JP2001511641A

JP2001511641A - インターロイキン―５のアンタゴニスト

Info

Publication number: JP2001511641A
Application number: JP54127997A
Authority: JP
Inventors: ロペスエンゼル; ヴァダスマスュー; シャノンフランセス; バスティラススタン; ウイリアムヘイアラン
Original assignee: ブレザーゲンリミティッド; メドヴェットサイエンスピーティーワイ．エルティーディー．
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2001-08-14
Also published as: EP0904293A4; EP0904293A1; WO1997045448A1; AUPO005496A0; NZ332946A; CA2256368A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、インターロイキン−５の活性に拮抗しまたはそれを弱めることができるＩＬ−５分子の修飾型および変異型に関する。そして、ＩＬ−５の天然型または突然変異型により惹起される異常な効果を緩和し、軽くしあるいはその他の方法により減少させるためのそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン−５のアンタゴニスト本発明は、ＩＬ−５の活性に拮抗したりそれを減少させたりすることができるインターロイキン−５分子の修飾型および変異型に関し、そしてＩＬ−５の天然型または突然変異型により惹起される異常な効果を緩和し、苦痛を和らげあるいはその他の方法で減少させるためのそれらの使用に関する。本出願（specification）で言及するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する配列番号(SEQ ID NOs.)は明細書の後に記載する。本出願を通じて、論旨から別の意味に解すべき場合を除き、「コンプライズ（ comprise）（含む、含んで成る）」という語、あるいは「コンプライジーズ(com prises)」または「コンプライジング(comprising)」などのその変形は、述べられている要素または実体あるいは要素群または実体群の含有を意味するが、他の如何なる要素または実体あるいは要素群または実体群の排除を意味するものではないと理解されるべきである。組換えＤＮＡ技術の精巧さが急速に増大したため、医学分野および関連健康分野における研究および発展が大いに促進されている。このことは、幾つもの疾病状態が天然型または突然変異型成長因子の異常な効果に起因しているヘモポエチン成長因子の研究の領域で特に重要である。一つの特に重要なヘモポエチン成長因子はＩＬ−５である。この分子はＴ−細胞および肥満細胞により分泌されるリンホカインであり、糖タンパクのジスルフィド結合をしたホモダイマーである。この分子のヒト型はモノマー当たり１１４個のアミノ酸を含んでいる。ＩＬ−５は上上、下下配列の４個のα−ヘリックスの束から形成されている。一つの束が一つのモノマーに由来する３個のヘリックスと第２のモノマーに由来する第４のヘリックスとから形成されるＤ−ヘリックス交換という現象は、ＩＬ−５に独特のものである。ＩＬ−５分子はヘリックスＡとＢおよびヘリックスＣとＤの間に位置する二つの短い逆平行β−鎖をも含んでいる。ヒトおよびネズミのＩＬ−５受容体は二つの異なる鎖、すなわち、α−サブユニットおよびβ−サブユニットを含んでいる。ヒトＩＬ−５はこのα−サブユニットに結合するが、その結合親和性はβ−鎖と結合すると増大する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３などの他のサイトカインもこのβ−鎖を共有する。ＩＬ−５はヒト好酸球の産生および活性化に対し選択性を有するヘモポエチンチン成長因子である。従って、慢性喘息またはＩＬ−５との関係が証明された好酸球増多症を伴う他の疾病状態またはＩＬ−５と関連する他の状態に対する治療剤として作用するＩＬ−５のアンタゴニストを開発すべき必要がある。ＩＬ−５アンタゴニストがＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−３などの他のサイトカインの活性を妨害しないことも重要である。従って、本発明の一つの側面は、第１のα−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を含む修飾されたＩＬ−５であって、その第１のα−ヘリックス中の酸性または酸様の性質を有する露出しているアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非−酸性アミノ酸残基で置換されているものを提供する。修飾を受けるＩＬ−５は、一般に、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、羊、牛、豚、馬）、実験室テスト動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）、愛玩動物（例えば、犬、猫）および捕獲された野生動物（例えば、カンガルー、狐、鹿）などから得られる哺乳類起源のものである。ＩＬ−５はヒト起源であることが最も好ましい。本発明の修飾されたＩＬ−５はグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよく、そしてＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の活性を妨害することはない。より一層具体的にいうと、本発明は第１のα−ヘリックス中のアミノ酸位置１３（またはそれと同等の位置）にあるＧｌｕがＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物または誘導体により置換されているアミノ酸配列を含んでいる修飾されたヒトＩＬ−５分子に関するものである。別の置換は、ＧｌｎおよびＡｓｎまたはそれらの化学的同等物または誘導体などの非−酸性アミノ酸残基を用いて行うこともできるが、これらの残基に限定されるわけではない。「誘導体」は天然に生ずるアミノ酸残基でも合成アミノ酸残基でもよい。本発明によれは、上に定義したような修飾されたＩＬ−５分子はＩＬ−５の天然型のアンタゴニストとして作用すると提唱される。「修飾された」という用語は、本明細書では、「変異型」、「誘導体」および「突然変異型」などの用語と同義語と考える。本発明はインビトロで観察されるようなＩＬ−５の分裂促進効果(mitogenic effects)に対し特異的拮抗作用を示す修飾されたＩＬ−５に特に関係する。この修飾されたＩＬ−５分子はグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよく、そしてＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の活性を妨害することはない。従って、本発明の別の側面はＩＬ−５アンタゴニストに関する。該アンタゴニストはその第１のα−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を有するＩＬ−５分子を含んで成るものであって、該第１のα−ヘリックス内の酸性または酸様の性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものである。より具体的には、本発明は、その第１のα−ヘリックス内の第１３位（またはそれと同等の位置）にあるＧｌｕがＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換されているＩＬ−５分子を含んで成るＩＬ−５のアンタゴニストを提供する。別の置換も、ＧｌｎおよびＡｓｎまたはそれらの化学的同等物または誘導体などの非−酸性アミノ酸残基を用いて行うことができるが、これらの残基に限定されるわけではない。