JP2001504830A

JP2001504830A - ヘレグリン拮抗因子及びその利用方法

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Publication number: JP2001504830A
Application number: JP52395298A
Authority: JP
Inventors: ヤン，ダジュン; ワン，シャオメン; ピー．コジコウスキー，アラン; イー．リップマン，マーク
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-19
Publication date: 2001-04-10
Also published as: EP0944311A4; EP0944311A1; EP0944311B1; DE69735383T2; AU5588598A; US6143740A; WO1998021956A1; DE69735383D1; ATE318515T1

Abstract

(57)【要約】本発明は有効な量の式（Ｉ）の化合物を癌で冒された哺乳動物に投与することを含んで成る、癌細胞の増殖を阻害し、それ故癌を処置する方法を提供する。ここで、Ｒ₁及びＲ₂の変異因子は本明細書において定義する意味をもつ。本発明は更に新規の式（Ｉ）の化合物並びに新規の薬理組成物及び式（Ｉ）の化合物を調製するために有用な中間体を提供する。図は本発明の化合物及びいくつかのリファマイシン類似体の構造及び結合活性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】ヘレグリン拮抗因子及びその利用方法発明の背景 EGFR，erbB−２／neu，erbB−３及びerbB−４遺伝子を含むEGFレセプターファミリーの構成員はヒト乳癌の少なくとも60〜70％において過剰発現される。モノクローナル抗体、免疫毒素又はアンチセンスオリゴヌクレオチドによるerbBレセプターのターゲッティング阻害が報告されており、そしていくつかが初期臨床試験段階に達している。いくつかの主たる治療的制約、例えば大きな分子サイズ、劣った組織浸透性、輸送及びヒト免疫応答がこれらの手法に伴う。 erbB−２／neuのリガンドを単離する試みはgp30又はヘレグリン(HRG又はNDF) の発見に結びついている(Lupuら、Science，256：１205-1210，1992；Holmesら、Science 256：1205-1210，1992；Pelesら、Cell，69：205-216，1992）。HRG はEGF−様ドメインを含み、それはp185^erbBに結合してそのリン酸化を刺激するのに有効である。HRGのEGF−様ドメインは成長因子のEGFファミリーに特徴的な６個のシステイン残基を含むが、HRGはEGFレセプターには結合しない(Holmesら、Science 256：1205-1210，1992；Pelesら、Cell，69：205-216，1992；Falls ら、Cell，72：801-815，1993；Marchionniら、Nature，362：312-318，1993；P elesら、Bioessays，15：815-824，1993)。erbB−３及びerbB−４は共にHRGのレセプターである(Plowmanら、Nature 366：473-475,1993；Carrawayら、Cell，78 ：5-8，1994；Tzaharら、J．Biol．Chem．269：25266-25233，1994；Carrawayら、J．Biol．Che m.269：14303-14306，1994；Kitaら、FEBS Lett.，349：139-143，1994)。ヘレグリン（ノイレグリン、NDF，GGF及びARIAとも呼ばれる）はニューロン及び間葉細胞により産生される膜結合型又は分泌型タンパク質の科に属する。これらの多種多様な細胞タイプに対して複数の利用を有する。Lemke，G．Mol．Cell ．Neurosci.，vol．7，2996，247-262；及びD．Zhang，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，vol．94，1997，9562-9567。一般にerbB−４のホモダイマーが生物学的に活性であり、一方erbB−３を通じるHRGのシグナル生成はその他のerbB−３レセプター、主としてerbB−２とのヘテロ二量化に依存することが現在知られている(Carrawayら、Cell，78：5-8，19 94；Sliwkowskiら、J.Biol．Chem．269：146；Alimandiら、Oncogene 1995 10(9 )：1813-21；Chenら、J．Biol．Chem．271：7620，1996)。 HRGの発現はヒト乳癌において実証され（Normannoら、Int．