JP2001508293A - マウスガラニンレセプターｇａｌｒ２及び該レセプターをコードするヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なガラニンレセプターＧＡＬＲ２が記載されている。また、該レセプターをコードする核酸及び該レセプターに特異的なリガンドを同定する種々のアッセイが開示されている。このように同定されたリガンドは肥満症の治療、疼痛の治療及び認識障害の治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】マウスガラニンレセプターＧＡＬＲ２及び該レセプターをコードするヌクレオチ ド 発明の分野 本発明は、ＧＡＬＲ２と命名された新規なガラニンレセプター、該レセプター をコードするヌクレオチド、及び、該レセプターを使用するアッセイに関する。発明の背景 ガラニンはブタの腸から初めて単離されたが、中枢及び末梢の神経系に広く分 布している。たいていの生物種のガラニンはアミド化カルボキシル末端をもつ２ ９個のアミノ酸から成るペプチドである。ヒトガラニンに特有の特徴は、３０個 のアミノ酸から成るより長いペプチドであること及びアミド化末端をもたないこ とである。ガラニン配列は高度に保存性であり、すべての種のガラニン配列の最 初の１５個のアミノ酸は完全に保存されている。ガラニンは、主として視床下部 、青斑、海馬及び下垂体前葉並びに脊髄、膵臓及び胃腸管の領域で免疫反応及び 結合を生じる。 満腹したネズミの視床下部の側脳室核（ＰＶＮ）にガラニンを注入したとき、 神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）と同様の用量依存的な摂取増進が生じる。ガラニンは ノルエピネフリンと同様に炭水化物の摂取を増進させるが、いくつかの研究はガ ラニンが脂肪摂取を強力に増進させることを証明した。巨大分子栄養素の選択順 位はガラニンによって炭水化物から脂肪に移ることが示唆された。ガラニンの注 入は摂取を増進し、エネルギー消費を抑制し、インスリン分泌を阻害する。遺伝 性肥満のラットでは視床下部のガラニン発現が痩せた同腹仔対照に比べて増進し ていることが観察される。ペプチドレセプターのアンタゴニストをＰＶＮに注入 すると、ガラニン特異的脂肪摂取増進の誘発がブロックされる。ガラニン特異的 アンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＶＮに注入すると、ガラニン発現の特異的 減少が生じ、これに対応してタンパク質または炭水化物の摂取は殆ど変化しない が脂肪の摂取及び総熱量摂取は減少する。従ってガラニンは、脂肪の摂取挙動に 関与する有力な神経化学マーカーの１つであると考えられる。 ガラニンはラットのコリン作動性機能を阻害し、機能性記憶を損傷する。コリ ン作動性ニューロンを破壊する病変は空間認 識機能を欠損させる。アセチルコリン（ＡＣｈ）の局所投与はこの欠損をある程 度回復させるが、ガラニンはこのようなＡＣｈ介在型の回復をブロックする。ア ルツハイマー病に罹患した脳の剖検サンプルは、基底神経節でガラニン作動性（ ｇａｌｉｎｅｒｇｉｃ）神経支配が増加したことを示唆する形跡を有している。 従って、もしガラニン作動性活性の亢進がアルツハイマー病の認識能力低下の原 因であるならば、ガラニンのアンタゴニストは認識能力低下を緩和させる治療に 有効であろう。 脳室内投与、皮下投与または静注によってラットにガラニンを投与すると、血 漿中の成長ホルモンが増加する。また、健常な被験者にヒトのガラニンを注入し たときも、血漿中の成長ホルモンが増加し、ＧＨＲＨ（成長ホルモン放出ホルモ ン）に対する成長ホルモン応答が強力に増進される。 ガラニンは背根神経節に特に高レベルで存在する。座骨神経の切除によってガ ラニンのペプチド及びｍＲＮＡのレベルが劇的に上方調節される。アキソトミー （ａｘｏｔｏｍｙ）後にガラニンレセプターのアンタゴニスト（Ｍ３５、Ｍ１５ ）を反復投与すると、通常は疼痛に対する反応であると考えられているラットの 自己加害損傷挙動が明らかに亢進している。切断した 座骨神経の近位端にガラニン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを付加する と、ガラニンペプチドのレベル上昇が抑制され、同時に自己分裂が促進される。 莢膜注入したガラニンはモルヒネの鎮痛作用に相乗効果を与える。このようなモ ルヒネの抗侵害受容効果はガラニンレセプターのアンタゴニストによってブロッ クされる。従って、ガラニンのアゴニストは神経性疼痛の緩和にある程度有効で あろう。 ガラニンは、百日咳毒素感受性Ｇｉ／Ｇｏタンパク質に結合する高親和性ガラ ニンレセプターに介在され、アデニル酸シクラーゼ活性の阻害、Ｌ型Ｃａ⁺⁺チャ ンネルの閉鎖及びＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャンネルの開放などに作用する。¹²⁵Ｉ−ガ ラニン（Ｋｄ約１ｎＭ）の特異的結合は、ガラニンの免疫反応が局在する領域、 即ち、視床下部、腹側海馬、前脳基底、脊髄、膵臓及び下垂体で証明されている 。大抵の組織中では、高親和性結合及びアゴニスト活性を生じるためには、アミ ノ末端（ＧＡＬ１−１５）だけで十分である。 最近、ガラニンレセプターのｃＤＮＡがヒトＢｏｗｅｓメラノーマ細胞系から 発現クローニングによって単離された（Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉら，１９９ ４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９１：９７８０−９７８３）。このレセプターＧ ＡＬＲＩはヒト胎児の脳及び小腸で発現されるが他の場所ではその分布が殆ど知 られていない。ＣＯＳ細胞中で一過性に発現されたこのレセプターに対する¹²⁵ Ｉ−ブタガラニンの結合を阻害する物質としてＧａｌ（１−１６）はｐＧＡＬ（ ３−２９）の１０００倍以上の活性を示した。レセプターのこのサブタイプがガ ラニン特異的摂取挙動に介在する視床下部のレセプターであるか否かを判断する ことは今後の研究課題である。 上記以外のガラニンレセプターを更に同定し、この生体システムを更に詳細に 特性決定し、ガラニンレセプターのサブタイプの選択的なアゴニスト及びアンタ ゴニストを同定することも要望されている。発明の概要 本発明は、随伴タンパク質が実質的に存在しない、ＧＡＬＲ２と命名された新 規なガラニンレセプター、及びＧＡＬＲ２に少なくとも約４０％の相同性を有し ており実質的に同じ生物活性を有しているＧＡＬＲ２様レセプターに関する。本 発明の好ましい実施態様では、ＧＡＬＲ２様レセプターはＧＡＬＲ２に 少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少な くとも約８５％の相同性を有している。より特定的には本発明は、随伴タンパク 質が実質的に存在しないラット、ヒト及びマウスのＧＡＬＲ２、並びに、ＧＡＬ Ｒ２に少なくとも約５０％の相同性を有しており実質的に同じ生物活性を有して いるレセプターに関する。 本発明の別の目的は、霊長類または非霊長類のＧＡＬＲ２タンパク質であって 、実質的に同じ核酸配列によってコードされているが、スプライシングによる変 化またはその他のＲＮＡプロセシングに由来する修飾または突然変異に誘発され た変化を生じた結果として、発現されたタンパク質が天然形態と相同であるが天 然形態とは異なるアミノ酸配列を有しているようなＧＡＬＲ２タンパク質を提供 することである。これらの変異形態はヒト及び動物の生理学においてもｉｎ ｖ ｉｔｒｏの細胞ベースアッセイにおいても異なる及び／または追加の機能を有し 得る。 本発明の更に別の目的は、ラット、ヒト、マウス、ブタまたは他の生物種のガ ラニンレセプターまたはその機能的等価物をコードする核酸を提供することであ る。これらの核酸は随伴核 酸が存在しないものでもよく、または、単離もしくは精製されたものでもよい。 本発明のレセプターをコードする核酸は任意の種類の核酸でよい。