本発明の修飾されたＩＬ−５分子は組換え型または合成型であることが好ましい。その第１のα−ヘリックス内のアミノ酸の置換（単数または複数）を例外として、ＩＬ−５のアミノ酸配列は天然に生ずる分子（すなわち、天然の分子）と同一であることができあるいは天然のアミノ酸配列に対する１個または多重の、アミノ酸の置換、欠失および／または付加を持つこともできる。それを「突然変異型」ＩＬ−５と呼ぶ。ＩＬ−５の第１α−ヘリックスの構造は２．４オングストローム分解能でＸ線結晶学により決定され、それがアミノ酸残基７〜２７またはそれらの同等物を含んでいることが明らかにされた（ミルバーンら、Nature 363:172-176，1993を参照）。本発明の修飾されたＩＬ−５はリーダー配列を含んでいてもよくあるいは含んでいなくてもよい。第１３位にＡｒｇを持つ修飾されたＩＬ−５に対するヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、配列番号：１および配列番号：２および図１に示す。リーダー配列はアミノ酸１〜６として（Met His Tyr His His His(配列番号：３ )）示してある。従って、アミノ酸７〜２７は配列番号：１および配列番号：２および図１ではアミノ酸１３〜３３として示される。アミノ酸７〜２７への言及はリーダー配列なしの分子中のアミノ酸残基番号と解される。アミノ酸７〜２７に対するアミノ酸配列は、アミノ酸１３がＸａａと表されている点を除き配列番号：４として示される。本発明によれば、Ｘａａは塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基であることが好ましい。本明細書で「非グリコシル化型」というときは、原核生物（例えば、大腸菌）中で組換え型として発現された場合のように分子が完全に非グリコシル化されていることを意味する。また、グリコシレーション欠如哺乳類細胞を使用することあるいは適当な酵素を用いてインビトロで完全な脱グリコシレーションを起こすこともできる。異なる哺乳類細胞中で組換え分子が製造される場合のような異なるグリコシレーションパターンも本発明の中に包含される。「露出した」アミノ酸とは、本明細書では、分子の内部に向いているアミノ酸と比べてα−ヘリックスの溶媒に露出した部分または外側にある部分のアミノ酸を指すために用いられる。酸性アミノ酸とは、例えば、ＧｌｕおよびＡｓｐを含む。塩基性アミノ酸はＡｒｇおよびＬｙｓであることが好ましい。非酸性アミノ酸はＧｌｎおよびＡｓｎであることが好ましい。本発明の別の側面によれば、下記の点により特徴付けられる修飾されたＩＬ− ５が提供される。（ｉ）第１α−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を含む、（ii）該α−ヘリックス内に、塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されている酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸を一つ以上持っている、 (iii)組換え型または合成型である、そして (iv)インビトロでＩＬ−５の分裂促進活性と拮抗することができる。関連する態様では、本発明は下記の点により特徴付けられるＩＬ−５アンタゴニストを提供する、（ｉ）第１α−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を含む、（ii）該α−ヘリックス内に、塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されている酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸を一つ以上持っている、 (iii)組換え型または合成型である、そして（iv）インビトロでＩＬ−５の分裂促進活性と拮抗することができる。ＩＬ−５突然変異体はグリコシル化型でも非グリコシル化型でもよい。本発明のこの側面は、一部には、ヒト（ｈ）ＩＬ−５のアミノ酸１３（Ｇｌｕ）のＡｒｇへの突然変異がインビトロでＩＬ−５の分裂促進効果に拮抗することができるｈＩＬ−５変異型を生ずるという発見に基づいている。この変異型は本明細書では「ＩＬ−５Ａｒｇ¹³」または「Ｅ１３Ｒ」と呼ばれる。このような変異型は高親和性受容体に結合することはできないであろうが、ＩＬ−５受容体の低親和性α鎖にはなお十分に結合することができるであろう。ＩＬ−５Ａｒｇ¹³ 突然変異体がアンタゴニストとして作用し、天然のＩＬ−５の刺激効果を阻止することが重要である。ＩＬ−５Ａｒｇ¹³アンタゴニストの特に重要な用途はインビボまたはインビトロでＩＬ−５により媒介される好酸球の刺激および活性化を弱めあるいはその他の方法で拮抗させる場合のものである。このアンタゴニストは突然変異をさせた内因性のＩＬ−５により惹起される効果に拮抗することもできる。本発明は、ＩＬ−５Ｌｙｓ¹³、ＩＬ−５Ｇｌｎ¹³およびＩＬ−５Ａｓｎ¹³ などの他の一連のＩＬ−５突然変異体並びに機能的に同等な突然変異体にも及ぶ。ＩＬ−５Ａｒｇ¹³（Ｅ１３Ｒ）のヌクレオチド配列およひ対応するアミノ酸配列は配列番号：１および配列番号：２に示してある。本発明は、特に好ましい態様では、配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号：１に実質的に記載されたヌクレオチド配列を有する配列をコードする遺伝配列に及ぶ。簡略記載法により、本出願においてアミノ酸残基に対して１文字略記および３文字略記の両方が使用される。これらは表１に示してある。特定のアミノ酸残基がＩＬ−５中におけるその位置により参照されるときは、１文字または３文字アミノ酸略号が上部添字として記す残基番号（例えば、Ｘａａⁿ、ここで、Ｘａａはアミノ酸残基である）と共に使用される。ここで「ｎ」は分子中の残基番号である。表１アミノ酸３文字略号対応する１文字略号アラニンＡｌａＡアルギニンＡｒｇＲアスパラギンＡｓｎＮアスパラギン酸ＡｓｐＤシステインＣｙｓＣグルタミンＧｌｎＱグルタミン酸ＧｌｕＥグリシンＧｌｙＧヒスチジンＨｉｓＨイソロイシンＩｌｅＩロイシンＬｅｕＬリジンＬｙｓＫメチオニンＭｅｔＭフェニルアラニンＰｈｅＦプロリンＰｒｏＰセリンＳｅｒＳスレオニンＴｈｒＴトリプトファンＴｒｐＷチロシンＴｙｒＹバリンＶａｌＶ本発明はＩＬ−５Ａｒｇ¹³を用いて実証される。しかしながら、これは、本発明がイン・ビトロでのＩＬ−５に対しあるいはイン・ビトロまたはイン・ビボでの好酸球に対する拮抗性を有する他のすべてのＩＬ−５変異型に及ぶという条件のもとでなされるものである。本発明の別の側面によれば、該ＩＬ−５の第１α−ヘリックス中のアミノ酸配列を含むＩＬ−５変異型が提供される、ここで、Ｘａａは、好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎより成る群から選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該変異型ＩＬ−５は対応する天然型ＩＬ−５の少なくとも一つの性質に対しアンタゴニストとして作用するものである。配列番号：４により規定されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−５のアミノ酸残基７〜２７に対応する。ＸａａはＸａａⁿであり、ｎはヒトＩＬ−５のアミノ酸位置１３であることが好ましい。ＸａａⁿはＡｒｇ¹³またはその同等物であることが好ましい。関連する態様では、本発明はヒトＩＬ−５の第１α−ヘリックスのアミノ酸７〜２７を含むポリペプチドまたはその化学的同等物を含んで成るＩＬ−５アンタゴニストを提供する、ただし該第１α−ヘリックス中の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されていることを条件とする。酸性または酸性様アミノ酸残基がＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換されていることが好ましい。