J.Onco．２：903 ，1993；Normannoら、Breast Cancer Res Treat 1995，35(3)：293-7）そしてHR Gはオートクライン増殖調節(Carrawayら、Cell，78：5-8(1994))、エストロゲン非依存性増殖に至る進行及び乳癌細胞の高まった腫瘍原性(Pietrasら、Oncogene ,1995，15：10(12)：2435-46)において一役担っていることがある。免疫染色研究はerbB−３が乳癌細胞(Lemoineら、Br．J．Cancer，66：1116-1121，1992；Qu innら、Histopatho.，25：247-252，1994；Gaspariniら、Eur．J．Cancer，30A ：16-22，1994）及びその他（Simpsonら、Br．J．Cancer，71：758-762，1995； Myersら、J．Natl．Cancer Inst．86：1140-1145，1994）において過剰発現されることを示す。erbB−４の発現は乳癌細胞系の中で高まり（Plowmanら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA，90：1746-17 50，1993）、そして侵襲性腺管癌及び胸のDCISにおいて過剰発現されるが、正常乳細胞付近では過剰発現されない。かくして、癌細胞増殖の有効なインヒビターとして機能しうるHRGの特異的な拮抗因子についてのニーズがある。発明の概要本発明は癌細胞増殖を阻害するための治療方法であって、かかる治療を要する哺乳動物（即ち、ヒト）に当該癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物： (式中：Ｒ₁はOH又は-CH₂C(O)N((C₁-C₄)アルキル)₂であり；Ｒ₂は-CH=N-N(R₇)(R₈)、-CH=NO((C₁-C₁₂)アルキル)、-CH=NOCH(フェニル)₂、- CH=NO(CH₂)_n-フェニル、-CH=N-NHR₉、-CH=N-R₁₀ であり；ｎは１−６であり；Ｒ₃及びＲ₄は互いと独立してＨ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル(好ましくは−CH₃)、ハロ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであるか、又は任意的に１〜２個のＮ，Ｓもしくは非過酸化Ｏを含んで成り、且つ任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルもしくはハロにより置換された（Ｃ₅−Ｃ₇）アリールであり；Ｒ₅及びＲ₆は互いと独立してＨ、OH、−NH₂、−C(O)OH又は−C(O)NH₂であり；Ｒ₇はＨもしくは（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；そしてＲ₈は二もしくは三環式環であり、ここで当該環は7〜10個の炭素を含んで成り（好ましくはアダマンタン）、任意的にＳ，Ｎもしくは非過酸化Ｏから選ばれる１もしくは複数個（例えば１〜４個）の異項原子を含んで成り、当該環は任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ハロもしくはハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルで置換されており；又はＲ₇及びＲ₈はそれらが付加されている窒素と一緒になって10〜20個（好ましくは17個）の炭素を含んで成る環を形成しており、任意的に当該環は、Ｓ，Ｎもしくは非過酸化Ｏから選ばれる１もしくは複数個（例えば１〜４個）の異項原子を含んで成り、当該環は任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ハロもしくはハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルにより置換されている；Ｒ₉は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、天然アミノ酸のペプチジル残基、又はジ−、トリ−もしくはテトラ−ペプチドであり；そしてＲ₁₀はピペラジン−１−イル環であり、任意的にＲ₃及びＲ₄について規定したものから選ばれる１又は２個の置換基により炭素上で置換されており、そして任意的にその４’位において基Ｒ₁₁で置換され、ここでＲ₁₁は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、フェニル、ベンジル、天然アミノ酸のペプチジル残基、又はジ−、トリ−もしくはテトラ−ペプチドである）；又はその薬理学的に許容される塩を投与することを含んで成る方法を提供する。好適な態様において、癌細胞は固形腫瘍細胞、例えば乳癌細胞である。