSM2ミオシン重鎖 プロモーター、カルポニン-h1プロモーター、SM22αアンジオテンシンレセプタ ープロモーターは、本発明の状況において有用である。 例示的な組織特異的プロモーターには、αクリスタリン、チロシナーゼ、αフ ェトプロテイン、前立腺特異的抗原、CEA、αアクチン、VEGFレセプター、erbB- 2、C-myc、サイクリンＤ、FGFレセプター、γクリスタリンプロモーター、tek、 tie、ウロキナーゼレセプター、Ｅセレクチン、Ｐセレクチン、VCAM-1、エンド グリン、エンドシアリン(endosialin)、α_Vインテグリン、β₃インテグリン、エ ンドセリン-１、ICAM-3、E9、フォンビルブラント因子、CD-44、CD40、血管内皮 カドヘリン、notch 4および高分子量メラノーマ関連抗原が含まれる。 内皮特異的プロモーターは、内皮細胞に関連する増殖性疾患を標的化すること に特に有用である。血管新生または原発性血管形成疾患に依存性の疾患またはそ れにより悪化する疾患を処置するために、以下のプロモーターが特に有用である ：VEGFレセプタープロモーター(Morishitaら、J．Biol．Chem．270:27948，1995 ；GenBank受託番号第X89776号);FGFレセプタープロモーター；盛んに増殖する血 管の内皮細胞において優性に発現されるレセプターチロシンキナーゼであるTEK またはtie 2プロモーター(Huangら、Oncogene 11:2097,1995；GenBank受託番号 第L06139号)；tie(WO96/09381；Korhonenら、Blood 86:1828,1995;GenBank受託 番号第X60954号；GenBank受託番号第S89716号)；血管新生の間に内皮細胞中で高 レベルで発現されるウロキナーゼレセプター(Hollasら、Cancer Res．51:3690,1 991；Gumら、Anti-Cancer Res．15:1167，1995；Soraviaら、Blood 86:624，199 5；GenBank受託番号第S78532号)；乳ガンのような腫瘍の内皮で発現が増加して いるEおよびPセレクチン(Foxら、J.Pathol.177:369,1995；Blanconeら、J.Exp.M ed.183:581,1996；GenBank受託番号第M64485号；GenBank受託番号第L01874号)； VCAM-1(Iademarcoら、J.Biol.Chem267:16323,1992；GenBank受託番号第M92431号 )；腫瘍の脈管構造においてアップレギュレートされるエンドセリン(Bellonら、 Eur.J.Immunol.23:2340,1993；GougosおよびLetarte、J.Biol.Chem.265:8361,19 90；GenBank受託番号第HSENDOG号)；腫瘍毛細血管で優先的に発現されるエンド シアリン(Rettingら、PNAS 89:10832,1992);α_Vβ₃インテグリン(Villa-Garcia ら、Blood 3:668,1994；Donahueら、BBA 1219.228,1994)；内皮細胞についての 増殖因子であるエンドセリン-1(GenBank受託番号第M25377号；GenBank受託番号 第J04819号；GenBank受託番号第J05489号)；腫瘍内皮にて発現されるICAM-1(Pat eyら、Am.J.Pathol.148:465,1996；Foxら、J.Path.177:369,1995；GenBank受託 番号第S50015号)；脛瘍内皮にてアップレギュレートされるE9抗原(Wangら、Int. J.Cancer.54:363,1993)；フォンビルブラント因子(JahroudiおよびLynch、Moll. Cell.Biol．144:999,1994；GenBank受託番号第HUMVWFI；GenBank受託番号第HUMV WFA号)；CD44(Hofmannら、Cancer Res.53：1516,1993；Maltzmanら、Mol.Cell.B iol.16:2283,1996；GenBank受託番号第HUMCD44B号)；CD40(Pammerら、Am.J.Path ol.148:1387,1996；GenBank受託番号第HACD40L号；GenBank受託番号 第HSCD405FR号)；血管腫の内皮細胞において高度に発現される血管内皮カドヘリ ン(Martin-Paduraら、J.Pathol.175:51,1995)；notch 4(Uyttendaeleら、Develo pment 122:2251,1996)および高分子量メラノーマ関連抗原。 誘導性プロモーターもまた用いられ得る。これらのプロモーターには、デキサ メサゾンにより誘導し得るMMTV LTR(PCT WO91/13160)、重金属により誘導し得る メタロチオネイン、およびcAMPにより誘導し得るcAMP応答エレメントを有するプ ロモーターがあげられる。誘導性プロモーターを使用することによって、核酸は 、細胞に送達され得、そしてインデューサーの添加まで静止状態であり続ける。 これは、遺伝子産物の生成のタイミングについてのさらなる制御を可能にする。 事象型特異的プロモーターは、腫瘍形成またはウイルス感染のような事象の発 生の際のみに活性であるかまたはアップレギュレートされる。HIV LTRは、事象 特異的プロモーターの周知の例である。このプロモーターは、tat遺伝子産物が 存在しなければ、不活性である。そしてこれは、ウイルス感染の際に生じる。い くつかの事象型プロモーターはまた、組織特異的プロモーターでもある。 さらに、特定の細胞性遺伝子と協調して調節されるプロモーターが使用され得 る。例えば、特定のFGFレセプター遺伝子が発現される場合に協調して発現され る遺伝子のプロモーターは、使用され得る。次いで、核酸は、FGFR1のようなFGF レセプターが発現された場合に転写され、そしてFGFR2が発現される場合は、転 写されない。この型のプロモーターは、特定の組織におけるFGFレセプター発現 のパターンを知っている場合、特に有用である。その結果、この組織内の特異的 細胞は、周辺組織に影響を与えることなく細胞傷害性薬剤遺伝子の転写の際に殺 傷され得る。 ドメインが配列特異的様式で結合する場合、構築物は、核酸結合ドメインに結 合する配列を含まなければならない。以下に記載のように、標的ヌクレオチド配 列は、さらなる配列を組み込む必要がない場合に、細胞破壊薬のコード領域内に 含まれ得る。さらに、標的配列の複数コピーを有することが所望され得る。標的 配列がコード配列である場合、さらなるコピーは、細胞破壊薬コード薬剤の非コ ード領域に配置されなければならない。核酸結合ドメインの標的配列は、代表的 には、一般に既知である。既知でない場合、標的配列は、容易に決定され得る。 標的配列を確立するための技術は、一般に利用可能である(例えば、PCT出願番号 WO92/05285および米国特許出願第586,769号を参照のこと)。 プロモーターに加えて、リプレッサー配列、ネガティブ調節因子、または組織 特異的サイレンサーは、細胞破壊薬またはプロドラッグの非特異的発現を低減さ せるために挿入され得る。複数のリプレッサーエレメントは、プロモーター領域 に挿入され得る。転写の抑制は、リプレッサーエレメントの方向またはプロモー ターからの距離に非依存性である。リプレッサー配列の１つの型は、隔離配列で ある。このような配列は、転写を阻害し(Dunawayら、Mol Cell Biol 17:182-9,1 997；Gdulaら、Proc Natl Acad Sci USA 93:9378-83,1996,Chenら、J Virol 70: 5312-28,1996；ScottおよびGeyerら、EMBO J.14:6258-67,1995；KalosおよびFou rnier、Mol Cell Biol 15:198-207,1995；Chungら、Cell 74:505-14,1993)、そ してバックグラウンド転写をサイレントにする。 ネガティブ調節エレメントは、多くの異なる遺伝子のプロモーター領域におい て特徴づけられた。リプレッサーエレメントは、オボアルブミン遺伝子のプロモ ーター領域においてNSEが機能する(Haeckerら、Mol.Endocrinology 9:1113-1126 ,1995)のと同様に、ステロイドのような因子の非存在下において転写のリプレッ サーとして機能する。これらのネガティブ調節エレメントは、卵管由来の特異的 タンパク質複合体(これらのいずれもステロイドに感受性でない)に結合する。３ つの異なるエレメントは、オボアルブミン遺伝子のプロモーターに位置する。こ れらのエレメントの一部に対応するオリゴヌクレオチドは、TKレポーターのウイ ルス転写を抑制する。サイレンサーエレメントの１つは、他の遺伝子のサイレン サーとの配列同一性(TCTCTCCNA)を共有する。 リプレッサーエレメントはまた、コラーゲンII遺伝子のプロモーター領域にお いて同定された。ゲル遅延研究によって、HeLa細胞由来の核因子が、サイレンサ ー領域を含むDNAフラグメントに特異的に結合することを示したが、軟骨細胞核 抽出物は、結合活性を全く示さなかった(Savangerら、J.Biol.Chem.265(12):666 9-6674,1990)。リプレッサーエレメントはまた、カルバミルホスフェートシンセ ターゼ遺伝子における転写を調節することを示した(Gopingら、Nucleic Acid Re search 23(10):1717-1721,1995)。この遺伝子は、２つの異なる細胞型、すな わち、肝細胞および腸粘膜の上皮細胞のみで発現される。ネガティブ調節領域は また、コリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域、アルブミ ンプロモーター(Ｈｕら、J.Cell.Growth Differ.3(9):577-588,1992)、ホスホグ リセレートキナーゼ(PGK-2)遺伝子プロモーター(Misunoら、Gene 119(2):293-29 7,1992)、および6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファ ターゼ遺伝子において同定された。ここで、ネガティブ調節エレメントは、非肝 細胞株における転写を阻害する(Lemaigreら、Mol.Cell.Biol.11(2):1099-1106) 。さらにネガティブ調節エレメントであるTse-1は、チロシンアミノトランスフ ェラーゼ(TAT)を含む多くの肝臓特異的遺伝子において同定された。TAT遺伝子発 現は、肝臓特異的であり、そしてグルココルチコイドおよびcAMPシグナリング経 路の両方によって誘導性である。cAMP応答エレメント(CRE)は、Tse-1および肝細 胞特異的エレメントによる抑制のための標的であることが示されている(Boshart ら、Cell．61(5):905-916,1990)。 好ましい実施態様において、所望の産物の発現を増加させるエレメントは、構 築物中に組み込まれる。このようなエレメントには、内部リボソーム結合部位(I RES;WangおよびSiddiqui、Curr.Top.Microbiol.Immunol 203:99,1995；Ehrenfel dおよびSemler、Curr.Top.Microbiol.Immunol.203:65,1995；Reesら、Biotechni ques 20:102,1996；Sugimotoら、Biotechnology 12:694,1994)が含まれる。IRES は、翻訳効率を増加させる。同様に、他の配列は、発現を増強させ得る。いくつ かの遺伝子については、特に5'末端での配列は、転写および/または翻訳を阻害 する。これらの配列は、通常、ヘアピン構造を形成し得るパリンドロームである 。送達される核酸における任意のこのような配列は、一般に欠失される。転写ま たは翻訳産物の発現レベルは、どの配列が発現に影響を及ぼすかを確認または確 実にするためにアッセイされる。転写物レベルは、ノーザンブロットハイブリダ イセーション、Rnaseプローブ保護などを含む任意の公知の方法によってアッセ イされ得る。タンパク質レベルは、ELISAを含む任意の公知の方法によってアッ セイされ得る。 他のエレメントは、構築物中に組み込まれる。好ましい実施態様において、こ の構築物は、ポリアデニル化配列を含む転写終結配列、スプライス供与体部位お よび受容体部位、ならびにエンハンサーを含む。哺乳動物細胞または他の真核生 物細胞における構築物の発現および維持に有用な他のエレメントもまた、組み込 まれ得る(例えば、複製起点)。構築物は、細菌細胞において都合のよいように生 成されるので、細菌における増殖に必要とされるかまたはそれを増強するエレメ ントが、組み込まれる。このようなエレメントには、複製起点、選択マーカーな どが含まれる(以下の考察を参照のこと)。 適切な細胞のみにおける核酸の発現を開始するため、または複合体の取り込み を増強するためのさらなるレベルの制御は、２つの構築物の送達である。このう ちの一方は、細胞破壊薬をコードし、そして他方の構築物は、細胞破壊薬もしく はプロドラッグを駆動するプロモーターの発現を制御するか、または腫瘍塊もし くは他の標的細胞への複合体の取り込みを増強させる、第２の遺伝子をコードす る。例示の手段として、１つの構築物において、細胞破壊薬をコードする薬剤は 、熱ショックプロモーターのようなプロモーターにより制御される。第２の構築 物は、腫瘍特異的プロモーターの制御下でSOS経路を誘発する遺伝子のような遺 伝子である。この２つの構築物は、同時送達されるか、または連続的に送達され る。腫瘍細胞に送達される場合、SOS遺伝子は発現され、そして細胞破壊薬コー ド薬剤の発現を引き起こすことを生じる。この場合において、この２つの構築物 は、１つの構築物に併合され得る)。 他の型の複数送達系において、第１の構築物は、上記に記載のもののようなプ ロモーターの制御下での細胞破壊薬遺伝子である。第２の構築物は、良好に透過 させるために腫瘍塊における漏出を誘導する遺伝子(例えば、IL-2)の発現を制御 する異なるプロモーターを含む。第２の構築物が最初に導入される場合、腫瘍塊 は、送達される第１の構築物により容易に接近可能である。 代表的には、これらの構築物は、プラスミドベクターである。好ましい構築物 は、改変pNASSベクター(Clontech，Palo Alto，CA)である。この改変ベクター（ amp.R遺伝子が、kan.R遺伝子によって置き換えられる）には、ポリＡシグナル配 列が、哺乳動物プロモーターの上流に添加されている。T7プロモーターは、哺乳 動物プロモーターの下流でかつ細胞破壊薬またはプロドラッグ遺伝子の上流に添 加されて、細胞傷害性活性の確認を容易にする。他の適切な哺乳動物発現ベク ターは、周知である(例えば、Ausubelら、1995；Sambrookら、前出；Invitrogen catalogue，San Diego，CA；Novagen，Madison，WI；Pharmacia catalogue，Up psala，Swedenなどを参照のこと)。 Ｇ．薬学的組成物の処方物および投与 本明細書中に提供される再標的化されたウイルスベクターおよび複合体は、種 々の疾患の処置および予防において有用である。例示として特定の疾患が以下に 列挙される一方、本明細書中に開示されるベクター、複合体、結合体、および他 の構築物は、増殖性疾患、静止状態(quiescent)疾患、および代謝性疾患の処置 を含む、広範な種々の治療適用において有用であることが理解されるべきである 。先に記載したように、疾患の原因は、無関係である；従って、症状または疾患 が遺伝性であるか、先天性であるか、または後天性であるかどうかであり、本発 明の組成物および方法は、治療的介入において特に有用である。 本明細書中に用いられる場合、「処置」または「治療」とは、状態、障害また は疾患の症状が緩和されるか、またはそうでなければ、有利に改変される任意の 様式を意味する。処置はまた、本明細書中の組成物の任意の薬学的使用を含み、 この使用は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロのいずれであってもよい 。本明細書中に用いられる場合、特定の障害の症状の「緩和」とは、永続性であ ろうと一過性であろうと、永続的であろうと一時的であろうと、組成物の投与に 起因し得るかまたは関連し得る、任意の低減をいう。 １．腫瘍の処置 上記に記載のように、本発明の組成物は、腫瘍を処置するために用いられる。 これらの疾患において、細胞増殖は、過剰であるか、または制御されない。本発 明の状況において処置に適切な腫瘍としては、乳ガン、神経膠肺、メラノーマ、 前立腺ガン、肝細胞腫、肉腫、リンパ腫、白血病、卵巣腫瘍、胸腺肺、腎腫、膵 臓ガン、結腸ガン、頭部および頸部ガン、胃ガン、肺ガン、中皮腫、骨髄腫、神 経芽細胞腫、網膜芽細胞種、子宮頚癌、子宮癌、および皮膚の扁平上皮細胞癌が 挙げられるが、これらに限定されない。上記に記載のように、これらのガンにつ いてのリガンドは、一般的に、腫瘍において優先的に発現される細胞表面レセプ ターに結合する。これらの細胞表面のレセプターおよびそれらのリガンドの多く は、公知である。このようなリガンド−レセプター対のない腫瘍に関して、抗体 のようなリガンドが、開発され得る。 本発明の組成物の送達を介して、所望されない細胞の増殖は、遅延され得るか または停止され得、従って、疾患が緩和される。本明細書中において利用される 方法は、腫瘍細胞の表面においてリガンドに関するレセプターを有する腫瘍細胞 の増殖を特異的に標的化し、殺傷または停止する。この処置は、温血動物：ヒト 、ウマ、イヌ、およびネコを含むがこれらに限定されない哺乳動物、ならびに鳥 類のような非哺乳動物に適切である。これらのFGF結合体でこのような動物を処 置する方法は、本明細書中に提供される。これらの結合体は、腫瘍に対して有効 であること、およびFGFマイトジェン刺激に感受性である細胞の増殖によって引 き起こされる、他の病態生理学的状態に対して有効であることが示される。 ２．SMC 障害の処置 この結合体は、動脈が再閉栓(reclogged)する血管形成に続いて生じる過程お よび生じた状態であるアテローム性動脈硬化および狭窄症を処置または予防する ために使用され得る。一般には、アテローム性動脈硬化の処置は、狭窄血管内腔 の拡大、それにより遠位組織へのより多い血流および酸素付加を可能にすること を含む。残念なことに、これらの手順は、血管系において再狭窄を生じる正常な 創傷応答を誘導する。創傷、血栓症、弾性重拍(recoil)および平滑筋細胞増殖に 対する正常な血管応答に対する３つの成分のうち、抗血栓性／血小板インヒビタ ーおよび血管系ステントは、それぞれ、急性／亜急性の血栓形成および弾性重拍 を、有効に取り組む。しかし、病変における平滑筋細胞の増殖に起因する血管再 造形、細胞外マトリックスの沈着および引き続く新生内膜(neointima)の形成を 改変し得る治療はない。従って、再狭窄は重要な臨床的問題として残されたまま である。 創傷応答はまた、他の介入（例えば、ステントを用いるかまたは用いない、冠 血管および末梢血管のバルーン血管形成；頚動脈内膜削除；静脈移植系および末 梢動脈および動静脈分流における合成移植片）の後に生じる。創傷応答の時間経 過ははっきりと定義されていないが、応答が短期間（およそ２週間）で抑制され る場合、長期間の利点が達成される。 ３．血管形成疾患の処置 上記に示したように、本発明の組成物は、血管形成依存性疾患の処置に使用さ れる。これらの疾患において、血管増殖は過剰であり、または他の組織の所望さ れない増殖を、血液を供給することによって可能にする。これらの疾患には以下 のものが挙げられる、血管線維腫、動静脈形成異常、関節炎、アテローム硬化性 斑、角膜移植新血管新生、遅延性創傷治癒、糖尿病性網膜症、火傷に起因する顆 粒形成、血管腫、血友病性関節、過形成性瘢痕、血管新生緑内障、偽関節骨折、 オースラ−ウェーバー症候群、乾癬、化膿性肉芽腫、水晶体線維増殖、強皮症、 固形腫瘍、トラコーマ、および血管性癒着。 血管形成の阻害（血管新生）によって、所望されない増殖は遅延され得るか、 または停止させられ得、従って疾患を回復させる。正常な血管では、内皮細胞の 単層は細胞内腔を裏打ちする。血管増殖は、内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を 必要とする。実際に、本発明は細胞表面分子(レセプター)にリガンドを介して結 合し、そしてインターナリゼーションし、従って核酸分子を送達する核酸送達ビ ヒクルを提供する。 ４．陽性遺伝子治療 本発明の分子、構築物、および方法はまた、広範ないわゆる「陽性遺伝子治療 」の適用において有用であり得る。陽性遺伝子治療の適用は、本明細書の以前の 節で詳細が議論されているので、その情報についてはここでは繰り返さない。そ れにもかかわらず、当業者にとって、本発明の分子、構築物および方法は、一般 に遺伝子転写または翻訳の改変による細胞上または細胞内部の処置をもたらし得 、これは細胞を種々の「陽性」遺伝子治療の適用（例えば、創傷修復および骨再 成長の刺激）において理想的にさせる。 従って、広範な種々の陽性遺伝子治療の適用および治療遺伝子産物は上記に記 載され、そして虚血の処置、創傷治癒の促進、骨成長および再成長の刺激、血管 新生の増加などのような多様な適用を含む。所望される遺伝子産物を生成する遺 伝子を有する「欠損」すなわち非機能的遺伝子の増強または置換もまた、１つの 遺伝子が機能不全調節配列もしくは非機能的調節配列置換するにせよ、構造遺伝 子をコードする配列を置換するにせよ、「陽性」遺伝子治療であるとみなされる 。 ５．薬学的薬剤の調製 本明細書で提供される結合体および複合体の投与のために適切な薬学的キャリ アまたはビヒクルは、投与の特定様式について適切である当業者に公知である任 意のこのようなキャリアを含む。さらに、結合体および複合体は組成物中で単独 の薬学的活性成分として処方され得るか、または他の活性成分と合わされ得る。 この結合体および複合体は、任意の適切な経路、（例えば、経口的、非経口的 （静脈内、皮下内、皮下、または局所に、液体中で、半液体中または固体形態を 含む））により投与され得、そして、それぞれの投与の経路について適切である 様式で処方される。好ましい投与態様は、処置の適応症に依存する。皮膚科の適 応症および眼科の適応症は、代表的には局所的に処置される一方、腫瘍および再 狭窄は、代表的には全身、皮内、または筋肉内の投与様式により処置される。 本明細書において結合体および複合体は、局所的(topical)、局所性(local)、 静脈内および全身的な適用について適切な薬学的組成物に処方され得る。眼科的 使用については、局所性の投与、局所的投与によるかまたは注入によるかのいず れかが好ましい。 時間放出処方物もまた本発明の結合体および複合体が投与される経路または形 態に関係なく所望される。有効濃度の１つ以上の結合体および複合体は、適切な 薬学的キャリアまたはビヒクルと混合される。本明細書で使用される特定の疾患 の処置のための化合物の「有効量」は、回復させるために十分であるか、または いくつかの様式の疾患に関連する病状を低減させる量である。このような量は、 単回用量として投与され得るか、またはレジメに従って投与され得、それにより 有効であり得る。この量は疾患を治癒し得るが、代表的には、疾患の症状を回復 するために投与される。反復投与は、所望される病状の回復を達成するために必 要とされ得る。 本明細書で使用される「有効量」は、投与される組成物において、および投与 される技術によって治療薬剤の量を、関与する組織に対して細胞増殖を阻止する か、もしくは減少させるために、または静止性(quinsent)疾患もしくは代謝疾患 を回復するために充分な量を提供する量である。 有効である結合体および複合体の濃度または量は、投与において、症状を回復 させるかまたは疾患を処置する量の送達を必要とする。代表的には、組成物は単 回の投与のために処方される。治療有効濃度および量は、結合体および複合体を 公知であるインビトロおよびインビボの系（例えば、ここに記載される系；次い で、ヒトまたは他の動物についての投与量がそこから推定され得る）で試験する ことにより経験的に決定され得る。 結合体は、薬学的に受容可能なキャリアに、処置された患者において所望され ない副作用の非存在下で、治療的に有用な効果を発揮するための十分な量で含ま れる。結合体は、薬学的に受容可能な結合体の塩、エステル、または任意の塩と して送達され得る。これらは、当業者によってこのような誘導体化のため、およ び動物またはヒトに対して実質的な毒性効果なしで投与され得る化合物を生成す る公知方法を使用して容易に調製され得る任意の塩、エステルまたは誘導体を含 む。副作用の回数および度合いは、結合体および複合体が投与される条件に依存 することが理解される。例えば、特定の毒性および所望されない副作用は、生命 を危うくする病気（例えば、腫瘍）を処置する場合では許容されるが、重度では ない結果の障害の処置の場合では許容されない。組成物中での結合体の濃度は、 吸収、不活化、およびそれらの排出の速度、投薬日程および投与される量ならび に当業者に公知である他の因子に依存する。 好ましくは、結合体および複合体は実質的に純粋である。本明細書で使用され る「実質的に純粋」とは、このような純粋を評価するために当業者によって使用 される標準的な分析方法（例えば、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ゲル電気泳 動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)）により決定される場合、容易に検出可 能な不純物がないような十分な均質性を意味するか、またはさらなる精製におい て物質の物理的特性および化学的特性（例えば、酵素活性および生物学的活性） が検出可能に変化しない程度に十分な純粋を意味する。実質的に化学的に純 粋な化合物を生成するために化合物を生成する方法は、当業者に公知である。し かし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。この ような場合では、さらなる精製が化合物の比活性を増加させ得る。 結合体および複合体は、局所性(local)または局所的(topical)な適用（例えば 、皮膚および粘膜への局所的適用、例えば、眼において、ゲル、クリーム、およ びローションの形態で）、ならびに眼の適用のため、または槽内または脊髄内の 適用のために処方され得る。このような溶液（特に、それらの眼科的使用が意図 される）は、適切な塩を有する、0.01％〜10％の等張性溶液、pHが約5〜7として 処方され得る。この眼科的組成物はまた、さらなる成分（例えば、ヒアルロン酸 ）を含み得る。この結合体および複合体は、局所的適用のためのエアロゾルとし て処方され得る（例えば、米国特許第4,044,126号、同第4,414,209号、同第4,36 4,923号を参照のこと）。 非経口的、皮内的、皮下的または局所的な適用について使用される溶液または 懸濁液は、以下の任意の成分を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用の水、生 理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレン グリコール、または他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよ びメチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナト リウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））；緩衝液（ 例えば、酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩）；ならびに毒性調節のための薬剤 （例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。大元の調製物は、ガラス、 プラスチック、または他の適切な材料から作られたアンプル、使い捨て注射器ま たは多数回用量バイアルに封入される。 静脈内に投与される場合、適切なキャリアには、生理食塩水、またはリン酸緩 衝化生理食塩水（PBS）および濃厚剤および可溶化剤（例えば、グルコース、ポ リエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール、およびその混合物） が挙げられる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして適 切であり得る。これらは当業者に公知の方法に従って調製され得る。 ビヒクルとの結合体の混合または添加において、得られた混合物は、溶液、懸 濁物、エマルジョンなどであり得る。得られた混合物の形態は多くの因子、（投 与の意図される様式および選択されたキャリアまたはビヒクルにおける結合体の 可溶性を含む）に依存する。有効濃度は、処置される疾患、障害または状態の症 状を回復させるために十分であり、そしてインビトロおよび／またはインビボの データ（例えば、腫瘍についてのマウス異種移植片モデルまたはウサギの眼科的 モデルからのデータ）に基づいて経験的に決定され得る。必要ならば、結合体お よび複合体の薬学的に受容可能な塩または他の誘導体が調製され得る。 活性物質もまた、所望の作用を損なわない他の活性物質と混合され得るか、ま たは所望の作用を補充する物質との混合され得る。これらは、以下のような粘弾 性物質、例えば、ヒアルロン酸（これはヒアルロン酸ナトリウムの画分のHEALON (高分子量(約300万のMW)の溶液)の商標で販売されており（Pharmacia,Inc.によ り製造されている(例えば、米国特許第5,292,362号、同第5,282,851号、同第5,2 73,056号、同第5,229,127号、同第4,517,295号および同第4,328,803号を参照の こと)））、VISCOAT(フッ素含有アクリル酸（メタクリル酸）塩（例えば、1H、1 H、2H、2H-ヘプタ-デカフルオロデシルメタクリル酸塩（例えば、米国特許第5,2 78,126号、同第5,273,751号、および5,214,080号）（Alcon Surgical Inc.