酸性または酸性様アミノ酸残基がＡｒｇによって置換されていることがより好ましい。修飾されたＩＬ−５のアミノ酸配列が配列番号：２に記載されているものであることが最も好ましい。特に好ましい態様では、本発明は、その第１α−ヘリックス中に下記のアミノ酸配列を有する修飾されたＩＬ−５分子、ここでＸａａはＡｒｇである、あるいは、第１α−ヘリックス中における１個または多重の突然変異であって、ＸａａがＡｒｇであるその突然変異に機能的に類似の拮抗性を与えるものを有するＩＬ−５分子、を含んで成るＩＬ−５アンタゴニストに関する。後者の態様の側面では、ＩＬ−５分子中の突然変異は１個または多重のアミノ酸の置換、欠失および／または付加であることができ、あるいは突然変異の中でもとりわけグリコシレーションパターンの変更であることもできる。ＩＬ−５アンタゴニストは配列番号：２に記載されたようなアミノ酸配列を含んで成ることが好ましい。本発明のＩＬ−５アンタゴニスト、そして特にＩＬ−５Ａｒｇ¹³は、ＩＬ−５により媒介される好酸球の活性化を防止しまたは弱めることにより、アレルギー、一部の骨髄性白血病（好酸球性骨髄性白血病などの）、特発性の好酸球症候群、喘息、鼻炎および皮膚アレルギーなどのアレルギー性炎症を治療するのにとりわけ有用である。これらおよびその他の状態は本明細書では内因性の天然型ＩＬ −５または内因性の自然に生じた突然変異型ＩＬ−５の異常な効果により生じまたは促進されるものと考える。従って、本発明はこれまで述べてきた修飾されたＩＬ−５、そして特にＩＬ− ５Ａｒｇ¹³の有効量を該治療を行うのに十分な時間および条件の下で哺乳類に投与することを含んで成る治療方法を提供する。この治療は、アレルギー、一部の骨髄性白血病（好酸球性骨髄性白血病などの）、特発性好酸球症候群、喘息、鼻炎および皮膚アレルギーなどのアレルギー性炎症の治療の局面で行われることが好ましい。一般に、治療対象である哺乳類はヒト、霊長類、家畜動物、愛玩動物または実験室テスト動物である。哺乳類はヒトであることが最も好ましい。１種の修飾されたＩＬ−５を投与してもよく、あるいは同一ＩＬ−５の変異型の組み合わせを投与してもよい。例えば、一連のＩＬ−５変異型はＩＬ−５Ａｒｇ¹³、ＩＬ−５Ｌｙｓ¹³、ＩＬ−５Ｇｌｎ¹³およびＩＬ−５Ａｓｎ¹³の二つ以上から選択された組み合わせとして使用することができよう。本発明のＩＬ−５変異型は好酸球増多症そして喘息などのそれから生ずる状態を治療するのに特に有用である。投与は静脈内投与によるのが好ましいが、一連の他の投与形態も本発明により予定されており、その中にはＩＬ−５変異型の移植物または制御放出を可能とする他の形態、噴霧器型または鼻スプレーを経由するものが含まれる。局所適用の後に浸入を許すＩＬ−５の修飾型も本発明に包含される。上記のＩＬ−５への修飾に加え、本発明はさらに一群の他のＩＬ−５誘導体を提供する。このような誘導体はＩＬ−５ポリペプチドおよび対応する遺伝子配列の断片、一部、部分、突然変異体、同族体および類似体を含む。誘導体は、ＩＬ−５に対する１個または多重のアミノ酸の置換、欠失および／または付加あるいはＩＬ− ５をコードする遺伝子配列に対する１個または多重のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加をも含む。誘導体は本来のヌクレオチド(resident nucleoti de)に対する修飾をも予定する。ヌクレオチドの変更は対応するアミノ酸配列の変更または他の効果の中でもとりわけグリコシレーションパターンの変更を生じる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対する「付加」には、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクとの融合あるいはヌクレオチド配列への融合が含まれる。本明細書で「ＩＬ−５」というときは、機能的誘導体すなわちＩＬ−５と免疫学的に相互作用する誘導体を含むその全ての誘導体を指す。このような誘導体はすべて上記の第１α−ヘリックスに対する修飾に加えられるであろう。従って、このような誘導体はＩＬ−５Ａｒｇ¹³、ＩＬ−５Ｌｙｓ¹³、ＩＬ−５Ｇｌｎ¹³またはＩＬ−５Ａｓｎ¹³に加えられるであろう。本発明で予定するＩＬ−５の類似体は、側鎖に対する修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクの合成の間における非天然型アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、およびタンパク性の分子またはそれらの類似体に対しコンホーメーション上の制約を課す架橋剤の使用およびその他の方法の使用を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明はＩＬ−５のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することができ、あるいはＩＬ−５の機能的類似体として作用することができるＩＬ−５の化学的類似体をさらに提供する。化学的類自体は必ずしもＩＬ−５から誘導されるとは限らず、ある種のコンホーメーション上の類似性を共有するものであることもある。また、化学的類自体はＩＬ−５のある種の物理化学的性質を模倣するように特別に設計することができる。化学的類自体は化学的に合成することができ、あるいは、例えば、天然産物のスクリーニングの後に検出することができる。本発明が予定する他の誘導体には、完全にグリコシル化されていない分子から完全にグリコシル化されている分子まで、そして天然にグリコシル化された分子から改変されたグリコシレーションパターンを持つ分子までの一連のグリコシレーション変異型が含まれる。改変されたグリコシレーションパターンは異なる宿主細胞中で組換え体分子を発現させることにより得ることができる。これらのすべての型の修飾が、修飾されたＩＬ−５分子を個体に投与するときまたは診断薬として使用するとき、これらを安定化するために重要である。これらの修飾は修飾されたＩＬ−５分子の拮抗性を付加し、補完し、あるいは他の方法で促進することができる。従って、本明細書で「修飾された」ＩＬ−５というときは、第１α−ヘリックス内に改変されたアミノ酸配列を持つＩＬ−５に対する参照、並びに適当な場合には、一連のグリコシレーション変異型、分子の他の部分におけるアミノ酸の変化、分子および融合分子への化学的修飾を持つＩＬ−５に対する参照をも含んでいる。本発明はこれまで述べてきた修飾されたＩＬ−５分子またはそれらの組み合わせを含んで成る薬学的組成物をも提供する。従って、本発明は、修飾されたＩＬ−５を含んで成る薬学的組成物であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックスを有するアミノ酸配列を含むものであり、該第１α−ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものであり、該組成物が一つ以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤をさらに含むものである、薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、修飾されたヒトＩＬ−５または哺乳類のそれらの同族体を含んで成る薬学的組成物であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α− ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含んでいるものであり、Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該組成物が一つ以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤をさらに含むものである薬学的組成物を提供する。ＸａａはＸａａⁿであり、ｎはアミノ酸位置１３であることか好ましい。