本発明は更に薬理学的に許容される担体と組合さった有効な量の式（Ｉ）の化合物を含んで成る薬理組成物も提供する。本発明は更に式（Ｉ）の新規の化合物、並びに式（Ｉ）の化合物の調製のために有用な本明細書において開示する中間体及び方法を提供する。本発明は更に医学的療法において利用するための（好ましくは癌細胞増殖を阻害するうえで利用するための）式（Ｉ）の化合物を提供する。式（Ｉ）の代表的な化合物はヘレグリン拮抗因子としての活性を有することが示されている。かくして、式（Ｉ）の化合物は、ヘレグリン又はそのレセプターによる細胞シグナル生成が関与し、且つ当該細胞シグナル生成の拮抗を所望する病気又は症状を処置するために有用でありえる。従って、本発明はヘレグリン又はそのレセプターの作用を、当該レセプターを有効量の式（Ｉ）の化合物と（in vivo又はin vitro）で接触させることより中和するための方法も提供する。本発明は更にヘレグリン又はそのレセプターによるシグナル生成が関与する病気（即ち、癌）又は症状を処置するための方法であって、当該病気又は症状を患う哺乳動物（ヒト）に拮抗的に有効な量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含んで成る方法も提供する。本発明は更に、ヘレグリン又はそのレセプターの作用を中和するうえで利用するための化合物、並びにヘレグリン又はそのレセプターによる細胞シグナル生成が関与する病気（即ち、癌）又は症状を処置するのに利用するための式（Ｉ）の化合物を提供する。本発明は更にヘレグリン又はそのレセプターによる細胞シグナル生成が関与する病気（即ち、癌）又は症状を処置するために有用な医薬品を調製するための式（Ｉ）の化合物の利用を提供する。図面の簡単な説明図１は本発明の化合物による32Ｄ細胞増殖の阻害を示す。図２は本発明の化合物による32Ｄ細胞増殖の阻害を示す。図３はHRGαによる本発明の化合物の作用の競合阻止を示す。図４は本発明の化合物によるヒト乳癌細胞増殖の阻害を示す。図５は本発明の化合物による乳癌MDA−231細胞におけるソフトアガーコロニー形成の阻害を示す。図６は本発明の化合物及びいくつかのその他のリファマイシン類似体の構造及び競合活性を示す。図７は本発明の化合物及びいくつかのその他のリファマイシン類似体の構造を示す。図８は本発明の化合物及びいくつかのその他のリファマイシン類似体の構造を示す。発明の詳細な説明レセプター結合競合、HRG誘導型リン酸化及びHRG依存性細胞増殖アッセイにおけるHRGの特異的な拮抗因子である一定のリファマイシンの類似体が発見されている。分子モデル研究は本発明のリファマイシン類似体を鋳型としてのその大きな環骨格を利用して重ね合わせることができることを示す。構造的相違はＣ₉位にあり、そこに異なる置換基が付加されている。この部位はその拮抗活性において重要な役割を果たしていることが明らかであり、なぜならこの部位に異なる置換基を有する化合物は事実上不活性からかなり強力に至るまでの活性を示すからである（結合、リン酸化及びHRG依存性増殖阻害アッセイにおいて10〜100倍の差）。リファマイシン類似体とHRG ３Ｄ構造に由来する薬物モデルとの比較はこの部位にある置換基がHRGにおける残基177〜18 0（Ser-His-Leu-Val）により占められる領域の中にあることを示した。残基177 〜180はそのレセプターに対するHRG結合において重要な役割を果たすことが示されている（Barbacciら、J．Bio．Chem．1995；270(16)9589-9）。残基177〜181 の欠失はリガンドを完全に不活性なものとする。残基177及び178のアセチル基による置換はHRGのそのレセプターに対する結合親和力を50倍以上にする（Barbacc iら、J．Bio．Chem．1995；270（16）9589-9）。リファマイシン類似体間の構造活性関係はこの領域の重要性も示唆する（図６及び７）。例えば、かさ高い疎水性置換基をこの部位に有する化合物、例えば化合物Ａ３及びＡ４はかなり良好な活性を示し、一方この部位に親水性基を有する化合物Ａ５〜Ａ７は事実上不活性である。分子モデル研究はこの部位にある疎水基が疎水性残基Leu 179及びおそらくはVal 180を擬態することを示唆する。化合物Ａ１及びＡ２のモデル研究は１，５−ジメチルピペラジンがHRGにおける疎水性残基Leu 179を擬態し、そしてヒドロキシルベンジル基がHis 178及びおそらくはSer 177を擬態することを示した。基、置換基及び範囲についての下記の特異的、且つ好適な意味は例示にすぎない；それらは基及び置換についての規定の範囲及び規定外の範囲を排除するものではない。詳しくは、Ｒ₂は以下であってよい：より詳しくは、Ｒ₃及びＲ₄はそれぞれ−CH₃であってよく；Ｒ₅はOHであってよく；そしてＲ₆はＨであってよい。化合物の特定の群はＲ₅及びＲ₆が独立してＨ、−NH₂、−C(O)OH又は−C(O)NH₂ である式（Ｉ）の化合物である。