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JP2001502883A - Mini adenovirus vector - Google Patents

Mini adenovirus vector

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JP2001502883A
JP2001502883A JP09543095A JP54309597A JP2001502883A JP 2001502883 A JP2001502883 A JP 2001502883A JP 09543095 A JP09543095 A JP 09543095A JP 54309597 A JP54309597 A JP 54309597A JP 2001502883 A JP2001502883 A JP 2001502883A
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dna molecule
gene
protein
vector
sequence
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Japanese (ja)
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ザン、ウェイ―ウェイ
アレマニー、ラモン
ダイ、イファン
ジョゼフス、スティーヴン
バラーグ、クリスティナ
アヤレス、デイヴィッド
シュナイダーマン、リチャード
Original Assignee
バクスター インターナショナル インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明はアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、並びに遺伝子移入、遺伝子治療、及び遺伝子ワクチン接種を含む遺伝学的医療の分野におけるそれらの用途に関する。特には、本発明は、Ａｄゲノムの最小ｃｉｓ−要素を坦持し（ミニＡｄベクター）、かつ約３６ｋｂまでの導入遺伝子及び／又は異種ＤＮＡを送達することが可能なＡｄベクターに関する。このミニＡｄベクターの生成及び増殖には、Ａｄヘルパー細胞系におけるパッケージ化弱力化複製欠損ヘルパーＡｄ（ヘルパー）のトランス補完性が必要とされる。本発明は、さらに、血友病の遺伝子治療において用いるためのミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクター及びこのＡｄベクターのイン・ビボ評価のための動物試験系を生成するための方法論を包含する。特には、本発明では、Ａｄゲノムの最小シス−要素（いわゆるミニＡｄ）のみを有し、かつヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを他の支持ＤＮＡ要素と共に３６ｋｄまで含む第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）Ａｄベクターが説明される。このＦＶＩＩＩミニＡｄは、パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ及びヘルパー細胞系の補助により生成し、優先的に増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄのイン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニックマウスモデルを生成するための設計及び方法も報告する。 SUMMARY The present invention relates to adenovirus (Ad) vectors and their use in the field of genetic medicine, including gene transfer, gene therapy, and gene vaccination. In particular, the invention relates to Ad vectors that carry the smallest cis-element of the Ad genome (mini-Ad vectors) and are capable of delivering up to about 36 kb of transgene and / or heterologous DNA. The production and propagation of this mini-Ad vector requires transcomplementation of a packaged, weakened, replication-defective helper Ad (helper) in an Ad helper cell line. The invention further encompasses a mini-adenovirus (mini-Ad) vector for use in gene therapy for hemophilia and methodology for generating an animal test system for in vivo evaluation of the Ad vector. In particular, the present invention describes a Factor VIII (FVIII) Ad vector that has only the minimal cis-element of the Ad genome (the so-called mini-Ad) and contains up to 36 kd of human FVIII cDNA along with other supporting DNA elements. . This FVIII mini-Ad can be generated with the aid of a packaged weakened helper Ad and a helper cell line and preferentially amplified. The present invention also reports designs and methods for generating a transgenic mouse model that can be used for in vivo mini-Ad testing.

Description

【発明の詳細な説明】 ミニアデノウイルスベクター 本願は、１９９６年５月３１日出願の米国出願番号０８／６５８，９６１号及 び１９９７年１月３１日出願の米国出願番号０８／７９１，２１８号の優先権を 主張する。 発明の技術分野 本発明はアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、並びに遺伝子移入、遺伝子治療、 及び遺伝子ワクチン接種を含む遺伝学的医療の分野におけるそれらの用途に関す る。特に、本発明は、Ａｄゲノムの最小ｃｉｓ−要素を坦持し（ミニＡｄベクタ ー）、且つ約３６ｋｂまでの導入遺伝子及び／又は異種ＤＮＡを送達することが 可能なＡｄベクターに関する。このミニＡｄベクターの生成及び増殖には、Ａｄ ヘルパー細胞系におけるパッケージ化弱力化複製欠損ヘルパーＡｄ（ヘルパー） のトランス補完性が必要とされる。 本発明は、さらに、血友病の遺伝子治療において用いるためのミニアデノウイ ルス（ミニＡｄ）ベクター及びこのＡｄベクターのイン・ビボ評価のための動物 試験系を生成するための方法論を包含する。特には、本発明では、Ａｄゲノムの 最小シス−要素（いわゆるミニＡｄ） のみを有し、且つヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを他の支持ＤＮＡ要素と共に３６ｋ ｄまで含む第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）Ａｄベクターが説明される。このＦＶ ＩＩＩミニＡｄは、パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ及びヘルパー細胞系の補助 により生成し、優先的に増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄの イン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニックマウスモデルを生成す るための構造及び方法も報告する。 従来技術の説明 遺伝学的医療の開発における重要な問題は好ましい遺伝子送達系の開発である 。この好ましい遺伝子送達系は、単一の遺伝子治療ベクターにおいて現在利用不 可能である幾つかの特性を有していなければならない。この好ましいベクターは 、大きな、もしくは複数の、調節要素を含む導入遺伝子を受け入れるのに適する 収容力を保持し、且つ製造のための簡潔な操作及びスケールアップに順応しなけ ればならない。また、このようなベクターは安全で低毒性を示すことはもちろん 、標的細胞又は組織への非常に効率的且つ選択的な導入遺伝子の送達を示さなけ ればならない。最後に、このようなベクターは、標的細胞における導入遺伝子の 適切な保持、発現、及び調節を支持することが可能でなければならない。本発明 は、新規構造の高収容力且つ高効率Ａｄベクター系を包含し、好ましい遺伝子送 達系に関する問題及び当業者の関心を 解決することに焦点を当てる。 血友病Ａは、疾患に冒された個体において凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の 発現又は機能における欠損の結果生じる。血友病の治療は、現在、血漿濃縮物か ら得られ、又は組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現するように操作された培養細 胞から精製して得られる正常ＦＶＩＩＩタンパク質の注入を含む（１）。治療上 の利点は血漿濃度が正常血漿濃度（ミリリットル当たり２００−３００ｎｇもし くは１単位；参考文献２）の５−１０％にまで回復することにより達成される。 正常血漿濃度の３０％を上回る濃度の維持が正常な生活様式の近いものと見込ま れることが研究により示されている（３）。血友病の治療を指向する遺伝子治療 アプローチは刺激的な潜在力を有する；しかしながら、幾つかの主な挑戦は、こ れらの治療様式を現実のものとするために克服すべきもののままである（４）。 本発明は、これらの困難を解決することが可能な幾つかの手段を提供する。 ＦＶＩＩＩは通常肝臓において生成され、新生ポリペプチドのアミノ末端から 誘導される、９２ｋＤａ乃至２１０ｋＤａの見かけの分子量範囲を有する重鎖ポ リペプチド及び８０ｋＤａのＣ−末端軽鎖を含んでなる（５３）。これは、ファ ンデルワールス力（ｖＷＦ）での複合体の形成によりタンパク分解から保護され ている。その活性化形態は、血液凝固カスケードにおいて、活性化第ＩＸ因子（ ＦＩＸａ）、負に荷電したリン脂質及びカルシウ ムイオンと共に補因子として作用し、第Ｘ因子をその活性化形態Ｘａに変換する 。ヒトｃＤＮＡは９ｋｂの長さであり、数種類のドメインをＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ ３、Ｃ１及びＣ２の順で含んでなる２３５１アミノ酸のペプチドをコードする（ ５−７）。Ａ及びＣドメインは機能的な活性に重要であり、これに対して約９８ ０アミノ酸からなるＢドメインの大部分は活性には不必要である（８）。完全長 ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡはレトロウイルス及びアデノウイルスベクターのサイズ制 限を超えるため、現在までに当業者によって用いられる遺伝子治療プロトコルの 大部分は、残りのｃＤＮＡが約４．５ｋｂとなるようにＢドメインを欠失させた ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを用いる。 レトロウイルスベクターは遺伝子治療における使用について最初に研究すべき もののうちの１つであった（６４、６５）。外来性ＤＮＡの挿入に対するサイズ 容量は約７．５ｋｂに制限される。一般には、ウイルスｍＲＮＡの不安定性の問 題及びＦＶＩＩＩ遺伝子産生物（６１，６３，７４）をコードするｍＲＮＡの発 現の困難性のため、レトロウイルスベクターから高水準のＦＶＩＩＩの発現を得 ることは困難である。加えて、大部分の肝細胞のような非分裂細胞の感染にも問 題がある。この制限を克服する方法の１つは、レトロウイルス感染に先立って２ ／３部分的肝切除を行い、活発に再生する肝細胞の感染を可能にすることである （７３）。別のアプローチにおいては、筋肉特異的エンハンサーを用いて長期間 の発 現が達成されているが、低水準の遺伝子産生物ＦＩＸのみが達成されただけであ る（７８）。治療水準のＦＶＩＩＩはマウスにおいて達成されている（７７）。 近年、ネズミアルブミンプロモーターの制御の下にあるＢドメイン欠失ＦＶＩ ＩＩ ｃＤＮＡを含むＥ１置換アデノウイルスベクターが用いられ、マウス及び イヌにおいて治療水準のヒトＦＶＩＩＩの発現が達成されている（１３−１５） 。ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを含むこのアデノウイルスベクターを高用量（４Ｘ１０9 ｐｆｕ）投与した場合、免疫適格動物における遺伝子の発現は持続性の点で制 限された；遺伝子発現の漸進的な低下は肝臓組織におけるアデノウイルスベクタ ーＤＮＡの検出の喪失と相関していた（１３）。発現の低下はベクター接種物を 減少させることにより部分的に解消され、その結果、ＦＶＩＩＩの治療血漿濃度 が投与の後２２週間続いた（１６）。しかしながら、これらの研究において用い られたＣ５７Ｂ１／６株のマウスは免疫応答が弱力化された；このため、これら の結果は、完全に免疫適格の動物を用いて得ることができるものを反映していな い可能性がある。イヌにおける、これらのベクターを用いる発現の急速な低下は 、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質又はアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答に 起因するものであると考えることが可能であった。このようなＥ１置換アデノウ イルスベクターのヒトにおける潜在的な使用を確認するには、イヌのようなより 大型の動物でイヌＦＶ ＩＩＩを用いて実験を行うことが必要であろう。 アデノウイルスベクターは、１）アデノウイルスの静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射の 結果、部分的にはこのアデノウイルスベクターが主として肝臓組織に蓄積するた め、遺伝子発現の標的が肝臓に設定され；２）肝臓からのＦＶＩＩＩの発現が血 漿中のＦＶＩＩＩの濃度を大きく上昇させ；及び３）正常な個体においては肝臓 がＦＶＩＩＩの合成の主要部位であるという事実により、ＦＶＩＩＩの送達に好 ましいものであり得る。 しかしながら、重大な困難はアデノウイルス遺伝子の送達に関連する。例えば 、Ａｄは通常宿主細胞のゲノムに組み込まれない。導入遺伝子の発現を長期間維 持するためには、Ａｄが宿主細胞の統合に必要な要素又はＤＮＡ保持の他の機構 を含まなければならない。加えて、アデノウイルスベクターに対して介在する免 疫応答がそのベクターの再投与を非常に困難なものとする（７６）。本発明のミ ニＡｄベクターは、導入遺伝子を坦持するミニＡｄベクターから全てのアデノウ イルス遺伝子が排除されている。これは、少なくとも部分的に、宿主細胞におけ るＡｄ遺伝子の発現によって生じる可能性がある、導入遺伝子の発現の低下に寄 与し得るあらゆる有害な免疫応答を排除する。 大きな異種ＤＮＡインサートを考慮したアデノウイルスベクターが国際特許出 願ＷＯ９６／３３２８０号に記述されている（参考文献１３２を参照）；しかし ながら、 このベクターは、標的細胞に侵入した際にこのベクターを標的細胞ゲノムに組み 込むための、又はエピソーム維持のための要素を提供しない。本発明は、標的細 胞ゲノムに組み込むことにより、又はエピソーム核酸として維持することにより 、宿主細胞における送達された導入遺伝子の保持が考慮された要素を提供する。 本発明によってこれが達成される方法の１つは、ウイルス組み込み機構を用いて 宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを容易にすることを含む。アデノ関 連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは感染した細胞のＤＮＡに組み込まれる能力を有し 、ヒトゲノムの特定の部位、１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒのＡＡＶＳ１に組み込ま れる外来性ＤＮＡの唯一の例である（３５、１３３）。ＡＡＶ組み込みの最小要 素は逆末端反復（ＩＴＲ）配列及び機能的Ｒｅｐ７８／６８タンパク質である。 本発明は、導入遺伝子の発現を持続させるために宿主細胞のゲノムに導入遺伝子 を組み込むためのこれらの組み込み要素を包含する。また、本発明は、標的細胞 のゲノムへの異種組換えが可能なアデノウイルスベクター、当業者が現在利用可 能なアデノウイルスベクターを上回る別の重要な利点をも提供する。また、本発 明は、導入遺伝子のエピソーム複製を可能にする要素をも提供する。 不死化細胞系（２２−２４、１３４）、エピソーム系（２５−２７）、及び細 胞非含有抽出物（２８）におけるＡＡＶ又はＡＡＶベースのベクターの部位特異 的組み 込みを検出するためにイン・ビトロモデル系が開発されている。始原ヒト細胞又 は不死化細胞系を用いるＡＡＶの形質導入効率の比較は、形質導入効率が不死化 ヒト細胞において始原細胞よりも１０−６０倍高いことを示した（２９）。これ らの結果は始原細胞を用いることの重要性を、又は、イン・ビボモデル系におい てＡＡＶベクターを遺伝子治療用途について正確に評価することがさらに良いこ とを強調する。しかしながら、現在に至るまで、部位特異的組み込みを検出する ためのイン・ビボ動物モデル系は開発されていない。そのゲノムにヒトＡＡＶＳ １配列が組み込まれた動物モデルが本発明において提供される。この動物モデル は、部位特異的組み込みを試験するだけではなく、イン・ビボでの遺伝子送達、 遺伝子導入効率、組織分布、及び遺伝子の発現の持続をも試験するための、ＡＡ Ｖ組み込み機構を有するベクターの評価に有用である。 血友病のイヌ及びマウスを含む動物モデルがＦＶＩＩＩ調製品の効率の試験に 用いられている（１１、１３−１５、８２、８３）。しかしながら、ヒトＦＶＩ ＩＩ遺伝子治療については、動物モデルにおけるヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対 する免疫応答がＦＶＩＩＩの長期送達の研究を複雑なものにする可能性がある。 本発明はヒトＦＶＩＩＩに対して寛容である動物モデルを提供する。このような 動物におけるヒトＦＶＩＩＩに対する免疫応答の欠如には、ヒトＦＶＩＩＩに対 する免疫応答によっ て生じ得る免疫学的な複雑性なしに導入遺伝子の送達を正確に評価する余地があ る。 本発明のミニＡｄベクター系は２つの重要な発見に基づいて開発された：１） ウイルスゲノムの大部分がＳＶ４０の配列で置換されているものの、Ａｄ ＩＴ Ｒ及びパッケージ化要素が存在するため処理を受けてパッケージ化され得るＡｄ −ＳＶ４０ハイブリッドの発見（１７）；及び２）パッケージ化シグナルの部分 的な欠失によりＡｄのパッケージ化を弱力化することが可能であること（１８） 。パッケージ化及びゲノム複製のための最小シス要素の組み込みに基づく他のア デノウイルスベクターパッケージング系を他者が開発中である（１９−２１）。 発明の要約 本発明の目的は、１）導入遺伝子の発現を制御し、標的細胞ゲノムＤＮＡへの 外来性ＤＮＡの組み込みを助成し、及び／又はベクターを標的細胞内においてエ ピソーム形態で維持するための要素を含んでいてもよい約３６ｋｂの異種ＤＮＡ を挿入するための収容力を有する大容量アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（“ミ ニＡｄ”ベクター）；２）このミニＡｄベクターの増殖を支持するように設計さ れ、且つ宿主産生細胞内でこのミニＡｄベクターがより大きなベクターにパッケ ージ化されるように操作されたパッケージ化シグナルを有する同族ヘルパーＡｄ ベクター；及び３）ミニＡｄベクター及びヘルパー Ａｄベクターの両者の増殖を支持するように設計されたヘルパー細胞系であって 、ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を調節し、且つヘルパーＡｄゲノムの パッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘルパー細胞系を提供する ために、改変されたアデノウイルスベクターを提供することである。 当業者が遭遇する問題は、従来のベクターに挿入することができる外来性ＤＮ Ａの量が現在の最大で約８ｋｂに制限されることである。本発明の目的は、約３ ７ｋｂまでのインサート収容力を提供することが可能なミニＡｄベクターを提供 することにあり、この収容力は大きなコーディング領域を有するタンパク質をコ ードする核酸の送達に十分なものである。 態様の１つにおいて、本発明はミニＡｄベクターを単離ＤＮＡ分子として提供 し、この単離ＤＮＡ分子は複製、パッケージ化及び持続性の遺伝子発現に必要な 要素、例えば、逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写調節領域、 エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維 持配列のいずれかを有し、これらの全ては感染性複製不全組換えアデノウイルス ベクターを産生するために作動の上で協働し、前記ＤＮＡ分子の残りの部分はア デノウイルスのタンパク質をコードしない。このようなベクターの例の１つにお いては、ヒトＦＶＩＩＩをコードするミニＡｄベクターが提供される。 当業者が遭遇する別の問題は、標的細胞に導入した後の遺伝子発現の持続期間 が制限されることである。本発明のさらに別の目的は、標的細胞に導入した後の 導入遺伝子の発現の持続時間を延長させるのに必要な要素を有するベクターを提 供することである。したがって、本発明は、標的細胞における導入遺伝子発現の 安定化をエピソームとして、又は導入された遺伝子のその細胞のゲノムへの組み 込みを容易にすることにより、助成し得る要素を有するベクターを提供する。態 様の１つにおいて、本発明は、ミニＡｄベクター内にゲノム組み込み要素又はエ ピソーム維持要素のいずれかを提供する。このような系の一例では、ＡＡＶの組 み込み要素を含むミニＡｄベクターが提供される。このような系の別の例では、 ミニＡｄベクター内に相同組換えアームが提供される。 本発明のさらに別の目的は、パッケージ化が弱力化された複製不全ヘルパーＡ ｄをＥ１補完性Ａｄヘルパー細胞系と組み合わせて用いて、ミニＡｄベクターを 生成するための試薬及び方法論を提供することにある。態様の１つにおいて、Ｅ １欠失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケ ージ化されるように変更されたパッケージ化シグナルを有するＥ１欠失ヘルパー Ａｄゲノムが提供される。別の態様においては、Ａｄ Ｅ１遺伝子配列が安定に 形質移入された細胞としてヘルパー又は産生細胞が提供され、このＡｄ Ｅ１遺 伝子欠失配列にはＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲ ノムと重複する配列がない。加えて、さらに別の態様においては、ヘルパー又は 産生細胞にミニＡｄベクター及びＡｄヘルパーゲノムを同時形質移入し、及び／ 又はこの細胞にＡｄヘルパーウイルスを感染させ、且つ該産生細胞の細胞非含有 溶解物を調製することにより、組換えアデノウイルスベクターを生成する方法が 提供される。このようにして調製される細胞非含有溶解物はこの感染性複製障害 組換えアデノウイルスベクター粒子を含み、その大部分はミニＡｄベクターＤＮ Ａを含む。 動物モデル系においてイン・ビボで、形質導入効率を分析し、且つＡＡＶの標 的をその組み込み部位ＡＡＶＳ１に設定することが困難であることも当業者にと っては立証されている。本発明のさらに別の目的は、本発明のミニＡｄベクター に組み込まれたＡＡＶ組み込み機構によって指向される標的組み込みを評価する ための動物モデル系を提供することにある。一例として、本発明は、それらのゲ ノム内にヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスを生成 するための方法論を提供する。このような動物にミニＡｄベクターを注射した後 、ＡＡＶＳ１部位への導入遺伝子の標的組み込みを評価することができる。 また、当業者は、ヒトＦＶＩＩＩの外来タンパク質としての免疫学的認識のた め、ヒトＦＶＩＩＩベクターの毒性及び長期間の効力の決定において困難に直面 している。本発明の目的は、ヒトＦＶＩＩＩの発現を評価する ためのヒト第ＶＩＩＩ因子寛容動物を提供する。本発明は、成熟動物ではなく発 生中のマウスにおいてヒトＦＶＩＩＩが発現するように、発生的に調節されたプ ロモーター（すなわち、α−胎児タンパク質プロモーター）に作動可能に連結さ れたヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを開発するための 方法論を提供する。この一時的な発現の結果、その動物はヒトＦＶＩＩＩタンパ ク質に対して寛容となり、それによりヒトＦＶＩＩＩを“自己”タンパク質とし て認識する。この場合、そのような動物においてはヒトＦＶＩＩＩに対する免疫 応答は生じない。本発明は、さらに、ヒトＦＶＩＩＩ寛容友血病マウス種に加え て、そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１予備組み込み部位が組み込まれているヒトＦＶ ＩＩＩ寛容友血病マウスを提供する。 したがって、本発明は、当業者が遭遇している、遺伝子治療ベクターに関連す る多くの困難を克服するのに必要とされる試薬及び方法論を提供する。本発明の 上述の目的はもちろん、他の目的も、以下に記載される発明の詳細な説明に鑑み て理解される。 図面の簡単な説明 図１．ミニＡｄベクター系の原理。ミニＡｄベクター系の３つの主要成分：ヘル パーＡｄ、ミニＡｄベクター、及びＡｄヘルパーが示される。ヘルパー細胞によ って供給されるＥ１はヘルパーＡｄがそれ自体で複製し、ウイ ルスキャプシドを形成する後期ウイルスタンパク質を合成することを可能にする 。このキャプシド内へのヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化は、本発明のヘルパ ーＡｄのパッケージ化シグナルが弱力化されているため非能率的である。ミニＡ ｄベクターゲノムの存在下において、ヘルパーＡｄはそのミニＡｄベクターゲノ ムの複製を支持し、これはその野生型パッケージ化シグナルがヘルパ−ウイルス パッケージ化タンパク質に対して高い親和性を有するため優先的にパッケージ化 される（３１）。ミニＡｄベクターのさらなる精製は、生化学的又は物理的方法 、例えば超遠心、を用いて達成することができる。 図２．現在のＡｄベクターの本発明との比較。このミニＡｄベクター系と比較し た、現在のＡｄベクターの一般的な設計及び補完機構が図示される。 図３．ヘルパーウイルス及びミニＡｄベクターの原型。 Ａ．アデノウイルスの左ＩＴＲを参照したパッケージ化シグナルの配置。Ｂ．野 生型アデノウイルス5のパッケージ化シグナル配列領域の配列が示される。角括 弧は弱力化ヘルパーウイルスパッケージ化シグナルを含めるために欠失された領 域を示す。Ｃ．Ｂに示される配列の反復領域は共通反復と共に記載されている。 図４．パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄＨβを生成するためのシャトルベクター の構築。ＧＴ５０００を構築するため、突然変異パッケージ化シグナル配列ｍｔ ΨをＰＣＲにより増幅し、シャトルベクター内で２８．９ｍｕ まで延びるＡｄ５配列で置換した（ＧＴ４００４）。ｐＴｋ−βに由来するβ− ｇａｌ発現カセットをＧＴ５０００のＥ１欠失物にクローン化し、シャトルベク ターＧＴ５００１を得た。 図５．ＡｄＨβの生成。シャトルベクターＧＴ５００１（図８を参照）をｐＪＭ １７と共に２９３細胞に同時形質移入した。これらのプラスミドの間の相同７Ｋ ｂ領域（Ａｄ５の９．２４乃至２８．９）での組換えにより、ＧＴ５００１から 誘導される左アームを有するパッケージ化可能なウイルスが生じる。最下部に示 されるＡｄＨβの左領域の数字はＡｄ５ ｎｔ配列に相当し、パッケージ化シグ ナルに加えてβ−ｇａｌ発現カセットが挿入されているＥ１における二重欠失の 伸長を示す。同時形質移入の２週間後、幾つかの青色プラークを単離し、パッケ ージ化シグナル中の突然変異をオリゴ７及び８を用いてＰＣＲにより分析した。 増幅した断片のサイズ、野生型パッケージ化シグナル（ｗｔΨ）については３１ ０ｂｐ、突然変異パッケージ化シグナル（ｍｔΨ）については１７７ｂｐは、示 されるように、２％アガロースゲルにおいて区別することが可能である。１Ｋｂ ラダー、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ（ゲーサースバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂ ＤＮＡラダーマーカー；ｗｔΨ及びｍｔΨ、ｖＤＮＲがそれぞれＥ１欠失ベクタ ーＡｄ−ＣＭＶβｇａ１及びｄｌ１０／２８ウイルスから抽出されたＰＣＲ対照 ；青色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されたプ ラークからのｖＤＮＡ；白色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されなかったプ ラークからのｖＤＮＡ（図６を参照）。 図６．Ｘ−ｇａｌでの染色によるＡｄＨβプラーク対他のものの同定。［これら のプラークのパッケージ化シグナルのＰＣＲ増幅が図５に示される。］ 図７．ＡｄＨβの増幅及び特徴付け。２９３細胞中に存在する内在性左Ａｄ５配 列を用いる組換えが複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ、Ｅ１＋）又はｗｔΨを有 するＥ１アデノウイルスを生じ得る可能性があるため、ＡｄＨβのパッケージ化 シグナルを各継代後に増幅した。ＣｓＣ１精製以前には継代中にｗｔΨは検出さ れなかった（４乃至８）。継代９では、ＡｄＨβを精製したときに、ウイルスＤ ＮＡ含量を勾配の５つのバンドの全てについて別々に分析した。１％アガロース ゲル（最下部左）においては上方の３つのバンドにおいてｖＤＮＡはほとんど観 察されず、これは、これらが大部分空のキャプシドによって形成されることを示 す。下方のバンド（４及び５）は充満キャプシドによって形成される。ＰＣＲに より、全てのバンドにおいて期待される突然変異パッケージ化シグナルが検出さ れる（最下部右）。１Ｋｂラダーマーカー（図９と同様）は各々のゲルの左レー ンである。ｖＤＮＡを含むゲルは１／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーも含む。 図８．ミニウイルスプラスミドの構築。これらのプラス ミドは、ＡｄＨβで補完された場合のパッケージ化に対するアデノウイルスゲノ ムの様々な欠失の効果を決定するために構築する。全ての構築体は、ＣＭＶプロ モーターによってβ−アクチンエンハンサー（濃い矢印）で駆動される緑色蛍光 タンパク質ｃＤＮＡ（ＧＦＰ、縦線付きのボックス）を含む。Ｍ７．９（最下部 右）はネオマイシンｃＤＮＡ及び内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）をも 有する。上部の６つはＭ３２から誘導され、これはＡｄ５ゲノムの中間に１０Ｋ ｂの欠失があるｐＪＭ１７誘導体である。最下部の２つはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ−ＫＳ（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＣＡ）からＡｄ５の複製 及びパッケージ化のための最小シス要素を含めて誘導される。数字はＡｄ５マッ プ単位に対応し、欠失及び挿入部位を示す。０／１００及び１００／０はＡｄ５ ＤＮＡの逆末端反復（ＩＴＲ）、Ａｄ５ ＤＮＡの天然の融合を示す、濃いレ ーン；プラスミド主鎖ＤＮＡ、薄いレーン。 図９．パッケージ化のために構築されたミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクタ ーの模式的図示。最上部は、初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）転写領域を伴うＡｄ５転 写マップ及びマップ単位（ｍｕ）。ＭＬＰ／ＴＬ：主要後期プロモーター及び三 部構成ラダー。逆末端反復（ＩＴＲ）及びパッケージ化シグナル（Ψ）は全ての ミニＡｄベクターにおける独自の共通配列である。ベクターは、複製の後にキャ プシド内で見出される通りに、直鎖形態で示 される。ベクターの生成に用いられる環状プラスミドは、同じ配列を有するがＩ ＲＴにより頭部が尾部に融合している。それぞれのミニＡｄベクターの名称はＫ ｂでのそのサイズを引き合いにする。Ｍ３２乃至Ｍ２０はｐＨＭ１７から中央ア デノウイルスゲノムの漸進的欠失により誘導される。これらのベクターにおいて は、プラスミド主鎖（ｐＢＲＸ、図示せず）は３．７ｍｕに位置する。Ｍ６．５ 乃至ｖＧｎＥ５Ｅ３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖（図示せず；ＧＦＰ発現カ セットの前に位置する）において、ネオマイシンｃＤＮＡ及びｃｈｒ．４ｑ１１ −２２に由来するヒトゲノム断片を挿入することにより構築される。 図１０．補完の２つの方法。ミニウイルスベクターを生成するのに、類似の収量 が得られる２つの別々の補完プロトコルを用いた。第１の方法においては、ミニ ＡｄプラスミドをＡｄＨβに由来するウイルスＤＮＡと共に同時形質移入し、そ れらの細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。第２の方法においては、ミニＡ ｄプラスミドをｐＢＨＧ１０と共に同時形質移入した３日後にＡｄＨβをウイル スとして加え、細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。 図１１．ミニウイルスプラスミドでの２９３細胞の同時形質移入。ＣａＰＯ4改 変プロトコルを用いることによりほとんど全ての細胞に形質移入した。Ｍ３２プ ラスミドの形質移入は形質移入の１日後に示される。右、明視野 ；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真。 図１２．ミニウイルス含有プラーク。ミニウイルス（ここではＭ３２）の存在が プラークの蛍光によって示される。右、明視野；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真 。 図１３．異なるサイズのミニウイルスベクターのパッケージ化効率。異なるサイ ズのミニＡｄベクターのパッキング効率及び増幅。同時形質移入の後に生成され るウイルスを継代０と命名する。その粗製溶解物を用いて２９３細胞を感染させ 、継代１を生成した。１ｍｌの粗製溶解物継代１を用いて１０６個の２９３細胞 を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（形質導入単位／ｍｌ 、黒柱）。２４時間後にＣＰＥが出現し、凍結／解凍によりウイルスを抽出した （粗製溶解物継代２）。再度、１ｍｌの粗製溶解物継代２を用いて１０６個の２ ９３細胞を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（斜線付きの 柱）。継代１と２との相違は５Ｘの増幅収量を示し、異なるミニＡｄベクター間 の相違はパッケージ化におけるサイズの効果を示す。 図１４．Ｍ３２の精製スキーム。数回継代することによりＭ３２を増幅させた後 、粗製抽出物をＣｓＣｌ分離した。第１勾配の結果４つのバンドが生じた：３つ は上方で１つが下方。これらを別々に集めて透析し、図１２に示されるように２ ９３細胞の感染に用いた。上方及び下方バンドの第２分離勾配から画分を集め、 図１６に示されるように２９３細胞の感染に用いた。 図１５．Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（１）。第１ＣｓＣｌ勾配。Ｍ３２及び ＡｄＨβをより高密度のバンドにおいて同時精製する（第４番以下）。蛍光のチ ェックに用いたものと同じウェルを後に固定及びＸ−ｇａｌでの染色に用いる。 図１６．Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（２）：第２ＣｓＣｌ勾配を用いる第１ ＣｓＣｌ勾配からの下方バンドの分画。各画分の一定分量０．５μｌを、６０％ 集密の２９３細胞を収容する９６ウェル／プレートのウェルの１つを感染するの に用いた。最初の画分（１乃至６）はＭ３２又はＡｄＨβを含んでいなかった（ これらの画分は勾配の３ｍｌまでを表す）。画分７乃至１６の１００μｌの試料 は多量のＭ３２及びＡｄＨβを明らかにする（パネルＡにおいて蛍光の下で示さ れるものと同じ画分のβ−ｇａｌ染色についてはパネルＢを参照）。続く画分（ １７乃至２９）はそれ以前の画分に類似する濃度のＭ３２を示すが、ＡｄＨβの 濃度は約１０倍低い。したがって、画分１７−２９は、ＡｄＨβに対して約１０ 倍のＭ３２の濃縮を表す。 図１７．ＧＡＬ４結合部位を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。Ｘｈｏ Ｉ及びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２ ）。設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、Ａ 反復IIとＶＩとの間に１つのＧＡＬ４結合部位が存在する。設計＃２においては 、Ａ反復Ｉの 前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、別の２つのＧＡＬ４結合部位がＡ反復Ｖ ＩＩの後に存在する。下線が付された配列は１７量体ＧＡＬ４結合部位である。 イタリック体の配列はＡ反復である。各ＧＡＬ４結合部位の中心とＡ反復との間 の距離が示される。 図１８．ｔｅｔＯ配列を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。ＸｈｏＩ及 びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２）。 設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＩＩ とＶＩとの間に１つのｔｅｔＯ配列が存在する。設計＃２においては、Ａ反復Ｉ の前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＶＩＩの後にさらなるｔｅｔＯ配列 が存在する。下線が付された配列は１９量体ｔｅｔＯ配列である。イタリック体 の配列はＡ反復である。各ｔｅｔＯ結合部位の中心とＡ反復との間の距離が示さ れる。 図１９．Ａｄ Ｐａｃ−ＧＡＬ４改変のための合成オリゴの位置及び配列。Ｇａ ｌ＃１乃至Ｇａｌ＃８は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位 の間の配列に隣接する合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示さ れる。Ｇａｌ＃１乃至Ｇａｌ＃8の配列が記載される。 図２０．ａｄ Ｐａｃ−ｔｅｒＯ改変のための合成オリゴの位置及び配列。ｔｅ ｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部 位の間 の配列を覆う合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示される。ｔ ｅｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０の配列が記載される。 図２１．ＣＭＶ−Ｅ１哺乳動物発現ベクターの構築。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコード するアデノウイルス５配列４６２−３５３７（ＡｆｌＩＩＩ−ＡｆＩＩＩ断片） をｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端クローン化した。 図２２．Ｅ１補完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８におけるＧＦＰ発現及びプラーク 形成。Ｅ１欠失アデノウイルスＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰを感染させた後。このプラー クの中心の透明領域はＥ１補完ウイルスの増幅によって生じるＣＰＥの証拠であ る。 図２３．Ｇ４１８ｒ Ａ５４９Ｅ１クローンのサザンブロット分析。ゲノムＤＮ ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、７５０ｂｐのＥ１プローブ（ＰｓｔＩ断片）で探 索した。レーン１：１ｋｂＤＮＡラダー；レーン２：Ａ５４９；レーン３：２９ ３；レーン４：Ａ５４９Ｅ１−６８；レーン５：サブクローンＡ５４９Ｅ１−６ ８．３。 図２４．新規細胞系の形態学的分析。親Ａ５４９細胞（上部パネル）及びＥ１補 完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８（下部パネル）の形態学的比較。 図２５．形質転換細胞系におけるＥ１タンパク質の発現の分析。Ａ．Ａ５４９細 胞（レーン１）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３） におけるＥ１Ａタンパク質の発現の、Ｅ１Ａ特異的モノクロ ーナル抗体（Ｍ７３、オンコジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ））を用いるウェスタンブロット分析。Ｂ．Ｅ１Ｂ ｐ５５特異的モノク ローナル抗体（オンコジーン・サイエンス）を用いる、Ａ５４９細胞（レーン１ ）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３）におけるＥ１ Ｂタンパク質の代謝性35Ｓ標識及び免疫沈殿。 図２６．ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴプラスミドの模式図。 このプラスミドは、ｐＢＲＣＡＴプラスミドベクター中に、クロラムフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）の上流に作動可能に連結するｐ Ａｌｂ１２．５ＣＡＴ １２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター（ＥｃｏＲＩ 乃至ＨｉｎｄＩＩＩ）を含む。近位プロモーター及びエンハンサー領域（Ｅ1.7 及びＥ6）が示される。 図２７．ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ+ベクターへの１２．５ｋｂヒトアルブ ミンプロモーターのクローン化。ＥｃｏＲＩ乃至ＡｖａＩの１０．５ｋｂ断片及 び２．０ｋｂのＡｖａＩ乃至ＨｉｎｄＩＩＩアルブミンプロモーター断片をｐＡ ｌｂ１２．５ＣＡＴから別々に単離し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＫＳ+ベクタ ーのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に同時にライゲートしてＧＴ４０３１を生 成した。 図２８．ＧＴ４０３１へのｈＦＶＩＩＩ発現カセットのクローン化。７．５ｋｂ ヒトＦＶＩＩＩカセットをプラ スミドＧＴ２０５１からＸｈｏＩ及びＳａｌＩを用いて切り出してＧＴ４０３１ のＳａｌＩ部位にライゲートし、ｈＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに作動可能に連結する ヒトアルブミンプロモーターを含むＧＴ２０５３を得た。 図２９．アルブミンプロモーター−ＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドの構築。 ＧＴ２０３３に由来するアデノウイルス５’ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルを 含む断片をＸｈｏＩを用いて切り出し、ＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位にクローン 化した。順方向又は逆方向（それぞれＧＴ２０６１及びＧＴ２０５９）のいずれ かのＩＴＲを有するプラスミドを得た。ＧＴ２０６１中のインサートは、ＦＶＩ ＩＩ遺伝子に近接する独自ＳａｌＩ部位と共に配向される。ＧＴ２０５９はＧＴ ２０６１とは反対の方向のＡｄ ＩＴＲを含む。 図３０．ＧＴ２０５３、ＧＴ２０５９及びＧＴ２０６１の制限消化プロフィール 。消化により、ＳａｌＩとの組み合わせでＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ及び ＸｈｏＩに期待される結合パターンが示される。 図３１．染色体４上のアルブミン／α−胎児タンパク質遺伝子領域の図。この図 は相同組換えのための３’組換えアームとしての機能を果たす３つの領域：１） Ａｌｂ−Ｅ５、アルブミン遺伝子の３’領域；２）ＡＦＰ−３、α−胎児タンパ ク質遺伝子の中央領域；及び３）α−胎児タンパク質のさらに３’、に位置する ＥＢＢ１４を示す。 図３２．クローン化スキーム。異なる３酎鞄ッ組換えアー ムを含む３つのベクター（Ａ、Ｂ、及びＣ）の、それらのアームを（パネルＡ、 Ｂ、及びＣの上に示される）ＧＴ２０６１にクローン化した後の制限酵素マップ 。 図３３．クローン化スキーム。クローンｐＡｌｂ−Ｅ５のヒトアルブミン遺伝子 の３窒U．８Ｋｂ ＸｈｏＩ断片がＧＴ２０６１のＳａｌＩ部位にクローン化さ れているＧＴ２０６３の詳細なクローン化スキーム。このベクターをベースとす るミニウイルスはＦＶＩＩＩ遺伝子の潜在的なイン・ビトロ治療手段である。 図３４．制限酵素マッピング。図９に示される３’相同アルブミン相同組換えア ームを有するアルブミンプロモーター駆動ｈＦＶＩＩＩを含むプラスミドの生成 に用いられたベクターの制限酵素消化を示すアガロースゲル。示される構築体の 各々についてＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩ消化が示されている。 図３５．ミニＡｄＦＶＩＩＩウイルスを生成するためのスキーム。ｈＦＶＩＩＩ ミニウイルスを生成するための２つのスキーム（Ａ及びＢ）が示される。スキー ムＡ ：第１日に、ヘルパーウイルスゲノムＤＮＡ及びプラスミドＧＴ２０６３を リン酸カルシウム沈殿により２９３細胞（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ１５７３）に同時形 質移入した。形質移入はリン酸カルシウム沈殿によるものであった。第６日に、 細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、細胞溶解物を調製した。その後、継代４まで 毎回、感染に続く３日間溶解物を回収し、その時点でウイルス調製物は５倍 に増幅していた。培地は感染後毎日代えた。スキームＢ：プラスミドｐＢＨＧ１ ０をプラスミドＧＴ２０６３と共にリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ ｎｅ）（ギブコ）を用いて２９３細胞に同時形質移入した。７２時間後に、５ｐ ｆｕ／細胞の多重度でヘルパーＡｄを感染させた。５日後、ＣＰＥを観察し、細 胞溶解物を調製した。その後、等しい接種容積を用いて継代３まで感染させ、そ の時点でウイルスは５倍に増幅し得る。培地は感染後毎日代えた。 図３６．ＦＶＩＩＩを含むミニＡｄベクターの生成。ミニＡｄＦＶＩＩＩベクタ ーを、ミニＡｄプラスミドＧＴ２０６３を２９３細胞に形質移入し、ヘルパーＡ ｄＨβを感染させることにより生成した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了したと き、それらの細胞及び上清を集めた（継代０）。増殖させるため、数回の凍結／ 解凍サイクルによりウイルスを細胞から抽出し、新鮮な２９３細胞の感染に用い た。各々の継代時に、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、及びプロテイナーゼＫを含む溶液中で のインキュベーション及び続くエタノール沈殿によるウイルスＤＮＡの抽出に７ ４０μｌの上清を用いた。ビリオン溶解工程に先立って、上清をＤＮＡ分解酵素 Ｉ消化に処し、ＧＴ２０６３プラスミドＤＮＡからの汚染を回避した。１／２０ の精製ウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＴ）による パッケージ化シグナル配列の増幅における基質として用いた。ＦＶＩＩＩミニＡ ｄ及び ヘルパー増幅領域の予想されるサイズは、それぞれ、１７７及び３１０ｂｐであ った。ＤＮＡサイズマーカー：ギブコ（ゲーサーズバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂラ ダー。さらなるＧＴ２０６３プラスミドを含み、又は含まない、非形質移入２３ ９細胞からの上清を、それぞれ、陰性対照及びＤＮＡ分解酵素Ｉ処理の対照とし て用いた。 図３７．ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターの継代０乃至２１に由来するｖＤＮＡのサ ザンブロット分析。ｖＤＮＡは図１４と同様に精製した。１／２の精製ｖＤＮＡ （３７０μｌの上清に相当）をＰｓｔＩで消化し、１％アガロースゲルで分離し てナイロンメンブランにブロットした。ミニＡｄ及びヘルパーの両者に存在する 右（３秩ｊＩＴＲに隣接する配列に対応するプローブをｖＤＮＡの検出に用いた 。検出される断片の予想サイズ：ミニＡｄＦＶＩＩＩ＝３．３Ｋｂ；ＡｄＨβ＝ ２．２Ｋｂ。４つの独立のブロットが示される（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。マーカー 断片への特異的ハイブリダイゼーションを標準化のために用いた。 図３８．連続継代の全期間にわたる、ミニＡｄＦＶＩＩＩ及びヘルパーにおける 動的変動。このプロットは、図１５に示されるバンドの濃度測定による定量化に よって得た。ヘルパーは方形を伴う明線によって示される；ミニＡｄＦＶＩＩＩ は菱形を伴う暗線によって示される。１単位はＹ軸上で検出される最低量と定義 される（継代１８でのヘルパーｖＤＮＡの量に相当）。他の値はこの 単位に標準化される。 図３９．ＣｓＣｌ勾配遠心によるミニＡｄＦＶＩＩＩ及びＡｄＨβの分離。第１ 勾配からの最下部バンドはビリオンを含んでおり、これらを第２勾配に適用する ことによりさらに分離した。ミニＡｄ（３１ｋｂ）とヘルパー（３７．１ｋｂ） とのサイズが異なることにより分離が可能となり、その結果、サザンブロットに よる測定で、１０：１ ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する上部画分及び１ ：１０ ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する下部画分が生じた。 図４０．ミニＡｄベクターが形質導入された細胞におけるＦＶＩＩＩの発現。２ ９３細胞をチャンバスライドにおいて成長させ、図１８Ｃに示されるように上部 又は下部画分の希釈した（１／１００）一定分量１μｌで感染させた。感染の２ ４時間後、これらの細胞を固定し、ＦＶＩＩＩ特異的ｍＡｂ（シーダーレーンシ ープ（Ｃｅｄａｒ Ｌａｎｅ Ｓｈｅｅｐ）抗ヒトＦＶＩＩＩＣ、＃ＣＬ２００ ３５Ａ、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレー ション（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストバリー、ＮＹ）、続いて二次抗体（ビオ チン化ロバ抗ヒツジＩｇＧ、ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、＃７１３−０６５−１４７）及びＤＡＢ（赤み を帯びた茶色を生じる；シグマ（ＳＩ ＧＭＡ）カタログ番号Ｄ７６７９）で染色した。Ａ．模倣非感染対照２９３細胞 。Ｂ及びＣ．図１８Ｃに示されるような上部画分の２つの独立の調製品での形質 導入（ミニＡｄＦＶＩＩＩ濃縮）。Ｂ及びＣの両者において、１０％の細胞がＦ ＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（矢印）。Ｃ．図１８Ｃ（ヘルパーウ イルス濃縮）に示されるような下部画分での形質導入の結果、０．１％の細胞が ＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された。 図４１．ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターが形質導入された細胞における機能的ＦＶ ＩＩＩ発現。機能的ＦＶＩＩＩのコーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）色素生成検定。 上の表はＯＤ読み取り値を示す。試料からの読み取り値を外挿するための等式を 得るため、４０００ｎｇ／ｍｌ乃至６２．５ｎｇ／ｍｌ（列Ａ乃至Ｇ）から３回 （レーン１、２、及び３）作成した標準曲線もプロットする。レーン４、５及び ６は試料から３回得たものである。Ａ：２９３細胞中の一定分量１０μｌのミニ ＡｄＦＶＩＩＩ；Ｂ：２９３細胞中の１μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｃ：Ｈｅｐ Ｇ２細胞中の１０μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｄ：ＨｅｐＧ２細胞中の１μｌの ミニＡｄＦＶＩＩＩ。Ｅ：非形質導入２９３細胞からの馴化培地。Ｆ：非形質導 入ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地。 図４２．クローンＧＴ２０７４のマップ。このプラスミドは、プラスミドＧＴ４ ０２０からＳａｌＩ消化によって切り出され、ＧＴ２０７３の独自ＳａｌＩ部位 にクロ ーン化された、［Ｂ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに作動可能に連結 された伸長因子−１（ＥＦ−１；参考文献５２）プロモーターを含む］発現カセ ットを含む。ＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴを含むｐＡＬＢ１２．５におけるＰｍｅＩ 部位の下流の３’近位アルブミンプロモーター領域（３２）が欠失していた。こ の発現カセットはＢ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに連結する伸長因 子Ｉプロモーターを含む。 図４３．ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩのマップ。このプラスミドは、ＧＴ２０７３の ＳａｌＩ部位にクローン化されている完全長ｈＦＶＩＩＩコーディング領域に作 動可能に連結するＣＭＶプロモーターを含む。このサイトメガロウイルスプロモ ーターはｐＣＭＶβ（クローンテック、パロアルト、ＣＡ）から誘導した。 図４４．組み込み頻度及び特異性の試験に用いられるプラスミドの模式図。プラ スミドＧＴ９００３及びＧＴ９００４は両側にＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接するｎ ｅｏ発現カセットを含む；ＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３はＡＡＶ ＩＴＲ配列 が隣接するＧＦＰ発現カセットを含む；ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２は組み込 みカセットの上流にＲｅｐ７８発現カセットも含む。プラスミドＧＴ９００３を 構築するため、ＡＡＶゲノムの１９３乃至２１２６のＲｅｐ配列をプラスミドｐ ＳＵＢ２０１からＰＣＲ（Ｐｆｕ ｐｏｌ）により増幅し、ｐＣＲＩＩ（インビ トロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＡ）にク ローン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９０００）をＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで 消化し、ＳＶ４０ポリＡ部位（Ｎｏｔ−ＳａｌＩ）を含む断片をその部位にクロ ーン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９００１）をＸｂａＩで消化し、クレノ ウで平滑末端化した。全ＡＡＶゲノムを含むＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＳ ＵＢ２０１から得、ＧＴ９００１の平滑末端化ＸｂａＩ部位にサブクローン化し た。その後、このプラスミド（ＧＴ９００２）をＸｂａＩで開裂させた。これは 、ＡＡＶコーディング配列を除去してＡＡＶ ＩＴＲを残す。次に、ｎｅｏ発現 カセット（ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ）をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩアダプターを用 いてＧＴ９００２にサブクローン化し、プラスミドＧＴ９００３を生成させた。 ＥｃｏＲＩを用いてＧＴ９００３からＲｅｐコーディング配列を除去することに よりプラスミドＧＴ９００４を生成した。ＧＴ９００３及びＧＴ９００４のｎｅ ｏ配列（ＸｂａＩ−ＸｂａＩ）をそれぞれＧＦＰ発現カセット（ＳｐｅＩ−Ｎｈ ｅＩ）で置換することによりプラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を生成し た。 図４５．組み込み可能な第ＶＩＩＩ因子カセットを含むミニアデノウイルスベク ターの設計。この構築体中に存在する複製及びパッケージ化に必要なミニＡｄ要 素はＡｄ ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルである。第ＶＩＩＩ因子カセットは ２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に含まれる。Ｒｅｐ発現カセットはこの組み込み可能 なセグメントの 外側に位置する。Ｒｅｐの発現はリプレッサーｔｅｔ−ＫＲＡＢを安定に発現す る細胞系のＴｅｔオペレーターで調節することができる。標的細胞において、Ｒ ｅｐの発現は、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する配列の染色体１９のＡＡＶＳ１部位を 標的とする組み込みをもたらすはずである。 図４６．２９３及びチャン（Ｃｈａｎｇ）肝細胞におけるＲｅｐタンパク質の免 疫沈殿。１０ｃｍペトリ皿においで成長させた細胞に１０ｍｇのプラスミドＧＴ ９００１、ＧＴ９００３、及びＧＴ９００４を形質移入した（プラスミドの構築 に関する詳細は図３１を参照）。非形質移入細胞及びＧＴ９００４形質移入細胞 を陰性対照として用いた。形質移入の２日後、細胞を溶解し、プロテインＧ−ア ガロースに結合させた抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体（クローン２２６．７；Ａ ＲＰ、ベルモント、ＭＡ０２１７８）を用いてＲｅｐタンパク質を免疫沈殿させ 、１０％ポリアクリルアミドゲルに流して、免疫沈殿において用いたものと同じ 抗体で免疫ブロットした。タンパク質を化学発光（ＥＬＣキット、アマシャム（ Ａｍｅｒｓｈａｍ））により可視化した。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質 の移動が示される。 図４７．プラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した２９３クロー ンのサザンブロット。幾つかのｎｅｏ耐性クローンに加えてｎｅｏ耐性集団（プ ールで示される）からの１５ｍｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ で消化して電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ− Ｎ）、アマシャム）にブロットして８ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片にわた るＡＡＶＳ１プローブにハイブリダイズさせた。正常なＡＡＶＳ１遺伝子座が示 される（パネルＡ）。幾つかのＧＴ９００３クローンはバンドのずれを示し、こ れはＡＡＶＳ１遺伝子座のうちの１つの破壊に相当する。パネルＢはｎｅｏ配列 に再度ハイブリダイズされた同じメンブランを示す。 図４８．プラスミドＧＴ９０１２又はＧＴ９０１３を形質移入した２９３クロー ンのサザンブロット。条件は図３３に記述される通りである。Ａ）ＡＡＶＳ１サ ザンブロット。プラスミドＧＴ９０１２から誘導されたクローンの幾つかがＡＡ ＶＳ１の再編成を示す。Ｂ）幾つかのブロットをＧＦＰ配列に再度ハイブリダイ ズさせた。 図４９．ＡＡＶＳ１ Ｐ１ゲノムクローンのサザンブロット分析。ＰＣＲ［ＡＡ ＶＳ１ ＰＣＲ（＋）］によってＡＡＶＳ１配列が検出された（Ｐ１クローン６ ５７６、Ｐ１クローン６５７７、Ｐ１クローン６５７８、及びＰ１クローン６５ ７９と呼ばれる）４つのＰ１ゲノムクローンからプラスミドＤＮＡ（１μｇ）を 単離し、ＥｃｏＲＩ（図２３Ａ）又はＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩ（図 ２３Ｂ）で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハ イボンドＮ＋、アマシャム）にブロットし、２５３ｂｐのＡＡＶＳＩ ＰＣＲ 産生物をプローブとして用いてハイブリダイズした。Ａ及びＢの両者において、 レーン１はＰ１クローン６５７６を表し、レーン２はＰ１クローン６５７７を表 し、レーン３はＰ１クローン６５７８を表し、且つレーン４はＰ１−クローン６ ５７９を表す。 図５０．ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏベクターの構築。ＡＡＶＳ１組み込み配列を含む ８．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン６５７６から単離し、Ｎｅｏ発現ベ クターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にライゲートしてｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを 作製した。 図５１．ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスの生成 。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示される。ＥＳ細胞に ＡＡＶＳ１プラスミドクローンを形質移入して胚盤胞に微量注入した後、それら を仮母に移植した。約１７日後、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６と交雑育種し、 子孫をＡＡＶＳ１導入遺伝子の存在について試験した。陽性子孫の交雑育種を行 い、導入遺伝子がホモ接合している系を生成した。次いで、これらのモデルをア デノ関連ウイルス組み込み系を含むように改変されたミニＡｄベクターのイン・ ビボ送達を試験するのに用い、このベクターＤＮＡの部位特異的組み込みの効率 を評価した。 図５２．ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを形質移入した後のＮｅｏR ＥＳ細胞クローン のＰＣＲ分析。１７のＮｅｏRＥＳ細胞クローン（３．１−３．１７）及び非形 質移入 親ＥＳ細胞から独立に単離されたゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ ２４９３及びＬ２７２２を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、ＡＡＶＳ１配 列を有するＮｅｏRクローンを確認した。これらのＰＣＲ反応試料を以下のよう に１．５％アガロースゲルにのせた：レーン１−１ｋｂＤＮＡサイズマーカー（ ギブコ／ＢＲＬ）；レーン２−ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラスミド対照；レーン３ −非形質移入ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４乃至２０−１７の個々のｐＡＡＶＳ１Ｎ ｅｏ形質移入ＮｅｏR ＥＳ細胞クローン。 図５３．ＡＡＶＳ１ ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析。２ つのＡＡＶＳ１ ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローン（ＥＳ＃４及びＥＳ３．１６） 及び親ＥＳ細胞に由来するゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩ で消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンドＮ＋ナイロンメン ブランにブロットし、８．２ｋｂのＡＡＶＳ１ブローブとハイブリダイズさせた 。レーン１−ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４；レーン２−ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃３．１６； レーン３−親ＥＳ細胞。ＡＡＶＳ１配列全体をＥＳ細胞ゲノムに組み込んだ結果 生じる、予想される断片は、５．２及び３．０ｋｂである。 図５４．ＡＡＶＳ１キメラマウス。ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４細胞を用いる胚盤胞微 量注入実験から得られた２匹の高パーセンテージトランスジェニック（キメラ） マウス。 ＥＳ幹細胞を用いて生成した動物においては、キメラ現象の程度の高さは導入遺 伝子の伝達の可能性の高さと相関する。 図５５．キメラマウスにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためのＰＣＲ分 析。ゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラの尾及び、独立に、非キメラ同腹子から単 離し、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２を用いてＰＣＲに よりスクリーニングした。ＰＣＲ反応物を以下のように１．５％アガロースゲル にのせた：レーン１−１ｋｇＤＮＡサイズマーカー；レーン２−ｐＡＡＶＳ１− Ｎｅｏプラスミド対照Ｃ；レーン３−非形質移入親ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４− ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４細胞ＤＮＡ（４）；レーン５−非キメラ同腹子からの尾の ＤＮＡ；レーン６−低パーセンテージキメラ（１０％未満のアグーチコート色） からの尾のＤＮＡ；レーン７−高パーセンテージＡＡＶＳ１キメラ（９０％を上 回るアグーチコート色）からの尾のＤＮＡ。予想ＰＣＲ産生物＝２５３ｂｐ。 図５６．ｈＦＶＩＩＩマウス寛容化ベクターの構築。７．２ｋｂの完全長ｈＦＶ ＩＩＩ遺伝子をＮｏｔＩを用いてＧＴ２０５１から切り出し、ＧＴ２０５７のＮ ｏｔＩ部位にクローン化してＧＴ２０５８におけるｍＡＦＰ−ＦＶＩＩＩカセッ トを生成した。次に、このｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットをＡａｔＩＩ及びＳ ａｌＩ断片を用いてＣＧＴ２０５８から切り出し、ｐＧＫＮｅｏのＡａｔ ＩＩ／ＸｈｏＩにクローン化してｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ（ＧＴ ２０６２）を生成した。 図５７．ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ ＥＳ細胞クローンのサザンブ ロット分析。非形質移入親ＥＳ細胞及び４つのＮｅｏR ＥＳクローンに由来す るゲノムＤＮＡをＸｂａＩで消化し（図２９を参照）、電気泳動し、ブロットし 、完全長ｈＦＶＩＩＩ ＮｏｔＩ断片をプローブとして用いてハイブリダイズさ せた。図に示されるように、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットの挿入を示す予想 断片サイズは７．８ｋｂであった。 図５８．ｍＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターの構築。ＡＦＰプロモーター／エンハ ンサー領域全体を含む７．