ＸａａはＡｒｇであることが好ましい。別の関連する態様では、本発明はＩＬ−５に拮抗することができる薬学的組成物であって、修飾されたＩＬ−５がその第１α−ヘリックス中に下記のアミノ酸配列を有するものでありＸａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択されるものである組成物を提供する。ＸａａはＡｒｇであることが好ましい。この薬学的組成物は、他のＩＬ−５変異型を含む他の薬学的に活性な分子を含むこともできる。薬学的組成物中の修飾されたＩＬ−５分子および他の成分は、以下には「活性薬剤」または「活性化合物」と呼ばれる。注射可能な用途に適する薬学的剤型としては、滅菌水溶液（水に可溶な場合）または滅菌分散剤および滅菌注射可能溶液または滅菌分散剤の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌やカビなどの微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。担体は、例えば、水、マンニトールグリシンまたはそれらの適当な混合液を含む溶媒または分散培地であることができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサル(thirmerosal)および同種のものにより行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期間吸収は組成物中に吸収を遅延させる物質を使用することにより行うことができる。滅菌した注射可能溶液は、適当な溶媒中の必要な量の活性化合物を上記の他の成分の必要なもの各種と混合し、その後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散剤は基本分散培地と上記のものの中の必要な他の成分とを含む滅菌ビークル中に各種の滅菌活性成分を混合することにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は活性成分プラス必要な付加的成分の粉末をそれらの予め濾過滅菌した溶液から形成させる真空乾燥法および凍結乾燥法である。マンニトールグリシンは、特別有用な処方剤(formulation)である、そして修飾されたＩＬ−５分子が静脈滴下により投与される場合に特にそうである。本発明は鼻スプレーや噴霧器型の吸入に適する剤型にも及ぶ。また、制御放出用組成物も一連の移植物と同様に調製することができる。適当に修飾すると、これらの分子はクリーム、ローションまたはゲルとすることもできる。クリーム、ローションまたはゲルに適する担体としては、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールおよび同種のものが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤としては、いずれかまたはすべての溶媒、分散培地、そして抗細菌剤および抗カビ剤が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような培地や物質の使用は当技術分野でよく知られている。通常の培地や物質がこの活性成分と配合禁忌である場合を除き、治療用組成物におけるそれらの使用は本発明によって予定されている。補足的な活性成分をこの組成物中に組み込むこともできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位剤型として非経口的組成物を製剤化することは特に有利である。投与量単位剤型とは、本明細書で使用されるとき、治療対象である哺乳類のために単一の投与量として適する物理的に区別された単位を指す。各単位は望まれる治療上の効果をもたらすように計算された活性物質の予め計量された量を必要な薬学的担体と共に含んでいる。本発明の新規な投与量単位剤型のための仕様は、（ａ）活性物質のユニークな特性および達成すべき特定の治療上の効果、および（ｂ）ＩＬ−５分子またはＩＬ−５レベルの異常に関係しそしてそれにより促進される疾病状態を有する生命体の病気の治療のためのこのような活性物質を調合する技術に固有の制約、により左右されそして直接依存する。主要な活性成分は、便利で効果的な投与ができるように、これまでに開示されたような投与量単位剤型中に適当な薬学的に許容され得る担体と共に有効量が調合される。単位投与量剤型は、例えば、主要な活性化合物を０．５μｇから約２０００ｍｇ／ｍｌの範囲の量で含むことができる。割合で表すと、活性化合物は一般に担体１ｍｌ当たり約０．５μｇから約２０００ｍｇまで存在する。補足的な活性成分を含む組成物の場合には、投与量は該成分の通常投与量および投与方法を参照することにより決定される。薬学的組成物は標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターなどの遺伝子分子を含むこともできる。ここで、ベクターは修飾されたＩＬ−５の発現または修飾されたＩＬ−５の活性を調節することができる核酸分子を担っているものである。かかるベクターは、例えば、ウイルスベクターであることができる。本発明のさらに別の側面は、修飾されたＩＬ−５分子およびそれらの誘導体に対する抗体に関する。このような抗体はモノクローンまたはポリクローンであることができ、そして修飾されたＩＬ−５またはそれらの誘導体にたいして特異的に産生させることができる。後者の場合には、修飾されたＩＬ−５またはその誘導体はまず担体分子と混合することが必要であるかも知れない。本発明の抗体および／または組換え修飾ＩＬ−５またはその誘導体は治療剤または診断薬として特に有用である。例えば、修飾されたＩＬ−５およびその誘導体はＩＬ−５に対して天然に生ずる抗体をスクリーニングするために使用することができる。これらは、例えば、自己免疫疾患の一部に起こり得る。また、特異的抗体は修飾されたまたは突然変異型のＩＬ−５をスクリーニングするために使用することができる。このような検定のための技法は当技術分野でよく知られており、例えば、サンドイッチ検定法およびＥＬＩＳＡが例示できる。ＩＬ−５レベルの知識はある種の癌または癌の素因の診断のためまたは修飾されたＩＬ−５分子が用いられるときの治療プロトコルを監視のために重要であり得る。本発明の修飾されたＩＬ−５に対する抗体は、モノクローンまたはポリクローンであり得る。また、Ｆａｂ断片のような抗体の断片も使用することができる。さらに、本発明は組換え抗体および合成抗体にも及び、そして抗体ハイブリッドにも及ぶ。「合成抗体」とは本明細書では抗体の断片およびハイブリッドをも含むものと考える。本発明のこの側面の抗体は免疫治療において特に有用であり、アポプトシス (apoptosis)を評価するためあるいは治療法のプログラムを監視するための診断用具として使用することもできる。例えば、特異的抗体は修飾されたＩＬ−５タンパクをスクリーニングするために使用することができる。後者は、例えば、細胞抽出物または他の生物体液中の修飾されたＩＬ−５のレベルをスクリーニングするためのまたは組換え手段により作られた修飾されたＩＬ−５を培養上清から精製するための手段として重要となるであろう。本明細書で予定される検定のための技法は当技術分野で公知であり、例えば、サンドイッチ検定法およびＥＬＩＳＡが含まれる。最初に述べた上記の抗体に対する第２の抗体（モノクローン、ポリクローンまたは抗体の断片または合成抗体）のいずれかを含めることも本発明の範囲内である。第１および第２の抗体は両方とも検出検定に使用することができ、あるいは第１の抗体は市販されている抗免疫グロブリン抗体と共に使用することができる。本発明で予定される抗体は修飾されたＩＬ−５の何らかの部分に対して特異的な如何なる抗体をも含む。ポリクローンおよびモノクローン抗体は両方とも酵素またはタンパクで免疫化することにより得ることができ、そしていずれのタイプも免疫検定に利用することができる。両方のタイプの血清を得る方法は、当技術分野でよく知られている。