JP2001510440A

JP2001510440A - Mucin conjugate peptide vaccine

Info

Publication number: JP2001510440A
Application number: JP53370097A
Authority: JP
Inventors: リビングストン、フィリップ・オー; ザング、シェングル
Original assignee: スローン―ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-20
Publication date: 2001-07-31
Also published as: EP0923605A1; AU2536997A; EP0923605A4; CA2249395A1; AU734253B2; WO1997034921A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ムチンを認識する免疫応答を生じることができるワクチンであって、対象において免疫応答を刺激または向上するのに有効な量の、免疫原性タンパクに結合したムチンペプチドと、有効量のアジュバントと、薬学的に許容可能な担体とを含有するワクチンを提供する。本発明は更に、ムチンを認識する免疫応答の生成を刺激または向上する方法であって、対象に対して、上記のワクチンを投与することを具備した方法を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides a vaccine that is capable of generating an immune response that recognizes a mucin, comprising an effective amount of a mucin peptide conjugated to an immunogenic protein, to stimulate or enhance an immune response in a subject; There is provided a vaccine comprising an adjuvant and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention further provides a method of stimulating or enhancing the generation of an immune response that recognizes a mucin, comprising administering to a subject a vaccine as described above.

Description

【発明の詳細な説明】ムチン接合体ペプチドワクチンここに開示する発明は、厚生省から賦与されたＮＩＨ，補助金CA61422号による政府の支援の下でなされたものである。従って、アメリカ合衆国政府は本発明における一定の権利を有する。〔発明の背景〕この出願の全体を通して、括弧内に種々の参照文献が引用されている。これら刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、その全体が、本発明の一部をなす参照として本願に組み込まれる。これら参照文献の完全な書誌的引用は、請求の範囲の前の明細書末尾に記載してある。ムチンMUC1のようなムチン類は、上皮起源の多くのヒト癌で多量に発現する、広範にグリコシル化された高分子量（＞200kD）のタンパクである(１−５)。最近の研究によって、MUC1は分子の細胞外部分に20アミノ酸ペプチド(PDTRPAPGSTA PPAHGVTSA)（配列番号７）の可変数のタンデムリピートを含むこと、並びに抗ムチンmAb類および細胞障害性Ｔ細胞により認識される殆どの抗原性エピトープは、該リピート内のAPDTR切片であることが示されている(６−８)。正常組織におけるMUC1の発現は、主に分泌性細胞の頂部表面、即ち免疫系に対するアクセスが最小限の部位に限定される(１，４)。加えて、正常組織に発現したMUC1の広範なグリコシル化によって、ペプチド骨格に対する免疫系の暴露は更に制限される。癌腫では、ムチンのペプチド骨格は完全にはグリコシル化されないので、正常には露出されないペプチド配列が免疫系に露出されることになる(６)。結局、MUC1 ペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、正常なムチンおよび癌腫ムチンの両者におけるアミノ酸配列は同じであるにもかかわらず、乳房、膵臓および卵巣起源の癌に由来する癌腫関連ムチンに対して特異性を示す(９)。MUC1を発現するワクシニア組換え体でラットを免疫感作すると、 MUC1を発現する腫瘍細胞による攻撃からの防御をもたらす(５)。これらの発見は、MUC1に対する免疫感作が可能であること、および該免疫感作は、乳癌または膵臓癌の患者における腫瘍の再増殖を防止し得ることを示唆している。この研究において、出願人は、長さおよび配列が異なるMUC1ペプチドを合成すると共に、種々のアジュバントと混合したこれらペプチドを含有するワクチン、または異なったリンカーを用いてタンパクキャリアであるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合されたこれらペプチドを含有するワクチンを調製した。臨床試験のための準備において、異なったワクチンの液性免疫応答および細胞性免疫応答に対するインパクト、および腫瘍攻撃からの防御性をマウスで比較した。ヒトムチンMUC1は、幾つかの上皮起源の癌において多量に発現されており、その殆どは正常組織における分泌性細胞の頂部表面に限定されている。従って、これは癌の免疫療法における潜在的な目標である。臨床試験の準備において、種々のアジュバントと混合し、または種々のリンカー法を用いてタンパクキャリアであるキーホールリンペットヘモシアニンに結合した長さおよび配列の異なる合成 MUC1ペプチドを含有するワクチンを、マウスにおいて研究した。MUC1ペプチド（ 30アミノ酸を含有する）＋アジュバントQS-21またはBCGは、抗体を誘導することができなかった。しかし、KLHに結合されたMUC1ペプチド（MUC1-KLH）＋QS-21は、免疫感作ペプチドおよびMUC1発現腫瘍細胞に対する高力化の抗体を誘導した。遅延型過敏性、リンパ球増殖および細胞障害性Ｔリンパ球を含むＴ細胞応答は、これらワクチンの何れで免疫感作したマウスにも観察されなかったが、MUC1-KLH で免疫感作されたマウスにおいては、MUC1発現腫瘍細胞からの顕著な防御が観察された。これらの研究に基づいて、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク心イミドエステルリンカーを用いて調製したMUC1-KLH接合体−QS-21を含有するワクチンを調製した。〔発明の概要〕本発明は、ムチンを認識する免疫応答を生じさせ得るワクチンであって、対象における免疫応答を刺激または向上させるのに有効な量の、免疫原性タンパクに結合したムチンペプチドと、有効量のアジュバントと、薬学的に許容可能な担体とを含有するワクチンを提供する。一つの態様において、前記対象はヒトである。もう一つの態様において、前記免疫原性タンパクはキーホールリンペットヘモシアニン、またはキーホールリンペットヘモシアニンの誘導体である。別の態様において、前記ムチンはMUC1である。前記ムチンは、MUC2-5のような他のムチンを含んでいてもよい。当業者は、本発明を他のムチンに適用することができるであろう。更なる態様において、MUC1ペプチドの長さは10アミノ酸〜300アミノ酸の範囲である。一つの態様において、MUC1接合体の有効量は、約１μｇ〜約１ｍｇの量である。もう一つの態様において、前記アジュバントはQS-21である。一つの態様において、QS-21の有効量は、約10μｇ〜約200μｇの量である。別の態様において、QS-21の有効量は約100μｇである。もう一つの態様において、前記対象は癌に冒されており、また該対象において生じる前記免疫応答は癌を効果的に治療する。更なる態様において、前記対象は癌に罹り易く、また当該ワクチンを投与したときに、該対象に生じる免疫応答は癌を有効に予防する。一態様において、前記癌の細胞はその表面にムチンを有する。更なる態様において、前記癌は乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺ガンまたは膵臓癌である。本発明は、上皮起源の他の癌にも適用可能である。本発明はまた、ムチンを認識する免疫応答を生じる方法であって、対象に対して、有効量の上記ワクチンを投与することを具備した方法を提供する。本発明は、癌に冒された対象において癌を治療する方法であって、前記対象に対して、有効量の上記ワクチンを投与することを具備した方法を提洪する。本発明は、癌に罹り易い対象における癌を予防する方法であって、前記対象に対して、有効量の上記ワクチンを投与することを具備した方法を提供する。上記の方法において、前記免疫原性タンパクはキーホールリンペットヘモシアニンまたはキーホールリンペットヘモシアニンの誘導体であり得る。上記方法の一態様において、前記アジュバントはQS-21である。〔図面の簡単な説明〕図１は、MUC1のKLHへの結合を示す図である。〔発明の詳細な説明〕本発明は、ムチンを認識するような免疫応答を生じさせ得るワクチンであって、対象における免疫応答を刺激または向上させるのに有効な量の、免疫原性タンパクに結合したムチンペプチドと、有効量のアジュバントと、薬学的に許容可能な担体とを含有するワクチンを提供する。一つの態様において、前記対象はヒトである。有効量のムチン接合体ペプチドは、単純な滴定実験によって容易に決定することができる。動物を異なった量の接合体ペプチドで免疫感作し、生じた免疫応答で試験すればよい。上記の有効量は、適切な免疫応答を生じるであろう。もう一つの態様において、前記免疫原性タンパクはキーホールリンペットヘモシアニン、またはキーホールリンペットヘモシアニンの誘導体である。他の適切な免疫原性タンパクもまた、本発明において使用することができる。当業者は、免疫応答を誘起できることが知られたムチンペプチドに、試験すべき免疫原性タンパクを結合することによって、免疫原性タンパクの適切さを試験することができる。結合されたムチンペプチドを動物に投与して、該ペプチドが良好な免疫応答を生じることができるかどうかを試験すればよい。良好な免疫応答をもったタンパクは、適切な免疫原性タンパクである。別の態様において、前記ムチンはMUC1である。該ムチンは、MUC2-5のような他のムチンを含んでいてもよい。当業者は、本発明を他のムチン類にも適用することができるであろう。更なる態様において、MUC1ペプチドの長さは10アミノ酸〜300アミノ酸の範囲である。特別の態様において、該ムチンペプチドは、 APDTRPAPGSTAPPAHGVTS、 TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS、 APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS、 VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA、 (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)₂VTSAPDTRPA、からなる群から選択される。更に特別な態様において、前記ムチンペプチドは、 VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAである。一つの好ましい態様において、MUC1接合体の有効量は、約１μｇ〜約１ｍｇの量である。もう一つの態様において、アジュバントはQS-21である。当業者には容易に理解されるように、他の適切なアジュバントを同様に使用してもよい。一つの好ましい態様において、QS-21の有効量は、約10μｇ〜約200μｇの量である。別の態様において、QS-21の有効量は約100μｇである。更に好ましい別の態様において、QS-21の有効量は約100μｇである。もう一つの態様において、前記対象は癌に冒されており、また該対象において生じる前記免疫応答は癌を効果的に治療する。更なる態様において、前記対象は癌に罹り易く、また当該ワクチンの投与に際し、該対象に生じる免疫応答は癌を有効に予防する。一態様において、前記癌の細胞はその表面にムチンを有する。更なる態様において、前記癌は乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺ガンまたは膵臓癌である。本発明は、上皮起源の他の癌にも適用可能である。本発明はまた、対象において、ムチンを認識する免疫応答の生成を刺激または向上させる方法であって、前記対象に対して、有効投与量の上記ワクチンを投与することを具備した方法を提洪する。本発明は、癌に冒された対象において癌を治療する方法であって、前記対象に対して、有効投与量の上記ワクチンを投与することを具備した方法を提供する。本発明は、癌に罹り易い対象における癌を予防する方法であって、前記対象に対して、有効量の上記ワクチンを投与することを具備した方法を提供する。上記の方法において、前記免疫原性タンパクにはキーホールリンペットヘモシアニンまたはキーホールリンペットヘモシアニンの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。上記方法の一態様において、前記アジュバントはQS-21である。別の態様において、前記ムチンはMUC1である。該ムチンは、MUC2-5のような他のムチン類を含んでいてもよい。当業者は、本発明を他のムチン類にも適用できるであろう。このムチンは、MUC2-5のような他のムチン類を含むことができる。当業者は、他のムチン類において本発明を適用できるであろう。更なる態様において、MUC1ペプチドの長さは30アミノ酸〜300アミノ酸の範囲である。特別の態様において、該ムチンペプチドは、 APDTRPAPGSTAPPAHGVTS、 TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS、 APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS、 VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA、 (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)₂VTSAPDTRPA、からなる群から選択される。更に特別な態様において、前記ムチンペプチドは、 VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAである。一つの好ましい態様において、MUC1接合体の有効量は、約１μｇ〜約１mgの量である。もう一つの態様において、アジュバントはQS-21である。当業者には容易に理解されるように、他の適切なアジュバントを同様に使用してもよい。好ましい態様において、MUC1接合体ペプチドの有効量は、約１μｇ〜約１mgの量である。もう一つの態様において、アジュバントはQS-21である。当業者であれば容易に理解できるように、他の適切なアジュバントを同様に使用してもよい。好ましい態様において、QS-21の有効量は約10μｇ〜約200μｇである。更に好ましい別の態様において、QS-21の有効量は約100μｇである。一つの態様において、前記癌細胞はその表面にムチンを有する。更なる態様において、前記癌は乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺ガンまたは膵臓癌である。本発明は他の上皮起源の癌にも適用可能である。本発明は、以下の実験の詳細の記載によって、より良く理解されるであろう。しかし、当業者は、ここで述べる具体的な方法および結果が、後述の請求の範囲で更に完全に記載される発明の単なる例示に過ぎないことを容易に承認するであろう。〔実験の詳細〕第一実験シリーズ＜材料および方法＞材料．ペプチド：配列の異なる20アミノ酸、30アミノ酸および50アミノ酸を含むMUC1ペプチドを、スローン・ケッタリング記念癌センターの中核施設において、アプライドバイオシステムズ社のモデル431A自動ペプチド合成器を用いて合成した。該合成ペプチドのＣ又はＮ端末のオリジナル配列に、表示されたようにシスチンを付加し、蛋白担体との接合を容易にした(表１)。表１ワクチン調整及びテスト用に使用された合成MUC1ペプチドの配列 Mabs及び細胞系： HMFG-２は、MUC1反応性マウスIgG mAbである(10)。410.4 は、ネズミ(BALB/c)乳腺上皮癌細胞系(11)であり、E4は、MUC1遺伝子(12)によってトランスフェクトされた410.4細胞のクローンから誘導された。HMFG-2、410.4 及びE4は、ジョイス・テイラー・パラデイミトリウ（Joyce taylor-Papadimitri ou）(帝国癌研究財団、ロンドン、英国)の好意によって提供された。MCF7は、ヒト乳癌細胞系（13）である。動物及びアジュバント：雌BALB/c×C57 BL/６Ｆ１マウス、BALB/c×C3H F1 マウス、又はBALB/cマウス、６週齢は、ジャクソン研究所（Bar Harbor，Maine ）から入手した。アジュバントＱＳ２１、つまり精製されたサポニン分両(16)は、ケンブリッジ・バイオテクInc．(Worcester，MA)から入手した。Bacille Calm ette-Guerin(BCG)は、コノート（connaught）研究所(Ontario，Canada)から購入した。 MUC1 ペプチドとキーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）との接合： K LH（PerImmune Inc.，Rockville，MD）を、MUC1ペプチド接合体の担体蛋白として使用した。m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシサクシイミド・エステル(MBS，Pierce Co.，Rockford IL)、N-サクシンイミジル．３-(2-ピリデイルジチオ)プロピオネート（SPDP，PierceCo.