より 市販されている))、ORCOLON(例えば、米国特許第5,273,056号を参照のこと)（Op tical Radiation Corporationより市販されている）、メチルセルロース、メチ ルヒアルロン酸、ポリアクリルアミドおよびポリメタクリルアミド（例えば、米 国特許第5,273,751号を参照のこと）を含む。粘弾性物質は、一般には、接合体 物質の重量当たり約0.5〜5.0％の範囲で、好ましくは1〜3％の範囲の量で存在し 、そして処置された組織のコーティングおよび保護に寄与する。この組成物はま た、色素（例えば、メチレンブルーまたは他の不活性色素）を含み、その結果、 眼へ注入するか、または手術中に手術部位に接触させた場合に、この組成物が見 られ得る。 結合体および複合体は局所性または局所的な適用（例えば、皮膚および粘膜へ の局所適用、例えば、眼において、ゲル、クリーム、およびローションの形態で ）のため、ならびに眼への適用のために処方され得る。このような溶液は、特に 眼科的使用について意図され、適切な塩を有する0.01％〜10％の等張性溶液、pH 約5〜7、として処方され得る。適切な眼科的溶液は公知である（例えば、米国 特許第5,116,868号、これは眼科的洗浄溶液および局所的適用のための溶液の代 表的な組成物を記載する）。このような溶液は、約7.4に調製されたpHを有し、 例えば、90〜100mMの塩化ナトリウム、4〜6mMの二塩基性リン酸カリウム、4〜6m Mの二塩基性リン酸ナトリウム、8〜12mMのクエン酸ナトリウム、0.5〜1.5mMの塩 化マグネシウム、1.5〜2.5mMの塩化カルシウム、15〜25mMの酢酸ナトリウム、10 〜20mMのD.L.-ナトリウムβ-ヒドロキシブチレート、および5〜5.5mMのグルコー スを含む。 結合体および複合体は、体からの迅速な除去に対してそれらを保護するキャリ アと一緒に調製され得る（例えば、時間放出アッセイまたはコーティング）。こ のようなキャリアは、制御された放出処方物を含み、例えば、以下を含むがこれ らに限定されない：移植片およびマイクロカプセル化送達系、ならびに、生体適 合性ポリマー、例えば、カルボキシメチルセルロース、エチレンビニル酢酸、ポ リ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など。例えば、組 成物はスポンジ（例えば、市販されている手術用スポンジ（例えば、米国特許第 3,956,044号および同第4,045,238号、Weck,Alcon,およびMentorより入手可能） を使用して手術中に適用され得、これは組成物中に湿潤され、そして眼との接触 の際に組成物を放出する。これらは、単回の投与のみが可能である手術後または 手術中に、眼科適応症のための眼への適用に特に有用である。組成物はまたペレ ット中で適用され（例えば、Elvaxペレット−エチレン-酢酸ビニルコポリマー樹 脂）、1mgの樹脂あたり1〜5μgの結合体が、手術中に眼に移植され得る。 経口投与が所望される場合、結合体は、胃の酸性環境から結合体を保護する組 成物中で提供されるべきである。例えば、組成物は、胃でのその保全性を維持し 、そして腸内で活性組成物を放出する腸溶コーティング中に処方され得る。組成 物はまた、制酸薬または他のこのような成分と組み合わせて処方され得る。 経口組成物は、一般に不活性希釈剤または食用キャリアを含み、そして錠剤へ と圧縮され得るかまたはゼラチンカプセル中に封入され得る。経口治療投与の目 的のために、活性化合物または複数の活性化合物は、賦形剤と一緒に取り込まれ 得、そして錠剤、カプセル、またはトローチの形態で使用され得る。薬学的に適 合する結合剤およびアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。 錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合 物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムおよび ゼラチン；賦形剤（例えば、デンプンおよびラクトース）、崩壊剤（例えば、ア ルギン酸およびコーンスターチがあるがこれらに限定されない）；滑沢剤（例え ば、ステアリン酸マグネシウムがあるがこれに限定されない）；滑走剤（glidan t）（例えば、コロイド状シリコンジオキシドがあるがこれに限定されない）、 甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；ならびに香料剤（例えば、ペ パーミント、サリチル酸メチルおよび果実香料剤）。 投与単位形態がカプセルである場合、上述の型の物質に加えて、液体キャリア （例えば、脂肪油）を含み得る。さらに、投与単位形態は、投与単位の物理的形 態を改変する種々の他の物質（例えば、ショ糖および他の腸内薬剤の被覆物）を 含み得る。結合体および複合体はまた、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、オブ ラート、チューインガムなどの成分として投与され得る。シロップは、活性化合 物に加えて、甘味剤としてスクロースならびに特定の防腐剤、色素、および着色 料および香料を含み得る。 活性物質はまた、所望される作用を損なわない他の活性物質または所望される 活性を補充する物質（例えば、腫瘍の処置のためのシスプラチン）と混合される 。 最終的には、化合物は、パッケージング物質、パッケージング物資の中の本明 細書で提供されるような１つ以上の結合体および複合体または組成物、およびこ の結合体が提供される適用を示すラベルを含む製品としてパッケージされ得る。 ６．投与 代表的には、治療的に有効な投与量は、約0.1ng/ml〜約500μg/mlの血清濃度 の活性成分を生成するべきである。薬学的組成物は、代表的には、結合体に依存 して約0.01mg/kgから約100〜2000mg/kgまでの結合体投与量を提供するべきであ る。眼科的障害および皮膚科的障害のための局所的適用は、単回投与量の投与あ たり約1ng〜100μgまで、好ましくは約１ng〜10μgを提供するべきである。投与 する量は、選択された結合体、処置される適応症、およびおそらく寛容される副 作用の関数であることが理解される。 治療的に有効な濃度および量は、本明細書におけるそれぞれの適用について経 験的に、公知であるインビトロおよびインビボの系（例えば、マウス、ラット、 ウサギ、またはヒヒのモデル）において結合体および複合体を試験することによ り決定され得る。これらの系は、例えば、本明細書中で記載される試験である次 いで、ヒトまたは他の哺乳動物についての投与量が、それから推定され得る。ウ サギの眼のモデルは、局所性および局所的に適用される薬物の効果を研究するた めの認知されたモデルである（例えば、米国特許第5,288,735号、同第5,263,992 号、同第5,262,178号、同第5,256,408号、同第5,252,319号、同第5,238,925号、 同第5,165,952号を参照のこと；Mirateら、Curr.Eye Res.１:491-493,1981もま た参照のこと）。 活性成分は、一回で投与され得るか、または時間の間隔をおいて投与されるた めに多くの小用量に分配され得る。処置の正確な投与量および期間は、処置され る疾患の関数であり、そして公知の試験プロトコルを使用するかまたはインビボ またはインビトロの試験データから推定することにより経験的に決定され得るこ とが理解される。濃度および投与量の値もまた、軽減されるべき状態の重症度と ともに変化し得ることに注目するべきである。任意の特定の被験体、特別な投与 量レジメは、個体の必要性および組成物の投与または投与を管理する人間の専門 的判定に従って、時間とともに調整されるべきであり、そして本明細書で示され る濃度の範囲は例示のみであり、そして本発明で請求される組成物の範囲内また は実施の制限を意図しないこともさらに理解されるべきである。 ７．治療の順序および組成物 本発明の治療的ヌクレオチド組成物は本明細書で記載される治療的分子をコー ドするヌクレオチド配列を含む。上記に記載されたように、治療的ヌクレオチド 組成物は、エンハンサーエレメントまたは５’に位置するプロモーターをさらに 含み得、そしてこの治療的ヌクレオチド配列または遺伝子の発現を制御する。こ のプロモーターは、プロモーターの３’側または下流に配置される遺伝子の発現 を制御するDNA配列を含むDNAセグメントである。このプロモーターは、RNAポリ メラーゼが特異的に結合し、そしてこの遺伝子(代表的にはプロモーターの３’ に位置する)のRNA合成（転写）を開始するDNA配列である。 被験体の治療的核酸ヌクレオチド組成物は、少なくとも２つの異なる作動可能 に連結されたDNAセグメントからなる。このDNAは、PCRによって、またはMolecul ar Cloning:A Laboratory Manual,第二版、Maniatisら（編）、Cold Spring Har bor,NewYork(1989)に記載される標準的な技術を使用することにより操作および 増幅され得る。代表的には、本発明の治療的ヌクレオチド組成物を生成するため に、選択された治療的組成物およびプロモーターまたはエンハンサーをコードす る配列は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて細胞中で自律的に複製 し得るベクタ−DNA分子に作動可能に連結される。エンハンサーエレメントまた はプロモーターおよび治療的ヌクレオチド組成物をコードするヌクレオチド配列 をベクターへ作動可能に連結することにより、付属するセグメントがベクター配 列と一緒に複製される。従って、本発明の組換えDNA分子（rDNA）は、天然では 通常見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドDNA分子 である。 本発明の治療的ヌクレオチド組成物は、全長が約20塩基対から約100,000塩基 対である。好ましくは、核酸分子は全長が核酸分子は全長が約50塩基対から約50 ,000塩基対である。より好ましくは、核酸分子は全長が約50塩基対から約10,000 塩基対である。最も好ましくは、全長が約50塩基対から約4,000塩基対である。 治療的ヌクレオチドは、所望される治療的効果を提供するタンパク質またはペプ チド（例えば、α1-抗トリプシンまたは嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質など ）をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントであり得る。あるいは、治療的 ヌクレオチドは、酵素的治療活性を示すDNAまたはRNAオリゴヌクレオチド配列で あり得る。後者の例は、有害な遺伝子の転写を阻害するアンチセンスオリゴヌク レオチドまたは選択された変異体遺伝子配列の切断について部位特異的なリボヌ クレオチドとして作用するリボザイムを含む。別の改変では、公開PCT出願第92/ 06693（この開示は本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、 本発明の治療的ヌクレオチド配列は、治療的ヌクレオチド分子（リボザイムおよ びアンチセンスDNAを含む）を生成し得るDNA構築物を含み、高いコピー数を標的 細胞中で含む。 調節可能なプロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および開始の速度が、外 部の刺激により調節されるプロモーターである。このような刺激は、組成物、光 、熱、ストレスなどを含む。誘導可能で、抑制的でそして制止可能なプロモータ ーは調節的なプロモーターである。調節可能なプロモーターはまた、組織特異的 なプロモーターを含み得る。組織特異的プロモーターは、特異的な細胞型へと、 この遺伝子の発現を指向する。プロモーターがこの内在性の遺伝子を発現した特 定の細胞において排他的でない場合、組織特異的プロモーターは、優先的に発現 されるために３’側に位置する遺伝子を生じる。代表的には、組織特異的プロモ ーターが、その３’側に位置する遺伝子を少しでも発現する場合、Palmiterら、 Ann.Rev.Genet.20:465-499(1986)により概説されるような正確な細胞型において 適切に発現されるようである。 組織特異的プロモーターが遺伝子発現を制御する場合、その遺伝子は、実質的 にに全ての組織および細胞型においてというよりもむしろ、少数の組織または細 胞型において発現する。組織特異的プロモーターの例としては、Brinsterら（Na ture 306:332-336(1983)）およびStorbら（Nature 310:238-231(1984)）が記載 したイムノグロブリンプロモーター；Swiftら（Cell 38:639-646(1984)）が記載 したエラスターゼＩプロモーター；Townesら（Mol.Cell.Biol.5:1977-1983(1985 )）およびMagramら（Mol.Cell.Biol.94581-4584(1986)）が記載したグロビンプ ロモーター；Bucchiniら（PNAS USA 83:2511-2515(1986)）およびEdwardsら（Ce ll 58:161(1989)）が記載したインスリンプロモーター；Rusconら（Nature 314: 330-334(1985)）およびGrosscheldら（Cell 38:647-658(1984)）が記載したイム ノグロブリンプロモーター；Shani（Mol.Cell.Biol.6:2624-2631(1986)）が記載 したαアクチンプロモーター；Overbeekら（PNAS USA 82:7815-7819(1985)）が 記載したαクリスタリンプロモーター；Crenshaw（Genes and Development 3:95 9-972(1989)）らが記載したプロラクチンプロモーター；Tremblayら（PNAS USA 85:8890-8894(1988)）が記載したプロオピオメラノコルチンプロモーター；Tats umiら（Nippon Rinsho 47:2213-2220(1989)）が記載したβ甲状腺刺激ホルモン （BTSH）プロモーター；Mullerら（Cell 54:105(1988)）が記載したマウス乳ガ ンウイルス（MMTV）プロモーター；Palmiterら（Ann.Rev.Genet.20:46 5-499(1986)）が記載したアルブミンプロモーター；Vassarら（PNAS USA 86:856 5-8569(1989)）が記載したケラチンプロモーター；McVeyら（J.Biol.Chem.263:1 1,111-11,116(1988)）が記載したオステオネクチンプロモーター；Allisonら（M ol.Cell.Biol.9:2254-2257(1989)）が記載した前立腺特異的プロモーター；Nath ansら（PNAS USA 81:4851-4855(1984)）が記載したオプシンプロモーター；Danc igerら（PNAS USA 86:8565-8569(1989)）が記載した嗅覚マーカータンパク質プ ロモーター；Forss-Pelterら（J.Neurosci.Res.16:141-151(1986)）が記載した ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター；Sutcliffe（Trends in Gene tics 3:73-76(1987)）が記載したL-7プロモーターおよびPeschonら（Ann．New Y ork Acad．Sci．564:186-197(1989)）およびBraunら（Genes and Development 3 :793-802(1989)）が記載したプロタミン１プロモーターが、挙げられる。 本発明の種々の代替的な実施態様において、本明細書において記載される治療 方法の実施のために有用である、治療的配列および治療的組成物が、意図される 。本発明の治療的組成物は、本発明の１つ以上の治療的ヌクレオチド配列ととも に、生理学的に許容し得るキャリアを含有し得、治療的ヌクレオチド配列は活性 成分としてキャリア中に溶解または分散されてる。好ましい実施態様において、 組成物は、哺乳動物またはヒト患者に治療目的で投与される場合、免疫原性でな いか、またはそうでなければ、所望されない副作用を生じない。 本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」、「薬学的に許容 し得る」およびそれらの文法上の変化は、組成物、キャリア、希釈物および試薬 をいう場合、これらは交換可能に用いられそして、哺乳動物に対してまたは哺乳 動物上に、所望されない生理学的効果（例えば、嘔気、めまい、胃の不調など） を生ずることなしに、投与され得る物質を表す。 非上皮細胞を優先的に標的化するように設計された組成物は、アデノウイルス 由来のタンパク質リガンド結合体および治療的ヌクレオチド配列を含み得る。特 異的レセプター（カッコ内で認定される）を指向する有用なリガンドの例として は、FGFおよび関連するリガンド（FGFR）；HIVgp120のV3ループ（CD4）；トラン スフェリン（トランスフェリンレセプター）；LDL（LDLレセプター）；および脱 グリコシル化タンパク質（アシアロ糖タンパク質レセプター）が挙げられる。-E DPGFFNVE-および-EDPGKQLYNVE-を包含する群より選択されるアミノ酸残基配列を 含む配列を有するポリペプチドは、CR2レセプターのようなレセプターを標的化 し得、従って、本発明に開示される組成物において有用である。 有用なリガンドはまた、抗体および付着配列ならびにレセプター自体を含む。 細胞のレセプター分子（例えば、インテグリンなど、MHCクラスIおよびMHCクラ スII、アシアロ糖タンパク質レセプター、トランスフェリンレセプター、LDLレ セプター、CD4、ならびにCD2）に対する抗体は、本発明による少数の有用な例に すぎない。代表的に、レセプターに結合されるリガンド、およびそれらリガンド のアナログは、本明細書で開示される細胞の標的化薬剤として有用であり得るこ とがまた、理解される。 例示的および好ましいヌクレオチド配列は、発現可能なペプチド、ポリペプチ ド、またはタンパク質をコードし、そしてさらに活性な構成的または誘導性プロ モーター配列を含み得る。例えば、本発明に従う好ましい治療的ヌクレオチド配 列は、HIVアンチセンスヌクレオチドを、CD4を介して潜在的に感染したＴ細胞へ 送達し得る。同様に、エプスタイン−バールウイルス（EBV）EBNa-1アンチセン スヌクレオチドのCR2を介したＢ細胞への送達は、治療的結果に影響し得る。 内部に溶解または分散された活性成分を含む薬学的組成物の調製は、当該分野 において十分に理解されている。そのような組成物は代表的に、液体溶液または 懸濁液としてのいずれかで注入可能に調製されるが、使用前に液体中にある溶液 または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、所望の投与 の経路に依存して、乳化され得るか、または坐薬、軟膏剤、クリーム、皮膚の膏 薬などへ処方され得る。 活性成分は、薬学的に受容可能であり、活性成分と適合し、そして本明細書中 に記載される治療的方法における使用のために適切な量で、賦形剤と混合され得 る。例えば、適切な賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセ ロール、エタノールなどおよびこれらの組み合わせであり、植物油、プロピレン グリコール、ポリエチレングリコールおよびベンジルアルコール（注入または液 体調製物のために）；ならびにワセリン、植物油、動物性脂肪およびポリエチレ ングリコール（外部適用可能な調製物のために）が挙げられる。さらに、所望さ れる場合、組成物は、湿潤剤または乳化剤、等張剤、溶解促進剤、安定化剤、着 色剤、防腐剤、および鎮静剤などの添加物（薬学的組成物に対する通常の補助的 な添加剤として）、ならびに活性成分の効果を増強するpH緩衝剤などを含み得る 。 本発明の治療的組成物は、成分の薬学的に受容可能な塩をその中に含み得る。 薬学的に受容可能な塩としては、例えば、塩酸またはリン酸のような無機塩ある いは酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸添加塩 （ポリペプチドのフリーなアミノ基とともに形成される）を含む。フリーなカル ボキシル基とともに形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アン モニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄のような無機塩基、あるいはイソプ ロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、 プロカインなどの有機塩基より誘導され得る。 生理学的に許容し得るキャリアは、当該分野で周知である。液体キャリアの例 は、活性成分および水以外の物質を含まないか、または生理的pH値のリン酸ナト リウム、生理食塩水、または両方（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）を含む、 滅菌水溶液である。なおさらに、水性キャリアは、１つより多い緩衝塩ならびに 、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような塩、デキストロース、ポリエチレ ングリコールならびに他の溶質を含有し得る。 液体組成物はまた、水に加えて、および水を排除して液相を含有し得る。この ようなさらなる液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油、および水−油 乳濁液である。 治療的組成物は、代表的には、標的組織に対し治療的有効量を送達するのに十 分な本発明の治療的ヌクレオチド配列の量を含み、代表的には、全治療的組成物 の重量あたり、治療的ヌタレオチド配列の少なくとも0.1重量パーセントから約9 0重量パーセントの量である。重量パーセントは、全組成物に対する、治療的ヌ クレオチド配列の、重量による割合である。従って、例えば、0.1重量パーセン トは、100グラムの全組成物あたり、0.1グラムのDNAセグメントである。 本発明の合成オリゴヌクレオチド配列を含む治療的ヌクレオチド組成物は、任 意の適切な方法（例えば、ホスホトリエステル法またはホスホジエステル法）を 用い調製され得る。Narangら、Meth．Enzymol．68:90,(1979)；米国特許第4,356 , 270号；およびBrownら、Meth．Enzymol．68:109,(1979)を参照のこと。改変体の ファミリーが好ましい治療的オリゴヌクレオチド配列組成物について、ファミリ ーのメンバーの合成は、同時に１つの反応容器中で行われ得、または独立に合成 され後に予め選択されたモル比で混合される。 同時合成のために、ファミリーのメンバーの配列の予め選択された位置が保存 されているヌクレオチド残基は、オリゴヌクレオチドのその位置の番号が、伸長 中のオリゴヌクレオチドポリマーに化学的に付加させられる場合、固相オリゴヌ クレオチド反応混合物に１つの予め選択されたヌクレオチド前駆体を添加するこ とによる化学合成プロトコールにおいて、改変体に同時に導入され得る。配列中 の変化するこれらの位置へのヌクレオチド残基の付加は、化学合成中に、固相オ リゴヌクレオチド反応混合物へ多数の予め選択されたヌクレオチド前駆体の量（ 好ましくは等モル量）を添加することにより同時に導入され得る。例えば、４つ の全ての可能な天然のヌクレオチド（A、T、GおよびC）が予め選択された位置へ 付加される場合、これらの前駆体が、その工程においてオリゴヌタレオチド合成 反応に添加され、４つの改変体を同時に形成する。 関連するオリゴヌクレオチドのファミリーの同時合成のこの様式は、「縮重オ リゴヌクレオチド」の調製についてAusubelら（Current Protocols in Molecula r Biology，補遺８、2.11.7頁、John Wiley & Sons，Inc.，New York(1991)）に より以前に記載され、そして本明細書に記載される治療的オリゴヌクレオチド組 成物の調製に容易に適用され得る。 通常の４つのヌタレオチド（A、T、GまたはC）以外のヌクレオチド塩基、また はRNA等価ヌクレオチドのウラシル（U）は、本発明において使用され得る。例え ば、イノシン（I）がA、TおよびGとハイブリダイズし得るが、Cとはハイブリダ イズし得ないことは周知である。従って、４つの通常のヌクレオチド全てがオリ ゴヌクレオチドファミリーの１つの位置を占める場合、すなわち、予め選択され た治療的ヌクレオチド組成物が、１つの位置で異なる４つの配列にハイブリダイ ズし得るオリゴヌタレオチドを含有するよう設計された場合、いくつかの異なる オリゴヌクレオチド構造が意図される。予め選択された位置がA、T、GまたはCを 含む場合、組成物は、４つのメンバーを含み得る。代替的に、予め選択された位 置がIまたはCを含み、そしてその位置で全ての４つの可能な通常のヌクレオチド とハイブリダイズする能力を有する場合、組成物は、２つのメンバーを含み得る 。最後に、イノシンと同様の様式で１つより多い通常のヌクレオチドと非不安定 化様式でハイブリダイズする能力を有する他のヌクレオチドを、予め選択された 位置に含み得る。 ８．構築物の試験 再プログラムしたウイルス送達ビヒクルは、任意の数のインビトロモデル系で 評価され得る。特に、標的細胞は、培養物中で増殖し、核酸送達ビヒクルととも にインキュベートされる。核酸は、レポーターをコードし得、この場合、レポー ター産物がアッセイされ、または細胞破壊的な産物をコードし得、この場合、細 胞殺傷が測定される。さらに、任意のアッセイ可能な遺伝子産物が使用され得る 。レポーター遺伝子としては、広く多様な適切な遺伝子が入手可能である。この ようなレポーターとしては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 β−グルタロニダーゼ、ラージＴ抗原、抗体が存在するかまたは開発され得る任 意のタンパク質が挙げられる。レポーターの選択は、部分的には試験される細胞 に依存する。代替的には、核酸は、細胞破壊的な産物をコードし得る。このよう な産物は本明細書中に記載されるもの全てを含む。 送達ビヒクルは、インビトロモデル系において評価され得る。一般的には、異 種腫瘍モデル系が使用されるが、他の腫瘍モデル系もまた有用である。異種系に おいては、免疫不全マウスに、または他の免疫不全動物に、ヒト腫瘍細胞のよう な腫瘍細胞を注入する。核酸送達ビヒクルが投与され、そして腫瘍の増殖がモニ ターされる。腫瘍増殖のいかなる縮小も本発明の状況において有用である。 以下の実施例は、例示の目的のためのみに包含され、そして本発明の範囲を限 定することを意図しない。 実施例 実施例１ カポージ肉腫細胞への標的化遺伝子の送達 ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染は、カポージ肉腫（KS）および非ホジキ ンリンパ腫を含む腫瘍性の障害の特徴的なサブセットの発生の増加と関連する（ Conant，Recent Results in Cancer Research 139:423-32(1995)）。この点にお いて、KSは主要なAIDS関連悪性腫瘍であり、そして有意な罹病率をもたらす（Co nant，同書、(1995);NorthfeltおよびVolberding，Advances in Oncology 7:9-1 7(1991)）。KSについての効果的な処置は、現在のところ欠けており、いくつか のより新しい実験的プロトコールを用いると、生存期間はわずか9.9ケ月である（ Gillら、J.Clin.Oncol.14:2353-64(1996)）。従って、新規のより効果的な治療 の開発がHIV関連KSにとって必要である。 この目標に向けて、種々の遺伝子治療アプローチが腫瘍性疾患のために開発さ れてきた（Rossら、Hum.Gene Ther.7:1781-90(1996)）。KSに対する遺伝子治療 的アプローチの実際的な実行は、腫瘍細胞のインビボにおける効率的な形質導入 を必要とする。さらに、KS紡錘細胞への標的化のあるレベルは、同様にベクター の選択にとって重要な判定基準である。この考察は、特にAIDS関連散在性KSに関 連する。なぜならこの腫瘍は全身の血管系と連続する血管上皮細胞より生じると 考えられているからである（Northfeltら、同書、(1991)）。さらにこの努力を 複雑にすることに、KS細胞は種々のウイルスベクター系および非ウイルスベクタ ー系による形質導入に耐性であることが以前に注目されており、従って、移動す る領域（loco-regional）への遺伝子送達に基づく遺伝子治療アプローチでさえ も限定する。この問題に対処するために、KS細胞へ標的化する能力を有する誘導 体ベクターが現在開発されており、そして本明細書中下記にさらに記載される。 Ａ．材料と方法 １．細胞株 ヒトAIDS-KS細胞株KSY-1（Lunardi-Iskandarら、J.Natl.Canser Inst.87:974- 981(1995)）、RW376、およびCVU-1を、本明細書中に記載するように、使用のた めに取得した。KS-SLK（Siegalら、Cancer 65:492-498(1990)）は、免疫抑制患 者の口部KS病変由来であり、また下記のように使用のために取得した。 すべての細胞株は、Dulbecco改変Eagle培地／ハムF12の1:1重量比（DMEM/F12 Collegro Mediatech，Washington，DC）＋10%ウシ胎仔血清（FBS，Hyclone，Log an，UT）＋2mMグルタミン（Cellgro Mediatech）＋ペニシリン／ストレプトマイ シン（Cellgro Mediatech）中で、5%O₂(CM)中で、37℃で増殖させた。培地交換 は３〜４日ごとに行った。細胞は、コンフルエントに達した場合、トリプシン／ EDTA（Cellgro Mediatech）を用いて継代した。