ポリクローン血清はあまり好ましくないが、適当な実験室動物に修飾されたＩＬ−５またはそれらの抗原性部分の有効量を注射し、その動物から血清を集め、そして公知の免疫吸着法のいずれかにより特異的血清を単離することにより比較的容易に調製することができる。この方法により調製される抗体はどのタイプの免疫検定にも実際に利用することができるが、これは調製物の潜在的不均一性のため一般的にはあまり好ましくない。免疫検定におけるモノクローン抗体の使用は、それを大量に製造する能力と生産物の均一性のために特に好ましい。不死化細胞系と免疫原調製物に対し感作されたリンパ球の融合により誘導されるモノクローン抗体製造のためのハイブリドーマ細胞系の調製は、当技術分野の熟練者によく知られている技法により行うことができる。本発明の別の側面はある主体から得られた生物試料中の修飾されたＩＬ−５を検出する方法であって、修飾されたＩＬ−５またはその誘導体または同族体に対して特異的な抗体と該生物試料を、抗体ー修飾されたＩＬ−５複合体が形成するのに十分な時間および条件の下で接触させる工程、および次いで該複合体を検出する工程を含んで成る方法を提供する。本発明は、修飾されたＩＬ−５遺伝子またはその誘導体を検出するためのＰＣＲ分析を含むような遺伝子検定法をも提供する。別の方法としては、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）や特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成などの直接ヌクレオチド配列決定または突然変異走査(mutation scanning)が含まれる。本発明は本発明の修飾されたＩＬ−５をコードする核酸分子に及ぶ。このような核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。核酸分子がＤＮＡ形であるときは、それはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。本発明の核酸分子のＲＮＡ形は一般にｍＲＮＡである。本発明の核酸分子は一般に単離された形態であるが、ベクター分子、特に発現ベクター分子などの他の遺伝子分子に取り込まれ、あるいは連結されあるいはその他の方法で融合または結合されていることもできる。ベクターおよび発現ベクターは一般に複製することができ、そして適用可能であれば、原核細胞または真核細胞の一つまたは両方の中で発現することができる。原核細胞は大腸菌、バチルス種(Bacillus sp)およびシュードモナス種(Pseudomonas sp)を含むことが好ましい。好ましい真核細胞としては、酵母細胞、カビ細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞が挙げられる。従って、本発明の別の側面は遺伝子構築物であって、ベクター部分と哺乳類の、より好ましくはヒトの修飾されたＩＬ−５遺伝子部分とを含んで成り、該修飾されたＩＬ−５遺伝子部分が修飾されたＩＬ−５ポリペプチドまたは機能的にまたは免疫学的に相互作用し得るその誘導体をコードすることができるものである遺伝子構築物を提供する。上記遺伝子構築物の修飾されたＩＬ−５遺伝子部分は、ベクター上のプロモーターに機能的に連結されており、該プロモーターが適当な細胞中で該修飾されＩＬ−５遺伝子部分の発現を制御することができるようなものであることが好ましい。さらに、この遺伝子構築物の修飾されたＩＬ−５遺伝子部分は、グルタチオン −Ｓ−トランスフェラーゼまたはその一部をコードするヌクレオチド配列などの別の遺伝子配列に融合された遺伝子のすべてまたは部分を含むこともできる。従って、本発明の別の側面は、修飾されたＩＬ−５をコードするまたはそれをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含んでおり、該第１α−ヘリックス中の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものである単離された核酸分子を提供する。上記ヌクレオチド配列は、下記のアミノ酸配列を第１α−ヘリックス中に含むヒトの修飾されたＩＬ−５または哺乳類の同族体をコードするものであり、Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性または非酸性のアミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘発される分裂促進効果に対し拮抗作用を示すものであることが好ましい。ＸａａはＸａａⁿであり、ｎはアミノ酸位置１３であることが好ましい。ＸａａはＡｒｇであることが好ましい。本発明はこのような遺伝子構築物に及び、そして該遺伝子構築物を含む原核細胞または真核細胞に及ぶ。本発明は、アレルギー、一部の骨髄性白血病（好酸球性骨髄白血病など）、特発性好酸球症候群、喘息、鼻炎および皮膚アレルギーなどのアレルギー性炎症の治療のための治療薬の製造における、これまで述べてきた修飾されたＩＬ−５の使用をさらに提供する。本発明は下記の非限定的な実施例および／または図面を参照することによりさらに説明する。図面の簡単な説明図１は（ａ）ＩＬ−５Ｅ１３Ｒ細菌発現プラスミドであるｐＰＰ３１の図式的表示であり、そして（ｂ）ＭＨＹＨ₃−ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）のＤＮＡ／アミノ酸配列である。Ｅ１３Ｒ突然変異は丸で囲んである。図２はＩＬ−５により媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗する能力を測定するためのＥ１３Ｒの滴定を示すグラフ表示である。図３ＡはＩＬ−５により媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗する能力を測定するためのＥ１３Ｒの滴定を示す。この数値はＥ１３Ｒが検出可能なアゴニスト活性を示さないことをも示す。図３ＢはＥ１３ＲがＩＬ−３により媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗し得ないことを示す。図３ＣはＥ１３ＲがＧＭ−ＣＳＦにはり媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗し得ないことを示す。図４はＴＦ１．８細胞に対する分裂促進効果を測定するためのＩＬ−３の滴定を示すグラフ表示である。そして、高レベルのＥ１３Ｒがこの活性を妨害し得ないことを示す。図５はＩＬ−５に対するＴＦ１．８の増殖試験を示すグラフ表示である。ＷＴＩＬ−５（ＨＩ）は細菌中の封入体として調製し、２Ｍ尿素中でダイマーとし、逆相ＨＰＬＣで精製し、ＰＢＳ中でバッファー交換で濃縮した。決して乾燥させなかった。ＩＬ−５ＷＴはＷＴＩＬ−５（ＨＩ）と同様にして調製したが、濃縮後に調製物を乾燥し、２５ｍＭグリシンおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのマンニトール中に溶解した点で異なる。図６はＴＦ１．８細胞に対する分裂促進効果を測定するためのＧＭ−ＣＳＦの滴定を示すグラフ表示であり、高レベルのＥ１３Ｒがこの活性を妨害し得ないことを示す。図７はＥ１３ＲがＩＬ−５により誘発される好酸球抗体依存性細胞により媒介される細胞毒性を阻害することを示すグラフ表示である。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５が存在しない場合は、⁵¹Ｃｒ-放出％は４％であった。図８はＥ１３ＲがＩＬ−５により誘発される好酸球コロニー形成を阻害することを示すグラフ表示である。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５が存在しない場合は、好酸球コロニーは検出されなかった。実施例１ＩＬ−５−アンタゴニスト活性を有する、インターロイキン−５（ＩＬ−５）の荷電逆転突然変異体の製造本発明者らは、１３位のグルタミン酸残基（Ｅ１３）がアルギニン残基（Ｒ）で置換されているＩＬ−５の荷電逆転突然変異体〔Ｅ１３Ｒ〕を発現させ、精製した。