，Rockford，IL）及びグルタルアルデヒド（アルドリッチ化学株式会社、Milwaukee，WI）を、MUC1 ペプチド接合体を作成するためのリンカーとして使用した(図1)。ＭＢＳ接合方法(14)： 70μｌのジメチルフォルムアミド（シグマ化学株式会社、セントルイス、モンタナ）中１ｇのMBSを、0.01Mのりん酸緩衝液（PB）pH7. 0中5mgのKLHに添加した。一時間後、MBS/KLH溶液を0.1Ｍ PB pH6.0で平衡化されたセファデックスG-15カラムに加えた。OD280（MBS-KLH）の最初のピークを採取し、5mgのMUC1ペプチドと混合し、室温で2時間攪拌した。未接合ペプチドを、セントリプレップ（centriprep）-30濃縮器（Amicon Inc.，Berverly，MA）を使用してMUC1-KLH接合体から分離した。MUC1/KLH接合比（500/1−600/1）は、スペクトロホトメータによる、ペプチド及びKLHの初期量ならびに濾過物中の未接合ペプチドの測定量に基づいて計算した。 SPDP 接合法(15)： SPDP法による接合は、MBSがSPDPによって置き換えられた以外は、ＭＢＳ方法による接合と同様であった。SPDP法から得られるMUC1/KLHの接合比は、二つの異なる分析：即ち、１）未接合ペプチドの量を基にした方法、 2）接合反応によって産生されたSPDP副産物（ピリジン-2-チオニン）を基にした方法によって計算された。両分析によるMUC1/KLH比は、400/1-500/1であった。グルタルアルデヒド接合方法(14): 1mlのほう酸緩衝液pH10中の５mgKLHを、5 mgのMUC1ペプチドと混合した。0.3%のグルタルアルデヒト１mlを加え、室温で2 時間攪拌した。未反応グルタルアルデヒトを0.25mlの1Mグリシンを添加して30分間でブロックした。MUC1−KLH溶液をPBSで一晩透析した。グルタルアルデヒトはＯＤ215で未接合ペプチドの吸収を阻害するので、MUC1／KLH比は、初期比（500/ 1）に基づいて推定した。ワクチンの調整と投与：マウスを、8-15μgMUC1ペプチド単独かあるいはKLH -8-10μｇのQS-21又は5x10⁵BCGと接合させた8-15μgMUC1ペプチドで、１週間の間隔をおいて2-3回免疫感作した。第二回又は三回目の免疫感作後8-10日して、マウスを出血させ、血清をELISA及びフロー・サイトメトリー分折による試験用に分離した。血清分析：ELISA： ELISAを前述したように実行した(17)。0.1Ｍ炭酸緩衝液（pH9.6）中入れたMUC1ペプチドを、ELISAプレートに0.1μｇ／ウエルで塗布した。抗血清連続希釈物を、塗布ペプチドと共に１時間インキュベートした。二次抗体は、希釈率1/200のアルカリりん酸ホスファターゼ結合接合ヤギ抗マウスIgG またはIgMであった(southern Biotechnology Associates，Inc.，Biringham，AL )。ELISAの力価は、正常マウス血清の吸光度を0.1以上高い吸光度を生じる最大希釈として定義される。各分析では、陽性対照としてMab HMFG−2が使用された。フロー・サイトメトリ：腫瘍細胞（２ｘ10⁵）を、１/30に希釈された抗血清又は１/２に希釈されたmAb上清液40ｌと共に、30分氷上でインキュベートした。３％子牛胎児血清／りん酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、該細胞を1/15に希釈された蛍光イソチオシアネートを用いて標識した、ヤギ抗マウスIgM又はIgG（Sout hern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL）20μｌと共にインキュベートした。染色された細胞の陽性集団を、フローサイトメトリー(EPICSプロフィルII、Coulter Co，Hialeah，FL)で前述したように定量した(18)。Ｔリンパ球分折：増殖分析(19)：第二回目の免疫感作後7日目のマウスの脾臓からリンパ球（2x10⁵/ウエル）を調整し、これをMUC1ペプチド（0.1−10μg／ ml）又はKLH（1−20μg/ml）と共に、37℃、５％ＣＯ₂の条件下で3−5日インキュベートした。0.5μCi³Ｈチミジン（ICN，Irvine,CA）/ウエルを添加し、その後18時間後に細胞を処理して、1204 βブレート（wallac Oy，Finland）で分析した。遅延型過敏性(DTH)(20)：第二回目の免疫感作後2週間目に、5μｑのMUC1ペプチド又はKLHを20μｌ PBS中で後足パッド(hind footpad)に注入した。足パッドの厚さを24時間及び48時間後に測定した。細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）分析(21)：第二回目の免疫感作後７日目に、脾臓のリンパ球を、１-8μg／ml MUC1ペプチドと10単位／ml IL−２（Boehringer Mannheim，Germany）を用いて７-１０日間、インビトロで感作した。被感作リンパ球は、次に、ユーロピウムで標識したＥ４細胞又は410.4細胞と共に、10:1- 100:1の比率で、４時間インキュベートした。目的細胞から分泌されるユーロビウムの分泌パーセントを、時間分解1232デルフィア・フルオロメータ（wallac O y，Finland）(18)で測定した。マウスにおける腫瘍誘発試験：第二回目の免疫感作後3日目に、マウスに２ｘ１０⁵のE4細胞を皮下注射した。25日後にマウスを殺生し、肺を10%フォルムアルデヒドで固定し、前述したように肺における腫瘍コロニーの数を計測した(22) 。＜実験結果＞ MUC1-KLH ワクチン構築物の血清学的反応における影響、MUC1ペプチド及びMUC1 の接合物の比較(表２) ：３回のワクチン接種後、15μｇペプチドＭＵＣ１（30 ）＋10μgQS-21、又は＋５ｘ１０⁵BCG／ワクチンで免疫感作された６マウスから得られた血清では、MUC1に対するIgM又はIgG抗体の有意な力価は示されなかったが、一方、KLH−10μｇ QS−21に接合された15gMUC1（30）で免疫感作されたマウスからの血清は、高いIgGの力価及び中程度のIgM（平均力価は夫々、1:409600 及び1:800）を示した。未接合のMUC1で免疫感作されたマウスではなく、MUC1（3 0）-KLHで免疫感作されたマウスから得られた血清はまた、MUC1を発現するE4マウス乳癌細胞及びMCF7ヒト乳癌細胞と強い反応性を示した。表２ MUC1ペプチド又はMUC1-KLHの接合体で免疫感作されたマウスから得られる抗血清との血清学的反応 ^a 本表中のMUC1接合体は全て、MBS法によって作成された。15gMUC1-KLH/マウス、又はMUC1ペプチド15g/マウス＋QS-21 10g/マウスがあるいは＋BCG3 x10⁵/マウス、で免疫感作されたマウスは、三回目のワクチン処置後７日目に出血させた。^b 本グループ全6匹のマウスから得られた貯蔵血清より得られたテスト値^c MUC1（30A）-KLH及びMUC1(30)-KLHグループとのMann-Whitney/Wilcoxon非パラメトリック統計による比較、ｐ＜0.01及びｐ＜0.05^d 未活性のマウスから得られた血清の吸光度値は、減算用バックグランド値として使用された。接合方法の比較（表３）：グルタルアルテヒドを使用して接合されたMUC1(2 0)-KLH、並びにSPDPを使用して接合されたMUC1(20)-KLHおよびMUC1-KLH(30A)-KL Hで免疫感作されたマウスから得られたＩｇＧの平均力価は、夫々1:1350、1:50 、1:2700であった。MBSを使用して接合されたMUC1(20)-KLH、MUC1（30A）-KLHで免疫感作した後の平均IgG力価は、夫々1:12150及び1:12150であり、グルタルアルデヒトまたはSPDP（p＜0.01）を使用して調整されたものよりも著しく高かった。同様に、MUC1（20）-KLH(グルタルアルデヒト）、MUC1(20)-KLH(SPDP)、MUC 1（30A）-KLH（SPDP）で免疫感作されたマウスから得られた血清についてのフローサイトメトリーによる平均陽性細胞％は、夫々59%、32%、61%であった。MUC1 （20）-KLH（MBS）群及びMUC1(30A)-KLH（MBS）群の両者は、97%の陽性細胞を有していた。これは、グルタルアルデヒト又はSPDP（ｐ＜0.05）によって調整された接合体よりも著しく高かった。一方、MUC1（20A）接合体については、力価又は陽性細胞％において、MBS及びSPDP法の間に明瞭な差異は見られなかった。MUC 1陰性細胞系410.4に対する反応性は、全グループで最低であった。長さの異なるMUC1ペプチド（表３）の比較：免疫ペプチドに対する平均IgG 力価は、MUC1（20A）-KLH(1:4500(SPDP)及び1:4500(MBS))、並びにMUC1(30A)-KL H(1:2700(SPDP)及び1:12150(MBS))で免疫感作されたマウスから得られた血清については同等であった。MUCl(30A)-KLH(SPDP)(61%)についての陽性細胞の平均％は、MUC1(20A)-KLH(SPDP) （32%）についてよりも若干高くても著しく高くはないが、MUC1(30A)-KLH(MBS)( 97%)についての平均陽性細胞％は、MUC1(20A)-KLH(MBS)(54%)よりも著しく高かった。MUC1（50）-KLHをMUC1（30）-KLH及びMUC1（20A）-KLH（表２及び３）と比較すると、陽性細胞％については顕著な違いは見られなかった。表３別種の方法によってKLHに接合されたMUC1で免疫感作されたマウスから得られた抗血清の血清学的反応 ^a 10g MUC1-KLH/マウス＋QS21 10g/マウスによる第三回目の免疫感作後、10日目。各グループのマウス１−３番目は、ＣＢ６Ｆ１株であり、４−６番目は、BA LB/cであった。^b SPDP又はグルタルアルデヒド法によって夫々接合されたMUC1-KLHのMann-Whit ney/Wilcoxon非バラメトリック統計を使用した比較。ELISA力価についてはｐ＜0 .01、陽性細胞％についてはｐ＜0.05。異なる配列を持つ接合されたMUC1に対する血清学的反応(表３)： MUC1-KLH(SPDP)（1:50）で免疫感作されたマウスから得られる血清の免疫ペプチドに対する平均IgG力価は、MUC1(20A)-KLH(SPDP)(1:4050)で免疫感作されたマウスから得られるものよりも明らかに低かった。しかしながら、これら二つのグループから得られる血清についてのフローサイトメトリーによる平均陽性細胞％は同じであった(32%)。MUC1(20)-KLH(MBS)え免疫感作したマウスから得られた平均IgG力価(1:12150)、及び陽性細胞％（97％）は何れも、MUC1（20A）-KLH（MBS ）によって免疫感作されたマウスについてのもの（夫々、1:4050及び54%、ｐ＜0 .05）よりも著しく高かった。MUC1(30)-KLHをMUC1(30A)-KLH（表２）と比較しても、血清学的反応において顕著な差異は見られなかった。 MUC1 免疫処理のＴ細胞反応における影響：表３及び表４における全マウスを DTHについてテストした。５μgMUC1ペプチドを足パッド注入後48時間目に、MUC1 ペプチド及びMUC1-KLH構築物で免疫感作したマウスの平均足パッド厚さは、夫々 1.72±0.05mm(n=12)及び1.73±0.06mm(n=28)であり、PBSのみを注入したマウスの1.73±0.06mm（n=20）と相違してはいなかった。しかしながら、5g KLH（陽性コントコール）によるDTHテストの後、MUC1-KLHで免疫されたマウスの平均足パッドの厚さは2.1±0.17mm(n=8)であり、初回免疫しなかったマウス及びMUC1ペプチドで免疫感作されたマウスのKLH DTH反応（夫々、1.71±0.02mm (n=6)及び1.71±0.03mm(n=6)）を上回って著しく増加した。増殖分折の結果は、DTH分析の結果と同等であった。MUC1（20）-KLH、MUC1（3 0）-KLH、及びMUC1（50）-KLH又は対応するペプチドで免疫感作された各グループについて5匹のマウスから得られた脾臓細胞は、これらの細胞をその対応するペプチドでインキュベートした時、初回免疫しなかったマウス（4530cpm）を凌ぐリンパ球の増加を示さなかった。増殖の増加（14500-18600cpm）は、MUC1-KLH 接合体で免疫感作したマウスから得られる脾臓細胞をKLHと共にインキュベートした時にのみ観察された。エフェクター細胞がマイトマイシン処理したＥ４細胞で免疫感作されたBALB/c x C3H F1マウスから得られたとき、Ｅ４細胞（Ｅ：Ｔ、60:1）についての３ＣＴＬ分析で平均30%の特異的分泌が観察された。しかしながら、MUC1ペプチド又はMUC1−KLH接合体で免疫感作されたマウスからは何ら顕著な特異的分泌（0-2% ）は見られなかった。 MUC1-KLH による活性免疫感作の、BALB/c x C3HマウスでのＥ４細胞肺転移についての影響(表４) ： MUC1（30）-KLHで免疫感作した10匹のマウスは、良好なE4 細胞表面反応性（平均陽性細胞％：52%）をもったIgG抗体を、平均力価1:5940で産生した。E4細胞で皮下誘導後４週間目に、10匹のマウスから得られた肺の平均コロニー数は、PBS及びKLHのコントロール群について夫々19及び20であったが、 MUC1（30A）-KLH群では僅に１であった（ｐ＜0.01）表４ MUC1（30）-KLH＋QS21による活性免疫感作のＥ４細胞肺転移^aにおける影響 ^a BALB/c x C3H F1を一週間間隔で二回、８ｇMUC1（30A）-KLH＋８ｇQS-21/マウスで免疫感作し、８ｇMUC1（30A）ペプチド＋８ｇQS-21で二回目にワクチン接種した後１週間目に追加免疫した。KLH群には、MUC1（30A）−KLH群と同量のKLHが投与された。第二回目のワクチン処理後の３日目に、２ｘ１０⁵のＥ４細胞が全グループに対して皮下注射された。マウスを殺生し、肺における転移コロニーをチェックした。二回目のワクチン処理後10日目に、ELISA用、フローサイトメトリー用にマウスを出血させた。^b ELISA及びサイトメトリーのテスト値は、本グループにおいて10匹のマウスから得られた血清プールから得られた。^c Mann-Whitney/Wilcoxon非パラメトリック統計によるPBS及びKLHコントコール群との比較、p<0.01。＜実験の考察＞ MUC1特異的な抗体は、偶発的乳癌、膵臓癌、及び腸癌患者（2、23）から得られた血清中で検出されてきた。これによって、MUC1がヒト免疫システムによって認識され得る事が示唆され、また、MUC1を発現する腫瘍細胞に対する免疫が、適切に構築されたMUC1ワクチンによって誘導されるかもしれないという可能性が惹起された。出願人は、種々のアジュバントと混合されるか、又はKLHに対して様々なリンカー法を使用して共有結合された、異なる長さと配列を持つ合成MUC1ペプチドを含むワクチンをここに開発した。MUC1ペプチド＋QS21あるいは＋BCGを含むワクチンは、抗体を誘導しなかった。しかしながら、MUC1ペプチドをKLH+QS -21に結合すると、高力価のIgM、特にMUC1抗原に対するIgG抗体が誘導された。これらの抗血清と、MUC1を発現するマウス腫瘍E4細胞及びヒト乳癌腫瘍MCF7細胞との反応性は、mAb HMFG-2に対するのと同様に強かった。MBS、SPDP及びグルタアルデヒトを利用する接合法を比較すると、MBSは、MUC1-KLH接合体を調製する為の最良のリンカーであり、力価及び特異性の点で最も好ましい抗体を誘導する事がわかった。MUC1ペプチドの長さが免疫反応に与える影響についての結論は今回導けなかったけれども、30又は50アミノ酸MUC1接合体は、MUC1陽性腫瘍細胞に対する抗血清を、20アミノ酸MUC1接合体よりもより高力価で誘導するようだ。単一の縦列（tandem）繰返し(20アミノ酸)を持つMUC1ペプチドについて、ペプチド内APDTR、即ちMUC1（20）は、該ペプチドのＮ末端にAPDTRを含むMUC1（20A）に比較して、 MUC1を発現するE4細胞に対して強い反応性を持つ抗体を誘導した。しかしながら、この効果は、もっと長いペプチド（30アミノ酸）をテストとしたときには失われていた。免疫感作していない癌患者におけるMUC1ペプチドに対するＴリンパ球免疫については、文献に記載されている(24、25)。本研究おいて、出願人は、KLH＋QS-21 に接合した合成MUC1ペプチドで免疫感作されたマウスにおいて、Ｔ細胞反応をテストした。QS-21は免疫学的アジュバントであり、他の溶解性蛋白抗原に対するC TLを誘導できる事が知られている(29)。しかしながら、出願人は、免疫感作後に、MUC1抗原又はMUC1陽性細胞に対するＴ細胞の反応（DTH、リンパ球増殖又はCTL ）を観測しなかった。他の研究者は、合成MUC1ペプチド、MUC1接合体、MUC1を発現するワクチン、又は全腫瘍細胞上で発現されるMUC1によって、Ｔ細胞反応を誘導しようと試みた(5、26−28)。ジフテリア・トキソイドと結合させたMUC1、グルタチオンＳトランスフェラーゼと融合させたMUC1(20アミノ酸）、または天然ムチン（ヒ乳脂肪小球）＋完全フロイトアジュバントでマウスを免疫感作する事により、マウスにおいてT細胞反応を誘導することは、アポストロプーロスら（A postolopoulos et al）(26)によっても失敗に終わった。しかし、出願人が実証できたように、MUC1抗原を発現する腫瘍全細胞でマウスを免疫感作した後にＴ細胞反応が観察された。デイングら(Ding et al)は、MUC1（16アミノ酸）-KLHで免疫感作されたマウスにおいて、インビトコの免疫反応ではなく、DTHを報告している(27)。これらの異なる観測は、異なるマウス種を使用した事に起因すのまもしれない。一つの縦列繰り返し（20aa）に対応するMUC1ペプチドによるT細胞反応誘導は行なわれなかったが、フィン（Finn et al）らは、５つの縦列繰り返しに対応するMUC1ペプチドがCTL誘導の能力を持つ事を発見した(30)。より長いMUC 1ペプチドは、KLHと接合していても接合していなくても、この能力を持つかどうかが今後の研究の焦点となる。天然ムチンアミノ酸配列、及びクラス I MHC分子と会合したペプチドモチーフは、ヒトよりもマウスにおいて異なるから(6、31)、ヒトにおけるMUC1抗原に対するT細胞反応は、マウスにおいてみられるものとは著しく違っているかもしれない。