その他の化合物の特定の群はＲ₂が−CH＝N−N( R₇)(R₈)又は−CH＝NO(CH₂)_n−フェニルである式（Ｉ）の化合物である。その他の化合物の特定の群はＲ₂が−CH−N−NHR₉である式（Ｉ）の化合物である。その他の化合物の特定の群はＲ₂が−CH＝N−R₁₀である式（Ｉ）の化合物である。その他の化合物の特定の群はＲ₉が-Val-Leu-His-Ser，-Leu-His-Ser，-Val-Leu-Hi s，-Val-Leu，-Leu-His，-His-Ser，-Asn-Ser-Asp-Ser，-Asn-Ser-Asp，-Asn-Se r又は-Ser-Asp-Serから成る群から選ばれるペプチド残基である式（Ｉ）の化合物である。その他の化合物の特定の群はＲ₁₁が-Val-Leu-His-Ser，-Leu-His-Ser ，-Val-Leu-His，-Val-Leu，-Leu-His，-His-Ser，-As n-Ser-Asp-Ser，-Asn-Ser-Asp，-Asn-Ser又は-Ser-Asp-Serから成る群から選ばれるペプチド残基である式（Ｉ）の化合物である。好適な化合物の群はＲ₁がOHである式（Ｉ）の化合物である。その他の好適な化合物の群はＲ₂がである式（Ｉ）の化合物である。モデル研究に基づき、疎水性残基Leu 179は小型の疎水基、例えばメチル、トリフルオロメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニル、フッ素、塩素及び臭素をかかるＲ₂のピペラジン環上に付加することにより擬態されうる。更に、小型の親水基、例えばヒドロキシ、アミノ、カルボキシ及びアミノカルボニルを任意的にかかるＲ₂のフェニル環上に置換してよい。複数の置換基を化合物中のピペラジン及びフェニル環に付加してよい。かくして、修飾は前記ピペラジン環の１，２，４，５位及び前記フェニル環の１ ’，２’，３’，４’，５’位に施してよい：従来の研究はこの部位がHRG又はEGFのそのレセプターに対する結合の特異性もコントロールすることを示す。従って、テトラ−、トリ−、ジ−又はモノ−ペプチドセグメントをリファマイシンの中核にこの部位において、HRG(残基177〜180 ，SHLV)又はEGF(残基１〜４，NSDS)のいづれかに由来する配列を伴って付加して、HRGレセプター又はEGFRに対して特異的な拮抗活性を有する化合物を供することができる。式（Ｉ）の化合物は３−ホルミルリファマイシンＯ−ｎ−オクチルオキシム（スキーム１の化合物Ｉ）を用いて合成でき、それは対応のアルデヒドを供するよう金属イオン触媒の下で加水分解する。例えば、モリブデン又は鉄カルボニルを必要たる変換を行うのに利用してよい。アルデヒド（スキーム１の化合物Ｉ）と選定のアルキル−及びアリール−ヒドラジンとの反応は対応のヒドラゾンを供する（スキーム１の化合物III）。これらの反応は溶媒としての塩化メチレンの中で触媒としてｐ−トルエンスルホン酸を利用する温和な条件下で実施してよい。目的化合物のための詳細な合成スキームをスキーム１及び２に示す。スキーム１（Nittaら、Bull．Chem．Soc．Jpn，59，2365，1986；Nittaら、Bull．Chem． Soc．Jpn，57，3357，1984参照）。スキーム２ (ここでAllocは−C(O)OCH₂CH=CH₂)である。Goslら、Org．Syn．43，１，1963 ；及びKunzら、Angew．Chem.，Int．Ed．Engl．23,436，1984参照。式（Ｉ）の化合物の薬理学的に許容される塩も本発明の態様である。酸の薬理学的に許容される塩は有機又は無機塩基、例えばNaOH、Na₂(CO₃）、NaHCO₃、KOH 等を利用して形成できうる。アミン塩は有機酸又は無機酸、例えばHCl、H₂SO₄、 TsOH、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸等から調製されうる。ペプチジル誘導体、例えばＮ−保護化（即ち、NAc，NBz等）誘導体も本発明の範囲に属する。式（Ｉ）の化合物及び／又はその塩は純粋な化学品として投与してよいが、当該活性成分を薬理組成物として付与するのが好ましい。かくして、本発明はｌ又は複数種の式（Ｉ）の化合物及び／又はその薬理学的に許容される塩を、そのための１又は複数種の薬理学的に許容される担体、そして任意的にその他の治療及び／又は予防用成分と一緒に含んで成る薬理組成物の利用を提供する。これらの担体は当該組成物のその他の成分との適合性の観点において「許容される」ものでなくてはならず、そしてその受容者に有害であってはならない。薬理組成物は経口又は非経腸（筋肉内、皮下及び静脈内）投与のために適当なものを含む。これらの組成物は、適宜、独立の単位投与形態において好適に供与してよく、そして薬品業界に周知の任意の方法により調製できうる。