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＥＧＦＰ−１ ベクター（クローンテック）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩにクローン化し、ｐＡＦＰ −ＥＧＦＰ−１を作製した。 図５９．免疫という結果をもたらすことなくｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試 験するためにｈＦＶＩＩＩに対して子宮内で寛容化されたトランスジェニックマ ウスの生成スキーム。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示 される。ａ−胎児タンパク質プロモーターに作動可能に連結するＦＶＩＩＩ ｃ ＤＮＡを含むＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏプラスミドが形質移入されたＥＳ細 胞を胚盤胞に微量注入し、それを仮母に移植する。約１７日後、キメラマウスを Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑育種し、子孫をＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝 子の存在について試験する。陽性子孫の交雑育種を行い、導入遺伝子がホモ接合 している系を生成した。これらのモデルを、ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含む ように改変されたミニＡｄベクターのイン・ビボ送達の試験に用いる。 図６０．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニッ クマウスの生成において用いられるＲＩＰ−ＥＧＦＰベクター。ＢＳプラスミド に由来するＲＩＰ−ｐＥＧＦＰの制限酵素マップが示される。このプラスミド（ ４８５５ｂｐ）は、ラットインシュリンプロモーターに作動可能に連結する緑色 蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コーディング領域を含む。このインシュリンプロモー ターは、膵臓組織におけるＧＦＰの発現の駆動のためにこの構築体において用い られた。 図６１．ＦＶＩＩＩカセットを含むエピソームミニアデノウイルスベクターの構 造。このミニＡｄベクターは、このウイルスベクターが標的細胞に侵入した後に 、エピソーム維持機構及びＦＶＩＩＩ発現カセットを含む環状プラスミド構造が 形成されるように設計される。このベクターの一般的な構造は以下の成分：（ａ ）組換え発現カセット；（ｂ）複製起点；（ｃ）ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ；（ ｄ）リコンビナーゼ標的部位；（ｅ）アデノウイルスＩＴＲ；及び（ｆ）スタフ ァー（Ｓｔｕｆｆｅｒ）ＤＮＡ配列を有する。 図６２．第１バージョンの抗癌性超Ａｄ（ｓｕｐｅｒ− Ａｄ）ベクターの一般的な構造。このウイルスベクターはＡｄヘルパーと癌抑制 及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超−Ａｄからなる。送達のた めに選択された遺伝子が図中に示される。 図６３．第２生成抗癌性超Ａｄベクターの一般的な構造。このウイルスベクター はＡｄヘルパーと癌抑制及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超Ａ ｄ−からなる。その一般的な構造はこれらのベクターの第１バージョンに類似す る。 図６４．ミニＡｄベクター及びヘルパーＡｄベクターの変種。Ａ．ミニＡｄベク ターの考えられる要素。Ｂ。ヘルパーＡｄベクターの考えられる要素。 発明の詳細な説明 本発明の目的は、１）導入遺伝子の発現を制御し、標的細胞ゲノムＤＮＡへの 外来性ＤＮＡの組み込みを助成し、及び／又はベクターを標的細胞内においてエ ピソーム形態で維持するための要素を含んでいてもよい約３７ｋｂまでの異種Ｄ ＮＡを挿入するための収容力を有する大容量アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（ “ミニＡｄ”ベクター）；２）このミニＡｄベクターの増殖を支持するように設 計され、且つ宿主産生細胞内でこのミニＡｄベクターがヘルパーＡｄベクターよ りも高い頻度でパッケージ化されるように操作されたパッケージ化シグナルを有 する同族ヘルパーＡｄベクター；及び３）ミニＡｄ ベクター及びヘルパーＡｄベクターの両者の増殖を支持するように設計されたヘ ルパー細胞系であって、ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を制御し、且つ ヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘル パー細胞系を提供するために、改変されたアデノウイルスベクターを提供するこ とである。 本発明は、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡのような治療用遺伝子をイン・ビボで標的組 織に送達することが可能なウイルスベクターの生成に有用な３つの成分を包含す る。これらの成分はヘルパーウイルス、ミニウイルスゲノム、及びヘルパー細胞 系からなる。ヘルパーウイルス及びヘルパー細胞系はミニウイルスゲノムを遺伝 子送達用のウイルス粒子内にパッケージ化するのに用いられる。この系を用いて 生成されるミニウイルスは、ヘルパーウイルスが誘導されたアデノウイルス株と 等しい向性及び宿主範囲を有する。 本発明は、さらに、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から誘導される要素を含め るためのミニＡｄベクターの改変を提供する。これらの要素は、宿主細胞ゲノム への遺伝物質の組み込みを促進する能力を有するものである。本発明においては 、宿主細胞ゲノムへのミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝子の 組み込みを促進するのにこれらの要素が用いられる。このようにして、遺伝子の 発現が従来のアデノウイルスベクターよりも長い期間宿主細胞において観察され る。 本発明は、さらに、ミニＡｄベクターであって、このベクターを宿主細胞内で エピソームとして維持して送達される遺伝子（１つ又は複数）の発現を長期化さ せるための要素を含むミニＡｄベクターを提供する。宿主細胞におけるＥ１欠失 ウイルスのウイルスゲノムの制限された複製には、複製が不可能であるゲノムと 比較して関心のある遺伝子がより長期間発現する余地があることが測定されてい る（８８）。アデノウイルスゲノムのＥ２領域を欠失させると、そのＥ２欠失ア デノウイルスベクターからの遺伝子の発現の複製及び持続が減少する。したがっ て、本発明の目的は、標的細胞におけるミニＡｄゲノムのＤＮＡ複製を容易にす る、正常な細胞ゲノムから誘導されるＤＮＡ配列又はそれと等価の配列を本発明 のミニＡｄベクターに組み込むことである。ＤＮＡの複製を容易にするような配 列の１つはアルフォイド（ａｌｐｈｏｉｄ）ＤＮＡである。アルフォイドＤＮＡ 反復の１６．２ｋｂ配列はＤＮＡ複製は可能にするが、そのＤＮＡの人工染色体 としての分離は許容しない。本発明には、この１６．２ｋｂ配列（７０−７２） のミニＡｄベクターへの組み込みの備えがある。したがって、これらの配列を含 むミニＡｄベクターの複製は、標的細胞内でのミニＡｄベクターＤＮＡの持続及 び関心のある遺伝子の発現を長期化させる。 本発明の改変ベクターを評価するための動物モデル試験系も提供される。本発 明によって提供される動物モデ ルには：１）ＡＡＶベースの組み込み機構を評価するためにそのゲノムにＡＡＶ Ｓ１配列が組み込まれているトランスジェニックマウス；及び２）そのゲノムに 挿入されている発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結するヒトＦＶ ＩＩＩ遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物が含まれる。この第２のモ デルにおいては、発生の過程でのそのトランスジェニック非ヒト動物におけるヒ トＦＶＩＩＩの一時的な発現の結果、その動物のヒトＦＶＩＩＩに対する寛容化 が生じる。この動物のヒトＦＶＩＩＩ遺伝子はひとたびその動物が成熟すると発 現せず、したがって、これらの動物へのヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の送達の評価が導 入遺伝子からのｈＦＶＩＩＩの発現により、又はｈＦＶＩＩＩに対する免疫応答 により複雑になることがない。したがって、このようにして、その動物による抗 −ｈＦＶＩＩＩ免疫応答によってもたらされる潜在的な複雑性が加わることなく 、ベクターによる遺伝子送達の効率を評価することができる。 本願においては、他に述べられない限り、用いられる技術は幾つかの公知の参 考文献のいずれかに見出すことができ、これらには：分子クローニング：実験マ ニュアル（Molecular Cloning:A Laboratovy Manual）（Sambrookら，1989，Col d Spring Harbor Laboratory Press）、遺伝子発現技術（Gene Expression Tech nology）（酵素学における方法（Methods in Enzymology），第185巻，D．Goedd el編，1991．Academic Press，San Diego，CA）、 ＰＣＲプロトコル：方法及び適用の手引（PCR Protocols:A Guide to Methods a nd Applications）（Innisら，1990．Academic Press，San Diego，CA）、動物 細胞の培養：基礎技術マニュアル（Culture of Animal Cells:A Manual of Basi c Technique）第２版（R.I．Freshney．1987．Liss，Inc．New York，NY），抗 体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）（Harlow及びLane．1 988．Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY）、タンパク質 生成の手引：酵素学における方法（Guide to Protein Purification Methods in Enzymology）第182巻（M.P．Deutscher編，Academic Press，San Diego，CA） 、酵素学における方法（Methods in Enzymology）第225巻（参考文献５７−６０ を参照）及び奇形癌腫及び胚性幹細胞−実用アプローチ（Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach）（Robertson，E.J.編，1987．I RL Press，Washington，D.C．；参考文献６１も参照）。 本願においては、転写調節領域又は転写制御領域は遺伝子の転写の調節に関わ るあらゆる核酸要素として定義され、これにはプロモーター、エンハンサー、サ イレンサー及びリプレッサーが含まれるがこれらに限定されるものではない。 ＤＮＡ断片は、あらゆる源から誘導される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのセグメン トとして定義される。 ＤＮＡ構築体は、あらゆる源から誘導されるプラスミ ド、ウイルス、自立的に複製する配列、ファージ又は一本鎖もしくは二本鎖ＤＮ ＡもしくはＲＮＡの直鎖セグメントとして定義される。 レポーター構築体は、検定可能な産生物をコードする遺伝子を含む染色体下の 精製ＤＮＡ分子として定義される。 検定可能な産生物は、検定を用いて検出可能である遺伝子によってコードされ るあらゆる産生物を含む。さらに、この検定可能な産生物の検出及び定量は、そ の遺伝子の発現の水準に直接比例するものと予想される。 組織特異的な方法で発現する遺伝子は、ある生物において１以上の第２の組織 とは対照的に１つの組織においてより多くの量の発現を示すものである。 エフェクター遺伝子は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現 により、生物、組織又は細胞に効果を及ぼすあらゆる遺伝として定義される。 異種ＤＮＡは、アデノウイルスゲノム以外の源から単離された、アデノウイル ス構築体に導入されるＤＮＡとして定義される。 導入遺伝子は、生物のゲノムに挿入されている、その生物のゲノムに通常存在 するもの以外の遺伝子として定義される。 組換えアデノウイルスベクターは、そのゲノムに少なくとも１つの異種ＤＮＡ のセグメントが含められているアデノウイルスとして定義される。アデノウイルス粒子は、野生型又は組換えの両者を含む感染性アデノウイルス として定義される。アデノウイルスにはアデノウイルスゲノム内にコードされる タンパク質外被によってキャプシドが形成されているＤＮＡ分子が含まれるが、 これに限定されるものではない。 組換えアデノウイルス粒子は、少なくともそのゲノムの一部に少なくとも１つ の他の源から誘導されるものを有し、アデノウイルス遺伝物質はもちろんアデノ ウイルス遺伝物質以外の遺伝物質をも含む感染性アデノウイルスとして定義され る。 安定な遺伝子の発現は、少なくとも７日を上回る期間宿主において一貫して検 出することができる遺伝子の発現として定義される。 治療可能な状態は、ある形態の治療の執行により変更することが可能な生物の 状態として定義され、この治療には通常医療起源のものであると定義される治療 が含まれるがこれに限定されるものではない。 抗原は、抗体が結合し、且つ免疫応答の活性化及び阻止もしくは抑制の両者を 含めて免疫応答を刺激することが可能なあらゆる分子をさらに含むことができる 分子として定義される。 腫瘍抑制遺伝子は、そのタンパク産生物の発現により、腫瘍の発生を抑制する 役目を果たす遺伝子として定義され、この抑制には成長の抑制又は細胞の死の誘 発が含まれるがこれらに限定されるものではない。成長抑制遺伝子は、そのタンパク産生物の発現により、細胞の成長を抑制する 役目を果たす遺伝子として定義される。 癌遺伝子は癌を引き起こす遺伝子として定義される。 免疫調節遺伝子は、その核酸もしくはタンパク産生物の発現により、免疫反応 を変更する役目を果たすあらゆる遺伝子として定義される。 リボザイムは、他の核酸分子を分解する能力を有するＲＮＡ分子として定義さ れる。遺伝的状態は、本願においては、少なくとも部分的には少なくとも１つの特定 の遺伝子の発現の結果である生物の状態として定義され、この特定の遺伝子には その遺伝子の野生型形態及びその遺伝子のあらゆる突然変異体形態が含まれるが それらに限定されるものではない。 発現カセットは、コーディング配列を含むＤＮＡ断片であって、このコーディ ング配列がコードされたタンパク質の適切な細胞型における発現に十分な転写調 節領域又は転写制御領域に作動可能に連結するレポーター又はエフェクターのも のであるＤＮＡ断片である。 １．ミニＡｄベクター系の基本概念 １．系の構成 ミニＡｄベクター系は３つの主要部分：１）パッケージ化弱力 化ヘルパーＡｄ；２）最少量のウイルスゲノムを有する同族Ａｄベクター；及び ３）２９３細胞と同様のＥ１トランス活性化の機能及び／又は ヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルの調節をもたらすＡｄヘルパー細胞系から なる。パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄは、自己複製に必要されるのはもちろん ミニＡｄベクターの複製のトランス補完にも必要とされるウイルス性遺伝物質を 含む。ヘルパーＡｄは、Ｅ１の欠失又は置換、及びヘルパーＡｄのパッケージ化 を本発明のミニＡｄベクターのパッケージ化に有利に制御又は区別するのに有用 な操作されたパッケージ化シグナルを除いて、野生型のＡｄ遺伝物質を保持する 。このミニＡｄベクターは、逆末端反復（ＩＴＲ）のみを含む最小Ａｄ遺伝物質 、並びにこのミニＡｄベクターの複製及びパッケージ化を促進する役割を果たす シス要素としての野生型パッケージ化シグナルを含む。このミニＡｄベクターの 残部は導入遺伝子、すなわち異種ＤＮＡを含む。本発明のＡｄヘルパー細胞系は 、Ａｄ Ｅ１遺伝子を含み、且つヘルパーＡｄの複製を支持するＡｄ Ｅ１遺伝 子産生物をもたらすという点で２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５３７）に類似 する。この細胞系は、さらに、ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化するための 制御機構を含んでいでもよい（図１）。 ２．系の作動機構 Ａｄのパッケージ化タンパク質は感染細胞内に少量存在す るトランス作動性因子であり、Ａｄのパッケージ化において速度制限因子として の役割を果たす。本発明のミニＡｄベクターによって処理された野生型パッケー ジ化シグナルはヘルパーＡｄの操作さ れたパッケージ化シグナルよりも高い親和性でパッケージ化タンパク質によって 認識されるため、ヘルパーＡｄ遺伝物質のパッケージ化はこのミニＡｄベクター の存在下において部分的に、もしくは完全に抑制される。その結果、ミニＡｄベ クターの優先的なパッケージ化が生じる。ミニＡｄベクターを高力価で複製及び パッケージ化するため、ウイルスＤＮＡの複製のためのタンパク質及びキャプシ ド組み立てのためのタンパク質が適度の量でもたらされなければならない。これ らのタンパク質は幾つかの異なる源からもたらすことができ、これらの源には細 胞系又はウイルスが含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明の好ま しい態様においては、これらのタンパク質はヘルパーＡｄによってもたらされる 。本発明では、多量のＡｄ構造タンパク質をミニＡｄベクターが利用可能である ように、ヘルパーＡｄがヘルパー細胞内でそれ自体を複製する点において完全に 機能的なままであることが考慮される。ミニＡｄベクターが存在しない状況にお いて、パッケージ化の弱力化の選択圧なしで、徐々に、又は非効率的にではある が、ヘルパーＡｄはパッケージ化される。ミニＡｄベクターの複数のコピーを生 成するため、ミニＡｄベクターＤＮＡの増幅にウイルスＤＮＡ複製タンパク質も 必要である。本発明の好ましい態様においては、これらのタンパク質はヘルパー Ａｄによってもたらされる。野生型パッケージ化シグナルを含むミニＡｄベクタ ーは、感染性複製適格Ａｄ粒 子としてＡｄビリオンにパッケージ化される。対照的に、ヘルパーＡｄ ＤＮＡ は操作されたパッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク質の乏しい認 識又は低親和性により競合で排除され、そのためヘルパー細胞内で完全に、又は 部分的に遊離したままである。このヘルパーＡｄのパッケージ化の弱力化及びミ ニＡｄベクターのパッケージ化の選択により、本発明の系はミニＡｄベクターの 優先的な増殖を生じる。この系を用いて生成されたミニＡｄベクターは少量のヘ ルパーＡｄで汚染される可能性があり、したがって、このミニＡｄ粒子調製品は １００％純粋ではない可能性がある。必要であれば、汚染されているヘルパーＡ ｄを生物学的、生化学的、又は物理的方法を用いて除去することができ、これら の方法にはＣｓＣｌ勾配を通す超遠心が含まれるがこれに限定されるものではな い。 ３．系の収容力 本発明のミニＡｄベクター系の３つの主な特徴は、それを独 自の、洗練された、現在当業者が利用可能なＡｄベクターより大きく進歩したも のにする（図２）。これらの特徴には以下のものが含まれるがこれらに限定され るものではない：１）このミニＡｄベクターは最小の免疫原性を示す；２）粉の ミニＡｄベクターは現実には複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）を生成すること ができない；及び３）このミニＡｄベクターは従来のＡｄベクターよりも非常に 大きな異種ＤＮＡセグメントを含むことができる。免疫原性及びＲＣＡ生成 の低下（遺伝子治療の分野における主な安全性上の関心）は、このミニＡｄベク ターが最少量のウイルスシス要素（ＩＴＲ及びパッケージ化シグナル）のみを坦 持し、それだけではＡｄタンパク質をコードしないために可能となる。このため 、現在利用可能なＡｄベクターの免疫原性及び細胞毒性の主な源は大部分が除去 されている。したがって、通常宿主細胞内又はその細胞表面上でのＡｄウイルス タンパク質の発現から生じる細胞毒性、炎症性、及び免疫原性応答が減少する。 本発明のミニＡｄベクターは、さらに、従来のＡｄベクターよりも異種ＤＮＡ の収容力が増大している。野生型Ａｄは３６ｋｂの平均ゲノムサイズを有する。 Ａｄの最大パッケージ化収容力はそのゲノムの約１０５％、すなわち、約３８ｋ ｂである。本発明のミニＡｄベクターは１ｋｂ未満のＡｄ遺伝物質を含むことが できる；したがって、このミニＡｄベクターの異種ＤＮＡの収容力は３７ｋｂで あり得る。異種ＤＮＡには導入遺伝子発現カセット、調節要素、又はレポーター もしくはエフェクター遺伝子に作動可能に連結する転写制御領域が含まれ得るが 、これらに限定されるものではない。発現カセットには単一又は複数の発現カセ ットが含まれ得るがこれらに限定されるものではない。調節要素には導入遺伝子 の保持、組み込み、転写、及び／又はベクターターゲティングを制御するための ＤＮＡ配列が含まれるがこれらに限定されるものではない。４．パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ ａ．ヘルパーの原型構造 このヘルパーＡｄベクターは、操作されたパッケー ジ化シグナル及び変更されたＥ１遺伝子を有する野生型Ａｄゲノムを含む。安全 性の理由から、ヘルパーＡｄは現在利用可能なＥ１欠失もしくは置換ウイルス構 築体のように複製が不完全でなければならない。ミニＡｄベクターの存在下にお いてパッケージ化を制御するため、このヘルパーはパッケージ化も不完全でなけ ればならない（以下に詳述）。したがって、このヘルパーの一般構造は、Ｅ１領 域及びパッケージ化シグナルが操作されていることを除いて野生型ゲノムを有す るＡｄベクターとして要約することができる。しかしながら、Ｅ２及びＥ４のよ うな他の必須調節遺伝子を操作することも可能である。ウイルスゲノムは、ヘル パーＡｄの複製適格性をさらに無効とするため、又はＣｓＣｌ勾配を通す超遠心 を含むがこれに限定されるものではない生物学的、生化学的、もしくは物理的方 法を用いてミニＡｄベクターから分離するためにヘルパーＡｄのゲノムサイズを 減少させるため、断片に分割することができる。ヘルパーＡｄの力価が大きな影 響を受けない限り、ヘルパーＡｄのウイルス複製の不全及びパッケージ化の弱力 化の両者をヘルパーＡｄの設計に含めることができる。 ｂ．ヘルパーＡｄの一般的な機能 ヘルパーＡｄの主要機能はミニＡｄベクタ ーのパッケージ化に必要なキャ プシドタンパク質を供給することである。このタンパク質を提供するため、ヘル パーＡｄは、野生型Ａｄより効率が劣るとしても、宿主細胞内で複製可能でなけ ればならない。好ましくは、ヘルパーのゲノムの複製及び転写は影響を受けない 。ヘルパーＡｄゲノムの合成が阻害される場合、後期遺伝子産生物（キャプシド タンパク質）の収量が変化し、ミニＡｄベクターの力価に悪影響を及ぼし得る（ すなわち、力価が低下する）。特定の用途については、ミニＡｄからのヘルパー Ａｄの除去が不必要であることがある。このような状況においては、ヘルパーＡ ｄのパッケージ化弱力化の厳密性は大きく低下し得る。 ｃ．パッケージ化弱力化の設計 ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化する目 的は、ミニＡｄベクターの調製品におけるヘルパーＡｄ汚染の可能性を減少させ ることである。これは、特定の用途に比較的純粋なミニＡｄベクターのバッチが 必要とされる場合に特に重要である。ヘルパーＡｄのパッケージ化機能は、ミニ Ａｄベクターが存在しない状況においてはヘルパーＡｄが徐々にではあっても増 殖することが可能でなければならないため、不完全ではあるが完全に無効ではな いように設計される。以下の遺伝子操作をパッケージ化弱力化ヘルパーＡｄの生 成に用いることができる。 １．パッケージ化シグナルの突然変異 Ａｄ５パッケージ化シグナルは機能的 に縮退した反復要素を含んでな る（１８）。このパッケージ化シグナル要素を部分的に欠失させることにより、 変異体Ａｄの収量が野生型パッケージ化シグナルを有するＡｄと比較して数倍か ら約１００倍減少することが示されている（１８）。したがって、本発明のパッ ケージ化シグナル突然変異の設計には、野生型Ａｄパッケージ化シグナルからの 共通アデノシン富化モチーフ（例えば、“Ａ反復”：ＴＡＡＡＴＴＴＧ；図３） の部分的欠失を取り込むことができる。 ２．合成パッケージ化シグナル Ａｄ５パッケージ化シグナルが共通Ａ（アデ ノシン）富化モチーフ（例えば、Ａ反復：ＴＡＡＡＴＴＴＧ）を有するため、選 択されたＡ−反復又は人工パッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク 質の親和性を変更することが可能なあらゆる合成ＤＮＡモチーフを含むがこれら に限定されるものではない直列反復の組み込み。 ３．パッケージ化シグナルの妨害 Ａｄパッケージ化シグナルは、パッケージ 化タンパク質によって認識され、且つそれと結合する特異的ＤＮＡ配列である。 このシグナルへのパッケージ化タンパク質の有効な結合を妨害するため、ヘルパ ーＡｄパッケージ化シグナルのＡ反復列の近位又はその内部に他のＤＮＡ配列を 配置することができる。挿入されたＤＮＡはそれらの同族ＤＮＡ結合タンパク質 による結合を可能にし、この同族ＤＮＡ結合タンパク質はＡｄパッケージ化シグ ナルへのＡｄパッケージ化タンパク質の結合を位置的に競合して排除すること が可能なものである。 ４．パッケージ化シグナルの再配置 野生型Ａｄパッケージ化シグナルは野生 型Ａｄゲノムの左端に位置する。研究者らはこのパッケージ化シグナルが右端に 位置してその機能を保持し得ることを見出しており（７５）、これはパッケージ 化シグナルを再配置することができることを示す。操作されたパッケージ化シグ ナルを野生型以外の位置に配置することは、ヘルパーＡｄのパッケージ化効率を さらに弱力化するのに有用である可能性がある。加えて、Ａｄゲノムの別の領域 へのパッケージ化シグナルの再配置は、ヘルパーＡｄの加工されたパッケージ化 シグナルとミニＡｄベクターの野生型パッケージ化シグナルとの間の相同組換え によるヘルパーＡｄの野生型Ａｄの回帰（すなわち、ＲＣＡの生成）の可能性を 最小にする助けとなり得る。 ５．さらなる可能性 ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化してミニＡｄベク ターの調製に対するヘルパーの汚染を最小にするため、２つの因子を考慮するこ とができる：シス要素及びトランス作動性因子。したがって、他の可能性のある 設計はこれらの２つの因子のいずれか、もしくは両者の操作を指向する。操作す ることができるシス要素の例はＡ反復モチーフである。操作することができるト ランス作動性因子の例はパッケージ化タンパク質である。その系によるミニＡｄ ベクターの高力価産生量を犠牲にすることなくパッケージ化を制御することが できる機構をさらに考慮すべきである。 ＩＩ．ミニＡｄベクター Ａ．ミニＡｄベクターの基本構造 ＡｄベクターはＡｄ ＩＴＲの融合による 環化プラスミドとして用いることができる（５４）。本発明のミニＡｄベクター の最も単純なプラスミド形態は、（野生型パッケージ化シグナルを有するＡｄ ＩＴＲを含む）ＩＴＲ融合配列、プラスミドＤＮＡ複製起点、及び１つもしくは 複数の制限酵素部位からなるポリクローン化部位を含む環状ＤＮＡ分子である。 ＩＴＲ融合配列は、野生型Ａｄの左端、好ましくはマップ単位０乃至１、及び右 端、好ましくはマップ単位９９乃至１００を含む。Ａｄ ＤＮＡ複製基点は各々 のＩＴＲ内に位置し、野生型パッケージ化シグナルは左ＩＴＲに隣接して位置す る。 Ｂ．ミニＡｄベクターの構造的及び機能的可能性 以下に記載され、且つ図７ Ｂに示されるものを含むがこれらに限定されるものではない他のＤＮＡ配列及び 要素をミニＡｄベクターに含めることができる。 １．導入遺伝子の発現カセット 発現カセットは基本的な転写単位である。所 定の遺伝子の単純な発現カセットは、一般に、転写制御領域、関心のある遺伝子 （すなわち、異種ＤＮＡ、インサートＤＮＡ）、及びポリアデニル化（ポリＡ） シグナルを含む。発現カセット内には、２以上の遺伝子を、これらの遺伝子の間 にＲＮＡの転写 もしくはスプライシングのためのさらなる要素がもたらされている限り、二もし くは多シストロン単位として含めることができる。一般に、ミニＡｄベクターは １つもしくは複数の発現カセットを含む。 ２．ベクターＤＮＡ保持のための機能的要素 標的細胞ゲノムへの発現カセッ トの組み込みを助成し得る（すなわち、ＡＡＶ組み込み要素）又は宿主細胞にお いてミニＡｄベクターをエピソーム形態として維持する要素。組み込みを助成す ることが示されている要素はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の逆末端反復（ＩＴ Ｒ）及びＲｅｐ７８／６８タンパク質である。ＡＡＶは、これらの要素を、ヒト 染色体１９（１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒ）のＡＡＶＳ１と命名された部位へのそ のゲノムの特異的組み込みを達成するのに用いる。 ＡＡＶは遺伝子治療のための候補ベクターとして考えられているが、幾つかの 制限が研究者によって同定されている。ＡＡＶは：１）外来性ＤＮＡに対する低 収容力（４．３ｋｂ）；２）大規模調製における高力価の達成の困難性；及び３ ）組換えＡＡＶの特異的組換えの喪失により制限される。これらの各々は、当業 者にとって困難な挑戦であることが立証されている。本発明は、ＡＡＶ−ＩＴＲ 配列及びＲｅｐ７８／６８発現カセット（Ｒｅｐ発現カセット）をベクターに組 み込むことにより、ミニＡｄベクターの利点をＡＡＶの組み込み収容力と組み合 わせる。 同様にミニＡｄゲノムに含めることができる機構には染色体外複製配列（７０ ）が含まれる。染色体又はウイルス配列のいずれかを含んでなるこのような配列 は、ベクターが哺乳動物細胞内で効率的に複製し、且つ保持されることを可能に する役割を果たす。これらの配列は、ヒトゲノムＤＮＡのような複製成分及び／ 又は保持成分、例えば、ヒトセントロメア配列もしくはｏｒｉＰ族の反復及び／ 又はＥＢＮＡ−１のようなエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）から誘導され る配列を含むことができる（７０）。ヒトゲノムＤＮＡはテロメア及び／又はア ルフォイドＤＮＡを含むことができる（７０）。このような要素をミニＡｄベク ターに含めることにより、ミニＡｄゲノムが宿主細胞においてより高いコピー数 に複製し、それによりミニＡｄゲノムがヘルパーウイルスより高い効率でパッケ ージ化される可能性が増加する。加えて、これらの配列は、宿主細胞内でのエフ ェクター又はレポーター遺伝子の発現の持続を長期化する役割を果たす。このよ うな機能は遺伝子治療へのミニＡｄベクターの使用において有用である。 ３．ＤＮＡの転写を制御するための調節要素 エンハンサー、リプレッサー、 活性化因子結合部位、イントロン、及び５’もしくは３’非翻訳領域を含むがこ れらに限定されるものではない転写調節機能を有する要素。 ４．ベクター及び導入遺伝子ターゲティングのための要素 ターゲティングは 幾つかの方法で達成することが でき、この方法にはベクター表面修飾及び組織特異的発現が含まれるがこれらに 制限されるものではない。特定の細胞型又は組織における遺伝子の発現を駆動さ せるのに組織特異的プロモーターを用いることができる。 ５．さらなる支持要素 これらには原核細胞もしくは真核細胞のＤＮＡ複製起 点、プラスミドもしくはベクター選択マーカー、及びベクター主鎖が含まれ得る が、これらに限定されるものではない。 Ｃ．ミニＡｄベクターの高力価生成の設計 ミニＡｄベクターの高力価生成は 本発明の別の主要な側面である。他のウイルスベクターを上回るＡｄベクターの 利点の１つは、Ａｄ粒子が高力価調製品保存物の調製に貢献することである（６ ７）。ＡＤの高力価増殖は、主として、感染の間に２９３細胞のような宿主細胞 内に生じる多量のウイルスキャプシドタンパク質及びウイルスゲノムコピーのた めに可能である。以下に記載されるものは、高力価ミニＡｄベクターの生成方法 の設計において考慮することができる因子の幾つかである。 １．増強されたＤＮＡの複製 ＡｄはＤＮＡ複製のためのそれ自体の酵素系を 有する。Ｅ２領域タンパク質がウイルスＤＮＡの複製を生じる主要トランス作動 性要素である。複製起点はウイルスゲノムのいずれかの端部又は両端に位置する シス要素である。ミニＡｄゲノムの複製を支持するため、十分な量のＥ２タンパ ク質がヘルパーウイルスによってもたらされなければならない。ヘル パーウイルスゲノムを適切に設計することにより、（ＡｄのＥ２領域内でコード される）Ｅ２タンパク質の高水準の発現が保証される。ミニＡｄゲノムのコピー 数を増加させるための他のこのような機構を考慮することもできる。このような 機構には、ミニＡｄゲノムにＳＶ４０のＤＮＡ複製起点（５４）を挿入し、ヘル パー細胞におけるＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ発現と同時にミニＡｄのコピー数を増加さ せることが含まれるが、これに限定されるものではない。 ２．増強されたパッケージ化シグナル より多数の、又はより効率的なパッケ ージ化配列を、例えば、ミニＡｄゲノムの一端もしくは両端により多数の直列配 列を組み込むことにより、又は野生型パッケージ化シグナルより効率的な様式で 機能する１つもしくは複数の合成パッケージ化シグナルを組み込むことにより用 いることができる。 ３．増強されたパッケージ化プロセス Ａｄのパッケージ化プロセス及び機構 は当業者によって未だに完全に理解されているわけではない。Ａｄのパッケージ 化シグナル以外のＤＮＡ結合タンパク質がパッケージ化に対して相乗的な役割を 有しているかどうかは明確ではない。“パッケージ化の足場”と呼ばれ、且つＡ ｄゲノム内に天然に存在する、ＤＮＡ結合タンパク質が親和性を示す配列をミニ Ａｄベクターに組み込むことができる。 Ｄ．Ａｄヘルパー細胞系 １．Ａｄヘルパー細胞の基本要素及び一般的機能 （宿主細胞としての役割を果たす）本発明の細胞系は、従来用いられる細胞系２ ９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）を改善する幾つかの重要な改変を提供する。 好ましい態様において、宿主細胞は、ヘルパーＡｄゲノムの転写プログラムをト ランス活性化するためのＡｄ−Ｅ１断片をコードする核酸配列を含む（図１）。 現在当業者に利用可能な２９３細胞のＥ１断片とは異なって独自に、本発明の細 胞系はヘルパーＡｄゲノムと重複する核酸配列を持たないＥ１断片をコードする 核酸配列を含むことができる。したがって、本発明は、Ａｄベクターに関連する 現在の困難の１つ：相同組換えによる野生型Ａｄ、すなわち複製適格Ａｄ（ＲＣ Ａ）の生成を排除する。他の要素にはミニＡｄベクターの高コピー数生成の支持 、ミニＡｄベクターのパッケージ化の増強、及び／又はヘルパーＡｄのパッケー ジ化の弱力化に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない 。 ２．ヘルパーＡｄのパッケージ化弱力化のための補助機構 ヘルパーＡｄのパ ッケージ化を弱力化する他の方法には、ヘルパーＡｄゲノム内のパッケージ化タ ンパク質結合部位の近傍に異なるタンパク質の結合部位を配置することによりパ ッケージ化タンパク質の結合部位を妨害することが含まれ得る。このような系に はテトラサイクリン−リプレッサー（Ｔｅｔ−Ｒ）、リコンビナーゼ、及び／又 は変更されたパッケージ化タンパク質の使用が 含まれ得るが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、こ の異なるタンパク質は宿主細胞内で発現する。Ｔｅｔ−Ｒは、Ｔｅｔ−Ｒの結合 部位、ｔｅｔ−オペロン（Ｔｅｔ−Ｏ）を含むヘルパーウイルスの操作されたパ ッケージ化シグナルに結合し、それにより、パッケージ化タンパク質の結合を阻 害することでパッケージ化を抑制することが可能である。Ｔｅｔ−ＲのＴｅｔ− Ｏへの結合はテトラサイクリンによって制御される。細胞培養培地にテトラサイ クリンを添加することによりＴｅｔ−Ｒへのテトラサイクリンの結合が生じ、そ れがｔｅｔ−Ｏに結合することを妨げる。テトラサイクリンを除去することによ りＴｅｔ−Ｒは加工されたパッケージ化シグナルへの結合について自由になり、 ヘルパーウイルスのパッケージ化をさらに弱力化する役割を果たす。 Ｃｒｅ又はＦｌｐのようなリコンビナーゼの発現も、ヘルパーウイルスのパッ ケージ化シグナルにそれぞれｌｏｘ−ｐ又はＦＲＰのような組換え部位が隣接す るのであれば、パッケージ化を阻害することが可能である（６６、６８）。ヘル パーウイルスの複製をさらに弱力化するため、ヘルパーウイルスゲノム内の他の 遺伝的改変を上に記載されるものとは別に、又はそれに加えて提供することもで きる。 幾つかの方法のいずれかによりパッケージ化タンパク質を変更することが可能 であり、これらの方法には、Ａ ｄの特定のパッケージ化タンパク質が同定されるという条件の下でミニＡｄのパ ッケージ化をヘルパーＡｄと区別するのにパッケージ化シグナルが異なる特定の 血清型又は種を用いることが含まれるがこれに限定されるものではない。加えて 、パッケージ化タンパク質は、そのパッケージ化タンパク質をコードする遺伝子 を遺伝的に改変することにより変更することができる。この改変は、そのパッケ ージ化タンパク質を野生型パッケージ化シグナルに対するその結合が増大するよ うに変更するものであってもよい。それにより、その改変されたパッケージ化タ ンパク質はミニＡｄゲノムの好ましいパッケージ化をさらに提供し得る。 ３．ミニＡｄベクターの高力価生成のための補助機構 宿主細胞内でのミニＡＤゲノムのコピー数が増加するように設計されたミニＡ ｄベクターの改変は、高力価ミニＡｄベクターの開発において有用である。宿主 細胞によるＳＶ４０Ｔ−Ａｇ（形質転換活性を持たない変異Ｔ−Ａｇ）の発現は 、ＳＶ４０ ＤＮＡ複製起点がミニＡｄプラスミドベクターに組み込まれている 場合、ミニＡｄゲノムのコピー数を増加させ得る。 ＩＶ．本発明の潜在的な用途 ａ．遺伝病の治療のためのイン・ビボでの遺伝子の送達 大きな治療用遺伝子 又は複数の遺伝はもちろん、制御可能な、もしくは組織特異的な発現を決定し、 且つよ り有効な治療上の効果を生じ得る、主要治療用遺伝子に伴う調節要素及び／又は 他の関連遺伝子の送達に大きな収容力が必要である。例には、嚢胞性線維症の遺 伝子治療の最適化に幾つかの遺伝子の制御可能な発現を必要とする嚢胞性線維症 が含まれるが、これに限定されるものではない。デュシェンヌ型筋ジストロフィ ー（ＤＭＤ）の遺伝子治療が、その治療に大容量ベクターが必要とされる状態の 別の例である。この疾患を治療するには、完全な生理学的効果をもたらして患者 の筋肉機能を回復させるため、筋肉及び神経成長因子を含むがこれらに限定され るものではない遺伝子を同時送達することが必要となり得る。 ｂ．ベクターの腫瘍内注射による宿主の抗癌性免疫の誘発 Ａｄベクターは、 培養腫瘍細胞及びイン・ビボでの異なる型の固形腫瘍モデルにおいて高水準の感 染性を示す。Ａｄベクターのこの特徴は癌の治療において用いられている。治療 の効率はベクターによって送達される遺伝子に依存する。腫瘍抑制及び免疫調節 の機能を併せ持つものを含むがこれに限定されるものではない複数の遺伝子が抗 癌効果の最適化に用いられる。このミニＡｄベクターは複数の遺伝子を送達する 能力を有し、腫瘍内注射のための抗癌性Ａｄベクターの構築に有用である。 ｃ．移植細胞又は組織の遺伝的改変による宿主の免疫の調節 移植には宿主の 免疫の一時的な、又は恒久的な抑制が必要である。移植細胞又は移植組織を含む がこれ らに限定されるものではない細胞又は組織に免疫抑制遺伝子を送達することが、 免疫抑制剤の投与に代わるアプローチであり得る。本発明において用いられる免 疫抑制タンパク質をコードする遺伝子の例には、本発明のミニＡｄベクターによ って単独で、又は組み合わせて送達することが可能なＴＧＦｂ、ＩＬ−１０、ウ イルスタンパク質ＨＳＶ−ＩＣＰ４７及びＣＭＶ−ＵＳ１１、並びに分泌性Ｆａ ｓリガンドタンパク質が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。 ｄ．遺伝的改変によるイン・ビボでの標的細胞機能の改変又は標的細胞の成長 の調節 Ａｄベクターは高力価の貯蔵物を生成することが可能であるという点で 他のウイルスベクターを上回る別の利点を有しており、これはイン・ビボ遺伝子 治療において有用である。ミニＡｄベクターは最少量のＡｄゲノムのシス要素の みを含むため、ミニＡｄの免疫原性は最小化されている。したがって、ミニＡｄ ベクターは、遺伝的改変によるイン・ビボでの標的細胞の機能の改変又は標的細 胞の成長の調節に有用である。 ｅ．ベクターの表面修飾によるイン・ビボでの標的細胞又は組織への導入遺伝 子の特異的送達 アデノウイルスのヘキソン及び腺維タンパク質をコードする遺 伝子を、標的細胞表面上に存在する特定のエピトープ又はリガンド（例えば、Ｉ ｇＧのＦｃ断片に結合するプロテインＡ）と融合するように加工する。これらの 改変遺伝子を、標 的細胞表面に対するターゲティング作用因子として作用するリガンドと相互作用 する表面部位を有するウイルスを生成するため、組換えウイルスゲノムに組み込 む。これにより、生成したウイルス粒子は組織又は細胞認識能を有する。 ｆ．直接イン・ビボアプローチによるＡｄ介在ワクチン接種への使用 ワクチ ン接種の目的に、Ｅ１置換Ａｄベクターの免疫原性は利益をもたらす可能性があ り、Ａｄベースの組換えベクターの開発において用いられている。この型の用途 において用いられるミニＡｄベクターは、Ｅ１置換Ａｄベクターを含むがこれに 限定されるものではないヘルパーウイルスはもちろんのこと、免疫をもたらす抗 原及び免疫源をコードする遺伝子の同時送達を用いる。 ｇ．エキソ・ビボ遺伝子送達への使用 従来のＡｄベクターの使用に関連する 一時的な遺伝子の保持及び発現は、Ａｄがエキソ・ビボ送達プロトコルにおいて 広く用いられることを妨げている。ＤＮＡ保持機構を有するこのミニＡｄベクタ ーはこの目的に有用である。さらに、培養細胞系におけるＡｄの高い感染性が、 このミニＡｄベクターを遺伝子治療に対するエキソ・ビボアプローチにとって非 常に有効な遺伝子送達系にしている。 ｈ．アデノウイルス学の基本的な研究及び開発並びに新規ベクターの構築のた めの手段としての使用 ミニＡｄベクター系それ自体は基本的なアデノウイルス 学の研 究にとって高い価値を有する。その構築と実施可能性及び作動の立証は既に当該 分野における大きな進歩である。このヘルパーＡｄ及びミニＡｄは、Ａｄ及びそ の潜在的な用途を研究するのに好都合の手段を提供する。これはミニＡｄベクタ ーについて特に言えることである。ミニＡｄの複製、パッケージ化、及び増殖効 率の特徴は、従来入手することができなかった重要な新しい情報を備える場を提 供する。 ｉ．遺伝子伝達及び治療の分野における他の方法論と組み合わせての使用 Ａ ｄベクターはポリリジン、リポソーム、及び他の結合物質と共に遺伝子送達複合 体として用いられている。このミニＡｄベクターも、これらの化合物はもちろん のこと、遺伝子送達複合体としての役目を果たす能力を有する他の化合物と共に 用いることができる。 ｊ．遺伝子伝達及び治療の分野における他の目的での使用 このミニＡｄベク ター系は、上に論じられているものに加えて、遺伝子伝達及び治療に用いられる 大きな潜在性を有している。この可能性は遺伝子伝達及び治療の分野のさらなる 開発に沿って理解されるであろう。 ＩＶ．肝臓関連疾患の治療のためのミニＡｄベクター アデノウイルスの静脈内注射の後、９０％を上回るウイルス粒子が肝臓に局在 する。ウイルス粒子の投与の後にアデノウイルス遺伝子又はアデノウイルスベク ターの 導入遺伝子の発現が観察されるのは肝臓においてである。 本発明は、レポーター又はエフェクター遺伝子の発現を駆動することが可能な転 写調節遺伝子、すなわちプロモーターを改変され、且つ大きく改善されたアデノ ウイルスベクターと組み合わせて用いて、遺伝子の発現を肝臓に向けるための方 法論を包含する。当業者は、肝臓における異常な遺伝子又は遺伝子の遺伝子産生 物の発現によって引き起こされる多くの疾患を思い描くことができる。異常な遺 伝子又は遺伝子産生物の発現は肝臓に通常見出されるものを上回り、又は下回る 水準の発現を含むことがあり、それは、遺伝子転写の構造もしくは機能の遺伝子 欠失、複製、挿入、もしくは変化、又は遺伝子それ自体もしくはそのタンパク産 生物のいずれかの他の変更の結果であり得る。また、異常な遺伝子又は遺伝子産 生物の発現は、それぞれ、遺伝子及び遺伝子産生物の転写又は翻訳の上で機構的 に調節する発現の変化からも生じ得る。 治療用又はレポーター遺伝子を肝臓に送達するためのベクターは本発明の重要 な利点を含んでいる。肝臓における遺伝子又はタンパク質のいずれかの発現の欠 陥に基づく多数の疾患の治療に本発明を用いることができることを当業者は理解 するであろう。本発明を用いて治療又は利用することができる疾患及び遺伝子の 例がそれぞれ表1にまとめられている。加えて、これらの遺伝子全てのプロモー ターが、肝臓における遺伝子又は遺伝子産生物 の発現を駆動する目的で肝臓における遺伝子の発現の駆動に有用であることが判 明する。 *表１は参考文献５５からのデータ及び情報を含んでなる。 本発明のさらに別の態様は、本発明のミニＡｄベクターを含む医薬組成物を包 含する。この医薬組成物は固体形態（顆粒、粉末又は座剤を含む）又は液体形態 （例えば、溶液、懸濁液、又はエマルジョン）で製造することができる。経口投 与のための固体投与形態にはカプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒が含まれ得 る。経口投与のための液体投与形態には、当該技術分野において一般に用いられ る不活性希釈剤、例えば水を含む、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸 濁液、シロップ及びエリキシルが含まれ得る。このような組成物は、湿潤剤、甘 味料、調味料、香料のような添加剤を含んでいてもよい。本発明の化合物は無機 又は有機酸から誘導される塩の形態で用いることができる。 本発明のベクターは単独の活性医薬組成物として投与することができるが、本 発明の１以上のベクター又は他の薬剤と組み合わせて用いることも可能である。 組み合わせとして投与する場合、治療剤は同時に、もしくは異なる時期に投与さ れる別々の組成物として処方することも、単一の組成物として投与することもで きる。 ＩＶ． ＦＶＩＩＩ活性を置換するためのミニＡｄベクター ＦＶＩＩＩ遺伝子を含むＥ１置換アデノウイルスベク ターが宿主動物における治療水準のＦＶＩＩＩの発現の達成に用いられている（ １３）。しかしながら、アデノウイルスベクターを遺伝子治療に用いることを試 みている研究者は幾つかの困難に遭遇している。本発明は、以下に説明されるよ うに、これらの問題の多くの解決法を提供する。 Ａｄ ＤＮＡ複製及びパッケージ化の必須シス作動性要素がウイルスゲノムの 端部に位置するため（ＩＴＲに加えてパッケージ化シグナル、１ｋｂ未満）、ミ ニＡｄベクターの主鎖はこの必須シス要素のみを含むように改変されている。ミ ニＡｄゲノムの残部は、その約３８ｋｂのパッケージ化限界まで、異種ＤＮＡを 含むことが可能である。本発明においては、この異種ＤＮＡはヒトＦＶＩＩＩに 類似する活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。ＦＶＩＩＩは通 常肝臓において生成し、発生期ポリペプチドのアミノ末端から誘導される９２ｋ Ｄａ乃至２１０ｋＤａの見かけの分子量範囲を有する重鎖ポリペプチド及び８０ ｋＤａのＣ末端軽鎖を含む（５３）。その活性化形態は、血液凝固カスケードに おいて活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、負に荷電したリン脂質及びカルシウムイ オンと共に補因子として作用し、第Ｘ因子をその活性化形態、Ｘａに変換する。 ヒトｃＤＮＡは９ｋｂの長さであり、幾つかのドメインをＡｌ、Ａ２、Ｂ、Ａ３ 、Ｃ１及びＣ２の順で含んでなる２３５１アミノ酸のポリペプチドをコードする （５−７）。Ａ 及びＣドメインは機能的活性に重要であり、これに対して約９８０アミノ酸から なるＢドメインの大部分は活性には不必要である（８）。本発明は、ＦＶＩＩＩ 様活性を有するミニＡｄベクターの例として、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含むミニ Ａｄベクターを提供する。ＦＶＩＩＩ様活性（すなわち、第Ｘ因子のその活性化 形態Ｘａへの変換において補因子として作用する能力）を有するタンパク質をコ ードする遺伝物質を含むミニＡｄベクターが本発明に包含されることは当業者に よって理解されるはずである。 本発明のＦＶＩＩＩミニＡｄは、ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡはもちろんのこと 、宿主細胞ゲノムへの遺伝子の組み込み及び宿主細胞内でのヒトＦＶＩＩＩの発 現を支持するＤＮＡ要素（すなわち、異種組換えアーム、ＡＡＶ／ＩＴＲ配列、 及び転写制御領域）をも含む。ＤＮＡの複製及びＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの キャプシド形成に必要なウイルスタンパク質はヘルパーＡｄ（トランス補完）か らトランスでもたらされる。ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの比較的純粋な調製品 をウイルス粒子として生成するため、そのパッケージ化シグナルの改変によりヘ ルパーＡｄゲノムのパッケージ化が弱毒化されている。これは、ヘルパー細胞系 におけるＦＶＩＩＩミニＡｄベクターゲノムの優先的なパッケージ化を斟酌する 。 態様の１つにおいて、このＦＶＩＩＩミニＡｄは部位特異的組み込み機構を含 む。この機構は、ヒト組み込み 配列（ＡＡＶＳ１部位）に標的設定された異種組換え配列又はＡＡＶ／ＩＴＲを 含むことができる。この組み込み機構を試験するためには、ＡＡＶＳ１部位をマ ウスゲノムに移さなければならない。これを伴う方法の１つは、胚幹細胞形質転 換のような遺伝子導入技術を用いることにより、又はＡＡＶＳ１部位を含む導入 遺伝子をマウス単細胞卵子の雄性前核に直接ＤＮＡを注射することにより達成す ることができる（５７−６０）。このような方法論によって開発されたトランス ジェニックマウスをミニＡｄベクターの組み込み効率及び特異性の試験に用いる ことができる。 本発明のさらなる態様は、宿主動物体内で生じ得る潜在的な抗−ヒトＦＶＩＩ Ｉ免疫応答に取り組む。このような免疫応答は、ミニＡｄベクターの利用又はこ のベクターの効率の分析を妨害する可能性がある。ミニＡｄベクターが送達され 、且つマウス体内でのヒトＦＶＩＩＩの発現を駆動するため、処置マウスの免疫 応答がＦＶＩＩＩの発現の持続及び水準の評価を複雑にする可能性がある。これ らの、及び他の理由から、ＦＶＩＩＩ不全トランスジェニックマウスモデルが本 発明によって提供される。ミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝 子が移入され、その結果そのレポーター又はエフェクター遺伝子の遺伝子産生物 に対して寛容である非ヒトトランスジェニック動物を本発明が包含することは理 解されるであろう。 上述のトランスジェニックマウスの各々の例が本発明によって提供され、これ らは遺伝的に改変された胚幹（ＥＳ）細胞の微量注入により生成される。本発明 の一態様においては、一時的な遺伝子の発現を可能とするために発生的に調節さ れたシス作動性制御要素に作動可能に連結する二本鎖ヒトＦＶＩＩＩ ＤＮＡが 組み込まれている非ヒトトランスジェニック動物が提供される。プロモーターは 、発生の間の一時的なヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の発現をその発現した外来性タンパ ク質に対する寛容化が生じるように方向付けることが可能な発生的に調節された あらゆる遺伝子単位から誘導することができる。その動物の寛容化及び成熟の後 には、そのＦＶＩＩＩ導入遺伝子はもはや発現しない。本発明においては、α− 胎児タンパク質プロモーターがヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに作動可能に連結され 、そのゲノム内にヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを有するトランスジェニックマウス の生成に用いられた。このようなマウスは発生的に調節された様式でｈＦＶＩＩ Ｉを発現し、そのようなものとしてヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化される。別の モデルには、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターの部位特異的組 み込みの標的である二本鎖ＡＡＶＳ１配列を有するトランスジェニック動物が含 まれる。ヒト第ＦＶＩＩＩ因子寛容血友病動物モデルを作製するため、このヒト ＦＶＩＩＩ及びＡＡＶＳ１トランスジェニック動物を飼育して血友病動物とする ことができる。 以下の例は本発明の特定の熊様を説明するものであり、本明細書及び請求の範 囲をいかなる意味においても限定するものではない。 ＩＶ．実施例実施例１： パッケージ化シグナル変異ヘルパーＡｄ、及び緑色蛍光タンパク質（ ＧＦＰ）レポーター遺伝子を坦持するミニＡｄベクターの構築及び特徴付け １．１ パッケージ化シグナル変異ヘルパーＡｄの生成 Ａｄ５のパッケージ化シグナル欠失変異体の幾つかが記述されている（９０） 。変異体ｄｌ１０／２８（ｄｌ３０９−１９４／２４３：２７４／３５８とも記 述される）はＡｄ５のｎｔ１９４乃至２４３及び２７４乃至３５８が欠失してい る。ｄｌ１０／２８ウイルスは、Ｓｔｏｗの方法（８９）により、Ａｄ５の左端 含むプラスミドをこの二重変異体（ｐＥ１Ａ−１０／２８）及びＡｄ５ゲノムの 残部とライゲートすることにより生成した（９０）。ｄ１１０／２８は単一のウ イルス感染におけるウイルスの収量で１４３倍の低下を示し、野生型ウイルスと 同時感染した場合には検出されなかった。我々は、ｄｌ１０／２８と同じ突然変 異を有するヘルパーウイルスに関して、低収量であってもそのウイルスを増幅す ることが可能であり、且つ野生型パッケージ化シグナルを含むミニウイルスベク ターの存在下においてそのヘルパ ーウイルスは未包被のままであるはずだと結論付けた。 このパッケージ化シグナルをＰＣＲによりｐＥ１Ａ−１０／２８から下記プラ イマーを用いて増幅した。 Ｒ７：５’−ＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧ （Ａｄ５のｎｔ１３７乃至１６３、ＡｆｌＩＩＩ部位には下線が付されている ）及び Ｒ８：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧ ＡＣＣＣＧ （ｎｔ４４９乃至４２１、ＣｌａＩ部位が結合している） 増幅した１３３ｂｐの断片をＡｆｌＩＩＩ及びＣｌａＩで切断し、シャトルベク ターＧＴ４００４の対応する配列の置換に用いた（この構築スキームについては 図4を参照）。ＧＴ４００４はＡｄ５の左領域をＸｈｏＩ部位（ｎｔ５７９２、 １６ｍｕ）からＳｎａＢＩ部位（ｎｔ１０３０７、２８ｍｕ）まで伸長すること によりｐＸＣＸ２（９１）から誘導され、したがって、ＧＴ４００４はＡｄ５の 左端を０．３８ｍｕのＡｆｌＩＩＩ部位を含めて０ｍｕから１．２ｍｕまで、Ｅ １欠失をこの欠失点内のＣｌａＩを含めて１．２ｍｕから９．２ｍｕまで、及び Ａｄ５の左アームの残部を２８ｍｕまで含む。この伸長された左アームは組換え ウイルスの生成に用いられる相同組換えの頻度を高める。野生型パッケージ化シ グナルが欠失したもので置換されているＧＴ４００４はＧ Ｔ５０００と命名された。ｐＴｋβ（クローンテック、Ｃａ）に由来するβ−ｇ ａｌ発現カセットをＳａｌＩ断片として切断し、クレノウ酵素で平滑末端化して 、ＧＴ５０００の平滑末端化ＣｌａＩ部位に挿入した。したがって、得られたプ ラスミドＧＴ５００１は二重欠失パッケージ化シグナル及びＴｋプロモーターに よって駆動されるβ−ｇａｌ遺伝子で置換されたＥ１領域を含む（図４）。この 構築体では、Ｘ−ｇａｌ染色によるヘルパーウイルスの検出が斟酌される。 ヘルパーウイルスを生成するのに、Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃによって記 述される方法を用いた（９１）（図５）。ＡＴＣＣから入手した２９３細胞の早 期継代をＭＥＭ−１０％ウマ血清において成長させ、６０ｍｍプレートに播種し た。３０％集密で、ＣａＰＯ4により、プレート当たり２ｍｇのＧＴ５００１及 び４ｍｇのｐＪＭ１７（９１）を用いて細胞に同時形質移入した。同時形質移入 の３日後、細胞を０．５％アガロースを含む培地で覆い、その後そのオーバーレ イ上の培地を毎日代えた。プラークが視認されるようになったら、Ｘ−ｇａｌ（ ＤＭＳＯ中４０ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍｇ／ｍｌまで培地に直接添加し、一晩イ ンキュベートした。所望のヘルパーウイルスを生成するプラークを青色で識別し た（図６）。青色プラークを採取し、そのアガロースプラグを１ｍｌＭＥＭ−１ ０％ＦＢＳに再懸濁した。この培地の３７０ｍｌをパッケージ化シグナルのＰＣ Ｒ増幅の ために以下のように処理した：４０ｍｌの１０ＸＤＮＡ分解酵素Ｉバッファ（４ ００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、６０ｍＭ Ｃｌ2Ｍｇ、２０ｍＭ Ｃｌ2 Ｃａ）（この処理の対照として０．５ｍｇのシャトルベクターを収容する管を用 いた）及び１ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉ（ベーリンガーＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ）、１０ｕ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡ 分解酵素Ｉを不活性化し、３２ｍｌ ＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）、ＥＧＴＡ（０． ２５Ｍ）、１０ｍｌ ＳＤＳ（２０％）、５ｍｌプロテイナーゼＫ（１６ｍｇ／ ｍｌ）を添加することによりウイルスのキャプシドを開裂させ、５６℃で２時間 インキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（１： １：１／２４）で１回抽出した後、１ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を 添加してウイルスＤＮＡの調製を助成し、これを微量遠心において１２０００ｒ ｐｍで遠心することに集めて２０ｍｌのＨ2Ｏに再懸濁した。５ｍｌを、プライ マーＲ７及びＲ８を用いるＰＣＲ反応に用いた。 所望の欠失パッケージ化シグナルを含む青色プラークの１つをＤＭＥＭ−１０ ％ＦＢＳ中で成長する２９３細胞においてさらに増幅させた。以下、Ａｄヘルパ ー−βｇａｌ又はＡｄＨβと命名する（図５を参照）。このウイルスを、感染後 ４８時間で、集めた細胞の８００ｇで５分間の遠心並びに細胞ペレットの３回の 急速冷凍及び 解凍サイクルにより抽出した。このＸ細胞からの粗製抽出物を３Ｘ細胞の感染に 用いた（増幅スケールは、野生型パッケージ化シグナルを有するウイルスの１対 ２０とは対照的に１対３であった）（図６）。継代毎に、上清のＰＣＲによりパ ッケージ化シグナルの欠失サイズを検証した（図７）。この欠失及びβ−ｇａｌ の発現は分析した継代の全てにおいて安定であった。継代９で、ＡｄＨβをＣｓ Ｃｌにより精製した。精製は、凍結−解凍サイクルを３回行い、その溶解物を０ ．５ｍｌ ＣｓＣｌ １．５ｍｇ／ｍｌ＋２．５ｍｌ ＣｓＣｌ １．３５ｍｇ ／ｍｌ＋２．５ｍｌ ＣｓＣｌ １．２５ｍｇ／ｍｌの段階的勾配に積層し、Ｓ Ｗ４１ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ローターにおいて１０℃、３５０００ｒｐ ｍで１時間遠心することにより行った。集めたウイルスバンドをＣｓＣｌ １． ３５ｍｇ／ｍｌと混合し、前と同様に１８時間遠心した。このウイルスバンドを ＰＢＳに対して２回、ＰＢＳ−１０％グリセロールに対して１回透析し、−８０ ℃で保存した。第２勾配の後に５つの異なるバンドが見られ、それらの全てを別 々に精製した。精製したウイルスから、ＥＤＴＡ／ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ処 理、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿（ＰＣＲについて上述 されるものと同じ条件）によりウイルスＤＮＡを抽出した。臭化エチジウムゲル においては上部３つのバンドにはＤＮＡが検出されず、それらは大部分が空のキ ャプシドであると考えられる。 下部の２つのバンドはウイルスＤＮＡを含み、したがって、完全なキャプシドで あり、これは制限マップ分析によりＡｄＨβと一致することが示された。Ｒ７＋ Ｒ８オリゴを用いるＰＣＲにより欠失パッケージ化シグナルが全てのバンドから 増幅され、これは、ウイルスが所望の弱力化を備えることを示す。溶液中のウイ ルスのミリリットル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数で表される力価を 決定するため、ウイルス含有溶液をＤ−ＭＥＭ１０％ＦＢＳで連続的に希釈し（ １：１０希釈で１０-12まで）、９０％集密の２９３細胞（６ウェルプレート内 に０．５ｍｌ／ウェル）の感染に用いた。３７℃で１時間感染させた後、ウイル ス懸濁液を新鮮な培地で置き換えた。翌日、細胞を０．５％アガロース、０．０ ２５％酵母抽出物及び５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４を含む培地で覆った。６ 乃至１０日後、プラークをカウントした。ＡｄＨβの増幅及び精製の後に得られ た力価は約１０9ＰＦＵ／ｍｌ（ウイルスを１５０ｍｍ2のプレート２枚から精製 し、再懸濁して最終容積１ｍｌとした）であった。この力価は、ｗｔパッケージ 化シグナルを含む類似のウイルスベクターを用いて得られるものより約１００Ｘ 低い。 １．２ ミニウイルスベクター用のプラスミドの構築 直鎖アデノウイルスＤＮＡは、その末端ＩＴＲによって頭部と尾部とが共有結 合で環化した場合、細菌内でプラスミドとして成長することが可能であるが、許 容的ヒ ト細胞に移入された場合に複製してウイルスを精製することが示されている（９ ２）。機能的接合は、感染細胞から抽出された環状ＤＮＡを用いて細菌を形質転 換することにより自然に選択されている。接合部には小さな欠失が観察されてお り、それは、おそらく、アデノウイルスＤＮＡのＩＴＲの頭部と尾部との融合の 結果生じた完全な回文構造を破壊することによりそのプラスミドに安定性を付与 している。したがって、基本的なミニウイルスの構造はＡｄ５の右端（少なくと も１０３ｎｔ−ＩＴＲを含む）に融合したＡｄ５の左端（１０３ｎｔ−ＩＴＲ及 びパッケージ化シグナルをｎｔ３５８まで含む）を含むプラスミドである。ミニ ウイルスベクター系の試験に用いられた初期のアプローチには、機能的ＩＴＲ融 合を含むプラスミドｐＪＭ１７において漸進性欠失を生成することが含まれてい た。ｐＪＭ１７は、Ａｄ５のゲノム全体をＩＴＲ配列で環化したＤＮＡ分子とし て、及び（細菌複製起点並びにアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を もたらす）Ｅ１Ａに挿入されたｐＢＲ３２２誘導体ｐＢＲＸを含むプラスミドで ある（９３）。Ｅ１Ａの欠陥を補完する２９３細胞内に形質移入されると、ｐＪ Ｍ１７は複製するが、アデノウイルスキャプシド（最大は３８ｋｂ）内にパッケ ージ化するには大きすぎる（４０．３ｋｂ）ためパッケージ化はされない。 本発明のものに加えて現在の文献示される様々なミニウイルスベクターの例が 図５に示されている。ｐＪＭ１ ７をＡｓｃＩで切断し、再ライゲートしてｐＢＲＸ−ＡｓｃＩを得た。これによ りＡｄ５のｍｕ４３．５乃至７０．２が除去され、これはＥ２Ａ（ＤＮＡ結合タ ンパク質）及びＬ３（ヘキソン、ヘキソン関連タンパク質及び２３Ｋプロテアー ゼ）を完全に欠失させ、且つＬ２（ペントン基部及び核タンパク質）及びＬ４（ ヘキソン関連タンパク質、ヘキソン−三量体足場タンパク質、及び３３Ｋタンパ ク質）を部分的に欠失させる。この欠失は環状ウイルスＤＮＡから複製及びキャ プシド形成を抑止し、それを十分な量の必要とされる複製タンパク質をトランス 作動的に提供するヘルパーウイルスに完全に依存性にする。ｐＢＲＸ−ＡｓｃＩ は７５．２ｍｕ（Ｌ４）に独自ＳｐｅＩ部位を含み、Ｍ３２（３２ｋＢのミニウ イルス）を得るため、そこに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含む ２．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された。このＧＦＰカセットは、ＣＭＶエンハン サー／β−アクチンプロモーター（ＣＡプロモーター）、エクオレア・ビクトリ アＧＦＰ ｃＤＮＡ、及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含んでなる。ミニウイルス ベクター構築体におけるＧＦＰの使用は、細胞におけるこのベクターの存在を蛍 光顕微鏡法を用いて測定するために用いた。蛍光顕微鏡法は、ＧＦＰを発現する 細胞の検出に用いることができるフローサイトメトリーを含むがこれに限定され るものではない幾つかの方法のうちの１つを代表する。ＡｄＨβの存在はＸ−ｇ ａｌ染色の青色によって検出す ることができる。Ｍ３１を生成するため、Ｍ３２をＭｌｕＩで切断して再ライゲ ートした。これにより３１．４乃至３４．５ｍｕが除去され、これはＬ１（５２ Ｋ、５５Ｋ及びペントン関連タンパク質）を部分的に欠失させた。Ｍ２８を生成 するため、Ｍ３２をＭｌｕＩ及びＡｓｃｌで切断して再ライゲートした。これに より３１．４乃至４３．５ｍｕが除去され、これはＭ３２に依然として残留して いたＬ１及びＬ２タンパク質を完全に欠失させた。Ｍ２６を生成するため、Ｍ２ ８をＲｓｒＩＩ及びＳｐｅＩで切断して再ライゲートした。これにより３０．９ 乃至７５．２ｍｕが除去され、これはＬ１及びＬ４の欠失に及んだ。Ｍ２３を生 成するため、Ｍ３２をＮｓｉＩで消化して再ライゲートした。ＧＦＰカセットを 含む、３２．２ｍｕ乃至ＣＡプロモーターのＮｓｉＩ断片（７５．２ｍｕでの融 合の次のＮｓｉＩ部位を含む）は再ライゲートされ、その結果、ＣＡプロモータ ーのＮｓｉＩ部位は５．５ｍｕにライゲートされ、３２．２のＮｓｉＩ部位は７ ５．３ｍｕでライゲートされた。これは、Ｅ２ｂ（末端タンパク質、ＤＮＡポリ メラーゼ）及びＩＶａ２タンパク質を含む５．５乃至７５．３ｍｕの全てのタン パク質の発現を抑止する。Ｍ２０を生成するため、Ｍ２３をＭｌｕＩ及びＡｓｃ Ｉで切断し（これは、Ｍ２３のＮｓｉＩ断片の３４．５乃至４３．５ｍｕの領域 を除去する）、再ライゲートした。 ｐＪＭ１７におけるものような環化完全長ウイルスゲ ノムの切り落としの代わりに、ＩＴＲ配列及びパッケージ化シグナルを含む、複 製及びパッケージ化に必要な最小シス要素をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタ ジーン）のような小プラスミドにサブクローン化し、導入遺伝子カセット及びそ のウイルスベクターの治療上の潜在性を改善し得る他の要素、例えば、エピソー ム維持もしくは染色体組み込みのための要素を漸進的に加えることにより他のミ ニウイルスベクターを構築した（図８、最下部）。頭部と尾部とが融合したＩＴ Ｒ及び左ＩＴＲの次のパッケージ化シグナル（ＩＴＲ／ＩＴＲ＋ｐａｃ）をＥｃ ｏ４７Ｉ１Ｉ（９８．７ｍｕ）及びＰｖｕＩＩ（１．２６ｍｕ）を用いてｐＢＲ Ｘ−ＡｓｃＩから切断し、平滑末端化して、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶにサブクローン化した。得られたプラスミドｐＢＳ／ミニ ＩＴＲ、すなわちＧＴ４００７は、発現カセットを含まず、且つＩＴＲ／ＩＴＲ ＋ｐａｃに隣接する幾つかの独自制限部位を有する３．８ミニウイルスプラスミ ドである。ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩを用いて、上述のＧＦＰ発現カセットをｐＢＳ ／ミニＩＴＲにサブクローン化してＭ６．５を生成した。次に、内部リボソーム エントリ部位（ＩＲＥＳ）及びネオマイシン（ｎｅｏ）ｃＤＮＡをＣＡプロモー ターとＧＦＰ遺伝子との間にサブクローン化してＭ７．０を生成した。２つの別 々のカセットにｎｅｏ及びＧＦＰを含む類似のミニウイルスＭ８．５を生成した ；Ｔｋプロモーター、ｎｅｏ ｃＤＮ Ａ及びＴｋ ｐＡを含むｐＲＥＰ９（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ）に由来するＮｒｕＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を平滑末端化し、Ｍ６．５のＳｔｕＩ −ＥｃｏＲＩにサブクローン化した。アデノウイルスゲノムを外来性ＤＮＡで完 全に置換したミニＡｄベクターのパッケージ化を試験するため、より大きなミニ Ａｄプラスミドの構築にＭ８．