生存率は、コンフルエント細胞 を、トリプシン／EDTAに曝露し、CM存在下で800×gで遠心分離し、そしてトリパ ンブルー排除後、血球計数器を用いて計数して決定した。ガンシクロビル（GCV; Cytovene）は、Hoffman Laboratories（Nutley，NJ）より購入した。組織培養プ レートおよびフラスコはNunclon（Denmark）により製造された。 ２．抗ノブ抗体およびフラグメント 本明細書において開示される例示的抗体およびフラグメントを産生し精製する 手順は、当業者にとって公知の種々の参考文献において記載される（例えば、Do uglasら、Nature Biotech．14:1574-1578(1996)）。一般的に、手順は以下のよ うに記載され得る。 中和抗ノブmAbの開発のために、インタクトなAd5を用いるマウスの免疫化に続 き、２度の精製Ad5ノブ（ネイティブまたは組換え体）を用いた免疫化の後に、 ハイブリドーマを標準的な技術により産生した。組換えAd5ノブに対する高親和 性結合およびHeLa細胞へのAd5感染を中和する能力に基づき（データ示さず）、1 D6.14と名付けられた１つのクローンを、さらなる研究のために選択し、そして 固定化プロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、 腹水からmAbを精製した。 抗ノブmAbを、BALB/cマウスをAd5で免疫化し、その後２度の精製組換えAd5ノ ブを用いた免疫化の後に（Henryら、J.Virol.68:5239-46(1994)を参照のこと） 、確立された方法（例えば、HarlowおよびLane、Antibodies，a Laboratory Man ual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1988)を参照のこと）で産生した。感 作されたリンパ球を、P3-X63-Ag8.653細胞と融台した。ハイブリドーマ上清の３ 量体Ad5ノブとの反応性を、ELISAによって決定した。ハイブリドーマ上清のAd5 感染中和能力は、終点CPEによりアッセイした。 1D6.14ハイブリドーマ細胞は、BALB/cマウスに注入され、腹水液を収集した（ HarlowおよびLane、同書、(1988)）。mAbの精製は、ImmunoPure IgG精製キット （Pierce，Rockford，IL）を用い、固定化プロテインＡ上でのアフィニティーク ロマトグラフィーにより行った。Fabフラグメントは、固定化パパインによる1D6 .14の消化後、ImmunoPure Fab精製キット（Pierce）を用い、固定化プロテイン Ａ上でのアフィニティークロマトグラフィーにより調製および精製した。リン酸 緩衝化生理食塩水（PBS）に対する広範な透析の後、精製mAbおよび精製Fabフラ グメントの濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ（Bio-Rad，Hercules，CA）を用 い決定した。 免疫学的手法により、標的化アデノウイルスベクターを開発する目的のために 、インタクトなイムノグロブリンよりも抗体のFabフラグメントを用いることが 好ましい。Fabフラグメントを用いることにより、親抗体の２つの抗原結合アー ムが、細胞への取り込みに対し耐性を証明し得る、大きな複合体を形成するため に異なるウイルスを架橋することを防ぎ得る。インタクトな1D6.14は、パパイン により消化され、そしてFabフラグメントは精製される。親抗体（1D6.14）およ びFabフラグメントの両方は、用量依存の様式でアデノウイルス感染を中和し得 、一方、コントロール固体は、感染をブロックしない（Douglasら、同書、(1996 )を参照のこと）。 ３．組換えアデノウイルス ホタルルシフェラーゼ（AdCMV-Luc）を発現する組換えEIA欠損アデノウイルス （HerzおよびGerard，PNAS USA 90:2812-1216(1993)）を、本明細書中以下に記 載のように使用する。CMV駆動性単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（AdCMVHS Vtk）を発現するE1欠損Ad5ベクターを、以前に報告されたように（Rosenfeldら 、Clin．Cancer Res．1:1571-1589(1995)）、相同組換え技術を用いて構築する 。グリーン蛍光タンパク質の増強された改変体を発現するE1欠損組換えアデノウ イルス（AdCAG-GFPS65T）をまた使用し、そして以前に記載されている（Moriyos hiら、Neuron 16:255-260(1996)）。 組換えアデノウイルスを、許容的な293細胞株で増殖し、塩化セシウム勾配を 用い精製し、続いて標準的な手法を用い、プラークを293細胞で力価測定する（G rahamおよびPrevec、Methods in Mol．Biol．7:Gene Transfer and Expression Techniques，MurrayおよびWalker(編)、Humana Press，Clifton，1991，109-129 頁）。ウイルスストックを、-80℃で、使用するまで冷凍保存する。 ４．Fab-FGF2 分子結合体 Fab-FGF2結合体を、改変組換え塩基性線維芽細胞成長因子（FGF2-3；Sosnowsk iら、J.Biol.Chem.271:33647-33653(1996)）と、アデノウイルス５型（Ad5）ノ ブ領域（Douglasら、Nature Biotech．14.1574-1578(1996)）に対して惹起した ブロッキングモノクローナル抗体1D6.14のFabフラグメントとを連結させること によって、構築する。結合のために、Fabを、ヘテロ二機能性架橋剤S-2-ピリジ ルジスルフィド（SPDP；Pharmacia，Uppsala，Sweden）を1:3のモル比で用い誘 導体化し、改変Fabフラグメント（PDP-Fab）を産生するために室温で30分インキ ュベートする。 PDP-Fabを、未結合リンカーを除去するために透析する。精製FGF2を、以前に 記載されたように産生し（Sosnowskiら、同書、(1996)）、次に還元し、そしてP DP-Fabと2:1のモル比で混合し、4℃で16時間振とうさせながらインキュベートす る。 一般的に、FGF2は以下のように調製され、還元される。155アミノ酸ヒトFGF2( 96位のシステインがセリンに変異誘発されている（Lappi,D.A.,Matsunami,R.,Ma rtineau,D.,およびBaird,A.(1993)Anal.Biochem．212:446-451)）は、本発明に おいて記載されるように使用され得る。この分子は例として記載されており、限 定として記載されていないことは、理解されるべきである；他のFGF改変体およ びFGFレセプター複合体と反応性のポリペプチドは、本発明に従い、有用である 。 FGF2はE.coliで発現され、そして従来のクロマトグラフィー技術により均質に まで精製される。FGF2（C96S；本明細書中ではまた、FGF2-3という）に、トリス 塩基を加え、pH7.0に調整する。次に、FGF2を、MTGを終濃度20mMまで添加するこ とによって、還元する。反応物を、室温で30分間インキュベートする。過剰のMT Gを、FGF2(C96S)をPD-10カラム（Pharmacia）に通すことにより除去する。分画 緩衝液は、0.14M NaCl，1mM EDTAを含む10mM NaOAc/H0Ac pH5.4である。 Fabは、本質的に以下のとおりにチオール化される。1.6mgのFabをNaPO₄（0.1M NaClおよび1.0mM EDTAを含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5）に対し 、1:250(v/v)で３時間、緩衝液を２度交換し、透析する。透析したFabフラグメ ントを14、000rpm（Eppendorf遠心機5415C）で10分間遠心分離し、上清を収集す る。Fabフラグメントを、SPDP(Pharmacia),(エタノールに溶解したSPDP)と1:3の モル比で、30分間室温で、時折撹拌しつつ誘導体化する。過剰のSPDPおよび低分 子反応生成物を、上記の緩衝液に対し1:500(v/v)で透析することにより除去する 。 FGF2とFabとの結合を、本質的に以下のように実施する。FGF2およびPDP-Fabを 、pH7.5にて2:1のモル比で混合し、そして振盪しながら、16時間４℃にてインキ ュベートする。反応混合物のアリコートをSEC-HPLCで分析する。結合物を、未結 合のFabフラグメントを除去するために、Heparin-Sepharoseカラム（1mlのHepar in Hi-Trap，Pharmacia）上で精製する。物質を10mMトリスpH7.4中のカラムにロ ードし、そして、同緩衝液プラス0.6M NaCl中で洗浄する。吸光度がバックグラ ウンドまで戻る場合、結合体を2MのNaClを含む同緩衝液中でカラムから溶出させ る。2Mの溶出物のアリコートをSEC-HPLCで分析する。2Mの溶出物を、遊離のFGF2 を除去するためにSephacryl S-100にロードし、そしてpH7.4のPBSへ緩衝液を交 換した。フラグメント17-26を最終精製Fab-FGF2物質としてプールする。 結合反応を、DTTでそしてpH7.4のPBSへ緩衝液を交換した反応混合物のアリコ ートを還元することによって、および343nMにおけるPDPの吸光度をモニターする ことによってモニターする。精製したFab-FGF2、FGF2およびFabを、SDS-PAGE(12 %)およびFGF2に対して産生した抗体を使用するウエスタン分析によって、分析す る。Fabへの結合が、レセプターに結合そして増殖を刺激するFGF2の能力を妨害 するかどうかを決定するために、この物質を内皮増殖アッセイでアッセイする。 ウシ大動脈内皮細胞を、DMEM(Biowhittaker)、10%FCS(Hyclone)、50mg/mlゲンタ マイシン(JRH Biosciences)、および2mM L-グルタミン(Biowhittaker)中、24ウ ェル平底組織培養プレートに1000細胞/ウェルで播種する。翌日、6ng/mlから1 0pg/mlの範囲の、連続希釈のFGF2およびFab-FGF2を、三連(triplicate)ウェルへ 添加した。48時間後、培地を除去し、そして同じ濃度のFGF2およびFab-FGF2を含 む1.5mlの新鮮培地を細胞へ添加する。さらに72時間のインキュベーションの後 に、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いで0.25%のトリプシンで剥離する。 トリプシン処理した細胞をCoulter Counterを使用して計数する。増殖アッセイ の結果は、FGFへのFabフラグメントの結合が、その受容体へ結合しそして増殖を 刺激するFGF2の能力を妨害しなかったことを示す。 結合体を、10mMトリス塩酸、pH7.4中でHeparin-Sepharoseカラム(Pharmacia) にロードし、10mMトリス塩酸/0.6mM NaCl、pH7.4で洗浄し10mMトリス塩酸/2M Na Cl、pH7.4で溶出することによって精製する。過剰の塩および未結合タンパク質 を除去するために、溶出物をDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、pH7.4)で 平衡化したSephacryl S-100カラムを通して分離する。結合体中のPDPの存在を、 結合体のアリコートを還元し、そしてPDPの吸光度(342ナノメーター)を測定する ことによって確認する。次に、結合体のサイズおよび活性をウエスタンブロット により分析する(Antibodies:A Laboratory Manual，第12章、Immunoblotting、H arlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory(1988))および酵素結合 免疫測定法(ELISA)分析(Antibodie:A Laboratory Manual、第14章、Immunoassay s HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)を参照のこと) 。 5.アデノウイルス感染アッセイ アデノウイルス形質導入を評価するために、各KS細胞株の24,000細胞を1mlのC Mの存在下で12ウェルプレートの各々のウェルへ三連でプレートする。細胞を、 一晩インキュベートして細胞を接着させる。感染複合体を以下を含む最終容積50 μl中で混合する：(1)50プラーク形成単位(pfu)/細胞でアデノウイルス(AdCMV-L ucまたはAd-CAG-GFPS65T)；(2)アデノウイルス+Fab-FGF2結合体；(3)アデノウイ ルス+Fab；または(4)アデノウイルス+Fab-FGF2結合体+抗FGF2抗血清(Sigma)の16 μl。複合体を、30分間27℃にて1.5mlのポリプロピレンチューブ中でインキュベ ートする。次いで混合物を、DMEM/F12+2%のFBS中で希釈し、そして200μｌの容 積で各ウェルへ添加する。細胞を1時間、5%のCO₂中にて37℃にてインキュベート し、次いで800μｌのDMEM/F12+10%のFBSを各ウェルへ添加する。ウイルスの添加 24時間後、細胞をPBSでリンスし、そしてルシフェラーゼ活性をアッセイするか または蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によって分析する。すべてのルシフェ ラーゼアッセイには、細胞を、200μlのPromega(Madison,WI)溶解緩衝液で溶解 する。次いで、12μｌの各サンプルを、製造業者の指示に従って100μｌのProme gaルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、そして二連(duplicate)サンプルを三 連の測定で、Bertholdルミノメーターでアッセイする。 AdCMVHSVtk媒介殺傷を評価するために、１×10⁵KSY-1またはKS-SLK細胞を、2m lのCM中６ウェルプレートにおいて二連でプレートする。細胞を、一晩、5%のCO² にて37℃でインキュベートする。培地を吸引し、そして5pfu/細胞の以下のいず れか：(1)AdCMVHSvtk、(2)AdCMVHSKtk+Fab、または(3)AdCMVHSVtk+Fab-FGF2結合 体を含む感染混合物を、500μl容量のDMEM/F12+2%のFBSで各ウェルに添加する。 5%のCO₂中37℃にて1時間のインキュベート後、1.5mlのCMを添加する。細胞をさ らなる24時間インキュベートし、次いで培地を吸引し、そして20μMのGCV非存在 下(-GCV)または存在下(+GCV)でCMと交換する。培地を3日後に変えて、そして細 胞の計数を、TK-GCV媒介殺傷を評価するためのアデノウイルスへの暴露後6日に 、各二連のウェルについて三連で実施する。 6.免疫細胞化学 KS細胞（2×10⁴/ウェル）を、CM中で24ウェル組織培養プレートの複製ウェル 中にプレートし、そして48時間５％のCO²において37℃にてインキュベートする 。細胞をリンスし、そして内在性ペルオキシダーゼを30分間１％H₂O₂メタノール でブロックする。次いで、細胞をリンスし、そして27℃で１時間、１％のウシ血 清アルブミン（BSA;フラグメントV，Boehringer Mannheim，Germany）PBSでブロ ッキングする。ウサギ抗繊維芽細胞成長因子レセプター抗血清(FGFR1およびFGFR 2反応性；Upstate Biotechnologies，Inc.，Lake Placid，NY)またはコントロー ルのウサギIgG(Vector;Burlingame,CA)を、３％のBSA/PBS中で1：400に希釈し、 そして37℃で１時間、細胞とインキュベートする。細胞をリンスし、そして、製 造業者の指示に従ってVectastainのウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼキットを 使用して、ジアミノベンジジン(Sigma)で染色する。細胞をリンスし、そして顕 微鏡写真撮影するまで水にて保存する。 7.統計学的分析 個々の状態の比較を、等しい平均についてStudentのt-検定を使用して評価す る。MacIntosh softwareのためのStatex 1.2 Dinan Software，Clinton，IAを分 析を容易にするために使用する。 B.結果および討論 KSのための遺伝子治療アプローチは、インサイチュで腫瘍細胞に有効な遺伝子 送達を達成するものの能力に依存する。この点から、アデノウイルスベクターが 種々のインビボ癌治療適用のために使用されている。この適用のための、アデノ ウイルスベクターは、全身性能力およびインビボにおける高レベルの遺伝子発現 の利点を有する。 アデノウイルスが、KS細胞を選択的に再標的とするように改変する前に、Adの ネイティブの形質導入効率を試験する。関連実験において、２つのAIDS-KS細胞 株(KSY-1およびRW376)、免疫抑制された患者由来の１つのKS細胞株(KS-SLK)、お よび１つの古典的なKS細胞株(CUV-1)を使用する。最初のセットの実験において 、各細胞株のアデノウイルス形質導入を、抗アデノウイルスノブFabの存在下ま たは非存在下でAdCMV-Lucで各細胞株を感染させ(図1を参照のこと)、次いで感染 後24時間でルシフェラーゼ活性を測定することによって決定する。 図１は４つのKS細胞株のためのAdCMV-Luc形質導入の比較を示す。KS細胞を、F abフラグメントブロッキングアデノウイルスノブ媒介感染の非存在下または存在 下で、ルシフェラーゼを発現する組換えアデノウイルスとインキュベートする。 実験は三連で実施する。相対光単位(RLU)を縦軸に示し；横軸を横切って、次の 細胞株が示される：KSY-1；RW376；KS-SLK;およびCVU-1。白（無色）の棒はAdCM V-Lucを示し、その一方、黒(暗い)棒は、AdCMV-Luc+抗ノブFabを示す。 試験した細胞株の内、KSY-1およびKS-SLKはアデノウイルスによる形質導入が 不十分である（アッセイあたり、10⁶相対光単位(RLU)未満を生じる）。KS細胞株 CVU-1は、中程度に形質導入可能であり（アッセイあたり1.83×10⁶±1.15×10⁵R LU）、その一方、RWE376細胞株は高度に形質導入可能である（アッセイあたり2. 88×10⁶±5.4×10⁴RLUのルシフェラーゼの読みを生じる）。 AdCMV-Lucを使用する形質導入後に得られたルシフェラーゼ活性は、AdCAG-GFP S65Tで感染される細胞から得られるFACS分析データと関連した。この文脈におい て、AdCAG-GFPS65Tの細胞あたり100pfuで形質導入されたKS細胞株のFACS分析に よって、1%未満のKSY-1およびKS-SLK細胞が形質導入可能である。CVU-1およびTW 376 KS細胞株は、それぞれ12%および99%形質導入効率を生じ、有意により形質導 入可能である。３つの細胞株において（KSY-1、RW376、およびKS-SLK）、抗アデ ノウイルスノブFabが、50%(p<0.01)以上AdCMV-Luc形質導入をブロックした。CVU -1細胞株は、アデノウイルス形質導入において-統計学的に有意な(p<0.05)--よ り劇的ではない(20%)ブロックを示した。この低レベルの阻害は、ネイティブの アデノウイルスベクターによる中程度のレベルの形質導入効率と相関する。この ことは、これらの細胞が不応性である程度が、ノブ依存的細胞結合と逆に相関し ていることを示唆する。 この認識に基づいて、感染に対するこの制限が効果的な遺伝子移入を達成する ための他の細胞進入経路を使用して克服され得ると仮定される。この点において 、免疫学的アプローチは今や、異種細胞経路へのアデノウイルスベクターの再標 的化を可能にするように発展している(Douglasら、同上、(1996)を参照のこと) 。これらの研究における最初の確証工程として、本発明者らは、KS細胞がFGFRを 発現したか否か、そしてこの受容体が、再標的化のための有力な基質として役立 ち得たかどうかを決定することを探求した。 第一に、免疫細胞化学を、共通のエピトープを介してFGFR-1およびFGFR-2を同 時に認識するポリクローナル抗体を使用して、４つのKS細胞株について実施する 。本明細書に記載されるように使用される４つのKS細胞株のFGFR免疫細胞化学的 反応性を評価する。KSY-1(A,B)、RW376(C,D)、KS-SLK(E,F)およびCVU-1(G,H)細 胞株を、FGFR-1およびFGFR-2に共通のペプチドに対して産生されたポリクローナ ル抗血清または非免疫コントロールで染色する。免疫反応性を、４つの細胞株（ デ ータは示されない）において、およびマウス繊維芽細胞(ポジティブコントロー ル；示されない)において観測する。免疫反応性の分布は、分散細胞膜染色を用 いて、4つのKS細胞株のすべてにおいて有する主に核性である。RW376ヒトKS細胞 株は最も高い程度の膜染色を有するようであったが、CVU-1KS株は、密な核免疫 反応性を有していた（データは示されず）。これらの研究は、以前の報告(Liら 、Cancer 72:2253-9(1993))と一改して、FGFRが当面関連するヒトKS細胞株にお いて高度に発現されることを証明する。 一旦、本明細書中に記載されるベクターの再標的化アプローチのための生物学 的な理論的根拠を確立すると、次いで基質としてKS細胞を使用して、FGFR標的化 アデノウイルスの有効性を基質として試験する。第３のセットの実験において、 本発明者らは、ウイルスノブに対するハンドルとしてFabを使用して、アデノウ イスルをFGFRに免疫学的に再標的化し得るかどうかを探求した。FGF受容体とア デノウイルスFab複合体(または結合体)との間で再標的化を達成するために、繊 維芽細胞成長因子(FGF2)を標的部分として使用する。なぜならそれはFGFR-1およ びFGFR-2の両方と高度な親和性で結合し、そしてFabに容易に共有結合し得るか らである。この目的に向けて、Fabと改変されたFGF2上に存在するシステインと の間でジスルフィド結合を形成するようにSPDPを使用して共有結合を合成する。 ウエスタンブロット分析は、大多数のFab-FGF2結合体が、単一のFGF2分子および 単一のFabフラグメントを含んでいたことを確認した。さらに、ELISAに基づく結 合研究は、結合体がノブ結合活性およびFDGF2免疫活性を同時に保持していたこ とを確認した（データは示されず）。 Fab-FGF2結合体がアデノウイルスをKS細胞に再標的化し得たか否かを評価する ために、結合体を、細胞形質導入前にAdCMV-Lucと最初にプレインキュベートす る。さらなる反応混合物において、再標的化がFab-FGF2結合体のFGF2部分を介し て生じるかどうかを評価するために、AdCMV-Luc+Fab-FGF2混合物を、FGFに対し て産生したブロッキング抗血清とさらにインキュベートする。図３は、Fab-FGF2 結合体およびFGF2ブロッキング実験を使用するAdCMV-Luc再標的化実験の結果を 示す。 図３はFab-FGF2結合体によるKS細胞株の増強されたAdCMV-Luc感染性を示す。A d-結合体複合体の増強された感染性を、抗FGF2抗血清の存在下または非存在下で 評価する。相対光単位(RLF)を縦軸にプロットし、そして当初関連するKS細胞株 （KSY-1、RW376、KS-SLK、およびCVU-1）を横軸に示す。黒棒はAdCMV-Lucを示し ；点描棒はAdCMV-Luc+Fab-FGF2を示し；そして白捧（無色）はAdCMV-Luc+Fab-FG F2+抗FGF2抗血清を示す。 図３に示される結果は、アデノウイルスをFab-FGF2結合体とあらかじめ混合し た場合、４つのKS細胞株のすべてにおけるAdCMV-Luc形質導入の劇的な増強を証 明する。この予期せぬ増強は、４つの細胞株のすべてについて総括的に有意であ り(p<0.001)、そしてKSY-1細胞に対する形質導入において44倍の増強そしてRW37 6細胞に対して7.7倍の増強を示す。さらなる注目すべきこととして、FGF2に対し て産生させた抗血清の付加が、４つのKS細胞株のすべてにおけるAdCMV-Luc形質 導入を増強するためのFab-FGF2結合体の能力をブロックした(p<0.01)。抗FGF-2 抗血清による結合体媒介アデノウイルス形質導入の減弱は、再標的化が結合体の FGF部分を介して生じることを確証した。 今日まで行われた実験は、KS細胞において達成されたアデノウイルスの低い形 質導入効率が、アデノウイルスFGFR経路に再標的化することによって克服され得 たことを示す。増大したルシフェラーゼ活性の検出が、移入遺伝子発現が生じた ことを確証した。 この例証が遺伝子治療アプローチの文脈において有用性を有し、それによって 毒素遺伝子がKS細胞へ導入されることを確証する目的で、本発明者らは、条件的 毒素遺伝子産物である、単純ヘルペスチミジンキナーゼ(AdCMVHSVtk)をコードす る組換えアデノウイルスを使用して一連の実験を実施した。この実験において、 本発明者らは、アデノウイルス遺伝子移入に対して最も高度な耐性を示した２つ の細胞株KSY-1およびKS-SLKを選択した。これらの２つの細胞株のための用量応 答殺傷曲線を種々の濃度のAdMCHSVtkで感染し、そして次いでGCVの存在下または 非存在下で維持された細胞を使用して作成する（データは示されず）。これらの 実験は、GCVの存在下で細胞を5pfu/細胞のAdCMVHSVtkで感染させる場合、両方の 細胞株が細胞殺傷の証拠をほとんど示さなかったことを証明した。 次の実験において、本発明者らは、Fab-FGF2結合体の添加によって、KS細胞に おいて、AdCMVHSVtk遺伝子形質導入を可能にすることおよび次いでGCVに感受性 にすることを探究した。実験デザインにおいて、細胞をAdCMVHSVtkまたはFab-FG F2と複合体化したAdCMVHSVtkのいずれかの5pfuで処理する。GCV介在殺傷を、GCV の存在下または皮存在下で細胞を維持することによって評価する。これらの実験 の結果を図４に示す。 図４は、Fab-FGF2結合体によるKSY-1およびKS-SLK細胞における殺傷したAdCMV HSKtk/GCV細胞殺傷を示す。AdCMVHStkトランスフェクト細胞に対するGCVの効果 が、結合体の存在下または非存在下において評価され、そしてGCVに対して暴露 されない細胞（すなわち、-GCV）と比較した細胞生存のパーセントとして表され る。二連のウェルにおいて生存細胞を、トリパンブルー排除後、三連で計数する 。縦軸上に細胞生存の％を図４Aおよび図４Bの両方に示す。図4Aにおいて、AdCM VHSVtkまたはAdCMVHSVtk+Fab-FGF2は、横軸に同定される。図４Bにおいて、AdCM VHSVtkまたはAdCMVＨSVtk+Fab-FGF2でトランスフェクトしたKS-SLK細胞を、横軸 で同定する。 細胞殺傷を、GCVの非存在下で生存する細胞数に対するGCVの存在下で生存する 細胞数の割合として示す。図４は、Fab-FGF2によるAdCMVHSVtkの再標的化が、GC V媒介殺傷に対するKS細胞感受性の有意な増強を生じたことを証明する。従って 、これらの研究は、効果的な遺伝子移入が、FGFRを介したアデノウイルスの再標 的化によってKS細胞において達成され得るという本発明者らの仮説を確認する。 重要なことは、この策略が、試験したすべての細胞株において効果的な形質導入 を定量的に増強したことである。Adが細胞を標的にしない場合、この技術は、そ れ受容体に標的化することを本発明者らに可能にさせ、そして生じる応答は、予 期される応答よりも大きい。 実施例２ FGFR を介する標的化遺伝子送達 組替えアデノウイルスベクターは、効果的なインビボ遺伝子輸送を達成するた めのこれらの能力に起因して、癌遺伝子治療の文脈において大いに重要である。 しかし、特定の細胞型へのこれらのベクターの標的化は障害が残ったままである 。 特定の標的化を達成するために、中和抗ノブ抗体フラグメント(Fab)(Ad感染を阻 止する)を、塩基性繊維芽細胞成長因子(FGF2)リガンドへ結合する。生じる結合 体Fab-FGF2を、抗FGF2抗体を使用してウエスタン分析によって特徴づける。結合 体におけるFGF２活性の機能性の確認を、内皮細胞増殖アッセイを使用して達成 し、そしてELISAを、Ad5ノブになお結合した結合体のFab成分を確認するために 実施する。次いで、FGF２結合体を、インビトロにおいて、ルシフェラーゼレポ ーター遺伝子(AdCMVLuc)を有するAdベクターをFGF受容体陽性細胞(Swiss 3T3，P ANC-1，SKOV3.ipl、およびD54MG)に標的化するために使用する。 本発明者らの結果は、Fab-FGF2結合体で標的化したAdが、Adが単独で全ての細 胞株に使用する場合よりも有意に大きい遺伝子発現のレベルを達成したことを証 明した。さらに、Fab-FGF2結合体は、ヌードマウス中に腹腔内で移植されたSKOV 3.1pl腫瘍にAdCMVLucの特異的インビボ送達を達成し得る。従って、この仕事は 、Adベクターが適切なリガンドを使用して、インビボで特異的細胞型に標的化さ れ得ることを証明する。これは、種々の遺伝子治療戦略においてAdベクターを使 用する場合、すさまじい潜在的有用性をもつ。 C.材料および方法 1.細胞およびウイルス ヒト膵臓類上皮癌腫細胞株であるPANC-1、およびマウス繊維芽細胞株であるSw iss 3T3をアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC，Pockvill，MD)から 得る(例えば、それぞれATCC受託番号CRL-1469およびCCL-92を参照のこと)。ヒト 神経膠腫細胞であるD54MGは、Giardらによって確立されたA172細胞株の誘導体で ある（例えば、Giardら、J．Natl．Cancer Inst．51:1417-23(1973);Bingerら、 J．Neuropathol．Exp．Neurol．