かかる方法は当該活性化合物を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、細分割されて固体担体又はそれらの組合せと一緒にし、次いで適宜その製品を所望のデリバリーシステムへと成形する工程を含む。経口投与に適当な独立の単位投与形態、例えば各々所定量の活性成分を含むハード又はソフトゼラチンカプセル、カッシェ又は錠剤、粉末又は顆粒、溶液、懸濁物又はエマルションとして供与してよい。当該活性成分はボーラス、練り薬又はペーストとして供与してよい。経口投与用の錠剤及びカプセルは好適な賦形剤、例えば結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤又は湿潤剤を含んでよい。この錠剤には当業界周知の方法に従って経腸用コーティングを施してよい。経口液体調製品は例えば水性もしくは油性懸濁物、溶液、エマルション、シロップもしくはエリクシールの形態であってよく、又は使用前の水もしくはその他の適当なビヒクルによる構築のための乾燥製品として供与してよい。かかる液体調製品は慣用の添加剤、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（これは食用油であってよい）、又は保存剤を含みうる。当該化合物は非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射又は連続点滴による）のために処方してもよく、そしてアンプル、予備充填シリンジ、小ボーラス点滴容器又は多重投与容器の中で添加保存剤を伴って単位投与形態で供与してよい。当該組成物は油性又は水性ビヒクル中の懸濁物、溶液又はエマルションとしての形態をとっていてよく、そして製剤化剤、例えば懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤を含んでよい。好ましくは、当該液体担体は非アルカリ性溶液である。他方、当該活性成分は無菌固体の無菌単位により、又は溶液からの凍結乾燥により得られる、使用前の適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水による構築のための粉末形態であってよい。表皮への局所投与のため、当該化合物はオイントメント、クリームもしくはローションとして、又は経皮パッチの活性成分として処方してよい。適当な経皮デリバリーシステムは例えばFisherら（米国特許第4,788,603号）又はBawasら（米国特許第4,931,279，4,668,504及び4,713,224号）に開示されている。オイントメント及びクリームは例えば適当な増粘剤及び／又はゲル化剤の添加を伴って水性又は油性ベースで処方してよい。ローションは水性又は油性ベースで処方してよく、そして一般に１又は複数種の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤又は着色剤も含むであろう。当該活性成分は例えば米国特許第4,140,122，4,383 ,529又は4,051,842号を開示のイオン導入法を介して導入することもできる。口内局所投与に適する組成物には、フレーバーベース、通常はスクロース及びアカシアもしくはトラガンス中に活性成分を含んで成るロゼンジー；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアの如き不活性ベース中に活性成分を含んで成るパスチル；適当な液体担体中に活性成分を含んで成る粘膜収着剤及びマウスウォッシュが挙げられる。所望するなら、上記の組成物は、例えば所定の親水性ポリマーマトリックス、例えば天然ゲル、合成ポリマーゲル又はそれらの混合物との組合せにより採用されうる活性成分の徐放を供するように仕上げることができる。本発明に係る薬理組成物はその他のアジュバント、例えば風味剤、着色剤、抗菌剤又は保存剤も含んでよい。処置に必要とされる当該化合物、又はその活性塩もしくは誘導体の量は選定の特定の塩によって変わるだけでなく、投与のハート、処置する症状の性質、並びに患者の年令及び状態によっても変わり、そして究極的にはかかりつけの医師又は看護人の判断によるであろう。しかしながら、一般に、適当な用量は受容者の体重１kg当り、１日につき約10 〜約75mg、例えば３〜約50mg、好ましくは６〜90mg／kg／日の範囲、そして最も好ましくは15〜60mg／kg／日の範囲であろう。当該化合物は単位投与形態当り５〜1000mg、好都合には10〜750mg、最も好都合には50〜500mgの活性成分を含む単位投与形態で好適に投与する。理想的には、当該活性成分は約0.5〜約75μＭ、好ましくは約１〜50μＭ、最も好ましくは約２〜約30μＭの当該活性化合物のピーク血漿濃度に達するように投与すべきである。