本発明は特定 的にＲＮＡも包含するが、好ましい形態はゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのようなＤ ＮＡである。核酸構築物はまた、１つまたは複数のプロモーター領域、終止領域 及び所望の場合にはエンハンサー領域のような転写及び翻訳の調節領域を含み得 る。核酸は、平均的な知識をもつ当業者に公知の汎用技術に従って、プラスミド のような公知の任意のベクターに挿入され、適当な宿主細胞をトランスフェクト するために使用される。 本発明の別の目的は、ＧＡＬＲ２をコードする核酸を含むベクター、及び、こ れらのベクターを含む宿主細胞を提供することである。本発明の更に別の目的は 、ＧＡＬＲ２をコードする核酸を含むベクターを培養条件下で宿主細胞に導入す る段階から成るＧＡＬＲ２の製造方法を提供することである。 本発明のまた別の目的は、本発明のレセプター及び／または核酸を利用するＧ ＡＬＲ２リガンドのアッセイを提供することである。このアッセイの好ましい実 施態様では、ＧＡＬＲ２に対する推定ＧＡＬＲ２リガンドの結合とガラニンの結 合とを比 較する。図面の簡単な説明 図１は、５’及び３’非翻訳領域を含むラットＧＡＬＲ２（クローン２７Ａ） の核酸配列（配列１）である。 図２は、開始コドンＭｅｔから終止コドンまでのＧＡＬＲ２（クローン２７Ａ ）の核酸配列（配列２）である。 図３は、ＧＡＲＬ２（クローン２７Ａ）の概略図、並びに、ＧＡＬＲ２（クロ ーン２７Ａ）の核酸配列及び推定アミノ酸配列（配列３及び４）である。 図４は、ＧＡＬＲ２（クローン２７Ａ）の推定アミノ酸配列（配列５）である 。 図５は、ラットＧＡＬＲ１のアミノ酸配列（配列６）とラットＧＡＬＲ２（配 列７）のアミノ酸配列との比較（重層位置合せ）である。 図６は、ＧＡＬＲ２を単離するために使用したｃＤＮＡプローブの核酸配列（ 配列８）である。 図７は、ヒトＧＡＬＲ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列９）である。 図８は、ヒトＧＡＬＲ２遺伝子のＤＮＡ配列（読取り枠だけ） （配列１０）である。 図９は、ヒトＧＡＬＲ２の推定アミノ酸配列（配列１１）である。 図１０は、ヒト及びラットのＧＡＬＲ２の薬理学を示す。 図１１は、ＧｑまたはＧｓ共役応答（色素分散）及びＧｉ共役応答（色素凝集 ）を示す。 図１２は、マウスＧＡＬＲ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列１２）である。 図１３は、マウスＧＡＬＲ２遺伝子のアミノ酸配列（配列１３）である。 図１４は、ＧＡＬＲ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の高度な配列保存性を示 すヒト、ラット及びマウスのＧＡＬＲ１及びＧＡＬＲ２のタンパク質配列の比較 である。 図１５は、ヒトＧＡＬＲ２のＲＮＡ発現プロフィルである。 図１６は、ラットＧＡＬＲ２の脳内発現を示す。発明の詳細な説明 明細書及び請求の範囲で使用した用語を以下に定義する。 “随伴タンパク質が実質的に存在しない”という表現は、レセプターの少なく とも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％ が、ガラニンレセプターを発現する生存哺乳類細胞中で通常は検出される他の細 胞膜タンパク質を随伴していないことを意味する。 “随伴核酸が実質的に存在しない”という表現は、核酸の少なくとも約９０％ 、好ましくは少なくとも約９５％が、ガラニンレセプター遺伝子を天然に発現す る生存哺乳類細胞中で通常は検出される他の核酸を随伴していないことを意味す る。 “実質的に同じ生物活性”という表現は、レセプター−ガラニン結合定数がＧ ＡＬＲ２とガラニンとの結合定数の５倍以内、好ましくはＧＡＬＲ２とガラニン との結合定数の２倍以内であることを意味する。 “緊縮性ポストハイブリダイゼーション洗浄条件”は、６５℃の０．１×標準 生理的クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）を意味する。 “標準ポストハイブリダイゼーション洗浄条件”は、５５℃の６×ＳＳＣを意 味する。 “緩和ポストハイブリダイゼーション洗浄条件”は、３０℃の６×ＳＳＣ、ま たは５５℃の１〜２×ＳＳＣを意味する。 “機能性等価物”は、選択的スプライシング、欠失、突然変異または付加の結 果として天然産生ＧＡＬＲ２タンパク質に完 全に等しいアミノ酸配列を有していないが、天然産生レセプターの生物活性の少 なくとも１％、好ましくは１０％、より好ましくは２５％を保存しているレセプ ターを意味する。このような誘導体は天然ＧＡＬＲ２に有意な相同性を有してお り、ＧＡＬＲ２から得られたＤＮＡ配列と共に低緊縮性ハイブリダイゼーション を行わせることによって検出できる。機能性等価物をコードしている核酸は天然 産生レセプターの核酸に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約６０％の相同 性を有している。 第二のガラニンレセプターが存在することが本発明によって知見され、ＧＡＬ Ｒ２と命名され。ラット、ヒト及びマウスのＧＡＬＲ２配列をそれぞれ図４、図 ９及び図１３に示し、実施例で説明する。しかしながら、本発明が生物の種に関 わりなくＧＡＬＲ２を特定的に包含すること、特に齧歯類（ラット及びマウスを 含む）、アカゲザル、ブタ、ニワトリ、ウシ及びヒトのＧＡＬＲ２を特定的に包 含することを理解されたい。ガラニン２レセプターはどの種においても高度に保 存されており、平均的な知識をもつ当業者は、本文中に示したラット、ヒト及び ／またはマウスの配列に基づいて他の生物種のＧＡＬＲ２を得るためのプローブ を容易に設計できる。 ＧＡＬＲ２タンパク質は、細胞膜中でレセプターを固定する１つまたは複数の ドメイン、少なくとも１つのリガンド結合ドメイン、などのような種々の機能性 ドメインを含む。多くのレセプタータンパク質と同様に、多くのアミノ酸の修飾 、特にリガンド結合ドメインに検出されないが出発レセプターの生物活性を少な くともある程度のパーセンテージで保存しているアミノ酸の修飾が可能である。 従って、本発明は特定的に、Ｎ末端部分の欠失、欠損または突然変異を有する機 能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を包含する。また、本発明は特定的に、機能 的活性の低下を随伴しない修飾及び／または欠失を他のドメインに有している機 能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を包含する。 更に、第二のメッセンジャーエフェクター系と相互作用するドメインのような 他の機能性ドメインを結合特異性及び／または選択性を改変することによって修 飾することも可能である。このような機能的に等価の突然変異レセプターも本発 明の範囲内に包含される。 本発明のタンパク質は、７つのトランスメンブランドメイン（ＴＭ）を有する Ｇタンパク質に結合したレセプターのスーパ ーファミリー（ＧＰＣ−Ｒまたは７−ＴＭレセプター）の典型的な構造的特徴を 有していることが知見された。従って、ＧＡＬＲ２タンパク質はレセプターファ ミリーＧＰＣ−Ｒの新規な構成員となる。本発明の完全形のＧＡＬＲ２は、７つ のトランスメンブラン領域、細胞内及び細胞外の３つのループ、ＧＰＣ−Ｒタン パク質のシグナチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列、のようなＧＰＣ−Ｒの一般 的特徴を有していることが知見された。ＴＭドメイン及びＧＰＣ−Ｒタンパク質 のシグナチャー配列は、ＧＡＬＲ２のタンパク質配列にも認められる。機能を果 たすために全部の領域が必要であるとは限らないので、本発明は必須でない１つ または複数のドメインが欠失した機能性レセプターも包含する。 ヌクレオチド配列の決定は、ＧＡＬＲ２がイントロン含有のＧＰＣ−Ｒのクラ スに属することを示した。ポリ（Ａ）領域で終結する前駆体ｍＲＮＡであるクロ ーン２７Ａは１１１９ｂｐの読み取り枠をコードしており、この読み取り枠は約 ５００ｂｐの１つのイントロンによって２つのエキソンに分割されている（図４ ）。