40:390-409(1981);およびGoldmanら、Mol．Biol ．Cell 4 121-33（1993）を参照のこと）。 SKOV3.iplヒト卵巣腺癌細胞株は、Janet Price(Baylor University)より親切 に提供される。(関連のSKOV3細胞株は、受託番号HTB-77下でATCCから入手可能で ある)。ウシ大動脈血管内皮細胞を一次培養物から得る(Gospodarowiczら、Endro crinology 117:2383-91(1985))。 3T3、PANC-1、およびSKVO3.1pl細胞を、10％の仔ウシ血清(FCS)(Summit Biote chnology，Fort Collins,CO)および２mML-グルタミンを補充したDulbecco改変Ea gle培地(DMEM)で維持する。D54MG細胞を7％のFCSおよび２mML-グルタミンを補充 したDMEM/F12で維持する。ウシ大動脈血管内皮細胞を10％のFCS、ゲンタマイシ ン(50μg/mL)、２mML-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム溶液、および0.1mM MEM非不可欠アミノ酸溶液を補充したDMEMで維持する。AdCMVLuc(HerzおよびGer ard，PNAS USA 90:2812-6(1993))は、E1欠失複製欠損Ad5ベクター（サイトメガ ロウイルス(CMV)プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ(Luc)を発現する ）である。前述のベクターは、引用された参考文献に記載されるように調製され 得る。アデノウイルスを、許容の293細胞株上で増殖させ、そして標準的な技術 によって精製する。 ２.1D6.14-Fb へのFGF2の結合 1D6.14-Fbを、先に記載のように(Douglasら、Nature Biotech．14:1574-78(19 96))生成し、そして特徴づける。Fab(1.6mg)を、0.1M NaClおよび1.0mM EDTA(BP S-E)を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5、に対して、1:250(v/v)で3時間 緩衝液を2回交換して透析する。透析したFabフラグメントを、10分間14,000rpm で遠心分離し、そして上清を収集する。Fabフラグメントを、時折撹拌しながら 、室温にて30分間1：3のモル比で、N-サクシンイミジル-3（ピリミジルジチオ） プロピオネート(SPDP)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)で誘導化する。過剰のSPDP および低分子量反応副産物を、PBS-E(1:500，v/v)に対する透析によって除去す る。FGF２ムテインを、本明細書に記載されるすべての研究において使用する； このムテインは96位でそのシステインをセリンに突然誘発された。FGF2ムテイン は、E．coliにおいて発現し、そして以前に記載されるように(Lappiら、Amal．B iochem．212:446-51(1993))精製する。 FGF2ムテインを含む反応を、Tris塩基の添加によってpH7.5に調整し、そして モノチオグリセロール(MTG;Evans Chemetics，Waterloo，NY)を最終濃度20mMま で添加することによって還元する。反応を30分間室温にて実施した後、過剰のMT GをPD-10カラム(Pharmacia)へ混合物を通すことによっておよび0.14M NaClおよ び1mMのEDTAを含むpH5.4の１0mMのNaOAc/HOAcで溶出することによって除去する 。次いで、還元したFGF２ムテインを、pH7.5にて2：1のモル比でSPDP誘導化され たFabと混合し、そして振とうしながら16時間４℃にてインキュベートする。 結合体を、ヘパリン-Sepharose(１mLヘパリンHi-Trap,Pharmacia)上で、10mM のトリスpH7.4のカラムへ反応混合物をロードし、そして同緩衝液+0.6M NaClで 洗浄することによって精製し、未結合のFabを除去する。吸光度がバックグラウ ンドまで戻った場合、結合体を2M NaClを含む同緩衝液でカラムから溶出する。 次いで、2Mの溶出物をSephacrylS-100カラム(Pharmacia)へロードし、遊離FGF２ ムテインを除去し、そしてpH7.4のPBSへ緩衝液交換する。Fabの最終タンパク質 濃度は0.24mg/mLである。このFabを以下の研究に直接に使用する。 ３． Fab-FGF2 結合体の特徴付け Fab-FGF2結合体を非還元条件下でのSDS-PAGE（12%）により評価し、そしてク マシーブルーで染色する。ウェスタンブロット分析をまた、タンパク質をニトロ セルロース膜に移し、抗FGF2ウサギポリクローナル抗体、次いで¹²⁵I-プロテイ ンＡ（これはオートラジオグラフィーにより示される）を用いてプローブ（prob ing）することにより、結合体上で行う。 Fab-FGF2結合体のFGF2成分の活性を、細胞増殖アッセイを用いて確認する。ウ シ大動脈内皮細胞を24ウェル組織培養プレートにおいて1000細胞/ウェルで、播 種する。次の日、FGF2またはFab-FGF2結合体の段階希釈物（30pg/m:〜6ng/mL） を３連でウェルに添加する。48時間後、培地を取り除き、そして同じ濃度のFGF2 またはFab-FGF2を含む1.5mlの新しい培地を添加する。さらに72時間インキュベ ートした後、培地を取り除き、細胞をPBSで洗い、0.25%トリプシン処理し、そし て、Coulter Particle Counter（Coulter）を用いて計測する。 Fab-FGF2結合体のFab部分の活性をELISAにより確認する。Ｎ末端６-Hisタグを 有する組換え三量体Ad5ノブ（knob）タンパク質（180ng）（Krasnykhら、J．Vio l．70:6839-6846(1996)）を、室温にて１時間、Ni-NTA HisSorb Strips（Qiagen ，Chatsworth，CA）にプレートする。Fab-FGF2結合体または適切なコントロール をウェルに添加し、そしてQiagenのプロトコルに従ってアッセイを行う。ポリ クローナル抗FGF2抗体（Sigma Immunochemicals，St．Lois，MO）を一次抗体と して使用し、一方、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体（ Southern Biotechonology Associates，Birmingham，AL）を二次抗体として使用 する。 ４． Fab-FGF2 結合体を用いたインビトロ感染 10.5μgの中和抗体（Fab）または抗体結合体（Fab-FGF2）を1.9×10⁸プラーク 形成単位（pfu）のAdCMVLucを用いて、総容量110μlのHPES緩衝化生理食塩水（p H7.3）中、室温にてインキュベートする。30分後、９μ1のFabまたはFab-FGF2の AD複合体を、３連で24時間前に24,000細胞/ウェルの密度でプレートされた3T3、 PANC-l、SKOV3.iplおよびD54MG細胞に添加する。複合体を添加する前に、まず細 胞をPBSで洗い、そして200μlの血清を減少させた培地であるOPTI-MEM（Gibco-B RL，Grand Island，NY）を補充する。37℃で１時間のインキュベートの後、細胞 に１mlの完全培地を補充し、そしてさらに37℃で24時間、インキュベートさせる 。次いで、細胞を溶解し、そして抽出物をルシフェラーゼアッセイ系（Promega ，Madison，WI）を用いて、製造業者のプロトコルに従い、ルシフェラーゼ活性 についてアッセイする。相対光単位（relative light units）(RLU)を、BioRad のプロテインアッセイを用いて、製造業者のプロトコルに従い、タンパク質含量 に対して基準化する。阻害研究を、細胞感染の前に、AdCMVLuc-Fab-FGF2混合物 にポリクローナル抗FGF2抗体（Sigma Immunochemicals）を添加することにより 行う。全ての実験を三連で行う。 ５． Fab-FGF2 結合体を用いたインビボ感染 インビボ実験をSKOV3.ipl細胞を腹腔内（i.p.）移植された胸腺欠損（athymic ）ヌードマウスにおいて行う。SKOV3.ipl細胞（2×10⁷）を腹腔内注射を介して 移植し、そして７日間増殖させる。次いで、マウスに、AdCMVLuc（１×10⁸fpu） 、AdCMVLuc-Fab、AdCMVLuc-Fab-FGF2、または2%FCSを含む総容量600μlの培地中 で抗FGF2抗体とともにインキュベートされたAdCMVLuc-Fab-FGF2のいずれかを腹 腔内注射する。 AdCMVLuc-FabおよびAdCMVLuc-Fab-FGF2結合体を上記の様式と一致する様式で 作製する。Ad注射の２日後、マウスを屠殺し、そして腫瘍および背側中皮内層（ dorsal mesothelial lining）を採取する。器官（organ）を水でリンスし、粉砕 （grinding）緩衝液（50mM K₃PO₄、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、10%グリ セロール）中でホモジナイズし、そして溶解緩衝液（Promaga）で溶解する。ホ モジネートを氷上で30分間インキュベートし、次いで、10分間、４℃にて14,000 rpmで遠心分離する。上清を上記のようなルシフェラーゼ活性についてアッセイ し、そして総タンパク質含量を標準化する。 Ｄ．結果および考察 １．Fab に対するFGF2の結合 1D6.14抗Ad5ノブ中和抗体のFabフラグメントは、SPDPを用いて誘導体化され、 そしてFGF2ムテインにおける１つの残存する活性システインに結合される（図４ ）。反応はサイズ排除HPLCによりモニタリングされ、そして結合体はヘパリン-S epharoseカラム、次いでSephacryl S-100ゲル濾過を用いて精製される。 図４は、Fab-FGF2結合体の合成および精製についてのスキームを図示している 。このスキームは、任意のFab-リガンド結合体の合成および精製に適応され得、 従って、図示されたスキームに限定されないことが、明らかに理解されるべきで ある。 図5Aは、非還元条件下におけるFab-FGF2のSDS-PEGEの結果を示す。FGF2（レー ン２）、Fab（レーン３）またはFab-FGF2（レーン４）の等量（2μl）がゲルに アプライされ、そしてクマシーブルーによる染色により分子量スタンダード（レ ーン１、数千）と比較される。図5Bにおいて、Fab-FGF結合体のウエスタンブロ ット分析が示される。タンパク質は、ニトロセルロース膜に移され、、抗FGF2ウ サギポリクローナル抗体、次いで¹²⁵I-プロテインＡを用いてプローブされ、そ してオートラジオグラフィーにより可視化される。バンドは、FGF2（レーン５） およびFab-FGF2結合体（レーン７）について観察されるが、Fab抗体のみ（レー ン６）については観察されない。 結合体の完全性（integrity）はSDS-PAGE分析により確認され（図5A、レーン ４）、ここでクマシー染色は、Fab-FGF2結合体に相当するバンドを示し、そして フリーのFGF2の存在を示さなかった。さらに、FGF2に対して作製された抗体を用 いるウェスタン分析は、Fab-FGF2結合体のサイズに相当するバンドを示し（図5B 、レーン７）、そしてフリーのFGF2の存在を示さなかった。従って、FGF2がFab に結合すること、および過剰のFGF2が除去されていることが確認される。 ２．Fab-FGF2 結合体の機能性確認 Fab-FGF2結合体を、結合されていないFGF2と、内皮細胞増殖アッセイにおいて 比較する。内皮細胞増殖アッセイにおける結果は、FGF2に対するFabの結合が、F GF2の、そのコグネートレセプターに結合する能力および増殖を刺激する能力を 妨害しないことを示した（図6A）。 Fab-FGF2結合体がまだノブ結合能力を保持しているかどうかを決定するために 、ELISAアッセイが行われる。プレートは、可視化のための基質を添加する前に 、抗FGF2一次抗体を用いてプローブされ、次いでヤギ抗ウサギ二次抗体でプロー ブされる。Fab-FGF2結合体は、Ad5ノブを含むウェルに対して添加された場合、A d5ノブをを含まないウェルにおける0.35±0.04の吸光度と比較して、3.70±0.13 の吸光度を有した。さらに、結合体の吸光度は、FGFが単独で添加された場合（1 .55±0.03）（p<0.002）よりも有意に高い。従って、本発明者らは、Fab-FGF2結 合体のFab部分が、結合後にAd5ノブに結合すること、および結合体のFGF2部分が 内皮細胞増殖アッセイにより証明されるように、まだ機能的であることを示し得 る。 上記に簡潔に要約されたように、アッセイの結果は、図6Aおよび36Bに図示さ れる。図６は、Fab-FGF2結合体の機能性確認を示す。図6Aにおいて、FGF2および Fab-FGF2結合体による内皮細胞増殖刺激が示される。ウシ大動脈内皮細胞は、種 々の濃度（30pg/ml〜6ng/mL）のFGF2またはFab-FGF2で処理され、そして細胞数 が決定される。細胞計数（×1000）が縦軸にプロットされ、これに対してpg/mL が横軸にプロットされている。白丸はFGF2を表し、これに対して黒丸はFab-FGF2 を表す。 図6Bにおいて、ELISAにおけるAd5ノブに対するFab-FGF2の結合を図示する。組 換えAd5ノブは、Fab-FGF2、ブランクコントロール（すなわち、FGF2）のいずれ かでプローブされる。コントロールとして、Fab-FGF2がAd5ノブを含まなかった プレートに添加される。吸光度が縦軸にプロットされ、これに対して以下のもの が棒グラフの横軸に示さる。左から右へ進んでいくと：ノブなし＋Fab-FGF2；ノ ブ＋Fab-FGF2；ノブ単独；およびノブ＋FGF2。 ３．Fab-FGF2 結合体を用いるインビトロ感染 Fab-FGF2結合体が内皮細胞増殖を刺激することおよびアデノウイルスファイバ ーノブに結合することが示されているので、次いで、結合体がインビトロにおい て、高親和性FGFレセプターに対するAdCMVLucの標的化を示すために使用される 。４つの細胞株（3T3、PANC-1、SKOV3.ipl、およびD54MG）が、AdCMVLuc単独、F abと予め混合されたAdCMVLuc、Fab-FGF2と予め混合されたAdCMVLuc、またはFab- FGF2および抗FGF2抗体と予め混合されたAdCMVLucのいずれかに感染される。 感染後24時間で、ルシフェラーゼアッセイが行われる。AdCMVLuc単独に感染さ れた3T3、PANC-1、SKOV3.ipl、およびD54MG細胞は、それぞれ3.7×10⁴、5.8×10⁴ 、8.4×10⁴、および2.0×10⁶RLU/μg（タンパク質）のルシフェラーゼ活性を生 じた（図７）。 図７は、Fab-FGF2結合体を用いる細胞株のパネルのインビトロ感染の結果を図 示する。図7Aにおいて、Fabによるルシフェラーゼ発現の阻害が示されている。 ４つの細胞株は、AdCMVLucまたは本文において記載されるようにFabと予め混合 されたAdCMVLucのいずれかに感染される。このデータは、それぞれの細胞株に対 してAdCMVLucが単独で用いられている場合のルシフェラーゼ発現の割合として表 される。その割合は、縦軸にプロットされ；細胞株（3T3、PANC-1、SK0V3.iplお よびD54MG）が横軸に従って図示されている。白の棒はAdCMVLucを表し、これに 対して黒の棒はAdCMVLuc＋Fabを表す。 図7Bにおいて、AdCMVLuc、AdCMVLucまたはAdCMVLuc-Fab-FGF2結合体のいずれ かに感染された４つの細胞株におけるルシフェラーゼ活性が示されている。棒は 、タンパク質１μgあたりの相対光単位（RLU）におけるルシフェラーゼ発現を図 示し、そして三連の測定±標準偏差を表す。RLU/μg（タンパク質）は縦軸にプ ロットされている。横軸において、細胞株（3T3、PANC-1、SKOV3.iplおよびD54M G）が図示されている。黒の棒は、AdCMVLucを表し、これに対して平行線模様の 棒はAdCMVLuc＋Fab-FGF2を表す。 図7Cにおいて、抗FGF抗体によるルシフェラーゼ発現の阻害が示されている。 ４つの細胞株は、Fab-FGF2結合体と予め混合されたAdCMVLuc、またはFab-FGF2結 合体および上記の抗FGF2抗体と予め混合されたAdCMVLucのいずれかに感染されて いる。データは、それぞれの細胞に対してAdCMVLuc-Fab-FGF2複合体が用いられ た場合に見られるルシフェラーゼ発現に対する割合として表されている。その割 合は縦軸にプロットされ；横軸にそって細胞株（3T3、PANC-1、SKOV3.iplおよび D54MG）が図示されている。明るい陰を付けられた棒は、AdCMVLuc＋Fab-FGF2を 表し、これに対して暗い黒の棒は、AdCMVLuc＋Fab-FGF2＋抗FGF2Abを表す。 AdCMVLucがFab抗体と予め混合されている場合（図7A）、その感染はそれぞれ の細胞株において、それぞれ97.0、98.8、69.3、および98.3%阻害される。興味 深いことに、それぞれの細胞株は、AdCMVLuc単独に感染された場合（図7B）より もFab-FGF結合体と予め混合されているAdCMVLucに感染された場合に高レベルの ルシフェラーゼ活性（それぞれ、2.9×10⁵、1.3×10⁵、2.0×10⁵および4.1×10⁶ RLU/μg（タンパク質））を示した。抗FGF2抗体は、Ad-Fab-FGF2複合体による細 胞感染を、それぞれ96.1、96.3、90.1および94.0%で阻害した（図7C）。これら の結果は、複合体がAdを高親和性FGFレセプターに対して特異的に再標的化させ ることを証明した。この経路を介する再標的化により、Adがそのネイティブのレ セプター経路を介して経路設定される場合よりも、高レベルの遺伝子移入が達成 される。 ４． Fab-FGF2 結合体を用いたインビボ感染 遺伝子治療のアプローチにおける治療の指標は頻繁に、腫瘍細胞と非腫瘍細胞 形質導入との間の差により指示される。従って、本発明者らは、マウスの卵巣ガ ンモデルにおける腫瘍特異的送達を達成するための能力を調べた。腹膜にSKOV3. ipl腫瘍を保有する胸腺欠損ヌードマウスにおける腫瘍および背側中皮内層のル シフェラーゼ活性が、AdCMVLuc単独、Fabと予め混合されたAdCMVLuc、Fab-FGF2 と予め混合されたAdCMVLuc、またはFab-FGF2および抗FGF2抗体と予め混合された AdCMVLucの腹腔内投与の48時間後に決定される（表１）。表１は、それぞれの胸 腺欠損ヌードマウスに対する種々のAdCMVLuc複合体投与の48時間後での、腫瘍お よび背側中皮内層におけるルシフェラーゼ発現（RLU/μg）を示す。 表１に示された結果は、腫瘍が背側中皮内層よりもAd形質導入に対してより感 受性であり（それぞれ、131対15.1RLU/μg（タンパク質））、そして両方の器官 が、Ad-Fab複合体がマウスに投与される場合にルシフェラーゼ活性の減少を示し た（腫瘍においては37.6%阻害、腹側（abdominal）内層においては17.9%阻害） ことを示す。しかし、マウスがAd-Fab-FGF2を投与される場合、腫瘍および腹側 内層の両方が、Ad単独を投与された場合よりも高いルシフェラーゼ活性（それぞ れ、9250、404RLU/μgタンパク質）を示した。背側中皮内層におけるルシフェラ ーゼ活性に対する腫瘍におけるルシフェラーゼ活性の比は、AdCMVLuc単独または Fab-FGF2を用いて標的化されたAdCMVLucが投与される場合、それぞれ18.5および 31.2である。これらの結果は、この卵巣ガンのインビボモデルにおいて、Fab-FG F2結合体が、AdCMVLucをFGFレセプターポジティブ腫瘍細胞に対して優先的に 標的化することを示す。 実施例３ FGFムテインの調製 上記に開示したように、FGF関連分子（そのアナログ、誘導体、フラグメント 、および模倣物を含む）が、本発明の結合体、組成物、系および方法において有 用である。FGFムテインの調製手順を、本明細書に開示される有用ないくつかの 分子の例および例示の目的のために本明細書中以下に提供する。 Ｅ． 材料および方法 １．試薬 FGF2コード配列を含むプラスミドpFC80は、Farmitalia Cargo Erba（Milan，I taly）のPaolo Sarmientos博士およびAntonella Isacchi博士の寄贈である。プ ラスミドpFC80は、PCT出願番号第WO 90/02800号およびPCT出願番号第PCT/US93/0 5702号に記載されている。pFC80においてFGF2をコードするDNAの配列は、PCT出 願番号第PCT/US93/05702号に示される配列である。 プラスミドの単離、コンピテント細胞の生成、形質転換、およびM13操作を、 公開されている手順（Sambrookら、Molecular Cloning，a Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989）に従 って行う。DNAフラグメントの精製を、Bio 101（La Jolla，CA）から購入したGE NECLEAN IIキットを用いて達成する。異なる構築物の配列決定をUSB（Cleavelan d，OH）のSEQUENASEキット（バーション2.0）を用いて行う。 ２．ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ゲル電気泳動およびウェスタンブロッテ ィング SDSゲル電気泳動を20%ゲルを利用しているPhastSystem（Pharmacia）において 行う。ウェスタンブロッティングをPhastTransfer system（Pharmacia）を用い て、製造業者により記載されるように、ニトロセルロースに電気泳動されたタン パク質を移すことにより達成する。SAPおよび塩基性FGFに対する抗血清を1:1000 の希釈で使用する。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗IgGを二次抗体として 用いる。 Ｆ．部位特異的変異誘発により変異誘発されたFGFの調製 システインからセリンへの置換を、Amersham（Arlington Heights，IL）のイ ンビトロ変異誘発系（in vitro-mutagenesis System）2.1を用いたオリゴヌクレ オチド特異的変異誘発により行う。新しいアミノ酸をコードするオリゴヌクレオ チドを、380B自動化DNA合成機（Applied Biosystems，Foster City，CA）を使用 して合成する。 １．変異誘発 システイン78のインビトロ変異誘発のために使用するオリゴヌクレオチドは、 AGGAGTGTCTGCTAACCであり、これはFGF2のヌクレオチド225〜241の範囲である。 システイン96の変異誘発のためのオリゴヌクレオチドは、TTCTAAATCGGTTACCGATG ACTGであり、これはヌクレオチド279〜302の範囲である。変異複製形態のDNAを 、E.coli株JM109に形質転換し、そして単一のプラークを採取し、そして変異の 確認のために配列決定した。次いで、FGFの変異遺伝子をM13から切り出し、取り 出された遺伝子の非変異形態を有する発現ベクターpFC80に連結し、そしてE.col i株JM109で形質転換する。単一のコロニーを採取し、そして変異を確認するため に配列決定されたプラスミドが存在する。次いで、正しい変異を有するプラスミ ドをE.coli.株FICE2に形質転換し、そしてこれらの形質転換体からの単一のコロ ニーを用いて、変異塩基性FGFを得る。培養ブロス１リットルあたり、約20mgの タンパク質を得る。 ２．変異誘発されたFGFの精製 細胞を100μg/mlのアンピシリンを含む20mlのLBブロス中で一晩、増殖させる 。翌朝、細胞をペレット化し、そして100μg/mlのアンピシリンを含む500mlのM9 培地に移し、そして７時間増殖させる。細胞をペレット化し、そして溶解溶液（ 10mM TRIS、pH7.4、150mM NaCl、10μg/mLリゾチーム、10μg/mLアプロニチン、 10μg/mLロイペプチン、10μg/mLペプスタチンＡ、および1mM PMSF；16gのペレ ットあたり、45〜60ml）に再懸濁し、そして撹拌しながら室温にて１時間インキ ュベートした。溶液を３回凍結融解し、そして2.5分間超音波処理する。懸濁液 を遠心分離し；上清を貯蔵し（saved）、そしてペレットをリゾチームを含まな い別の容量の溶解溶液に再懸濁する。再度遠心分離し、そして上清をプールする 。40ml容量の抽出物を10mM TRIS、pH7.4（緩衝液Ａ）を用いて50mlに希釈する。 プールしたものを、150mMの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで平衡化した5mlのHi -Trapヘパリン-Sepharoseカラム（Pharmacia，Uppsala，Sweden）に充填する。 カラムを0.6Mの塩化ナトリウムおよび1Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで洗い 、次いで2Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出する。280nmでの光学密度に より決定された2M溶出ピークの画分をプールし、そして純度をゲル電気泳動によ り決定する。収量は、Cys⁷⁸変異体については10.5mgの精製タンパク質、およびC ys⁹⁶変異体については10.9mgである。 [C78S]FGFおよび[C96S]FGFの生物活性を培養中の（in culture）副腎毛細管内 皮細胞について測定する。細胞を、1mlの10%仔ウシ血清-HDMEM中で、24ウェルプ レートにウェルあたり3,000個でプレートする。細胞を付着させ、そしてサンプ ルを、示した濃度で三連で添加し、そして37℃にて48時間インキュベートする。 等量のサンプルを添加し、さらに48時間インキュベートする。培地を吸引し；細 胞をトリプシン（1ml容量）で処理して細胞を取り出し、9mlのHematallで希釈し 、そしてCoulter Counterで計測する。結果は、培養における内皮細胞増殖を刺 激する能力により判断すると、２つの変異体は、ネイティブな塩基性FGFの実質 的に完全な増殖活性を保持することを示す。 実施例４ FGF-ADの有効性および毒性 上記に開示したように、ポリペプチドを用いて再標的化されたウイルスベクタ ー（FGFレセプター（FGFの誘導体およびフラグメントならびにそれらのポリペプ チド部分を含む）を標的化する）は、本発明の結合体、組成物、系、および方法 において有用である。本発明の構築物の使用の手順およびいくつかの新規の利点 および予想外の利点を例示する例示的なデータを、例および例示の目的のために 本明細書中以下に提供する。 Ａ．方法 １．インビボ毒性評価 FGF AdβgalおよびAdβgalの毒性を、雌性C57B1/6マウスにおいて評価する（n =5/群）。FGF AdβgalまたはAdβgalの調製のために、77μgのFGF-Fabまたは等 容量の0.9%NaClを2×10¹⁰pfuのAdβgalを用いて室温にて30分間インキュべート する。マウスあたり、2×10¹⁰pfuのAdβgalまたはFGF-Adβgalのいずれかを最終 容量0.32mlで（30秒間にわたって）静脈注射する。コントロールマウスは0.32ml の賦形剤（25mM Tris pH7.5、100mM NaCl、10mg/mlラクトース）を受けた。注射 の４日後に、一群あたり２匹のマウスを屠殺する。血清を血清トランスアミナー ゼおよびアルカリホスファターゼの分析のために収集する。肝臓、肺、脾臓、お よび腎臓を取り出し、重量を量る。肝臓および肺の一部をすぐに液体窒素中で急 速に凍結し、-80℃で保存し、次いでβ-ガラクトシダーゼ活性の定量分析のため に処理する。それぞれの器官の一部分をドライアイスで予め冷却したイソペンタ ンを使用して、OCT中で急速に凍結させ、そして-80℃で保存する。それぞれの器 官の別の部分を、中性に緩衝化された10%のホルマリン中で、４時間４℃にて固 定し、次いでパラフィンに埋め込む。７日目に、１群あたり３匹のマウスを屠殺 し、そして組織および血清を同じ様式で処理する。 ２．β-ガラクトシダーゼ活性測定 マウス肝ホモジネートにおけるβ-gal活性を、標準的な技術に従って定量する 。手短に言えば、凍結組織をカミソリの刃で刻み、そして氷上で冷溶解緩衝液中 にて、ガラスダウンサー（douncer）を使用して手動でホモジナイズする。1mLの 0.2％Triton、100mMリン酸カリウム溶解緩衝液、pH7.8あたり0.1ｇの器官重量を 加える。ホモジネートを、各々4℃で微量遠心管中での12,000×ｇの、二度の20 分の遠心分離工程によって明澄化する。上清を、Chelex-100樹脂（BioRadカタロ グ＃142-2842）を用いて、0.25×容量のキレート剤を各々のサンプルに添加す ることによって処置する。次いで、ホモジネートを、短くボルテックスし、室温 で２〜５分間インキュベートし、そして30秒間微量遠心管中で12K×ｇで遠心分 離する。一連の各々の上清の２倍希釈物を、Clontech Luminescent β-gal Dete ction Kit（カタログ＃K2048-1）を使用してアッセイする。各々のサンプル希釈 物10μlを、96ウェルプレート中で75μlのClontech β-gal Reagentとともに室 温で１時間インキュベートし、そしてDynatech Laboratories ML3000マイクロタ イタープレートルミノメーターで読みとる。各々のサンプルの活性を、Clontech キットにより供給されるβ-gal酵素の標準曲線から外挿することによって決定し 、mU/g器官重量で表現する。 ３．β-ガラタトシダーゼ活性の組織学的決定 ８μmの凍結（cryostat）切片を、PBS pH7.4中の2％PFA、0.5％GAに、30分間 室温で固定する。