これは例えば、任意的に食塩水中の当該活性成分の0.05〜５％の溶液の静脈内注射により、又は約１〜100mgの当該活性成分を含むボーラスとして経口投与により達せられうる。所望の血液レベルは約0.01〜5.0mg／kg／h rを供する連続点滴により、又は約0.4〜15mg／kgの活性成分を含む断続点滴により維持できうる。所望の用量は好都合には単一投与で、又は適当な間隔、例えば１日当り２，３，４又はそれより多くのサブ投与で投与する分割投与で供与してよい。サブ投与自体は更に、例えば数回の独立の厳密でなく間隔を置いた投与、例えば吸入器からの数回の吸入、又は目への数回の点眼により、分けてよい。以下の実施例は例示であって本発明を限定するつもりはない。実施例実施例Ｉヒト乳癌細胞に対するin vitro生物学的活性及び特異性乳癌細胞増殖を阻害する本発明の化合物の能力は、HRGを分泌する高度に悪性のヒトMDA−23 1乳癌細胞を利用して測定できる。事前の研究はこのような細胞の増殖が中和抗体によりブロッキングされうることを示している（Lupuら、Breast Concer Res ．& Treat．1996，38：57-66）。HRG又はHRG−PE毒素に対して応答しないSKOV− ３細胞をネガティブコントロールとして利用できうる。HRGは当業界において公知の技術を利用してMCF−７細胞の中にトランスフェクションできる。例えば、T angら、Cancer Rec.，1996年７月を参照のこと。細胞増殖アッセイ細胞を死滅させる本発明の化合物の能力は当業界において公知の可溶性テトラゾリウム／ホルマザン(XTT)アッセイを利用して直接測定できる。例えば、Alleyら、Concer Res.，48：589-601，1989を参照のこと。本発明の代表化合物のデーターを図４に示す。HRG 依存性細胞増殖の阻害 −ほとんどのヒト癌細胞は複数のerbBレセプターを発現し、そして異なるヘテロ二量化は結合親和力及び／又は内在化を改変しうるため、レセプターの発現と小分子の拮抗活性との正確な関係を特定するのは難しい。この問題を解決するため、32Ｄ細胞（ネズミ、造血系）モデルシステム（それにおいては、32Ｄ細胞はerbB−４レセプターでトランスフェクションされている）を利用することができる。野生型32Ｄ細胞は任意のerbBレセプターを発現しなく、それ故生存及び増殖に関してIL−３に厳格に依存する（Ruggieroら、FEBS ，291，203，1991）。erbB−４でトランスフェクションされた32Ｄ細胞はHRG又はIL−３の存在下で増殖するであろう。この32Ｄ細胞モデルシステムにより、本発明の化合物はHRG依存性及びHRG非依存性増殖の双方においてその拮抗活性及び特異性について試験できうる。活性化合物、例えばＡ１は32Ｄ／erbB−４細胞におけるHRG− 依存性細胞増殖のみを阻害し、32Ｄ又は32Ｄ／erbB−４細胞におけるIL−３刺激増殖は阻害しない。本発明の代表化合胸のデーターを図１及び２に示す。図３に示す通り、過剰のヘレグリンの添加は本発明の化合物の抗増殖作用を抑制する。これは本発明の化合物がヘレグリン拮抗因子であることを示唆する。実施例II−ソフトアガロース内でのコロニー形成ソフトアガーコロニー形成アッセイはリガンドの形質転換能を測定し、そして in vivo腫瘍原性とよく相関する。このアッセイはYangら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA．89，2237-2241，1992により発表のものと似かよった手順を利用して実施できる。本発明の代表化合物のデーターを図５に示す。実施例III−レセプター二量化アッセイ及びキナーゼ活性アッセイ（チロシンリン酸化アッセイ）二量化の阻害又はレセプターチロシンキナーゼ活性の阻害を包含する基礎メカニズムはChenら、J．Biol．Chem．271：7620，1996に記載の通りにして乳癌細胞において調べることができる。レセプター結合の阻害 − 化合物がHRGとそのレセプターとの間での結合を阻害できるかを調べるため、、結合アッセイをHRG−β１（HED−β1）の¹²⁵Ｉラベル化EGFドメインを利用して実施した。T47D又はMDA−453細胞におけるヨウ素− ラベル化HED−β１の結合親和力を予備決定した。ラベルしてない化合物をラジオラベルしたリガンドと４℃で２時間一緒にインキュベーションし、そして細胞を氷冷結合バッファーで３回洗った。ラベル化細胞を溶解させ、そしてガンマーカウンターで計測した。HRG−レセプターからラベル化HED−β１を50％以上追い出す化合物を用量依存式に再検査した。HRG 誘導化チロシンリン酸化の阻害 − T47D細胞において0.01nM〜１μＭの範囲にわたり用量依存式にリン酸化を誘導する組換HRG−α１及びHRG−β１を調製した。HRG誘導化リン酸化を阻止する本発明の化合物の能力を10nMのHRG(最大誘導)との同時インキュベーションにより試験し、そして活性化合物Ａ２８及び化合物Ａ１〜Ａ８による結果を以下において「Ａ」で示す（その他のリファマイシン類似体で実施した阻害研究の結果は図６及び７に示す）。