５を用いた。インサートとして、アルブミン遺伝 子の３’、半分及びα−胎児タンパク質遺伝子の５’、半分に相当するゲノム断 片を用いた。これらの断片は、潜在的なアームとして、この部位での相同組換え を研究する見込みで選択した。これらの断片は、Ｍ８.５の二重ＧＦＰ／ｎｅｏ 発現カセットの上流及び下流に挿入した。したがって、得られた構築体において は、ｐＧｎＥ５Ｅ３（２３．８Ｋｂ）、ＧＦＰ及びｎｅｏ導入遺伝子がそのヒト ゲノム内に存在する対応１０Ｋｂアルブミン−ａ−胎児タンパク質遺伝子間領域 を置換する。図９は上述のプラスミドを用いて得られるミニウイルスの構造を示 す。 １．３ ミニＡｄＧＦＰベクターの生成及び増幅 様々なミニＡｄプラスミドの複製及びパッケージ化を支持するのにＡｄＨβを 用いた。ミニウイルスがパッケージ化可能であったかどうかを決定することが重 要であった。また、ミニウイルスのサイズがパッケージ化効率に影響を及ぼすか どうかを決定することも重要であった。 アデノウイルスにおいては、１００％野生型長のＤＮ Ａが最も効率的にパッケージ化され、ゲノムサイズが最大で１０５％まで増加し 、又は１００％未満に減少するに従いパッケージ化の効率が低下した。野生型ア デノウイルスを欠陥ミニウイルスの補完に用いた場合、６９％（２５ｋｂ）とい うより低い限界が示唆されている（９４）が、弱力化ヘルパーウイルスを用いる ことにより、より短いミニウイルスのパッケージ化が可能であった。 本発明のミニウイルスを補完するため、各々同様の効率で作用する２つの方法 を用いた（図１０）。第１の方法においては、ＣｓＣｌ精製ミニウイルスプラス ミドを精製ＡｄＨβから抽出した直鎖ウイルスＤＮＡと共に同時形質移入した。 このウイルスＤＮＡの精製に用いられた方法は、複製の初回刺激の原因である末 端タンパク質を破壊するＳＤＳ及びプロテイナーゼＫに処されることに注意され たい。この方法は、同様に末端タンパク質を欠くミニウイルスプラスミドを上回 る複製の利点をヘルパー−ウイルスに付与することを回避するために用いた。し たがって、ＡｄＨβでの直接感染による補完がミニウイルスを救済することはな かった。同時形質移入は、５０％集密の２９３細胞で、６ウェルプレートのウェ ル当たりＣａ2ＰＯ4及び２ｍｇのミニウイルスプラスミド及び１ｍｇのウイルス ＤＮＡを用いて行った。この形質移入混合物中で一晩インキュベートした後、培 地を代え、蛍光顕微鏡法を用いて細胞を検査することにより形質移入の効率を評 価した。ＣｓＣｌ精製プラスミドで、この 効率はプラスミドのサイズに関わりなく１００％に達した（図１１）。同時形質 移入の６日後にＣＰＥが観察され、３回の凍結及び解凍サイクルによりウイルス を細胞から回収した。第２の補完方法においては、ミニウイルスプラスミドをｐ ＢＨＧ１０、パッケージ化シグナルが完全に欠失しているためにパッケージ化が 不可能であるｐＪＭ１７に類似する環化アデノウイルスプラスミド（９５）、と 共に同時形質移入した。このプラスミドは、複製に必要な早期タンパク質の全て に加えてキャプシドを形成する後期タンパク質をも生成する。ミニウイルスがｐ ＢＨＧ１０と同じ細胞内に存在する場合、それもまた複製し、且つ、ミニウイル スが野生型パッケージ化シグナルを含むため、ミニウイルスベクターがキャプシ ドに包まれる主要核酸である。しかしながら、ミニウイルスが隣接細胞に放出さ れる場合、欠陥を有するために増幅しない。したがって、このミニウイルスを増 幅させるため、同時感染の３日後、その細胞単層に１０プラーク形成単位（ｐｆ ｕ）／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）でＡｄＨβを感染させた。同時形質移入の３ 日後にＣＰＥが観察され、３回の凍結及び解凍サイクルによりウイルスを回収し た。 補完の方法に関わりなく、その溶解物（生成ミニウイルスの継代０）を用いて ９０％集密２９３細胞の新鮮な単層に（１対３の増幅スケールを用いて）感染さ せた。感染後の当日、ミニウイルスの存在を蛍光により観察し、 ヘルパーの存在をＸ−ｇａｌ染色により確認した。どのようなものであっても溶 解物中にヘルパーウイルスが存在した場合には、それらの細胞のさらなるインキ ュベーションによりミニウイルス＋ヘルパー混合物の増幅がＣＰＥの出現を伴っ て導かれた（この単層の新たな溶解物はミニウイルスの継代１と考えられる）。 溶解物中にヘルパーが存在しない場合には、ミニウイルス単独ではパッケージ化 せず、新たなヘルパーを添加することによってのみＣＰＥが出現した。したがっ て、ヘルパーの存在をＸ−ｇａｌ染色により、及びより高い感度でＣＰＥの出現 により評価した。 ミニウイルス構築体（Ｍ３２、Ｍ３１、Ｍ２８、Ｍ２６、Ｍ２３、及びＭ２０ ）の各々を用いて別々に形質移入した後、ＧＦＰを含むプラークの出現を観察し た（図１２）。これにより、試験したプラスミドの各々について補完が可能であ ったことが示された。新鮮な２９３細胞単層に各々のウイルスの粗製抽出物を感 染させた２日後にＣＰＥが観察され、これはヘルパーウイルスの存在を示した。 さらなるミニウイルスの継代の結果は、全ての継代において５倍の増幅が生じ、 パッケージ化効率がミニウイルスのサイズに比例することを示した（図１３）。 ベクターサイズが３ｋｂ減少する毎に効率が２倍低下することが観察された。例 えば、Ｍ２０のパッケージ化効率は野生型（（３６−ｘｋｂ）／３＝ｎ、効率は ０．５nである）の２．４８％である。しかしながら、Ｍ６．５、 Ｍ７．９及びＭ８．５では蛍光プラークは見出されず、これは非常に非能率的な パッケージ化、又はパッケージ化が存在しないことを示した（図１３）。これは 、８．５Ｋｂ乃至２０Ｋｂのどこかに存在するパッケージ化下限を反映している 可能性があった。しかしながら、これらの限界の間でもパッケージ化は依然とし て生じているが、観察された線形の減少によると、１１．５Ｋｂのサイズの差が ７．６倍のパッケージ化効率の低下を生じ、それにより増殖が不可能になり得る というのがより確からしいように思われる。 外来ＤＮＡによるウイルスゲノムの完全な置換が可能であり、これがパッケー ジ化効率に影響を及ぼすかどうかを試験した。Ａｄ５のＩＴＲ及びパッケージ化 シグナルのみを含む２３．８Ｋｂの完全に置換されたミニＡｄを構築した。外来 性ＤＮＡとして、一方がＧＦＰで他方がネオマイシンのものである２つの直列の 発現カセットにアルブミン ａ−胎児タンパク質ゲノムＤＮＡの２つの長アーム を隣接させた（図９）。ＡｄＨｂ ｖＤＮＡで最初に補完した後に得られたウイ ルスを継代させたときに、ＧＦＰ−陽性２９３細胞の数を増加させることにより パッケージ化が示された。この形質導入単位力価はＭ２３で得られるものに類似 しており（図１３）、これは、Ａｄ５ ＤＮＡと比較した場合、外来性ＤＮＡが パッケージ化効率において有害な効果を持たないことを示した。 １．４ ミニＡｄＧＦＰウイルス（Ｍ３２）の精製 ミニウイルスの継代に続いて、感染後に全ての細胞が蛍光を発するようになる まで力価を増加させた。これは、例えば、Ｍ３２の継代４で生じた。Ｍ３２を１ 対３の増幅スケールで連続的に継代することにより継代８に達したとき、１５０ ｍｍ2のプレート７５枚を感染させるのに十分なウイルスが得られた。ＣＰＥが 出現したら、上述のように３回の凍結／解凍サイクルによりウイルスを抽出し、 ＣｓＣｌ勾配により精製した。勾配中には、３つの上部バンドと遠心管の中央部 のより濃い１つのバンドとの４つのバンドが観察された（図１４のスキームを参 照）。管の頂部から吸引することによりそれぞれのバンドを別々に集め、透析し た。２９３細胞にそれぞれのバンドを感染させて蛍光を観察し、又はＸ−ｇａｌ 染色することにより、ミニウイルス及びヘルパーウイルスが両者とも高密度バン ドに存在することが示された（図１５）。緑色及び青色細胞の数に基づいて、ミ ニウイルス及びヘルパーの量が同じ範囲内にあることが決定された。Ｍ３２（３ ２Ｋｂ）及びＡｄＨβ（３７．１Ｋｂ）内に存在するウイルスＤＮＡのサイズの 相違は、Ｍ３２をＡｄＨβよりも密度が僅かに劣るものとした。ミニＡｄベクタ ーのヘルパーに対する比を増加させるため、高密度バンドを１．３５ｇ／ｍｌ連 続ＣｓＣｌ勾配中に分離し、その管の底部から画分を集めた。それぞれの画分の ０．５ｍｌを亜集密の２９３細胞の感染に直接用い、２４時間後に蛍光性及び青 色細胞をチェックした。多量のＡｄＨ βを含むピーク（図１６、画分７乃至１６）の後により軽い画分が続き、これは ＡｄＨβに対して１０倍のＭ３２の濃縮を示した（画分１７乃至２９）。したが って、ミニＡｄ調製品中に存在するヘルパーウイルスの量の低減にＣｓＣｌによ る分画を用いることができる。 まとめると、これらの結果は、ｄｌ１８／２８から採取されたパッケージ化シ グナルにおける部分的な欠失と共に用いられるヘルパーはミニウイルス系におけ る大きな欠失を補完することが可能であるが、ミニウイルスの存在下において依 然としてパッケージ化することを示す。このヘルパーは、純粋なミニウイルスの 集団が重要ではない場合、例えば、幾つかの治療用遺伝子（例えば、インタ−ロ イキン及び腫瘍抑制遺伝子）を含むミニウイルスを他の治療用遺伝子を含むこの ヘルパーに結合させることが可能な抗腫瘍ベクター系において用いることができ る。ヘルパーに対するより高いミニＡｄの比が必要である場合には、このヘルパ ーをそのパッケージ化においてさらに弱力化する必要がある。 実施例２．パッケージ化シグナルが妨害されたヘルパーＡｄの設計 アデノウイルスのパッケージ化はパッケージ化要素（Ａ反復）に結合するのに パッケージ化タンパク質を必要とする（９０、９６）ため、本発明ではＡｄ５パ ッケージ化シグナル(A反復）に隣接する幾つかの特定のＤ ＮＡ結合配列を導入してヘルパーウイルスのパッケージ化機能をさらに物理的に 妨害する。２つのＤＮＡ結合配列が選択されている：Ａ．ＧＡＬ４結合配列（９ ７）；Ｂ．テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）（９８、９９）。Ｇ ＡＬ４は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における転写を活性化する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク 質である。ＧＡＬ４の最初の１４７アミノ酸は、ガラクトース中の活性化領域Ｕ ＡＳG又は自然に生じる部位、“１−量体”５’ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴ ＣＣＧ−３’もしくは５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’近似共 通の上流の４つの部位に結合する（９７）。ｔｅｔＯは大腸菌のＴｎ１０特異的 テトラサイクリン耐性オペロンに由来するものであり、耐性介在遺伝子の転写は ｔｅｔＯの１９−ｂｐ逆転反復配列５’ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧ Ａ−３’の結合するテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）によって負に調 節される（９８、９９）。 パッケージ化シグナル変異構築体ＧＴ５０００（実施例、第１項）に基づいて 、ＧＴ５０００のＸｈｏＩ乃至ＸｂａＩ（ｎｔ１９４、０．５ｍｕ乃至ｎｔ４５ ２、１．２５ｍｕ）の配列の置換に合成配列が用いられている。４種類の合成配 列（図２１及び２２）が設計されている。４種類の合成配列は全て、Ａｄ５パッ ケージ化要素（Ａ反復）Ｉ、II、ＶＩ及びＶＩＩを含む。１７量体ＧＡＬ ４結合配列（５’ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’（９７）又は１９ 量体ｔｅｔＯ配列（５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ−３’（１ ００、１０２）の３つもしくは４つの反復をこれらのＡ反復の周囲又はそれらの 間に導入した（図１７及び１８）。Ａ反復の間の領域はパッケージ化効率に影響 を及ぼす（９０、９６）ため、各Ａ反復間の距離はそのヘリックスのほぼ完全な ターン、すなわち、１０、２１又は３１ｂｐに維持する（図１７及び１８）。図 １９及び２０は合成オリゴ配列及び位置を示す。 実施例３．Ａｄ−Ｅ１ヘルパー細胞系の構築及び特徴付け 遺伝子治療用途において用いられるアデノウイルスペクターの大部分はアデノ ウイルス５（Ａｄ５）ゲノムのＥ１領域に欠失を有するように設計されていた。 領域ＩＸを含まないＥ１領域はＡｄ５の左端の９％（１．２−９．８マップ単位 ）からなり、２つの早期領域タンパク質Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする。Ｅ１Ａ ／Ｅ１Ｂの発現には、ウイルスの複製並びにＥ２−Ｅ４及び後期タンパク質のよ うな他のＡｄ５タンパク質全ての発現が必要とされる（１００）。Ｅ１の欠失は 、理論上は、全てのＡｄ５タンパク質の発現について無活動であり、且つ関心の ある導入遺伝子のみを発現する複製不適格ウイルスを創出する。Ｅ１Ａ及びＥ１ Ｂの欠失も、これらの２種 類のタンパク質が組み合わせて哺乳類動物細胞の癌遺伝子性形質転換に関連付け られているため、安全性の理由から関心のあるものである（１０１−１０３）。 ヒトの臨床試験において現在までに用いられている全てのクラスＩアデノウイル スベクターに加えて、実施例１に記述される新規パッケージ化不全ヘルパーウイ ルスもＥ１が欠失されている。 Ｅ１不全アデノウイルスは２９３と呼ばれるＡｄ５ヘルパー細胞系において増 殖する（１０４）。２９３細胞は、Ａｄ５ ＤＮＡの共有断片を含むヒト胚性腎 臓細胞を形質転換することにより誘導された。ゲノムの分析により、２９３細胞 は細胞当たり４乃至５コピーのウイルスゲノムの左側１２％（Ｅ１領域全体を含 む）及び細胞当たり約１コピーの右端、Ｅ４領域の９％を含むことが明らかにな った（１０５）。２９３細胞は高力価のＥ１不全アデノウイルスを生成する点で は非常に効率的ではあるが、（Ｅ１領域以外の）２９３ゲノムに組み込まれてい る外来性Ａｄ５配列の存在のため、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター中の配列と の組換えが生じ、それがＥ１を含む複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）の生成を 引き起こす可能性があるという不利な点を有する。Ｅ１不全アデノウイルスの増 幅及び増殖の間にいかに早い継代（この継代はアデノウイルス貯蔵物の大規模生 成に用いられるものである）で異常な組換え現象が生じるのかに依存して、２９ ３細胞におけるＲＣＡの生成はヒト遺伝 子治療試験の安全性に対する深刻な結果を提示し得る（１０６）。ＲＣＡの生成 に加えて、２９３細胞における組換えは、導入遺伝子の発現に影響を与え、それ により機能的アデノウイルス粒子の力価を低下させる欠失及び再配置をも引き起 こし得る。近年、Ｅ１領域を含む決定されたＡｄ５ ＤＮＡを用いて細胞系が開 発されているが、これらの細胞系はＥ１欠失アデノウイルスベクター中の相同配 列と重複する重要な配列を保持し、これが望ましくない相同組換え現象及びＲＣ Ａの生成の可能性の余地を残す（１０７、１０８）。 ３．１ 細胞系生成のためのプラスミドの構築 アデノウイルスベクターとの組換えの可能性を排除するため、補完に必要とさ れるＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列のみを有し、且つＥ１不全アデノウイルス中の領域と重 複するいかなる相同配列をも含まない新規Ａｄ５ヘルパー細胞系が開発されてい る。Ａｄ５ Ｅ１Ａ及びＥＩＢをコードする配列を含む、ＡｆＩ ＩＩＩ（４６ ２ｂｐ）部位とＡｆＩ ＩＩ（３５３７ｂｐ）部位との間の３．１ｋｂ ＤＮＡ 断片を、以下のように、スーパーリンカーベクターｐＳＬ３０１（インビトロゲ ン）に２つの断片として連続的にクローン化した：まず、８８１ｂｐのＡｆｌＩ ＩＩ乃至ＸｂａＩ断片（Ａｄ５ ｂｐ４６２−１３４３）をｐｂＲＸａｄ５Ｋｐ ｎＩＣｌ（ｐＪＭ１７のサブクローン）からｐＳＬ３０１（ＡｆｌＩＩＩ／Ｘｂ ａＩ）にクローン化した。次に、近接する２１９４ｂｐの ＸｂａＩ乃至ＡｆｌＩＩ（Ａｄ５ ｂｐ１１３４３−３５３７）をｐＢＲＸａｄ ５ＸｈｏＩＣｌから同じベクターにクローン化した。得られた３０７５ｂｐのＥ １断片（ｐＳＬ３０１中）は、Ｅ１ＡのＴＡＴＡボックス及びＲＮＡキャップ部 位、Ｅ１Ａコーディング配列、完全なＥ１Ｂプロモーター、並びにＥ１Ｂコーデ ィング配列を含み、これにはＥ１Ｂｐ５５タンパク質の停止コドンが含まれるが 領域ＩＸは含まれない。この３０７５ｂｐのＡｆｌＩＩＩ−ＡｆｌＩＩ Ｅ１Ａ ／Ｅ１Ｂ断片（Ａｄ５ ｂｐ４６２−３５３７）を単離し、クレノウ酵素で平滑 末端化して、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御の下で哺乳動物発現ベク ターｐＣＤＮＡ３（インビトロゲン）のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端ライゲートし た。このプロセスによりＡｄ５Ｅ１発現ベクターＣＭＶ−Ｅ１が生じた（図２１ ）。 ３．２ 新規細胞系の生成及び特徴付け このＣＭＶ−Ｅ１発現￥ベクター（Ｇ４１８耐性遺伝子、ｎｅｏを含む）をリ ポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）を用いてＡ５４９ヒト肺癌細胞に形質移入し 、Ｇ４１８Rコロニーを単離した。単細胞クローンを機能的なＥ１Ａ／Ｅ１Ｂの 発現についてスクリーニングした；緑色蛍光タンパク質（ＦＧＰ）発現カセット をＣＭＶ／β−アクチン（ＣＡ）プロモーターＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰの存在下に含 むＥ１欠失アデノウイルスをＡ５４９−Ｅ１クローンの感染に用いた。感染の３ 日後、細胞変性効果（ＣＰ Ｅ）の目視検査によりＥ１補完Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰアデノウイルスの生成につい てクローンをスクリーニングした。クローンの１つ、Ａ５４９Ｅ１−６８が３日 間で（２９３細胞について観察されるものに類似する）１００％のＣＰＥを示し た。このクローンは高い感染性も示し、実質的に１００％の細胞が感染後２４時 間で緑色の蛍光を発した（図２２）。 この細胞系に誘発されたＣＰＥの迅速な生成に加えてこの高い感染率は、Ｅ１ 欠失Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰウイルスの複製及び増幅を促進することが可能な機能的 Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質が生じていることの強力な証拠である。Ｅ１配列特異 的プローブを用いるサザンブロット分析により、Ａ５４９Ｅ１−６８、Ａ５４９ Ｅ１−６８のサブクローン（Ｅ１−６８．３）、及び２９３細胞におけるＣＭＶ −Ｅ１導入遺伝子の存在が示されたが、親のＡ５４９細胞系には示されなかった （図２３）。これらのＥ１形質移入細胞の形態は親のＡ５４９細胞系とは大きく 異なっていた。亜集密密度のＡ５４９細胞は細長い線維芽細胞様の形態を有する 別々の単細胞として成長し、これに対してＥ１細胞系、Ａ５４９Ｅ１−６８はよ り立方体状の形態を有する細胞のコロニーとして成長する（図２４）。 Ｅ１欠失アデノウイルス（Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰ）の生成についてプラーク検定 によりＡ５４９Ｅ１−６８を２９３細胞と比較し、等しい力価の補完ウイルス（ Ａ５４ ９Ｅ１−６８についての７Ｘ１０9ＰＦＵ対２９３についての９Ｘ１０9ＰＦＵ） を生成することが見出された。免疫沈殿及びＥ１Ａ特異的抗体（Ｍ７３、オンコ ジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いるウェスタ ンブロットにより４６ｋｄ及び４２ｋｄの見かけの分子量を有する２つのＥ１Ａ 特異的バンドが明らかとなり、これらはＥ１Ａ １３Ｓ及び１２Ｓ ｍＲＮＡか ら予想される産生物（６）に相当し、且つ２９３細胞中に観察されるものと同じ サイズであった（図２５Ａ）。Ａ５４９Ｅ１−６８は、Ｅ１Ｂｐ５５に特異的な モノクローナルＡｂを用いて約５５ｋｄのバンドを生成した。この５５ｋｄのＥ １Ｂ特異的バンドはもちろん、二次バックグランドバンドも、同様に２９３細胞 において観察された（図２５Ｂ）。実験及び対照レーンの両者に見出される余分 な“バックグラウンド”バンドは他の著者によって観察されており、サイクリン 、ｐ５３、及びＲｂを含む様々なタンパク質の同時免疫沈殿によるものと考えら れている。Ａ５４９Ｅ１−６８及び２９３細胞とは異なり、親のＡ５４９細胞系 は４６ｋｄ、４２ｋｄ、又は５５ｋｄ Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質の発現を示さ なかった。Ａ５４９Ｅ１−６８がＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現するだけではなくそれ らが機能的であることは、この細胞系が高力価のＥ１欠失組換えアデノウイルス の生成を補完することが可能であることから明らかである。この新規Ａｄ５ヘル パー細胞系がＲＣＡを生成すること なく補完可能であることを立証するため、Ａ５４９Ｅ１−６８細胞でＥ１欠失ア デノウイルスを連続的に継代し、継代の間に増幅したウイルスを、Ｅ１を含む複 製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）については親Ａ５４９細胞を用いて、ＣＰＥに よってはもちろん、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いるこ とにより試験した。この細胞系は、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの増殖及び スケールアップの間に、製造ロットがＲＣＡを含まないことを保証するために用 いられる。 実施例４．ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを含む発現カセット 本発明のＡｄミニベクターの関心のある遺伝子に対する大きな収容力は、従来 のＡｄベクターのサイズ容量を大きく上回る大プロモーター及びタンパク質コー ディング領域の組み込みを許容する。本発明の目的上、このＦＶＩＩＩミニＡｄ ベクターはＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓に送達することが好ましい。したがって、肝 臓において作用する非常に活性の高いプロモーターを用いることが重要である。 このようなプロモーターの１つはヒトアルブミン遺伝子プロモーターである（３ ２）。ヒトアルブミンプロモーターの１２．５ｋｂ領域はカルガリー大学のＴａ ｍａｏｋｉ博士から入手した。この１２．５ｋｂプロモーター内の３つの領域が プロモーターの活性に大きく影響することが決定されている（３２）：１）ＴＡ ＴＡボックスを含む近位領域（５５０ｂｐ）；２）−１． ７ｋｂのエンハンサー領域；及び３）−６．０ｋｂの第２エンハンサー領域（図 ２６）。合わせると、これらの領域は１２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター 全体の強度に近づく。ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴの１０．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ａ ｖａＩ断片（図２）をＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ近位ヒトアルブミンプロモータ ー断片と共にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ+ベクターのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に同時ライゲートして組換えプラスミドＧＴ４０３１を生成した（図 ２７）。５’側接ＳＶ４０最初期イントロン及び３’側接ＳＶ４０ポリアデニル 化シグナルを有する７．２ｋｂ完全長ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡをプラスミドＧ Ｔ２０５１からＸｈｏＩ／ＳａｌＩ消化により切り出し、ＧＴ４０３１のＳａｌ Ｉ部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０５３を生成した（図２８）。次に、 最小ＩＴＲ領域及びＡｄパッケージ化シグナルを含むＧＴ２０３３から誘導され るＸｈｏＩ断片をＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位に正方向又は逆方向のいずれかに クローン化し、それぞれ、アルブミン／ｈＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドＧ Ｔ２０５９及びＧＴ２０６１を生成した（図２９）。このＧＴ２０５９及びＧＴ ２０６１ミニウイルスプラスミドの制限酵素消化パターンが図３０及び３１に示 されている。 ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡはプロモーターもしくは転写制御要素に作動可能に連結 させることが可能であり、この要素は合成であっても、制御可能もしくは調節可 能であ っても、あるいは組織／細胞型に特異的であってもよい。好ましくは、産生もし くはヘルパー細胞におけるＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡの発現はウイルス生成の間抑制 され、標的細胞に送達された後に活性化する。このようにして、このミニＡｄベ クターのレポーター又はエフェクター遺伝子の弁別的発現が活性化される。この ような弁別された発現は、α1−抗トリプシン（α1−ＡＴ）プロモーターに作動 可能に連結する肝臓特異的エンハンサーを有するもの又はテトラサイクリンオペ ロン（ｔｅｔＯ）がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ｔｅｔＯ− ＣＭＶ）に作動可能に連結するもの（この場合、ｔｅｔ−ＫＲＡＢ転写リプレッ サータンパク質を発現する細胞系が用いられる）のような合成プロモーターの転 写制御の下にＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを有するＤＮＡ分子を構築することにより達 成される。 実施例５．ＦＶＩＩＩ発現カセットの相同組換えアーム 外来性遺伝子を標的細胞のゲノムに挿入して安定な遺伝子発現を得るのに相同 組換えを用いることができる。この技術を用いて、ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡの 標的を標的細胞のゲノムＤＮＡに設定することができる。ヒトアルブミン遺伝子 又はヒトα−胎児タンパク質から誘導される細胞ＤＮＡの大セグメントを用いた （３２、３３）。ＦＶＩＩＩミニＡｄベクター中の１２．５ｋｂアルブミンプロ モーターは、６ｋｂを上回る幾つかの下流断片が 潜在的な３’組換えアームとして調製されたのに対して、上流相同組換えアーム として作用する。本発明において用いられるアルブミン遺伝子、遺伝子間領域及 びα−胎児タンパク質遺伝子領域の形状が図３１に示されている。５’末端にこ の１２．５ｋｂアルブミンプロモーターを含み、且つ３’同族組換えアームとし ての役割を果たす幾つかの領域を含むプラスミドＧＴ２０６１内の発現力セット の構造が図３２に示されている。これらのベクターは、これらのアームの方向が 正常ヒトゲノムにおける配列と同じ方向であるため、相同組換え置換ベクターと しての役割を果たす。ヒトアルブミン遺伝子から誘導される３’ＸｈｏＩ組換え アーム及びＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位にクローン化されたｐＡ１ｂ−Ｅ５ セグメントを含む構築体（ＧＴ２０６３）が図３３に示されている。３’アルブ ミン相同組換えアームに隣接するヒトアルブミンプロモーター誘導ｈＦＶＩＩＩ を構築するのに適するベクターの制限酵素消化が図３４に示されている。プラス ミドｐＥ５のＸｈｏＩアルブミン遺伝子断片をＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位 に挿入することによりプラスミドＧＴ２０６３を構築した。 実施例６．ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの生成 １２．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヒトアルブミンプロモーター断片 をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、ＣＡ）に挿入 した。こ れにより、ヒトアルブミンプロモーターベクターＧＴ４０３１は、ヒトＦＶＩＩ Ｉ ｃＤＮＡ（５’末端にＳＶ４０早期イントロンを、及び３’末端にＳＶ４０ ポリアデニル化シグナルを含む、ＧＴ２０５１のＸｈｏＩ乃至ＳａｌＩの領域） が挿入されている独自ＳａｌＩ部位を含む。得られたプラスミドＧＴ２０５３は 、ポリアデニル化部位の３’、に位置する独自ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を含む （図２９）。Ａｄ最小ＩＴＲ及び野生型パッケージ化シグナルをプラスミドＧＴ ２０３３からＸｈｏＩ消化により切り出し、プラスミドＧＴ２０５３のＳａｌＩ 部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０６１を生成した。アルブミン遺伝子の ６．８ｋｂアームｐＡｌｂ−Ｅ５から単離し、ＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位 にクローン化してプラスミドＧＴ２０６３を生成した。ＧＴ２０６３をヘルパー ウイルスＤＮＡと共に２９３細胞に形質移入し、ＧＴＶ２０６３と呼ばれるミニ Ａｄ ＦＶＩＩＩミニウイルスを生成した。 ＦＶＩＩＩミニウイルスを生成するため、ヘルパーウイルスゲノム（２μｇ） をウイルス粒子から精製し、ヘルパーＡｄゲノム（０．２μｇ）と共にリン酸カ ルシウム介在形質移入（８１）により２９３細胞に同時形質移入した。ＣＰＥが 出現した後、細胞非含有凍結解凍溶解物を調製し、新鮮な２９３細胞の感染に用 いた。その細胞上清中に、コーテスト色素生成検定（ファルマシア（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ））を用いて、ＦＶＩＩＩＧＴ２ ０６３ミニＡｄの存在を示すヒトＦＶＩＩＩが検出された。これらのデータはヘ ルパー／ＧＴ２０６３ミニＡｄベクター混合物の増殖と一致した。 さらに別のアプローチ（図３５）においては、Ａｄパッケージ化シグナル及び Ｅ１領域を欠いているがＡｄタンパク質の残部をコードするアデノウイルスヘル パープラスミドｐＢＨＧ１０をミニＡｄクローンＧＴ２０６３と共に２９３細胞 に同時形質移入した。このＡｄミニウイルスゲノムの救済は、２９３細胞の感染 の後、弱力化パッケージ化機能を有するＥ１置換ヘルパーウイルスを用いて達成 した。本発明の方法論を用いて、ヘルパーＡｄ／ミニＡｄ比は変化し得るが、こ れらのＡｄヘルパー及びミニＡｄゲノムの両者をパッケージ化することが可能で あり、いずれかのゲノムを坦持するアデノウイルス粒子を生成することが可能で ある。 ＦＶＩＩＩミニＡｄの生成及び検出がそれぞれ図３５及び３６に示されている 。ヘルパープラスミドｐＢＨＧ１０（０μｇ）及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む ミニＡｄベクター（ＧＴ２０６３；２μｇ）を、リン酸カルシウム形質移入（８ １）により２９３細胞に同時形質移入した。２９３細胞への形質移入は、公知の 広く利用可能な技術のいずれか、例えば、リポフェクチン（すなわち、ギブコ／ ＢＲＬ製のリポフェクタミン）又は電気穿孔法（すなわち、バイオ・ラッド（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ）から入手可能な試薬及びエレクロトポレーター）を用いて行う ことができる。形質移入２９３細胞への弱力化ヘルパーウイルスの感染は形質移 入の３日後に行った（図３５Ｂ）。アデノウイルスの感染が十分に進行している ことを示す図３５Ｂの細胞変性効果（ＣＰＥ）は感染の４日後に観察された。そ の後、ウイルス貯蔵物（継代０、すなわちＰ０）を、感染細胞ペレットを複数回 凍結−解凍することにより調製した。次に、２９３細胞をＰ０貯蔵物に感染させ （１：１）、感染の２４時間後に集めた上清はｈＦＶＩＩＩ配列の存在に特異的 なＰＣＲで陽性であった。６日後にＣＰＥが検出され、凍結−解凍溶解物（Ｐ２ ）を調製した。次いで、このＰ２溶解物をＰＣＲによりパッケージ化ＧＴ２０６ ３ミニＡｄの存在及び機能的ｈＦＶＩＩＩについて試験した。２９３細胞におけ るｈＦＶＩＩＩの発現は、ヒトアルブミンプロモーターがこれらの細胞において は活性が低いため、最小であるものと予想された。これは、リン酸カルシウム沈 殿形質移入法を用いて２９３細胞にＧＴ２０６１を形質移入した後、ＣＡＴ検定 （６９）及びＦＶＩＩＩ色素産生検定（ヘレナ・ラボラトリーズ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ファルマシア）の両者を用いて測定されている 。 実施例７．ミニＡｄＦＶＩＩＩの増幅及び生成 出願人は、以前、１９９６年５月３１日に米国特許出願番号０８／６５８，９ ６１号を出願し、その出願の中 でミニＡｄＦＶＩＩＩベクターＧＴ２０６３を生成し、且つ増殖物の初期継代を 実施するための試薬及び方法論を提供した（７９、８０）。これらの増殖段階に おいて、出願人は、ヘルパーウイルスＡｄＨβに対するミニＡｄＦＶＩＩＩの比 が増殖の進行に従って増加することを見出した。本願は、いずれも当業者に公知 の通常の技術であるＰＣＲ及びサザンブロットを用いる、ヘルパーに対するベク ターの比の分析を提供する。全ての継代について、５００μｌの（感染細胞の３ 回の凍結／解凍サイクルにより得られた）ウイルス粗製抽出物を６ウェルプレー トのウェルにおける２９３細胞の新たな亜集密単層の感染に用いた。感染の１時 間後、１．５ｍｌの新鮮な培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）を添加した。細胞変 性効果（ＣＰＥ）が完了したら直ちに細胞を回収し、再度ウイルスを抽出した。 各々の継代において、２ｍｌのうちの０．５ｍｌが用いられ、そのためこの増殖 の増幅スケールは１対４である。全ての継代の清澄化した粗製溶解物を用いて、 ＳＤＳ／ＥＤＴＡ／プロテイナーゼＫ消化及びエタノール沈殿によりウイルスＤ ＮＡを精製した。このウイルスＤＮＡをＰＣＲ及びサザンブロットに用いてミニ Ａｄ及び、独立に、ヘルパーＡｄウイルスＤＮＡを検出した。 ＰＣＲはヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いて行い、増幅 は、ＤＮＡ抽出の前にＤＮＡ分解酵素処理を行ってあらゆる残留非ウイルス汚染 プラス ミドＤＮＡを除去したウイルスに対して行った。ＰＣＲは、テンプレートとして の単離ウイルスＤＮＡ（単離されたウイルスＤＮＡの１／２０）、最終濃度１μ ＭのＦＶＩＩＩプライマー＃１（配列番号１；ＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧ ＡＡＡＧＡＡＧＡとして記載）、最終濃度１μＭのＦＶＩＩＩプライマー＃２（ 配列番号２；ＣＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴとして記載）、 及び以下の条件を用いて行った：５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の 重合、９４℃で１分間の変性を合計３５サイクル。これらの結果は、ＦＶＩＩＩ ミニウイルスが早期継代中に存在することを示した（継代３；データは示さず） 。 図３６は、ＦＶＩＩＩミニＡｄ及び、独立に、ヘルパーＡｄのパッケージ化シ グナルのＰＣＲ増幅の結果を示す。ＰＣＲをパッケージ化シグナル領域に対して も行った。ＰＣＲは、テンプレートとしての単離ウイルスＤＮＡ（単離された全 ウイルスＤＮＡの１／２０）、最終濃度１μＭのパッケージ化シグナルプライマ ー＃１（配列番号３；ＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧ）、最終濃度 １μＭのパッケージ化シグナルプライマー＃２（配列番号４；ＣＣＡＴＣＧＡＴ ＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧ）及び以下の条件を用 いて行った：５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の重合、９４℃で１分 間の変性を合成３５サイクル。ヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルが部分的に 欠失し ているため、パッケージ化シグナル欠失ヘルパーからのＰＣＲ産生物は野生型パ ッケージ化シグナルを有するミニＡｄのもの（約３１０ｂｐ）より短い（１７７ ｂｐ）。初期継代においてはＦＶＩＩＩミニＡｄは検出されないが、その存在は 継代３乃至６において徐々に検出された。同じ結果がサザンブロット分析を用い て得られた（図３７）。サザンブロット分析におけるプローブとして、ＦＶＩＩ ＩミニＡｄ及びヘルパーＡｄの両者に存在する右ＩＴＲに隣接するＡｄ ＤＮＡ 断片を用いた。ミニＡｄ ＧＴ２０６３及びＡｄＨβのＰｓｔＩ消化の後に検出 される断片の予想される長さは、それぞれ、３．３及び２．２Ｋである。図３７ は、継代１乃至２１から独立に単離されたＦＶＩＩＩミニＡｄ ＤＮＡの４つの サザンブロット（Ａ−Ｄ）を編集したものである。ミニＡｄＦＶＩＩＩに相当す る３．３Ｋｂバンドが継代５−２１から単離されたＤＮＡに検出された。ＦＶＩ ＩＩミニＡｄ ＤＮＡの安定な増加が継代１０まで検出され、その後継代１２ま でＦＶＩＩＩミニＡｄが漸進的に減少した。このＦＶＩＩＩミニＡｄ ＤＮＡの 水準の増加及び減少のサイクルは４つの継代ほぼ全てに生じることが観察され、 これには僅かに早く開始するヘルパーＡｄ ＤＮＡの水準の平行なサイクルが付 随した。これらのサイクルをより十分に決定するため、サザンブロットからＦＶ ＩＩＩミニＡｄ ＤＮＡ及びヘルパーＡｄ ＤＮＡの量を濃度測定により定量し 、図３８にプロットした。等量の マーカー（ギブコ、ゲーサーズバーグ、ＭＤからの１Ｋｂラダーマーカー）から のバンドの強度を用いて、異なるブロットの結果を標準化した。観察されたサイ クルは、欠陥妨害性ウイルスに関連して生成するウイルス集団（本発明の系にお いては、このウイルス集団はＦＶＩＩＩミニＡｄを含む）及びヘルパーウイルス の公知の動態と一致する。これらのサイクルの理解及び制御は、最適力価を得る ためにどの継代でミニＡｄべクターを精製するべきであるのかを決定するのに重 要である。＃１８（Ｐ１８）のような継代は、低力価ではあるが、ＦＶＩＩＩミ ニＡｄに富むベクター調製品を生じる（すなわち、Ｐ１８はヘルパーＡｄより１ ０倍多いＦＶＩＩＩミニＡｄを含むものと考えられる）。＃２０（ｐ２０）のよ うな継代は、１：１の望ましくないＦＶＩＩＩミニＡｄ対ヘルパーＡｄ比ではあ るが、高濃度のＦＶＩＩＩミニＡｄ及びヘルパーＡｄを含む。 大規模増幅をｐ２０で行った。各々約１０9個の感染２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１５７３）を収容する１００の１５ｃｍ皿をＣＰＥが完了したら直ちに回 収した。その後、粗製溶解物を３回の凍結／解凍サイクルによって調製してウイ ルスを抽出した。この粗製溶解物を遠心によって清澄化し、ＣｓＣｌの段階濃度 勾配（１．５、１．３５、及び１．２５ｇ／ｍｌの３層）にのせて３５０００Ｘ ｇで１時間遠心した。ミニＡｄ及びヘルパーＡｄに相当するバンドを、１．３５ ｇ／ｍｌの第２連続Ｃ ｓＣｌ勾配を用いてさらに精製した。３５，０００ｒｐｍ（１５０，０００Ｘｇ ）で１６時間遠心した後に類似の強度を有する２つのバンドが観察され、それら を別々に単離して１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中 に透析した。各々のバンドの一定分量からウイルスＤＮＡを精製し、ミニＡｄＦ ＶＩＩＩ及びヘルパーの量をサザンブロットにより分析した。上部バンド（より 軽量）は主としてミニＡｄを含み、下部バンドは主としてヘルパーＡｄを含むも のと思われた。これらの結果はＦＶＩＩＩミニＡｄゲノム（ＧＴ２０６３＝３１ Ｋｂ）がヘルパーＡｄゲノム（ＡｄＨβ＝３７．１Ｋｂ）より小さいことから予 想されたことであり、本願の親出願（１９９６年５月３１日出願の米国０８／６ ５９，９６１号）において示されるＭ３２ミニＡｄについての以前のＣｓＣｌ分 画結果と一致する。 実施例８．細胞系におけるミニＡｄＦＶＩＩＩの試験 ＦＶＩＩＩミニＡｄ（ＧＴ２０６３）を上述の通りＣｓＣｌにより精製し、こ のベクターで感染した宿主細胞におけるＦＶＩＩＩの生成を示すのに用いた。こ の目的を達成するため、２９３及びＨｅｐＧ２細胞を、アルブミンプロモーター を用いるそれらの能力のために用いた。これらの細胞におけるＦＶＩＩＩの生成 は感染の２４時間後に免疫組織化学及び機能的検定により検定した。精製ＦＶＩ ＩＩミニＡｄベクターを０．５ｍｌの培地に添 加し、４ｃｍ2ウェルにおける６Ｘ１０5個の２９３及びＨｅｐＧ２細胞の感染に 用いた。４時間インキュベートしでウイルス粒子を宿主細胞に吸着させた後、そ の感染培地を新鮮な培地に置き換えた。ＦＶＩＩＩミニＡｄを含むより軽量の画 分の１／１００希釈液０．１μｌで２９３細胞を感染させ、これらの細胞をヒト ＦＶＩＩＩの存在について免疫組織科学的分析を行った後、これらの細胞の約１ ０％がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（図４０、パネルＡ−Ｄ）。 ミリリットル当たりの形質導入単位での見積もり力価は６Ｘ１０9形質導入単位 ／ｍｌと決定された。４時間の吸着時間、４ｃｍ2に０．５ｍｌの吸着容積、及 び非振盪吸着を考慮に入れた場合、見積もり力価はそれぞれ０．４２、０．５６ 、及び０．５３の因子だけ減少し得る（４９）。したがって、ミニＡｄＦＶＩＩ Ｉベクターの実際の力価は、４．６Ｘ１０10形質導入因子／ｍｌと見積もられる 。ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を反映する２６０ｎｍでの光学吸収に よって決定される力価は、ＦＶＩＩＩミニＡｄの軽量画分について３．６Ｘ１０12 粒子／ｍｌと決定された。したがって、ＦＶＩＩＩミニＡｄの生物活性は７８ ウイルス粒子毎に１ＦＶＩＩＩ形質導入単位と算出することができ、これは食品 医薬品局が推奨する許容度の水準内に入る。 形質導入細胞の上清中の機能的ＦＶＩＩＩの量を色素産生コースターＦＶＩＩ Ｉ試験（ファルマシア、ピスカ タウェイ、ＮＪ）を用いて測定した。１００万個の２９３細胞又は、独立に、Ｈ ｅｐＧ２細胞に、１００％の形質導入を達成するため、過剰量の精製ベクターを 感染させた。感染条件は上述の通りであり、感染の２４時間後に上清（２ｍｌ） を集めた。標準曲線を作成するため、標準ヒト血漿試料を細胞培養培地で連続的 に希釈して６２．５乃至４０００ｎｇ／ｍｌの最終ＦＶＩＩＩ濃度範囲を得た。 これらの結果が図４１に示される。ＨｅｐＧ２及び２９３上清中に検出されたＦ ＶＩＩＩの量は、それぞれ、０．８及び０．２３ｎｇ／ｍｌであった。したがっ て、２４時間で生成したＦＶＩＩＩの総量は１００万個のＨｅｐＧ２細胞当たり １．６ｎｇ、１００万個の２９３細胞当たり０．４６ｎｇであった。 実施例９．イン・ビボでのミニＡｄＦＶＩＩＩの改善 様々な発現カセットをクローン化することができるベクターを生成することに よりベクター系の改善を達成した。近位アルブミンプロモーター領域並びにＰｍ ｅＩ及びＳａｌＩ部位の間に位置するヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を切除することによ りベクターＧＴ２０６３を改変した。これは、まず、ＳａｌＩリンカーをＰｍｅ 部位にライゲートすることによってＧＴ２０６３のＰｍｅＩ部位をＳａｌＩ部位 に変換することにより達成した。得られたクローンＧＴ２０７２をＳａｌＩで処 理し、再ライゲートして近位アルブミンプロモーター／ｈＦＶＩＩＩ遺伝子 を除去し、それにより様々な発現カセットを挿入するための独自ＳａｌＩクロー ニング部位を有するミニＡｄベクターを作製した。このようなカセットからの発 現は上流に位置するアルブミン遺伝子エンハンサーの影響を受ける可能性がある 。各々のクローンを分析して導入遺伝子の発現の水準を決定した。 この改善されたベクターＧＴ２０７２に挿入するため、発現カセットを調製し た。この例の発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモー ター、伸長因子Ｉ（ＥＦ−Ｉ）プロモーター（これは様々な細胞型で作用するこ とが知られている）又はピルビン酸ホスホエノールカルボキシキナーゼ（ＰＥＰ ＣＫ）遺伝子の肝臓特異的プロモーターを含む。ＥＦ−Ｉ及びＣＭＶプロモータ ーは、各々別々に、完全長ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ又はＢドメイン欠失（ＢＤＤ） 第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのいずれかの発現を駆動するのに用いた（それぞれ、図 ４２及び４３）。次に、ＳａｌＩ部位が隣接するＥＦ−１ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ カセットをＧＴ２０７３のＳａｌＩ部位にクローン化し、図４２に示されるプラ スミドを生成した。完全長ヒトＦＶＩＩＩコーディング領域をＣＭＶプロモータ ーの制御の下に含む発現ベクターも構築し、これは図４３に示される。 実施例１０．組み込み可能なＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐ系ベースのベクターの構築 アデノ関連ウイルスは、アデノウイルス又はヘルペスウイルスのようなヘルパ ーウイルスの存在下においてのみ複製する、ヒト非病原性一本鎖直鎖パルボウイ ルスである。しかしながら、ヘルパーが存在しない状況では、ＡＡＶは宿主細胞 ゲノムに特異的に組み込まれ、潜在的なプロウイルスとして維持される（３４） 。ＡＡＶが組み込まれる特定の遺伝子座は染色体１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒに位 置しており、ＡＡＶＳ１と呼ばれる（２２−２５、３５）。 ＡＡＶ組み込みの機構は完全には解明されていない。しかしながら、２つのウ イルス要素がこのプロセスに関連付けられている：ＡＡＶ ＩＴＲ及び２つの形 態のＲｅｐウイルスタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）。ＡＡＶ ＩＴＲ （逆末端反復）はＡＡＶゲノムの両端に存在する回文構造配列であり、これはヘ アピン構造に折り畳まれ、複製起点として作用する。Ｒｅｐ７８／６８タンパク 質については、配列特異的ＤＮＡ結合（３６、３７）、配列及び鎖特異的エンド ヌクレアーゼ活性（３８）、及びＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性（３８−４０）を 含む幾つかの活性が記述されている。これらのタンパク質はＩＴＲ ＤＮＡの特 定の配列に結合することが可能であり、それによってＩＴＲヘアピンに切れ目が 入って複製が行われる末端分解と呼ばれるプロセスを促進する。Ｒｅｐ結合モチ ーフ及び末端分解部位（ｔｒｓ）はＡＡＶ ＩＴＲ及びＡＡＶＳ１の両者におい て同定され ており、Ｒｅｐの存在下においてイン・ビトロＤＮＡ複製を促進することが示さ れている（２８）。また、Ｒｅｐ６．８タンパク質がイン・ビトロでのＡＡＶ ＩＴＲとＡＡＶＳ１部位との複合体形成に介在し得ることも示されている（４１ ）。これらの発見は、ＩＴＲ及びＡＡＶＳ１部位でのＲｅｐのＤＮＡ結合及びエ ンドヌクレアーゼ活性が、制限されたＤＮＡシンターゼと共に、ＩＴＲの間に含 まれる配列の標的設定された組み込みを可能にすることを示唆する（２７）。 ＡＡＶは遺伝子治療の候補ベクターとして考えられている。しかしながら、そ れが受け入れることができる外来性ＤＮＡのサイズの制限（４．２Ｋｂ）、大規 模調製において高力価を得ることの困難性、及び組換えＡＡＶの特異的組み込み の喪失がこのウイルスを遺伝子治療ベクターとして用いる上での問題を引き起こ す。 １０．１ ＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系を試験するためのプラスミドの 構築 ミニＡｄベクターへのＡＡＶ組み込み機構の取り込みに向けて（図４４）、出 願人は組み込みに必要なアデノ関連ウイルス要素を含むプラスミドベクターを開 発して試験している。本発明の設計（図４５）において、このベクターは（ウイ ルス内在性プロモーターを含む）Ｒｅｐ発現カセットに加えて２つのＡＡＶ Ｉ ＴＲが隣接するレポーター遺伝子の発現のためのカセットからなる。このＲｅｐ 発現カセットは、プラスミドｐＳＵＢ２０１ （４１）に由来するＡＡＶゲノムの配列１９３乃至２２１６のＰＣＲ増幅の後に 得られた。この断片はＩＴＲの後の右側から始まり、ｐ５プロモーター及びＲｅ ｐ７８コーディング領域を通して延びる。 １０．２ 培養細胞におけるＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系の試験 一時的に形質移入した２９３細胞及びＥ１非発現細胞系（チャン肝細胞）にお けるこのプラスミドからのＲｅｐの発現を、免疫沈殿に加えて、特異的抗体を用 いるウェスタンブロットにより試験した。それらの結果（図４６）は、２種類の 異なる形態のＲｅｐが２９３及びチャン肝細胞に生成されることを示す。Ｒｅｐ ７８は二重の白色として現れ、Ｒｅｐ５２、ｐ１９プロモーターの産生物は単一 のバンドとして現れる。チャン肝細胞においては、信号は２９３細胞のほうがよ り強いものの、２種類の主要な形態、同様に二重線としてのＲｅｐ７８及びＲｅ ｐ５２、が検出される。 これらのプラスミドの特異的組み込み能力を試験するため、Ｒｅｐ発現カセッ トを除去し、しかしながらレポーター遺伝子発現カセットは２つのＡＡＶ ＩＴ Ｒの間に配置したままにすることにより対照プラスミドを構築した。２９３細胞 にプラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した後、Ｇ４１８（０． ５ｍｇ／ｍｌ）で１２日間選択した。Ｇ４１８耐性コロニーを単離して増殖させ 、ゲノムＤＮＡを異なるコロニーから塩沈殿法 （１２５）により抽出した。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＡＡＶＳ１に 対するプローブを用いるサザンブロットにより分析した。ＥｃｏＲＩは、ＡＡＶ Ｓ１遺伝子座が８ＫｂのＥｃｏＲ１−ＥｃｏＲ１断片内に含まれることから選択 した。図４７（パネルＡ）は、正常な配列に相当する８ｋｂのバンドに加えてシ フトしたバンドの存在により示されるように、プラスミドＧＴ９００３（Ｒｅｐ 発現プラスミド）から誘導した分析済の耐性コロニーの５０％が少なくとも１つ のＡＡＶＳ１遺伝子座の再配置を見せたことを示す。プラスミドＧＴ９００４か ら誘導されるコロニーにおいては再配置は観察されず、これは、この現象がＲｅ ｐの発現に依存することを示す。これらの結果は、Ｒｅｐが導入遺伝子の特異的 組み込みを駆動し得ることを示唆していた。次に、これらのメンブランをｎｅｏ に対する特異的プローブと再度ハイブリダイズさせた（図４８、パネルＢ）。得 られたバンドのパターンは、幾つかのＡＡＶＳ１の再配置がｎｅ０に相当する（ 例えば、クローン２Ｌ２）ことを示したが、おそらくは適用した選択圧のために 分析したクローンにおいて無作為組換え現象が頻繁に生じることをも示唆してい た。 １０．３ 選択圧のないＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系の試験 この可能性を除外するため、プラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を用い て別の一組の実験を行った。こ れらのプラスミドにおいては、レポーター遺伝子はＧＦＰ（エクオレア・ビクト リア緑色蛍光タンパク質）である。このレポーターは細胞を、フローサイトメト リーによる仕分け及び単細胞クローン化を含むがこれに限定されるものではない 方法を用いる単離に適するものとし、それによりｎｅｏ発現カセットによって付 与される選択圧の効果を排除する。２９３細胞にいずれかのプラスミドを形質移 入した。形質移入の１日後、所定の蛍光範囲に入る（それにより形質移入性の相 違による可変性を除去する）細胞をフローサイトメトリーにより仕分け、単細胞 を９６ウェルプレートにおいてクローン化した。仕分けの２乃至３週間後、コロ ニーを蛍光について採点した。３回の独立の実験を行い、それらの結果が表２− ｌに示されている。クローン化効率（播種ウェルの総数当たりの発生したコロニ ーの数）はＧＴ９１３誘導細胞について幾らかの可変性を示したが、プラスミド ＧＴ９０１２を形質移入したものについては一般に一定であった。プラスミドＧ Ｔ９０１２から誘導されるコロニーは約５０％が蛍光を発し、且つ引き続く継代 においてそれらの蛍光を維持し、それに対してプラスミドＧＴ９０１３から誘導 されるものは８％が幾らかの蛍光を示した。蛍光強度は微かであり、観察は宿主 細胞ゲノムへの１もしくは数コピーのＧＦＰ発現カセットの組み込みと一致する 。興味深いことに、幾つかのコロニーはＧＦＰ発現のモザイク現象を示した。こ れの説明の１つは、仕分けされた 細胞が分裂を始めた後に組み込み現象が生じ、これが２種類の異なる集団を発生 させたとするものであり得る。平行する実験においては、ＧＦＰ発現カセットを 単独で含むプラスミドｐＣＡ−ＧＦＰ（ウイルス配列を含まない）を細胞に形質 移入した。仕分けに加えて単細胞クローン化の後、蛍光を発するコロニーは検出 されなかった（表２−１）。考え合わせると、これらの結果は、組み込みの効率 はＡＡＶ ＩＴＲの存在によって高められるが、Ｒｅｐが発現する場合には４− ５倍高いことを示す。ＡＡＶＳ１におけるＧＦＰの標的設定された組み込みをさ らに分析するため、幾つかのコロニー（蛍光性及び非蛍光性）を成長させ、ゲノ ムＤＮＡを上述の通りに抽出した。図４８（パネルＡ）は、ＡＡＶＳ１に対する プローブを用いるサザンブロットによって得られた結果を示す。プラスミドＧＴ ９０１２から誘導される幾つかのコロニーにおいてはＡＡＳＶ１の再配置が実際 に検出され、これに対してＧＴ９０１３誘導コロニーにおいては再配置は検出さ れず、これは、Ｒｅｐの存在が標的設定された組み込みに必要であることを示す 。次に、このメンブランをＧＦＰについて探索し、再配置されたバンドとの一致 をチェックした（図４８、パネルＢ）。親細胞系２９３は予想通り陰性であった 。５つのコロニーがＡＡＶＳ１で得られるものに一致する８Ｋｂ上回るバンドを 示し、したがって、ＡＡＶＳ１におけるＧＦＰの特異的組み込みを示す。全体的 に見て、上に示される結果は、Ａ ＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐを含むプラスミドが宿主ゲノムＤＮＡに高頻度で組み込 まれ得ることを示し、且つこの設計がアデノウイルスベクターによって送達され る配列の組み込みに有用であることを示唆する（図４４）。 表２−１．単細胞クローン化実験の結果 *播種したウェルの数当たりのコロニー数を示す。 **コロニーの数当たりの、仕分けの２週間後に蛍光性細胞を示すコロニーの数 を示す。 実施例１１．ＦＶＩＩＩ発現カセットの部位特異的組み込み Ｒｅｐ７８の発現と結び付けられるプラスミドへのＩ ＴＲ ＤＮＡ配列の導入が関心のあるＤＮＡ配列の細胞ゲノムへの組み込みを増 強することは、本願の親出願（１９９６年５月３１日に出願された米国０８／６ ５９，９６１号）において本出願人らによって以前に示されている（５６）。こ の以前の発明は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接するレポーター遺伝子［すなわち、 ｎｅｏ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子］を有する発現カ セット（以下、組み込みカセットと称する）を上流Ｒｅｐ発現カセットと組み合 わせて含む複数のプラスミドを包含する（図４４、パネルＡ−Ｄ）。実験の結果 は、これらのプラスミド（すなわち、ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２）の組み込 み効率がＲｅｐ活性を欠くプラスミド（すなわち、ＧＴ９００４及びＧＴ９０１ ３）よりも約１０倍高いことを示す。このデータは、さらに、Ｒｅｐが宿主細胞 ゲノムへの外来性ＤＮＡの効率的な標的設定された組み込みに必須であることを 示す。これらの結果を鑑みて、本発明は、Ａｄベクターの利点（高力価調製品、 外来性ＤＮＡに対する大きな収容力、複数の細胞型の高水準の感染性）及びＡＡ Ｖの組み込み能力を兼ね備えるハイブリッドベクターを提供する。本発明のこの ハイブリッドウイルスはアデノウイルスとして複製し、組み込みに十分なＡＡＶ 要素を含む。 本発明は、Ｒｅｐ発現カセット及びＡＡＶ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩ発現 カセットを有するミニＡｄベクターを含む（図４４）。さらなる外来性ＤＮＡ（ ３６ｋ ｂまで）をこのベクターに挿入することができる。このベクターのさらなる外来 性ＤＮＡはヒトアルブミンゲノム配列（非コーディング）に相当する。Ｒｅｐ発 現カセットはＡＡＶゲノムの１９３乃至２２１６ｂｐを含む。この断片はＩＴＲ の直後で始まり、ｐ５プロモーター及びＲｅｐ７８コーディング配列を通して延 びる。以下に記載される理由により、７つのｔｅｔオペレーターを含む断片をｐ ５プロモーターの上流に導入し、ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサー（４２）による ｒｅｐ遺伝子の転写抑制を可能とするために含めた。 細胞内の高濃度のＲｅｐタンパク質が細胞成長抑制性であり、ことによるとミ ニＡｄベクターの複製を妨害する可能性がある。そこで、ウイルスベクターの生 成の間Ｒｅｐの発現を阻止するため、ｔｅｔ−ＫＲＡＶリプレッサーを転写スイ ッチとして提供することができる。この目的を達成するため、本発明は、ｔｅｔ −ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を安定に発現する２９３細胞系を提供する。 ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現しない宿主細胞にウイルスが侵 入すると、それらの細胞内にリプレッサーが存在しないためＲｅｐの発現が生じ 、それによりＡＡＶ ＩＴＲが隣接する配列の細胞ゲノムへの組み込みが促進さ れる。このようにして生成するウイルスベクターは、イン・ビトロ及びイン・ビ ボで、組み込みの頻度及び特異性について試験することができる。 実施例１２． ＡＡＶＳ１のクローン化及びベクターの構築 本発明の態様の１つは、イン・ビボ動物モデルとして用いられる、ヒトＡＡＶ Ｓ１組み込み部位を有するトランスジェニックマウスを生成するための方法論で ある。この動物モデルは、上述のＡＡＶ組み込み機構を含むウイルスベクターの 部位特異的組み込みの試験に用いられる。この動物モデルの開発を目指す第１の 段階は、ＡＡＶＳ１部位のクローン化及びその配列の哺乳動物発現ベクターへの 挿入である。 ＡＡＶＳ１ヒト組み込み部位は、最初に、Ｋｏｔｉｎら（５０）によって８． ２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローン化され、その最初の４０６７ｂｐは配列 決定されでいる。このＤＮＡ配列情報を用いて２種類のオリゴヌクレオチドプラ イマーを設計し、続いてそれらを、ＡＡＶＳ１特異的プローブとして用いるため の２５３ｂｐＰＣＲ産生物の生成に用いた。上方プライマーＵ２４９３（配列番 号５：ＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ）はＡＡＶＳ１配列の 塩基対２４９２−２５１５に延びる２３量体であり、下方プライマーＬ２７２２ （配列番号６：ＴＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＧ）もＡＡＶＳ １配列の塩基対２７２２−２７５４に延びる２３量体である。ＰＣＲ増幅は、テ ンプレートとしての１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ並びに 最終濃度１μＭのＵ２４９２及びＬ２７２２プライマー（それぞれ、配列番号５ 及び配列番号６）を用いて以下の通りに行った：９５℃、４分−１サイクル；９ ５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７ 分−１サイクル。２５３ｂｐのＡＡＶＳ１特異的ＰＣＲ産生物をゲノム・システ ム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ）（セントルイス、ＭＯ）に送り、そこでヒト Ｐ１ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。８０−１２０ｋｂの サイズ範囲の４つのＰ１クローン（＃６５７６、６５７７、６５７８、６５７９ ）を正しい２５３ｂｐ ＡＡＶＳ１ ＰＣＲ断片を生じるものと同定した。これ らのクローンがＡＡＶＳ１配列を含むことを確認するため、これら４つのＰ１ク ローンからＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ単独で、又はＥｃｏＲＩをＥｃｏＲＶと 組み合わせて消化し、サザンブロット分析に用いた。２５３ｂｐのＡＡＶＳ１特 異的ＰＣＲ産生物をプローブとして用いるブロットのハイブリダイゼーションに より、全てのクローンが予想される８．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（図４９Ａ）及 び予想される５．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片（図４９Ｂ）を含むこと が明らかとなり、これは、これらがヒトＡＡＶＳ１配列の無傷の完全長コピーを 含むことを示す。８．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン＃６５７６から単 離し、哺乳動物発現ベクターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。 得られた１２．９ｋｂのプラス ミドｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏは、ヒトＡＡＶＳ１配列に加えて、哺乳動物細胞での 選択のためのネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）有する（図５０）。 実施例１３．ＡＡＶＳ１（＋）ＥＳ細胞系の生成及び特徴付け ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成において用いられるＡＡＳＶ１配 列を含むマウス胚幹（ＥＳ）細胞系を生成するため、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラ スミドをマウスＥＳ細胞（１２９Ｓｖアグーチ、ゲノム・システムズ）に形質移 入した（図５１）。２５μｇのｐＡＡＶＳ１−ＮｅｏプラスミドＤＮＡをＸｂａ Ｉで直線化し、バイオラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐ ｕｌｓｅｒ）を用いて電気穿孔法（９７５μＦｄ、２５２ｖ）によりＥＳ細胞に 形質移入した。形質移入細胞を２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８において１週間選択 した。２４のｎｅｏ−耐性（ＮｅｏR）コロニーが単離され、分化全能性表現型 を維持する細胞系を富化させるため、それらを増殖させ、形態により特徴付けて ＞９５％が“非微分化”であるクローンを得た。１７のＮｅｏR ＥＳクローン に加えて非形質移入親ＥＳ細胞系からゲノムＤＮＡを単離し、そのＤＮＡ １０ ０ｎｇをテンプレートとして、プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２（それぞれ 、配列番号５及び配列番号６；最終濃度１μＭ）を用いて、ＡＡＶＳ１特異的Ｐ ＣＲに用いた。ＰＣＲの条件は：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０． ５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サイ クルであった。図５２に示されるように、１７／１７ＮｅｏR ＥＳクローンに 由来するＤＮＡのＰＣＲでは予想される２５３ｂｐのＡＡＶＳ１ ＰＣＲ産生物 が生成し、一方、非形質移入対照ＥＳ細胞に由来するＤＮＡのＰＣＲ分析では検 出可能なＰＣＲ産生物は生成しなかった。サザンブロット分析を対照及びＡＡＶ Ｓ１（＋）ＥＳ細胞系に対して行い、機能的ＡＡＶＳ１配列が形質移入及びゲノ ム組み込みの後に保存されていることを確認した（図５３）。（ＰＣＲによる検 定で）ＡＡＶＳ１陽性のＥＳ細胞系（ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４及びＥＳ＃３．１６ ）をＥｃｏＲＩにＥｃｏＲＶを組み合わせて消化し、電気泳動してブロットし、 ８．２ｋｂ ＡＡＶＳ１プローブとハイブリダイズさせた。ＥＳ＃４及びＥＳ＃ ３．１６細胞系の両者は予想される５．２ｋｂ及び３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｅ ｃｏＲＶ断片を含み、これは８．２ｋｂ ＡＡＶＳ１配列全体の組み込みを示す （図５３）。非形質移入親ＥＳ細胞は、このヒトＡＡＶＳ１特異的プローブを用 いてハイブリダイズするバンドを示さなかった。ＡＡＶウイルスはヒトに加えて マウスゲノムに組み込まれるが、ＡＡＶＳ１のマウス相同体（これは未だ同定さ れていない）はヒトの配列とは大きく相違するはずでヒトＡＡＶＳ１プローブと は交差ハイブリダイズしないことが知られているため、対照マウスＥＳ細胞に幾 らかのハイブリダイゼーション が検出されることが予想されていた。これらのＡＡＶＳ１（＋）細胞系ＥＳ＃４ 及びＥＳ＃３．１６の各々を、ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成を目 指す次の胚盤胞微量注入実験に用いた。 実施例１４．ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成 未分化の分化全能性表現型を保存するため、ＡＡＶＳ１陽性ＥＳクローンＥＳ ＃４及びＥＳ＃３．１６を白血病抑制因子（ＬＩＦ−抗分化因子）の存在下にお いて１°ネズミ胚性線維芽細胞支持層上で成長させ、非常に低い継代（Ｐ．２− Ｐ．７）で維持した。第３．５ｐ．ｃ．に胚盤胞段階の胚を過剰排卵Ｃ５７ＢＬ ／６マウスから集め、Ｍ１６胚培地において維持した。１５−２０個のＥＳ細胞 （ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４又はＥＳ＃３．１６）を３．５日の胚の胞胚腔にライツ （Ｌｉｅｔｚ）ＤＭ−ＩＬＢマイクロインジェクション・ワークステーション（ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて微量注入し た。微量注入に続いて、これらの胚をＭ１６培地に戻し、５％ＣＯ2中３７℃で ２時間インキュベートして胚盤胞に再度腔を形成させた。続いて、１０−１５個 の注入胚盤胞を、交尾後（ｐ．ｃ．）第２．５日の偽妊娠ＣＧ６Ｆ1仮母の子宮 に移した。子宮に移入された後、それらの胚盤胞は子宮壁に植え付けられ、ＡＡ ＶＳ１陽性ＥＳ細胞が胚の内部細胞塊に取り込 まれてそれらの遺伝情報を胚の発生に渡し、その結果約１７日後にトランスジェ ニック（キメラ）子孫が誕生する。現在までに４０を上回る高率で雄キメラ（始 祖）が生成されている。ＥＳ細胞誘導アグーチ（茶色）毛皮色遺伝子の高率の寄 与を示すこれらのキメラ始祖の幾つかの例が図５４に示されている。キメラマウ スにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためにＰＣＲ分析を行った。ゲノム ＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラ及び非キメラ同腹子の尾から単離し、これらのＤＮＡ １００ｎｇを、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２（それ ぞれ、配列番号５及び配列番号６）を最終濃度１μＭで用いるＰＣＲ分析により スクリーニングした。ＰＣＲの条件は：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０ ．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サ イクルであった。