乳癌、卵巣癌、膵臓癌の非免疫感作患者で既に確認されているMUC1に対するCTLは、これがそうであることを示唆する(24、25)。免疫感作後にMUC1に対するT細胞免疫が検出されていないにも拘わらず、MUC1 陽性E4細胞での抗原投与に対する防御が見られた。MUC（30）-KLH+QS-21で免疫感作されたマウスにおける肺の転移数は、PBS又はKLH+QS-21コントロール群についての転移数よりも顕著に低かった。このことから、体液性免疫が、MUC1を発現するE4腫瘍細胞での抗原投与に対する抵抗性の原因であることが示唆される。他の研究者等は、齧歯類において、免疫感作後MUC1陽性腫瘍細胞による誘導から保護された事もまた記載している。MUC1発現するＥ３細胞（27）を用いた誘導後に、MUC1を発現するワクシニア組替体で免疫感作されたフィッシャー（Fisher）ラットにおいてはムチンを発現する腫瘍の顕著な拒絶反応が起こり(5)、またMUC1 接合BP-1-7-KLH(GVTSAPDTRPAPGSTA)（配列認識番号１）で免疫感作されたCAF1マウスの生存が長くなった事が記載されている(27)。BP-1-7-KLHで免疫感作されたマウスにおいてDTH反応がみられたが、CTL反応は記載されていない。よって、免疫系のどの腕が腫瘍誘導の防御に本質的に関与するのかを、齧歯類モデルでの結果から知るのは困難である。よってMUC1ワクチンの免疫原性を至適化するために企画されたフェーズI／II臨床試験において、どの免疫分析を続けるのが最も重要になるかを予測するのは困難である。 MUC1に対するCTL及び抗体反応については、乳癌、卵巣癌、膵臓癌の未免疫感作患者において記述されてきた(2、23−25)。患者におけるMUC1に対する免疫性が、腫瘍ワクチンで処置する事により増大できるかどうかを決定する事がまだ残されている。今までは、進行した乳癌患者をBCGと混合された105アミノ酸MUC1ペプチド（５縦列繰り返し）で免疫感作する一つの試みが行われたに過ぎない(30)。最終結果は入手されていないが、抗MUC1抗体およびDTHは何れも一貫して増大しなかったようだ。しかしながら、免疫感作前の血液と比べて免疫感作後の血液では、HLAで規制されない抗MUC1CTL前駆体が2−3倍に増大した(O．J．Finn，Personal communication)。しかしながら、疾患の進行した患者におけるこれらの結果は、アジュバントのセッティングには応用できないであろう。我々の結果は、MUC1に対するIgG抗体及びIgM抗体を誘導する事について、MUC1-KLH接合物はMUC1＋BCGよりもはるかに有望である事を実証した。MUC 1抗原に対するT細胞反応は我々の研究では観測されなかったが、合成MUC1、MUC1 を発現するネズミおよびヒト腫瘍細胞に対しする高力価の抗体は全マウスにおいて誘導でき、この事は、MUC1を発現するＥ４腫瘍細による抗原投与からの顕著な防御に関連していた。これに基づき、出願人は、MBSリンカー＋QS21を使用して調整されるMUC1-KLH(30アミノ酸)による臨床試験を開始しており、90アミノ酸MU C1ペプチドも、この条件で試験することを計画している。体液性DTHに対する分析、増殖性、及びＣＴＬ反応も続けて行うつもりである。ヒトムチンMUC1は、上皮細胞起源の多くの癌で多量に発現され、その大部分は、正常組織における分泌細胞の先端表面に限られる。よって、それは癌の免疫治療の有望なターゲットである。臨床試験の準備において、異なる長さと配列の合成MUC1ペプチドを含み、且つ種々のアジュバントと混合され、または蛋白担体であるキーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）に共有結合されたワクチンが、ネズミにおいて研究された。（20及び30アミノ酸を含む）MUC1ペプチド＋アジュバントQS−21又は＋BCGは、抗体を誘導しなかった。しかしながら、特にリンカーのマレイミドベンゾイル-N-ヒドロサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）によってKLHに接合されたMUC1ペプチド（MUC1-KLH）にQS−21を付加したものは、免疫性ペプチドに対して高力価抗体、つまり、IgGに対して平均力価1:800、IgGに対して1：30 7、200を誘した。更に、これらの抗血清は、MUC−1反応性のmAb HMFG−2と同様に、MUC1を発現するネズミ腫瘍E4細胞及びヒト乳癌MCF−7細胞と強く反応性した。これらの研究に基づいて、リンカーMBS＋QS−21を用いて調製したMUC1-KLH接合体を含むワクチンを、臨床試験の試験のために構築した。第二実験シリーズムチンMUC-1は糖化された構造で乳癌腫瘍上で発現され、従って、免疫認識のターゲットである。MUC-1の30のアミノ酸（aa）配列は合成されており、その免疫原性を増大させるために、KLHに共有結合で連結され、免疫アジュバントQS21 と共に混合された。資格規準には、ステージ４のＮＥＤ患者(疾病形跡なし)、CE A又はCA15-3レベルが上昇していてNEDである患者、又は最初は切除不能段階の患者であってアジュバント治療(ｔｘ)後である患者が含まれる。夫々がMUC-1ペプチドを100mcg含む5つのワクチンが1、2、3、7及び19週間目に賦与された。このように、5人をはるかに超える患者について研究中であるが、５患者のみは、3回以上のワクチン接種を受けた。注入部位の局所的紅斑及び硬化、軽いインフルエンザ様症状（これらは#2のワクチン処置後に最も顕著であった）が、すべての患者で観察された。患者の血清を、精製されたMUC-1に対するIgG及びIgM抗体についてはELISA法で分析され、また、MUC-1陽性、陰性細胞系に対するIgG及びIgM抗体については免疫粘着ロゼット分析で分析した。最初の5患者に対するELISAによるIgM／IgG力価は、下記の通りであった。 Pt#1からPt#4についての、MCF-7細胞に対するIgM反応性を測定する免疫粘着分析では、治療前は０であった力価が９週までに力価160に上昇した。治療前の力価80でスタートした第５番目の患者（Ｐｔ#5）は、9週までに160まで増加した。MUC−1ムチンは、KLH及びQS21を含むワクチン中に存在するときに、乳癌患者において強力な免疫原性である。第三実験シリーズステージIVの疾病の形跡のない（NED）乳癌患者(BCPts)、或いはCEAもしくはB R2729レベルが上昇している以外は初期ステージにあるBCPtsは、明らかに再発の危険が高く、免疫治療からの恩恵を得る可能性がある。ほとんどの乳癌腫瘍にみられろムチンMUC-1は有望なターゲットである。MUC-1の３０合成アミノ酸（aa）の配列が、免疫認識を高あるためにKLHと接合され、免疫アジュバントQS1と混合された。9人の患者（年齢43−61）がワクチン処置された。8人はステージIVのNE Dであり、一人はCEAレベルが増大したステージIIのNEDであった。ステージＩＶのNED患者一人を除くすべての患者は、ホルモン治療中であった。全患者は、100 mcgMUC-1 s.c.の投与を、1、2、3、7及び19週に5回受けた。全患者は、ワクチン投与部位に２回の一過性の局所的毒性が現れ、殆どは、グレード1−2のインフルエンザ様症状を呈した。すべての患者はNEDを維持していた（平均55週まで追跡した）が、1患者は、胸板再発を示し、これは切除された。全患者について、精製MUC-1に対するIgM及びIgGのELISA法による力価逆数の範囲は次の通りであった。 5人の患者は、最終ワクチン処理後6−12月の間、IgG力価（320−1280）を維持している。8人の患者中のIgGサブクラスを分析すると、IgG1及びIgG3が優先していることが解明された。MCF-7細胞系に対する免疫粘着ロゼット分析では、６／７の患者においてIgM力価の増加がみられた。阻止分析において、すべての血清は、MUC-1のAPDTRPA決定因子とのみ反応する事が実証された。T細胞免疫を増大させる証拠は何も発見されなかった。このMUC-1ワクチンはNEDの乳癌患者において免疫原性である。第四実験シリーズムチンMUC-1は、正常組織と比較すると糖化されない形で乳癌上で発現され、従って癌免疫治療の有望なターゲットである。MUC-1は、20アミノ酸ペプチドの多重の縦列繰り返し(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)を含んでいる。APDTRエピトープは、様々なネズミのモノクローナル抗体及び免疫血清によって認識され、また上皮細胞癌で免疫感作されていない患者から得られたある血清及び細胞毒性Ｔ細胞によって認識されるので、特に免疫原性である。キーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）に対して化学接合させるために、Ｎ末端にシステインを有する下記の30アミノ酸ペプチドVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVYSAPDTRPAを調整した。この接合物プラス免疫学的アジュバントQS21とで設定される該アジュバント中で免疫処置された６人の乳癌患者では、全て該30アミノ酸MUC-1ペプチドに対する高力価（E LISAによる）のIgG及びIgM抗体が産生された。一連の小ペプチドをが調整して、これらの免疫血清によって認識されるエピトープを阻害分析で決定した。APDTRP Aを含むペプチドのみが、完全な30アミノ酸ペプチドに対するELISA反応性を阻害する事ができた。APDTR，APDTRP，PDTRPA又は完全なAPDTRPAエピトープを含まない他の何れのペプチドによっても、血清は阻害されなかった。注目すべきことに、全6患者から得られた血清はこの同じエピトープを認識し、且つ認識したのはこのエピトープのみであった。反応性は最高であったが、APDTRPAが該ペプチドのC末端にあるときは、APDTRPAは当該免疫原の末端であるので、優先的に認識されるという可能性が生じる。別の患者群では、Ｃ末端に他のアミノ酸をもつMUC- 1ペプチド含んだ接合体ワクチンで免疫感作することを計画している。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Mucin conjugate peptide vaccine The invention disclosed herein is based on NIH, Grant CA61422 granted by the Ministry of Health and Welfare. It was made with the support of the government. Accordingly, the United States government Have certain rights in [Background of the Invention] Throughout this application, various references are cited in parentheses. these Publications of the publication are intended to more fully describe the state of the art to which this invention pertains. Incorporated herein by reference in its entirety. Of these references Full bibliographic citations are provided at the end of the specification, before the claims. Mucins such as mucin MUC1 are abundantly expressed in many human cancers of epithelial origin, It is a widely glycosylated high molecular weight (> 200 kD) protein (1-5). Most Recent studies have shown that MUC1 has a 20 amino acid peptide (PDTRPAPGSTA) in the extracellular portion of the molecule. PPAHGVTSA) (SEQ ID NO: 7) containing a variable number of tandem repeats Most antigenic epitopes recognized by tin mAbs and cytotoxic T cells , APDTR section within the repeat (6-8). Normal tissue MUC1 expression is mainly associated with access to the apical surface of secretory cells, the immune system. It is limited to the minimum site (1, 4). In addition, a wide range of MUC1 expressed in normal tissues Glycosylation further limits exposure of the immune system to the peptide backbone. In carcinomas, the mucin peptide backbone is not completely glycosylated, The unexposed peptide sequence is exposed to the immune system (6). After all, MUC1 Monoclonal antibodies specific for the peptide are available in both normal and carcinoma mucins. Breast, pancreatic, and ovarian origin It shows specificity for carcinoma-associated mucins derived from the source cancer (9). A mouse expressing MUC1 Immunization of rats with recombinant xinia It provides protection from challenge by MUC1-expressing tumor cells (5). These discoveries That immunization against MUC1 is possible, and that the immunization is breast cancer or pancreatic It suggests that tumor regrowth can be prevented in patients with visceral cancer. In this study Applicants have synthesized MUC1 peptides differing in length and sequence, Vaccine containing these peptides mixed with different adjuvants, or different Keyhole limpet hemocyanin is a protein carrier using a modified linker Vaccines containing these peptides conjugated to (KLH) were prepared. Clinical trial In preparation for the experiment, the humoral and cellular immune responses of the different vaccines were The impact on the answers and the protection from tumor challenge were compared in mice. Human mucin MUC1 is abundantly expressed in several cancers of epithelial origin, Are restricted to the apical surface of secretory cells in normal tissues. Therefore, It is a potential goal in cancer immunotherapy. In preparing for clinical trials, Mixed with an adjuvant, or with a protein carrier using various linker methods Synthesis of different length and sequence bound to a keyhole limpet hemocyanin A vaccine containing the MUC1 peptide was studied in mice. MUC1 peptide ( Containing 30 amino acids) + adjuvant QS-21 or BCG can induce antibodies Could not. However, MUC1 peptide bound to KLH (MUC1-KLH) + QS-21 , Induced immunizing peptides and potentiating antibodies against MUC1-expressing tumor cells. T cell responses, including delayed type hypersensitivity, lymphocyte proliferation and cytotoxic T lymphocytes, MUC1-KLH was not observed in mice immunized with any