次いで、組織切片を、0.03％NP-40および2mM MgCl₂を含むPBS 中ですすぎ、そしてX-Gal溶液（2mM MgCl₂および0.03％NP-40を含むPBS pH7.4中 の１mM/ml X-Gal、5mM K₃Fe(CN)₆、3mM K₄Fe(CN)₆）中で16時間、37℃でインキ ュベートする。スライドガラスをPBS中ですすぎ、10％緩衝化ホルマリン中で後 固定し、15秒間Nuclear Fast Redで対比染色し、脱水し、そしてマウントする。 形態学的研究のために、日常的なヘマトキシリンおよびエオシン染色を、パラフ ィンに埋め込んだ組織上で行う。 ４．インビトロ腫瘍モデル FGF-Ad_HSVTKを、0.3μgのFGF-Fabを1×10⁸pfuのFGF-Ad_HSVTKと混合し、そして 30分間室温でインキュベートすることによって調製する。次いで、FGF-Ad_HSVTK 、Ad_HSVTK、または20mM HEPES緩衝液のいずれかを、50のMOIの懸濁液中でB16黒 色腫細胞と混合する。この混合液を、室温で１時間インキュベートする。雌性BD F1マウス（n=8/群）は、０日目に腹腔内移植されたFGF-Ad_HSVTK、Ad_HSVTK、また は20mM HEPES緩衝液で処理された2×10⁶B16細胞のいずれかを有した。次いでマ ウスを、１日目の始めに、qdX14で、100mg/kgの用量でガンシクロビル（またはH₂ O）で処置する。次いでマウスを生存について追跡する。統計学的な分析を、Ka plan-Meier およびLogrank（Mantel-Cox）post-hox分析を用いて行う。 Ｂ．結果 １．毒性分析 Adの再標的化を成し遂げるために、本発明者らは、FGF-2をブロック性の抗ア デノウイルスノブFabに結合体化させることによって、二機能分子を作製した。 次いで、この分子を、インビトロでの細胞の形質導入またはインビボでの使用に 先立ちAdとともにインキュベートする。FGF-2で再標的化されたAdが、肝臓に対 するAdのネイティブな親和性をブロックするかどうかを決定するために、FGF-2A dβgalおよびAdβgalをマウスに静脈内注射し、そして肝臓細胞におけるβgalの 発現を評価する。 図8A-Cは、AdβgalまたはFGF-2Adβgalで処置後のマウスの肝臓におけるβ-ガ ラタトシダーゼの発現を示す。図Ａにおいては、賦形剤で処置したC57B1/6マウ スの肝臓では、Xgal染色された細胞が見られない。図８Ｂにおいては、マウス１ 匹あたり2×10¹⁰pfuの静脈内投与でAdβgalを用いて処置したC57B1/6マウスの肝 臓に、多数のXgal染色された肝臓細胞が存在する。図８Ｃにおいては、マウス１ 匹あたり2×10¹⁰pfuのFGF-2Adβgalを用いる静脈内処置が、非常に少ない肝臓細 胞を形質導入する。 投与後４日目において、多数のX-gal染色された肝臓細胞がAdβgalで処置した マウスの肝臓に存在する（図８Ｂを参照のこと）。FGF-2Adβgalを用いて処置し たマウスの肝臓において、X-gal染色肝細胞の明示的な減少が存在する（図８Ｃ ）。肝臓におけるβ-ガラクトシダーゼ活性の定量（表２）は、Adβgal処置クル ープにおけるよりもFGF-2Adβgal処置群におけるβgalが30分の１の少なさであ ることを証明した。投与後７日目における、X-gal染色およびβ-ガラクトシダー ゼ活性の定量の両方についての結果は同様であった（X-gal染色は省略、表２に おける定量）。 図９は、AdβgalまたはFGF-2Adβgalで処置したマウスにおける血清トランス アミナーゼおよびアルカリホスファターゼレベルを示す。血清トランスアミナー ゼ（AST、ALT）およびアルカリホスファターゼを、賦形剤；Adβgal、2×10¹⁰pf u、静脈内；またはFGF-2Adβgal、2×10¹⁰pfu、静脈内のいずれかで処置後のC57 B1/6マウス中で７日目に測定する。 投与後７日目に、血清トランスアミナーゼレベルは、Adβgal処置群では8.2〜 13.6倍上昇するが、FGF-2Adβgal処置群では中程度の3.2〜4.7倍のみである（図 ９を参照のこと）。血清アルカリホスファターゼはまた、Adβgal処置マウスの 血清では上昇するが、FGF-2Adβgal処置マウスでは正常である。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、AdβgalまたはFGF-2Adβgalで処置後のマウスの 肝臓の組織病理学を例示する。Adβgal、2×10¹⁰pfu、静脈内（図１０Ａ）；ま たはFGF-2Adβgal、2×10¹⁰pfu、静脈内（図１０Ｂ）のいずれかで処置したC57B 1/6マウスの肝臓のヘマトキシリンおよびエオシン染色したパラフィン切片。Ad βgalで処置したマウスの肝臓に存在する広範な肝細胞の壊疽および炎症性の浸 潤。FGF-2Adβgalで処置したマウスの肝臓においては、肝細胞壊疽はほぼ完全に 廃棄されている。また、非常に少ない炎症性の浸潤が観察される。 ７日目の組織病理学はまた、Adβgalで処置したマウスの肝臓における有意な 肝細胞壊疽および炎症性浸潤の証拠を示すが、FGF-2Adβgal処置群由来の肝臓の 分析は、肝細胞壊疽がほとんど完全に廃棄され、そして炎症性の浸潤が存在しな いことを示す（図１０）。 ２．B16 黒色腫のエキソビボ形質導入 FGF-AdがAdに非感受性の細胞に形質導入し得るかどうかを決定するために、B1 6マウス黒色腫細胞株を標的として選択する。B16細胞を、BDF1マウスへの腹腔内 移植に先立ち、1時間、エキソビボで、AdtkまたはFGF-2Adtkのいずれかとともに インキュベートする。ガンシクロビル治療を、腫瘍細胞接種1日後にインビボで 開始する。 図１１は、AdtkまたはFGF2-Adtkのいずれかで処置した、腫瘍を有するマウス の生存分析を示す。B16黒色腫細胞を、1時間、AdtkまたはFGF2-Adtkのいずれか でエキソビボ処置し、次いでBDF1マウスに、マウス１匹あたり2×10⁶細胞で腹腔 内移植する。次いで、マウスを、ガンシクロビル（GCV）またはH₂O（コントロー ルとして）のいずれかで14日間腹腔内処置する。FGF2-Adtkで処置し、次いでガ ンシクロビルを投与した腫瘍を有するマウスの生存は延長される；このようなマ ウスは、すべての他の群と比較して統計学的に延長した（p＜0.001）生存を有す る。 Adtkおよびガンシクロビルで処置したB16黒色腫を有するマウスの生存は、非 処置B16腫瘍細胞およびガンシクロビル療法を受容したコントロールマウスと区 別不可能である（図１１）。著しく対照的に、FGF2-Adtkで処置されたB16黒色腫 を受容したマウスは、コントロールマウスに比較してメジアン生存の247％増加 を実証した。 実施例５ 卵巣ガンのマウスモデルにおけるAd仲介のHSVTK遺伝子の送達のFGF2による増強 ヒト卵巣ガンのマウスモデルおいて、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ 遺伝子を有するFGF2-再指向アデノウイルスベクター（AdCMVHSV-TK）が、非改変 のAdCMVHSV-TKの同数の粒子と比較して、生存の有意な延長を生ずることが示さ れる。さらに、非改変のベクターと比較して、FGF-2再指向AdCMVHSV-TKの10分の 1の低用量で、等価量の生存率が達成される。これらの所見はアデノウイルスベ クターの感染の効率を増強するための戦略が、大きな臨床的有用性であり得るこ とを示唆する。 先の実施例に記載したように、効率的な遺伝子送達は、Adファイバーのノブド メインによって認識される一次レセプター以外のレセプターを特異的に再標的化 する、親和性改変されたAdベクターの使用を介して達成され得る。Ad5ベクター を二重特異的結合体（Fab-FGF2）と複合体化することによって、４つのカポージ 肉腫細胞株中の遺伝子送達の有意な増強を実証した（上記の実施例１を参照）。 このアプローチの治療的利点をさらに描写するために、本明細書でさらに記載さ れるように、結合体を構築し、そしてヒト卵巣ガンのマウスモデルで利用する。 Ａ．方法 １．細胞およびウイルス ヒト卵巣ガン細胞株SKOV3.iplは、種々の供給源より容易に入手可能である。 本発明者らの供給を、Janet Price（Baylor University，Houston，TX）から入 手し、そしてDulbecco改変Eagle培地（DMEM）中で維持する。293細胞を、アメリ カンタイプカルチャーコレクション、Rockville、MDから購入し、そしてDMEM/Ha m's F-12培地中で維持する（Grahamら、J．General Virol．36:59-72(1977)もま た参照のこと）。培地を10％熱非働化ウシ胎仔血清（FCS）、グルタミン（2mM） 、ペニシリン（100単位/ml）、およびストレプトマイシン（100μg/ml）で補充 し、そして細胞を30℃、5％CO₂雰囲気中で増殖させる。FCSをHyClone Laborator ies，Logan，UTから購入し、そして培地および補充物をMediatech．Herndon VA から購入する。 CMVプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現するE1、E3欠損Ad5ベ クターAdCMVLucは、R.D．Gerard，University of Texas Southwestern medical Center，Dallas，TXにより提供された（HerzおよびGerard、PNAS USA 90:2812-2 816(1993)を参照のこと）。CMVプロモーターからのE．coliβ-ガラクトシダーゼ を発現する、E1欠損ベクターAd5ベクターAdCMVlacZを、De-chu Tang（Universit y of Alabama at Birmingham，AL）から入手した。AdCMVHSV-TKは、以前に記載 され、そしてCNVプロモーターからHSV-TKを発現するE1-欠損Ad5ベクターであ る（Rosenfeldら、Clin．Cancer Res．1:1571-1580(1995)を参照）。組換えアデ ノウイルスを、許容性の293細胞株で増殖させ、そして標準的な技術に従って精 製する（GrahamおよびPrevec、「Manipulation of Ad Vectors」、Methods in M olecular Biology第7巻、Gene Transfer and Expression Techniques、Murrayお よびWalker（編）、Humana Press，Clifton、1991、109-128頁）。 ２．Fab-FGF2 結合体の生成および特徴付け Fab-FGF2結合体は、本明細書の別の個所に記載するように、Ad5knobに対して 指向された無効化モノクローナル抗体ID6.14のFabフラグメントを、FGF2ムテイ ンと結合体化させることによって構築する。質量分析による分析は、結合体が、 Fabフラグメントに連結した単一分子のFGF2を含むことを示した。Fab-FGF2結合 体のFGF2成分は、そのコグネートレセプターに結合し、そして内皮細胞増殖を刺 激する能力を保持した。Fab-FGF2結合体のFab成分は、ELASAにおいて決定される 場合、三量体Ad5knobを認識する能力を保持した。 ３．インビトロでのアデノウイルス感染のアッセイ 予備的な実験を、1D6.14Fabフラグメントの最適な中和用量を決定するために 本明細書中で先に記載したように行う。感染の16時間前に、SKOV3.IPl細胞を、 １ウェルあたり24,000細胞の密度で24ウェルプレート中に播種する。Fabフラグ メントの漸増的な希釈物を、総容量20μlのHEPES-緩衝化生理食塩水（HBS）中で 10⁸PFUのAdCMVLucと室温で30分インキュベートする。次いで、ベクターをDMEM/F -12＋2％FCS（感染培地）で希釈し、そして100μlの複合体を、１細胞あたり50P FUのMOIでSKOV3.ipl細胞に添加する。30℃で1時間のインキュベーションの後、 感染培地を吸い出し、そして1mlのDMEM/F-12＋10％FCS（完全培地）に置き換え る。37℃で24時間でのさらなるインキュベーションの後、細胞を溶解し、そして 抽出物を、化学発光アッセイ（Promega，Madison WI）によって、ルシフェラー ゼ活性についてアッセイする。溶解物のタンパク質濃度を、データの標準化を可 能にするために決定する。感染をブロックするFabの最低容量は、次の実験で用 いられる。加えて、結合体中のFabのFGF2に対するモル比は１：１であると知ら れているので、この値を用いて、次の再標的実験で行われるFab-FGF2の最適用量 を計算する。 Fab-FGF2結合体のアデノウイルス仲介遺伝子送達を増強する能力を決定するた めに、AdCMVLuc（5×10⁷PFU）を、20μlのHBS中で、Fabフラグメント（1.44μg ）またはFab-FGF2結合体（1.94μg）の最適用量と室温で30分プレインキュベー ションする。次いで、ベクターまたはベクター複合体を感染培地中で希釈し、そ して最終容量100μl中で、１細胞あたり50PFUのMOIで、24ウェルプレート中の24 ,000 SKOV3.ipl細胞を感染させる。阻害実験を、感染の前にポリクローナル抗FG F-2抗体（Sigma，St Louis，MO）をAdCMVLuc-Fab-FGF2複合体に添加することに よって行う。細胞溶解物を、感染24時間後のルシフェラーゼ活性についてアッセ イする。溶解物のタンパク質濃度を、データの標準化を可能にするために決定す る。統計学的分析は、スチューデントのｔ検定を用いて行う。 形質導入された細胞の数を定量するために、SKOV3.ipl細胞を、AdCMVLacZで感 染させる。感染16時間前に、SKOV3.ipl細胞を、ウェルあたり3×10⁵細胞の密度 で6ウェルプレートに播種する。AdCMVLacZ細胞（5×10⁷PFU）を、Fab-FGF2（1.9 4μg）と、またはなしで、20μlHBS中、室温で30分プレインキュベーションする 。次いで、ベクターまたはベクター-Fab-FGF2複合体を、感染培地で希釈し、そ して最終容量200μlで、１細胞あたり5または50PFUのいずれかのMOIでSKOV3.ipl 細胞とともにインキュベートする。30℃で1時間のインキュベーションの後、感 染培地を吸い出し、細胞をPBSで洗浄し、そして3mlの完全培地を各々のウェルに 添加する。β-ガラクトシダーゼの発現を、感染24時間後に標準的な手順に従っ て発色基質X-galを用いて染色することにより測定する。細胞を、PBSで２度すす ぎ、そして0.5％グルタルアルデヒドで37℃、10分間固定する。次いで、細胞を1 mM MgCl₂を含むPBSで15分間、２度洗浄し、その後細胞を、5mM K₃FE(CN)₆、5mM K₄Fe(CN)₆、1mM MgCl₂、および1mg/ml X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル -β-D-ガラクトシド；Sigma）を含むPBS溶液で染色する。X-gal溶液を除去した 後、細胞を70％グリセロールの上に重層し、そして4℃で保存する。 ４．インビトロ生存実験 6〜8週齢の雌性マウスを、National Cancer Animal Program（Frederick，MD ）から入手し、０日目に2×10⁷のSKOV3.ipl細胞の腹腔内注射を受容させた。生 存への効果を研究するために、腫瘍細胞を有するコントロール群が5匹のマウス しか含まない以外は、マウスを10動物からなる10の群に分ける。5日目に、処置 した群に2×10⁸もしくは2×10⁹PFUのAdCMVHSV-TK単独またはFGF2と複合体化した AdCMVHSV-TKで腹腔内注射する。48時間後、群の半分をガンシクロビル（50mg/kg 体重）の腹腔内注射で14日間処置する。マウスを，生存について毎日モニターす る。次いで、コントロールと実験群との間の生存の違いを比較し、ログ階級付け 検査（log-rank test）を使用して統計学的な違いを分析する。 Ｂ．結果と考察 ¹²⁵Ｉ標識FGFを用いる結合研究を、標的卵巣ガン細胞株SKOV3.iplがFGFレセプ ターを有することを確認するために最初に行う（データ示さず）。次いで、SKOV 3.iplの感染が１細胞あたり50プラーク形成単位（pfu）の感染多重度（MOI）の 単一層を呼ぶのに先立ち、ホタルルシフェラーゼ（Herzら、PNAS USA 90:2812-1 6(1993)）を発現するE1、E3欠損Ad5ベクターであるAdCMVLucを、結合体化されて いない抗ノブFabフラグメントまたはFab-FGF2結合体と予め混合する。感染細胞 におけるルシフェラーゼ活性の発現を、感染後24時間に測定する；この値は、感 染するウイルス粒子の数に正比例する。 図１２は、Fab-FGF2結合体によるAd仲介遺伝子送達の増強を例示する。AdCNVL uc（5×10⁷pfu）を、20μL HBS中で、最適用量のFabフラグメント（1.44μg）ま たはFab-FGF2結合体（1.94μg）とともに室温で30分間プレインキュベーション する。次いで、ベクターまたはベクター複合体を、DMEM/F-12＋2％FCSで希釈し 、そして、24ウェルプレート中の24,000SKOV3.ipl細胞を、50pfu/細胞のMOIで感 染させる。阻害実験を、感染の前に、ポリクローナル抗FGF2抗体（Sigma，St．L ouis，MO）を、AdCMVLuc-Fab-FGF2複合体に添加することによって行う。細胞溶 解物を、感染24時間後にルシフェラーゼ活性についてアッセイを行う。溶解物の タンパク質濃度を、データの標準化を可能にするために決定し、細胞タンパク質 1μgあたりの相対光単位（RLU）として表現する。結果は、３つの実験の平均±S D である。 図１２に示すように、AdCMVLucをFab-FGF2結合体と予め混合する場合、ルシフ ェラーゼ活性のレベルは、非改変ベクターによって達成された活性の9倍よりも 大きい（ｐ＜0.0007）。この感染の増強は、FGF2によって特異的に仲介される； Ad-Fab-FGF2複合体による遺伝子送達は、抗FGF2抗体によって阻害される。 本発明者らは、次に、このFGF2仲介の遺伝子発現の増強は、標的細胞の感染の 大きい百分率に起因するのか、それとも、１形質導入細胞あたりのより多くの遺 伝子コピーに起因するのかの研究に努めた。SKOV3.ipl細胞単層を、β-ガラクト シダーゼレポーター遺伝子であるAdCMVLacZを有する、E1欠損Ad5ベクターで、Fa b-FGF2の存在下または非存在下で、異なるMOIで感染させる。 組織学的データは、FGF-2仲介のAd遺伝子の発現の増強がより多い百分率の標 的細胞の感染の結果であることを示す。AdCMVLacZ（5×10⁷pfu）を、Fab-FGF2（ 1.94μg）と、またはなしで20μL HBS中で、室温で30分間プレインキュベーショ ンする。次いで、ベクターまたはベクター-Fab-FGF2複合体を、DMDM/F-12＋2％F CSで希釈し、そしてSKOV3.ipl細胞を、5または50pfu/細胞のMOIで感染させる。 β-ガラクトシダーゼの発現を、感染24時間後に発色基質X-galを用いて染色する ことにより測定する。組織を、次の４つの群から試験する：Ａ：AdCMVLacZ、MOI =５；Ｂ：AdCMVLacZ-FGF2、MOI=5；Ｃ：AdCMVLacZ、MOI=50；およびＤ：AdCMVLa cZ-FGF2、MOI=50（結果示さず）。 感染24時間後、細胞を、β-ガラクトシダーゼの発現を証明するためにX-galを 用いて染色する。Fab-FGF2結合体が、ネイティブウイルスよりも標的細胞のより 大きい百分率のAd感染を仲介すること、これにより所定の多数の標的細胞の形質 導入が、ウイルスのより少ない用量によって達成されることが可能になることが 見い出される（結果示さず）。 アデノウイルスベクターは、齧歯動物および霊長類において用量依存的な炎症 応答を生じることがよく認識されている。ベクターに付随する毒性はまた、ヒト の臨床試験において観察されており、そしてこれはアデノウイルスがヒト遺伝子 治療のためのベクターとしての十分な可能性を実現することを妨げる恐れがある 。これは、インビボで遺伝子移入の所定のレベルに必要なAd粒子の数を減ずるこ と が有利であることを示唆する。それゆえに、本発明者らは、Ad感染のFab-FGF2仲 介の増強が治療的利点のために開発され得るかどうかの決定に努めた。 ヒト卵巣ガンのマウスモデルは、先に記載されたように、SK0V3.ipl細胞を用 いるSCIDマウスの腹腔内注射によって確立されている（Yuら、Cancer Research 53:891-8(1993);Rosenfeldら、J．Molec．Med．74:455-462 91996)）。５日後、 処置したマウスに２つのMOI（2×10⁸または2×10⁹pfu）で、プロドラッグ活性化 HSV-TK遺伝子を発現する、E1欠損Ad5ベクターであるAdCMVHSV-TK、またはFab-FG F2結合体と予め混合したAdCMVHSV-TKのいずれかを用いて腹腔内注射を行う。次 いで、マウスを14日間、50mg/kgのプロドラッグ、ガンシクロビル（GCV）または 等容量の無血清培地で処置する。各群で10匹の動物を調べた。これらの動物を毎 日モニターし、そして各々のマウスの生存期間を記録する（図１３）。 図１３は、生存実験における治療的利益を増大させる、HSV-TK遺伝子のAd仲介 発現のFGF2による増強の結果を示す。０日目に、総計95の6〜8週齢の雌性のSCID マウスに、2×10⁷SKOV3.ipl細胞を腹腔内接種する。５日目に、いくつかのマウ スに、2×10⁸もしくは2×10⁹pfuのAdCMVHSV-TK単独、またはFGF2と複合体化した AdCMVHSV-TKを腹腔内注射した（群あたりn=20マウス）。48時間後、各々のマウ ス群の半分（n=10）を、毎日4日間ガンシクロビル（50mg/kg体重）の腹腔内注射 で処置する。コントロール群は、ウイルスまたはGCV受容していないマウス（n=5 ）またはGCVのみで処置したマウス（n=10）からなる。マウスを毎日生存につい てモニターする。生存している動物の百分率を、腫瘍細胞接種後日数に対してプ ロットする。 予想されるように、腫瘍で処置していないマウス群を超える生存期間の有意な 増加は、GCV単独で処置されたこれらの動物に対して観察されなかった（生存中 央値＝32日間）。AdCMVHSV-TKまたはFab-FGF2と予め混合したAdCMVHSV-TKのいず れかでの注射もまた、GCVの欠落において生存における利点は付与されなかった 。しかし、ガンシクロビルでの処置を考慮すると、マウスのFab-FGF2と予め混合 したAdCMVHSV-TKでの注射は、同じ数の非改変型AdCMVHSV-TKの粒子での注射と比 較して、有意な生存期間の延長を生じることが示される。従って、10⁸pfuのウイ ルス用量が使用される場合、ネイティブなウイルス（p=0.0025）について観察さ れた３５日と比較して、Fab-FGF2と予め混合したAdCMVHSV-TKで注射したマウス の平均生存は37日である。 同様に、10⁹pfuのウイルス用量では、アデノウイルス感染の効率がFab-FGF2（ p=0.0070）により増強されると、平均生存値は36日から44日に増加される。記載 のように、非改変型ベクター（Fab-FGF2と複合体化した10⁸pfuのAdCMVHSV-TKに ついて37日対10⁹pfuのAdCMVHSV-TKについて36日；p=0.3760）と比較した場合、 等しい生存率は10倍低い用量の再指向型AdCMVHSV-TKを用いて達成される。 Fab-FGF2結合体が、細胞あたりより多い遺伝子コピーを生成することによるよ りむしろ、より多い割合の細胞の感染を許容することにより、Ad感染を増強した という事実は、本治療用様相の重要な特性である。HSV-TK/GCVの抗腫瘍効果が細 胞あたりのHSV-TK酵素レベルの増加による、と単純に議論し得ないことが報告さ れている（Elshamiら、Cancer Gene Therapy 4:213-221(1997)）。ヒト乳癌のマ ウス腹水症モデルのHSV-TKのAd媒介性遺伝子送達を調べるYeeらによる研究にお いて、３倍高いウイルス用量が生存率を増加させる試みにおいて使用される（Hu man Gene Therapy 7:1251-7（1996））。しかし、彼らは代わりに、より高い用 量が相当の毒性およびより高い死亡を導くことを見出した。 対照的に、本発明者らは酵素を発現する細胞の数を増加させることにより、HS V-TK/GCV系の効率を増強させ得た。従って、これらの結果は、インビトロにおい て観察されるAd感染におけるFab-FGF2媒介性の増強により、インビボでの有意な 治療効果を得たことを実証した。HSV-TK遺伝子の卵巣腫瘍細胞への増強されたAd 送達は、等量のネイティブなベクターと比較して宿主生存の増加を生じた。さら に、増強したAd感染は10倍低い用量のAdCMVHSV-TKを用いて、等価な治療効果を 可能にした。従って、治療的に有意なレベルの遺伝子の移動を可能にする一方、 多数のウイルス粒子に関連する毒性を最小限にすることによって、前述の実施例 は、組換えAdベクターの感染効率を増強するストラテジーが一般的な臨床利用の ものであり得ることを示唆する。 実施例６ ADV と比較した再標的化されるFGF2-ADV複合体の免疫原性の評価 アデノウイルスベクターは特定の免疫応答を活性化することが示されている。 宿主免疫応答は、ファイバーノブタンパク質を含むアデノウイルスタンパク質に 特異的である。FGF2-再標的化Adは、抗ウイルス免疫応答を鈍くするかまたはブ ロックするためのストラテジーとして使用される。 アデノウイルスの免疫原性を評価するため、マウスを１×10⁹pfuのアデノウイ ルス単独またはFGF-2再標的化アデノウイルスで処置する。また、FGF-Fab対アデ ノウイルスの比は本実験においては変化させる。各グループにおける動物の総数 との４つのグループの計は、10または13である。グループ１の動物は、腹腔内投 与によって与えられた、200μlの賦形剤（25nM Tris pH7.5、100mM NaCl、10mg/ mlラクトース）を受けた。グループ２は、腹腔内にアデノウイルス単独を200μl 中１×10⁹pfuで受けた。グループ３は、FGF2-再標的化アデノウイルスを、１×1 0⁹PFU/200μlで30:1のFGF2-Fab対アデノウイルスノブ比で腹腔内注射を受けた。 グループ４は、FGF2-再標的化アデノウイルスを300μあたり１×10⁹pfuで、2000 :1のFGF2-Fab対アデノウイルスノブ比で腹腔内注射を受ける。マウスは体重をチ エッタし、そして週２回測定される。 腹腔内注射後21日目に、血液サンプルを４つのグループ各々からの５匹の動物 から回収する。血液サンプルをエッペンドルフチューブに入れ、そして凝塊させ る。サンプルを遠心分離して、血清を回収する。血清サンプルはアデノウイルス タンパク質、特にアデノウイルスノブタンパク質に対する抗体を生成するために ELISAでアッセイする。 Ａ．ELISA アッセイ １．アデノウイルスELISA マイクロタイタープレート（96ウェル）をアデノウイルス（１ウェルあたり10 0μl中３×10⁸pfu）でコーティングし、そして室温で一晩インキュベートする。 ウェルをPBSで３回リンスし、次いでPBS＋10％ヤギ血清で室温で２時間の間ブロ ックする。ウェルを３回リンスし、続けて1:50の希釈で一次抗体を添加する。室 温で30分後、ウェルをPBSで３回リンスし、続けてアルカリフォスフアターゼ抗 マウス二次Igを添加する。30分後、ウェルをTBS（Tris緩衝化生理食塩水）でリ ンスし、続けてPNPP基質を添加する。呈色反応を60分間生じさせる。 ２．アデノウイルスノブタンパク質ELISA マイタロタイタープレート（96ウェル）を１ウェルあたり100μl中100ngのノ ブタンパク質でコーティングし、そして室温で一晩インキュベートする。ウェル を３回PBSでリンスし、次いでPBS+10％BSAで室温で２時間の間ブロックする。ウ ェルを３回リンスし、続けて1:50の希釈で一次抗体を添加する。室温で30分後、 ウェルをPBSで３回リンスし、続けてアルカリフォスファターゼ抗マウス二次Ig を添加する。30分後、ウェルをTBSでリンスし、続けてPNPP基質を添加する。呈 色反応を60分間生じさせる。 Ｂ．結果 図14は賦形剤、アデノウイルスまたはFGF-Fab:Ad結合体の単回注射21日後での 抗体反応を示す。光学密度（O.D.）×10³を縦軸にプロットし、一方、賦形剤、A d、またはFGF-Fab:Ad結合体の単回注射に対応するデータ点を横軸に確認する。 白四角、丸、および菱形は抗アデノウイルスタンパク質反応に対応し、一方黒四 角、丸、および菱形は抗ノブタンパク質反応に対応する。 示されるように、賦形剤で処置された動物は、33光学密度単位の中央反応で14 〜43の範囲のバックグラウンド反応を有した。アデノウイルスで処置された動物 は、アデノウイルスタンパク質に強い反応を発症した。反応は、808光学密度単 位の中央反応で1180〜667で変化した（図14を参照のこと）。FGF2-再標的化アデ ノウイルスから（2000:1のFGF2-Fab:Ad比で）生成された抗体反応は有意に減少 した。反応は175光学密度単位の中央で556〜38で変化した。 ノブタンパク質由来の反応の割合を決定するため、全ての処置群から生成され た抗血清をノブのELISAによって分析する。賦形剤で処置した動物は24光学密度 単位の中央反応で28〜21で変化するバックグラウンド反応を有した。図14はまた 、アデノウイルスで処置した動物が559光学密度単位の中央反応で582〜412の範 囲のノブタンパク質に対する有為な反応を有することを示す。FGF2-再標的化ア デ ノウイルスから（2000:1のFGF2-Fab:アデノウイルス比で）生成された抗体反応 は有意に減少される。反応は、34光学密度単位の中央で422〜24で変化する。 