正しい２５３ｂｐ ＡＡＶＳ１ ＰＣＲ産生物が高率キメラに 由来する尾ＤＮＡにおいては実際に検出された（図５７、レーン７）が、非キメ ラ同腹子の尾ＤＮＡ又は１０％未満のアグーチ毛皮色キメラ現象を示す低率キメ ラにおいては検出されなかった（図５５、それぞれレーン５及び６）。したがっ て、ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列をクローン化し、それをマウス胚性幹細胞に形 質移入し、これらのＥＳ細胞を胚盤胞段階の胚に微量注入し、得られたトランス ジェニックマウスのゲノム内にこのヒト導入遺伝子の存在を示すことに成功して いる。これらのキメラ始祖は、 現在、ヒトＡＡＶＳ１導入遺伝子の生殖系列伝達を得るために野生型Ｃ５７ＢＬ ／６の雌と共に飼育されている。ひとたび生殖系列伝達が達成されると、そのＦ １ヘテロ接合体子孫を飼育することでホモ接合ＡＡＶＳ１トランスジェニックマ ウス系が得られる。次に、このホモ接合系を用いてＡＡＶウイルスベクター、ハ イブリッドアデノウイルス／ＡＡＶウイルスベクター、又はＡＡＶＳ１部位での 組み込みに必要とされるＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐ７８／６８遺伝子を含む他の あらゆるプラスミドベクターのいずれかのＡＡＶＳ１部位特異的組み込みの試験 に用いることができる。このＡＡＶ導入遺伝子は、ウイルスの感染（Ｉ．Ｖ．注 入の後）により、又はリガンド介在ＤＮＡ／リポソーム複合体を用いることによ り、イン・ビボでＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスに送達することができる 。部位特異的組み込みの頻度、組み込まれた導入遺伝子の安定性及び安定なタン パク質発現の持続期間（すなわち、ヒト第ＶＩＩＩ因子又は第IX因子）は標的細 胞への組み込みの後に評価することができる。 ゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニックマウスへのア デノ関連組み込み要素を含むウイルスベクターのイン・ビボ送達の効率は以下の 方法で試験することができる。本発明のウイルスベクターをトランスジェニック マウスの静脈内又は門脈に注射する。このベクターは医薬組成物の一部であって もよく、且つ リポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）のような脂質及び／又は肝臓特異的リガン ド（７９、８０）と複合体を形成していてもいなくてもよい。マウスにウイルス ベクターを投与した後、血液試料を１年まで、もしくはそれ以上、毎週尾の静脈 から採取して導入遺伝子の発現の持続を評価する。ウイルスベクターのエフェク ター又はレポーター遺伝子の発現水準は、ノーザンブロット、ＲＮＡ分解酵素保 護検定、又はＰＣＲのような技術を用いて測定する。ＦＶＩＩＩミニＡｄの試験 において、ＦＶＩＩＩはＥＬＩＳＡ検定により検出する。導入遺伝子の発現の持 続を決定するため、各血液試料中のエフェクター又はレポーター遺伝子の発現水 準を互いに比較する。また、ベクターの部位特異的組み込みを決定するため、そ の動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する。その後、ＡＡＶＳ１特異的プラ イマー及びこのベクターの配列と相同の配列を含むプライマーを用いるゲノムＤ ＮＡのＰＣＲ分析を行う。このベクターの、トランスジェニック動物ゲノムのＡ ＡＶＳ１部位での部位特異的組み込みにより、ＡＡＶＳ１及びベクター配列の両 者を含む産生物が生じる。増幅したＰＣＲ産生物は、ウイルスベクターがその動 物のＡＡＶＳ１部位に組み込まれているのであれば、ベクター配列を含む。 実施例１１． Ａ．ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するＦＶＩＩＩ トランスジェニックマウス ｎｅｏ又はＧＦＰレポーター遺伝子のいずれかを含むＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ ベクター（それぞれ、ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２）をヒト２９３細胞に形質 移入した。次に、これらの細胞の抽出物を、サザンブロットにより、内在性ＡＡ ＶＳ１部位でのこのベクターの部位特異的組み込みについて検定した。ＡＡＶＳ １での組み込みは、ＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐベクターのｎｅｏ又はＧＦＰ）バー ジョン（それぞれ、ＧＴ９００３又はＧＴ９０１２）のいずれかを形質移入した 後に得られた試料においで５０％の頻度で観察された。これらの結果は、これら のＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐコーディング領域がＡＡＶＳ１での高効率の部位特 異的組み込みを導くのに十分なものであることを示す（５６）。ＡＡＶ−ＩＴＲ ／Ｒｅｐ組み込み要素を含むミニＡｄ−ｈＦＶＩＩＩベクターがイン・ビボでＡ ＡＶＳ１を標的とし、部位特異的な様式で組み込まれ、且つｈＦＶＩＩＩの長期 間の発現を維持することを示すため、動物モデル系を開発した。 本発明は、そのゲノム内にヒトＡＡＶＳ１組み込み部位を有するトランスジェ ニックマウスを包含する。このトランスジェニックマウスは、図５１に示される 胚幹細胞操作技術（４３）を用いて生成される。８．２ｋｂヒトＡＡＶＳ１配列 全体及びｎｅｏ（もしくはＮｅｏ）選択マーカーを含む発現ベクターを構築する 。このＡＡＶＳ１／Ｎｅｏベクターを分化全能性マウス胚幹（ＥＳ） 細胞に移入してＮｅｏＲ、ＡＡＶＳ１+ＥＳ細胞クローンを得、続いてこれをマ ウス胚盤胞段階の胚に微量注入しで仮母の子宮に移植する。移植の後、このＡＡ ＶＳ１+ ＥＳ細胞は正常な胚発生を再開し、それらのゲノム情報（ヒトＡＡＶ Ｓ１配列を含む）を発生する胚に渡す。キメラ（トランスジェニック）子孫はＥ Ｓ細胞誘導アグーチ茶毛皮色の存在によって同定する。次に、キメラ始祖を野生 型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと共に飼育して導入遺伝子の生殖系列伝達を得る。Ｆ１ ヘテロ接合体を飼育して、そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１組み込み配列が安定に取 り込まれているホモ接合マウス系を得る。次いで、このマウスモデルに尾の静脈 又は門脈を介してＡＡＶ−ＩＴＲ／ミニＡｄ−ＦＶＩＩＩベクターを注射し、イ ン・ビボ形質導入効率、ヒトＡＡＶＳ１配列での組み込み、及び導入遺伝子発現 の持続を評価する。 Ｂ．ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニックマウス ＦＶＩＩＩ寛容化マウスモデル系も本発明によって提供される。過去、ＦＶＩ ＩＩ寛容化は、新生児マウスにＦＶＩＩＩを一時的に注入することにより達成さ れている（４４）。本発明は、発生期特異的な様式で作用するプロモーターの制 御下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有するマウスを包含する。このようなプロモータ ーにはα−胎児タンパク質遺伝子又は胚性グロビン遺伝子、イプシロンのものが 含まれ得るが、これらに限定されるものでは ない。α−胎児タンパク質プロモーターは、成熟動物においては不活性である早 期発生段階特異的プロモーターの例である（４５）。胚性グロビン遺伝子、イプ シロンは、本発明において用いることができる発生的に調節される遺伝子の別の 例である。α−胎児タンパク質プロモーターの制御下において、遺伝子の発現は 肝臓に限定され、活性化については肝臓特異的転写因子に依存する（４６、４７ ）。ＦＶＩＩＩ発現の正常部位及びＦＶＩＩＩ遺伝子送達の好ましい標的臓器が 肝臓であるため、同様に発生的に調節される肝臓特異的プロモーター要素が好ま しい。α−胎児タンパク質プロモーター（ＡＦＰ）はこれらの基準の両者を満た す。α−胎児タンパク質プロモーターは未分化ＥＳ細胞においては作用しないが 、分化の間に誘発される（４８）；これは、そのようなものとして、トランスジ ェニックマウスにおけるｈＦＶＩＩＩの発現の制御に用いることができる。 本発明の目的の１つは、異種間ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対して寛容化され ているトランスジェニックマウスを提供することである。このトランスジェニッ クマウスは、アデノウイルスもしくはＡＡＶベクター系を用いて、又は免疫単離 装置内でＦＶＩＩＩ分泌細胞を用いて、イン・ビボでのヒトＦＶＩＩＩの送達の 試験に用いることができる。この系においては、ヒトＦＶＩＩＩは、発生するト ランスジェニックマウスにおいてＡＦＰプロモーターの制御の下に胚性に発現す る。これにより、ＨＦ ＶＩＩＩがマウスから“自己”と見なされ、寛容が生じる。マウスがｈＦＶＩＩ Ｉに対して寛容であるため、異種間ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子が治療用ベクター （すなわち、ＡＡＶ−ミニＡｄ−ＦＶＩＩＩ）によって送達されたときに、それ に対する免疫反応は生じない。このようにして、ウイルスベクター主鎖の抗原性 の正確な評価が、イン・ビボでの遺伝子発現の持続の信頼のおける測定に加えて なされる。また、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ導入遺伝子は胚形成の間にのみ発現する（ 動物が成熟した後には発現しない）ため、正確な濃度のｈＦＶＩＩＩが成熟トラ ンスジェニックマウスの肝臓に送達される。 実施例１６．ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏベクターの構築 トランスジェニックマウスの子宮内寛容化を達成するため、細胞において時間 的に調節された胚特異的な様式でヒト第ＶＩＩＩ因子の発現を駆動することが可 能なベクターを生成するのにマウスα−胎児タンパク質（ＡＦＰ）プロモーター を用いた。プラスミドＧＴ２０５７は７．５ｋｂ ＡＦＰプロモーター配列を含 み、この配列は最初にＵｒａｎｏらによって特徴付けられた（３３）。完全長ヒ ト第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む７．２ｋｂ ＮｏｔＩ断片をｐＣＭＶ−ＦＶＩＩ Ｉ（ＧＴ２０５１）から単離し、ＧＴ２０５７のＡＦＰプロモーターの後ろのＮ ｏｔＩ部位にクローン化した（図５６）。続いて、Ａ ＦＰプロモーター及びｈＦＶＩＩＩ遺伝子を含むカセットをＡａｔＩＩ／Ｓａｌ Ｉ断片としてＮｅｏ発現ベクターｐ；ＧＫＮｅｏのＡａｔＩＩ／ＸｈｏＩにクロ ーン化した。得られた２０．２ｋｂのベクター、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧ ＫＮｅｏ（図５６）はｈＦＶＩＩＩ遺伝子を胚性プロモーター（ＡＦＰ）の制御 の下に有し、且つ哺乳動物細胞における選択のためのＮｅｏ発現カセットを有す る。 実施例１７．ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳ細胞クローンの生成及び特徴付け トランスジェニックマウスの生成において用いられる、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ 配列を含むマウス胚幹（ＥＳ）細胞を生成するため、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ− ｐＧＫＮｅｏベクターをマウスＥＳ細胞に安定に形質移入した。２０μｇのＡＦ Ｐ−ＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏ ＤＮＡをＡａｔＩＩで直線化し、バイオラッド・ジー ン・パルサーを用いて電気穿孔によりＥＳ細胞に移入した（９７５μＦｄ、２５ ２ｖ）。電気穿孔の後、ＥＳ細胞を胚性線維芽細胞支持層上で２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中において増殖させてＮｅｏRクローンについて選択した。４８のＮ ｅｏRクローンを取り出し、増殖させ、コーテストキットを用いて機能的第ＶＩ ＩＩ因子タンパク質について分析した。これらの４８のクローンのいずれの組織 培養上清においてもＦＶＩＩＩは検出されなかった。ゲノムＤＮ Ａを１３のＮｅｏR ＥＳクローン及び非形質移入親ＥＳ細胞から単離し、Ｘｂ ａＩで消化して、ＧＴ２０５１に由来する７．２ｋｂ ＦＶＩＩＩ ＮｏｔＩ断 片をプローブとして用いるサザンブロット分析によりスクリーニングした。１１ ／１３の形質移入クローンが予想される７．８ｋｂ ＸｂａＩ断片を含んでおり 、ｈＦＶＩＩＩ配列はもちろん、ＡＦＰプロモーターの３’末端の５００ｂｐの 存在も確認された。これらのＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローンのうちの４ つに加えて親ＥＳ細胞対照の分析が図５７に示されている。これらの結果は、ｈ ＦＶＩＩＩ導入遺伝子がＮｅｏRクローン内に存在していたことを示す。 ＡＦＰプロモーターがＥＳ細胞内において機能的であったかどうかを試験する ため、ＡＦＰプロモーターをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片としてレポータープラス ミドｐＥＧＦＰ−１（クローンテック）にクローン化し、緑色蛍光タンパク質（ ＧＦＰ；図５８を参照）の発現を駆動させた。このｐＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１プラ スミドをＥＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞（高水準のα−胎児タンパク質を発現する ことが知られる肝細胞系）の両者に一時的に形質移入し、ＦＩＴＣフィルターを 備えるニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）広範囲顕微鏡を用 いる直接可視化により、２４時間後に緑色蛍光性細胞について検査した。ＧＦＰ の発現はＨｅｐＧ２細胞系においては検出されたがマウスＥＳ細胞においては検 出 されず（データは示さず）、ＡＦＰプロモーターは未分化ＥＳ細胞においては作 用しないが分化した肝細胞系においては作用することが確認された。これらの結 果は、ＡＦＰプロモーターが末分化Ｆ９胚幹細胞において活動休止状態であり、 レチノイン酸で処理された後に分化するように誘発されたときに活性化されるこ とを示すＶｏｇｔら（４８）のものと一致する。発現が期待される細胞系におい てｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターが機能的であったことを確認 するため、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターをＨｅｐＧ２細胞に 形質移入し、１０ラ濃縮上清を色素生成コーテストＦＶＩＩＩ検定（ファルマシ ア、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いてｈＦＶＩＩＩタンパク質の発現について分 析した。ヒトＦＶＩＩＩが３．０ｎｇ／１０6細胞／２４時間の濃度で検出され 、これによりＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ構築体が機能的であり、且つ７．５ｋｂ ＡＦ Ｐプロモーター／エンハンサー要素の組織特異的及び発生特異的発現パターンが 保存されていたことが確認された。ＡＰＦ−ＦＶＩＩＩベクターが相応に機能性 であることが示されたこととで、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローンのうち の１つ、クローン＃２２（図５７、レーン３）をその未分化成長表現型に基づい て選択し、胚盤胞微量注入実験に用いた。 実施例１８．ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマ ウスの生成 本発明は、異種間ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対しで子宮内で寛容化され ているトランスジェニックマウスを提供する。このトランスジェニックマウスは 、アデノウイルスもしくはＡＡＶベクター系を用い、又は米国特許５，３１４， ４１７号；５，３４４，４５４号；５，４２１９２３号；５，４５３，２７８号 ；５，５４５，２２３号；もしくは５，５６９，４６２号に記述されるもののよ うなセラサイト（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ）免疫単離装置においてＦＶＩＩＩ分泌細 胞を用いるイン・ビボでのヒトＦＶＩＩＩの送達の試験に用いられる。ｈＦＶＩ ＩＩが発生中のトランスジェニックマウスにおいてＡＦＰプロモーターの制御の 下で胚性に発現するため、治療用ベクター（すなわち、ＡＡＶ−ミニＡｄ−ｈＦ ＶＩＩＩ）によって送達されるｈＦＶＩＩＩはマウスの免疫系によって梼ウ己剥R 原として認識される。そのようなものとして、ｈＦＶＩＩＩタンパク質に対する 寛容が生じる。このトランスジェニックマウスはｈＦＶＩＩＩに対しで寛容化さ れているため、“異種間”ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫反応が生じる ことはなく、ウイルスベクター主鎖の抗原性の正確な評価及びイン・ビボでの遺 伝子発現の持続の現実的な測定を決定することができる。また、ＡＦＰ−ＦＶＩ ＩＩ導入遺伝子は主として胚形成の間に発現するため、成熟トランスジェニック マウスにおいてこのベクターによる形質導入の結果とし て肝臓が発現するｈＦＶＩＩＩタンパク質の量を正確に定量することができる。 ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスを生成するためのスキームはそ の概要が図５９に記されている。ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローン＃２２ からのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に微量注入し、仮母の子宮内に移植した 。現在までに、ＥＳクローン＃２２を用いで４匹のキメラ子孫が生み出されてい る。それらを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスとつがわせて生殖系列伝達について試 験し、生殖系列始祖を飼育してホモ接合ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩトランスジェニッ クマウス系を得る。このキメラ子孫は、定義上、それらの組織の全てにおいてＡ ＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子のモザイク発現を示すため、ホモ接合系の生成を 待つことなく、イン・ビボ遺伝子送達実験にも直接用いられる。このスキームに よって生成されるトランスジェニック動物に、最初にｈＦＶＩＩＩタンパク質を 注射することにより抗原投与して飼育し、ヒトタンパタ質に対する抗体について スクリーニングしてｈＦＶＩＩＩに対する寛容化を確かなものとする。また、こ のＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスを、成体動物における ｈＦＶＩＩＩの“漏出性”出現についても試験する。少量のｈＦＶＩＩＩタンパ ク質が成体トランスジェニック動物において生成される場合には、治療用ベクタ ー又はタンパク質送達装置によって送達されるｈＦＶＩＩＩの濃度から減ずるこ とができるようにそれを正確に定量する。トランスジェニック動物がｈＦＶＩＩ Ｉに対して寛容化され、且つ有意の水準で内在性ヒトタンパク質を発現すること がないのであれば、それをｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達の効率の試験に用いる ことが可能であり、遺伝子発現の持続、組織分布、及び導入遺伝子以外の送達系 の要素（すなわち、ベクター主鎖、ウイルス被覆タンパク質）に対する免疫反応 を分析することができる。他のパラメータもこのトランスジェニック動物を用い て試験することができる。 実施例１５．第２世代トランスジェニック動物モデル ａ．ＦＶＩＩＩノックアウトマウスとのＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化マウスの 飼育 マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子の標的設定破壊（遺伝子ノックアウト）が行われ ているトランスジェニックマウス株が、ジョンホプキンス大学及びペンシルバニ ア大学と結ばれた非排他的使用制限付きライセンスにより得られでいる。このマ ウス系はｍＦＶＩＩＩの欠乏が深刻であり、したがって血友病Ａの有用なモデル である（５１）。ヒト第ＶＩＩＩ因子に対して寛容化された我々のトランスジェ ニックマウスを全体に的にマウス第ＶＩＩＩ因子が欠乏するマウスと交雑させる ことにより、ｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試験するための“クリーン”モデ ルを生成することが可能である。ｈＦＶＩＩＩと交差反 応する潜在能力を有するマウスＦＶＩＩＩが存在しない状況において、ｈＦＶＩ ＩＩの正確な定量。加えて、この二重トランスジェニックマウスは、遺伝子治療 を用いる血友病Ａの表現型修正の有用なモデルを提供する。 ｂ．三重トランスジェニックマウス 本発明のさらなる態様は、上記３種類のトランスジェニック動物全てを交雑さ せて“三重トランスジェニック”マウスモデルを生成することを含む。ヒトＦＶ ＩＩＩに対して寛容化され、且つマウスＦＶＩＩＩが欠乏する、前項に記述され るマウスをＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス系と交雑飼育する。この三重ト ランスジェニックマウスモデルは、ＡＡＶ ＩＴＲ／Ｒｅｐ組換え系によるＡＡ ＶＳ１での部位特異的組み込み；寛容化された導入遺伝子に対する免疫反応を伴 わないヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子の送達及び長期間の発現；ヒトＦＶＩＩＩの成 体発現の欠如に加えて交差反応性マウスＦＶＩＩＩタンパク質の欠如による送達 されたｈＦＶＩＩＩの正確な定量；並びに、最後に、深刻なＦＶＩＩＩの欠乏（ 血友病Ａ）の遺伝上及び表現型上の修正を含む我々のＡＡＶ−ミニＡｄ−ｈＦＶ ＩＩＩベクター系の全ての側面の試験に好ましく適する。 ｃ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニック マウス ＧＦＰ発現カセットを様々なウイルスベクターにレポーター遺伝子として組み 込み、新規ミニＡｄベクター、 ＡＡＶベクター、及び新規バージョンのヘルパーウイルスを開発することが好都 合である。ウイルス感染、増殖、ヘルパー補完及び標的細胞へのイン・ビボ送達 は緑色蛍光の目視検出により容易に理解される。導入遺伝子によってコードされ るタンパク質に対する免疫応答が、アデノウイルスベクターの注入後の遺伝子発 現の安定性に負に衝撃を与え得ることが示されている（３０）。マウスに注入し た後のＧＦＰ発現の持続期間を短くし得る、ベクターに組み込まれるＧＦＰ導入 遺伝子に対する免疫応答を排除するため、ＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウ スを開発する。図５８に示されるＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクター、又はＧＦＰの 膵臓特異的発現のためのラットインシュリンプロモーター（ＲＩＰ）を含む類似 のベクターをこの目的で用いることができる。 安定なＮｅｏR ＲＩＰ−ＧＦＰ ＥＳ細胞系［ＲＩＰ−ＧＦＰ（＋）ＥＳ］ を開発するため、ＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１ベクター（図６０）をマウスＥＳ細胞の 形質移入に用いた。ＲＩＰ−ＧＦＰ（＋）ＥＳ細胞を、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛 容化マウスモデルの生成について説明されるもの（図５９）と同じ様式で、ＡＦ Ｐ−ｈＦＶＩＩＩベクターの代わりにＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターを用いて、 ＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウスの生成に用いる。このようにして生成し たＲＩＰ−ＧＦＰ寛容化マウスは、新規アデノウイルスベクター又はＧＦＰ導入 遺伝子をレポーターとして用いる他の送達系を開発す るための有用な研究手段を提供する。 実施例１２に提供されるＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス、実施例１５の ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウス、及び実施例１９ＣのＧＦＰ寛容 化トランスジェニックマウスを含む上述のトランスジェニック動物モデルは全て 、導入遺伝子（それぞれ、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐ ＧＫＮｅｏ及びＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１）の直接ＤＮＡ注入により代わりに生成さ せることができる。これは、上述のＥＳ細胞技術を用いる代わりに、導入遺伝子 をマウス単細胞卵子の雄性前核に注入してトランスジェニックマウスを生成する ことにより達成される。当業者にとっては、これはトランスジェニックマウスを 生成するための明白な代替法である。したがって、本発明は、本願において論じ られる方法のいずれかによって生成することができる（５７−６１）。 実施例２０．エピソームミニＡｄウイルスの設計 ミニウイルスベクターによって送達される導入遺伝子の長期間の発現を可能に する要素を提供する別のアプローチとして、本発明は、標的細胞の感染の際にミ ニウイルス配列から自己複製エピソームを切除することを可能にする部位特異的 リコンビナーゼベースの系の設計を提供する。 部位特異的リコンビナーゼはＤＮＡの操作に広く用い られている。部位特異的リコンビナーゼは２つの適切な標的配列の間の正確な組 換えを触媒するもので、ＤＮＡ特定の部位で開裂させ、それを開裂されたＤＮＡ の第２部位にライゲートする（再検討のためには、参考文献１１１を参照）。バ クテリオファージＰ１に由来するｃｒｅ／ｌｏｘＰ系（１１１）又は酵母に由来 するＦＬＰ／ＦＲＴ（１１２）のような幾つかの系が同定され、特徴付けられて いる。両リコンビナーゼ（ｃｒｅ及びＦＬＰ）の認識部位（ｌｏｘＰ及びＦＲＴ ）は共通の構造を共有する：これらは中央コア領域（乗換え部位）に隣接する２ つの逆反復要素（リコンビナーゼ結合部位）を有する。（コア領域によって決定 される）これらの標的部位の方向は最終的な結果に影響を及ぼす：同じ分子上の ２つの平行な部位の間の組換えは介在する配列の切除を生じ、各々標的部位を有 する２つの分子を生成する。２つの逆平行部位の間の組換えは介在配列の逆転を 生じる。異なる分子における２つの平行な部位の間の組換えは標的部位が隣接す る配列の組み込みを生じる。切除は分子内の現象であるため、組み込みよりも好 ましい。 本発明の設計において、リコンビナーゼは真核細胞複製起点（ｏｒｉ）を有す る配列の切除に用いられる。哺乳動物ｏｒｉ配列及び結合因子は現在までには特 徴付けられていない。しかしながら、幾つかのウイルスｏｒｉ配列及び複製の開 始に必要とされるウイルスタンパク質が特徴付けられ、プラスミドベクターに組 み込まれてお り、その例の幾つかにはシミアンウイルス４０に由来するＳＶ４０ ｏｒｉ／Ｔ −Ａｇ（１１３）及びエプスタイン・バーウイルスに由来するｏｒｉＰ／ＥＢＮ Ａ−１（１１４）が含まれるがこれらに限定されるものではない。これらの要素 は真核細胞において自立的に複製し、且つ選択圧に対して安定に維持されるプラ スミドの生成を可能にしている。ｏｒｉＰを含み、且つＥＢＮＡ−１を発現する プラスミドは細胞サイクル当たり１回複製し（１１５、１１６）、培養において 細胞から選択圧が除去されると失われる。しかしながら、肝細胞のような非分裂 細胞におけるエピソームブラスミドの安定性に関するイン・ビボデータは存在し ない。非分裂細胞（すなわち、分化した細胞）において、且つ選択なしで、エピ ソームが長期間安定のままであり得ることが予想される。本発明者らは、ミニウ イルスＤＮＡにｏｒｉ配列を組み込むことにより非分裂細胞における導入遺伝子 の発現を長期化することが可能であるものと信じる。 エピソームミニウイルスには以下のものが含まれるがこれらに限定されるもの ではない（図６１）： ａ）リコンビナーゼ発現カセット：ウイルスの生成に用いられる細胞における 不適切な発現は２つの組換え部位の間に含まれる配列の切除を促進するため、リ コンビナーゼは標的細胞内でのみ発現しなければならない。このため、発現は、 プロモーターの上流に転写リプレッサーの結合配列を加えるか（例えば、ｔｅｔ Ｏ）、又は組 織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロ モーター）を用いることにより厳密に制御される。 ｂ）複製起点（ｏｒｉ）：これはＤＮＡの複製を開始させるための配列及び複 製に必要とされる他のあらゆる要素（例えば、起点の配列を認識するＤＮＡ結合 タンパク質）を含んでいなければならない。 ｃ）導入遺伝子：これは組換え部位（５秩ｊ及びポリＡシグナル配列（３秩ｊ が隣接するあらゆる治療用又はレポーター遺伝子であり得る。これは、そのＤＮ Ａの環化の際に標的細胞内でのみ発現する。 ｄ）リコンビナーゼ標的部位：平行な方向の２つの部位が必要であり、一方は プロモーターとリコンビナーゼｃＤＮＡとの間に配置され、他方は治療用遺伝子 ｃＤＮＡの上流に配置される。 ｅ）アデノウイルスＩＴＲ：これはミニウイルスの複製及びパッケージ化に必 要である。 ｆ）スタファーＤＮＡ配列：ミニウイルスのサイズをパッケージ化可能な長さ まで増加させる必要がある場合。スタファーＤＮＡ配列はいかなる長さのいかな るＤＮＡ断片であってもよい。 この設計で、ミニウイルスが増幅する間リコンビナーゼは発現しない。ミニウ イルスベクターが標的細胞に送達されると、プロモーターが機能的になってリコ ンビナーゼが発現し、２つのリコンビナーゼ標的部位の間に含 まれる配列を切除して環化する。リコンビナーセプロモーターは導入遺伝子プロ モーターとなり、複製起点が存在することでそのプラスミドの安定な維持が可能 となり、したがって、導入遺伝子の安定な発現が保証される。 実施例２１．癌治療のためのミニＡｄの設計 現在、遺伝子治療を用いる癌の治療に対する最も有効なアプローチの１つは、 腫瘍−宿主の関係を変化させ、免疫系を用いて悪性細胞の認識及び破壊を容易に することである。腫瘍を有する個人において、有効な免疫応答の欠如は、部分的 には、腫瘍細胞の弱い免疫原性、免疫同時刺激の欠如、又は腫瘍特異的免疫抑制 環境のいずれかのためである可能性がある。腫瘍細胞のサイトカイン介在遺伝子 移入は、免疫系を増強してより有効な抗腫瘍応答を導く方策の１つを提供する（ １１７）。近年、多くのサイトカイン遺伝子が単離され、クローン化され、特徴 付けられている。これらの免疫調節因子の特定のもの、例えばＩＬ−２、の全身 投与により一定の割合の抗腫瘍応答が生じている。しかしながら、臨床効果を生 成させるのに必要とされる高い濃度のため、これらの生物製剤の多くはその使用 に毒性が伴う。極めて望ましくない効果と全身投与による最低限の治療結果との 組み合わせは、腫瘍細胞を遺伝的に加工してサイトカインそれ自体を生成させる 努力を刺激している（１１８）。 動物モデルにおいて、遺伝子改変腫瘍細胞がワクチン として抗腫瘍応答の刺激に用いられている（１１７、１１９）。腫瘍指向サイト カイン遺伝子移入の訴求点は、局部的に生成されるサイトカインが免疫学的によ り効率的であり、全身的な毒性を生じないことである。このサイトカイン（１種 もしくは複数）の高い局所濃度で示される、新生物細胞上に発現する腫瘍抗原は 、外来性サイトカインの投与では再現することができない免疫学的微小環境を創 出する。サイトカイン生成性腫瘍細胞によって創出されるこの免疫学的微小環境 は細胞毒性Ｔリンパ球の生成に有効である。幾つかの異なる動物モデルにおいで 、サイトカイン生成性腫瘍細胞は腫瘍原性の低下及び免疫学的に重要な分子の発 現の増加に有効であることが示されている（１１７、１１９）。初期抗腫瘍拒絶 には非特異的炎症応答が付随するように思われる。しかしながら、サイトカイン 分泌腫瘍細胞の拒絶は、ほとんどの場合、Ｔ細胞依存性の全身性腫瘍特異的免疫 の生成につながった。 予め存在する腫瘍免疫原性に対する要求はほとんどの遺伝子移入モデルで確立 されていない；しかしながら、多くの十分に特徴付けられている腫瘍細胞系は高 度に分化し、且つ免疫原性である。幾つかの系において、非免疫原性腫瘍がサイ トカイン遺伝子移入の後に免疫を生成することが示されている。さらに、腫瘍指 向遺伝子移入モデルの大部分は、これらの悪性物の急速な成長が免疫治療が介入 する時間をほとんど与えないため、それ自体 では既存腫瘍負荷の存在下において宿主を治療する研究の役に立たない（１１９ ）。 近年の研究は、腫瘍細胞によるＴＧＦβの分泌の低下が癌遺伝子治療の重要な アプローチであり得ることを示している（１２０、１２１）。一組の実験におい て、Ｆａｋｈｒａｉらは、ラットグリアサルコーマ（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ） 細胞系におけるそのサイトカインの発現の阻害にＴＧＦβのアンチセンスを用い た。このアンチセンス改変肺瘍細胞での腫瘍坦持ラットの免疫は、対照ベクター で改変した腫瘍細胞での動物の免疫と比較して動物の高い生存を生じた。異なる アプローチを用いて、Ｉｓａｋａらは、骨格筋にｃＤＮＡコーディングデコリン を形質移入することにより、ラットにおける繊維性疾患の量を低下させることが 可能であった。デコリンはＴＧＦβの発現を阻害する小プロテオグリカンである 。したがって、ＴＧＦｂの発現を阻害する２つの異なるアプローチが癌又は前癌 の２種類の異なるモデルにおける効力を示している。 加えて、Ｂ７によるＴ細胞の同時刺激がＴ細胞の活性化に対する正及び負の両 者の効果を有することが新たな証拠により示されている（１２２）。Ｔ細胞の他 の同時刺激性分子、例えば、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＬＦＡ−３及びＶＣＡＭ−Ｉも適切 な抗腫瘍応答の誘発に関連付けられている（１２３）。当業者の間での一般的な 総意は、これらの同時刺激性信号のうちの最も重要なものがＴ細胞上 のＣＤ２８とその一次リガンドＢ７−１（ＣＤ８０）及び抗原提示細胞表面上の Ｂ７−２（ＣＤ８６）との相互作用によってもたらされるものであるというもの である（１２４）。様々なモデル系において、Ｂ７ｃＤＮＡが形質移入された腫 瘍細胞が、改変及び非改変腫瘍細胞の両者に対する強力な抗腫瘍応答を誘発した 。同様にＴ細胞上に発現する分子であるＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりも非常に 高い親和性でＢ７−１及びＢ７−２を結合する。幾つかの研究の結果は、ＣＴＬ Ａ−４がＴ細胞応答性の負の調節因子として作用し、ＣＴＬＡ−４−Ｂ７相互作 用によってもたらされる阻害の遮断が腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を増強し、且 つ抗腫瘍活性を高める可能性を生じることを示す。Ｌｅａｃｈらは、ＣＴＬＡ− ４に抗体を注入した結果、マウスモデルにおける予め確立された腫瘍を含む腫瘍 の拒絶が生じることを示した（１２４）。これは、遺伝子移入実験の設計におい ては、所望の効果が他の潜在的な有害効果によって覆い隠されないように注意を 払わなければならないことを示す。 癌の遺伝的基礎には癌遺伝子及び／又は腫瘍抑制遺伝子における異常が含まれ る。両方の型が癌遺伝子治療の標的になっている。腫瘍抑制遺伝子の癌関連欠陥 が通常突然変異又は欠失であるため、これまで開発されている腫瘍抑制遺伝子治 療における方策は遺伝子置換治療であり、この治療では野生型腫瘍抑制遺伝子を 癌細胞に移入して欠陥遺伝子の正常な機能を回復させ、又は殺腫瘍性 効果を誘発する（１２４）。クローン化されて特徴付けられているヒト腫瘍抑制 遺伝子には、小児癌に関与するＲｂ、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍（ＷＴ１） 、及び神経線維腫症（ＮＦ１）；結腸直腸癌に寄与する腺腫ポリープ症ｃｏｌｉ （ＡＰＣ）及び結腸癌における欠失（ＤＣＣ）；広範囲のヒト癌において変異形 態で見出されるｐ５３が含まれる（再検討のためには、参考文献１２５を参照） 。近年、新たな腫瘍抑制因子又は癌感受性遺伝子の同定の領域において２つの大 きな事件が発生した。第１に、ｐ１６（主要腫瘍抑制因子１、ＭＴＳ１）及びｐ １５（ＭＴＳ２）と呼ばれるサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害因子集団 の２つの高度に関連するメンバーが、染色体領域９ｐ２１から単離された（１２ ６−１２８）。第２に、乳癌及び卵巣癌感受性遺伝子ＢＲＣＡ１の強力な候補が 単離された（１２９）。ｐ１６は広範囲の癌細胞系において欠失もしくは変異を 受けていることが示されたが、ｐ１５はＴＧＦ−β誘発細胞サイクル停止の強力 なエフェクターであることが示された（１３０）。これら全ての腫瘍抑制遺伝子 の中で、これまでに癌の遺伝子治療に用いられているものはｐ５３遺伝子である （１３１）。 癌の遺伝子治療に対する我々の現在の努力は、腫瘍抑制遺伝子及び癌の免疫調 節遺伝子治療を他の分子、例えば、腫瘍抗原、ＭＨＣ分子、細胞接着分子及び他 の免疫調節因子の導入と組み合わせることである。以下は、抗 癌超Ａｄベクターの２つの設計の一般的な説明である。 ２１．１ 第１バージョンの抗癌超Ａｄベクターの構築 免疫分子の幾つかの組み合わせを抗癌超Ａｄベクターの構築に用いることがで きる。このミニＡｄベクターは、腫瘍の成長を抑制し、又は宿主の抗癌免疫応答 を誘発するように作用する複数の遺伝子を坦持することができる。この型のベク ターは抗癌超Ａｄベクターと呼ばれる。この超Ａｄベクターの第１バージョンは 、ヒトｐ５３ ｃＤＮＡ、ＧＦＰマーカー遺伝子、ヒトＩＬ２ ｃＤＮＡ、ヒト ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ、ヒトＢ７−１ ｃＤＮＡ、ヒトＩＬ７ ｃＤＮＡ並び にヒトＩＬ１２ ｐ３５及びｐ４０ ｃＤＮＡの４つの二重発現カセットを坦持 する。また、これは、左及び右Ａｄ５ ＩＴＲ及びＡｄ５パッケージ化配列の最 小配列（合計６６０ｂｐ）並びにヒトａ−胎児タンパク質遺伝子の約１８ｋｂゲ ノム配列をも有し、３０ｋｂを超えるサイズに到達する（図６２）。カセット１ はＣＭＶプロモーター、ヒトｐ５３ ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ＧＦＰ遺伝 子及びＳＶ４０ｐＡを含む。カセット２はＥＦプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ１２ ｃＤＮＡ及びウシ成長ホルモン ｐＡを含む。カセット３はＳＶ４０プロモーター、ヒトＢ７−１ ｃＤＮＡ、Ｅ ＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ７ ｃＤＮＡ及びＳＶ４０ｐＡを含む。カセット４は ｔｋプロモーター、ヒトＩＬ１２ ｐ３５ ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ１２ ｐ４０ ｃＤＮＡ及び ウシ成長ホルモンｐＡを含む（図６４）。 ２１．２ 第２バージョンの抗癌超Ａｄベクターの構築 抗癌超Ａｄベクターの第２バージョンは第１バージョンに類似する構造を有し 、５’及び３’末端の両者にアデノウイルス逆末端反復を含み、且つ４つの別々 の発現カセットを含む。調節分子及び遺伝子の幾つかの組み合わせを抗癌超Ａｄ ベクターの構築において用いることができる。以下に説明される例は、腫瘍細胞 の成長を調節するために構築することが可能なミニＡｄベクターの型をいかなる 点においても限定するものではない。各々の発現カセットには５’末端に独自プ ロモーターが隣接する。加えて、各々の発現カセットは、“末端”遺伝子の独立 の翻訳を完了させるための、脳心筋炎ウイルス内部リボソームエントリ部位配列 で連結された２つの遺伝子を含む。このベクターのために示される遺伝子には、 ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＧＭ−ＣＳＦによって代表されるサイトカイン遺伝子 ；ｐ５３に代表される腫瘍抑制遺伝子；Ｂ７−１及びＩＣＡＭ−１に代表される 免疫細胞同時刺激性分子；並びに、しばしば癌に関連する免疫抑制を保存するこ とが可能な分子、抗−ＴＧＦβ及びＳＣＡ乃至ＣＴＬＡ−４が含まれる。ベクタ ーのサイズを増加させて子孫ウイルス内に効率的にパッケージ化させる ため、ヒトα−胎児タンパク質の“スタファーＤＮＡ”が含められている。スタ ファーＤＮＡは、いかなる長さのＤＮＡフラグメントを含んでいてもよい。第２ バージョンの抗癌超Ａｄベクターの一般構造が図６３に示されている。 実施例２２．系を改善するための他の設計 １．標的設定能力を有するミニＡｄベクター。遺伝子発現の標的を特定の細胞 型又は組織に設定するのに、複数の機構を用いることができる。そのような機構 の１つは、細胞型、細胞型サブセット又は特定の組織の転写ターゲティングに関 与する。転写ターゲティングは特定の型の細胞又は組織においてのみ遺伝子の発 現を駆動する転写調節単位の使用を含む。このような転写調節単位は組織特異的 と呼ばれる。ミニａｄベクターは、レポーター又はエフェクター遺伝子の発現を 駆動する組織特異的転写調節単位を含めるように設計される。このようにして、 組織特異的転写調節単位の制御の下にあるレポーター又はエフェクター遺伝子の 発現は、この転写調節単位が活性である特定の組織において高水準で検出される 。遺伝子の発現を特定の細胞型又は組織に限定することが好ましいことがある。 治療用遺伝子は、多量に発現する場合、しばしば毒性である。そのため、遺伝子 の発現の特定の組織への調節は、特定の治療用遺伝子の高水準の遺伝子発現の悪 影響から宿主を保護する役割を果たし得る。 組織特異的な遺伝子発現を導くさらなる方法は、関心のある細胞型上のリガン ドに対して反応性の細胞表面タンパク質をコードするヘルパーウイルスを用いる ことである。例えば、ヘルパーウイルスを、細胞表面受容体に対するリガンドを 発現するように加工することができる。本発明の組換えパッケージ化適格ＤＮＡ 構築体のパッケージ化により、細胞表面上の受容体に結合する組換えアデノウイ ルス粒子が生成する。さらなる例は、そのウイルス外被の表面上に抗体又は抗体 断片を発現する組換えアデノウイルスを含む。このような組換えウイルスは、パ ッケージ化不全ヘルパーウイルスを、そのウイルス外被上に抗体又は抗体断片を 融合タンパク質又は別々のタンパク質として発現するように加工することにより 生成することができる。少なくとも１つのアデノウイルスパッケージ化配列及び 少なくとも１つのレポーター又はエフェクター遺伝子をコードするＤＮＡ分子を 形質移入した細胞の感染により、標的細胞上の細胞表面分子に対して反応性の抗 体又は抗体断片を有する組換えアデノウイルス粒子が生成する。このようにして 、組換えアデノウイルス粒子は、その抗体又は抗体断片に対して反応性の細胞表 面分子を発現する宿主中の細胞に特異的に結合する。 ２．局所免疫抑制機能を有するミニＡｄベクター。特定の自己免疫疾患は不適 切な免疫反応から生じる。この自己免疫反応を妨げ、停止させ、又は遅らせるの に用い ることができる方法の１つはそのような反応の部位に免疫調節タンパク質を導く ことである。これは、本願で示されるように、ミニＡｄゲノムから構築されるア デノウイルス粒子を適用することにより達成することができる。特定のサイトカ イン又はケモカインをコードする遺伝子を発現させることが可能であり、そのよ うな発現は免疫応答の弱力化を生じ得る。この免疫応答における弱力化は自己免 疫反応の症状の緩和につながる。さらなる例には、アレルギー反応の弱力化が含 まれ得る。アレルギー反応を引き起こすことが知られる抗原をミニＡｄベクター でコードすることができる。組換えアデノウイルス粒子によって細胞に送達され たこのミニＡｄベクターで駆動される、低濃度もしくは極端に高濃度の抗原のい ずれかの発現により寛容が生じ得る。さらに、この抗原の発現を、この抗原の発 現が寛容を誘発し得る組織に向けることができる。このような組織には発生中の 胸腺が含まれ得る。脱感作の後、組換えアデノウイルス粒子が送達された宿主は その抗原との相互作用でアレルギー反応を示すことがない。このようにして、加 工されたミニＡｄ ＤＮＡ分子を坦持する組換えアデノウイルス粒子を投与する ことにより、免疫抑制の一形態が達成される。 ３．他の要素とハイブリダイズするミニＡｄベクター。本願において説明され るミニＡｄベクターを宿主内でのウイルス感染及び複製の予防又は排除に用いる ことも可能である。ミニＡｄベクターは、ウイルスの特定の遺伝 的プロセスが妨害もしくは排除され得るように設計することができる。ミニＡｄ ベクターは、感染の転写又は翻訳段階でウイルスの複製を妨害するアンチセンス 核酸を発現するように設計することができる。妨害は、伝令ＲＮＡに結合し、又 はウイルスゲノムへの組み込みの後にＤＮＡに結合して転写を妨げるものを含む アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡの発現により促進することができる。さらに、特 定のウイルス転写体を破壊の標的に設定するリボザイムを設計することができる 。ミニＡｄベクターによって“おとり”分子をコードすることもできる。このよ うなおとりは、ウイルスの転写に必要とされる転写因子に、ウイルス遺伝子の発 現及び複製に必要とされる遺伝子への結合及びその転写の駆動にその転写因子が もはや利用可能ではなくなるように結合することにより作用し得る。 ４．ワクチン接種に用いることができるミニＡｄベクター。発現が生じる生物 において免疫を生成するように働く特定の抗原又は免疫源の発現を駆動するよう にミニＡｄベクターを加工することができる。免疫反応を誘発し、それにより免 疫を生じる細菌又はウイルス遺伝子の発現を駆動するミニＡｄベクターを設計す ることができる。例えば、ＨＩＶのようなレトロウイルスに由来する外被タンパ ク質をミニＡｄベクターでコードすることができる。このミニＡｄベクターを含 む組換えアデノウイルス粒子で宿主の細胞を感染させることにより、ＨＩＶ ウイルスに対する免疫を確実なものとすることができる。また、癌特異的抗原の 発現を駆動するようにミニＡｄベクターを設計することもできる。癌抗原の発現 を導くミニＡｄベクターを含む組換えアデノウイルス粒子で宿主の細胞を感染さ せることにより、その型の癌に対する免疫が生じる。最適には、このような免疫 は、その原発腫瘍はもちろんのこと、治療した生物全体にわたって存在する他の 転移及び微小転移をも広範囲にわたって根絶する。加えて、寄生虫から誘導され る抗原性分子をコードするミニＡｄベクターを設計することができる。このミニ Ａｄベクターを含む組換えアデノウイルスベクターの投与に続いて、この寄生虫 による感染に対する免疫が生じる。 本発明の好ましい形態が図面に示され、かつ記述されているが、この好ましい 形態の変形が当該技術分野における熟練者に明らかであるため、本発明は図示さ れ、かつ記述される特定の形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、そ の代わりに請求の範囲に記載される通りのものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                        Mini adenovirus vector   No. 08 / 658,961, filed May 31, 1996, and US patent application Ser. And U.S. Ser. No. 08 / 791,218 filed Jan. 31, 1997. Insist. TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION   The present invention relates to adenovirus (Ad) vectors, as well as gene transfer, gene therapy, And their use in the field of genetic medicine, including genetic vaccination You. In particular, the present invention carries minimal cis-elements of the Ad genome (mini-Ad vectors). -) And delivering up to about 36 kb of transgene and / or heterologous DNA. For possible Ad vectors. For the production and propagation of this mini-Ad vector, Ad Packaging weakened replication-deficient helper Ad (helper) in helper cell line Trans complementation is required.   The present invention further provides miniadenowis for use in gene therapy for hemophilia. Rus (mini-Ad) vector and animals for in vivo evaluation of this Ad vector Methodologies for generating test systems. In particular, in the present invention, the Ad genome Minimum cis-element (so-called mini-Ad) And the human FVIII cDNA, together with other supporting DNA elements, Factor VIII (FVIII) Ad vectors containing up to d are described. This FV III Mini-Ad is a packaged weakened helper Ad and helper cell line And can be preferentially amplified. Also, the present invention provides a mini-Ad Generate transgenic mouse models that can be used for in vivo testing The structure and method for this is also reported. Description of the prior art   A key issue in the development of genetic medicine is the development of favorable gene delivery systems . This preferred gene delivery system is not currently available in a single gene therapy vector. It must have some properties that are possible. This preferred vector is Suitable for accepting large or multiple transgenes containing regulatory elements Maintain capacity and adapt to simple operations and scale-up for manufacturing I have to. In addition, such vectors are safe and have low toxicity. Must demonstrate highly efficient and selective transgene delivery to target cells or tissues. I have to. Finally, such vectors provide for transgene transduction in target cells. It must be possible to support proper retention, expression and regulation. The present invention Contains a novel structure of a high capacity and high efficiency Ad vector system, Issues and concerns of those skilled in the art. Focus on solving.   Hemophilia A is associated with clotting factor VIII (FVIII) in affected individuals. A consequence of a defect in expression or function. Is treatment of hemophilia currently a plasma concentrate? Culture cells obtained from or engineered to express recombinant FVIII protein. Injection of normal FVIII protein obtained by purification from vesicles (1). Therapeutic The advantage is that the plasma concentration is normal plasma concentration (200-300 ng per milliliter if Or 1 unit; achieved by recovering to 5-10% of Reference 2). Maintaining concentrations above 30% of normal plasma levels is expected to be close to a normal lifestyle Studies have shown (3). Gene therapy for the treatment of hemophilia The approach has exciting potential; however, some major challenges are These treatment modalities remain to be overcome to make them a reality (4). The present invention provides several means that can solve these difficulties.   FVIII is normally produced in the liver and is derived from the amino terminus of the nascent polypeptide. Derived heavy chain polypeptides having an apparent molecular weight range of 92 kDa to 210 kDa. (53) comprising the repeptide and an 80 kDa C-terminal light chain. This is Protected from proteolysis by complex formation at Ndelwars force (vWF) ing. Its activated form, in the blood coagulation cascade, activates factor IX ( FIXa), negatively charged phospholipids and calcium Acts as a cofactor with muon to convert factor X to its activated form Xa . The human cDNA is 9 kb long and has several domains, A1, A2, B, A 3, encodes a 2351 amino acid peptide comprising in order C1 and C2 ( 5-7). The A and C domains are important for functional activity, whereas about 98 Most of the 0 amino acid B domain is not required for activity (8). Full length FVIII cDNA is sized for retrovirus and adenovirus vectors. Of gene therapy protocols used by those skilled in the art to date. Most deleted the B domain so that the remaining cDNA was approximately 4.5 kb. FVIII cDNA is used.   Retroviral vectors should be studied first for use in gene therapy One of those (64, 65). Size for insertion of foreign DNA Capacity is limited to about 7.5 kb. In general, the question of viral mRNA instability Title and Generation of mRNA Encoding FVIII Gene Product (61, 63, 74) Due to current difficulties, high levels of FVIII expression have been obtained from retroviral vectors. It is difficult to do. In addition, infection of non-dividing cells, such as most hepatocytes, is questionable. There is a title. One way to overcome this limitation is to use two / 3 perform a partial hepatectomy to allow the infection of actively regenerating hepatocytes (73). Another approach is to use muscle-specific enhancers for long-term Departure This has been achieved, but only low level gene product FIX has been achieved. (78). A therapeutic level of FVIII has been achieved in mice (77).   Recently, a B-domain deleted FVI under the control of the murine albumin promoter An E1-substituted adenovirus vector containing the II cDNA was used, Achieving therapeutic levels of human FVIII expression in dogs (13-15) . This adenovirus vector containing the FVIII cDNA is used in high doses (4 × 109 pfu), gene expression in immunocompetent animals is restricted in terms of persistence. Limited; gradual decline in gene expression is due to adenoviral vectors in liver tissue -Correlated with loss of DNA detection (13). Decreased expression requires vector inoculum Is partially eliminated by the reduction, so that the therapeutic plasma concentration of FVIII Lasted 22 weeks after administration (16). However, used in these studies The resulting mice of the C57B1 / 6 strain had a weakened immune response; Results do not reflect what can be obtained with fully immunocompetent animals. May be The rapid decline in expression using these vectors in dogs is Immune response to human FVIII protein or adenovirus protein Could have been attributed to this. Such an E1-substituted adenovirus To confirm the potential use of the ils vector in humans, Dog FV with large animals It may be necessary to perform experiments with III.   The adenovirus vector comprises: 1) an intravenous (IV) injection of adenovirus; As a result, in part, this adenovirus vector accumulated primarily in liver tissue. Therefore, gene expression is targeted to the liver; 2) expression of FVIII from the liver is Greatly increases the concentration of FVIII in plasma; and 3) liver in normal individuals Is a prime site for the synthesis of FVIII due to the fact that Can be better.   However, significant difficulties are associated with the delivery of adenovirus genes. For example , Ad are not normally integrated into the genome of the host cell. Maintain transgene expression for long periods In order for Ad to be carried, Ad is required for host cell integration or other mechanism of DNA retention. Must be included. In addition, intervening immunity to adenovirus vectors Epidemiological responses make re-administration of the vector very difficult (76). The present invention (D) All Adeno vectors are derived from the mini-Ad vector carrying the transgene. The ils gene has been eliminated. This is, at least in part, in host cells. Contributes to reduced transgene expression, which may be caused by the expression of the Ad gene. Eliminate any deleterious immune responses that can be conferred.   Adenovirus vector considering large heterologous DNA insert is patented internationally Described in WO 96/33280 (see ref. 132); While This vector integrates this vector into the target cell genome when it enters the target cell. Does not provide elements for integration or episomal maintenance. The present invention By integrating into the cell genome or maintaining it as an episomal nucleic acid Provide an element that takes into account the retention of the delivered transgene in the host cell. One way in which this is achieved by the present invention is to use a virus integration mechanism. Facilitating integration of the transgene into the genome of the host cell. Adenoseki Avian virus (AAV) genome has the ability to integrate into the DNA of infected cells Integrated into AAVS1 at a specific site in the human genome, 19q13.3-qter It is the only example of exogenous DNA to be obtained (35, 133). Minimum requirements for AAV integration The elements are an inverted terminal repeat (ITR) sequence and a functional Rep78 / 68 protein. The present invention provides a method for transgene expression in a host cell genome to maintain transgene expression. Include these built-in elements for embedding. The present invention also relates to a target cell Adenovirus vector capable of heterologous recombination into the genome It also offers another important advantage over competent adenovirus vectors. In addition, Ming also provides elements that allow episomal replication of the transgene.   