本発明の化合物の用量依存式阻害（Ａ１及びＡ３）はMDA−453細胞において決定し、そして特異性はEGFをEGFRレセプター過剰発現細胞系(MDA−468)の中でインキュベーションすることにより決定した。以下の「Ｂ」及び「Ｃ」に示す通り、これらの活性化合物はEGF−媒介シグナル生成経路において何ら又はほとんど作用を及ぼさず、これらの活性化合物が、ハービマイシンとは異なり、おそらくは一般のキナーゼ阻害剤のように機能しないことを示唆する（Satohら、J．Bio ．Chem.，1992，267(4)：2537-41；Current Med．Chem.，167-194，1996）。Ａ．T47D細胞、100μＭのcpds；Ｂ．MDA−453細胞とHRG；Ｃ．MDA−468細胞とEGF，HRG=10mM； EGF−50ng／ml 実施例IV−in vivo抗腫瘍活性及び毒性治療的研究のために動物に与えることのできる化合物の量を決定するための動物毒性研究を実施することができる。４〜５匹の雌のヌードマウスのグループに、100μｌの様々な量の化合物を尾静脈を介してi.v.注射することができる。LD₅ ₀ は動物の50％の死を及ぼす用量を認定することにより得ることができる。一部の動物をＨ／Ｅ染色により組織毒性について調べることができる。 in vivo抗腫瘍活性研究はMDA−231ヌードマウス外植片又はHRGトランスフェクション化MCF−７細胞を利用して実施できる。化合物についての適切な投与スケジュール及び処置ルートをLD₅₀の用量で出発して決定できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ワン，シャオメンアメリカ合衆国，バージニア 22102，マクリーン，トレマインプレイス 7640, ユニット 309 (72)発明者コジコウスキー，アランピー. アメリカ合衆国，ニュージャージー 08540，プリンストン，キャメロンコート 45 (72)発明者リップマン，マークイー. アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベテスダ，ベンドームドライブ 9220 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．癌細胞増殖を阻害するための治療方法であって、かかる治療を要する哺乳動物（即ち、ヒト）に当該癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物：（式中：Ｒ₁はOH又は-CH₂C(O)N((C₁-C₄)アルキル)₂であり；Ｒ₂は-CH=N-N(R₇)(R₈)、-CH=NO((C₁-C₁₂)アルキル)、-CH=NOCH(フェニル)₂、- CH=NO(CH₂)_n-フェニル、-CH=N-NHR₉、-CH=N-R₁₀ であり；ｎは１−６であり；Ｒ₃及びＲ₄は互いと独立してＨ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル(好ましくは−CH₃)、ハロ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであるか、又は任意的に１〜２個のＮ，Ｓもしくは非過酸化Ｏを含んで成り、且つ任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルもしくはハロにより置換された（Ｃ₅−Ｃ₇）アリールであり；Ｒ₅及びＲ₆は互いと独立してＨ、OH、−NH₂、−C(O)OH又は−C(O)NH₂であり；Ｒ₇はＨもしくは（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；そしてＲ₈は二もしくは三環式環であり、ここで当該環は７〜10個の炭素を含んで成り（好ましくはアダマンタン）、任意的にＳ，Ｎもしくは非過酸化Ｏから選ばれる１もしくは複数個（例えば１〜４個）の異項原子を含んで成り、当該環は任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ハロもしくはハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルで置換されており；又はＲ₇及びＲ₈はそれらが付加されている窒素と一緒になって10〜20個（好ましくは17個）の炭素を含んで成る環を形成しており、任意的に当該環は、Ｓ，Ｎもしくは非過酸化Ｏから選ばれる１もしくは複数個（例えば１〜４個）の異項原子を含んで成り、当該環は任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ハロもしくはハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルにより置換されている；Ｒ₉は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、天然アミノ酸のペプチジル残基、又はジ−、トリ−もしくはテトラ−ペプチドであり；そしてＲ₁₀はピペラジン−１−イル環であり、任意的にＲ₃及びＲ₄について規定したものから選ばれる１又は２個の置換基により炭素上で置換されており、そして任意的にその４’位において基Ｒ₁₁で置換され、ここでＲ₁₁は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、フェニル、ベンジル、天然アミノ酸のペプチジル残基、又はジ−、トリ−もしくはテトラ−ぺプチドである）；又はその薬理学的に許容される塩を投与することを含んで成る方法。２．前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項１記載の方法。３．ヘレグリン又はそのレセプターの作用を中和するための方法であって、当該レセプターを有効な量の請求項１記載の化合物を接触させることによる方法。４．ヘレグリン又はそのレセプターによる細胞シグナル生成が関与する病気又は症状を処置するための方法であって、かかる病気又は症状に冒された哺乳動物に拮抗的に有効な量の請求項１記載の化合物を投与することを含んで成る方法。５．式（Ｉ）の化合物：（式中：Ｒ₁はOH又は-CH₂C(O)N((C₁-C₄)アルキル)₂であり；Ｒ₂は-CH=N-N(R₇)(R₈)、-CH=NO((C₁-C₁₂)アルキル)、-CH=NOCH(フェニル)₂、- CH=NO(CH₂)_n-フェニル、-CH=N-NHR₉、-CH=N-R₁₀ であり；ｎは１−６であり；Ｒ₃及びＲ₄は互いと独立してＨ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル(好ましくは−CH₃）、ハロ、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであるか、又は任意的に１〜２個のＮ，Ｓもしくは非過酸化Ｏを含んで成り、且つ任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルもしくはハロにより置換された（Ｃ₅−Ｃ₇）アリールであり；Ｒ₅及びＲ₆は互いと独立してＨ、OH、−NH₂、−C(O)OH又は−C(O)NH₂であり；Ｒ₇はＨもしくは（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルであり；そしてＲ₈は二もしくは三環式環であり、ここで当該環は７〜10個の炭素を含んで成り（好ましくはアダマンタン）、任意的にＳ，Ｎもしくは非過酸化Ｏから選ばれる１もしくは複数個（例えば１〜４個）の異項原子を含んで成り、当該環は任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ハロもしくはハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルで置換されており；又はＲ₇及びＲ₈はそれらが付加されている窒素と一緒になって10〜20個（好ましくは17個）の炭素を含んで成る環を形成しており、任意的に当該環は、Ｓ，Ｎもしくは非過酸化Ｏから選ばれる１もしくは複数個（例えば１〜４個）の異項原子を含んで成り、当該環は任意的に（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ハロもしくはハロ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキルにより置換されている；Ｒ₉は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、天然アミノ酸のペプチジル残基、又はジ−、トリ−もしくはテトラ−ペプチドであり；そしてＲ₁₀はピペラジン−１−イル環であり、任意的にＲ₃及びＲ₄について規定したものから選ばれる１又は２個の置換基により炭素上で置換されており、そして任意的にその４’位において基Ｒ₁₁で置換され、ここでＲ₁₁は（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、フェニル、ベンジル、天然アミノ酸のペプチジル残基、又はジ−、トリ−もしくはテトラ−ペプチドである）；又はその薬理学的に許容される塩。６．薬理学的に許容される担体と組合さった、癌細胞増殖阻害有効量の請求項５記載の化合物を含んで成る薬理組成物。７．前記Ｒ₂が−CH=N−N(R₇)(R₈）又は−CH=NO(CH₂)_n−フェニルである、請求項５記載の化合物。８．前記Ｒ₂が−CH−N−NHR₉である、請求項５記載の化合物。９．前記Ｒ₁がOHである、請求項５記載の化合物。 10．前記Ｒ₂がである、請求項５記載の化合物。