of these vaccines. In mice immunized with, marked protection from MUC1-expressing tumor cells was observed Was done. Based on these studies, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy MUC1-KLH conjugate prepared using a square imide ester linker-containing QS-21 Vaccine was prepared. [Summary of the Invention] The present invention provides a vaccine capable of generating an immune response that recognizes mucin, An immunogenic protein in an amount effective to stimulate or enhance an immune response in the subject. A mucin peptide conjugated to a protein, an effective amount of an adjuvant, and a pharmaceutically acceptable A vaccine comprising the carrier. In one embodiment, the subject is a human. In another embodiment, the immunogenic protein is keyhole limpet hemoglobin. It is a derivative of cyanine or keyhole limpet hemocyanin. In another embodiment, the mucin is MUC1. The mucin is similar to MUC2-5 Other mucins may be included. Those skilled in the art will be able to apply the present invention to other mucins. In a further embodiment, the length of the MUC1 peptide ranges from 10 amino acids to 300 amino acids. It is. In one embodiment, the effective amount of the MUC1 conjugate is an amount from about 1 μg to about 1 mg. . In another embodiment, the adjuvant is QS-21. In one embodiment, an effective amount of QS-21 is an amount from about 10 μg to about 200 μg. Another In an embodiment, the effective amount of QS-21 is about 100 μg. In another embodiment, the subject has cancer and in the subject The resulting immune response effectively treats cancer. In a further aspect, the subject is The subject is susceptible to cancer, and when the vaccine is administered, the immune response generated in the subject is Effectively prevent cancer. In one embodiment, the cancer cells have mucin on their surface You. In a further embodiment, the cancer is breast, prostate, colon, lung or pancreatic cancer. It is. The invention is also applicable to other cancers of epithelial origin. The present invention also provides a method for generating an immune response that recognizes a mucin, comprising: And administering an effective amount of the vaccine. The present invention is a method of treating cancer in a subject afflicted with cancer, the method comprising: In contrast, a method comprising administering an effective amount of the vaccine is provided. The present invention is a method for preventing cancer in a subject susceptible to cancer, the method comprising: A method comprising administering an effective amount of the vaccine. You. In the above method, the immunogenic protein is keyhole limpet hemonia It can be a derivative of nin or keyhole limpet hemocyanin. Of the above method In one embodiment, the adjuvant is QS-21. [Brief description of drawings] FIG. 1 shows the binding of MUC1 to KLH. [Detailed description of the invention] The present invention relates to a vaccine capable of generating an immune response that recognizes mucin. An immunogenic protein in an amount effective to stimulate or enhance an immune response in the subject. Mucin peptide conjugated to pak, an effective amount of adjuvant, and pharmaceutically acceptable A vaccine comprising a suitable carrier. In one embodiment, the subject is a human It is. Effective amounts of mucin conjugate peptides can be readily determined by simple titration experiments. Can be. Animals are immunized with different amounts of conjugate peptide and the resulting immune response Test with The above effective amounts will produce an appropriate immune response. In another embodiment, the immunogenic protein is keyhole limpet hemoglobin. It is a derivative of cyanine or keyhole limpet hemocyanin. Other appropriate Various immunogenic proteins can also be used in the present invention. Those skilled in the art Mucin peptides known to be capable of eliciting an immune response By binding proteins, the suitability of immunogenic proteins can be tested. Wear. The conjugated mucin peptide is administered to the animal so that the peptide has good immune response. You just have to test if you can give an answer. Those with a good immune response The protein is a suitable immunogenic protein. In another embodiment, the mucin is MUC1. The mucin can be May be included. One skilled in the art will appreciate that the present invention can be applied to other mucins. And will be able to. In a further embodiment, the length of the MUC1 peptide ranges from 10 amino acids to 300 amino acids. It is. In a particular embodiment, the mucin peptide is APDTRPAPGSTAPPAHGVTS, TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA, (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)_TwoVTSAPDTRPA, Selected from the group consisting of: In a more particular embodiment, said mucin peptide comprises: VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA. In one preferred embodiment, the effective amount of the MUC1 conjugate is from about 1 μg to about 1 mg. Quantity. In another embodiment, the adjuvant is QS-21. It is easily understood by those skilled in the art. As will be appreciated, other suitable adjuvants may be used as well. In one preferred embodiment, the effective amount of QS-21 is in an amount from about 10 μg to about 200 μg. is there. In another embodiment, the effective amount of QS-21 is about 100 μg. Another more preferred In embodiments, the effective amount of QS-21 is about 100 μg. In another embodiment, the subject has cancer and in the subject The resulting immune response effectively treats cancer. In a further embodiment, the subject is susceptible to developing a cancer and is not susceptible to administering the vaccine. However, the immune response generated in the subject effectively prevents cancer. In one aspect, the cancer Cells have mucin on their surface. In a further embodiment, the cancer is breast, prostate, colon, lung or pancreatic cancer. It is. The invention is also applicable to other cancers of epithelial origin. The invention also provides for stimulating or generating in a subject an immune response that recognizes a mucin. Administering to the subject an effective dose of the vaccine. Devise a method that includes: The present invention is a method of treating cancer in a subject afflicted with cancer, the method comprising: In contrast, there is provided a method comprising administering an effective dose of the vaccine. The present invention is a method for preventing cancer in a subject susceptible to cancer, the method comprising: In contrast, there is provided a method comprising administering an effective amount of the vaccine. In the above method, the immunogenic protein may be a keyhole limpet hemolymph. Derivatives of anine or keyhole limpet hemocyanin include It is not limited to. In one embodiment of the above method, the adjuvant is QS-21. In another embodiment, the mucin is MUC1. The mucin can be May be contained. One skilled in the art can apply the present invention to other mucins. Will be. The mucin can include other mucins such as MUC2-5. Those skilled in the art The invention could be applied to other mucins. In a further embodiment, the length of the MUC1 peptide ranges from 30 amino acids to 300 amino acids. It is. In a particular embodiment, the mucin peptide is APDTRPAPGSTAPPAHGVTS, TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA, (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)_TwoVTSAPDTRPA, Selected from the group consisting of: In a more particular embodiment, said mucin peptide comprises: VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA. In one preferred embodiment, the effective amount of the MUC1 conjugate is an amount of about 1 μg to about 1 mg. It is. In another embodiment, the adjuvant is QS-21. It is easily understood by those skilled in the art. As will be appreciated, other suitable adjuvants may be used as well. In a preferred embodiment, the effective amount of the MUC1 conjugate peptide is from about 1 μg to about 1 mg. Quantity. In another embodiment, the adjuvant is QS-21. Easy for those skilled in the art