Immortalized cell lines (22-24, 134), episomal systems (25-27), and cells Site-specific AAV or AAV-based vector in cell-free extract (28) Mark In vitro model systems have been developed to detect insets. Primitive human cells or Compared the transduction efficiency of AAV using immortalized cell lines It was shown to be 10-60 fold higher in human cells than progenitor cells (29). this These results suggest the importance of using progenitor cells, or in in vivo model systems. It is even better to accurately evaluate AAV vectors for gene therapy applications. And emphasize. However, to date, site-specific integration is detected An in vivo animal model system has not been developed. Human AAVS in its genome Animal models incorporating one sequence are provided herein. This animal model In addition to testing site-specific integration, gene delivery in vivo, AA for also testing gene transfer efficiency, tissue distribution, and persistence of gene expression It is useful for evaluating vectors having the V integration mechanism.   Animal models, including dogs and mice with hemophilia, to test the efficiency of FVIII preparations Used (11, 13-15, 82, 83). However, human FVI For II gene therapy, human FVIII protein in animal models The resulting immune response can complicate studies of long-term delivery of FVIII. The present invention provides an animal model that is tolerant to human FVIII. like this The lack of an immune response to human FVIII in animals includes Depending on the immune response Room for accurate assessment of transgene delivery without the potential immunological complexity You.   The mini-Ad vector system of the present invention was developed based on two important findings: 1). Although most of the viral genome is replaced with the SV40 sequence, Ad IT Ad that can be processed and packaged due to the presence of R and packaging elements -Discovery of SV40 hybrid (17); and 2) part of the packaging signal That Ad packaging can be attenuated by permanent deletion (18) . Other approaches based on the incorporation of minimal cis elements for packaging and genome replication Others are developing a denovirus vector packaging system (19-21). Summary of the Invention   It is an object of the present invention to: 1) control the expression of a transgene, and Assists in the integration of exogenous DNA and / or allows the vector to be Approximately 36 kb of heterologous DNA that may contain elements for maintaining it in pisome form Large-capacity adenovirus (Ad) vector (“mi (2) Ad "vector); 2) Designed to support the propagation of this mini-Ad vector. And this mini-Ad vector can be packaged into a larger vector in host-producing cells. Cognate helper Ad with packaging signal manipulated to be merged Vector; and 3) mini-Ad vector and helper A helper cell line designed to support the growth of both Ad vectors, Regulates the expression of the transgene during the propagation of the virus, and Provide helper cell lines that can also help selectively weaken packaging To provide a modified adenovirus vector.   The problem encountered by those skilled in the art is that foreign DNs can be inserted into conventional vectors. The amount of A is currently limited to a maximum of about 8 kb. The purpose of the present invention is to Provides a mini-Ad vector capable of providing insert capacity up to 7 kb This capacity translates into proteins with large coding regions. Sufficient for delivery of nucleic acids to be loaded.   In one aspect, the invention provides a mini-Ad vector as an isolated DNA molecule However, this isolated DNA molecule is required for replication, packaging and persistent gene expression. Elements such as inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcriptional regulatory regions, Effector or reporter genes, and genomic integration sequences or episomal proteins All of which are infectious replication-defective recombinant adenoviruses Operatively cooperate to produce a vector, the remainder of the DNA molecule being Does not encode denovirus proteins. One example of such a vector is In addition, a mini-Ad vector encoding human FVIII is provided.   Another problem encountered by those skilled in the art is the duration of gene expression after introduction into target cells. Is limited. Yet another object of the present invention is to provide a Providing a vector containing elements necessary to extend the duration of transgene expression Is to provide. Thus, the present invention provides for transgene expression in target cells. Stabilization as an episome or integration of the introduced gene into the genome of the cell By providing for easy integration, a vector is provided that has substitutable elements. state In one embodiment, the invention provides a genomic integration element or element in a mini-Ad vector. Provide any of the pisome maintenance elements. One example of such a system is the AAV set A mini-Ad vector is provided that includes an embedding element. In another example of such a system, A homologous recombination arm is provided in the mini-Ad vector.   Yet another object of the present invention is to provide a replication-deficient helper A with reduced packaging d in combination with the E1 complementing Ad helper cell line It is to provide reagents and methodologies for producing. In one embodiment, E 1-deleted helper Ad genome is less frequent than wild-type helper Ad genome E1 deletion helper with altered packaging signal An Ad genome is provided. In another embodiment, the Ad E1 gene sequence is stably Helper or producer cells are provided as transfected cells, and the Ad E1 The gene deleted sequence contains the gene of the E1 deleted helper Ad genome. No sequence overlaps with nom. In addition, in yet another aspect, a helper or Co-transfecting the producer cells with the mini-Ad vector and the Ad helper genome, and / or Alternatively, the cells are infected with an Ad helper virus, and the producing cells are free of cells. A method for producing a recombinant adenovirus vector by preparing a lysate Provided. The cell-free lysate prepared in this way is responsible for this infectious replication disorder. Containing recombinant adenovirus vector particles, most of which are mini-Ad vector DN A.   The transduction efficiency is analyzed in vivo in an animal model system and the It is also difficult for a person skilled in the art to set a target for the integration site AAVS1. Has been proven. Still another object of the present invention is to provide a mini-Ad vector of the present invention. The targeted integration directed by the AAV integration mechanism integrated into the system To provide an animal model system for the animal. As an example, the present invention Generation of transgenic mice with human AAVS1 integration sequence in nom Provide a methodology for After injecting such animals with the mini-Ad vector , Target integration of the transgene into the AAVS1 site.   Those skilled in the art also recognize the immunological recognition of human FVIII as a foreign protein. Face difficulties in determining toxicity and long-term efficacy of human FVIII vector are doing. An object of the present invention is to evaluate the expression of human FVIII To provide a human Factor VIII tolerant animal. The present invention is not a mature animal, A developmentally regulated vector that expresses human FVIII in living mice. Operably linked to a promoter (ie, an α-fetal protein promoter). For developing transgenic mice having a modified human FVIII gene Provide methodology. As a result of this transient expression, the animal has a human FVIII protein. To make human FVIII a "self" protein Recognize. In this case, immunization against human FVIII in such animals No response occurs. The invention further relates to a human FVIII tolerant hemophilia mouse strain. A human FV having a human AAVS1 pre-integration site integrated into its genome. III Tolerant mice are provided.   Thus, the present invention relates to gene therapy vectors that have been encountered by those skilled in the art. It provides the reagents and methodologies needed to overcome many of the difficulties. Of the present invention In addition to the objects set forth above, other objects have been considered in light of the detailed description of the invention set forth below. Is understood. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. Principle of the mini-Ad vector system. The three main components of the mini-Ad vector system: Hell Per-Ad, mini-Ad vectors, and Ad helpers are shown. Helper cells The helper Ad replicates itself on the E1 Allows synthesis of late viral proteins that form Ruscapsid . The packaging of the helper Ad genome into this capsid is based on the helper of the present invention. Inefficient due to weakened Ad packaging signal. Mini A In the presence of the d-vector genome, the helper Ad will System replication, whose wild-type packaging signal is a helper virus Preferential packaging due to high affinity for packaged proteins (31). Further purification of the mini-Ad vector can be performed using biochemical or physical methods. For example, by ultracentrifugation. FIG. Comparison of the current Ad vector with the present invention. Compared to this mini-Ad vector system Also, the general design and complementation mechanism of the current Ad vector is illustrated. FIG. Prototype of helper virus and mini-Ad vector. A. Placement of the packaging signal with reference to the left ITR of the adenovirus. B. field The sequence of the packaging signal sequence region of live adenovirus 5 is shown. Square The arc is the region deleted to include the attenuated helper virus packaging signal. Indicates the area. C. Repeat regions of the sequence shown in B are described with consensus repeats. FIG. Shuttle vector for generating packaged weakened helper AdHβ Building. To construct GT5000, the mutant packaging signal sequence mt Ψ was amplified by PCR and 28.9 mu in the shuttle vector. Was replaced with an Ad5 sequence extending to (GT4004). β- derived from pTk-β The gal expression cassette was cloned into the GT5000 E1 deletion and Ter GT5001 was obtained. FIG. Generation of AdHβ. Shuttle vector GT5001 (see FIG. 8) 293 cells were co-transfected with the same. 7K homology between these plasmids Recombination at the b region (Ad5 9.24 to 28.9) resulted in A packageable virus with a induced left arm results. Shown at the bottom The number in the left region of AdHβ corresponds to the Ad5 nt sequence, Double deletion in E1 in which the β-gal expression cassette is inserted in addition to the null Indicates elongation. Two weeks after co-transfection, several blue plaques were isolated and Mutations in the aging signal were analyzed by PCR using oligos 7 and 8. 31 for the size of the amplified fragment and the wild-type packaging signal (wtΨ) 0 bp, 177 bp for the mutation packaging signal (mt $) As can be seen, it is possible to distinguish on a 2% agarose gel. 1Kb Ladder, 1 Kb from Gibco BRL (Gaithersburg, MD) DNA ladder marker; wtΨ and mtΨ, vDNR are each E1 deletion vector -PCR controls extracted from Ad-CMV βgal and dl10 / 28 viruses Blue plaques, plaques stained blue with X-gal; VDNA from larks; white plaques, those not stained blue with X-gal VDNA from Lark (see Figure 6). FIG. Identification of AdHβ plaques versus others by staining with X-gal. [these PCR amplification of the plaque packaging signal is shown in FIG. ] FIG. Amplification and characterization of AdHβ. Endogenous Left Ad5 Distribution Present in 293 Cells Recombination using a row has replication competent adenovirus (RCA, E1 +) or wtΨ Packaging of AdHβ due to the potential for producing E1 adenovirus The signal was amplified after each passage. WtΨ was detected during passage before CsC1 purification No (4 to 8). At passage 9, when AdHβ was purified, virus D NA content was analyzed separately for all five bands of the gradient. 1% agarose In the upper three bands on the gel (bottom left), almost no vDNA was observed. This was not observed, indicating that they were mostly formed by empty capsids. You. The lower bands (4 and 5) are formed by the full capsid. For PCR The expected mutation packaging signal was detected in all bands. (Bottom right). The 1 Kb ladder marker (similar to FIG. 9) is located on the left It is. The gel containing vDNA also contains the 1 / HindIII marker. FIG. Construction of minivirus plasmids. These plus Mid is an adenovirus genome for packaging when complemented with AdHβ. Constructs to determine the effects of various deletions of the gene. All constructs are CMV Pro Green fluorescence driven by β-actin enhancer (dark arrow) by motor Includes protein cDNA (GFP, box with vertical line). M7.9 (bottom Right) shows neomycin cDNA and internal ribosome entry site (IRES) Have. The top six are derived from M32, which is 10K in the middle of the Ad5 genome. pJM17 derivative with b deletion. The bottom two are pBluescript Replication of Ad5 from t-KS (Stratagene, CA) And a minimum cis element for packaging. The number is Ad5 Deletion and insertion sites are shown, corresponding to the loop units. 0/100 and 100/0 are Ad5   Inverted terminal repeats (ITRs) of DNA, a dark label indicating natural fusion of Ad5 DNA Lane; plasmid backbone DNA, thin lane. FIG. Mini-adenovirus (mini-Ad) vector constructed for packaging FIG. At the top is Ad5 translocation with early (E) and late (L) transcriptional regions. Map and map unit (mu). MLP / TL: major late promoter and three Part ladder. The inverted terminal repeat (ITR) and the packaging signal (Ψ) Unique consensus sequence in the mini-Ad vector. The vector will be Shown in linear form as found in the psid Is done. The circular plasmid used to generate the vector has the same sequence but RT fuses head to tail. The name of each mini-Ad vector is K Reference its size in b. M32 to M20 are central Induced by progressive deletion of the denovirus genome. In these vectors Indicates that the plasmid backbone (pBRX, not shown) is located at 3.7 mu. M6.5 VGnE5E3 is a pBluescript backbone (not shown; GFP expression (Located before the set), the neomycin cDNA and the chr. 4q11 It is constructed by inserting a human genome fragment derived from -22. FIG. Two ways of completion. Similar yields to produce minivirus vectors We used two separate complementation protocols that yielded: In the first method, mini The Ad plasmid was co-transfected with viral DNA derived from AdHβ and The cells are cultured until CPE is observed. In the second method, mini-A AdHβ was removed 3 days after co-transfection of plasmid d with pBHG10. And the cells are cultured until CPE is observed. FIG. Cotransfection of 293 cells with minivirus plasmid. CaPOFourBreak Almost all cells were transfected by using a modified protocol. M32P Rasmid transfection is shown one day after transfection. Right, bright field Left, fluorescence micrograph of the same field of view. FIG. Plaque containing minivirus. The presence of minivirus (here M32) Indicated by plaque fluorescence. Right, bright field; left, fluorescence micrograph of the same field . FIG. Packaging efficiency of minivirus vectors of different sizes. Different rhino Packing efficiency and amplification of the mini-Ad vector. Generated after co-transfection Virus is named passage 0. The crude lysate was used to infect 293 cells. , Passage 1 was generated. 106 293 cells using 1 ml of crude lysate passage 1 And after 24 hours the number of cells that fluoresce was counted (transduction units / ml , Black pillar). After 24 hours CPE appeared and virus was extracted by freezing / thawing (Crude lysate passage 2). Again, use 106 ml of 2 with 1 ml of crude lysate passage 2. 93 cells were infected and the number of cells that fluoresced after 24 hours was counted (hatched cells). Pillar). Differences between passages 1 and 2 indicate an amplification yield of 5X, indicating a difference between different mini-Ad vectors. Differences indicate the effect of size on packaging. FIG. Purification scheme for M32. After amplifying M32 by several passages , The crude extract was CsCl separated. The first gradient resulted in four bands: three Is above and one below. These were collected separately and dialyzed to give 2 as shown in FIG. Used for infection of 93 cells. Collecting fractions from the second separation gradient of the upper and lower bands, As shown in FIG. 16, it was used for infection of 293 cells. FIG. Purification of M32 mini-Ad virus (1). First CsCl gradient. M32 and AdHβ is co-purified in higher density bands (No. 4 et seq.). Fluorescent light The same wells used for the check are later used for fixation and staining with X-gal. FIG. Purification of M32 mini-Ad virus (2): first using a second CsCl gradient Fractionation of the lower band from the CsCl gradient. Aliquot 0.5 μl of each fraction to 60% To infect one of the wells of a 96 well / plate containing confluent 293 cells It was used for. The first fractions (1-6) did not contain M32 or AdHβ ( These fractions represent up to 3 ml of gradient). 100 μl sample of fractions 7 to 16 Reveals abundant M32 and AdHβ (shown under fluorescence in panel A) (See panel B for β-gal staining of the same fractions as those tested). The following fraction ( 17-29) show a concentration of M32 similar to that of the earlier fraction, but of AdHβ The concentration is about 10 times lower. Thus, fractions 17-29 had about 10 Represents a two-fold concentration of M32. FIG. Modification of the Ad5 packaging signal using the GAL4 binding site. Xho The nucleotide sequence between the I and XbaI sites is shown (Design # 1 and Design # 2 ). In design # 1, there are two GAL4 binding sites before A repeat I and A There is one GAL4 binding site between repeats II and VI. In design # 2 , A iteration I There are two previous GAL4 binding sites and another two GAL4 binding sites Present after II. The underlined sequence is the 17-mer GAL4 binding site. The sequence in italics is an A repeat. Between the center of each GAL4 binding site and the A repeat Is shown. FIG. Modification of Ad5 packaging signal using tetO sequence. XhoI and The nucleotide sequence between the XbaI and XbaI sites is shown (design # 1 and design # 2). In design # 1, there are two tetO sequences before A repeat I and A repeat II There is one tetO sequence between and VI. In design # 2, A iteration I There are two tetO sequences before and another tetO sequence after A repeat VII Exists. The underlined sequence is the 19-mer tetO sequence. Italic font Are A repeats. The distance between the center of each tetO binding site and the A repeat is shown It is. FIG. Position and sequence of the synthetic oligo for Ad Pac-GAL4 modification. Ga l # 1 to Gal # 8 are the XhoI and XbaI sites in designs # 1 and # 2 Are synthetic oligos flanking the sequence between. Arrows indicate the position and direction of each oligo It is. The sequence of Gal # 1 to Gal # 8 is described. FIG. Position and sequence of the synthetic oligo for ad Pac-terO modification. te t # 1 to tet # 10 are the XhoI and XbaI units in the designs # 1 and # 2. Between the ranks Is a synthetic oligo covering the sequence The position and direction of each oligo is indicated by an arrow. t The sequence of et # 1 to tet # 10 is described. FIG. Construction of CMV-E1 mammalian expression vector. Code E1A and E1B Adenovirus 5 sequence 462-3535 (AflIII-AfIII fragment) Was blunt-end cloned into the EcoRV site of pcDNA3. FIG. GFP expression and plaque in the E1 complementing cell line A549E1-68 Formation. After infection with the E1-deleted adenovirus Ad5CA-GFP. This puller The clear region in the center of the marker is evidence of CPE generated by amplification of the E1 complementing virus. You. FIG. Southern blot analysis of G418r A549E1 clone. Genome DN A was digested with HindIII and probed with a 750 bp E1 probe (PstI fragment). I searched. Lane 1: 1 kb DNA ladder; Lane 2: A549; Lane 3:29 3: Lane 4: A549E1-68; Lane 5: Subclone A549E1-6 8.3. FIG. Morphological analysis of new cell lines. Parental A549 cells (upper panel) and E1 complement Morphological comparison of the complete cell line A549E1-68 (lower panel). FIG. Analysis of E1 protein expression in transformed cell lines. A. A549 thin Vesicles (lane 1), 293 cells (lane 2) and A549E1-68 (lane 3) E1A-specific monochrome expression of E1A protein in E. coli Internal antibody (M73, Oncogene Science) nce)). B. E1B p55 specific monoc A549 cells (lane 1) using a lonal antibody (Oncogene Science) ), E1 in 293 cells (lane 2) and A549E1-68 (lane 3). Metabolic properties of B protein35S labeling and immunoprecipitation. FIG. Schematic diagram of pAlb12.5CAT plasmid. This plasmid is chloramphenicol in the pBRCAT plasmid vector. P operably linked upstream of the acetyltransferase gene (CAT) Alb12.5CAT 12.5 kb human albumin promoter (EcoRI To HindIII). Proximal promoter and enhancer regions (E1.7 And E6) Is indicated. FIG. pBlueScript KS+12.5 kb human albu into vector Cloning of the Min promoter. EcoRI to AvaI 10.5 kb fragment and And 2.0 kb AvaI to HindIII albumin promoter fragment lb12.5CAT, isolated separately from pBlueScript-KS.+Vector Ligated simultaneously to the EcoRI / HindIII sites of Done. FIG. Cloning of hFVIII expression cassette into GT4031. 7.5 kb Plug the human FVIII cassette GT4031 was cut out from Sumid GT2051 using XhoI and SalI. And operably linked to hFVIII cDNA GT2053 containing the human albumin promoter was obtained. FIG. Construction of albumin promoter-FVIII minivirus plasmid. Adenovirus 5'ITR from GT2033 and packaging signal The containing fragment was cut out using XhoI and cloned into the SalI site of GT2053. It has become. Forward or reverse (GT2061 and GT2059 respectively) A plasmid having the ITR was obtained. The insert in GT2061 is FVI It is oriented with a unique SalI site close to the II gene. GT2059 is GT An Ad ITR in the opposite direction to 2061 is included. FIG. Restriction digestion profiles of GT2053, GT2059 and GT2061 . Upon digestion, BamHI, XbaI, ClaI and in combination with SalI The expected binding pattern for XhoI is shown. FIG. Diagram of the albumin / α-fetal protein gene region on chromosome 4. This figure Are three regions that serve as 3 'recombination arms for homologous recombination: 1) Alb-E5, 3 'region of albumin gene; 2) AFP-3, α-fetal tamper And 3) located further 3 'of the α-fetal protein. EBB14 is shown. FIG. Cloning scheme. Three different shochu bags Arm of three vectors (A, B and C) containing the Restriction map after cloning into GT2061 (shown above B and C) . FIG. Cloning scheme. Human albumin gene of clone pAlb-E5 Of 3N U. An 8 Kb XhoI fragment was cloned into the SalI site of GT2061. Detailed GT2063 cloning scheme. Based on this vector Miniviruses are potential in vitro therapeutics for the FVIII gene. FIG. Restriction enzyme mapping. The 3 'homologous albumin homologous recombination DNA shown in FIG. Of a plasmid containing an albumin promoter-driven hFVIII with a chromosome An agarose gel showing the restriction enzyme digestion of the vector used in step (a). Of the indicated construct EcoRI and ClaI digests are shown for each. FIG. Scheme for generating mini-AdFVIII virus. hFVIII Two schemes (A and B) for generating minivirus are shown.Ski Mu A : On the first day, the helper virus genomic DNA and plasmid GT2063 were Simultaneous formation in 293 cells (ATCC @ CRL1573) by calcium phosphate precipitation Introduced. Transfection was by calcium phosphate precipitation. On the sixth day, The cytopathic effect (CPE) was observed and a cell lysate was prepared. Then, until passage 4 Each time the lysate was collected for 3 days following infection, at which time the virus preparation was 5x Was amplified. The medium was changed every day after infection.Scheme B: Plasmid pBHG1 0 with Lipofectamine along with plasmid GT2063. ne) (Gibco) was used to co-transfect 293 cells. After 72 hours, 5p Helper Ad was infected at a multiplicity of fu / cell. Five days later, the CPE was observed and fine A cell lysate was prepared. Thereafter, the cells are infected up to passage 3 using equal inoculation volumes, and At this point the virus can be amplified 5-fold. The medium was changed every day after infection. FIG. Generation of mini-Ad vectors containing FVIII. Mini AdFVIII vector 293 cells were transfected with the mini-Ad plasmid GT2063 and helper A Produced by infecting dHβ. That the cytopathic effect (CPE) is complete The cells and supernatant were collected (passage 0). Several freezes / Virus is extracted from cells by a thaw cycle and used to infect fresh 293 cells Was. At each passage, in a solution containing SDS, EDTA, and proteinase K Extraction of viral DNA by incubation with ethanol followed by ethanol precipitation. 40 μl of the supernatant was used. Prior to the virion lysis step, the supernatant was I digestion to avoid contamination from GT2063 plasmid DNA. 1/20 Purified viral DNA (vDNA) by polymerase chain reaction (PCT) Used as a substrate in the amplification of the packaged signal sequence. FVIII mini A d and The expected size of the helper amplification region is 177 and 310 bp, respectively. Was. DNA size marker: 1 Kb lamb from Gibco (Gaithersburg, MD) Dah. Non-transfected 23 with or without additional GT2063 plasmid Supernatants from 9 cells were used as a negative control and a control for DNase I treatment, respectively. Used. FIG. VDNA derived from passages 0 to 21 of the mini-AdFVIII vector Zan blot analysis. vDNA was purified as in FIG. 1/2 purified vDNA (Equivalent to 370 μl of supernatant) was digested with PstI and separated on a 1% agarose gel. And blotted on a nylon membrane. Present in both mini Ad and helper The probe corresponding to the sequence adjacent to the right (3 order jITR was used for vDNA detection . Expected size of fragment detected: mini-AdFVIII = 3.3 Kb; AdHβ = 2.2 Kb. Four independent blots are shown (A, B, C and D). marker Specific hybridization to fragments was used for normalization. FIG. In mini-AdFVIII and helpers for the entire duration of serial passage Dynamic fluctuation. This plot was used to quantify the bands shown in FIG. 15 by densitometry. Thus obtained. Helpers are indicated by bright lines with squares; mini-AdFVIII Are indicated by dark lines with diamonds. One unit is defined as the minimum amount detected on the Y axis. (Corresponding to the amount of helper vDNA at passage 18). Other values are Standardized into units. FIG. Separation of mini-AdFVIII and AdHβ by CsCl gradient centrifugation. First The bottom band from the gradient contains virions and applies them to the second gradient To further separate. Mini Ad (31 kb) and helper (37.1 kb) Separation is possible due to the difference in size between The upper fraction with a 10: 1 mini-Ad / helper virus ratio and 1 : 10 A lower fraction with a mini-Ad / helper virus ratio resulted. FIG. Expression of FVIII in cells transduced with the mini-Ad vector. 2 Ninety-three cells were grown in chamber slides and grown on top as shown in FIG. 18C. Alternatively, infection was performed with a diluted (1/100) aliquot of 1 μl of the lower fraction. Infection 2 Four hours later, the cells were fixed and FVIII-specific mAbs (Cedar Lane). (Cedar Lane Sheep) anti-human FVIIIC, # CL200 35A, Accurate Chemical and Scientific Corporation (Accurate Chemical and Scientific   Corporation, Westbury, NY) followed by a secondary antibody (Bio Tinted donkey anti-sheep IgG, Jackson Immunoresearch (Jackson I) mmoresearch), # 713-065-147) and DAB (reddish) Produces a brownish hue; Sigma (SI GMA) catalog number D7679). A. Mock uninfected control 293 cells . B and C. Trait with two independent preparations of the top fraction as shown in FIG. 18C Introduction (mini-AdFVIII concentration). In both B and C, 10% of the cells were F Stained positively for VIII expression (arrow). C. FIG. 18C (Helper As a result of transduction in the lower fraction as shown in FIG. Stained positively for FVIII expression. FIG. Functional FV in cells transduced with mini-AdFVIII vector III expression. Coatest chromogenic assay for functional FVIII. The table above shows the OD readings. The equation for extrapolating the readings from the sample is Three times from 4000 ng / ml to 62.5 ng / ml (rows A to G) to obtain (Lanes 1, 2, and 3) The prepared standard curves are also plotted. Lanes 4, 5 and 6 is obtained three times from the sample. A: 10 μl aliquots of mini in 293 cells AdFVIII; B: 1 μl of mini-AdFVIII in 293 cells; C: Hep 10 μl mini-AdFVIII in G2 cells; D: 1 μl in HepG2 cells Mini AdFVIII. E: Conditioned medium from non-transduced 293 cells. F: non-transduction Conditioned medium from incoming HepG2 cells. FIG. Map of clone GT2074. This plasmid is called plasmid GT4 020 by SalI digestion and the unique SalI site of GT2073 To black Operably linked to the B-domain deleted human FVIII cDNA Including the modified elongation factor-1 (EF-1; reference 52) promoter] Including PmeI in pALB12.5 with TATA and CCAAT The 3 'proximal albumin promoter region (32) downstream of the site was deleted. This Expression cassette is linked to a B-domain deleted human FVIII cDNA Includes child I promoter. FIG. Map of pCMV-hFVIII. This plasmid contains the GT2073 Creates a full-length hFVIII coding region cloned into the SalI site. Includes a CMV promoter operably linked. This Site Megalovirus Promo Was derived from pCMVβ (Clontech, Palo Alto, Calif.). FIG. Schematic diagram of a plasmid used for testing integration frequency and specificity. Plastic Sumid GT9003 and GT9004 have the AAV ITR sequence flanked on both sides by n GT9012 and GT9013 contain AAV ITR sequences Contains the adjacent GFP expression cassette; GT9003 and GT9012 are integrated A Rep78 expression cassette is also included upstream of the cassette. Plasmid GT9003 To construct, the Rep sequence from 193 to 2126 of the AAV genome was SUB201 is amplified by PCR (Pfu pol), and pCRII (Invitrogen) is amplified. Invitrogen, CA) Got a loan. The resulting plasmid (GT9000) was digested with NotI and XhoI. After digestion, the fragment containing the SV40 polyA site (Not-SalI) was cloned into that site. It has become The resulting plasmid (GT9001) was digested with XbaI and The ends were blunted with c. The PvuII-PvuII fragment containing the entire AAV genome was pS Obtained from UB201 and subcloned into the blunt-ended XbaI site of GT9001 Was. Thereafter, this plasmid (GT9002) was cleaved with XbaI. this is , Remove the AAV coding sequence, leaving the AAV ITR. Next, neo expression Cassette (BamHI-BamHI) using XbaI and BamHI adapter And subcloned into GT9002 to generate plasmid GT9003. To remove the Rep coding sequence from GT9003 using EcoRI Thus, plasmid GT9004 was produced. GT9003 and GT9004 ne o sequence (XbaI-XbaI) was used for each GFP expression cassette (SpeI-Nh). The plasmids GT9012 and GT9013 were generated by substitution with Was. FIG. Mini-adenovirus vector containing an integrable factor VIII cassette Design. Mini Ad required for replication and packaging present in this construct The elements are the Ad ITR and the packaging signal. Factor VIII cassette Included between two AAV ITRs. Rep expression cassette can be integrated into this Segment Located outside. Expression of Rep stably expresses the repressor tet-KRAB Can be adjusted by the Tet operator of the cell line. In target cells, R Expression of ep results in the AAVS1 site on chromosome 19 of the sequence flanked by the AAV ITRs. It should result in targeted integration. Figure 46.293 and Rep protein immunization in Chang hepatocytes. Epidemic precipitation. 