それゆえ、FGFレセプターと反応性であるポリペプチドを用いたウイルスベク ターの再標的化は、えり抜きの遺伝子の送達および発現をを増強させる状況のみ ではなく、ウイルス性ベクターの免疫原性を減少させるのに実行可能なストラテ ジーである。このような再標的化ベクターは、治療の状況に置いてこのようなベ クターを投与される個体において、抗体反応を刺激する可能性を減少させるとい う点で、全身的な治療効果を生成するのにより有用であり得る。 実施例７ 血管内皮細胞および平滑筋細胞に対する増強された遺伝子送達 血管病理学の分子学的基礎の迅速に拡がる知識に基づき、治療的遺伝子の血管 系への送達は多くの疾患の治療に対する合理的なアプローチである。示唆されて いる特定のアプローチは、アテローム性動脈硬化症、血管形成に続く冠動脈再狭 窄、末梢血管疾患および肺性高血圧症ならびに新血管新生関連腫瘍増殖を含む（ Finkel Tら、FASEB J.1995;9(10):843-851;Gibbons GHら、Science.1996;272(52 62):689-693;Nabel EG、Circulation.1995;91(2):541-548;Isner JM、ら、Hum G ene Ther.1996;7(8):989-1011;Isner JM、ら、Lancet.1996;348(9024):370-374; Rios CD、ら、Arterioscl Thromb Vasc Biol.1995;15(12):2241-2245;Rodmen DM 、ら、Am J Respir Cell Mol Biol.1997;16(6):640-649;Muller DW、ら、Circ R es.1994;75(6):1039-1049）。 これらの障害の性質は、有効な遺伝子治療ストラテジーが直接インサイチュ遺 伝子送達に基づかねばならない事を必要とする。従って、任意の提案されたアプ ローチは、インビボで細胞を標的する適した遺伝子送達を達成し得るベクタービ ヒクルに依存する。近年の利用可能なベクター系のうち、アデノウイルスは、イ ンビボでの適応に対して見込みのあるベクターにする多数の特性を有し（Brody SL、ら、Ann N Y Acad Sci.1994;716:90-101）、そして血管性疾患についての多 数の遺伝子治療アプローチがこれらのベクターを使用するモデル系において開発 されている（Rios CD、ら、Arterioscl Thromb Vasc Biol.1995;15(12):2241-22 45;Rodman DM、ら、Am J Respir Cell Mol Biol.1997;16(6):640-649;Muller DW 、ら、Circ Res.1994;75(6):1039-1049;Harrell RL、ら、Circulation.1997;96( 2):621-627;Lemarchand P、ら、Circ Res.1993;72(5):1132-1138;Steg PG、ら、 Circulation.1994;90(4)1648-1656;Rade JJ、ら、Nat Med.1996;2(3):293-298;F eldman LJ、ら、J Clin Invest.1995;95(6):2662-2671）。しかし血管系におい て、相対的に低いレベルのアデノウイルスに対する細胞性レセプターが存在する 場合（Wickham TJ、ら、J Virol.1996;70(10)6831-683）、高レベルの遺伝子送 達を達成するために必要とされるウイルス粒子の濃度は、直接的な細胞毒性効果 に関連する（Schulick AH、ら、Circ Res.1995;77(3):475-485;Schulick AH、ら 、Circulation.1995;91(9)2407-2414）。 ウイルス毒性は使用されるウイルスの用量に直接的に関連するので（Schulick AH、ら、Circ Res.1995;77(3):475-485;Crystal RG、ら、Nat Genet.1994;8(1) :42-51）、それゆえ低容量のウイルスを用いる適したレベルのトランスフェクシ ョンを達成する利点である。血管細胞上で非常に発現される別のレセプターに対 するアデノウイルス感染を標的化することは、従って、このゴールを達成するた めに適切な方法であるようである。 アデノウイルスの屈性が再標的化ストラテジーを用いて変更され得ることが、 本明細書中上記に示されている。概念の証拠として、アデノウイルスのファイバ ーノブドメインに対する中和抗体のFabフラグメント（Louis N、ら、J.Viol.199 4;68(6):4104-4106;Henry LJ、ら、J Viol.1994;68(8):5239-5246）（これは近 年同定された細胞性アデノウイルスベクターに結合する（Bergelson JM、ら、Sc ience.1997;275(5304):1320-1323、Tomko RP、ら、Proc Natl Acad Sci USA.199 7;94(7):3352-3356;Hong SS、ら、EMBO J.1997;16(9):2294-2306））は、葉酸に 結合される（Douglas JT、ら、Nat Biotech.1996;14:1574-1578）。次いで、こ の結合体を使用して、特に葉酸レセプターを介したアデノウイルス感染を再標的 化する（Douglas JT、ら、Nat Biotech.1996,14:1574-1578）。 次いで、類似のストラテジーを使用して、標的リガンドとして塩基性FGF（FGF 2）を用いて、線維芽細胞成長因子（FGF）レセプターに対するアデノウイルス感 染を指向する（Goldman CK、ら、Cancer Res.1997;57(8):1447-1451）。このア プローチを使用して、カポージ肉腫細胞の形質移入能力（これは低レベルのアデ ノウイルス性ファイバーレセプターを有するが、高レベルのFGFレセプターを有 する）は非常に増強される。このアプローチの合理的な拡大として、本研究にお いて本発明者らは、血管遺伝子送達に対する標的化リガンドとしてFGF2を使用す ることを、血管細胞がFGFレセプターを発現するという知識を利用して、選択し た（Asahara T、ら、Circulation.1995;92(9補遺):11365-371;Sosnowski BA、ら 、J Biol Chem.1996;271(52):33647-33653）。この方法において、本発明者らは 血管内皮および平滑筋細胞に対する遺伝子送達の有意な増強を達成し得、それゆ え、低濃度のウイルス粒子を用いて達成される、所定のレベルの遺伝子発現を可 能にし得る。従って、本ストラテジーは、毒性を生じる濃度以下でのウイルス濃 度での効率的なインビボ遺伝子送達を可能にすることによって、最終的にアデノ ウイルスベクターの臨床的利用を改善し得る。 A.方法 １．細胞培養 ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）の初代培養物を、F.M.Booyse博士の研究室（Uni versity of Alabama at Birmingham，Birmingham,AL）から得る。これらの細胞 を、以前に記載されるように（Booyse FMら、Blood．1981;58:788-796）臍帯か ら得、そして10％心臓非動化ウシ胎児血清（FBS；Hyclone Laboratories,Logan, UT）、ペニシリン（100 I.U./mL；Cellgro）、ストレプトマイシン（69mmol/L； 100mg/mL；Cellgro）、グルタミン（２mmol/L；Cellgro）、ヘパリン（10U/mL； Elkins-Sinn Incorporated,Cherry Hill,NJ）、インシュリン（1.4mmol/L；10mg /mL）、トランスフェリン（0.13mmol/L；10mg/mL）、および亜セレン酸ナトリウ ム（0.06mmol/L；10ng/mL）（Becton Dickson Labware(Bedford,MA)からITSスト ックとして購入）、および内皮マイトジェン（0.1mg/mL；Biomedical Technolog ies,Stoughton,MA）を含む、培地199（Cellgro,Herndon,VA）における１％ゼラ チンコーティングにおいて増殖させる。 ヒト冠状動脈内皮細胞（HCAEC）の初代培養物を、Clonetics Corporation（Wa lkersville,MD）から購入し、そしてEGM-2MV補充物（FBS（５％）、ヒドロコル チゾン、ヒト線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、R3-インシュリン成長因 子-1、アスコルビン酸、ヒト内皮成長因子、ゲンタマイシン、およびアンホテリ シン）を含むEBM-2培地（Clonetics Corporation）における１％ゼラチンコーテ ィングにおいて増殖させる。 ヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC）の初代培養物を、アメリカンタイプカルチャ ーコレクション（Rockville,MD）から得、そして10％心臓非動化FBS（Hyclone） 、グルタミン（２mmol/L）、内皮マイトジェン（0.02mg/mL，Biomedical Techno logies）、インシュリン（1.4mmol/L；10mg/mL）、トランスフェリン（0.13mmol /L、10mg/mL）および亜セレン酸ナトリウム（0.06mmol/L、10ng/mL）（Becton D ickson Labware）を含むハムF12倍地（Cellgro）における未コートのフラスコに おいて増殖させる。 全ての細胞を、５％CO₂を含む湿潤雰囲気下において37℃にて維持する。 ２.アデノウイルスベクター サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ を発現する組換えE1A欠失アデノウイルス（AdCMVLuc（Herz Jら、Proc.Natl.Aca d.Sci.USA.1993;90(7):2812-2816））を、許容性293細胞株において増殖させ、 ２つの塩化セシウム勾配を通して遠心分離することによって精製し、そして標準 的な技術によって293細胞においてプラーク力価測定する（Graham Fら、Methods in Molecular Biology.第７巻-Gene Transfer and Expression Techniques．Cl ifton,NJ:Humana Press;1991:109-129頁）。サイトメガロウイルスプロモーター の制御下でESCherichia coliβガラクトシダーゼを発現する組換えE1A欠失アデ ノウイルス（AdCMVLacZ）を、上記のように調製する。無関係のウイルス（AdAmp g（これは、レトロウイルスパッケージング機能についての遺伝子をコードする ）を、ガラクトシダーゼ実験におけるコントロールとして使用する。 ３．1D6.14 Fab-FGF2 結合体 Fab-FGF2を、組換えFGF2（Lappi DAら、Anal Biochem.1993;212(2):446-451） をアデノウイルス血清型５ノブ（knob）領域に対して作製された中和モノクロー ナル抗体のFabフラグメント（ID6.14）と結合体化させることによって構築する （Douglas JTら、Nat Biotech.1996;141574-1578）。結合体化手順および続く結 合体のFabおよびFGF2成分の活性の確認は、他の場所に記載されている（Goldman CKら、Cancer Res.1997;57(8):1447-1451）。簡単には、結合体化を、N-スクシ ンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピネート（SPDP；Pharmacia,Uppsala,Swed en）を用いて行い、つづいてヘパリン-SepharoseおよびSepharose S-100カラム クロマトグラフィー（Pharmacia）を用いて精製する。得られる結合体の質量分 析は、Fab対FGF2の1：1のモル比を示した。FabおよびFGF2成分の活性を、酵素結 合型イムノアッセイおよび細胞増殖アッセイによって確認する。簡単には、ELIS Aプレートを、組換えアデノウイルスノブタンパク質でコートし、Fab-FGF2結合 体をプレートに適用し、次いで結合した結合体を、抗FGF抗体を用いて検出する 。結合体のFGF活性を、ウシ内皮細胞を用いる増殖アッセイで確認する。 ４．アデノウイルス感染 FGF2再標的化の効果を適切に評価するために、本発明者らは、ネイティブのウ イルス親和性を同時に除去し、そしてFGF2による感染を再指向することを目的と した。それゆえ、予備実験を行い、これを達成する至適なFab−FGF2対アデノウ イルス比を決定する。最初に、ネイティブのレセプターによる感染をブロックす るのに必要なFabの用量を、力価測定によって決定する。感染を最大にブロック した（ウイルスの全てのFab結合部位が満たされることを意味する）Fabの最低用 量を、ルシフェラーゼアッセイ（以下を参照のこと）によって決定し、そして続 く計算のための規準として選択する（データは示さず）。次いで、本発明者らは 、同じモル比のFab-FGF2対ウイルスを、結合体が1：1比のFab:FGF2を含んだとい う事実に基づいて、至適なFab対ウイルス比として使用した。トランスフェクシ ョンの分析のために、細胞を、トリプシン処理によって回収し、トリパンブルー 排除によって生存率について評価し、そして１ウェルあたり24,000細胞の密度で 24ウェルプレートにプレートする。 24時間後、細胞をアデノウイルスベクターに感染させる。AdCMVLuc（1ml中５ ×10⁶プラーク形成単位（pfu）HEPES緩衝化生理食塩水（HBS；150mmol/L HEP ES、20mmol/L NaCl、pH7.8）でのストックからの希釈物）を、1.5mLポリプロピ レン微量遠心管において、Fab（0.2mg）またはFab-FGF2（0.27mg）と混合し、そ して全容量５mlにおいて、室温にて30分間インキュベートする。異なる濃度のウ イルスを使用する実験のために、FabまたはFab-FGF2の量を、一定の割合を保つ ように調整する。ブロッキング研究のために、２mlのウサギポリクローナル抗FG F抗体Sigma Chemical Co）または10mgの可溶性組換えFGFレセプター細胞外ドメ イン（Austral Biologicals,San Ramon,CA）を管に添加し、そして続いて室温に て30分間さらにインキュベートする。 感染の直前に、各混合物の容量を、２％FBS、グルタミン、ペニシリン、およ びストレプトマイシンを含む暖めた（37℃）DMEM/F12（50：50）培地（Cellgro ）で350mlにする。過剰のFGF2でのブロッキングを、（結合体における量と比較 して）100倍過剰の遊離FGF2と共に、30分間細胞を予めインキュベートすること 、ならびに感染培地においてFGF2のこの量を含むことによって行う。ヘパリンと のブロッキングを、感染培地において500U/mlの濃度（すなわち、HUVEC増殖培地 におけるヘパリンの濃度と比較して50倍過剰）を用いることによって行う。完全 に培地を細胞から除去し、そしてウイルス含有培地（三連のウェルあたり100ml ）と置き換える。トレイを、37℃にて５％CO₂雰囲気において１時間インキュベ ートし、次いで感染培地を吸引し、細胞をDulbeccoリン酸緩衝化生理食塩水（D- PBS,Cellgro）で１回穏やかに洗浄し、そして500mlの適切な完全培地をウェルに 添加する。細胞をさらに24時間インキュベートし、次いでルシフェラーゼレポー ター遺伝子発現をアッセイする。 ５．ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼ発現を、ルシフェラーゼアッセイ系キット（Promega,Madison WI）を用いて、製造業者の説明書に従って分析する。簡単には、培地を細胞から 吸引し、細胞をPBSで洗浄し、次いでPromega細胞溶解緩衝液に溶解させる（１ウ ェルあたり100ml）。溶解物の20マイクロリットルを、100mlのPromegaルシフェ ラーゼアッセイ試薬に添加し、そして相対光単位（RLU）の決定を、較正したBer thold照度計を用いて、RLU読み出しが系の直線範囲内であることを確認する。 ６．βガラクトシダーセアッセイ βガラクトシダーゼ遺伝子発現の分析のために、AdCMVLacZを、AdCMVLucにつ いて記載された様式においてFabまたはFab-FGF2と複合体化し、次いで細胞を上 記のように感染させる。βガラクトシダーゼ活性を、48時間後に評価する。培地 を細胞から除去し、そして細胞をPBSで一回洗浄し、次いで0.5％グルタルアルデ ヒドで10分間固定する。10mM塩化マグネシウムでの2回の洗浄の後、細胞を１mg/ mL X-gal（GibcoBRL,Grand Island NY）を含む溶液を用いて、室温にて暗所にお いて一晩染色する。ネガティブコントロールは、未感染細胞の染色および無関係 のウイルス（AdAmpg）に感染させた細胞の染色を含んだ。全細胞に対する染色さ れた細胞の数を、３つのランダムな高出力（100×）視野で計数する。 βガラクトシダーゼ発現もまた、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）分析に よって評価する。これらの実験のために、細胞を、１ウェルあたり100,000細胞 で６ウェルプレートにプレートし、次いでアデノウイルス単独またはアデノウイ ルスFab-FGF2複合体（上記のように調製した）で感染させる。48時間後、細胞を トリプシン処理により採取し、10mmol/L HEPES、D-PBS中４％FCSの溶液（染色培 地ともいわれる）に、100ml中100,000細胞で、６mL FACS管に再懸濁する。細胞 懸濁物を、10分間37℃にて暖め、100mlの２mmol/Lフルオレセインジガラクトピ ラノシド（FDG；Sigma Chemical Company）を添加し、次いで反応を、１分後に5 00mlの氷冷染色培地、次いで500ml冷２％パラホルムアルデヒドの添加で停止さ せ、つづいてBecton-Dickinson FACScaliber機器を用いて分析する。 7．トリチウム化アデノウイルス結合アッセイ ³H-標識化アデノウイルスを使用した結合アッセイは、記載(Wickham TJら、JV irol.1996;70(10):6831-6838)のように実行した。手短に言えば、細胞は、バー シーン(Versene;GibcoBRL)を含むコンフルエントな80cm²フラスコから採取、そ して1mlあたり10⁷細胞の密度で再懸濁する。³H-AdCMVLuc(10,000cpm、１粒子あ たり1.5×10^-5カウントの比活性)を、上記のように、Fab、Fab-FGF2もしくはFab -FGF2+抗FGF抗体でインキュベートし、次いでDulbecco改変Eagle培地(DMEM; Cellgro)、10mmol/L HEPES、1mmol/L塩化マグネシウムの最終容量200ml中の10⁶ 細胞に加える。細胞懸濁液を１時間４℃で振とうし、4mlの冷D-PBS/0.1%ウシ血 清アルブミンで洗浄し、次いで1500rpmで10分間遠心分離した。細胞ペレットを2 00ml D-PBS/0.1%ウシ血清アルブミンに再懸濁し、そしてシンチレーションカウ ンター(Packard,1900TR液体シンチレーション分析機)でカウントするためにシン チレーション液5mlに移す。 8．FGF レセプターについてのFACS分析 HUVECを、トリプシン処理によって採取し、冷(5℃)D-PBSで２回洗浄し、次い で氷上で30分間1%パラホルムアルデヒドで固定した。冷D-PBSで２回洗浄した後 、細胞をD-PBSに再懸濁し(100ml中200,000細胞)、次いでFGFレセプターに対する モノクローナル抗体(EcR6,PRIZM Pharmaceuticals,San Diego CA)を最終濃度50m g/mlに添加し、そして氷上で30分間インキュベートする。この抗体は、それが認 識するエピトープが、記載した４つすべてはFGFレセプターによって共有される 領域にマッピングされているので選択された。コントロールは、マウスIgG(Sigm a)および一次抗体なしから成った。D-PBSで２回洗浄した後、ヤギ抗マウスFITC 標識２次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.,West Grove PA)を、 D-PBS中1:100希釈で氷上で30分間適用し、次いで細胞をD-PBSで２回洗浄し、1% パラホルムアルデヒドに再懸濁し、そしてBecton-Dickson FACScaliber machine を使用して分析する。 9．統計分析 異なるベクター群間の比較を、p<0.05で有意性を認め、単一因子ANOVAおよびS tudentのt-検定を使用して行った。 B．結果および考察 1.アデノウイルスのFGF2再標的化は、HUVECにおける遺伝子発現を増強する アデノウイルスは、血管系へのインサイチュ遺伝子送達のための見込みのある ベクターである。しかし、インビボにおける血管細胞の高レベルの形質導入の達 成は、ウイルスの高濃度における標的細胞の細胞傷害性によって限定される。従 って、本発明者らは、所定レベルのトランスフェクションを達成するために必要 なアデノウイルスベクター濃度を減少できるストラテジーを開発することを目的 とした。血管細胞のネイティブなアデノウイルスレセプターのレベルが比較的低 いために、増強した遺伝子送達は、血管細胞で発現した別のレセプター、FGFレ セプターにアデノウイルスに感染を標的化することによって達成し得ると仮定す る。この可能性を探索するために、HUVECを、AdCMVLuc単独で、または再標化結 合体と共にウイルスをインキュベートした後のAdCMVLucでトランスフェクトする 。再標的化結合体は、アデノウイルスファイバーノブドメインに対する中和抗体 のFabフラグメントにFGF2を結合することによって形成する。ウイルスのFabの結 合を確認するためのコントロールとして、細胞はまた、Fab単独と共にインキュ ベートしたウイルスで感染される。24時間後、感染ウイルス粒子の数に比例する 、ルシフェラーセレポーター遺伝子発現を評価する。AdCMVLucでのトランスフェ クションは、1D6.14 Fabによって87±3%(３つの実験の平均±SD)抑制される。こ のことは、したがって、これらの実験においてアデノウイルスノブのFab結合の 安定性を確認する。アデノウイルス-Fab-FGF2複合体でのトランスフェクション は、ウイルス単独での感染と比較して、ルシフェラーゼ発現の32.4±6.6倍の有 意な増強を生じた(３つの実験の平均±SD。図15A)。遺伝子発現の実質的な改善 は、アデノウイルス媒介遺伝子送達がFGFを介して標的化することにより増強さ れ得るという仮説を支持した。この効果がFGFによって媒介されるが本当の再標 的化に起因することを確認するさらなる実験を、次に行う。 2．増強遺伝子発現は、細胞へのAdの増加した結合によって介在される アデノウイルス媒介は、遺伝子送達の増強がFGF2によって特異的に媒介されて いるかを調査するために、Fab-FGF2再標的化ウイルスを、HUVEC感染に先行して 、FGFに対するポリクローナル抗体、過剰な遊離FGF、またはヘパリン(FGFに結合 する)と共にインキュベートする。トランスフェクションは、これらの試薬のそ れぞれによって、それぞれ82±4%、41±29%、および97±0.6%(３つの実験の平均 ±SD)に阻害され、このことは、増強がFGF2を介して特異的に媒介されることを 確 認する(図15B)。 別の実験において、77%±4%の抑制(３連の測定の平均±SD)はまた、可溶性FGF レセプターと共にアデノウイルス-Fab-FGF2複合体をインキュベートすることに よって観察される(データは示さず)。重要なことに、ヘパリンおよび過剰FGFは どちらもアデノウイルス単独によるトランスフェクションに何らの効果も有さな かった。アデノウイルス-Fab-FGF2複合体で観察される増強の、本発明者らが提 案したように、アデノウイルス結合における変化、またはFGF2自体の刺激効果の いずれかに起因し得るということが理論的に可能であるが、過剰遊離FGF2での増 強の欠如は、この場合後者ではないことを示唆した。 しかし、この問題により具体的に答えるために、細胞を、アデノウイルスに単 独または再標的化に使用した結合体の容量に含まれる遊離のFGF2の等モル量の遊 離のFGF2存在下において感染される。結果は、遊離FGF2単独のこの用量がアデノ ウイルス形質導入に全く影響しなかったいことを示す(図15C)。それゆえ、観察 された増強場面は、FGF2の刺激効果には起因しない。Fab-FGF2を用いて観察され た形質導入の増強が、増強されたアデノウイルス結合に起因することを確認する ために、³H標識アデノウイルスと用いる結合アッセイを実施する。このアッセイ を、コンフルエントな75cm²フラスコから採取したHUVECを使用して実行する。結 果は、ウイルス単独と比較して、ウイルスがFab-FGF2と複合体化した場合の、HU VECに対する放射標識ウイルスの結合の増強を示す(図15D)。まとめると、これら の結果は、観察された遺伝子発現増強が、FGF2を介して再標的化された場合、ア デノウイルス結合の増加した結合に起因するようであることを確認した。このよ うに、これらの知見は、内皮細胞の形質導入が、異種レセプターを介してAdを標 的化することによって改善し得るという仮説を支持する。 3. FGF2 再標的化は、冠動脈内皮細胞および血管平滑筋細胞におけるAd媒介遺 伝子発現を増強する 増強血管遺伝子送達のためのアデノウイルスのFGF2再標的化の可能性をさらに 探索するため、および本発明者らがHUVECに特異的でないと記載した効果を確認 するために、本発明者らは、ヒト冠動脈内皮細胞およびヒト大動脈平滑筋細胞の 初代培養への遺伝子送達に対するFGF2の再標的化の効果を調査した。細胞を以前 に記載されたように３連で感染させ、そして３つの実験がそれぞれについて実行 される。 これらの細胞の形質導入は、Fab-FGF2によって顕著に増強される。内皮細胞の 結果は、アデノウイルス単独と比較して4.55±1.3倍(平均±SD、p<0.01)の増強 を示し、平滑筋細胞において92.6±2.6倍(平均±SD、p<0.01)のなおより大きな 増強を示した(図16A-B)。これらの知見は、アデノウイルス感染のFGF2再標的化 が、関連する血管細胞の遺伝子送達を増強するために有用なストラテジーである というさらなる証拠を提供する。 4．アデノウイルスのFGF2再標的化は、アデノウイルス用量の減少を可能にする 主要な目的は、細胞傷害性を避ける方法としてアデノウイルス用量を減少させ るための手段を提供することであるので、本発明者らは、次に、FGF2再標的化に より観察される遺伝子発現増強が、同じレベルのトランスジーン発現を達成する ために必要なウイルスの減少を可能にする証拠を追求した。HUVECを、Fab-FGF2 と共にまたは伴なわずに10、50、または100pfu/細胞の用量でAdCMVLucに感染さ せる。 24時間後に行ったルシフェラーゼアッセイは、ウイルス単独が使用されたとき 100pfu/細胞で観察されるように、FGF2再標的化と共に10pfu/細胞を使用して、 およそ同等レベルの形質導入を示した。しかし、本発明者らは、FGF2再標的化で 見られる増強ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現が、恐らく、１細胞あたりの より多くの発現、またはより多数の形質導入細胞、あるいはその両方のいずれか に起因し得ると認識した。それゆえに、形質導入細胞の数を、Fab-FGF2と共にま たは伴なわずにAdCMVLacZで感染させ、そして細胞の染色および計数によってβ- ガラクトシダーゼを評価することにより決定する。 これらの実験は、Fab-FGF2再標的化を使用した時、同じ用量のウイルスに対し てより多くの数の形質導入細胞を示す(データを示さない)。HUVECを使用して集 められたデータは、50pfu/細胞の非改変アデノウイルスでのトランスフェクショ ンが、同じ濃度のウイルスとFGF2再標的化で100%まで増加する、10%のトランス フェクション効率に導くことを示した。平滑筋細胞について、相対的増強はさら により大きく、FGF再標的化で非改変ウイルスによる1%未満のトランスフェクシ ョン効率は、FGF再標識化で100%まで増大する。 分析はまた、Fab-FGF2と共にまたは伴なわない10、50または100pfu/細胞のAdC MVLacZでの形質導入を評価し、続いてFDG染色およびFACS分析することによって 行う。この分析は、100%形質導入が、アデノウイルス単独で達成されても、FGF2 再標的化が１細胞あたりの発現量の増加ならびに形質導入細胞の数の増加の両方 を生じたことを確認する(データを示さない)。これらの実験は、FGF2を介して再 標的化された場合に、ウイルスの低用量は同程度のレポーター遺伝子発現を達成 し得ることを確認し、そしてこの効果がウイルス用量の所定の範囲にわたって生 ずることを示す。 5. FGF 再標的化による遺伝子送達の増強は増殖細胞においてより大きい 本発明者らは、インビボでの増殖および組織傷害(Casscells Wら、Proc Natl Acad Sci USA.1992;89(15):7159-7163;Yamada Kら、Acta Neurochirurgica Supp lementum.1994;60:261-264;Lindner Vら、Circ Res.1993;73(3):589-595)ならび にインビトロでの器官培養(Daley SJら、Am J Pathol.1996;148(4):1193-1202) の場面においてアップレギュレートされることが知られているレセプターに再標 的化しているので、本発明者らは、インビトロで静止細胞と増殖細胞との間にFG F2再標的化による遺伝子移入の相対的増強の何らかの検出可能な相違があるかど うか、および何らかの相違がFGFレセプター発現のレベルに相関するかどうかを 評価することを望んだ。