この突然変異体、Ｅ１３Ｒ、はイン・ビトロでＩＬ−５の分裂促進効果に対し特異的な拮抗作用を示す。発現を最大にするため、このタンパクは、現在、リーダー配列であるＭＨＹＨ₃（ＭＨＹＨＨＨ）（配列番号：３）との融合タンパクとして発現させている。このリーダー配列は、配列番号：１および２中のアミノ酸１〜６を含んでいる。しかしながら、このリーダー配列の除去（または別のリーダー配列によるその置換）がＥ１３Ｒの拮抗効果に悪影響を与えると信ずべき理由はない。ＭＨＹＨ₃およびＥ１３Ｒの配列の図式的表示は図１に示してある。Ｅ１３Ｒのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は配列番号：１および２に示してある。実施例２ＭＨＹＨ₃ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）をコードする細菌発現プラスミドの製造ヒトＩＬ−５Ｅ１３Ｒ突然変異体の解読配列はＩＬ−５野生型配列から部位特異的突然変異誘発により誘導された。コドン１３はＡｒｇコドンに変換した。ここにリストした付加的なコドン変化は、大腸菌における翻訳効率を増加させるための細菌のコドン優先に基づくものであり、アミノ酸の変化をもたらすものではなかった。突然変異体のＤＮＡ断片は、プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により修飾して、５’末端にリーダーＭＨＹＨ₃、３’末端に停止コドンをコードする配列を作成した。増幅された断片をプラスミドｐＥＣ６１１中にサブクローニングして、ｔｒｃプロモーターを含む発現プラスミドｐＰＰ３１を作成した。実施例３ＭＨＹＨ₃ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）の生産、単離および再生（refolding）醗酵は流加培養法（Fed-Batch method）で行う。Ｅ１３Ｒ−発現プラスミドであるｐＰＰ３１で形質転換された大腸菌ＭＭ２９４／ｐＡＣＹＣＬａｃＩ^qを３７℃で最小培地に生育させる。ｐＨは細菌が成長する間ＮＨ₄ＯＨの添加によりｐＨ７．０に一定に保つ。ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）の発現は高細胞密度（ＯＤ₆₀₀＞２０）でＩＰＴＧの添加かまたは乳糖の添加かのいずれかにより誘導される。誘導は５時間（誘導期を含まず）続けると、タンパクは不溶性の封入体（ＩＢｓ）として発現する。細胞を高圧ホモジナイゼーションにより溶解する。細胞断片から不溶性封入体の一次分離はディフレンシャルセントリフュゲーションにより行い、その後不溶性封入体を洗浄し、もう一度ホモジナイズする。最終的遠心分離工程により、再生用には十分にきれいな不溶性封入体が単離される。醗酵、誘導、単離および再生の諸条件は下記のようなものである。１．醗酵Ａ．接種１．ｐＰＰ３１を保持する大腸菌ＭＭ２９４／ｐＡＣＹＣｌａｃＩ^qをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含む最小培地プレート上に−８０℃グリセリンストックから塗布し、３７℃で一晩成長させた。２．誘導物質をふくむ２０ｍｌ振盪フラスコ培養物の顕微鏡検査により、または誘導物質の存在下または非存在下に寒天プレート上でのコロニーサイズにより、多数のコロニーについてＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）の発現レベルを評価した。誘導物質としてはＩＰＴＧを用いた。３．寒天プレートから選択された１個のコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含む窒素の豊富な最小培地（２）２０ｍｌ中に移植し、振盪しながら、３７℃で一晩培養した。４．２２リットル醗酵槽中で１０リットルのＣ２を滅菌し、一晩培養を極めて低い密度で接種した。成長は３７℃で行い、ｐＨはＮＨ₄ＯＨまたはＨ₂ＳＯ₄の添加により７．０に維持された。５．振盪は手動で制御し、通気は酸素飽和レベルで自動的に制御し１０％ｖ／ｖｐＯ₂以上を維持するようにした。１６〜２０時間でグルコースが枯渇した後、菌体に付加的な塩を含む濃グルコース溶液をフィードした。栄養素のフィード流速はｐＨまたは酸素飽和レベルにより決定された。Ｂ．誘導１．Ａ₆₀₀＝＞２０という光学密度で、Ｅ１３Ｒアンタゴニストの組換え体発現が誘導された。この場合、乳糖系の栄養素フィードに変えることにより誘導を行った。誘導は３７℃、ｐＨ７．０で５時間継続させた。試料を誘導直前および誘導後１時間ごとに採取して不溶性封入体の存在を顕微鏡で検査した。そのサイズはディスク遠心分離により測定した。２．培養物は４℃で一晩貯蔵した。２．ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）封入体の一次単離１．ホモジナイゼーション−工程１培養物はガウリン３０ＣＤホモジナイザーを１３，５００ｐｓｉで５回通過させた。通過の間、ホモジネートは冷却した。次いで、ホモジネートを等容量のＲＯＨ₂Ｏで希釈した。不溶性封入体のサイズはディスク遠心分離で再測定した。２．遠心分離−工程１ホモジネートはウエストファリアＳＢ−７セパレーター中で、不溶性封入体のサイズにより定められる流速で、９，２１０ｒｐｍの一定速度で遠心分離した。この第１工程から集められた濃縮物は２．５％ｗ／ｖまたはそれ以下に希釈された。３．ホモジナイゼーションー工程２不溶性封入体の懸濁液を１３，５００ｐｓｉでガウリン３０ＣＤホモジナイザーを１回通過させた。不溶性封入体のサイズは再度ディスク遠心分離により測定された。４．遠心分離−工程２ホモジネートをウエストファリアＳＡ−１セパレーター中で、不溶性封入体のサイズにより定められる流速で、９，７００ｒｐｍの一定速度で遠心分離した。再生のために、不溶性封入体をまず５〜１０ｍＭジチオスレイトールを含みｐＨ９．５に緩衝化された６Ｍグアニジン−塩酸中に溶解する。ＭＨＹＨ₂ＩＬ− ５（Ｅ１３Ｒ）の還元型ＩＬ−５モノマーを次に５ｍＭジチオスレイトールを含みｐＨ９．５に緩衝化された６Ｍグアニジン−塩酸中、ゲル濾過クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography）(例えば、Superose 12(ファルマシア)) により、非還元タンパクから精製する。精製された還元型モノマーは、次にｐＨ９．５に緩衝化された２Ｍ尿素中に、最終タンパク濃度が０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌまで希釈することにより、ダイマーに再生される。正確に畳み込まれたダイマーの精製は、適当なカラム（例えば、ブラウンリーのブチル−シリカ、緩衝液Ａとして水中０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および緩衝液Ｂとしてアセトニトリル中０．１％ｖ／ｖＴＦＡを用いるもの）を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）上の逆相クロマトグラフィーにより行う。精製された、正確に畳み込まれたタンパクは賦形剤として添加されたマンニトールおよびグリシンの存在下にＨＰＬＣ緩衝液から凍結乾燥後に生物学的バッファ中に回収することができる。精製されたタンパクの同定は質量分析およびＮ−末端配列決定を用いて確認することができる。実施例４ＩＬ−５に対する拮抗活性の検定Ｅ１３ＲによるＩＬ−５拮抗作用についての生物学的検定はＩＬ−５により誘導される細胞増殖を検出するため放射標識化チミジンの取り込みを利用する。使用する細胞系、ＴＦ１．８は、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに対する受容体を発現するヒト赤白血病細胞系であるＴＦ１のサブラインである。ＴＦ１．８はＩＬ−５受容体の発現に対して選択されたという点でＴＦ１と異なっている。ＩＬ−５によるＴＦ１．