10 mg of plasmid GT was added to cells grown in a 10 cm Petri dish. 9001, GT9003, and GT9004 (plasmid construction). See FIG. 31 for details. Non-transfected cells and GT9004 transfected cells Was used as a negative control. Two days after transfection, cells were lysed and protein G-A Anti-Rep monoclonal antibody conjugated to galose (clone 226.7; A RP, Belmont, MA02178) to immunoprecipitate the Rep protein. Run on 10% polyacrylamide gel, same as used in immunoprecipitation Immunoblot with antibodies. Chemiluminescence of protein (ELC kit, Amersham ( Amersham)). Rep78 and Rep52 proteins Is shown. FIG. 293 clones transfected with plasmid GT9003 or GT9004 Southern blot. In addition to several neo-resistant clones, the neo-resistant population (pro 15 mg of genomic DNA from EcoRI And electrophoresed on a nylon membrane (Hybond-N). N), Amersham) and spread over an 8 Kb EcoRI-EcoRI fragment. Hybridized to the AAVS1 probe. Normal AAVS1 locus indicated (Panel A). Some GT9003 clones show band shifts, It corresponds to the disruption of one of the AAVS1 loci. Panel B is neo array Shows the same membrane hybridized again. FIG. 293 clones transfected with plasmid GT9012 or GT9013 Southern blot. The conditions are as described in FIG. A) AAVS1 service Zan blot. Some of the clones derived from plasmid GT9012 have AA 3 shows the reorganization of VS1. B) Rehybridization of some blots to GFP sequence I did. FIG. Southern blot analysis of AAVS1 P1 genomic clones. PCR [AA VS1 PCR (+)], the AAVS1 sequence was detected (P1 clone 6 576, P1 clone 6577, P1 clone 6578, and P1 clone 65 Plasmid DNA (1 μg) from the four P1 genomic clones (designated 79) Isolated and EcoRI (Figure 23A) or EcoRI combined with EcoRV (Figure 23A). 23B), and electrophoresed on a 1% agarose gel. (Abond N +, Amersham) and 253 bp AAVSI PCR The product was hybridized using as a probe. In both A and B, Lane 1 represents P1 clone 6576 and lane 2 represents P1 clone 6577. Lane 3 represents P1 clone 6578, and lane 4 represents P1-clone 6 579. FIG. Construction of pAAVS1-Neo vector. Contains AAVS1 integration sequence An 8.2 kb EcoRI fragment was isolated from P1 clone 6576 and Neo-expressed. Ligated into the EcoRI site of pGKneo Produced. FIG. Generation of transgenic mice with human AAVS1 integrated sequences . A sequence of steps for generating a transgenic mouse is illustrated. ES cells After transfection of AAVS1 plasmid clones and microinjection into blastocysts, Was implanted in the foster mother. About 17 days later, the chimeric mice were cross-bred with C57BL / 6, Progeny were tested for the presence of the AAVS1 transgene. Cross breeding of positive offspring Thus, a system in which the transgene was homozygous was generated. These models are then The mini-Ad vector modified to contain the deno-associated virus integration system Used to test in vivo delivery, the efficiency of site-specific integration of this vector DNA Was evaluated. FIG. Neo after transfection with pAAVS1-NeoR  ES cell clone PCR analysis. 17 NeoRES cell clone (3.1-3.17) and non-shaped Quality import Genomic DNA independently isolated from parent ES cells was purified using AAVS1-specific primer U Screening by PCR using 2493 and L2722, AAVS1 Neo with columnsRThe clone was confirmed. These PCR reaction samples were prepared as follows. On a 1.5% agarose gel: lane 1-1 kb DNA size marker ( Gibco / BRL); lane 2-pAAVS1-Neo plasmid control; lane 3 -Untransfected ES cell DNA; individual pAAVS1N in lanes 4 to 20-17 eo transfected NeoR  ES cell clone. FIG. Southern blot analysis of AAVS1 PCR (+) ES cell clones. 2 Two AAVS1 PCR (+) ES cell clones (ES # 4 and ES 3.16) And EcoRI combining genomic DNA from parental ES cells with EcoRV And electrophoresed on a 0.8% agarose gel. Blotted to bran and hybridized with 8.2 kb AAVS1 probe . Lane 1-AAVS1 ES # 4; Lane 2-AAVS1 ES # 3.16; Lane 3-parent ES cells. Result of integrating the entire AAVS1 sequence into ES cell genome The expected fragments that result are 5.2 and 3.0 kb. FIG. AAVS1 chimeric mouse. Blastocyst microscopy using AAVS1 ES # 4 cells Two high percentage transgenics (chimeras) from volume injection experiments mouse. In animals generated using ES stem cells, the degree of chimerism was high. Correlate with high likelihood of gene transfer. FIG. PCR assay for detecting AAVS1 transgene in chimeric mice Analysis. Genomic DNA was isolated from AAVS1 chimeric tails and, independently, from non-chimeric littermates. For PCR using AAVS1-specific primers U2492 and L2722. More screened. The PCR reaction was run on a 1.5% agarose gel as follows. On: lane 1-1 kg DNA size marker; lane 2-pAAVS1- Neo plasmid control C; lane 3-untransfected parental ES cell DNA; lane 4- AAVS1 ES # 4 cell DNA (4); lane 5-tail from non-chimeric littermates DNA; Lane 6-low percentage chimera (less than 10% agouti coat color) Lane 7-high percentage AAVS1 chimera (90% above) Tail DNA from the agouti coat rotating). Expected PCR product = 253 bp. FIG. Construction of hFVIII mouse tolerization vector. 7.2 kb full-length hFV The III gene was excised from GT2051 using NotI and the N cloned into the otI site and cloned into the mAFP-FVIII cassette in GT2058. Generated. Next, the mAFP-hFVIII cassette was inserted into AatII and SatII. The fragment was excised from CGT2058 using the all fragment, and the Aat of pGKNeo was used. II / XhoI and cloned into mAFP-hFVIII-pGKNeo (GT 2062). FIG. Southamp of mAFP-hFVIII-pGKNeo ES cell clone Lot analysis. Untransfected parental ES cells and 4 NeosR  Derived from ES clone Genomic DNA was digested with XbaI (see FIG. 29), electrophoresed and blotted. Hybridized using the full length hFVIII NotI fragment as a probe. I let you. Predictions showing insertion of the mAFP-hFVIII cassette as shown in the figure The fragment size was 7.8 kb. FIG. Construction of mAFP-EGFP-1 vector. AFP promoter / enha The 7.5 kb EcoRI / SalI fragment containing the entire The vector (Clonetech) was cloned into EcoRI / SalI, and pAFP -EGFP-1 was produced. FIG. Attempt to deliver hFVIII in vivo without immunity consequences Transgenic Ma Intrauterine Tolerance to hFVIII for Testing Mouse generation scheme. Diagram of process steps related to generation of transgenic mice Is done. a-FVIII c operably linked to a fetal protein promoter ES cells transfected with AFP-hFVIII-Neo plasmid containing DNA The blastocyst is microinjected into the blastocyst and implanted into the foster mother. About 17 days later, the chimeric mouse was C57BL / 6 mice were cross-bred and offspring were transgenic for AFP-hFVIII Test for the presence of the offspring. Cross breeding of positive offspring, transgene homozygous Generated system. These models include the human FVIII expression cassette For testing in vivo delivery of the mini-Ad vector modified as described above. FIG. Transgenic tolerized to green fluorescent protein (GFP) RIP-EGFP vector used in the production of Kuma. BS plasmid 1 shows a restriction map of RIP-pEGFP derived from E. coli. This plasmid ( 4855 bp) is green, operably linked to the rat insulin promoter. Includes fluorescent protein (GFP) coding region. This insulin promotion Is used in this construct to drive expression of GFP in pancreatic tissue. Was done. FIG. Construction of episomal mini-adenovirus vector containing FVIII cassette Build. The mini-Ad vector is used after the viral vector enters the target cell. The circular plasmid structure containing the episome maintenance mechanism and the FVIII expression cassette Designed to be formed. The general structure of this vector comprises the following components: (a ) Recombinant expression cassette; (b) origin of replication; (c) human FVIII cDNA; d) recombinase target site; (e) adenovirus ITR; and (f) staff (Stuffer) DNA sequence. FIG. The first version of the anticancer super-Ad (super- Ad) General structure of the vector. This virus vector is Ad helper and tumor suppressor And a plurality of genes for anti-cancer immunomodulation. Delivery The genes selected for are shown in the figure. FIG. General structure of the second generation anti-cancer super-Ad vector. This viral vector Ultra-A containing Ad helper and multiple genes for tumor suppression and anti-cancer immune regulation d-. Its general structure is similar to the first version of these vectors. You. FIG. Variants of mini-Ad and helper Ad vectors. A. Mini Ad Vec Possible elements of the B. Possible elements of the helper Ad vector. Detailed description of the invention   It is an object of the present invention to: 1) control the expression of a transgene, and Assists in the integration of exogenous DNA and / or allows the vector to be Up to about 37 kb of heterologous D, which may include elements for maintaining it in pisome form Large capacity adenovirus (Ad) vector with capacity to insert NA "Mini-Ad" vector); 2) designed to support the propagation of this mini-Ad vector. This mini-Ad vector is called a helper Ad vector in the host-producing cell. With packaging signals that are manipulated to be packaged more frequently Cognate helper Ad vector; and 3) mini-Ad Vector designed to support the growth of both the vector and the helper Ad vector. A Ruper cell line, which controls transgene expression during viral propagation; and Helpers that can also help selectively weaken the packaging of helper Ad genomes Providing a modified adenovirus vector to provide a par cell line And   The present invention relates to the targeting of therapeutic genes such as FVIII cDNA in vivo. Includes three components useful for generating viral vectors that can be delivered to the tissue You. These components include helper virus, minivirus genome, and helper cells System. Helper virus and helper cell lines inherit the minivirus genome Used to package in viral particles for delivery to a child. Using this system The minivirus produced is the same as the adenovirus strain from which the helper virus was induced. It has equal tropism and host range.   The invention further includes elements derived from adeno-associated virus (AAV). To provide a mini-Ad vector modification for These elements are the host cell genome It has the ability to promote the integration of genetic material into DNA. In the present invention Of the reporter or effector gene of the mini-Ad vector into the host cell genome These elements are used to facilitate integration. In this way, the gene Expression is observed in host cells for a longer period than traditional adenovirus vectors You.   The invention further relates to a mini-Ad vector, which is used in a host cell. Prolonged expression of gene (s) maintained and delivered as episomes A mini-Ad vector comprising elements for causing E1 deletion in host cells Limited replication of the virus's viral genome includes genomes that cannot replicate. It has been determined that there is room for longer-term expression of the gene of interest by comparison. (88). Deletion of the E2 region of the adenovirus genome results in the deletion of the E2 region. The replication and persistence of expression of the gene from the denovirus vector is reduced. Accordingly Thus, it is an object of the present invention to facilitate mini-Ad genome DNA replication in target cells. DNA sequence derived from a normal cell genome or a sequence equivalent thereto Into a mini-Ad vector. Arrangements that facilitate DNA replication One of the columns is alphoid DNA. Alphoid DNA The repetitive 16.2 kb sequence allows DNA replication, but the artificial chromosome of that DNA Is not allowed. In the present invention, this 16.2 kb sequence (70-72) For integration into the mini-Ad vector. Therefore, including these sequences Replication of the mini-Ad vector is dependent on the persistence of the mini-Ad vector DNA in target cells. And prolong the expression of the gene of interest.   An animal model test system for evaluating the modified vector of the present invention is also provided. Departure Animal model provided by Ming Include: 1) AAV in its genome to assess AAV-based integration mechanisms A transgenic mouse in which the S1 sequence is integrated; and 2) its genome Human FV operably linked to an inserted developmentally regulated promoter Non-human transgenic animals having the III gene are included. This second model In Dell, humans in its transgenic non-human animals during development have Transient expression of toxin FVIII results in tolerization of the animal to human FVIII Occurs. The human FVIII gene in this animal is released once the animal has matured. And therefore, an assessment of the delivery of the human FVIII gene to these animals Immune response by or against hFVIII from a transgene No more complications. Thus, in this way, the animal -Without adding the potential complexity introduced by the hFVIII immune response In addition, the efficiency of gene delivery by a vector can be evaluated.   In this application, the techniques used are, unless otherwise stated, the techniques used by several well-known references. It can be found in any of the literature, including: Manual (Molecular Cloning: A Laboratovy Manual) (Sambrook et al., 1989, Col. d Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Tech nology) (Methods in Enzymology, Volume 185, D. Goedd el edition, 1991. Academic Press, San Diego, CA), PCR Protocols: A Guide to Methods a nd Applications) (Innis et al., 1990. Academic Press, San Diego, CA), animals Culture of Animal Cells: A Manual of Basi c Technique) Second Edition (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY) Body: Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow and Lane. 1) 988. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), protein Guide to Production: Guide to Protein Purification Methods in Enzymology  Enzymology) Vol. 182 (edited by M.P. Deutscher, Academic Press, San Diego, CA) Methods in Enzymology, Vol. 225 (Refs. 57-60). Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach (Teratocarcinomas and  embryonic stem cells-a practical approach) (Robertson, E.J. ed., 1987.I RL Press, Washington, D.C. See also reference 61).   In this application,Transcription regulatory regionOrTranscription control areaIs involved in the regulation of gene transcription Defined as any nucleic acid element, including promoters, enhancers, Includes, but is not limited to, an eraser and a repressor.   DNA fragmentIs the segment of single-stranded or double-stranded DNA derived from any source. Is defined as   DNA constructMeans plasm derived from all sources Virus, autonomously replicating sequence, phage or single- or double-stranded DN Defined as A or a linear segment of RNA.   Reporter constructIs located below the chromosome containing the gene encoding the testable product. Defined as a purified DNA molecule.   Assayable productsIs encoded by a gene that is detectable using a test All products. In addition, the detection and quantification of this assayable product Is expected to be directly proportional to the level of expression of the gene.   Tissue-specific methodsIs expressed in one or more second tissues in an organism. In contrast, one tissue shows a higher amount of expression.   Effector geneIs the expression of the polypeptide encoded by the gene Is defined as any genetic that effects an organism, tissue or cell.   Heterologous DNAIs an adenovirus isolated from a source other than the adenovirus genome DNA to be introduced into the DNA construct.   TransgeneIs inserted into the genome of an organism and is usually present in the genome of that organism Are defined as genes other than   Recombinant adenovirus vectorHas at least one heterologous DNA in its genome Is defined as an adenovirus that contains a segment ofAdenovirus particlesIs an infectious adenovirus, including both wild-type and recombinant Is defined as Adenovirus is encoded within the adenovirus genome Includes DNA molecules whose capsids are formed by protein envelopes, It is not limited to this.   Recombinant adenovirus particlesHas at least one part of its genome Adenovirus genetic material, of course, derived from other sources Defined as an infectious adenovirus that contains genetic material other than viral genetic material You.   Stable gene expressionIs consistently detected in the host for a period of at least It is defined as the expression of a gene that can be delivered.   Treatable conditionOf organisms that can be changed by the execution of some form of treatment Treatment defined as a condition, where this treatment is usually of medical origin But is not limited to this.   antigenBinds the antibody and both activates and blocks or suppresses the immune response. Can further include any molecule capable of stimulating an immune response, including Defined as a molecule.   Tumor suppressor geneInhibits tumor development by expressing its protein product It is defined as a gene that plays a role, and this suppression includes suppression of growth or induction of cell death. Includes, but is not limited to.Growth suppressor geneInhibits cell growth by expressing its protein product It is defined as a gene that plays a role.   OncogeneIs defined as a gene that causes cancer.   Immunoregulatory genesIndicates that an immune response is caused by the expression of the nucleic acid or protein product. Is defined as any gene that serves to alter   RibozymeIs defined as an RNA molecule that has the ability to degrade other nucleic acid molecules. It is.Genetic conditionMeans at least in part at least one particular Defined as a state of an organism that is the result of the expression of a particular gene, Including the wild-type form of the gene and any mutant forms of the gene. It is not limited to them.   Expression cassetteIs a DNA fragment containing the coding sequence, Transcriptional Regulation Sufficient for Expression of the Protein Encoding the Transcription Sequence in the Appropriate Cell Type A reporter or effector operably linked to a nodal region or transcription control region This is a DNA fragment. 1. Basic concept of mini-Ad vector system   1.System configuration  The mini-Ad vector system has three main parts: 1) Weak packaging Helper Ad; 2) a cognate Ad vector with a minimal amount of viral genome; and 3) The same function of E1 transactivation as 293 cells and / or From Ad Helper Cell Line Brings Regulation of Helper Ad Packaging Signal Become. Packaged weakening helper Ad is of course required for self-replication Viral genetic material that is also required for trans-complementation of mini-Ad vector replication Including. Helper Ad is a deletion or substitution of E1 and packaging of Helper Ad Is useful for controlling or differentiating the packaging of the mini-Ad vector of the present invention. Retains wild-type Ad genetic material, except for a few engineered packaging signals . This mini-Ad vector is a minimal Ad genetic material containing only inverted terminal repeats (ITRs). And promotes replication and packaging of this mini-Ad vector Contains wild-type packaging signal as cis element. Of this mini Ad vector The remainder contains the transgene, ie, the heterologous DNA. The Ad helper cell line of the invention Ad E1 gene, which contains the Ad E1 gene and supports the replication of the helper Ad Similar to 293 cells (ATCC # CRL1537) in that they yield offspring products I do. This cell line may also be used to weaken the packaging of helper Ad. A control mechanism may be included (FIG. 1).   2.Operating mechanism of system  Ad packaging protein is present in small amounts in infected cells Trans-acting factor, a rate limiting factor in the packaging of Ad Plays a role. Wild type package treated with the mini-Ad vector of the present invention The digitization signal is controlled by the helper Ad. Packaged protein with higher affinity than the packaged signal As will be appreciated, packaging of the helper Ad genetic material will Is partially or completely suppressed in the presence of As a result, the mini Adve Preferential packaging of the reactor occurs. Replicate mini-Ad vectors at high titers and For packaging, proteins and capsids for viral DNA replication The protein for assembly must be provided in a reasonable amount. this These proteins can come from a number of different sources, and these sources include Cell systems or viruses, including but not limited to. Preferred of the present invention In a preferred embodiment, these proteins are provided by a helper Ad . In the present invention, a large Ad structural protein can be used as a mini-Ad vector. Thus, in that helper Ad replicates itself within helper cells, It is considered to remain functional. In the absence of mini-Ad vector And gradually or inefficiently without the selective pressure of packaging weakening However, the helper Ad is packaged. Produce multiple copies of mini-Ad vector In addition, viral DNA replication proteins are also used for amplification of mini-Ad vector is necessary. In a preferred embodiment of the invention, these proteins are helper Brought by Ad. Mini-Ad vector containing wild-type packaging signal -: Ad particles eligible for infectious replication Packaged as a child in an Ad virion. In contrast, helper Ad DNA Shows poor recognition of packaged proteins for engineered packaging signals Knowledge or low affinity to compete out and therefore completely within helper cells, or Remains partially free. Weakened packaging and helper Depending on the choice of packaging of the Ad vector, the system of the present invention may Produces preferential growth. Mini-Ad vectors generated using this system can Can be contaminated with Ruper Ad, and therefore this mini-Ad particle preparation It may not be 100% pure. If necessary, contaminated helper A d can be removed using biological, biochemical, or physical methods; Methods include, but are not limited to, ultracentrifugation through a CsCl gradient. No.   3.System capacity  The three main features of the mini-Ad vector system of the present invention are Significant advances over their own, sophisticated, Ad vectors currently available to those skilled in the art (Fig. 2). These features include, but are not limited to: 1) This mini-Ad vector shows minimal immunogenicity; 2) Mini-Ad vectors actually produce replication-competent adenovirus (RCA) And 3) this mini-Ad vector is much more It can contain large heterologous DNA segments. Immunogenicity and RCA generation Reduction (a major safety concern in the field of gene therapy) Only carry the smallest amount of viral cis elements (ITR and packaging signal) And alone do not code for the Ad protein. For this reason Most of the main sources of immunogenicity and cytotoxicity of currently available Ad vectors are eliminated Have been. Thus, the Ad virus usually in or on the host cell Cytotoxic, inflammatory, and immunogenic responses resulting from protein expression are reduced.   The mini-Ad vector of the present invention further has a more heterologous DNA than the conventional Ad vector. Has increased capacity. Wild-type Ad has an average genome size of 36 kb. The maximum packaging capacity of Ad is about 105% of its genome, ie, about 38 k b. The mini-Ad vector of the present invention may contain less than 1 kb of Ad genetic material. Therefore, the capacity of this mini-Ad vector for heterologous DNA is 37 kb. possible. For heterologous DNA, a transgene expression cassette, regulatory element, or reporter Alternatively, it may include a transcription control region operably linked to the effector gene, However, the present invention is not limited to these. The expression cassette contains one or more expression cassettes. May be included, but not limited to. The transgene is a regulatory element To control the retention, integration, transcription, and / or vector targeting of DNA sequences include, but are not limited to.4. Packaged weakening helper Ad   a.Prototype structure of helper  This helper Ad vector contains the engineered package Includes a wild-type Ad genome with a dilation signal and an altered E1 gene. safety For sexual reasons, the helper Ad is currently available for the E1 deletion or replacement virus construct The replica must be incomplete, as in a built body. In the presence of mini-Ad vector This helper must also be incompletely packaged to control (Detailed below). Therefore, the general structure of this helper is Has a wild-type genome except that the region and packaging signals have been manipulated This can be summarized as an Ad vector. However, like E2 and E4 It is also possible to manipulate other essential regulatory genes such as The virus genome Ultracentrifugation to further abolish the replication eligibility of PerAd or through a CsCl gradient Biological, biochemical, or physical methods, including but not limited to Size of the helper Ad to separate it from the mini-Ad vector using the method To reduce it, it can be split into fragments. Helper Ad's titer is a big shadow Unless affected, helper Ad virus replication failure and packaging weakness Both can be included in the design of the helper Ad.   b.General functions of helper Ad  The main function of helper Ad is mini Ad vector Required for packaging Supplying the Psid protein. To provide this protein, Par-Ad must be able to replicate in host cells, albeit less efficiently than wild-type Ad. I have to. Preferably, helper genome replication and transcription are not affected . If the synthesis of the helper Ad genome is inhibited, the late gene product (capsid Protein) yield can be adversely affected and affect the mini-Ad vector titer ( That is, the titer decreases). For specific applications, helpers from Mini-Ad Removal of Ad may not be necessary. In such a situation, helper A The rigor of the packaging weakening of d can be greatly reduced.   c.Packaging weakening design  Eye to weaken packaging of helper Ad The aim is to reduce the potential for helper Ad contamination in mini-Ad vector preparations. Is Rukoto. This means that a batch of relatively pure mini-Ad vectors for a particular application Of particular importance where needed. Helper Ad packaging features mini In the absence of the Ad vector, the helper Ad will increase gradually, if at all. Be incomplete but not completely invalid Is designed to be The following gene manipulation is packaged to produce a weakened helper Ad It can be used for formation.   1.Mutation of packaging signal  Ad5 packaging signal is functional Do not include the degenerated repetition element (18). By partially deleting this packaging signal element, Is the yield of mutant Ad several times higher than Ad with wild-type packaging signal? About 100-fold reduction (18). Therefore, the package of the present invention The design of caged signal mutations involves designing a wild-type Ad packaging signal. A common adenosine-enriched motif (eg, "A repeat": TAAATTTG; FIG. 3) Can be incorporated.   2.Synthetic packaging signal  Ad5 packaging signal is common A (Ade Nosin) enriched motifs (eg, A repeat: TAAATTTG) Packaging protein for selected A-repeat or artificial packaging signal Includes any synthetic DNA motif that can alter quality affinity Incorporation of serial iteration, not limited to.   3.Interference of packaging signals  Ad packaging signal is package Is a specific DNA sequence that is recognized by and binds to an oxidized protein. Helper binding of the packaged protein to this signal -Another DNA sequence proximal to or within the A repeat of the Ad packaging signal Can be arranged. The inserted DNAs are their cognate DNA binding proteins And the cognate DNA binding protein is labeled with an Ad-packaged signal. Positionally Competitive Elimination of Ad Packaged Protein Binding to Nulls Is possible.   4.Relocate packaging signal  Wild type Ad packaging signal is wild It is located at the left end of the type Ad genome. Researchers have found this packaging signal on the far right Have been found to be able to retain their function (75) Shows that the activation signal can be rearranged. Manipulated packaging sig Placing nulls in non-wild-type locations will increase the packaging efficiency of the helper Ad. It may be useful for further weakening. In addition, another region of the Ad genome Rearrangement of packaging signal into helper Ad processed packaging Homologous recombination between the signal and the wild-type packaging signal of the mini-Ad vector Regression of helper Ad wild-type Ad (ie, RCA generation) It can help minimize it.   5.More possibilities  Mini Ad vec by weakening the packaging of helper Ad To minimize helper contamination for the preparation of the Can: cis element and trans-acting factor. Therefore, other possible The design is directed at manipulating either or both of these two factors. Operate An example of a cis element that can be used is the A repeat motif. Can be operated An example of a lance-acting factor is a packaged protein. Mini Ad by the system Controlling packaging without sacrificing high titer production of vectors Possible mechanisms should be further considered. II. Mini Ad vector   A.Basic structure of mini-Ad vector  Ad vector is fused by Ad ITR It can be used as a circularized plasmid (54). The mini-Ad vector of the present invention Is the simplest plasmid form (Ad with wild-type packaging signal) ITR fusion sequence (including ITR), plasmid DNA origin of replication, and one or more A circular DNA molecule containing a polycloning site consisting of a plurality of restriction enzyme sites. The ITR fusion sequence is located at the left end of the wild-type Ad, preferably at map units 0 to 1, and at the right. An edge, preferably including map units 99-100. Ad DNA replication origin The wild-type packaging signal is located adjacent to the left ITR. You.   B.Structural and functional possibilities of mini-Ad vectors  Described below and FIG. B. Other DNA sequences, including but not limited to those shown in B. Elements can be included in the mini-Ad vector.   1.Expression cassette for transgene  An expression cassette is a basic transcription unit. Place A simple expression cassette for a given gene generally comprises a transcriptional regulatory region, a gene of interest, (Ie, heterologous DNA, insert DNA), and polyadenylation (poly A) Including signals. In the expression cassette, two or more genes are inserted between these genes. RNA transcription Or as long as there are additional elements for splicing, Or as multicistronic units. Generally, mini-Ad vectors Contains one or more expression cassettes.   2.Functional elements for vector DNA retention  Expression cassette for target cell genome Can facilitate integration of the host (ie, AAV integration element) or That maintain the mini-Ad vector in episomal form. Promote integration The elements that have been shown to be active are the inverted terminal repeats (ITV) of adeno-associated virus (AAV). R) and Rep78 / 68 proteins. AAV uses these elements as human Chromosome 19 (19q13.3-qter) to the site designated AAVS1 Used to achieve specific integration of the genome.   