Other appropriate adjuvants may be used as well, No. In a preferred embodiment, the effective amount of QS-21 is from about 10 μg to about 200 μg. Even better In yet another embodiment, the effective amount of QS-21 is about 100 μg. In one embodiment, the cancer cells have mucin on their surface. In a further embodiment, the cancer is breast, prostate, colon, lung or pancreatic cancer. It is. The invention is also applicable to cancers of other epithelial origin. The invention will be better understood from the following description of experimental details. However, those skilled in the art will recognize that the specific methods and results described herein It will be readily appreciated that this is merely an illustration of the invention more fully described in Would. [Experiment Details] First experiment series <Materials and methods> material.peptide: 20 amino acids, 30 amino acids and 50 amino acids with different sequences MUC1 peptide at the core facility of Sloan-Kettering Memorial Cancer Center Using an Applied Biosystems Model 431A automated peptide synthesizer. Done. As indicated in the original sequence of the C or N terminal of the synthetic peptide Cystine was added to facilitate conjugation with the protein carrier (Table 1). Table 1 Used for vaccine preparation and testing Sequence of synthetic MUC1 peptide Mabs and cell lines: HMFG-2 is a MUC1-reactive mouse IgG mAb (10). 410.4 Is a murine (BALB / c) mammary epithelial carcinoma cell line (11) and E4 is driven by the MUC1 gene (12). Derived from a clone of 410.4 cells transfected. HMFG-2, 410.4 And E4, Joyce taylor-Papadimitri ou) (Empire Cancer Research Foundation, London, UK). MCF7 Breast cancer cell line (13). Animals and adjuvants: Female BALB / c × C57 BL / 6F1 mouse, BALB / c × C3H F1 Mice or BALB / c mice, 6 weeks of age, were from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine ). The adjuvant QS21, ie the purified saponin component (16) , Cambridge Biotech Inc. (Worcester, MA). Bacille Calm ette-Guerin (BCG) purchased from Connaught Institute (Ontario, Canada) did. MUC1 Conjugation of peptide with keyhole limpet hemocyanin (KLH): K LH (PerImmune Inc., Rockville, MD) as a carrier protein for MUC1 peptide conjugate Used. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysa Succinimide ester (MBS, Pierce Co., Rockford IL), N-succinimidyl. 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP, PierceCo., Rockford, IL) and And glutaraldehyde (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), MUC1 It was used as a linker to create a peptide conjugate (FIG. 1). MBS joining method (14): 70 μl of dimethylformamide (Sigma Chemical Co., Ltd.) 1 g of MBS in St. Louis, Montana), 0.01 M phosphate buffer (PB) pH 7. Added to 5 mg KLH in 0. One hour later, the MBS / KLH solution was equilibrated with 0.1 M PB pH 6.0. On a Sephadex G-15 column. Collect the first peak of OD280 (MBS-KLH) The mixture was taken, mixed with 5 mg of the MUC1 peptide, and stirred at room temperature for 2 hours. Unconjugated peptide, Using a centriprep-30 concentrator (Amicon Inc., Berverly, MA) To separate from the MUC1-KLH conjugate. The MUC1 / KLH junction ratio (500 / 1-600 / 1) is Initial amount of peptide and KLH and unconjugated in filtrate by cttrophotometer The calculation was based on the measured amount of the peptide. SPDP Joining method (15): SPDP bonding, MBS replaced by SPDP Except for the above, it was the same as the joining by the MBS method. MUC1 / KLH obtained from SPDP method The conjugation ratio was determined by two different assays: 1) a method based on the amount of unconjugated peptide, 2) Based on SPDP by-product (pyridine-2-thionin) produced by conjugation reaction Calculated by method. The MUC1 / KLH ratio by both analyzes was 400 / 1-500 / 1. Glutaraldehyde bonding method (14): 5 mg KLH in 1 ml borate buffer pH 10 Mixed with mg of MUC1 peptide. Add 1 ml of 0.3% glutaraldehyde and add 2 ml at room temperature. Stirred for hours. Add unreacted glutaraldehyde to 0.25 ml of 1 M glycine for 30 minutes Blocked between. The MUC1-KLH solution was dialyzed against PBS overnight. Glutar Aldecht Since the absorption of the unconjugated peptide is inhibited at OD215, the MUC1 / KLH ratio is the initial ratio (500 / Estimated based on 1).Vaccine preparation and administration: Mice were treated with 8-15μg MUC1 peptide alone or KLH -8-10μg QS-21 or 5x10^Five8-15μg MUC1 peptide conjugated with BCG for 1 week Immunization was performed 2-3 times at intervals. 8-10 days after the second or third immunization, Mice are bled and serum is tested by ELISA and flow cytometry analysis Separated. Serum analysis: ELISA: ELISA was performed as previously described (17). 0.1 M carbonate buffer (PH 9.6) MUC1 peptide was coated on an ELISA plate at 0.1 μg / well. Was. Antiserum serial dilutions were incubated with the applied peptide for 1 hour. secondary The antibody was a goat anti-mouse IgG conjugated to alkaline phosphate phosphatase at a dilution of 1/200. Or IgM (southern Biotechnology Associates, Inc., Birringham, AL ). The ELISA titer is the maximum that produces an absorbance higher than normal mouse serum by 0.1 or more. Defined as dilution. In each analysis, Mab HMFG-2 was used as a positive control . Flow cytometry: Tumor cells (2 × 10^Five), Antiserum diluted 1/30 Alternatively, the plate was incubated on ice for 30 minutes with 40 l of the diluted mAb supernatant. After washing with 3% fetal calf serum / phosphate buffered saline, the cells were diluted 1/15. Goat anti-mouse IgM or IgG (South) labeled with a fluorescent isothiocyanate hern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) Was added. Positive populations of stained cells were analyzed by flow cytometry (EPICS (Phil II, Coulter Co, Hialeah, FL) as described previously (18). T lymphocyte analysis: Proliferation analysis (19): spleen of the mouse 7 days after the second immunization Lymphocytes from the gut (2x10^Five/ Well) and adjust this to the MUC1 peptide (0.1-10 μg / well). ml) or KLH (1-20 μg / ml) at 37 ° C, 5% CO_Two3-5 days ink under the conditions of Was added. 0.5μCi^ThreeAdd H-thymidine (ICN, Irvine, CA) / well and add After 18 hours, the cells were treated and 1204 Analysis was performed with β-plate (wallac Oy, Finland). Delayed type hypersensitivity (DTH) (20): Two weeks after the second immunization, 5 μq of MUC1 Peptides or KLH were injected into the hind footpad in 20 μl PBS. Foot The thickness of the pad was measured after 24 and 48 hours. Cytotoxic T lymphocyte (CTL) analysis (21): 7 days after the second immunization, spleen The lymphocytes of the pancreas were incubated with 1-8 μg / ml MUC1 peptide and 10 units / ml IL-2 (Boehringer In vitro sensitization for 7-10 days using Mannheim, Germany. Sensitization The hempocytes were then 10: 1- with E4 cells or 410.4 cells labeled with europium. Incubated for 4 hours at a ratio of 100: 1. Eurovi secreted from target cells Of the secretion of um is determined by time-resolved 1232 Delphi Fluorometer (wallac O y, Finland) (18). Tumor induction test in mice: On day 3 after the second immunization, 2 x10^FiveOf E4 cells were injected subcutaneously. After 25 days, the mice are sacrificed and the lungs are Fixed with aldehyde and counted the number of tumor colonies in the lung as previously described (22) . <Experimental results> MUC1-KLH Impact of vaccine constructs on serological response, MUC1 peptide and MUC1 Comparison of joints (Table 2) : 15 μg peptide MUC1 (30 ) +10 μg QS-21 or + 5 × 10^FiveFrom 6 mice immunized with BCG / vaccine The resulting sera did not show significant titers of IgM or IgG antibodies to MUC1 On the other hand, mice immunized with 15 g MUC1 (30) conjugated to KLH-10 μg QS-21 Sera from high and low IgM (average titers of 1: 409600, respectively) And 1: 800). Instead of mice immunized with unconjugated MUC1, MUC1 (3 0) The serum obtained from mice immunized with -KLH was also used for E4 mice expressing MUC1. It showed strong reactivity with mouse breast cancer cells and MCF7 human breast cancer cells. Table 2 Immunization with MUC1 peptide or MUC1-KLH conjugate Reaction with antiserum from immunized mice ^a All MUC1 conjugates in this table were prepared by the MBS method. 