エキソン１は予測されたＴＭ−３を含むＮ末端の細胞外ドメインをコードし ており、エキソン２はＣ末端細胞内 ドメインを含む第二の予測された細胞外ループをコードしている。完全に保存さ れたスプライスドナー部位（Ｇ／ｇｔ）はヌクレオチド３６８に検出され、これ はＧタンパク質に結合したレセプターのシグナル芳香族トリプレット（Ｄ，Ｅ） ＲＹの第二残基に一致する。 イントロンの除去は、クローン２７Ａが図４の下線部分で示したような７つの 予測されたＴＭドメインと共に３７２個のアミノ酸から成る全長ラットガラニン レセプターポリペプチドをコードしていることを示す。核酸及びタンパク質の配 列のデータベースを検索すると、読み取り枠の配列は１つであり、ラットのガラ ニン１レセプター（ＧＡＬＲ１）に極めて近縁であり、核酸は５５％及びタンパ ク質は３８％の配列一致を有することが判明した。ラットのＧＡＬＲ１及びＧＡ ＬＲ２のタンパク質配列の位置合せを図５に示す。ＧＰＣ−Ｒが有している複数 の保存された特徴、即ち、ＴＭ−３に隣接のシグナチャー芳香族トリプレット配 列（Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）、ジスルフィド結合し得る最初の２つの細胞外ル ープ中のＣｙｓ−９８及びＣｙｓ−１５３、推定アミノ末端のＮグリコシル化部 位（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、カルボキシル末端及び第三の細 胞質ループ中のリン酸化部位、ＴＭ−４、５、６及び７中の保存プロリン残基、 がラットＧＡＬＲ２でも同定された。 第二のｃＤＮＡクローンを単離し、クローン１６．６と命名した。このクロー ンはイントロン非含有であり従ってＧＡＬＲ２の完全読み取り枠を含む連続的ｃ ＤＮＡである。クローン１６．６はクローン２７Ａと同様に約５００ｂｐの５’ 非翻訳領域と、７−ＴＭドメインをコードする連続的ＧＡＬＲ２読み取り枠（１ １１９ｂｐ）と、約３２０ｂｐの３’非翻訳領域と、ポリ（Ａ）領域とを含む。 クローン２７Ａ及びクローン１６．６の読み取り枠は、読み取り枠のヌクレオチ ド１０９（予測されたＴＭ−１に存在する）以外は等しい配列を有している。ク ローン２７Ａは１０９位にＴを含むがクローン１６．６はＣを含む。従って、Ｇ ＡＬＲ２タンパク質のアミノ酸３７はクローン１６．６中ではフェニルアラニン でありクローン２７Ａ中ではイソロイシンである。クローン２７Ａ及びクローン １６．６の双方のＤＮＡはそれぞれのタンパク質と同様に本発明の目的となる。 ヒトＧＡＬＲ２タンパク質の配列はラットＧＡＬＲ２オルトログに顕著な一致 及び類似を示す。ヒト形態及びラット形態の 顕著な違いの１つは、ヒトＧＡＬＲ２のＣ末端細胞内ドメインに追加の１５個の アミノ酸が存在することである。マウスのタンパク質配列もまた、ＧＡＬＲ遺伝 子ファミリーに極めて顕著な一致及び類似を示す。 本発明はまた、ＧＡＬＲ２の欠損形態、特にレセプターの細胞外部分を含むが レセプターの細胞内シグナル発生部分が欠失した欠損形態、及び、これらの欠損 形態をコードする核酸に関する。このような欠損レセプターは種々の結合アッセ イで有用である。従って本発明は特定的に、Ｎ末端部分の欠失、欠損または突然 変異を有する機能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を包含する。また、本発明は 特定的に、機能的活性の低下を随伴しない修飾及び／または欠失を他のドメイン に有しているレセプターキメラのような機能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を 包含する。 更に、第二のメッセンジャーエフェクター系と相互作用するドメインのような 他の機能性ドメインを結合特異性及び／または選択性を改変することによって修 飾することも可能である。このような機能的に等価の突然変異レセプターも本発 明の範囲内に包含される。 本発明の別の目的を構成するアッセイは、結合アッセイ（¹²⁵Ｉ−ガラニン結 合に対する競合）、共役活性測定アッセイ（ガラニンレセプター発現細胞中のフ ォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼのガラニン介在阻害を含む）、ガラニン レセプター発現細胞中のガラニン刺激カルシウム遊離の測定（例えばエクオリン アッセイ）、ガラニンレセプター発現細胞中の内部整流カリウムチャンネルの刺 激（ＧＩＲＫチャンネル、電圧変化によって測定）、マイクロフィジオメーター （微量生理機能測定計）によって測定されるガラニンレセプター発現細胞のガラ ニン刺激によるｐＨ変化の測定、などである。 宿主細胞はＧＡＬＲ２を産生するための適正条件下で培養し得る。レセプター をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは組換え宿主細胞中でレセプターを発現 させるために使用し得る。組換え宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれで もよく、その非限定例としては、大腸菌のような細菌、酵母のような真菌類細胞 、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類に由来の細胞系を非限定例とする哺乳類細 胞、ショウジョウバエ、ヨトウムシ、カイコに由来の細胞系を非限定例とする昆 虫細胞がある。哺乳動物種に由来の市販の適当な細胞系の非限定例は、Ｌ細胞Ｌ − Ｍ（ＴＫ^-）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ １（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／ ３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、 Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）である。 レセプターに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローン化したレセ プターでトランスフェクトした細胞またはこれらの細胞に由来の膜に対する化合 物の親和性を測定することによって示される。クローン化したレセプターを発現 させ、これらの細胞に対する放射性標識リガンドの結合を阻害する化合物をスク リーニングする方法は、レセプターに対して高い親和性をもつ化合物を迅速に選 択するための合理的な方法である。上記アッセイによって同定されたこれらの化 合物は、レセプターのアゴニストでもアンタゴニストでもよく、ペプチド、タン パク質または非タンパク質性有機分子でよい。あるいは、レセプターの活性に影 響を与える化合物をスクリーニングするためにレセプターの機能アッセイを使用 してもよい。このような機能アッセイはｅｘ ｖｉｖｏの筋肉収縮アッセイから レセプターを発現する細胞中の第二のメッセンジャーレベルを測定するアッセイ までの範囲に及ぶ。第二メッセンジャーアッセイの非限定例は、サイクリックＡ ＭＰもしくはカルシウムのレベルを測定するアッセイまたはアデニリルシクラー ゼ活性を測定するアッセイである。上記アッセイによって同定されたこれらの化 合物はレセプターのアゴニスト、アンタゴニスト、サプレッサーまたはインデュ ーサーのいずれでもよい。これらの化合物の機能的活性は組織中で先天的に発現 されたレセプターまたはクローン化され外的に発現されたレセプターを用いて最 良に評価される。 本発明のアッセイを使用してガラニンのアゴニスト及びアンタゴニストを同定 し得る。ガラニンのアゴニストは、ガラニン擬似物のようなＧＡＬＲ２に結合し ガラニンの細胞応答に少なくともほぼ等しいかまたは上回る細胞応答を生じる化 合物である。このような化合物はガラニン不足を原因とする食欲不振状 態または疼痛の治療に有効であろう。 また、アッセイのこの実施態様を使用してガラニンのアンタゴニストを同定し てもよい。ガラニンのアンタゴニストは、ＧＡＬＲ２に結合できるが天然型ガラ ニンの応答よりも少ない応答を生じる化合物である。