それゆえ本発明者らは、5または10日間コンフルエント な培養物中でHUVECを維持することによってFGFレセプター発現をダウンレギュレ ートすることを試み、次に24時間だけ非コンフルエント培養物中にあった細胞で 見られる結果と、これらの細胞におけるFGF2再標的化の効果とを比較した(上記 のように)。 コンフルエントな培養物を、24ウェルプレートにおいて１ウェルあたり24,000 の細胞をプレートし、次いでこれを、さらに栄養を全く与えずに(5日まで)また は培養液を１回のみ交換して(10日間維持した細胞について5日目に)コンフルエ ンスに達成させることにより調製する。これらの条件下で、5日および10日めに 、細胞は、有糸分裂形状を全く欠くことによって証明されるような比較的静止的 に見えたが、しかし良好な生存能は維持された(良好な形態、細胞死の証拠は全 くない)。次に細胞を、FGF2再標的化を伴なってまたは伴なわずにAdCMVLucで感 染させ、新鮮完全培地をウェルに添加する。 ルシフェラーゼアッセイを、24時間後に実行する。結果を、非改変ウイルスに 感染した、同時にプレートした細胞と比較した、再標的化したアデノウイルスに 感染した細胞に見られる遺伝子発現の比として表す(データは示さない)。この場 合において、本発明者らは、培養物における延長した時間と共に、アデノウイル ス形質導入自体に影響し得る任意の因子(例えば、細胞代謝率)について補正した 。 そのデータは、培養物における累進的により長い時間と共に、FGF2再標的化の 増強効果が減少し、その結果、10日目までに、FGF2再標的化が、アデノウイルス 単独と比較しての遺伝子発現の54±6%の相対的減少を実際に導くことを示す。し かしこの時点でさえも、Fab-FGF2再標的化と伴う形質導入のレベルは、感染をFa bでブロックした時に見られるレベルよりもまだ大きい(データは示さない)。こ のことは、ある程度のFGF2再標的化感染がまだ起こっていることを示す。 一旦、FGF2再標的化ストラテジーが、細胞へのFGF2結合によって媒介されるこ とが明らかになった時、本発明者らは、インビボで静止細胞について報告された ように(Casscells Wら、Proc Natl Acad Sci USA.1992;89(15):7159-7163;Lindn er Vら、Circ Res.1993;73(3):589-595)、コンフルエントな細胞に見られた増強 の減少は、これらの細胞におけるFGFレセプター発現の相対的な減少により、少 なくとも一部説明され得るかどうかを調査しようと努めた。 これを調査するために、FGFレセプターについてのFACS分析を、急速に増殖中 の細胞および上記のようにコンフルエントな培養物に維持された細胞を使用して 実行する。本発明者らは、４つの記載したFGFレセプターサブタイプの全ての間 に共有され共通エピトープを認識するモノクローナル抗-FGFレセプター抗体(EcR 6)、およびマウスIgGと共にまたは一次抗体なしでインキュベートした細胞から なるネガティブコントロールを使用した。この技術を使用して、本発明者らは、 非コンフルエント細胞と比較して、10日間コンフルエンスに維持した細胞におけ るFGFレセプターについてポジティブに染色される細胞の比率の60%減少を検出し 得る(データは示さない)。このように、これらのデータは、公開されたインビボ の報告と一致する傾向を示し、そして再標的化遺伝子移送と標的化レセプターの 発現レベルとの間の相関についての証拠を提供する。 6．考察 本発明者らの確立された再標的化ストラテジーは、血管細胞へのアデノウイル ス媒介遺伝子送達の増加を達成さらに拡張された。所定のレベルの形質導入に必 要なウイルス濃度の減少という目的は、今や達成された。これらの知見は、アデ ノウイルスベクターが、高用量で直接的な細胞傷害効果を引き起こし得るので、 遺伝子治療の臨床実行に関連性がある(Crystal RGら、Nat Genet.1994;8(1):42- 51)。この効果は、特に血管系において明らかであり、そこでは、導入効果の劇 的な減少および血管細胞の喪失が、かなり狭い範囲のウイルス濃度にわたって見 られる(Schulick AHら、Circ Res.1995;77(3):475-485;Schulick AHら、Circula tion.1995;91(9):2407-2414)。このように、本実施例に記載したアプローチは、 細胞傷害性効果に関連するウイルスの高用量を避けながら、インビボでの高いト ランスフェクション効率を達成するための手段としての将来性を保持する。 遺伝子発現の増強を示すことに加えて、本発明者らは、これが生じる機構を調 査した。遺伝子送達の増強を、抗-FGF抗体、過剰FGF2、可溶性FGFレセプターお よびヘパリンによってブロックする。これらの知見は、明らかに、応答がFGF2に よって媒介されることを示す。加えて、本発明者らの結果は、遺伝子発現に対す る効果が、FGF2自体の潜在的刺激効果とは異なり、FGF2再標的化の場面で細胞へ のウイルスの結合の増強によることを示す。このようにこの結果は、別のレセプ ターを通じての感染の再標的化の本発明者らの目的と調和している。この知見は 、このアプローチのインビボにおける可能な有用性について重要な実際的な意味 を有する。真の再標的化機構は、FGF2刺激に基づく機構よりインビボにおいて効 果的である可能性がより高い、なぜなら、FGF2が、インビボにおいて極端に短い 半減期を有し、そして一般的に観察されるべき刺激的効果のために注入によって または持続放出処方物で与えられなければならないからである(Edelman ERら、 J Clin Invest.1992;89(2):465-473)。 細胞レセプターにFGF2を結合することは、高親和性チロシンキナーゼレセプタ ー(このうちの４つは記載されている)ならびに細胞表面上の低い親和性の結合部 位(ヘパラン硫酸)に結合する工程を含む複雑な工程である(Yayon Aら、Cell.199 1;64(4):841-848)。FGF2の生物学的応答を、最初にヘパラン硫酸に結合すること によって媒介し、次いで高親和性レセプターに結合することによってもまた媒介 し、このように３量体複合体を形成することは明白である(Roghani M，ら、J Bi ol Chem.1992;267(31):22156-22162)。FGF2再標的化における細胞へのウイルス 結合を増加する正確な機構は、すぐには明らかにならない。ある程度の形質転換 のブロックは、過剰な遊離のFGFの競合とともに見られる(これは、高親和性結合 を意味する(Roghani M,ら、J Biol Chem.1992,267(31):22156-22162))が、本発 明者らは、ヘパリンでの最も劇的なブロッキング効果を認め、これは、高親和性 結合部位および低親和性結合部位の両方とFGF2との相互作用に影響する(Guimond S,ら、J Biol Chem.1993;268(32):23906-23914)。このように、増強したウイル ス結合はFGF2によるけれども、この影響に対する高親和性結合部位および低親和 性結合部位の相対的寄与は未解決である。 多くの増殖因子レセプターと同様に、後者の群におけるアップレギュレーショ ンで、増殖または傷害細胞に対して静止状態においてFGFレセプターを差示的に 発現する(Casscells W,ら、Proc Natl Acad Sci USA.1992;89(15):7159-7163;Br others TE，ら、J Surg Res.1995;58(1):28-32;Speir E,ら、J CellPhysiol.199 1;147(2):362-373)。このように、本発明者らは、延長した期間にわたってコン フルエンスに維持した細胞、ならびに急速に増殖する細胞に再標的化するFGF2の 影響を調べた。興味深いことに、本発明者らはFACS分析により測定されるように FGFレセプター発現が見られたので、相対的増強が、培養における時間が延長さ れるにつれて減少した、FGF2再標的化に見られることを見出した。これらの知見 は、FGF再標識化が、インビボにおいて増殖または傷害細胞のためのある程度の アデノウイルスベクターの選択を可能に得るという予測を生じる。これは、、心 血管の医薬に関連する多くの治療的状況、ならびに新生物形成に関連する血管形 成において有利である。実際、Casscellsらによる研究において血管病理の部位 について選択的な標的リガンドとしてFGF2を示すためにいくつかの前例があり、 ここでは、FGFと毒素であるサポリンとの間の結合体を使用して、血管形成の再 狭窄モデルにおける平滑筋細胞の増殖を選択的に排除する(Casscells Wら、Proc Natl Acad Sci USA.1992;89(15):7159-7163)。この設定において、周囲の静止状 態細胞は、影響されず、そしてその影響は放射性リガンド結合によって証明され るようなFGFレセプターの分布と相関するように見られる。次いでFGF2-サポリン は、血管形成モデルにおいて新内膜形成を抑制することが見られ(Farb A,ら、Ci rc Res.1997;80(4):542-550)、および選択的な標的もまた、動静脈の移植片のモ デルにおいて証明される(Chen Cら、Circulation.1996;94(8):1989-1995)。しか し、このような選択性が、アデノウイルス標的の脈略において見られるか否かは 、インビボの研究を待ち受ける。 再標的化ストラテジーのためにアデノウイルスベクターを誘引性にする、イン ビボで使用するためのアデノウイルスベクターの多くの利点はまた、他の研究者 によって認識されている。Wickhamらは、最近、二重特異的抗FLAG/抗インテグリ ン抗体結合体およびペントン基部に短いファイバーおよび操作されたFLAGエピト ープを有するアデノウイルスベタターを使用した培養において、内皮細胞および 平滑筋細胞への増強された(7〜9倍)ルシフェラーゼ遺伝子送達を証明した(Wickh am TJら、J Virol.1996;70(10):6831-6838)。ノブのC末端でポリリジン残基を有 する遺伝的に改変したウイルスを使用して細胞表面ヘパラン硫酸に感染を標的化 された別のストラテジーは、このグループによって開発された(Wickham TJら、N at Biotech.1996;14(11):1570-1573)。これらのストラテジーはまた、血管遺伝 子送達のために有望であるが、インビボにおける研究が待ち受けている。本発明 者らは、以前にインビトロにおける効果的な標的化遺伝子送達を達成した、標的 化されたアデノウイルス-ポリリジン-DNA複合体の状況においてポリシジンを使 用するストラテジーを同時に開発している(Curiel DTら、Hum Gene Ther.1992;3 (2):147-154)。しかし、インビボにおける適用を、ポリリジン成分の補体を媒介 した不活性化によって制限する(Gao Lら、Hum Gene Ther.1993;4(1):17-24)。 本発明者らが本明細書に提示するストラテジーは、任意のアデノウイルス血清 型５のベクターに適用される柔軟性を提供する。加えて、本発明者らの知見は、 FGFレプター発現のレベルに基づく増殖している細胞のための選択性の可能性を 示す。潜在的なインビボ適用に関して、本発明者らは、Fabに対するアデノウイ ルスノブの結合が血流において安定であること(未発表観察、1997)、そしてFab- FGF2再標的化は、相対的増強、単純ヘルペスチミジンキナーゼ導入遺伝子への増 強した治療効果をもたらす卵巣癌のマウスモデルにおいて腹膜腫瘍へのアデノウ イルスに媒介された遺伝子送達を増強し得る(未発表の観察、1997)ことを証明す る。このように、アデノウイルスベクターのFGF再標的化は、インビボにおける 適用についての有意な見込みがある。 この数年にわたって、ストラテジーは、専門のカテーテルおよび化学的エンハ ンサーの使用を含む血管系への遺伝子送達について記述している(Feldman LJら 、Gene Ther.1997;4(3):189-198)。本発明者らがここで記述するストラテジーは 、これらのアプローチを補足し、そして直接のアデノウイルス細胞傷害性を避け る一方で、高レベルの遣伝子発現および形質導入効果の惹起の可能性を示す。こ の知見は、心血管性疾患に関する重要な関連がある。特に、高形質導入効果は、 特に血管形成再狭窄および他の増殖性血管障害について現在提示されている増殖 抑制性細胞のストラテジーに有用である。本発明者らのアプローチはまた、心筋 虚血および末梢血管疾患のための標的血管形成治療を容易にし得る。なぜなら、 特に虚血の脈略におけるFGFレセプターのアップレギュレーションについて明ら かであるからである(Yamada Kら、Acta Neurochirurgica-Supplementum.1994;60 :261-264)。このように、このストラテジーは、通常の臨床問題における重要な 影響があり得る。 実施例８ 再標的化Adを治療的ヌクレオチド配列を送達するために使用する場合、Ad感染感 受性およびAd感染耐性細胞株に遺伝子発現を増強する 前述の実施例および以下で示されるのように、遺伝子発現は、本発明の再標的 化アデノウイルスベクターが投与される細胞株において増強される。驚いたこと に、増強された遺伝子発現は、アデノウイルス感染に感受性であると理解されて いたそれらの細胞株において観察されるだけでなく；増強された発現はまた、Ad 感染に通常耐性である細胞株において観察される。 例えば、増強された遺伝子発現を、再標的化Adベクターが以下の細胞株におい て使用される場合に観察する。それぞれの場合において、略語およびそれぞれの 細胞株の細胞型を示す。 実施例９ 再標的化Adは、減少した毒性および免疫原性を有し、そして Ad 耐性腫瘍をチャレンジしたマウスにおける増強した生存を付与する アデノウイルス(Ad)は、広範囲の種々の組織へ遺伝子を送達するためのベクタ ーとして使用されてきた。インビボにおける高発現レベルを達成するにも拘わら ず、Adベクターは、治療上の可能性を制限する、抗ベクター免疫応答、一過性発 現、および正常組織毒性のような制限を示す。ネイティブの親和性を廃止し、そ して規定されたレセプターを通じてのAd取り込みを指向させるための標的化スト ラテジーは、ベクター関連毒性を減少させ、形質導入効率を増加させ、したがっ て全身投与を可能にすべきである。 標的化リガンドとして塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)を使用してAdを再標 的化することによって、Adの細胞取り込みは、罹患細胞または傷害細胞において アップレギュレートされるFGFレセプターを通じて再指向される。FGF再指向化Ad は、顕著に減少した肝毒性、肝臓トランスジーン発現、および免疫原性を示す。 FGF再標的化は、Ad耐性腫瘍を有するマウスの増強された生存を生じる、Ad感染 に対して高度に耐性である腫瘍に対する感受性を付与することによって確立され る。ネイティブなAd親和性を再指向化するためのこの広く有用な方法は、重要な 治療上の利点を提供し得る。 複製欠損ヒトアデノウイルス(主に血清型２および５)は、広範囲の種々の細胞 型における遺伝子送達のためにベクターとして使用されてきた。アデノウイルス ベクターを使用して高い発現レベルが達成されるにも拘わらず、毒性、短期間の トランスジーン発現、および免疫原性が、アデノウイルスベクターの有用性を制 限し、臨床的効力の証明を妨げてきた(Goldmanら、Cancer Res 57，1447-1451(1 997)；Wagnerら、Annu Rev Med 48，203-216(1997))。いくつかのアプローチは 、アデノウイルスのネイティブな親和性をブロックするか、ゲノムの一部の削除 により免疫原性を減少させるか、またはウイルスを目的の細胞型に標的化するか のいずれのために研究中であり、その首尾は色々である(例えば、Wickhamら、J Virol 71，8221-8229(1997)；Yangら、Proc Natl Acad Sci USA 91，4407-4411( 1994)；Morralら、Human Gene Therapy 8，1275-1286(1997)；Grahamおよ びPrevec、Methods in Molecular Biology 109-128 Humana Press，Clifton，NJ ，(1991)；ならびにRosenfeldら、1571-1580(1995)を参照)。 Ａ．材料および方法 １．材料 FGF2−抗ノブファイバーFab結合体を、本明細書に記載のように作製する(Gold manら、Cancer Res 57，1447-1451(1997)もまた参照)。FGF2-Fab(0.34mg/mL)を −80℃にてDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水(Gibco BRL，Grand Island，NY) において保存する。AdCMVHSV-TKは以前に記載されており、CMVプロモーターから HSV-TKを発現するE1欠失Ad5ベクターである。Ad5β-galをMolecular Medicine L LC(La Jolla，Ca)から入手する。Ad5β-galは、CMVプロモーターからβ-galを発 現するE1欠失E3変異ベクターである。AC2細胞は、より高いウイルス産生レベル について選択された、293細胞のクローンに由来する(Molecular Medicine，LLC) 。 ウイルスをプラーク精製し、そして個々の単離体を使用してAC2培養物に感染 させる。ウイルスを、クロマトグラフィー法を使用して精製し、CsCl調製物と等 価な感染性ウイルスを作製する。粒子数およびプラーク力価アッセイを、標準的 な方法²を使用して実行する。Ad5HSV-TKおよびAdβ-galのプラーク形成単位(pfu )をそれぞれ１mLあたり４×10¹⁰および１mLあたり９×10¹⁰であると決定する。A d5HSVtkおよびAd5β-galの粒子対pfu比を、それぞれ22.5および18.9であると決 定する。 ２．肝親和性の評価 FGF2−Adβ-galおよびAdβ-galの標的化を、雌性C57B1/6マウスにおいて評価 する。FGF2−Adβ-galまたはAdβ-galの調製には、77μgのFGF2−Fab、または等 量の0.9％NaClを、30分間室温で、２×10¹⁰pfuのAdβ-galと共にインキュベート する。０日目に、２×10¹⁰pfuのAdβ-galまたはFGF2−Adβ-galのいずれかを、 マウス１匹あたりに(30秒間にわたって)0.32mLの最終容量で静脈内投与する。こ れは、50:1モル比のFGF2-Fab対ファイバー分子になる。コントロールマウスには 、0.32mLの賦型剤(25mM Tris pH7.5，100mM NaCl，10mg/mLラクトース)を与える 。 注射後２、４、７および１２日目に、１群あたり３〜６匹のマウスを屠殺する。 トランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼの分析のために血清を集める 。肝臓を取り出し、秤量し、そして即座に液体窒素中で凍結させ、−80℃にて保 存し、次いでβ−ガラクトシダーゼ活性の定量的分析のために加工処理する。肝 臓の一部を４時間４℃にて10％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、次いでパラフ ィン中に包埋するか、またはドライアイスで予め冷却したイソペンタンを使用し てOCT中で直ぐに凍結させ、そして−80℃にて保存するかのいずれかする。 ３．β−ガラクトシダーゼ活性の組織学的測定 ８ミクロンのクリオスタット切片を、PBS(pH7.4)中の２％パラホルムアルデヒ ド、0.5％グルタルアルデヒドにおいて30分間室温にて固定する。次いで、組織 切片を、0.03％NP-40および２mM MgCl₂を含むPBS中でリンスし、そして２mM MgC l₂および0.03％NP-40を含むPBS(pH7.4)中の１mg/mLの５-ブロモ-４-クロロ-３- インドリルb-Ｄ-ガラクトピラノシド(X-Gal)(Fischer)、５mM K₃Fe(CN)₆および ５mM K₄Fe(CN)₆において37℃にて16時間インキュベートする。スライドをPBS中 でリンスし、10％緩衝化ホルマリン中で後固定し、Nuclear Fast Redで15秒間対 比染色し、脱水し、そしてマウントする。形態学的研究には、ルーチンのヘマト キシリンおよびエオシン染色が、パラフィン包埋組織について実行される。 ４．β-ガラクトシダーゼ活性の定量 β-gal活性を、標準的な技術に従ってマウス肝臓ホモジネートにおいて定量す る。簡潔には、凍結組織を細かく刻み、そして冷溶解緩衝液中で氷上にて、ガラ ス組織グラインダーを使用して手でホモジネートする。１mLの0.2％Triton-X、1 00mMリン酸カリウム溶解緩衝液(pH7.8)あたり、100mgの肝臓重量を加える。ホモ ジネートを、微小遠心器における12,000gで４℃にて各20分間の２回の遠心分離 工程により明澄化する。上清を、各サンプルに0.25×容量のキレーターを添加す ることによって、Chelex-100樹脂(BioRadカタログ番号142-2842)で処理する。次 いで、ホモジネートを短くボルテックスし、室温にて２〜５分間インキュベート し、そして微小遠心器において12,000gで30秒間遠心分離する。各上清の２倍系 列希釈物を、Clontech Luminescent β-gal Detection Kit II(カタログ番号K20 48-1)を使用してアッセイする。10μlの各サンプル希釈物を、75μlのClontech β-gal Reagentと共に、96ウェルプレートにおいて、室温で１時間インキュベー トし、Dynatech Laboratories ML3000 Microtiterプレートルミノメーターにお いて読み取る。各サンプルの活性を、Clontech kitと共に供給されたβ-gal酵素 の標準曲線からの外挿によって決定し、そしてmU/g器官重量で表す。データの統 計解析を、対応のないｔ検定を使用して実行した。 ５．免疫原性の研究 雌性BDF1マウス(ｎ＝５匹/群)を、０日目に１×10⁹pfuのAdβ-galまたはFGF2A dβ-gal(2000:1の比のFGF2−Fab対ノブモノマーにて)で腹腔内的に処置する。コ ントロールマウスには200μLのPBSを与える。21日目に、血液サンプルを集め、 そしてELISAによって抗体についてアッセイする。 ６．ELISA 手順 96ウェルクラスタープレート(Costarカタログ番号3590)を、PBS中で希釈した1 00μl/ウェルのAd5(３×10⁸PFU/ウェル)または精製ファイバータンパク質(0.1μ g/ウェル)のいずれかで一晩コートする。次いで、プレートをPBSで３回リンスし 、そして10％ヤギ血清(GIBCO，Grand Island NY)を含むPBSで２時間ブロックす る。さらに３回のリンスに続いて、PBS中1:50希釈した血清を、100μl容量とし て添加し、そして30分間インキュベートする。ウェルを再びPBSで３回リンスし 、そしてアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgのF(ab')2フラグメントの 最適希釈物100μlを、１ウェルあたり加える。Tris緩衝化生理食塩水(TBS)にお ける３回のリンスに続いて、結合抗体を、100μlのｐ-ニトロフェニルホスフェ ート(Sigma Chemical，St．Louis MO)の添加により検出する。 60分間のインキュベーションの後、基質反応を、参照については490nmの波長 、検出については405nmの波長に設定されたマイクロプレートリーダーを使用し て決定する。全てのウェルから、一次抗体を与えなかった６ウェルをブランクと して差し引いて、そして３つの３連ウェルの平均を各血清サンプルについて決定 す る。データをOD405×10³として表わす。 Ｂ．B16 メラノーマ腫瘍モデル FGF2-AdHSVTKを、0.3または0.03μgのFGF2-Fabと１×10⁸pfuのFGF2-AdHSVTK(3 :1または30:1のFGF2-Fab対ノブのモル比)とを混合し、30分間室温にてインキュ ベートすることによって調製する。次いで、FGF2-AdHSVTK、AdHSVTK、または20m M HEPES緩衝液のいずれかを、50:1の感染多重度のB16メラノーマ細胞懸濁物と混 合する。この混合物を、室温にて１時間インキュベートする。 雌性BDF1マウス(ｎ＝８匹/群)に２×10⁶個のB16F0細胞(Lou Weiner，Fox Chas e Cancer Center)を与え、これをFGF2-AdHSVTK、AdHSVTK、または20mM HEPES緩 衝液のいずれかで処置し、０日目に腹腔内的に移植する。次いで、マウスに、０ 日目に100mg/kgの用量から始めて、14日間毎日、ガンシクロビル(Cytovene，Roc he)(またはH₂O)を腹腔内的に投与する。次いで、マウスを生存に関して追跡する 。統計解析をKaplan-MeierおよびLogrank(Mantel-Cox)の事後分析を使用して実 行する。 Ｃ．結果および考察 齧歯類モデルにおいて、静脈外送達された大部分のAdベクターは、肝臓におい て、最初の24時間以内に迅速に除去される。同時に、肝臓肝細胞のかなりの形質 導入および関連するトランスジーン発現が生じる。このことは、齧歯類肝臓にお けるAd細胞レセプターであるコクサッキーアデノウイルスレセプター(CAR)の高 濃度に一部起因する。Adトランスジーン発現は、Adベクター投与後の最初の７日 にわたって迅速に減衰するが、増大した血清トランスアミナーゼ、壊死、および 炎症により顕現されるような顕著な肝臓毒性と関連する(Yangら、同上(1994)；G aoら、J Virol 12，8934-8943(1996)；Hwangら、Am J Respir Cell Mol Biol 13 ，7-16(1995))。AdをCARに関するネイティブな親和性から離して再標的化するこ とは、この肝臓毒性を排除し得る。 本発明者らは、Adファイバータンパク質のノブ領域に対する中和Fabを使用す ることにより、Adを再標的化する広く有用な方法を開発した。ファイバータンパ ク質は、CARへの結合のためにアデノウイルスにより使用される。標的化リガン ドとしてのFGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子)をこのFabに接着することによって 、この二官能性分子は、高親和性FGFレセプターを介するアデノウイルスの細胞 侵入を標的化および再指向化する。FGF2は、他のリガンドーレセプター相互作用 と比較して、通常に高い親和性(Kd約10^-12M)で、FGFレセプターに結合する。FGF レセプターは、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる、多くの疾患にお いてアップレギュレートされ、そして多くのヒト悪性腫瘍は、４つの認識された FGFレセプターのうちの１またはそれ以上の亢進したレベルを含む。 本発明者らは、FGF2が、インビトロおよびインビボの両方で、DNAを標的化す ることを以前に示した。最近、本発明者らは、レポーター遺伝子またはHSVチミ ジンキナーゼ(TK)遺伝子を、インビトロでヒトカポージ肉腫細胞株に、そしてイ ンビトロおよびインビボの両方でヒト卵巣ガン細胞に送達することにFGF2再標的 化Adを使用すると、Adと比較して、遺伝子発現が12倍まで増大することを示した (Sosnowskiら、J Biol Chem 271:33647-33653(1996))。本発明者らは、増強した インビボ効力は、より高い特異性を示唆すると推論した。したがってネイティブ な親和性を改変することによってFGF2-Adが減少した毒性および免疫原性を示す かどうかを評価することは、適切である。再指向化親和性を、ネイティブなAd感 染に対して耐性である腫瘍細胞でチャレンジしたマウスにおいて、さらに評価し 得る。 １．肝親和性の再指向化 Adの再標的化を達成するために、二官能性分子を、FGF2とブロッキング抗ファ イバーFabとを結合することによって作製する。次いで、この分子を、培養細胞 の形質導入またはインビボでの使用の前に、Adと共にインキュベートする。この FabとAdファイバータンパク質のノブドメインとの高親和性相互作用は、Biacore 分析を使用して、2.1×10^-9Mと測定されている。この値は、市販の治療用抗体に 匹敵するか、またはそれより大きい。 FGF2再標的化Adが肝臓に対するAdのネイティブな親和性をブロックするかどう かを決定するために、FGF2-Adβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)およびAdβ-galを、 マウスに静脈内注射し、そして肝臓におけるβ-galの発現を評価する。マウスを 、賦型剤、Adβ-gal(２×10¹⁰pfu、i.v.)またはFGF2-Adβ-gal(２×10¹⁰pfu、i. v.)のいずれかの注射後２，４および７日目に屠殺する。肝臓組織を、上記のよ うに、処理し、そしてXgalで染色する。 投与後１、２、４、７、および12日目に、FGF2-Adβ-galで処置したマウスの 肝臓(これは、X-gal染色肝細胞の激減を有した(示さず))と比較して、顕著に大 きな数のXgal染色肝細胞が、Adβ-galで処置したマウスの肝臓に存在する。X-ga l⁺幹細胞は、コントロールマウスには観察されない(データを示さず)。 肝臓におけるβ-ガラクトシダーゼ活性の定量(表３)は、組織化学的結果と並 行し、Adβ-gal処置マウスの肝臓においてより、FGF2-Adβ-gal処置マウスの肝 臓において、12〜20倍少ないβ-galを示した。12日目まで、中程度レベルのβ- ガラクトシダーゼが、Adβ-gal処置マウスの肝臓に存在する(259mU/g)が、FGF2- Adβ-gal処置マウスの肝臓では検出不可能である。 図９は、Adβ-galまたはFGF2-Adβ-galを処置したマウスにおける血清トラン スアミナーゼおよびアルカリホスファターゼレベルを示す。