15gMUC1-KLH / mouse Or MUC1 peptide 15 g / mouse + QS-21 10 g / mouse or + BCG3 x 10^Five/ Ma Immunized mice were bled 7 days after the third vaccine treatment .^b Test values obtained from stored sera obtained from all 6 mice in this group^c Mann-Whitney / Wilcoxon non-para with MUC1 (30A) -KLH and MUC1 (30) -KLH groups Comparison by metric statistics, p <0.01 and p <0.05^d The absorbance value of serum obtained from inactive mice is used as the background value for subtraction. Used. Comparison of joining methods (Table 3): MUC1 (2 bonded using glutaraldehyde 0) -KLH, and MUC1 (20) -KLH and MUC1-KLH (30A) -KL joined using SPDP The average titers of IgG obtained from mice immunized with H were 1: 1350 and 1:50, respectively. , 1: 2700. MUC1 (20) -KLH and MUC1 (30A) -KLH joined using MBS The average IgG titers after immunization were 1: 12150 and 1: 12150, respectively, Significantly higher than those adjusted using Rudecht or SPDP (p <0.01) Was. Similarly, MUC1 (20) -KLH (glutaraldehyde), MUC1 (20) -KLH (SPDP), MUC Flow of serum from mice immunized with 1 (30A) -KLH (SPDP) -The average positive cell percentage by cytometry was 59%, 32%, and 61%, respectively. MUC1 (20) Both the -KLH (MBS) group and the MUC1 (30A) -KLH (MBS) group have 97% positive cells. Was. It is regulated by glutaraldehyde or SPDP (p <0.05) Significantly higher than the conjugate. On the other hand, for MUC1 (20A) conjugate, Did not show a clear difference between MBS and SPDP methods in% positive cells. MUC Reactivity to the 1-negative cell line 410.4 was lowest in all groups. Comparison of MUC1 peptides with different lengths (Table 3): Average IgG against immune peptide The titers were MUC1 (20A) -KLH (1: 4500 (SPDP) and 1: 4500 (MBS)) and MUC1 (30A) -KL H (1: 2700 (SPDP) and 1: 12150 (MBS)) with serum obtained from mice immunized About the same. Average% of positive cells for MUCl (30A) -KLH (SPDP) (61%) Is MUC1 (20A) -KLH (SPDP) (32%) is slightly higher than that of MUC1 (30A) -KLH (MBS) ( 97%) is significantly higher than MUC1 (20A) -KLH (MBS) (54%) Was. MUC1 (50) -KLH and MUC1 (30) -KLH and MUC1 (20A) -KLH (Tables 2 and 3) By comparison, no significant difference was found for the% positive cells. Table 3 Immunization with MUC1 conjugated to KLH by different methods Response of antisera from isolated mice ^a 10 days after the third immunization with 10 g MUC1-KLH / mouse + QS21 10 g / mouse Eye. Mice 1-3 in each group are CB6F1 strains, and mice 4-6 are BA LB / c.^b Mann-Whit of MUC1-KLH joined by SPDP or glutaraldehyde method respectively Comparison using ney / Wilcoxon non-parametric statistics. P <0 for ELISA titer .01, p <0.05 for% positive cells. Serological response to conjugated MUC1 with different sequences (Table 3): Immune peptide of serum obtained from mice immunized with MUC1-KLH (SPDP) (1:50) The average IgG titer for the tide was calculated for mice immunized with MUC1 (20A) -KLH (SPDP) (1: 4050). Obviously lower than what could be obtained from a mouse. However, these two groups Mean% positive cells by flow cytometry for serum from loop Was the same (32%). MUC1 (20) -KLH (MBS) was obtained from immunized mice. The average IgG titer (1: 12150) and the percentage of positive cells (97%) were all MUC1 (20A) -KLH (MBS ) (1: 4050 and 54%, respectively, p <0 .05). Compare MUC1 (30) -KLH with MUC1 (30A) -KLH (Table 2) No significant differences were seen in the serological response. MUC1 Effect of immunization on T cell response: All mice in Tables 3 and 4 Tested for DTH. 48 hours after injecting 5 μg MUC1 peptide into the foot pad, MUC1 The average footpad thickness of mice immunized with the peptide and the MUC1-KLH construct was respectively 1.72 ± 0.05mm (n = 12) and 1.73 ± 0.06mm (n = 28) mice injected with PBS only 1.73 ± 0.06 mm (n = 20). However, 5g KLH (yang Average feet of mice immunized with MUC1-KLH after DTH test The pad thickness was 2.1 ± 0.17 mm (n = 8), and mice and MUC1 KLH DTH response of mice immunized with peptides (1.71 ± 0.02 mm each) (n = 6) and 1.71 ± 0.03 mm (n = 6)). The results of the proliferation analysis were equivalent to the results of the DTH analysis. MUC1 (20) -KLH, MUC1 (3 0) Each glue immunized with -KLH and MUC1 (50) -KLH or the corresponding peptide Spleen cells obtained from 5 mice for each Outperforms mice (4530 cpm) not primed when incubated with peptide No increase in lymphocytes was found. Increased proliferation (14500-18600cpm) is due to MUC1-KLH Incubate spleen cells from mice immunized with conjugate with KLH Only observed when BALB / c effector cells immunized with mitomycin-treated E4 cells x 3C for E4 cells (E: T, 60: 1) when obtained from C3H F1 mice An average of 30% specific secretion was observed by TL analysis. However, the MUC1 peptide or Shows no significant specific secretion (0-2%) from mice immunized with MUC1-KLH conjugate. ) Was not seen. MUC1-KLH Of active immunization with E4 cells in BALB / cx C3H mice (Table 4) : 10 mice immunized with MUC1 (30) -KLH showed good E4 An IgG antibody with cell surface reactivity (average positive cell%: 52%) was obtained at an average titer of 1: 5940. Produced. Four weeks after subcutaneous induction with E4 cells, the average of lungs obtained from 10 mice The number of colonies was 19 and 20 for the PBS and KLH control groups, respectively. Only 1 in the MUC1 (30A) -KLH group (p <0.01) Table 4 According to MUC1 (30) -KLH + QS21 E4 cell lung metastasis of active immunization^aImpact on ^a BALB / c x C3H F1 twice at weekly intervals, 8 g MUC1 (30A) -KLH + 8 g QS-21 / mouse And vaccination for the second time with 8g MUC1 (30A) peptide + 8g QS-21 One week after the administration, a booster immunization was performed. In the KLH group, the same amount of KLH as in the MUC1 (30A) -KLH group Was administered. On day 3 after the second vaccine treatment, 2 × 10^FiveE4 cells are all The group was injected subcutaneously. Kill mice and remove metastatic colonies in the lungs Checked. 10 days after the second vaccine treatment, for ELISA, flow cytometry Leave the mouse for Lee I let blood.^b ELISA and cytometry test values were based on 10 mice in this group. Obtained from the resulting serum pool.^c PBS and KLH control by Mann-Whitney / Wilcoxon non-parametric statistics Comparison with group, p <0.01. <Experimental considerations> MUC1-specific antibodies were obtained from patients with incidental breast, pancreatic, and intestinal cancers (2, 23). Have been detected in serum obtained. This allows MUC1 to be Immunization against MUC1-expressing tumor cells. The possibility that it may be induced by a newly constructed MUC1 vaccine. Was awakened. Applicants may be mixed with various adjuvants or Synthetic MUC1 pairs of different lengths and sequences covalently linked using various linker methods A vaccine containing the peptide was developed here. MUC1 peptide + QS21 or + BCG The containing vaccine did not induce antibodies. However, the MUC1 peptide was replaced with KLH + QS Binding to -21 induced high titers of IgM, especially IgG antibodies to the MUC1 antigen. These antisera and MUC1-expressing mouse tumor E4 cells and human breast cancer tumor MCF7 cells Was as strong as for mAb HMFG-2. MBS, SPDP and gluta MBS prepares MUC1-KLH conjugates when comparing conjugation methods using aldehydes Is the best linker for inducing the most favorable antibodies in terms of titer and specificity I understood that. Conclusion about the effect of MUC1 peptide length on immune response is now Although not diverted, the 30 or 50 amino acid MUC1 conjugate was found to bind to MUC1-positive tumor cells. The antiserum appears to be induced at higher titers than the 20 amino acid MUC1 conjugate. single For the MUC1 peptide with one tandem repeat (20 amino acids), the peptide APDTR, ie, MUC1 (20), is converted to MUC1 (20A) containing APDTR at the N-terminal of the peptide. Compared to, Antibodies with strong reactivity against EUC cells expressing MUC1 were induced. However