AAV is considered as a candidate vector for gene therapy, but some Restrictions have been identified by researchers. AAV is: 1) low on exogenous DNA Capacity (4.3 kb); 2) difficulty in achieving high titers in large scale preparations; and 3 ) Limited by the loss of specific recombination of recombinant AAV. Each of these Has proved to be a difficult challenge for the elderly. The present invention relates to AAV-ITR Assembling Sequence and Rep78 / 68 Expression Cassette (Rep Expression Cassette) into Vector Combining the advantages of mini-Ad vectors with the integration capacity of AAV Let it go.   Similarly, mechanisms that can be included in the mini-Ad genome include extrachromosomal replication sequences (70 ) Is included. Such a sequence comprising either a chromosomal or viral sequence Enables vectors to replicate and be maintained efficiently in mammalian cells Play a role. These sequences contain replication components such as human genomic DNA and / or Or a retention component, such as a human centromere sequence or an oriP family repeat and / or Or derived from Epstein-Barr virus (EBV) such as EBNA-1 (70). Human genomic DNA is telomere and / or Rufoid DNA can be included (70). Mini AdBec The mini-Ad genome has a higher copy number in the host cell. And the mini-Ad genome is more efficiently packaged than the helper virus. The likelihood of being upgraded. In addition, these sequences are It plays a role in prolonging the persistence of expression of a vector or reporter gene. This Such functions are useful in the use of mini-Ad vectors for gene therapy.   3.Regulatory elements for controlling DNA transcription  Enhancers, repressors, It contains an activator binding site, an intron, and a 5 'or 3' untranslated region. An element having a transcription control function that is not limited thereto.   4.Elements for vector and transgene targeting  Targeting is Can be achieved in several ways This includes vector surface modification and tissue-specific expression, There is no restriction. Drives gene expression in specific cell types or tissues Tissue-specific promoters can be used to effect this.   5.Further support elements  These include the prokaryotic or eukaryotic DNA replication origin. Points, plasmid or vector selectable markers, and vector backbones can be included However, the present invention is not limited to these.   C.Design of high titer generation of mini-Ad vector  High titer generation of mini-Ad vectors Fig. 4 is another main aspect of the present invention. Ad vectors outperform other viral vectors One of the advantages is that the Ad particles contribute to the preparation of high-titer preservation stocks (6 7). High titer growth of AD is mainly due to the host cells such as 293 cells during infection. A large amount of viral capsid proteins and viral genome copies It is possible for Described below are methods for generating high titer mini-Ad vectors. Are some of the factors that can be considered in the design of   1. Enhanced DNA replication  Ad has its own enzyme system for DNA replication Have. Major transactuation of E2 region proteins resulting in viral DNA replication Sex element. Origin of replication located at one or both ends of the viral genome It is a cis element. A sufficient amount of E2 protein to support replication of the mini-Ad genome The protein must be provided by a helper virus. Hell By properly designing the pervirus genome, the coding within the E2 region of Ad A) high level of expression of the E2 protein is guaranteed. Copy of the mini-Ad genome Other such mechanisms for increasing the number can also be considered. like this The mechanism is to insert the SV40 DNA replication origin (54) into the mini-Ad genome, Increased MiniAd copy number simultaneously with SV40 T-Ag expression in par cells Including, but not limited to.   2. Enhanced packaging signal  More or more efficient packages For example, a large number of tandem sequences can be arranged at one or both ends of the mini-Ad genome. By incorporating columns or in a more efficient manner than wild-type packaging signals By incorporating one or more synthetic packaging signals that work Can be.   3. Enhanced packaging process  Ad packaging process and mechanism Is not yet fully understood by those skilled in the art. Ad Package DNA binding proteins other than the activation signal play a synergistic role in packaging It is not clear if they do. Called “packaging scaffold” and A d Minimize the sequence naturally present in the genome to which the DNA binding protein exhibits affinity. It can be incorporated into an Ad vector.   D. Ad helper cell line   1.Basic elements and general functions of Ad helper cells The cell line of the present invention (serving as a host cell) comprises the cell line 2 conventionally used. 93 (ATCC # CRL1573). In a preferred embodiment, the host cell is transduced with a helper Ad genome transcription program. Contains the nucleic acid sequence encoding the Ad-E1 fragment for lance activation (FIG. 1). Unlike the E1 fragment of 293 cells currently available to those skilled in the art, The vesicle system encodes an E1 fragment that has no nucleic acid sequence overlapping with the helper Ad genome It can include a nucleic acid sequence. Accordingly, the present invention relates to an Ad vector. One of the current difficulties: wild-type Ad by homologous recombination, ie a replication-competent Ad (RC Eliminate the production of A). Other elements support high copy number generation of mini-Ad vectors , Mini-ad vector packaging enhancement and / or helper Ad package Genes including, but not limited to, attenuated .   2.Auxiliary mechanism for weakening packaging of helper Ad  Helper Ad Other methods of weakening packaging include packaged tags in the helper Ad genome. By placing different protein binding sites near the protein binding site, Blocking the binding site of the packaged protein may be included. In such a system Is a tetracycline-repressor (Tet-R), recombinase, and / or Is the use of modified packaging proteins It may include, but is not limited to: In a preferred embodiment, Are expressed in host cells. Tet-R is a bond of Tet-R Engineered proteins of the helper virus, including the tet-operon (Tet-O) Binding signal, thereby preventing the binding of the packaged protein. By doing so, packaging can be suppressed. Tet-R Tet- Binding to O is controlled by tetracycline. Tetra rhinoceros in cell culture medium The addition of culin causes the binding of tetracycline to Tet-R, It prevents binding to tet-O. By removing tetracycline Tet-R is free to bind to the processed packaging signal, It serves to further weaken the packaging of helper viruses.   Expression of a recombinase such as Cre or Flp is also a helper virus package. Recombination sites such as lox-p or FRP are adjacent to the caged signal, respectively. If so, packaging can be inhibited (66, 68). Hell To further attenuate the replication of the parvirus, other Genetic alterations may be provided separately or in addition to those described above. Wear.   Packaged proteins can be modified in any of several ways And these methods include A under the condition that a particular packaged protein of d is identified. Specific packaging signals differ to distinguish packaging from helper Ad Including but not limited to using serotypes or species. in addition , A packaged protein is a gene that encodes the packaged protein Can be changed by genetically modifying This modification is Increased binding of the protein to the wild-type packaging signal It may be changed as follows. Thereby, the modified packaging The protein may further provide favorable packaging of the mini-Ad genome.   3.Auxiliary mechanism for generating high titers of mini-Ad vectors   Mini A designed to increase copy number of mini AD genome in host cells Modification of the d vector is useful in developing high titer mini-Ad vectors. Host Expression of SV40 T-Ag (mutant T-Ag without transforming activity) by cells , SV40 DNA origin of replication is integrated into mini-Ad plasmid vector If so, the copy number of the mini-Ad genome can be increased. IV. Potential applications of the invention   a.Gene delivery in vivo for treatment of genetic diseases  Large therapeutic gene Or to determine controllable or tissue-specific expression, as well as multiple genes, Katsuyo Regulatory elements associated with the main therapeutic gene and / or that can produce a more effective therapeutic effect. Large capacity is required for delivery of other related genes. Examples include cystic fibrosis Cystic fibrosis requires controllable expression of some genes to optimize gene therapy , But is not limited to this. Duchenne muscular dystrophy -(DMD) gene therapy has been This is another example. To treat this disease, patients have full physiological effects Muscle and nerve growth factors, including but not limited to It may be necessary to co-deliver non-genes.   b.Induction of anti-cancer immunity of host by intratumoral injection of vector  The Ad vector is High levels of sensitivity in cultured tumor cells and in different types of solid tumor models in vivo Shows dyeability. This feature of the Ad vector has been used in the treatment of cancer. Treatment Efficiency depends on the gene delivered by the vector. Tumor suppression and immunomodulation Multiple genes, including but not limited to those with Used to optimize cancer effects. This mini-Ad vector delivers multiple genes Capable of constructing anti-cancer Ad vectors for intratumoral injection.   c.Modulation of host immunity by genetic modification of transplanted cells or tissues  Transplantation of the host Temporary or permanent suppression of immunity is needed. Including transplanted cells or tissues But this Delivery of the immunosuppressive gene to cells or tissues that are not limited thereto, It may be an alternative approach to the administration of immunosuppressants. Immunity used in the present invention Examples of the gene encoding the epidemic suppression protein include the mini-Ad vector of the present invention. TGFb, IL-10, and cG can be delivered alone or in combination. Ils proteins HSV-ICP47 and CMV-US11 and secreted Fa An s-ligand protein can be included, but is not limited to.   d.Modification of target cell function or growth of target cells in vivo by genetic modification Adjustment of   Ad vectors are capable of producing high titer depots It has another advantage over other viral vectors, which is the in vivo gene Useful in therapy. The mini-Ad vector contains a minimal amount of the cis element of the Ad genome. The immunogenicity of the mini-Ad is minimized. Therefore, mini-Ad Vectors can be used to modify the function of a target cell in vivo or Useful for regulating vesicle growth.   e.In vivo transfer to target cells or tissues by vector surface modification Specific delivery of offspring   Remains encoding adenovirus hexon and fibrous proteins The gene may be a specific epitope or ligand present on the surface of the target cell (eg, I It is engineered to fuse with protein A) which binds to the Fc fragment of gG. these The modified gene is Interacts with ligands that act as targeting agents for specific cell surfaces Integrated into the recombinant viral genome to produce a virus with No. Thus, the generated virus particles have a tissue or cell recognition ability.   f.Use for Ad-mediated vaccination by a direct in vivo approach  Wakuchi For the purpose of vaccination, the immunogenicity of the E1-substituted Ad vector may provide benefits. Have been used in the development of Ad-based recombinant vectors. Purpose of this mold The mini-Ad vector used in the above includes an E1-substituted Ad vector, Not limited to helper virus, as well as anti-immunity Co-delivery of the genes encoding the original and the immunogen is used.   g.Use for Ex Vivo Gene Delivery  Related to the use of conventional Ad vectors Transient gene retention and expression may be determined by Ad in an exo-vivo delivery protocol. Prevents widespread use. This mini-Ad vector having a DNA retention mechanism Is useful for this purpose. Furthermore, the high infectivity of Ad in cultured cell lines This mini-Ad vector is useful for an exo-vivo approach to gene therapy. We always have an effective gene delivery system.   h.Basic research and development of adenovirology and construction of new vectors Use as a means of   The mini-Ad vector system itself is a basic adenovirus Academic lab High value for ultimate. Demonstration of its construction, feasibility and operation has already been It is a major advance in the field. This helper Ad and mini-Ad are Ad and its Provides a convenient means to study the potential uses of This is a mini Ad vector This is especially true. Mini-Ad replication, packaging and propagation effects The rate feature provides a place for important new information that was previously unavailable. Offer.   i.Use in combination with other methodologies in the field of gene transfer and therapy  A d vector is a gene delivery complex with polylysine, liposomes, and other binding agents It is used as a body. This mini-Ad vector is not limited to these compounds. Together with other compounds capable of acting as a gene delivery complex Can be used.   j.Other uses in the field of gene transfer and therapy  This mini Advek Ter systems are used for gene transfer and therapy in addition to those discussed above. Has great potential. This potential has further implications for the fields of gene transfer and therapy. It will be understood along with the development. IV. Mini-Ad vectors for the treatment of liver-related diseases   After intravenous injection of adenovirus, more than 90% of virus particles are localized in liver I do. After administration of the virus particles, the adenovirus gene or adenovirus vector Of It is in the liver that transgene expression is observed. The present invention provides transposable genes capable of driving reporter or effector gene expression. Adenos whose transcript regulatory genes, ie, promoters, have been modified and greatly improved For directing gene expression to the liver when used in combination with a viral vector Includes legal theory. Those skilled in the art will recognize that abnormal gene or gene production in the liver Many diseases caused by the manifestation of an object can be envisioned. Unusual remains Expression of gene or gene product is above or below what is normally found in the liver May include a level of expression, which is the gene for the structure or function of gene transcription Deletion, duplication, insertion, or alteration, or production of the gene itself or its protein It may be the result of any other modification of the organism. In addition, abnormal genes or gene production Expression of an organism is mechanistically involved in the transcription or translation of genes and gene products, respectively. Can also result from changes in expression that are regulated.   Vectors for delivery of therapeutic or reporter genes to the liver are important for the present invention. Includes significant benefits. Lack of expression of either gene or protein in the liver One of ordinary skill in the art understands that the present invention can be used to treat a number of diseases based on depression Will do. Diseases and genes that can be treated or used using the present invention Examples are summarized in Table 1. In addition, the promotion of all of these genes The gene or gene product in the liver Is useful for driving gene expression in the liver for the purpose of driving gene expression. I will tell. *Table 1 comprises data and information from reference 55.   Yet another aspect of the invention provides a pharmaceutical composition comprising a mini-Ad vector of the invention. Include. The pharmaceutical composition may be in solid form (including granules, powders or suppositories) or liquid form (Eg, a solution, suspension, or emulsion). Oral throw Solid dosage forms for administration can include capsules, tablets, pills, powders, and granules You. Liquid dosage forms for oral administration are commonly used in the art. Pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions containing inert diluents such as water. Suspensions, syrups and elixirs may be included. Such compositions may include humectants, sweeteners Additives such as flavorings, seasonings, and flavors may be included. The compounds of the present invention are inorganic Alternatively, it can be used in the form of a salt derived from an organic acid.   The vectors of the present invention can be administered as the sole active pharmaceutical composition, It can also be used in combination with one or more vectors or other agents of the invention. When administered as a combination, the therapeutic agents may be administered at the same time or different times. Can be formulated as separate compositions or administered as a single composition. Wear. IV. Mini-Ad vector for replacing FVIII activity   E1-substituted adenovirus vector containing FVIII gene Have been used to achieve therapeutic levels of expression of FVIII in host animals ( 13). However, attempts to use adenovirus vectors for gene therapy have been made. The researchers they are looking at have some difficulties. The present invention is described below. As such, there are many solutions to these problems.   An essential cis-acting element of Ad DNA replication and packaging is that of the viral genome. Because it is located at the edge (packaging signal in addition to ITR, less than 1 kb) The backbone of the dAd vector has been modified to contain only this essential cis element. Mi The rest of the Ad genome contains heterologous DNA up to its 38 kb packaging limit. Can be included. In the present invention, this heterologous DNA is added to human FVIII. Includes nucleic acid sequences encoding proteins having similar activities. FVIII 92 k produced in the normal liver and derived from the amino terminus of the nascent polypeptide Heavy chain polypeptides having an apparent molecular weight range of Da to 210 kDa and 80 It contains the C-terminal light chain of kDa (53). Its activated form affects the blood clotting cascade Activated IX (FIXa), negatively charged phospholipids and calcium Acts as a cofactor with ON to convert factor X to its activated form, Xa. The human cDNA is 9 kb long and some domains are Al, A2, B, A3 Encodes a 2351 amino acid polypeptide comprising, in order, C1 and C2 (5-7). A And the C domain are important for functional activity, whereas from about 980 amino acids Most of the B domains are not required for activity (8). The present invention relates to FVIII Of a mini-Ad vector having a human-like activity An Ad vector is provided. FVIII-like activity (ie its activation of factor X) Protein having the ability to act as a cofactor in conversion to form Xa) It is known to those skilled in the art that miniAd vectors containing the genetic material to be loaded are encompassed by the present invention. It should be understood.   The FVIII mini-Ad of the present invention is not limited to human FVIII cDNA. Integration of genes into host cell genome and expression of human FVIII in host cells DNA elements that support the current (ie, heterologous recombination arms, AAV / ITR sequences, And a transcription control region). DNA replication and FVIII mini-Ad vector Is the viral protein required for capsid formation a helper Ad (trans complementation)? Brought in trance. Relatively pure preparation of FVIII mini-Ad vector Is produced as a virus particle by modifying its packaging signal. The packaging of the Ruper Ad genome has been attenuated. This is a helper cell line Allow for preferential packaging of the FVIII mini-Ad vector genome in .   In one embodiment, the FVIII mini-Ad contains a site-specific integration mechanism. No. This mechanism is based on human integration Heterologous recombination sequence or AAV / ITR targeted to the sequence (AAVS1 site) Can be included. To test this integration mechanism, the AAVS1 site must be Must be transferred to the us genome. One method that involves this is embryonic stem cell transformation. By using gene transfer techniques such as recombination or by introducing an AAVS1 site Genes are achieved by direct DNA injection into the male pronucleus of mouse single-cell ova. (57-60). Transformer developed by such a methodology Use transgenic mice for testing mini-Ad vector integration efficiency and specificity be able to.   A further aspect of the present invention is a potential anti-human FVII that may occur within a host animal. Address the I immune response. Such an immune response may be determined by the use of mini-Ad vectors or May interfere with the analysis of the efficiency of the vector. The mini-Ad vector is delivered Immunization of treated mice to drive the expression of human FVIII in mice Responses can complicate assessment of the persistence and level of FVIII expression. this For these and other reasons, the FVIII-deficient transgenic mouse model is Provided by the invention. Reporter or effector inheritance of mini-Ad vectors The offspring are transferred, and consequently the gene product of the reporter or effector gene It is reasonable that the present invention encompasses non-human transgenic animals that are tolerant to Will be understood.   Examples of each of the above-described transgenic mice are provided by the present invention. Are produced by microinjection of genetically modified embryonic stem (ES) cells. The present invention In one embodiment, the gene is developmentally regulated to allow for transient gene expression. Double stranded human FVIII DNA operably linked to the isolated cis-acting control element An integrated non-human transgenic animal is provided. The promoter is , Transient expression of the human FVIII gene during development Developmentally regulated that can direct tolerance to the substance It can be derived from any genetic unit. After tolerization and maturation of the animal The FVIII transgene is no longer expressed. In the present invention, α- A fetal protein promoter operably linked to the human FVIII cDNA Transgenic mouse having human FVIII cDNA in its genome Was used to generate Such mice have hFVII in a developmentally regulated manner. I express and are tolerized as such to human FVIII. another The model includes a site-specific set of adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors. Includes transgenic animals that have a double-stranded AAVS1 sequence that is the target of incorporation. I will. To generate an animal model of human factor FVIII tolerant hemophilia, Rearing FVIII and AAVS1 transgenic animals into hemophilia animals be able to.   The following examples illustrate certain bears of the present invention, and are described in the specification and claims. It is not intended to limit the enclosure in any way.                               IV. ExampleExample 1 Packaged signal mutation helper Ad and green fluorescent protein ( Construction and characterization of a mini-Ad vector carrying a GFP) reporter gene   1.1 Generation of Packaged Signal Mutant Helper Ad   Some of the packaging signal deletion mutants of Ad5 have been described (90). . Mutant dl10 / 28 (also described as dl309-194 / 243: 274/358) Described) lacks nt 194 to 243 and 274 to 358 of Ad5. You. The dl10 / 28 virus was isolated from the left end of Ad5 by the method of Stow (89). Plasmid containing this double mutant (pE1A-10 / 28) and the Ad5 genome Generated by ligation with the remainder (90). d110 / 28 is a single c Showed a 143-fold reduction in virus yield in irs infection, It was not detected when co-infected. We have the same sudden change as dl10 / 28 Amplify different helper viruses, even at low yields Minivirus vectors that are capable of Helper in the presence of -Concluded that the virus should remain unencapsulated.   This packaged signal was obtained by PCR from pE1A-10 / 28 Amplification was performed using an immer.   R7: 5'-GGAACACATGTAAGCGACGG   (Ad5's nt 137-163, AflIII site is underlined )as well as   R8: 5'-CCATCGATAATAATAAAACGCCAACTTTG ACCCG   (Nt449 to 421, ClaI site is bound) The amplified 133 bp fragment was cut with AflIII and ClaI, and Used for the replacement of the corresponding sequence of ter GT4004 (for this construction scheme, See Figure 4). GT4004 binds the left region of Ad5 to the XhoI site (nt5792, Extending from 16 mu) to SnaBI site (nt 10307, 28 mu) Derived from pXCX2 (91), thus GT4004 From the left end to 0 mu to 1.2 mu including the AflIII site of 0.38 mu, E 1 deletion from 1.2 mu to 9.2 mu, including ClaI within this deletion point, and Includes the rest of the left arm of Ad5 up to 28 mu. This extended left arm is recombined Increase the frequency of homologous recombination used to generate the virus. Wild-type packaging GT4004, which has been replaced by a deletion of the signal, is G It was named T5000. β-g derived from pTkβ (Clontech, Ca) The al expression cassette was cut as a SalI fragment and blunt-ended with Klenow enzyme. Was inserted into the blunt-ended ClaI site of GT5000. Therefore, the obtained Rasmid GT5001 has a double deletion packaging signal and a Tk promoter. Thus, it contains the E1 region replaced by the driven β-gal gene (FIG. 4). this The construct allows for the detection of helper virus by X-gal staining.   To generate helper virus, noted by Graham and Prevec. The method described was used (91) (FIG. 5). 293 cells obtained from ATCC Subcultures were grown in MEM-10% horse serum and seeded on 60 mm plates. Was. 30% confluent, CaPOFour2 mg GT5001 per plate The cells were co-transfected with pJM17 (91) and 4 mg. Co-transfection Three days after, the cells are covered with a medium containing 0.5% agarose and then overlaid. The medium on A was changed daily. Once the plaque is visible, X-gal ( (40 mg / ml in DMSO) was added directly to the medium to 100 mg / ml and incubated overnight. Incubated. Identify the plaques that produce the desired helper virus in blue (FIG. 6). A blue plaque was collected and the agarose plug was added to 1 ml of MEM-1. Resuspended in 0% FBS. 370 ml of this medium was used for packaging signal PC. R amplification Was processed as follows: 40 ml of 10X DNase I buffer (4 00 mM Tris-HCl pH 7.5, 60 mM ClTwoMg, 20 mM ClTwo Ca) (A tube containing 0.5 mg of shuttle vector was used as a control for this treatment.) And 1 ml of DNAse I (Boehringer M)   M), 10 u / ml) and incubated at 37 ° C for 1 hour. DNA Inactivate the degrading enzyme I, and add 32 ml EDTA (0.25 M), 25M), 10 ml SDS (20%), 5 ml proteinase K (16 mg / ml) to cleave the virus capsid and add at 56 ° C for 2 hours. Incubated. Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (1: 1: 1/24), and 1 ml of yeast tRNA (10 mg / ml) was extracted. To aid in the preparation of the viral DNA, which was centrifuged at 12,000 rpm in a microcentrifuge. Collect by centrifugation at pmTwoResuspended in O. 5 ml It was used in a PCR reaction using the mer R7 and R8.   One of the blue plaques containing the desired deletion packaging signal was placed in DMEM-10. It was further expanded in 293 cells growing in% FBS. Below, Ad helper --- named βgal or AdHβ (see FIG. 5). After the infection, At 48 hours, the harvested cells were centrifuged at 800 g for 5 minutes and the cell pellet was washed three times. Quick freezing and Extracted by thaw cycle. This crude extract from X cells is used to infect 3X cells. (Amplification scale was one pair of virus with wild-type packaging signal. (1 to 3 in contrast to 20) (FIG. 6). At each passage, the PCR of the supernatant was performed by PCR. The deletion size of the packaging signal was verified (FIG. 7). This deletion and β-gal Was stable at all passages analyzed. At passage 9, AdHβ was replaced with Cs Purified by Cl. Purification was performed three freeze-thaw cycles and the lysate was . 5 ml CsCl 1.5 mg / ml + 2.5 ml CsCl 1.35 mg /Ml+2.5 ml CsCl 1.25 mg / ml stepwise gradient, S 10 ° C., 35,000 rp in a W41 Beckman rotor This was performed by centrifugation at 1 m for 1 hour. The collected virus bands were labeled with CsCl 1. Mix with 35 mg / ml and centrifuge for 18 hours as before. This virus band Dialyze twice against PBS, once against PBS-10% glycerol, -80 Stored at ° C. Five different bands are seen after the second gradient, all of which are separated Purified separately. EDTA / SDS / proteinase K treatment from purified virus Process, phenol / chloroform extraction, and ethanol precipitation (see above for PCR Virus DNA was extracted under the same conditions as those used in the experiment. Ethidium bromide gel No DNA was detected in the top three bands, and they were mostly empty keys. It is considered to be a capsid. The lower two bands contain the viral DNA and are therefore the complete capsids. And this was shown by restriction map analysis to be consistent with AdHβ. R7 + Deletion packaging signal from all bands by PCR using R8 oligo Amplified, indicating that the virus has the desired attenuation. Ui in solution The titer, expressed in plaque forming units (PFU) per milliliter of lux To determine, the virus containing solution was serially diluted in D-MEM 10% FBS ( 10 at 1:10 dilution-12293 cells at 90% confluence (in a 6-well plate) 0.5 ml / well). After infection at 37 ° C for 1 hour, The suspension was replaced with fresh medium. The next day, cells were harvested with 0.5% agarose, 0.0 Covered with medium containing 25% yeast extract and 5 mM Hepes pH 7.4. 6 After 乃至 10 days, plaques were counted. Obtained after amplification and purification of AdHβ About 109PFU / ml (150 mm virusTwoPurified from two plates And resuspended to a final volume of 1 ml). This titer is in wt package About 100X higher than that obtained with a similar viral vector containing the Low.   1.2 Construction of plasmid for minivirus vector   Linear adenovirus DNA has a head and tail covalently linked by its terminal ITR. When circularized together, it is possible to grow as a plasmid in bacteria, but Humorous Have been shown to replicate and purify the virus when transferred to autologous cells (9 2). Functional conjugation transforms bacteria with circular DNA extracted from infected cells In other words, it is naturally selected. A small deletion was observed at the junction This is probably due to the fusion of the head and tail of the ITR of adenovirus DNA. Add stability to the plasmid by disrupting the resulting complete palindrome are doing. Therefore, the basic minivirus structure is the right end of Ad5 (at least Also fused to the left end (103nt-ITR and 103nt-ITR) of Ad5. And a packaging signal up to nt 358). mini Early approaches used to test viral vector systems included functional ITR fusion. Creating a progressive deletion in plasmid pJM17 containing Was. pJM17 is a DNA molecule obtained by circularizing the entire Ad5 genome with an ITR sequence. And the (origin of bacterial replication and ampicillin and tetracycline resistance genes) Resulting in a plasmid containing the pBR322 derivative pBRX inserted into E1A (93). When transfected into 293 cells that complement the E1A defect, pJ M17 replicates, but packs within the adenovirus capsid (maximum 38 kb). It is too large (40.3 kb) to be packaged and is not packaged.   