８増殖の刺激はＥ１３Ｒの３０倍過剰の存在下では５０％まで阻害され、そして３００倍過剰の存在下では絶滅させられる（図２）。しかしながら、ＩＬ−３またはＧＭ −ＣＳＦによるＴＦ１．８増殖の刺激はＥ１３Ｒのの存在により影響を受けない。これらの結果はＥ１３ＲがＩＬ−５の特異的なかつ強力なアンタゴニストであることを証明するものである。検定（１５００ｒｐｍ／５ｍｉｎ／ＲＴ）前に、細胞を２４時間洗浄し、ついでそれをサイトカインを含まない培地に再懸濁する。上記の培養培地に標準液および試料を必要な濃度に（例えば、１０００ｎｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの範囲で）希釈する。希釈は３連で行った。滅菌した９６穴平底ミクロタイタープレート中に１００μｌの最終容量で、適当な標準液（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、など）および試料の希釈液を等分に分配する。洗浄した細胞の生存性をチェックし、ついで５×１０⁴細胞／穴の濃度で細胞を再懸濁する。各穴は希釈された標準液／試料の１００μｌ＋再懸濁細胞の１００μｌを含む。プレートは、加湿ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で７２時間インキュベートする（ＴＦ−１およびＴＦ１．８細胞に対しては４８時間）。細胞を³Ｈ−チミジン（貯蔵液を１／２０希釈し、ついで穴当たり１０μ ｌ添加する）０．５μＣｉ／穴でパルスする。加湿ＣＯ₂インキュベーター中で、プレートを３７℃で５時間インキュベートする。セルハーベスターを用いて各穴中の内容物をろ紙上に収穫し、液体シンチレーション計測によりＤＮＡ中に取り込まれた放射活性を測定する。その結果を図２から図６に示す。これらの結果はＥ１３ＲがＩＬ−５活性に対し特異的な拮抗作用を示すが、ＧＭ−ＣＳＦ活性またはＩＬ−３活性は妨害しないことを示す。特に、これらの図はＥ１３ＲがＩＬ−３により誘導されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗せず、ＧＭ−ＣＳＦにより誘導されるＴＦ１．８細胞の増殖にも拮抗しないことを示す。実施例５実施例６実施例７実施例８実施例９好酸球に対するＥ１３Ｒの拮抗活性Ｅ１３Ｒの好酸球機能に対する効果を測定するため、抗体依存性細胞により媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）検定を使用した。この検定はクロムで放射標識された標的細胞であって好酸球により認識されるある種の抗体を発現するものを殺す好酸球の能力を測定する(ヴァダスら、J.Immunol．130:795，1983)。血液は健康な供与者から集め、好酸球はデキストランで赤血球を除去した後、白血球をメトリズアミド(metrizamide)の勾配分離で除去することにより調製した（ヴァダスら、J.Immunol．122:1228，1979）。好酸球の純度は９５％を越えた。次いで、好酸球を標的細胞当たり１００個の好酸球の比率で標的細胞と共にインキュベートし、そしてＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）かまたはＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ）かの固定用量およびＥ１３Ｒの滴定を行った。図７はＥ１３Ｒが用量依存的にＩＬ−５により誘導されるＡＤＣＣに拮抗したが、ＧＭ−ＣＳＦにより誘導されるＡＤＣＣに対しては影響を与えなかったことを示す。数値は３連の平均値およびその標準誤差である。実施例１０好酸球の先祖の増殖および分化に対するＥ１３Ｒの影響健康な供与者から骨髄を集め、密度遠心分離にかけた(Lymphopr ep.)。その単核細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）かまたはＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ）かの固定用量で補足しそしてＥ１３Ｒの滴定をした寒天上でプレート培養した。細胞は３７℃で２週間成長させた。次いで、寒天プレートをグルタルアルデヒドで固定した後プレートをルクソールファストブルーで染色して好酸球のコロニーを検出した。図８はＥ１３Ｒが用量依存的にＩＬ−５のコロニー増殖効果に拮抗したが、一方、Ｅ１３Ｒは好酸球コロニー形成のＧＭ−ＣＳＦによる刺激に対しては影響を与えなかったことを示す。数値は３連の平均値およびその標準偏差である。当技術分野の熟練者は本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以外に変更および修飾を受け得るものであることを認めるであろう。本発明はこのような変更および修飾のすべてを包含するものと理解すべきである。本発明は本明細書で個別にまたは集合的に言及されあるいは指摘された工程、特徴、組成物および化合物のすべてをも包含し、そして上記の工程または特徴のどの二つ以上の組み合わせのいずれかおよびすべてをも包含する。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１２月９日（１９９９．１２．９）【補正内容】（１）明細書第３７頁の実施例７の配列番号：７における第１２位の「Ｌａ」を「Ｌｅｕ」に訂正致します。（２）明細書第３７頁の実施例８の配列番号：８における第４位の「Ｌａ」を「Ｌｅｕ」に訂正致します。（３）配列表の配列番号：７における第１２位の「Ｌａ」を「Ｌｅｕ」に訂正致します。（４）配列表の配列番号：８における第４位の「Ｌａ」を「Ｌｅｕ」に訂正致します。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＫＣ０７Ｋ 14/54 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者エンゼルロペスオーストラリア国、エス．エイ．5081、メディンディー、アーサーストリート 15 番地 (72)発明者マスューヴァダスオーストラリア国、エス．エイ．5152、スターリング、ブランチロード８番地 (72)発明者フランセスシャノンオーストラリア国、エス．エイ．5152、クラファース、ザクレセント８番地 (72)発明者スタンバスティラスオーストラリア国、エス．エイ．5000、アーデルエイド、ボニソンクローズ 21番地 (72)発明者アランウイリアムヘイオーストラリア国、エス．エイ．5244、ウッドサイド、ハチェンスロード 12番地

Claims

【特許請求の範囲】１．第１のα−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含んで成る修飾されたインターロイキン−５（ＩＬ−５）であって、該第１のα−ヘリックス内にある酸性または酸様の性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されており、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５のアンタゴニストとして作用するものである修飾されたＩＬ−５。２．修飾を受けるＩＬ−５が哺乳類起源のものである請求項１記載の修飾されたＩＬ−５。３．修飾を受けるＩＬ−５がヒト起源のものである請求項２記載の修飾されたＩＬ−５。４．この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することである請求項３記載の修飾されたＩＬ−５。５．この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＧｌｎまたはＡｓｎまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することである請求項３記載の修飾されたＩＬ−５。６．