このような化合物は肥満の 治療に有効であろう。 本発明の１つのアッセイは、（ａ）ＧＡＬＲ２レセプターを発現する細胞を化 合物の存在下で培養し、（ｂ）ＧＡＬＲ２レセプター活性または第二メッセンジ ャー活性を測定する段階から成るＧＡＬＲ２レセプターを変調する化合物の同定 方法である。所望の場合、上記で測定した活性を、例えば化合物としてガラニン を用いて測定した標準に比較し得る。好ましい実施態様では、細胞を形質転換さ せ、ＧＡＬＲ２レセプターを発現させる。 ハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをプローブするために、補助ｃ ＤＮＡクローン（または例えば１５ヌクレオチドの長さの短縮部分）を使用し、 核酸がハイブリダイズできる十分に類似の他のレセプターを発見してもよい。こ のようなクローンは他の種からライブラリーをスクリーニングするため に特に有効である。この段階のハイブリダイゼーション条件が極めて緊縮性の条 件から緩和された条件まで広い範囲で変化できることは平均的な当業者には理解 されよう。適正な温度、塩濃度及びバッファは公知である。 本発明をより十分に説明するために以下の非限定実施例を与える。実施例１ ラットの視床下部に由来のｃＤＮＡライブラリーをプラスミド主体の哺乳類ベ クターｐｃＤＮＡ−３(ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)中で 構築した。ＲＮａｇｅｎｔｓ全ＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ ｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、新しく摘出したラットの視床下部（液 体窒素中で瞬間冷凍）から全ＲＮＡを、１ｇ（湿潤重量）の視床下部組織から約 ０．５ｍｇの収率で単離した。ポリＡ領域ｍＲＮＡの単離システムＩＩＩｏｍｅ ｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してポリ(Ａ)⁺ｍＲＮＡを、０．５μｇの全ＲＮ Ａから約６μｇの収率で選択した。次に、ランダムヘキサマー及びオリゴ（ｄＴ ）−Ｎｏｔ Ｉプライミングの双方をもつキット（Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｕｐｅｒｓ ｃｒｉｐｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を用いるｃＤＮ Ａ合成の鋳型として３μｇのポリ(Ａ)⁺を使用した。ｐＣＤＮＡ−３のＢｓｔＸ Ｉ部位に挿入するために二重鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩアダプターを 用いて改造し、電気穿孔によって大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。得られ たライブラリーは約７５０，０００の一次形質転換体を含んでおり、９０％のク ローンがインサート（平均サイズ１−２ｋｂ）を含んでいた。ライブラリー（約 ７００，０００ｃｆｕ）をアンピシリンとクロラムフェニコールとを含むＬＢプ レートで平板培養し、約２８０ｂｐのＰＣＲフラグメント（配列８）でプローブ した。５０％のホルムアミドと４×デンハルト溶液と０．１％のＳＤＳと１０％ の硫酸デキストランと３０μｇ／ｍｌの剪断したサケ精子ＤＮＡとを２×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌの³²Ｐ−標識プローブと共に含む５×ＳＳＰＥバッファ中でハイブ リダイゼーションを３２℃で１８時間行った。〔α〕³²Ｐ−ｄＣＴＰによるラン ダムプライミングによってプローブを１０⁹ｄｐｍ／μｇよりも大きい比活性ま で放射性標識した。次に、フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で５５ ℃で洗浄し、フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ｏｍａｔ）に４８時間 露光した。独立の２つの陽性クローンを同定し（クローン２７Ａ及び１６．６） 、更に分析処理した。実施例２ ＧＡＬＲ２の配列解析 ＷｉｚａｒｄのＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉ ｓｏｎ，ＷＩ）を用いて一夜培養物からＤＮＡを調製し、ＡＢＩ ３７７器具に 載せたＰＲＩＳＭ色素デオキシターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて全 自動配列解析処理した。初期配列決定プライマーはｐｃＤＮＡ−３中のＴ７及び ＳＰ６のプロモーター部位に相補的であり、追加のプライマーをインサートＤＮ Ａに相補的にした。データベース検索（Ｇｅｎｂａｎｋ，ＥＭＢＬ，Ｓｗｉｓｓ −Ｐｒｏｔ，ＰＩＲ，ｄＥＳＴ，Ｐｒｏｓｉｔｅ，ｄｂＧＰＣＲ）、配列位置合 せ及びガラニンレセプターのヌクレオチド及びタンパク質の配列解析を、ＧＣＧ 配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ペプチド構造及びモ チーフの重層プログラム）、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴ検索プログラム、ＰＣ／ Ｇｅｎｅソフトウェアスーツ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉ ｃｓ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；タンパク質解析プログラム）を用い て行った。実施例３ ＧＡＬＲ２の発現ベクターの構築 ５μｇの哺乳類発現ベクターｐＣＩ．ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ ｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を２０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で２時間消化した 。次に消化物を仔ウシ腸ホスファターゼで処理し、次いで１×ＴＡＥバッファ中 の１％のＳｅａｐｌａｑｕｅゲルで電気泳動にかけ、直鎖化したベクターに対応 するバンドを切り出した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲシステム（Ｐ ｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて６５℃で融解後の切片からＤＮＡを回 収した。１％のＴＢＥゲル上の標準と共に電気泳動によってＤＮＡを定量した。 ｐＣＤＮＡ−３／２７Ａに由来の１００ｎｇの２２００ｂｐのＥｃｏＲＩインサ ート（イントロンを含む）を５０ｎｇのベクターｐＣＩ．ｎｅｏに１０ｍｌの反 応容量で室温で１時間結合させた。１μｌのこの結合混合物を使用して５０μｌ のコンピテントＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転 換させた。ＢａｍＨＩによる消化後に正しい配向のク ローンを選択した。次に、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いてトランスフェクション品質のＤＮＡを調 製した。哺乳類のＣＯＳ−７細胞を電気穿孔によってトランスフェクトした。Ｃ ＯＳ−７細胞（１×１０⁷）を０．８５ｍｌのリンゲルバッファに浮遊させ、１ ５ｍｇのｐＣＩ．ｎｅｏ／２７Ａクローンを０．４ｍｍの電気穿孔キュベット（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に加えた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ電気穿孔 デバイスを使用して電流を印加し（９６０μＦ，２６０Ｖ）、細胞をＴ−１８０ フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。