賦型剤、Adβ-gal( ２×10¹⁰pfu、i.v.)またはFGF2-Adβ-gal(２×10¹⁰pfu、i.v.)のいずれかの注射 後７日目に、血清を調製し、そしてトランスアミナーゼ(ALT、AST)およびアルカ リホスファターゼ(Alk Phos)を測定する。データを平均±S.E.として示す。 投与後７日目に、血清トランスアミナーゼレベルは、Adβ-gal処置群において ８〜16倍上昇するが、FGF2-Adβ-gal処置群においてはわずか３〜５倍である(図 ９を参照)。血清アルカリホスファターゼもまた、Adβ-gal処置マウスの血清に おいて上昇するが、FGF2-Adβ-gal処置マウスにおいては正常な限度内にある。 ７日目の組織病理学により、Adβ-gal(Adβ-gal、２×10¹⁰pfu、i.v.)を処置 したマウスの肝臓における重篤な肝細胞壊死および著しい炎症性浸潤の証拠が、 明らかにされたが、FGF2-Adβ-gal処置群(FGF2-Adβ-gal、２×10¹⁰pfu、i.v.) 由来の肝臓の分析により、幹細胞壊死がほとんど完全に排除され、僅かに最小限 度の炎症性浸潤が観察されることが明らかにされた(データを示さず)。 ２．免疫原性 本発明者らは、潜在的な免疫優性エピトープである、ファイバータンパク質ノ ブドメインをブロックすることがAdに応答する抗体を消滅させると仮定した。従 って、単回の腹腔内注射後のFGF2-AdまたはAdのいずれかに対する体液性応答を 評価する。総アデノウイルスまたは精製ファイバータンパク質に対して惹起され た血清抗体が、21日目にELISAによって測定される。 図１４は、賦形剤、Adβ-gal、またはFGF2-Adβ-galのいずれかで処置された マウス中の抗アデノウイルスおよび抗ノブタンパク質抗体の血清抗体レベルを示 す。賦形剤Adβ-gal(１×10⁹PFU静注)、またはFGF2-Adβ-galのいずれかの注射 の後21日目に、血清を調製し、そして総アデノウイルスまたは精製ノブタンパク 質にいずれかに対して惹起された特異的抗体レベルについてELISAによりアッセ イした。データは、各血清試料について測定するとき、３つの三連ウェルの平均 OD₄₀₅×10³値として表す。さらに、算術平均(破線)を、一方向の分散分析および 帰納的対比のための最小有意差のFisher法を用いて比較する。抗アデノウイルス 応答については、アデノウイルス群は、賦形剤およびFGF2-Ad群の両方と、p<0.0 001で異なる。抗ノブタンパク質応答については、アデノウイルス群は、賦形剤 群とp<0.0001で、そしてFGF2-Ad群とp=0.0003で異なる。 Ad単独と比較して、FGF2-Adは、より低い平均抗-Ad抗体応答を誘導し、そして FGF2-Ad処置群において、2/5マウスが抗Ad抗体を持たなかった。同様に、平均力 価はより少なく、そしてAd処置群と比較して、FGF2-Ad-処置群において、3/5マ ウスがファイバータンパタ質のノブドメインに対する抗体応答を生成しなかった 。平均抗ノブ抗体応答が抗Ad応答の50％を超えることを示すデータは、ノブが免 疫優性エピトープであるという仮説を支持する(図１４を参照のこと)。 ３．B16 黒色腫のエクスビボ形質導入 FGF2-Adが、ネイティブのAd感染に非感受性である細胞に形質導入し得るか否 かを決定するために、B16マウス黒色腫細胞株を標的として選択する。B16腫瘍細 胞は、FGFR1およびFGFR3mRNAを発現し、そしてFGF2の標的DNAおよびタンパク質 毒素類に感受性である。B16細胞を、エクスビボで１時間、単純ヘルペスウイル スチミジンキナーゼ遺伝子(AdHSVTK)を含むAdまたはFGF2-AdHSVTKのいずれかと 、BDF1マウスの腹腔内に移植する前インキュベートする。ガンシタロビルプロド ラ ッグ治療を、インビボで腫瘍細胞接種後１日で開始する。 図１１は、AdHSVTKまたはFGF2-AdHSVTKとエクスビボでインキュベートしたB16 FO腫瘍細胞のいずれかで処置したマウスの生存分析を示す。B16黒色腫細胞を、 エクスビボで１時間、AdHSVTKまたはFGF2-AdHSVTKのいずれかで処置し、次いで 、マウスあたり２×10⁶細胞でBDF1マウス中に腹腔内移植する。次いで、マウス を、ガンシクロビルまたはH20(コントロールとして)のいずれかで、14日間、静 注、処置する。FGF2-AdHSVTKで処置し、次いでガンシクロビルを投与された腫瘍 を持つマウスの生存は、すべての他の群と比較して統計的に延長した生存を有す る(p=0.001)。 AdHSVTKプラスガンシクロビルで処置したB16黒色腫を持つマウスの生存は、非 処置B16腫瘍細胞プラスガンシクロビル養生法を受けたコントロールマウスから 区別不能である(中央値の生存18-19日；図１１を参照のこと)。目立って対照的 に、２つの異なるFGF2-Fab対ノブのモル比で、FGF2-AdTKで処置されたB16黒色腫 を受けたマウスは、コントロール群と比較して中央値の生存において2.6倍の増 加を示した(図１１)。 癌の細胞傷害性遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの使用には、いく つかの顕著な障害がある。第１に、アデノウイルスによる正常な非腫瘍細胞の形 質導入は、腫瘍中への直接注射または腫瘍細胞を含む区画へのあちこちの領域(l ocoregional)への送達に対し、予備臨床研究および初期臨床試験を制限する傷害 性を導き得る(Goldmanら、同上(1997)；Mazueら、Toxicol Lett 64-65、329-338 (1992)；Yingら、Cancer 74、848-853(1994))。 さらに、アデノウイルスの免疫原性は、反復投薬に対する潜在的な障害である 。本発明者らは、アデノウイルスのネイティブの親和性を廃止し、そしてFGFレ セプターを通じてそれを細胞取り込みに再指向する方法を開発した。外因性FGF2 の投与に応答する正常組織はほとんどないので(Wagnerら、Proc Natl Acad Sci USA 89、6099-6103(1992)；Tomkoら、Proc Natl Acad Sci USA 94、3352-3356(1 997)；Worgallら、Human Gene Therapy 8、37-44(1997))、FGF2-Adを用いた正常 組織の形質導入は、制限されるべきである(データは示さず)。 さらに、FGF2を用いてAdを再指向することは、アデノウイルスの肝臓親和性を 廃止し、そしてその毒性を低減するはずである。実際、FGF2-Adは、非再標的Ad より12〜20倍少ない肝臓中の移入遺伝子発現(β-gal)を誘導し、そしてAdを受け るマウスにおける血清トランスアミナーゼの頑丈な増加と比較して、血清トラン スアミナーゼレベルに対して最も穏やかな影響を有していたに過ぎない。Adおよ びFGF2-Adに対する体液性応答を比較するとき、Ad処置群とは異なり、すべての 処置されたマウスで抗Adおよび抗ファイバータンパク質抗体が見出されないよう に、FGF2-Adは、減少した免疫原性を示した。FGF2抗ファイバーFabがファイバー タンパク質に対する抗体応答をブロックし得ることが予期され得るけれども、ビ リオン表面上の他のエピトープに対する応答を鈍らせることは予期されない。FG F2-Fabが立体的妨害によりこれらの他のエピトープをマスクしているか否か、ま たはそれがより少ない免疫原性経路を通じてウイルスのクリアランスを行うか否 かは未知である。 本発明の再操作されたベクターの複数用量が、それから生じる認知し得るレベ ルの体液性応答なくしてインビボで投与され得る。従って、本発明の改変された ベクターは、当該分野で記載された他のベクターより免疫原性が顕著により少な い。 さらに、ネイティブのAd親和性が、FGFレセプターを持つ細胞に完全に再指向 され得ることを示すために、本発明者らは、Ad耐性腫瘍株(B16マウス黒色腫)が 、FGF2-AdHSVTK形質導入に対して感受性にされ得ることを示した。FGF2-AdHSVTK 処置されたB16黒色腫細胞でチャレンジしたマウスは、コントロールまたはAdHSV TK処置されたB16黒色腫細胞を持つマウスと比較したとき、生存を大いに延長し た。 本発明者らはまた、Adに感受性であるヒト卵巣癌モデル(Rancourtら、Nat Med (1997))において、FGF2-AdHSVTKが、インビボで、AdHSVTKより少なくとも10倍よ り強力であることを示した。Adに比較してFGF-2再標的Adの増加した効力および 低減した細胞傷害性のため、インビボの治療指数は大いに増強される。このよう に、ウイルスベクターのFGF2再標的化は、標的化遺伝子送達に対する有用なアプ ローチを提供し、成功した臨床腫瘍学適用に必要である。 実施例１０ HER-2/NEU 過剰発現ヒト卵巣癌腫モデル(SKOV3IP1)におけるFGF2FABAD21の腹腔 内送達の効力 Her-2/neuレセプターに対する細胞内単鎖抗体(すなわち「内体(intrabody)」) を産生するAdベクターを、活性についてインビボで評価する。種々の細胞培養実 験で、このAd(Ad21)は、このHer-2/neuレセプターを過剰発現する細胞株におい てアポトーシスを誘導することが示された。Ad21およびFGF2FabAd21の効力をSKO V3iplモデルで試験する。 このような治療的意味で用いられ得る「ペイロード(payloads)」ならびに適切 な抗体およびそのフラグメントとして有用であり得る、単鎖抗体を含む抗体の構 築方法は当該分野で利用可能である。例えば、Her-2/neu(erbB-2としてもまた知 られる)レセプターに対する単鎖抗体を記載する米国特許第5,587,458号を参照の こと。内体の生成および使用はまた、公開された国際出願第WO 96/07321号に開 示されている。これら文献の開示は、あたかも本明細書に完全に記載されている ように参考として援用される。 SKOV3ipl細胞を０日目に静注で移植する。５日目に、マウスは、Ad21またはFG F2FabAd21いずれかの単回静注用量を、２つの用量レベルのいずれかで受け、次 いでそれらは生存について追跡される。例えば、投与されるAd21およびFGF2FabA d21の用量は、１×10⁹pfuおよび５×10⁹pfuである。 図２１は、FGF2で再標的され、そして内体ペイロードを送達するAdベクターが 、SKOV3腫瘍を持つマウスに投与されるとき、インビボマウス腫瘍モデルで見ら れる増加した生存時間を示す。生存％は垂直軸上にプロットされ；移植後生存( 日数で表す)が水平軸上にプロットされる。黒丸は、賦形剤単独(コントロール) を受けるマウスを表し；黒三角は、Her-2/neu内体を送達する非再標的Adを受け るマウスを表し；そして黒四角は、Her-2/neu内体を送達するFGF-2再標的Adを受 けるマウスを表す。示されるように、N=10；投与される用量は、１×10⁹ADVまた はFGF-2ADVであった。 非再標的Ad21は、生存に対して最小の影響を有するが、高用量FGF2FabAd21処 置群では、中央値の生存は顕著に増加する(％ILS=128；データは示さず)。ここ で再びウイルスベクターのFGF2再標的化は、それ自身がポジティブおよびネガテ ィブ遺伝子治療の意味の両方で有用であることを示し、そしてそれらのネイティ ブの親和性を保持するウイルスベクターによって通常標的されない、予備選択さ れたレセプターと反応性のポリペプチドを用いるウイルス再標的化が、臨床腫瘍 学適用を含む種々の治療の意味で成功の可能性を増大する可能性を強調する。 実施例１１ KGF および11A8を用いるアデノウイルスベクターの成功した再標的化 種々のレセプター結合性およびインターナリゼーションリガンドが、アデノウ イルスベクターの再標的化で有用であることを示すために、抗ノブFabとKGFの結 合体、ならびに抗ノブFabと11A8抗体の結合体が以下に記載のように構築される 。FGFレセプターと反応性の前述のポリペプチドを用いる再標的化された結合体 の投与は、記載のように、Ad親和性の成功した改変ならびに遺伝子発現における 同時増加を示す。 KGFは、上皮細胞、肝細胞、および肺のII型肺胞細胞を標的にすることにおい て特に有用であり、これは、先に論議したように、種々の遺伝子標的化および送 達適用のためにそれを理想的にする。従って、リガンド-Fab構築物中へのその取 り込み、およびAd再標的化薬剤としてのその使用は、特に、KGFによって特異的 に標的とされる細胞およびレセプター(例えば肝細胞およびII型肺胞細胞)を含む 疾患状態を取り扱う場合にさらなる処置オプションを提供する。 抗ノブ抗体(これからFabおよびその他のフラグメントが容易に調製される)を 生成するために用いられるAdノブ抗原を生成および精製する方法がまた例示とし て記載される。 Ａ．ノブ抗原の精製 供給回分バッチ発酵は約1.4kgのペーストを生成した。そしてノブを、２つの 連続的なクロマトグラフィー工程：カチオン交換、次いで固定化金属イオンアフ ィニティークロマトグラフィー(IMAC)を用いて精製する。カチオン交換クロマト グラフィー(CEC)を、溶解および清澄化後の捕獲および一次回収工程として用い る。次いでCEC精製された産物を、ノブのポリヒスチジンn-末端のニッケルに対 する親和性を基に、IMAC(ニッケルで充填)により精製する。ノブ産物を詳細に特 徴付けた(データは示さず)。 ネイティブ状態では、ノブ抗原は、ホモ三量体として存在することが示された 。 ノブモノマーをコードするcDNAに基づく理論的分子量は22,539Daである。現在ま での分析に基づいて、精製産物は、主に、参照標準に等価な結合特徴を備えた三 量体分子として存在するようである。ノブ抗原はまた、製造過程の試験および調 製量のFGF-Fab、KGF-Fab、EGF-Fabおよび11A8-Fabを精製する使用のためにクロ マトグラフィー樹脂に固定化されるアフィニティーリガンドとして有用である。 Ｂ．11A8 抗体を分泌するハイブリドーマの調製 雌のBalb/Cマウスに、0.2mlのDulbeccoのPBS中の10⁷SK-HEP-1細胞を皮下注射 し、抗体11A8を生成した。動物を、14および28日後に、腹腔内に注射された10⁷ 細胞で再免疫した。融合は、最後の免疫化の４日後に行った。 免疫したマウスから採取した脾臓細胞を、PEG-1500を用いてNS-0細胞と融合し た。ハイブリドーマ細胞を、HATおよび0.005％の2-メルカプトエタノールを含む RPMI-1640次いでHTを含むRPMI-1640中で選択した。 ELISAをハイブリドーマをスクリーニングするために用いた。簡単に述べれば 、プレートを、50μlのECDR1(100ng/ml)で一晩４℃でコートした。洗浄後、調製 培地試料を添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗体(Bio-R ad、１：1000希釈)を用いてハイブリドーマを検出した。ポジティブウェル中の 細胞を、制限希釈によりクローン化した。 抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、および製造業者のプロトコールに従ってAffi -Gel Protein Aアガロースカラム(Bio-Rad、Richmond、CA)クロマトグラフィー により精製した。抗体の純度を、非還元条件下で、クマシーブルー染色を用いて 7.5％PhastGel(Pharmacia、Uppsala、Sweden)によりチェックした。 Ｃ．KGF-Fab および11A8-Fab KGFがFab(抗ノブ)に結合された予備の小スケール研究を行う。結合体を、上記 のようなFGF-Fabの結合および精製に用いた手順(すなわちHeparin-Sepharoseア フィニティークロマトグラフィー次いでサイズ排除クロマトグラフィー)を僅か に改変した類似の手順を用いて精製する。特に、KGFおよび11A8は、製造業者(Ph armacia、Piscataway、NJ)の指示に従ってSPDPで誘導体化し(モノ誘導体化)；単 離して次いでFabと結合体化する。最終のバルク結合体をSE-HPLCにより分析し、 そしてFabに対するKGFのモル比を、SDS-PAGE/クーマシーにより決定する(結果は 示さず)。 SE-HPLCは、結合体が不均質ではあるが、検出可能なレベルの遊離KGFまたは遊 離Fabを含まないことを示した。KGFに対するFabのモル比は、還元条件下のSDS-P AGE/クマシー染色ゲルの走査デンシトメトリーを基に１：１であると推定される (データは示さず)。 結合体のKGF成分の生物学的活性を、Balb/MK細胞に対して実施される増殖アッ セイにより評価する。結合体は、誘導体化されたKGFおよび非誘導体化KGF標準に 効力が等しい(示さず)。ノブ結合活性および形質導入活性は、関連の当業者から 容易に認識し得るように、標準的なアッセイおよび手順を用いて容易に評価され る。 図２０は、FGF2または11A8-Fabのいずれかを用いてマーカー(Adβgal)に連結 されたAdベクターの成功した再標的化、およびHCT116細胞中のマーカー配列の成 功した送達を示す。左から右に、陰の棒は、Adβgal；Fab；FGF2Fab、30×；FGF 2Fab、３×；11A8Fab、30×；および11A8Fab、3×を表す。モル過剰のリガンド- Fab：ノブモノマーを、後者の４つのカテゴリーで示す。垂直軸上に、mUβgal/m gタンパタ質が示される。（25K、72時間；300MOI.） 詳細な実施態様および実施例を含む先行する明細書は、本発明の例示であるこ とを意図し、そして制限するとして考慮されるべきではない。多くの他の変更お よび改変が、本発明の真実の思想および範囲から逸脱することなく実施され得る 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/04 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ソスノウスキ，バーバラ エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92118, コロナド，アデラ アベニュー 1013 (72)発明者 バード，アンドリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122, サン ディエゴ，ビア パペル 5309 (72)発明者 ピアース，グレン エフ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067, ランチョ サンタ フェ，ミル アルボレ ス 14413 (72)発明者 キュリエル，デイビッド ティー. アメリカ合衆国 アラバマ 35222，バー ミングハム，リンウッド ロード 824 (72)発明者 ダグラス，ジョアン ティー. アメリカ合衆国 アラバマ 35803，ハン ツビル，リーボック サークル 2509 (72)発明者 ロジャーズ，バック イー. アメリカ合衆国 アラバマ 35205，バー ミングハム，10ティーエイチ コート サ ウス 2808，アパートメント エイ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．予め選択したレセプターを発現する細胞を特異的に標的化する、親和性が改 変されたアデノウイルスベクター系であって、以下： アデノウイルスキャプシドタンパク質を結合する抗体またはそのフラグメント ； 該予め選択したレセプターを結合する標的化リガンド；および プロモーターの制御下にある治療的遺伝子産物をコードする核酸分子を含むア デノウイルス； を含み、ここで、該リガンドが、該抗体またはそのフラグメントと結合体化して おり、そして該抗体またはそのフラグメントが該アデノウイルスに結合している 、 アデノウイルスベクター系。 ２．前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項１に記載のベク ター。 ３．前記標的化リガンドがFGFレセプターと反応性のポリペプチドである、請求 項１に記載のベクター。 ４．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドが抗体またはそのフラグメント である、請求項３に記載のベクター。 ５．前記抗体が11A8である、請求項４に記載のベクター。 ６．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドが、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF- 4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF−11、FGF-13、FGF-14、およびFGF -15からなる群より選択される、請求項３に記載のベクター。 ７．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドがFGF-2である、請求項３に記載 のベクター。 ８．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドがKGFである、請求項３に記載の ベクター。 ９．前記標的化リガンドが以下：VEGFレセプターと反応性のポリペプチド、PDGF レセプターと反応性のポリペプチド、およびEGFレセプターと反応性のポリペプ チドからなる群より選択される、請求項１に記載のベクター。 １０．前記ベクターのネイティブな親和性が除去されている、請求項１に記載の ベクター。 １１．前記治療的遺伝子産物が細胞破壊薬またはプロドラッグである、請求項１ に記載のベクター。 １２．前記治療的遺伝子産物が細胞増殖を増強する、請求項１に記載のベクター 。 １３．前記治療的遺伝子産物が、内因性タンパク質を増加させるかまたは補完す る、生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドである、請求項１に記載の ベクター。 １４．前記治療的遺伝子産物が細胞増殖を増強する、請求項１に記載のベクター 。 １５．前記治療的遺伝子産物が組織修復または再生を増強する分子である、請求 項１に記載のベクター。 １６．前記治療的遺伝子産物が防御性免疫応答を刺激する分子である、請求項１ に記載のベクター。 １７．前記プロドラッグがチミジンキナーゼ、ニトロレダクターゼ、またはシト シンデアミナーゼである、請求項１０に記載のベクター。 １８．生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和 性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物であって、該ベクタ ーがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする核酸分子を含む、薬 学的組成物。 １９．前記リガンドが、FGFレセプターと反応性のポリペプチドである、請求項 １８に記載の組成物。 ２０．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドが、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FG F-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-11、FGF-13、FGF-14、およびFG F-15からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。 ２１．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドがFGF-2である、請求項１９に 記載の組成物。 ２２．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドがKGFである、請求項１９に記 載の組成物。 ２３．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドが抗体である、請求項１９に 記載の組成物。 ２４．前記抗体が単鎖抗体である、請求項２３に記載の組成物。 ２５．前記リガンドが、アデノウイルスキャプシドタンパク質と遺伝子的に融合 されている、請求項１８に記載の組成物。 ２６．前記リガンドが、アデノウイルスキャプシドタンパク質と化学的に結合体 化されている、請求項１８に記載の組成物。 ２７．前記リガンドが、ウイルスキャプシドタンパク質を結合する抗体またはそ のフラグメントと結合体化されている、請求項１８に記載の組成物。 ２８．前記治療的遺伝子産物が、タンパク質、リボザイム、およびアンチセンス からなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。 ２９．前記治療的遺伝子産物が細胞破壊薬である、請求項１８に記載の組成物。 ３０．前記治療的遺伝子産物がプロドラッグである、請求項１８に記載の組成物 。 ３１．生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和 性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工程を包 含する、 腫瘍を処置する方法であって、 ここで、該ベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする ヌクレオチド配列を含み、そして該治療的遺伝子産物が、E-カドヘリン、BGP、R b、p53、CDKN2/P16/MTSI、PTEN/MMAC1、APC、p33ING1、Smad4、マスピン、VHLWT 1、Men1、NF2、MXI1、およびFHITからなる群より選択される、 方法。 ３２．生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和 性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工程を包 含する、 虚血を処置する方法であって、 ここで、該ベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする ヌクレオチド配列を含み、そして該治療的遺伝子産物が、IGF、TGFβ1、TGFβ2 、 TGFβ3、HGF、VEGF121、VEGF165、FGF1、FGF2、FGF4、FGF5、PDGF-A、およびPDG F-Bからなる群より選択される、 方法。 ３３．生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和 性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工程を包 含する、 結合組織傷害を処置する方法であって、 ここで、該ベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする ヌクレオチド配列を含み、そして該治療的遺伝子産物が、PTH、BMP1、BMP2、BMP 3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP10、BMP11、噛乳動物BMP、およびXenopu sBMPからなる群より選択される、 方法。 ３４．生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを提示する親和 性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を投与する工程を包 含する、 組織傷害を処置する方法であって、 ここで、該ベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする ヌクレオチド配列を含み、そして該治療的遺伝子産物が、ウシVEGF、VEGF、VEGF -B、VEGF-C、アンジオポイエチン-1、アンジオゲニン、IGF-1、IGF-II、HGF、PD GF A、PDGF B、TGFB1、TGFB2、およびTGFB3からなる群より選択される、 方法。 ３５．ガン細胞と、生理学的に受容可能な緩衝剤、およびその表面にリガンドを 提示する親和性が改変されたアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物とを接 触させる工程であって、 ここで、該ベクターがプロモーターの制御下に治療的遺伝子産物をコードする ヌクレオチド配列を含み、 そして該治療的遺伝子産物が、HSVTK、VZVTK、ニトロレダクターゼ、およびシ トシンデアミナーゼからなる群より選択される、 工程；ならびに 該ガン細胞を基質と接触させる工程、 を包含する、ガンを処置する方法。 ３６．前記リガンドがFGFレセプターと反応性のポリペプチドである、請求項３ １〜３５のいずれか１項に記載の方法。 ３７．前記FGFレセプターと反応性のポリペプチドがFGF-2である、請求項３６に 記載の方法。 ３８．前記リガンドが抗体またはそのフラグメントである、請求項３１〜３５の いずれか１項に記載の方法。 ３９．前記抗体が単鎖抗体である、請求項３８に記載の方法。 ４０．前記リガンドがウイルスキャプシドタンパク質を結合する抗体またはその フラグメントと結合体化されている、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の 方法。 ４１．前記ウイルスキャプシドタンパク質がアデノウイルスファイバータンパク 質である、請求項４０に記載の方法。 ４２．前記ウイルスキャプシドタンパク質がアデノウイルスノブタンパク質であ る、請求項４０に記載の方法。 ４３．前記リガンドが、ウイルスベクターの表面上のタンパク質と化学的に結合 体化されている、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。 ４４．前記治療的遺伝子産物がタンパク質、リボザイム、およびアンチセンスか らなる群より選択される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。 ４５．前記治療的遺伝子産物がプロドラッグである、請求項３１〜３５のいずれ か１項に記載の方法。