第１のα−ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含んで成る修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体、ここで、Ｘａａは好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘導される分裂促進効果(mitogeniceffects)に拮抗作用を示すものである。７．ＸａａがＡｒｇである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体。８．ＸａａがＬｙｓである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体。９．ＸａａがＧｌｎである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体。１０．ＸａａがＡｓｎである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体。１１．その第１α−ヘリックス内のアミノ酸配列に修飾を受けているＩＬ−５分子を含んで成るＩＬ−５アンタゴニストであって、アミノ酸残基１３が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基により置換されているものであるＩＬ− ５アンタゴニスト。１２．アミノ酸残基１３がＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択されるものである請求項１１記載のＩＬ−５アンタゴニスト。１３．配列番号：２に実質的に記載されているアミノ酸配列を含んで成る請求項１１または請求項１２記載のＩＬ−５アンタゴニスト。１４．修飾されたＩＬ−５を含んで成る薬学的組成物であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含むものであり、該第１α −ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものであり、該組成物が一つ以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤をさらに含むものである組成物。１５．修飾を受けるＩＬ−５が哺乳類起源のものである請求項１４記載の薬学的組成物。１６．修飾を受けるＩＬ−５がヒト起源のものである請求項１５記載の薬学的組成物。１７．この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することである請求項１６記載の薬学的組成物。１８．この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＧｌｎまたはＡｓｎまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することである請求項１６記載の薬学的組成物。１９．配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列を有する修飾されたＩＬ−５を含んで成る請求項１７記載の薬学的組成物。２０．修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体を含んで成る薬学的組成物であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含むものであり、Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該組成物が一つ以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤をさらに含むものである組成物。２１．このＩＬ−５のＸａａがＡｒｇである請求項２０記載の薬学的組成物。２２．このＩＬ−５のＸａａがＬｙｓである請求項20記載の薬学的組成物。２３．このＩＬ−５のＸａａがＧｌｎである請求項２０記載の薬学的組成物。２４．このＩＬ−５のＸａａがＡｓｎである請求項２０記載の薬学的組成物。２５．修飾されたＩＬ−５が配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列を含むものである請求項２０記載の薬学的組成物。２６．治療を行うのに十分な時間および条件の下で修飾されたＩＬ−５の有効量を哺乳類に投与する工程を含んで成る該哺乳類を治療する方法であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内にアミノ酸配列を含むものであり、該第１α−ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものである方法。２７．修飾を受けるＩＬ−５が哺乳類起源のものである請求項２６記載の方法。２８．修飾を受けるＩＬ−５がヒト起源のものである請求項２７記載の方法。２９．この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することである請求項２０記載の方法。３０．この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＧｌｎまたはＡｓｎまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することである請求項２０記載の方法。３１．治療を行うのに十分な時間および条件の下で修飾されたＩＬ−５の有効量を哺乳類に投与する工程を含んで成る該哺乳類を治療する方法であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含むものであり、Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘導される分裂促進効果に対し拮抗作用を示すものである方法。３２．このＩＬ−５のＸａａがＡｒｇである請求項３１記載の方法。３３．このＩＬ−５のＸａａがＬｙｓである請求項３１記載の方法。３４．このＩＬ−５のＸａａがＧｌｎである請求項３１記載の方法。３５．このＩＬ−５のＸａａがＡｓｎである請求項３１記載の方法。３６．配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列を有する修飾されたＩＬ−５の投与を含んで成る請求項２６または請求項３１記載の方法。３７．組換えタンパクを製造する方法であって、ヌクレオチド配列を発現して該組換えタンパクを製造することができる遺伝子構築物を細胞内に導入する工程、この細胞を該ヌクレオチド配列の発現を許す条件下に置く工程、封入体の形で発現される組換えタンパクを収集する工程および該封入体を該組換えタンパクを分散させ、部分的に巻き戻すのに十分高いｐＨの条件の下でカオトロピック剤（ chaotropic agent）中で溶解させる工程、該巻き戻された組換えタンパクを希釈しそれを再生条件下に置く工程および次いで該再生された組換えタンパクを精製する工程を含んで成る方法。３８．このカオトロピック剤が尿素である請求項３７記載の方法。３９．請求項３８記載の方法であって、組換えタンパクが第１α−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含む修飾されたＩＬ−５であり、該第１α−ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものであり、該修飾されたＩＬ− ５がＩＬ−５のアンタゴニストとして作用するものである方法。４０．請求項３８記載の方法であって、修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含むものであり、Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘導される分裂促進効果に対し拮抗作用を示すものである方法。４１．ヌクレオチド配列が該組換えタンパクに融合したリーダー配列をさらにコードするものである請求項３７記載の方法。４２．リーダー配列がアミノ酸配列Met His Tyr His His Hisである請求項４１記載の方法。