発現を７２時間進行させた。実施例４ ＧＡＬＲ２の薬理学 トランスフェクト細胞を無酵素の解離溶液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ ，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ）中で解離させた後、氷冷した膜バッファ（１０ ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、１０ｍＭのＰＭＳＦ、１０μＭのホスホルアミドン 及び４０μｇ／ｍｌのバシトラシン）中でダウンスホモジナイザーで破壊するこ とによって膜を調製した。低速遠心（１１００×ｇで１０ 分、４℃）及び高速遠心（３８，７００×ｇで１５分間、４℃）した後、膜をバ ッファに再懸濁させ、タンパク質濃度を測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイキッ ト）。２５ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、４０μｇ／ｍｌのバシトラシン、４μｇ／ｍｌのホスホルアミドン及び１０μ Ｍのロイペプトンを含む総量２５０μｌのバッファを用いて膜における¹²⁶Ｉ− ヒトガラニン（比活性＝２２００Ｃｉ／ミリモル、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の結 合を測定した。７０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ヒトガラニンを使用した。膜を加えて反応を 開始させ、インキュベーションを室温で１時間進行させた。非特異的結合は１μ Ｍの低温ガラニンの存在下で残留している結合放射能の量であると定義した。競 合試験では、種々の濃度のペプチド（ｈＧａｌ、ｐＧａｌ、ｈＧａｌ（１−１６ ）、ｒＧＡＬ（２−２９）、ｒＧＡＬ（３−２９）、ｈＧａｌ（１−１９））ま たはキメラペプチド（Ｃ７、Ｍ１５、Ｍ４０、Ｍ３５）が¹²⁵Ｉ−ｈＧａｌ（７ ０ピコモル）と共に含まれていた。ＴＯＭＴＥＣ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）細胞ハ ーベスターを使用し、０．１％のポリエチルアミンに予浸したＧＦ／Ｃフィルタ ーを通す高速濾過によってインキュベーションを終了させた。Ｐｒｉｓｍソ フトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い て結果を分析した。ラットＧＡＬＲ１タンパク質及びラットＧＡＬＲ２タンパク 質の双方のリガンド結合プロフィルを以下の表に示す（表はクローン２７Ａを示 す：クローン１６．６は同様の結果を生じた）。ラットＧＡＬＲ２に対する¹²⁵ Ｉ−標識ヒトガラニンの結合ＫＤは０．２ｎＭであった。 実施例５ ラットＧＡＬＲ２の発現 ラット脳内のＧＡＬＲ２ ｍＲＮＡの分布をマップするために、³²Ｐ−標識Ｇ ＡＬＲ２ ＯＲＦフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用いて ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．ら， １９９５Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８：８４−９１参照。図１６に示すように、多数 の脳核及び領域、特に上−、前−（ＰＭＤ／ＰＭＶ）、内−及び外−乳頭核、歯 状回（ＤＧ）、帯状回（ＣＧ）、視床後核（ＰＨ）、視索下部後核及び弓状核（ Ａｒｃ）で特異的ハイブリダイゼーションが検出された。前頭部及び頭頂部の皮 質領域も標識した。ヒトＧＡＬＲ２のクローン単離：縮重ＰＣＲによる部分的ＧａｌＲ２遺伝子のク ローニング ソマトスタチンレセプター及びソマトスタチン近縁遺伝子によってコードされ たレセプターＳＬＣ−１のトランスメンブラン(ＴＭ)領域をコードする配列ＴＭ ３(Ｐ１：５’−ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＹＣ ＡＴＧ ＲＳＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＳＧＣ ＴＡＣ；配列１４：Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｓ＝Ｃま たはＧ)及びＴＭ７（Ｐ２：５’−ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＲＳ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＧＣ ＲＴＡ；配列１５）に基づいて設計した縮重オリゴヌクレオチ ドを用いたＰＣＲによってヒトゲノムＤＮＡを増幅した。９５℃で１分間の変性 、５５℃、４５℃または３８℃で１分間のアニーリング及び７２℃で２．５分の 伸長を３０サイクル繰返し、次いで７２℃で７分間の伸長を行うＰＣＲ条件を使 用した。得られたＰＣＴ産物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈 殿させ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、クレノウ酵素によって平 滑末端を形成した。次いで、０．５％低融点アガロースで電気泳動にかけ、予想 したサイズのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングし た。コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを精製し、インサートを配列決定した 。実施例６ 遺伝子の配列及び構造：ヒトＧａｌＲ２ゲノムＤＮＡのクローニング及び配列決 定 ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７ヒトゲノムライブラリー（Ｃｌｏ ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をスクリーニングするためのプローブ として、ニックトランスレーションによって〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰで放射性標識した ＤＮＡフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した。Ｍａｒｃｈｅｓｅら，１ ９９４〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３，６０９−６１８〕に記載の手順で、陽性ファ ージクローンをプラーク精製し、ＤＮＡを調製し、制限酵素消化し、アガロース ゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜に移し、ライブラリーをスクリーニングする ために使用した同じプローブとハイブリダイズさせた。ファージＤＮＡを消化し 、得られたフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔベクターにサブクローニングす ることによって陽性ファージをサブクローニングした。ＡＢＩ ３７２全自動シ ークエンサー〔Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し標準方法でクローンのＤＮＡ配 列を決定した。図７に示すように、決定された配列は、１８００ｂｐのイントロ ンによって中断された合計２つのエキソンをもつ遺伝子を示す。完全読み取り枠 （図８）の推定アミノ酸配列（図９）は、７つのトランスメンブランアルファ螺 旋ドメインを含むＧタンパク質結合レセプターの典型的な特徴を もつ３８７個のアミノ酸から成るタンパク質を与える。図１４はＧＡＬＲ１及び ＧＡＬＲ２のタンパク質配列を位置合わせし、７つのトランスメンブランドメイ ンに下線を付けて示している。ヒトＧＡＬＲ２タンパク質はラットのＧＡＬＲ２ オルトログに高度な配列の一致及び類似を有している。ヒトの形態及びラットの 形態の顕著な違いは、ヒトＧＡＬＲ２のＣ末端細胞内ドメインに追加の１５個の アミノ酸が存在することである。実施例７ レセプター発現：ヒト及びラットのＧＡＬＲ２：ヒトＧａｌＲ２発現プラスミド の構築 ヒトゲノムクローンからヒトＧａｌＲ２発現構築物をＰＣＲによって組立てた 。各エキソンを標準条件を用いてＰＣＲ増幅した。エキソンＩのプライマーは、 順方向エキソンＩ（５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＣＧＴＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＧＣ ＣＣ−３’；配列１６）及び逆方向エ キソンＩ（５’−ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＧＣＣＡ ＧＡＴ ＡＣＣ Ｔ ＧＴ ＣＴＡ ＧＡＧ ＡＧＡＣＧＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’；配列１７）であっ た。エキソンＩＩのプライマーは、順方向エキソンＩＩ（５’−ＧＧＣ Ｃ ＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＣ Ｃ ＡＴ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＣ−３’：配列１８）及び逆方向エキソンＩＩ（５’ −ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＣ−３’；配列１９）であった。ＰＣＴ 産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、配列決定した。エキソン Ｉ産物をプラスミドｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の ＥｃｏＲＩ部位及びＸｂａＩ部位にサブクローニングした。次に、エキソンＩＩ をＸｂａＩ部位にクローニングし、適当な制限消化物及びＤＮＡ配列決定によっ てその向きを決定した。実施例８ 放射性リガンド結合アッセイ Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、電気穿孔によってＣＯＳ−７細胞に トランスフェクトした。簡単に説明すると、０．８５μｌのリンゲルバッファ中 のＣＯＳ−７細胞（１．２×１０⁷／ｍｌ）と２０μｇのＤＮＡとを０．４ｍｍ の電気穿孔キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）中で混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ電気穿孔デバイスを用いて電流（９６０μＦ 、２６０Ｖ）を印加した。細胞を新しい培地と共にＴ−１８０フラスコ（Ｃｏｒ ｎｉｎｇ）に移し、発現を７２時間進行させた。トランスフェクト細胞を無酵素 の解離溶液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ） 中で解離させた後、氷冷した膜バッファ（１０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、１０ ｍＭのＰＭＳＦ、１０μＭのホスホルアミドン及び４０μｇ／ｍｌのバシトラシ ン）中でダウンスホモジナイザーで破壊することによって膜を調製した。低速遠 心（１１００×ｇで１０分、４℃）及び高速遠心（３８，７００×ｇで１５分間 、４℃）した後、膜をバッファに懸濁させ、タンパク質濃度を測定した（Ｂｉｏ −Ｒａｄアッセイキット）。２５ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ 、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、４０μｇ／ｍｌのバシトラシン、４μｇ／ｍｌのホスホ ルアミドン及び１０μＭのロイペプトンを含む総量０．２５ｍｌのバッファを用 いて膜における¹²⁵Ｉ−ヒトガラニン（比活性＝２２００Ｃｉ／ミリモル、Ｄｕ Ｐｏｎｔ ＮＥＮ）の結合を測定した。７０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ヒトガラニンを使用 した。膜を加えて反応を開始させ、インキュベーションを室温で１時 間進行させた。非特異的結合は１μＭの低温ガラニンの存在下で残留している膜 結合放射能の量であると定義した。競合試験では、種々の濃度のペプチド（ｈＧ ａｌ、ｐＧａｌ、ｈＧａｌ（１−１６）、ｒＧＡＬ（２−２９）、ｒＧＡＬ（３ −２９）、ｈＧａｌ（１−１９））またはキメラペプチド（Ｃ７、Ｍ１５、Ｍ４ ０、Ｍ３５）が¹²⁵Ｉ−ｈＧａｌ（７０ピコモル）と共に含まれていた。ＴＯＭ ＴＥＣ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）細胞ハーベスターを使用し、０．１％のポリエチ ルアミンに予浸したＧＦ／Ｃフィルターを通す高速濾過によってインキュベーシ ョンを終了させた。Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて結果を分析した。 一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−７中のヒトＧＡＬ Ｒ２結合部位の 組換え発現を利用して、クローン化されたレセプターの薬理学を定量した。¹²⁵ Ｉ−ヒトガラニンは、クローン化したレセプターＧＡＬＲ２に、５ｎＭのＫＤと いう高い親和性で飽和可能にかつ特異的に結合した。図１０に要約したように、 種々のガラニン由来ペプチド及びキメラペプチドアンタゴニスト／部分アゴニス トと¹²⁵Ｉ−ヒトガラニンとの競合 はヒトレセプターＧＡＬＲ２がラットＧＡＬＲ２と同様の結合薬理学を有するこ とを示した。実施例９ 機能性キャラクタリゼーション：ポストレセプターシグナル伝達メカニズム：カ エル黒色素胞アッセイ アフリカツメガエルの黒色素胞及び線維芽細胞を従来技術に記載の手順（Ｐｏ ｔｅｎｚａ，Ｍ．Ｎ．ら，１９９２、Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３： ３８−４３）で増殖させた。簡単に説明すると、線維芽細胞馴化増殖培地で黒色 素胞を増殖させた。線維芽細胞馴化増殖培地を調製するために、２０％の熱失活 ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）と１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと１００ 単位／ｍｌのペニシリンと２ｍＭのグルタミンとを補充した７０％のＬ−１５培 地（Ｓｉｇｍａ），ｐＨ７．３中で線維芽細胞を２７．５℃で増殖させた。線維 芽細胞が増殖した培地を回収し、０．２μｍのフィルターで濾過し（線維芽細胞 馴化増殖培地）、黒色素胞を培養するために２７．５℃で使用した。 ＢＴＸ ＥＣＭ６００電気穿孔デバイス（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した電気 穿孔によってプラスミドＤＮＡを黒色素胞に一過性にトランスフェクトした。新 しいカエル線維芽細胞馴化培地の存在下で黒色素胞を１時間インキュベートした 後で細胞を回収した。トリプシン処理し（０．２５％のトリプシン、ＪＨＲ Ｂ ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いでカエル線維芽細胞馴化培地でトリプシンを失活 させるこによって黒色素胞単層を分離させた。２００×ｇで４℃で５分間遠心す ることによって細胞を収集した。細胞をカエル線維芽細胞馴化培地で一回洗浄し 、再度遠心し、氷冷した７０％のＰＢＳ，ｐＨ７．０中で５×１０⁶細胞／ｍｌ の濃度で再浮遊させた。