This effect is lost when testing longer peptides (30 amino acids) Had been. T lymphocyte immunity against MUC1 peptide in non-immunized cancer patients Are described in the literature (24, 25). In this study, the applicant was KLH + QS-21 T cells response in mice immunized with synthetic MUC1 peptide conjugated to Struck. QS-21 is an immunological adjuvant and has a C It is known that TL can be induced (29). However, the applicant has Of T cells against MUC1 antigen or MUC1 positive cells (DTH, lymphocyte proliferation or CTL ) Was not observed. Other researchers have developed synthetic MUC1 peptides, MUC1 conjugates, and MUC1. Elicit a T cell response by the resulting vaccine or MUC1 expressed on all tumor cells Tried to lead (5, 26-28). MUC1, combined with diphtheria toxoid MUC1 (20 amino acids) fused with lutathione S-transferase or natural Immunize mice with mucin (breast milk fat globules) + Complete Freud's adjuvant Inducing a T cell response in mice by Apostropoulos et al. (A postolopoulos et al) (26) also failed. However, the applicant demonstrated After immunization of mice with whole tumor cells expressing MUC1 antigen, T cells were A vesicle reaction was observed. Ding et al found that MUC1 (16 amino acids) -KLH was not available. Report DTH instead of in vivo immune response in sensitized mice (27). These different observations are simply due to the use of different mouse species. unknown. T cell reversal by MUC1 peptide corresponding to one tandem repeat (20aa) Although no response was performed, Finn et al. Et al. It was discovered that the MUC1 peptide corresponding to CTL had the ability to induce CTL (30). Longer MUC 1 Whether the peptide has this ability, whether or not it is conjugated to KLH Will be the focus of future research. Natural mucin amino acid sequences and classes Are peptide motifs associated with I MHC molecules different in mice than in humans? (6, 31) show that T cell responses to MUC1 antigen in humans are seen in mice. May be significantly different from Non-immunization of breast, ovarian and pancreatic cancer CTL for MUC1 already confirmed in patients suggests this is the case (24, 25). Despite no T cell immunity to MUC1 detected after immunization, MUC1 Protection against challenge with positive E4 cells was seen. Immunization with MUC (30) -KLH + QS-21 The number of lung metastases in sensitized mice was lower than that of PBS or KLH + QS-21 control group. Was significantly lower than the number of metastases. From this, humoral immunity expresses MUC1 It is suggested to be the cause of resistance to antigen administration in E4 tumor cells. other Researchers have shown that rodents are protected from induction by MUC1-positive tumor cells after immunization. It also states that she was protected. After induction with E3 cells (27) expressing MUC1 Immunized with recombinant vaccinia expressing MUC1 In tumors, marked rejection of mucin-expressing tumors occurred (5), and MUC1 CAF1 mice immunized with conjugated BP-1-7-KLH (GVTSAPDTRPAPGSTA) (SEQ ID NO: 1) It has been described that the survival of the mouse was prolonged (27). Immunized with BP-1-7-KLH DTH response was observed in mice, but CTL response was not described. Therefore, exempt It was determined in a rodent model which arms of the epidemic system were essentially involved in protecting against tumor induction. It is difficult to know from the fruits. Therefore, to optimize the immunogenicity of the MUC1 vaccine Which immunoassays are the most important in planned Phase I / II clinical trials It is difficult to predict what will be needed. Regarding CTL and antibody responses to MUC1, non-immunized breast, ovarian, and pancreatic cancer Has been described in working patients (2, 23-25). Immunity to MUC1 in patients Remains to determine whether treatment can be increased by treatment with tumor vaccines Have been. Until now, advanced breast cancer patients have been mixed with BCG. One trial of immunization with the combined 105 amino acid MUC1 peptide (5 tandem repeats) It was only done (30). Final results are not available, but anti-MUC1 antibodies and Neither DTH nor DTH seemed to increase consistently. However, blood before immunization 2 to 3 times more anti-MUC1CTL precursor not regulated by HLA in immunized blood compared to solution (OJ Finn, Personal communication). However, disease progression These results in patients who have failed to apply adjuvant settings Would be. Our results indicate that IgG and IgM antibodies to MUC1 were induced. MUC1-KLH conjugates proved to be much more promising than MUC1 + BCG. MUC T cell response to 1 antigen was not observed in our study, but synthetic MUC1, MUC1 High titer antibody against murine and human tumor cells expressing liposome in all mice Which is notable from challenge with E4 tumor cells expressing MUC1. Related to defense. Based on this, applicants can use MBS linker + QS21 Clinical trials with MUC1-KLH (30 amino acids) to be adjusted have started, and 90 amino acids MU The C1 peptide is also planned to be tested in this condition. Minutes to humoral DTH Analysis, proliferative and CTL reactions will continue. Human mucin MUC1 is abundantly expressed in many cancers of epithelial cell origin, most of which are , Limited to the tip surface of secretory cells in normal tissues. Therefore, it is an immunotherapy of cancer Is a promising target for medical treatment. When preparing for clinical trials, Contains the adult MUC1 peptide and is mixed with various adjuvants or with a protein carrier A vaccine covalently linked to a keyhole limpet hemocyanin (KLH) Has been studied in rats. MUC1 peptide (including 20 and 30 amino acids) Adjuvant QS-21 or + BCG did not induce antibodies. However, especially Maleimide benzoyl-N-hydrosuccinimide ester (MBS) Therefore, the one obtained by adding QS-21 to the MUC1 peptide conjugated to KLH (MUC1-KLH) Immune pepti High titer antibody against IgG, ie an average titer of 1: 800 for IgG and 1:30 for IgG 7, 200 invited. Furthermore, these antisera are similar to the MUC-1 reactive mAb HMFG-2. Strongly reacted with murine tumor E4 cells expressing MUC1 and human breast cancer MCF-7 cells . Based on these studies, the MUC1-KLH junction prepared with the linker MBS + QS-21 was used. Vaccines containing the conjugation were constructed for testing in clinical trials. Second experiment series Mucin MUC-1 is expressed on breast cancer tumors in a glycated structure, and therefore Target. The 30 amino acid (aa) sequence of MUC-1 has been synthesized and The immunoadjuvant QS21, which is covalently linked to KLH to increase Was mixed with. Eligibility criteria include stage 4 NED patients (no evidence of disease), CE Patients with elevated levels of A or CA15-3 and NED or initially in unresectable stage Patients who have been adjuvanted (tx). Each is MUC-1 Pep Five vaccines containing 100 mcg of tide were given at 1, 2, 3, 7 and 19 weeks. this As such, we are studying well over five patients, but only five patients I received the above vaccination. Local erythema and sclerosis at the injection site, mild influenza Za-like symptoms (these were most prominent after vaccine treatment # 2) Was observed in some people. The patient's serum was purified for IgG and IgM antibodies to MUC-1. Was analyzed by ELISA, and IgG and IgM antibodies against MUC-1 positive and negative cell lines. The body was analyzed by immunoadhesive rosette analysis. ELISA for first 5 patients The IgM / IgG titers were as follows: Immunoadhesion measuring IgM reactivity against MCF-7 cells for Pt # 1 to Pt # 4 In the analysis, the titer, which was 0 before treatment, rose to 160 by 9 weeks. Before treatment Fifth patient (Pt # 5), starting at a titer of 80, increased to 160 by 9 weeks . MUC-1 mucin is present in breast cancer patients when present in a vaccine containing KLH and QS21. Is strongly immunogenic.Third experiment series Patients with no evidence of stage IV disease (NED) breast cancer (BCPts) or CEA or B BCPts in the early stages, except for increased R2729 levels, are clearly recurrent High risk and could benefit from immunotherapy. For most breast cancer tumors Met MUC-1 is a promising target. 