２μｇのｐｃＩｎｅｏ；ヒトガラニン２レセプタープラ スミドＤＮＡを、ＤＮＡ総量が２０μｇとなるように対照レセプターｃＤＮＡ及 びヌードベクターＤＮＡと混合し、この混合物を入れた予冷エッペンドルフ管に 、ＰＢＳ中の細胞の４００μｌのアリコートを加えた（総量４０μｌ中の各２μ ｇのｐｃＤＮＡ１ａｍｐ：カンナビノイド２及びｐｃＤＮＡ３：トロンボキサン Ａ２レセプタープラスミドＤＮＡと１８μｇのｐｃＤＮＡ３．１プラスミドＤＮ Ａ、または、総量４０μｌ中の各２μｇのｐｃＤＮＡ１ａｍｐ：カンナビノイド ２及びｐｃＤＮＡ３：トロンボキサンＡ２レセプタープラスミドＤ ＮＡと２０μｇのｐｃＤＮＡ３．１プラスミドＤＮＡを対照とした）。サンプル を氷上で２０分間インキュベートし、７分毎に撹拌した。細胞とＤＮＡとのミッ クスを、予冷した２ｍＭギャップ電気穿孔キュベット（ＢＴＸ）に移し、キャパ シタンス３２５マイクロファラッド、電圧４５０ボルト及び抵抗７２０オームの 設定値で電気穿孔した。電気穿孔の直後に、細胞をカエル線維芽細胞馴化培地（ キュベットあたり７．８５ｍｌ）と混合し、平底の９６ウエルマイクロタイター プレート（ＮＵＮＣ）に平板培養した。均質なトランスフェクション効率を確保 するために、平板培養に先立って多数のキュベットの電気穿孔物を合わせてプー ルした。トランスフェクションの翌日に培地を除去し、新しいカエル線維芽細胞 馴化培地を黒色素胞単層に添加し、細胞を２７℃でインキュベートした。 ９６ウエルプレートフォーマットで行ったトランスフェクションの２日後に細 胞のレセプター発現を検定した。リガンド刺激の当日に培地を吸引によって除去 し、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３（Ｓｉｇｍａ）を含む７０％のＬ−１５ で細胞を洗浄した。黒色素胞で色素分散を生じるＧｓ／Ｇｑ機能性共役または色 素凝集を生じるＧｉ機能性共役を検査するためにアッセ イを個別の２つの部分に分割した。Ｇｓ／Ｇｑ機能性共役応答を検査するために 以下の手順でアッセイを行った。１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む１００μｌの７０ ％Ｌ−１５中の細胞を暗中、室温で１時間インキュベートし、次いでメラトニン （最終濃度２ｎＭ）の存在下で暗中、室温で１時間インキュベートして、色素凝 集を誘発した。リガンドを添加する前にＢｉｏ−ＴｅｋＥ１ｘ８００マイクロプ レートリーダー（ＥＳＢＥ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して６００ｎｍの初 期吸光度を測定した。ヒトガラニン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ）を重複ウエルに添加 し、サンプルを混合し、暗中、室温で１時間インキュベートした後、６００ｎｍ の最終吸光度を測定した。Ｇｉ共役応答を検査するために、細胞単層を１００μ ｌの２％線維芽細胞馴化増殖培地、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍｌのス トレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳ含 有の１００μｌの７０％のＬ−１５の存在下で暗中、室温で１５分間インキュベ ートして細胞を分散に予設定した。６００ｎｍの初期吸光度の測定後、ヒトガラ ニンを細胞単層に添加し、サンプルを混合し、暗中、室温で１．５時間インキュ ベートし、次いで最終吸光度を測定した。色素分散を定量するために公 式：１−Ｔｆ／Ｔｉ〔式中、Ｔｉ＝６００ｎｍの初期透過度及びＴｆ＝６００ｎ ｍの最終透過度〕を用いて吸光度の読み取り値を透過値に変換した。公式：Ａｆ ／Ａｉ−１〔式中、Ａｆ＝６００ｎｍの最終吸光度及びＡｉは６００ｎｍの初期 吸光度］を用いて色素凝集を定量した。 ヒトＧＡＬＲ２が黒色素胞中で機能的に発現できたか否かを判定するために、 発現プラスミドｐｃＩｎｅｏ：ｈＧＡＬＲ２を電気穿孔によって黒色素胞に一過 性にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞をヒトガラニンで刺激した。対 照ベクターでトランスフェクトした細胞とは明らかに違って、ヒトＧＡＬＲ２で トランスフェクトした黒色素胞中ではガラニンの用量増加に伴って用量依存的な 色素分散が生じた（図１１）。ｐｃＩｎｅｏ：ｈＧＡＬＲ２でトランスフェクト した黒色素胞中のヒトガラニンの見掛けＥＣ₅₀は２０ｎＭであり、ｐｃＩｎｅｏ ：ｈＧＡＬＲ２でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞中の特異的¹²⁵ヒトガラ ニン結合（ＩＣ₅₀〜４ｎＭ）にほぼ一致した。黒色素胞中の色素分散はＧαｓ共 役とアデニリルシクラーゼの刺激とを介してまたはＧａｑ共役とカルシウムの可 動化とを介して生じることは以前から証明されていた。 ｐｃＩｎｅｏ：ｈＧＡＬＲ２−または擬似（ｍｏｃｋ）−トランスフェクトし た黒色素胞中で、０．００１〜１，０００ｎＭのヒトガラニンの存在下のインキ ュベーション後に、検出可能な色素凝集は存在しなかった。この結果は、ｈＧＡ ＬＲ２がＧαｉに介在されるシグナル伝達経路に関与しないことを示唆する。実施例１０ エクオリン生物発光アッセイ エクオリンを発現する安定なリポーター細胞系２９３−ＡＥＱ１７（Ｂｕｔｔ ｏｎ，Ｄら，１９９３“Ｃａ²⁺可動化の指標として使用されるエクオリンを発現 する哺乳類細胞系（Ａｅｑｕｏｒｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉ ａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｐｏｒｔ Ｃａ²⁺ｍｏｂｉ ｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４：６６３−６７１）中のＧ ＡＬＲ２の発現を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ ６１００向けに書 かれたカスタムソフトウエアによって制御されるＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ ＲＴ光 度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を 使用して測定した。２９３−ＡＥＱ１７細胞（トラン スフェクション前にＴ７５フラスコで８×１０⁵細胞を１８時間平板培養した） を、２２μｇのラットまたはヒトのＧＡＬＲ２プラスミドＤＮＡ：２６４μｇの リポフェクトアミンでトランスフェクトした。約４０時間の発現後、細胞中のア ポ−エクオリンに、ＥＣＢバッファ（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ 、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ〔ｐＨ＝７．４〕、５ｍＭのグルコース、１ ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン ）中で還元条件下（３００μＭの還元グルタチオン）のコエレンテラジン（１０ μＭ）を４時間充填した。細胞を回収し、ＥＣＢ培地中で一回洗浄し、５００， ０００細胞／ｍｌの濃度で再浮遊させた。次に、１００μｌの細胞浮遊液（５× １０⁴細胞に対応）をテストプレートに注入し、積分発光を０．５秒単位で３０ 秒にわたって記録した。２０ｍＬの溶菌バッファ（０．１％の最終トリトンＸ− １００濃度）を注入し、積分発光を０．５秒単位で１０秒にわたって記録した。 各ウエルの“部分応答”の値を、初期チャレンジに対する積分応答とトリトンＸ −１００溶菌応答を含む総積分発光との比を利用して計算した。 エクオリン生物発光アッセイは、ホスホリパーゼＣの活性化、 細胞内カルシウムの可動化及びプロテインキナーゼＣの活性化に導くＧｑ及びＧ １１から成るＧａタンパク質サブユニットファミリーを介して結合するＧタンパ ク質結合レセプターを同定するための信頼性の高い試験である。