30 synthetic amino acids (aa) of MUC-1 Sequence is conjugated to KLH for enhanced immune recognition and mixed with the immune adjuvant QS1 Was done. Nine patients (ages 43-61) were vaccinated. Eight are NEs in Stage IV D and one was a Stage II NED with increased CEA levels. Stage IV All but one of the NED patients were on hormonal treatment. 100 for all patients mcgMUC-1 s.c. was administered 5 times at 1, 2, 3, 7 and 19 weeks. All patients have vaccine Two transient local toxicities appeared at the site of administration, most of which were grade 1-2 influenza. He presented with enza-like symptoms. All patients maintained NED (mean follow-up to 55 weeks on average) However, one patient had a recurrence of the breastplate, which was resected. For all patients, the range of reciprocal titers of IgM and IgG against purified MUC-1 by ELISA was The box was as follows. Five patients maintain IgG titers (320-1280) for 6-12 months after final vaccine treatment are doing. Analysis of IgG subclasses in 8 patients shows that IgG1 and IgG3 have priority It was revealed that there is. For immunoadhesive rosette analysis on the MCF-7 cell line, 6 / Seven patients had increased IgM titers. Obstruction In serum analysis, all sera react only with the MUC-1 APDTRPA determinant. Proven. No evidence was found to increase T cell immunity. This MUC-1 Kuching is immunogenic in breast cancer patients with NED.4th experiment series Mucin MUC-1 is expressed on breast cancer in a non-glycated form compared to normal tissues, Therefore, it is a promising target for cancer immunotherapy. MUC-1 is a 20 amino acid peptide Includes multiple tandem repeats (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG). APDTR epitope Recognized by various murine monoclonal antibodies and immune sera, Certain serum and cytotoxic T cells from patients not immunized with cell carcinoma Thus, it is particularly immunogenic. Keyhole Limpet Hemoshi For chemical conjugation to anine (KLH) The above 30 amino acid peptide VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVYSAPDTRPA was prepared. This junction Immunization in an adjuvant plus immunological adjuvant set with QS21 In all six breast cancer patients identified, high titers against the 30 amino acid MUC-1 peptide (E IgG (according to LISA) and IgM antibodies were produced. Coordinating a series of small peptides, The epitope recognized by these immune sera was determined by inhibition analysis. APDTRP Only peptides containing A inhibit ELISA reactivity to the full 30 amino acid peptide I was able to do it. Does not contain APDTR, APDTRP, PDTRPA or the complete APDTRPA epitope Serum was not inhibited by any of the other peptides. Noteworthy , Sera from all six patients recognized this same epitope and recognized Only this epitope. The reactivity was highest, but APDTRPA was At the C-terminus, APDTRPA is preferentially recognized because it is the end of the immunogen. There is a possibility that In another group of patients, MUC- with other amino acids at the C-terminus We plan to immunize with a conjugate vaccine containing one peptide.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ザング、シェングルアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10028、ニューヨーク、イースト・エイティーファースト・ストリート 504、アパートメント４エル────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Zang, Shengl United States, New York 10028, New York, East ATifa East Street 504, apartment To 4el

Claims

[Claims] 1. A vaccine capable of generating an immune response that recognizes a mucin, comprising an effective amount of a mucin peptide conjugated to an immunogenic protein to stimulate or enhance an immune response in a subject, and an effective amount of an adjuvant; A vaccine comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 2. 2. The vaccine according to claim 1, wherein the subject is a human. 3. 2. The vaccine according to claim 1, wherein the immunogenic protein is keyhole limpet hemocyanin or a derivative of keyhole limpet hemocyanin. 4. 2. The vaccine according to claim 1, wherein the mucin is MUC1. 5. The vaccine according to claim 1, wherein the mucin is selected from the group consisting of MUC2, MUC3, MUC4 and MUC5. 6. 5. The vaccine according to claim 4, wherein the length of the mucin peptide ranges from 10 amino acids to 300 amino acids. 7. The vaccine according to claim 4, wherein the mucin peptide is selected from the group consisting of APDTRPAPGSTAPPAHGVTS, TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA, (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) ₂ VTSAPDTRPA. 8. The vaccine according to claim 7, wherein the mucin peptide is VTSAPDTRPA PGSTAPPAHGVTSAPDTRPA. 9. 7. The vaccine according to claim 6, wherein the effective amount of the mucin conjugate is an amount of about 1 μg to about 1 mg. 10. The vaccine according to claim 1, wherein the adjuvant is QS-21. 11. 11. The vaccine of claim 10, wherein the effective amount of QS-21 is an amount of about 10 [mu] g to about 20 [mu] ig. 12. The vaccine of claim 11, wherein the effective amount of QS-21 is about 100 μg. 13. 2. The vaccine of claim 1, wherein the subject is afflicted with cancer, and wherein the immune response generated in the subject upon administration of the vaccine effectively treats cancer. 14． 2. The vaccine of claim 1, wherein the subject is susceptible to cancer, and wherein the immune response generated in the subject upon administration of the vaccine effectively prevents cancer. 15. 15. The vaccine according to claim 14, wherein the cancer cells have mucin on their surface. 16. 15. The vaccine according to claim 14, wherein the cancer is breast, prostate, colon, lung or pancreatic cancer. 17． A method of stimulating or enhancing the generation of an immune response that recognizes a mucin in a subject, comprising administering to said subject an effective dose of the vaccine of claim 1. 18. A method of treating cancer in a subject afflicted with cancer, the method comprising administering to the subject an effective dose of the vaccine of claim 1. 19. A method of preventing cancer in a subject susceptible to cancer, the method comprising administering to the subject an effective dose of the vaccine of claim 1. 20. A method of preventing cancer recurrence in a subject susceptible to cancer, the method comprising administering to said subject an effective dose of the vaccine of claim 1. 21. 21. The method of claim 17, 18, 19 or 20, wherein the immunogenic protein is keyhole limpet hemocyanin or a derivative of keyhole limpet hemocyanin. . 22. 21. The method according to claim 17, 18, 19 or 20, wherein the adjuvant is QS-21. 23. The method according to claim 17, 18, 19 or 20, wherein the mucin is MUC1. 24. 21. The method according to claim 17, 18, 19 or 20, wherein the mucin is selected from the group consisting of MUC2, MUC3, MUC4 and MUC5. 25. 24. The method of claim 23, wherein the length of the mucin peptide ranges from 10 amino acids to 300 amino acids. 26. The method of claim 25, wherein the mucin peptide, APDTRPAPGSTAPPAHGVTS, TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS, VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA , and (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) ₂ VTSAPDTRPA, method selected from the group consisting of. 27. 27. The method of claim 26, wherein the mucin peptide is VTSAPDTRPA PGSTAPPAHGVTSAPDTRPA. 28. 24. The method of claim 23, wherein the effective amount of the mucin conjugate peptide is an amount from about 1 [mu] g to about 1 mg. 29. 26. The method according to claim 25, wherein the adjuvant is QS-21. 30. 30. The method of claim 29, wherein the effective amount of QS-21 is from about 10 [mu] g to about 200 [mu] g. 31. 31. The method of claim 30, wherein the effective amount of QS-21 is about 100 g. 32. 21. The method according to claim 18, 19 or 20, wherein said cancer cells have mucin on their surface. 33. 21. The method according to claim 18, 19 or 20, wherein the cancer is breast, prostate, colon, lung or pancreatic cancer.