エクオリン生物 発光アッセイを使用すると、ＧＡＬＲ２に関する前記の黒色素胞データに基づい て、ＧＡＬＲ２の一次細胞内シグナル伝達メカニズムが２つの可能性、即ち、Ｇ αｓ共役とアデニリルシクラーゼの刺激、または、Ｇαｑ共役とカルシウムの可 動化、のいずれによって生じたかを識別できた。エクオリンを発現する２９３細 胞系（２９３−ＡＥＱ１７）中でヒトまたはラットのＧＡＬＲ２が発現すると、 ガラニン及び複数の近縁ペプチドによるチャレンジに応答してエクオリン生物発 光が用量依存的に増加した。Ｇｉ及びアデニリルシクラーゼの阻害を介してシグ ナルを伝達するヒトＧＡＬＲ１のトランスフェクションは、エクオリン生物発光 のガラニン依存的増加を全く生じなかった。ヒトまたはラットのＧＡＬＲ２の活 性化に対して観察された応答は飽和可能であり、力価の順位は¹²⁵Ｉ−ヒトガラ ニンとの結合に対する競合試験で観察された順位と同様であった。ヒトＧＡＬＲ ２に対するＥＣ₅₀をｎＭで示すと（結果はラットのＧＡＬＲ２オ ルトログと同様であった）、ヒトガラニン，３２；ラットガラニン，１２；ラッ トガラニン（２−２９），３１：ラットガラニン（３−２９）＞１０，０００； Ｍ３５，４４：Ｍ４０，８．８であった。特に注目すべきは、研究者によっては レセプターＧＡＬＲＩに対する純粋なアンタゴニストであると考えられていたガ ラニンキメラペプチドアンタゴニスト（Ｍ３５及びＭ４０）が、レセプターＧＡ ＬＲ２に対する部分的アゴニストであるらしいと認められたことである。これら のデータは、ＧＡＬＲ２に関する一次シグナル伝達メカニズムが、Ｇｉを介する アデニリルシクラーゼの阻害によって細胞内シグナルを伝達するＧＡＬＲ１と違 って、ホスホリパーゼｃ／プロテインキナーゼＣ経路を経由することを示す。更 に、ラット及びヒトのレセプターＧＡＬＲ２は高い親和性及び力価でガラニンと 結合し活性化されるが、ラットまたはヒトのＧＡＬＲ１は１／１０〜１／３０の 低い濃度でガラニンと結合し活性化される。この観察は、レセプターＧＡＬＲ２ のアゴニストであり得る他の未発見の天然産生リガンド系が存在することを示唆 する。実施例１１ ヒトＧａｌＲ２のＲＮＡ発現プロフィル ヒトＧＡＬＲ２ ｍＲＮＡ発現の組織特異性を評価するためにノーザンブロッ ト分析を使用した。図１５に示すように、最も控え目な発現（１個の“＋”で示 す）はラットのＧＡＬＲ２オルトログで観察されたように種々の脳領域及び末梢 組織で観察される。最も優勢な転写物のサイズは〜２．２ｋｂであり牌臓、胸腺 及び前立腺で〜１．５ｋｂのバンドが観察される。顕著に高い発現レベル（２個 または３個の“＋”によって示される）をもつ組織は胎盤、胸腺及び前立腺であ った。実施例１２ ヒトＧａｌＲ２遺伝子の染色体局在 文献に記載された手順（Ｈｅｎｇ，Ｈ．Ｈ．Ｑ．＆ Ｔｓｕｉ，Ｌ．−Ｃ．Ｍ ｏｄｅｓ ｏｆ ＤＡＰＩ ｂａｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕ ｓ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １ ０２：３２５−３３２）に従って、ヒトリンパ球由来の中期拡散染色体の蛍光ｉ ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をＤＡＰＩバンディングパタ ーンと共に使用してｈＧａｌＲ２をその染色体に対してマップした。ＦＩＳＨデ ータは、レセプター遺伝子がヒト染色体１７ｑ２５に局在することを示す。実施例１３ マウスＧＡＬＲ２：クローン単離：マウスＧａｌＲ２ゲノムクローンのクローニ ング ヒトＧａｌＲ２遺伝子に由来のＤＮＡフラグメントをランダムオクトマーラベ リング（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によって〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰで放射性標識し、マウ ス１２９ｓｖゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングす るためのプローブとして使用した。陽性ファージクローンをプラーク精製し、Ｄ ＮＡを調製し、制限酵素消化し、アガロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜 に移し、ライブラリーのスクリーニングに使用した同じプローブとハイブリダイ ズさせた。陽性のＮｏｔＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。実施例１４ 遺伝子の配列及び構造 マウスＧＡＬＲ２の完全ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列（配列１２）を図１２ に示す。１０６０ｂｐの単一のイントロンがＯＲＦを２つのエキソンに分割する 。イントロンを除去すると、図１３に示すような３７１個のアミノ酸から成る予 測されたＧ ＡＬＲ２ポリペプチドを与える接合的翻訳（ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｔｒａ ｎｓｌａｔｉｏｎ）が可能である。マウスのタンパク質配列はヒト及びラットの オルトログの双方に高度な一致（それぞれ８５％及び９６％）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 タン，カリーナ・ピー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 コラコウスキー，リー・エフ，ジユニア アメリカ合衆国、テキサス・78284、サ ン・アントニオ、フロイド・カール・ドラ イブ・7703

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．随伴タンパク質が実質的に存在しないマウスガラニンレセプター２（ＧＡＬ Ｒ２）またはＧＡＬＲ２に少なくとも約４０％の相同性を有しており実質的に同 じ生物活性を有しているＧＡＬＲ２様レセプター。 ２．マウスＧＡＬＲ２に少なくとも約５０％の相同性を有していることを特徴と する請求項１に記載のＧＡＬＲ２様レセプター。 ３．マウスＧＡＬＲ２に少なくとも約７５％の相同性を有していることを特徴と する請求項１に記載のＧＡＬＲ２様レセプター。 ４．マウスＧＡＬＲ２に少なくとも約８５％の相同性を有していることを特徴と する請求項１に記載のＧＡＬＲ２様レセプター。 ５．配列１１であることを特徴とする請求項１に記載のＧＡＬＲ２。 ６．マウスＧＡＬＲ２をコードしているかまたはマウスＧＡＬＲ２に少なくとも 約４０％の相同性を有しており実質的に同じ 生物活性を有しているＧＡＬＲ２様レセプターをコードしていることを特徴とす る結合核酸が実質的に存在しない核酸。 ７．ＧＡＬＲ２様レセプターがマウスＧＡＬＲ２に少なくとも約５０％の相同性 を有していることを特徴とする請求項６に記載のＧＡＬＲ２様レセプターをコー ドする核酸。 ８．ＧＡＬＲ２様レセプターがマウスＧＡＬＲ２に少なくとも約７５％の相同性 を有していることを特徴とする請求項６に記載のＧＡＬＲ２様レセプターをコー ドする核酸。 ９．ＧＡＬＲ２様レセプターがマウスＧＡＬＲ２に少なくとも約８５％の相同性 を有していることを特徴とする請求項６に記載のＧＡＬＲ２様レセプターをコー ドする核酸。 １０．ＤＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の核酸。 １１．請求項６に記載の核酸を含むベクター。 １２．請求項６に記載の核酸を含む宿主細胞。 １３．化合物とマウスＧＡＬＲ２とを接触させること、および結合が生じるか否 かを判定することを含む、化合物がマウスＧＡＬＲ２のリガンドであるか否かを 判定する方法。 １４．（ａ）マウスレセプターＧＡＬＲ２を発現する細胞を化合物の存在下で培 養すること、および （ｂ）マウスＧＡＬＲ２のレセプター活性または第二メッセンジャー活性を測定 することを含む、マウスＧＡＬＲ２のレセプター活性を変調させる化合物を同定 する方法。 １５．マウスレセプターＧＡＬＲ２を発現するように細胞を形質転換させること を特徴とする請求項１４に記載の方法。