Examples of various miniviral vectors shown in the current literature in addition to those of the present invention are: This is shown in FIG. pJM1 7 was cut with AscI and religated to obtain pBRX-AscI. This Mu43.5 to 70.2 of Ad5 were removed, which was E2A (DNA binding tag). Protein) and L3 (hexon, hexon-related protein and 23K protein) Ze) is completely deleted and L2 (penton base and nucleoprotein) and L4 ( Hexon-related protein, hexon-trimeric scaffold protein, and 33K tamper Is partially deleted. This deletion allows replication and cloning from circular viral DNA. Suppresses psid formation and transduces sufficient amounts of the required replication protein Make it completely dependent on the helper virus you operatively provide. pBRX-AscI Contains a unique SpeI site at 75.2 mu (L4) and contains M32 (32 kB Includes a green fluorescent protein (GFP) expression cassette to obtain A 2.7 kb DNA fragment was inserted. This GFP cassette is a CMV enhancer. Sir / β-actin promoter (CA promoter), Aequorea Victor A GFP cDNA and SV40 poly A signal. Mini virus The use of GFP in the vector construct will allow the presence of this vector in Used to measure using light microscopy. Fluorescence microscopy expresses GFP Including but not limited to flow cytometry that can be used to detect cells It represents one of several non-existent methods. The presence of AdHβ is Xg detected by blue color of al staining Can be To generate M31, cut M32 with MluI and religate I did it. This removes 31.4-34.5 mu, which is the L1 (52 K, 55K and penton-related proteins) were partially deleted. Generate M28 To do this, M32 was cut with MluI and Ascl and religated. to this From 31.4 to 43.5 mu, which remains in M32 L1 and L2 proteins were completely deleted. To generate M26, M2 8 was cut with RsrII and SpeI and religated. This gives 30.9 乃至 75.2 mu was removed, which extended to L1 and L4 deletions. Raw M23 To achieve this, M32 was digested with NsiI and religated. GFP cassette The NsiI fragment of the CA promoter (35.2 mu to 75.2 mu) (Including the next NsiI site) is religated so that the CA promoter The NsiI site of-was ligated to 5.5 mu and the NsiI site of 32.2 was 7 Ligation at 5.3 mu. This is because E2b (terminal protein, DNA poly 5.5 to 75.3 mu of all tans, including merase) and IVa2 protein Suppresses the expression of protein. To generate M20, M23 is converted to MluI and Asc. (This is the 34.5 to 43.5 mu region of the NsiI fragment of M23) ) And religated.   Cyclized full-length virions such as in pJM17 Instead of trimming the gnomes, multiple copies containing ITR sequences and packaging signals The minimum cis element required for fabrication and packaging is pBluescript (Strata Subclone into a small plasmid such as Gene Other factors that may improve the therapeutic potential of the viral vectors of By progressively adding elements for system maintenance or chromosome integration, A biviral vector was constructed (FIG. 8, bottom). IT that fuses head and tail R and next packaging signal (ITR / ITR + pac) of left ITR to Ec pBR using o47I1I (98.7 mu) and PvuII (1.26 mu) Cleavage from X-AscI, blunt-ended, each of pBluescript It was subcloned into SmaI-EcoRV. Obtained plasmid pBS / mini The ITR, GT4007, does not contain an expression cassette and has an ITR / ITR 3.8 minivirus plasmid with several unique restriction sites flanking + pac Is. Using XhoI and KpnI, the above GFP expression cassette was / Subcloned into the mini-ITR to generate M6.5. Next, the internal ribosome The entry site (IRES) and neomycin (neo) cDNA were And subcloned between the GFP gene to generate M7.0. Two different A similar minivirus M8.5 containing neo and GFP was generated in each cassette. Tk promoter, neo cDN PREP9 containing A and Tk pA (Invitrogen) ) Was blunt-ended and the M6.5 StuI fragment was -Subcloned into EcoRI. Complete adenovirus genome with exogenous DNA To test the packaging of the fully substituted mini-Ad vector, a larger mini-Ad vector was tested. M8.5 was used for the construction of the Ad plasmid. As an insert, albumin genetics Genomic fragments corresponding to 3 ', half of the offspring and 5', half of the α-fetal protein gene Pieces were used. These fragments are used as potential arms for homologous recombination at this site. Was selected with the prospect of studying. These fragments contain the M8.5 double GFP / neo. Inserted upstream and downstream of the expression cassette. Therefore, in the resulting construct Indicates that pGnE5E3 (23.8 Kb), GFP and neo transgene are human Corresponding 10 Kb albumin-a-fetal protein intergenic region present in the genome Replace FIG. 9 shows the structure of the minivirus obtained using the above-described plasmid. You.   1.3 Generation and amplification of mini-AdGFP vector   AdHβ is used to support the replication and packaging of various mini-Ad plasmids. Using. It is important to determine whether the minivirus was packageable. It was important. Does minivirus size affect packaging efficiency? It was also important to decide.   In adenovirus, 100% wild-type DN A is most efficiently packaged, increasing genome size by up to 105% Or less than 100%, the efficiency of packaging decreased. Wild type When denovirus is used to complement defective minivirus, it is 69% (25 kb). Lower limits have been suggested (94), but using attenuated helper virus This allowed for the packaging of shorter miniviruses.   Two methods, each working with similar efficiency, to complement the minivirus of the invention Was used (FIG. 10). In the first method, CsCl purified minivirus plus The mid was co-transfected with linear viral DNA extracted from purified AdHβ. The method used to purify this viral DNA was responsible for the primary priming of replication. Note that it is subjected to SDS and proteinase K, which destroy end proteins I want to. This method is superior to minivirus plasmids, which also lack terminal proteins. Used to avoid conferring additional replication benefits to the helper-virus. I Thus, complementation by direct infection with AdHβ does not rescue the minivirus. won. Co-transfection is performed using 293 cells at 50% confluence in 6-well plate wells. Ca per leTwoPOFourAnd 2 mg of miniviral plasmid and 1 mg of virus Performed with DNA. After overnight incubation in this transfection mixture, Change the transfection location and evaluate the transfection efficiency by examining the cells using fluorescence microscopy. Valued. This CsCl purified plasmid Efficiency reached 100% regardless of plasmid size (FIG. 11). Co-trait CPE was observed 6 days after transfer and virus was recovered by three freeze and thaw cycles. Was recovered from the cells. In a second complementation method, the miniviral plasmid was BHG10, packaging missing due to complete deletion of packaging signal A circularized adenovirus plasmid similar to pJM17 (95), which is impossible Both were co-transfected. This plasmid contains all of the early proteins needed for replication. In addition, it produces late proteins that form capsids. Minivirus is p When present in the same cell as BHG10, it also replicates and Minivirus vector contains the wild-type packaging signal, It is the main nucleic acid that is wrapped in metal. However, the minivirus is released to neighboring cells. If not, it does not amplify because it has a defect. Therefore, increase this minivirus Three days after co-infection, 10 plaque forming units (pf u) / AdHβ was infected at a multiplicity of infection (moi) of cells. Co-transfection 3 Days later CPE was observed and the virus was recovered by three freeze and thaw cycles. Was.   Regardless of the method of complementation, using the lysate (passage 0 of the produced minivirus) Infect a fresh monolayer of 90% confluent 293 cells (using a 1 to 3 amplification scale). I let you. On the day after infection, the presence of the minivirus was observed by fluorescence, The presence of helpers was confirmed by X-gal staining. Whatever If helper virus was present in the lysate, additional ink on those cells Amplification of minivirus + helper mixture is accompanied by emergence of CPE (The new lysate of this monolayer is considered to be passage 1 of the minivirus). Minivirus alone is packaged if no helper is present in the lysate Instead, CPE appeared only by adding new helpers. Accordingly The presence of helpers by X-gal staining and the appearance of CPE with higher sensitivity Was evaluated.   Minivirus constructs (M32, M31, M28, M26, M23, and M20 ) Were separately transfected, and the appearance of plaques containing GFP was observed. (FIG. 12). This allows complementation for each of the tested plasmids. Was shown. Sensing the crude extract of each virus in a fresh 293 cell monolayer Two days after staining, CPE was observed, indicating the presence of a helper virus. The result of additional minivirus passages was that a five-fold amplification occurred at all passages, Packaging efficiency was shown to be proportional to minivirus size (FIG. 13). It was observed that every 3 kb reduction in vector size resulted in a two-fold reduction in efficiency. An example For example, the packaging efficiency of M20 is wild type ((36-xkb) / 3 = n, 0.5n) Is 2.48%. However, M6.5, No fluorescent plaques were found in M7.9 and M8.5, which was very inefficient Packaging or no packaging was indicated (FIG. 13). this is , Reflecting a packaging lower limit somewhere between 8.5 Kb to 20 Kb There was a possibility. However, packaging remains in these limits. According to the observed linear decrease, a size difference of 11.5 Kb Produces a 7.6-fold reduction in packaging efficiency, which may make growth impossible That seems more likely.   Complete replacement of the viral genome with foreign DNA is possible, It was tested whether it would affect the aging efficiency. Ad5 ITR and packaging A 23.8 Kb fully substituted mini-Ad containing only the signal was constructed. Outpatient Two tandem DNAs, one for GFP and the other for neomycin, Two long arms of albumin a-fetal protein genomic DNA in the expression cassette Were adjacent (FIG. 9). The window obtained after the first complementation with AdHb vDNA By increasing the number of GFP-positive 293 cells when passaging Ruth Packaging was shown. This transduction unit titer is similar to that obtained with M23 (FIG. 13), which indicates that the exogenous DNA is It has no detrimental effect on packaging efficiency.   1.4 Purification of mini-AdGFP virus (M32)   Following minivirus passage, all cells become fluorescent after infection Up to titer. This occurred, for example, at passage 4 of M32. M32 is 1 When passage 8 was reached by successive passages on a pair 3 amplification scale, 150 mmTwoSufficient virus was obtained to infect 75 plates. CPE Once present, the virus is extracted by three freeze / thaw cycles as described above, Purified by CsCl gradient. During the gradient, the three upper bands and the center of the centrifuge tube Four bands with one darker band were observed (see scheme in FIG. 14). See). Collect each band separately by aspiration from the top of the tube, dialyze Was. 293 cells were infected with each band and observed for fluorescence, or X-gal By staining, both the minivirus and the helper virus are (Fig. 15). Based on the number of green and blue cells, It was determined that the amounts of divirus and helper were in the same range. M32 (3 2Kb) and the size of the viral DNA present in AdHβ (37.1Kb). The difference was that M32 was slightly less dense than AdHβ. Mini ad vector High density band to increase the ratio of Separated in a continuous CsCl gradient and collected fractions from the bottom of the tube. Each fraction 0.5 ml was used directly for infection of subconfluent 293 cells and after 24 hours the fluorescence and blue The color cells were checked. A large amount of AdH The peak containing β (FIG. 16, fractions 7-16) was followed by a lighter fraction, It showed a 10-fold enrichment of M32 relative to AdHβ (fractions 17 to 29). But Thus, CsCl was used to reduce the amount of helper virus present in mini-Ad preparations. Fractions can be used.   In summary, these results are based on a packaged system taken from dl18 / 28. Helpers Used with Partial Deletions in the Signal Large deletions can be complemented, but in the presence of minivirus Indicates that packaging will be done. This helper is a pure mini virus If the population is not important, for example, some therapeutic genes (eg, interlo Minivirus, which contains other therapeutic genes. Can be used in anti-tumor vector systems that can be conjugated to helpers You. If a higher ratio of mini-Ad to helper is required, this helper Needs to be further weakened in its packaging. Embodiment 2. FIG. Helper Ad design with blocking packaging signal   Adenovirus packaging requires binding to the packaging element (A repeat) Since the packaged protein is required (90, 96), the present invention requires Ad5 protein. Some specific D's flanking the packaging signal (A repeat) Introduce NA binding sequences to further enhance the helper virus packaging function to disturb. Two DNA binding sequences have been selected: GAL4 binding sequence (9 7); Tetracycline operator sequence (tetO) (98, 99). G AL4 is derived from the yeast Saccharomyces c. sequence-specific DNA binding proteins that activate transcription in E. elevisiae) Quality. The first 147 amino acids of GAL4 are the activation region U in galactose. ASGOr a naturally occurring site, "1-mer" 5'CGGAGTACTGTCCT CCG-3 'or 5'-CGGAGGACTGTTCCTCCG-3' Bind to the four upstream sites (97). tetO is specific for Tn10 of Escherichia coli Derived from the tetracycline resistance operon, the transcription of the resistance-mediated gene is 19-bp inverted repeat of tetO 5'TCCCTATCAGTGATAGAG A-3 'is negatively regulated by the tetracycline repressor (tetR). (98, 99).   Based on the packaged signal mutant construct GT5000 (Examples, Section 1) , GT5000, XhoI to XbaI (nt194, 0.5 mu to nt45) 2, 1.25 mu) of the sequence is replaced by a synthetic sequence. 4 types of synthetic distribution The columns (FIGS. 21 and 22) are designed. All four synthetic sequences are Ad5 packages. Includes caged element (A repeat) I, II, VI and VII. 17-mer GAL 4 binding sequence (5'CGGAGTACTGTCCTCCG-3 '(97) or 19 The dimer tetO sequence (5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3 '(1 00, 102) around or around these A repeats. Introduced in between (FIGS. 17 and 18). Area between A iterations affects packaging efficiency (90, 96), the distance between each A-repeat is almost complete for that helix. Maintain the turn, ie, 10, 21 or 31 bp (FIGS. 17 and 18). Figure 19 and 20 indicate synthetic oligo sequences and positions. Embodiment 3 FIG. Construction and characterization of Ad-E1 helper cell line   The majority of adenovirus vectors used in gene therapy applications are adenoviruses. It was designed to have a deletion in the E1 region of the virus 5 (Ad5) genome. The E1 area that does not include the area IX is 9% of the left end of Ad5 (1.2-9.8 map units). ) And encodes two early region proteins E1A and E1B. E1A / E1B expression involves viral replication as well as E2-E4 and late proteins. Expression of all other Ad5 proteins is required (100). The deletion of E1 , In theory, is inactive for expression of all Ad5 proteins and Create replication-incompetent viruses that express only certain transgenes. E1A and E1 B deletions are also Proteins combine to link oncogenic transformation of mammalian cells It is of interest for security reasons (101-103). All Class I adenoviruses used to date in human clinical trials In addition to the vector, the novel packaged defective helper window described in Example 1 Lus also lacks E1.   E1-deficient adenovirus is increased in an Ad5 helper cell line called 293. (104). 293 cells are human embryonic kidney containing a covalent fragment of Ad5 DNA Induced by transforming the gut cells. Genome analysis shows 293 cells Is the left 12% of the viral genome at 4-5 copies per cell (including the entire E1 region). And approximately 1 copy per cell, 9% of the E4 region. (105). 293 cells produce high titers of E1-deficient adenovirus. Is very efficient, but is integrated into the 293 genome (other than the E1 region). Sequence in the E1-deleted adenovirus vector due to the presence of the foreign Ad5 sequence Recombination, which leads to the generation of replication-competent adenovirus (RCA) containing E1. It has the disadvantage that it can cause it. Increase of E1-deficient adenovirus How fast the passage during width and propagation (this passage is for large scale production of adenovirus stocks) Depending on whether an abnormal recombination event occurs. RCA production in 3 cells is human genetic Serious consequences for the safety of offspring trials may be presented (106). Generate RCA In addition, recombination in 293 cells affects the expression of the transgene, Also causes deletions and rearrangements that reduce the titer of functional adenovirus particles I can rub. Recently, cell lines have been opened using determined Ad5 DNA containing the E1 region. However, these cell lines were homologous in an E1-deleted adenovirus vector. Retains important sequences that overlap the sequence, which is undesirable for homologous recombination and RC There is room for the possibility of generating A (107, 108).   3.1 Plasmid construction for cell line generation   Required for complementation to eliminate the possibility of recombination with adenovirus vectors Having only the E1A / E1B sequence, and overlapping with a region in the E1-deficient adenovirus. Novel Ad5 helper cell lines have been developed that do not contain any duplicate homologous sequences You. AfI III (46) containing sequences encoding Ad5 E1A and EIB. 3.1 kb DNA between the 2 bp) and AfII (3537 bp) sites The fragment was ligated with the superlinker vector pSL301 (Invitrogen ) Were serially cloned as two fragments: 881 bp AflI The II to XbaI fragment (Ad5 bp462-1343) was converted to pbRXad5Kp nICl (subclone of pJM17) to pSL301 (AflIII / Xb aI). Next, the adjacent 2194 bp XbaI to AflII (Ad5 bp11343-3537) were converted into pBRXad 5XhoICl was cloned into the same vector. The resulting 3075 bp E One fragment (in pSL301) contains the E1A TATA box and RNA cap Position, E1A coding sequence, complete E1B promoter, and E1B coding The E1Bp55 protein, including the stop codon. The region IX is not included. This 3075 bp AflIII-AflII E1A / E1B fragment (Ad5 bp 462-3537) is isolated and blunted with Klenow enzyme Terminating a mammalian expression vector under the control of a CMV promoter / enhancer Blunt-end ligated into the EcoRV site of pCDNA3 (Invitrogen) Was. This process resulted in the Ad5E1 expression vector CMV-E1 (FIG. 21). ).   3.2 Generation and characterization of new cell lines   This CMV-E1 expression vector (including the G418 resistance gene and neo) was Transfect A549 human lung cancer cells with Pofectamine (Gibco / BRL) , G418RColonies were isolated. Single cell clones are transformed into functional E1A / E1B Screened for expression; green fluorescent protein (FGP) expression cassette In the presence of the CMV / β-actin (CA) promoter Ad5CA-GFP. The E1-deleted adenovirus was used to infect the A549-E1 clone. Infection 3 Days later, the cytopathic effect (CP E) Visual inspection of E1 complementation of Ad5CA-GFP adenovirus Clones were screened. One of the clones, A549E1-68, is 3 days Showing 100% CPE (similar to that observed for 293 cells) between Was. This clone is also highly infectious, with virtually 100% of the cells being Green fluorescence was emitted between them (FIG. 22).   This high infection rate in addition to the rapid production of CPE induced in this cell line Functional capable of promoting the replication and amplification of the deleted Ad5CA-GFP virus There is strong evidence that E1A / E1B proteins are occurring. E1 sequence specific A549E1-68, A549 by Southern blot analysis using a specific probe. Subclones of E1-68 (E1-68.3), and CMV in 293 cells -The presence of the E1 transgene was indicated, but not in the parental A549 cell line (FIG. 23). The morphology of these E1 transfected cells is significantly different from the parental A549 cell line. Was different. A549 cells at subconfluent density have an elongated fibroblast-like morphology It grows as a separate single cell, whereas the E1 cell line, A549E1-68, is better. It grows as a colony of cells having a cubic morphology (FIG. 24).   Plaque assay for generation of E1-deleted adenovirus (Ad5CA-GFP) Compared A549E1-68 with 293 cells and found equal titers of the complementing virus ( A54 7X10 for 9E1-6899x10 for PFU vs 2939PFU) Was found to produce Immunoprecipitation and E1A specific antibodies (M73, Onco Wester using Gene Science (Oncogene Science) Two ElAs with apparent molecular weights of 46 kd and 42 kd by immunoblotting. Specific bands were revealed, indicating that these were E1A 13S and 12S mRNAs. Expected product (6) And the same as observed in 293 cells It was the size (FIG. 25A). A549E1-68 is specific for E1Bp55 A band of approximately 55 kd was generated using the monoclonal Ab. This 55kd E The secondary background band as well as the 1B-specific band was similarly used for 293 cells. (FIG. 25B). Extra found in both experimental and control lanes Another “background” band has been observed by other authors, May be due to co-immunoprecipitation of various proteins including, p53, and Rb. Have been. Unlike the A549E1-68 and 293 cells, the parent A549 cell line Indicates 46 kd, 42 kd, or 55 kd E1A / E1B protein expression Did not. A549E1-68 not only expresses E1A and E1B but also The fact that they are functional indicates that this cell line has a high titer of E1-deleted recombinant adenovirus. It is clear that it is possible to complement the generation of. This new Ad5 Hell Par cell line producing RCA In order to demonstrate that the complementation was possible without The denovirus was serially passaged and the virus amplified during the passage was cloned into E1 containing For adenovirus (RCA) qualified for production, parental A549 cells were used for CPE. Therefore, of course, PCR primers specific to the E1A / E1B sequence should be used. And tested by This cell line is used to propagate the E1-deleted adenovirus vector and Used to ensure that production lots do not contain RCA during scale-up Can be. Embodiment 4. FIG. Expression cassette containing FVIII cDNA   The large capacity of the Ad minivector of the present invention for the gene of interest Large promoters and protein promoters that greatly exceed the size capacity of Ad vectors Allows the inclusion of a coding region. For purposes of the present invention, this FVIII mini-Ad Preferably, the vector delivers the FVIII gene to the liver. Therefore, the liver It is important to use a very active promoter that works in the gut. One such promoter is the human albumin gene promoter (3 2). The 12.5 kb region of the human albumin promoter is from the University of Calgary Ta Obtained from Dr. Maoki. Three regions in this 12.5 kb promoter It has been determined that it greatly affects the activity of the promoter (32): 1) TA Proximal region containing the TA box (550 bp); 2) -1. 7 kb enhancer region; and 3) -6.0 kb second enhancer region (Fig. 26). Taken together, these regions are the 12.5 kb human albumin promoter. Approaches overall strength. 10.5 kb EcoRI / A of pAlb12.5CAT The vaI fragment (FIG. 2) was converted to the AvaI / HindIII proximal human albumin promoter. -PBluescript-KS with fragment+Vector EcoRI / Hind The recombinant plasmid GT4031 was generated by co-ligating to the III site (Fig. 27). 5 'flanking SV40 immediate early intron and 3' flanking SV40 polyadenyl The 7.2 kb full-length human FVIII cDNA having the It was excised from T2051 by digestion with XhoI / SalI, and Sal of GT4031 was digested. It was cloned into the I site to generate plasmid GT2053 (FIG. 28). next, Derived from GT2033 containing minimal ITR region and Ad packaging signal The XhoI fragment into the SalI site of GT2053 in either the forward or reverse direction. Cloned, respectively, albumin / hFVIII minivirus plasmid G T2059 and GT2061 were generated (FIG. 29). This GT2059 and GT The restriction enzyme digestion pattern of the 2061 minivirus plasmid is shown in FIGS. Have been.   FVIII cDNA is operably linked to a promoter or transcription control element This element can be synthetic or controllable or adjustable. Noh Or it may be tissue / cell type specific. Preferably, if production Or FVIII cDNA expression in helper cells is suppressed during virus production And activated after being delivered to the target cells. In this way, this mini Adve Differential expression of the reporter or effector gene of the promoter is activated. this Such differentiated expression is α1Anti-trypsin (α1-AT) Operates on promoter Having a liver-specific enhancer or tetracycline operably linked Ron (tetO) activates the cytomegalovirus (CMV) promoter (tetO- Operably linked to a CMV) (in this case, tet-KRAB transcriptional repressor). (A cell line that expresses a sarcoprotein is used.) By constructing a DNA molecule with FVIII cDNA under transcriptional control Is done. Embodiment 5 FIG. Homologous recombination arm of FVIII expression cassette   Homologous for inserting a foreign gene into the genome of a target cell to obtain stable gene expression Recombination can be used. Using this technique, the human FVIII cDNA The target can be set to the genomic DNA of the target cell. Human albumin gene Or using large segments of cellular DNA derived from human α-fetal protein (32, 33). 12.5 kb albumin pro in FVIII mini-Ad vector The motor has several downstream fragments over 6 kb While prepared as a potential 3 'recombination arm, the upstream homologous recombination arm Act as Albumin gene used in the present invention, intergenic region and The shape of the α-fetal protein gene region is shown in FIG. At the 5 'end 12.5 kb albumin promoter and a 3 'cognate recombination arm Expression set in plasmid GT2061 containing several regions 32 is shown in FIG. These vectors have the orientation of these arms Since the orientation is the same as the sequence in the normal human genome, Play a role. 3 'XhoI recombination derived from the human albumin gene PA1b-E5 cloned into the unique SalI site of arm and GT2061 The construct containing the segment (GT2063) is shown in FIG. 3 'albu Human albumin promoter-induced hFVIII flanking the min homologous recombination arm The restriction enzyme digestion of a vector suitable for constructing is shown in FIG. plus The XhoI albumin gene fragment of mide pE5 is replaced with the unique SalI site of GT2061. Into the plasmid GT2063. Embodiment 6 FIG. Generation of FVIII mini-Ad vector   12.5 kb EcoRI / HindIII human albumin promoter fragment To pBluescriptKS+(Stratagene, La Jolla, CA) did. This Thereby, the human albumin promoter vector GT4031 is transformed into human FVII. I cDNA (SV40 early intron at the 5 'end and SV40 at the 3' end XhoI to SalI region of GT2051 containing polyadenylation signal) Contains a unique SalI site in which is inserted. The resulting plasmid GT2053 is , Contains unique SalI and XhoI sites located 3 'of the polyadenylation site (FIG. 29). Ad minimal ITR and wild type packaging signal 2033 by XhoI digestion and SalI of plasmid GT2053. The site was cloned into plasmid GT2061. Albumin gene Isolated from the 6.8 kb arm pAlb-E5, a unique SalI site in GT2061 To generate plasmid GT2063. GT2063 helper Transfected 293 cells with viral DNA and called mini GTV2063 An Ad FVIII minivirus was generated.   Helper virus genome (2 μg) to generate FVIII minivirus Was purified from the virus particles, and phosphoric acid was added together with the helper Ad genome (0.2 μg). 293 cells were co-transfected by Lucium-mediated transfection (81). CPE After appearance, a cell-free frozen thawed lysate is prepared and used to infect fresh 293 cells. Was. In the cell supernatant, a coat test chromogenic assay (Pharmacia (Pharma) acia)) using FVIIIGT2 Human FVIII indicating the presence of 063 mini-Ad was detected. These data are Consistent with the growth of the Luper / GT2063 mini-Ad vector mixture.   In yet another approach (FIG. 35), the Ad packaging signal and An adenovirus hell lacking the E1 region but encoding the remainder of the Ad protein Perplasmid pBHG10 together with mini-Ad clone GT2063 in 293 cells Was co-transfected. This rescue of the Ad minivirus genome will infect 293 cells. Followed by an E1 replacement helper virus with attenuated packaging function did. Using the methodology of the present invention, the helper Ad / mini-Ad ratio may vary, but It is possible to package both these Ad helper and mini-Ad genomes. Yes, it is possible to generate adenovirus particles carrying either genome is there.   Generation and detection of FVIII mini-Ad are shown in FIGS. 35 and 36, respectively. . Contains helper plasmid pBHG10 (0 μg) and human FVIII gene The mini-Ad vector (GT2063; 2 μg) was transfected with calcium phosphate (8 293 cells were co-transfected according to 1). Transfection of 293 cells is performed by known methods. Any of the widely available techniques, such as lipofectin (ie, Gibco / Lipofectamine from BRL) or electroporation (ie, Bio-Rad (B io-Rad) and an electroporator). be able to. Infection of transfected 293 cells with attenuated helper virus Performed 3 days after entry (FIG. 35B). Adenovirus infection is progressing sufficiently The cytopathic effect (CPE) in FIG. 35B was observed 4 days after infection. So After that, the virus stock (passage 0, ie, P0) is added to the infected cell pellet multiple times. Prepared by freeze-thaw. Next, 293 cells were infected with the P0 stock. (1: 1), supernatant collected 24 hours after infection was specific for the presence of hFVIII sequence PCR was positive. After 6 days, CPE was detected and the freeze-thaw lysate (P2 ) Was prepared. The P2 lysate was then packaged by PCR into GT206. The presence of 3 mini-Ad and functional hFVIII were tested. In 293 cells HFVIII expression is determined by the human albumin promoter in these cells. Was expected to be minimal due to low activity. This is due to calcium phosphate precipitation. After transfection of 293 cells with GT2061 using the transfection method, (69) and FVIII chromogenic assay (Helena Laboratories (Helena)   Laboratories) and Pharmacia) . Embodiment 7 FIG. Amplification and generation of mini-AdFVIII   Applicant previously filed May 31, 1996 with US patent application Ser. No. 08 / 658,9. Application for No. 61, in the application To generate the mini-AdFVIII vector GT2063 and perform early passage of the growth Reagents and methodology for performing were provided (79, 80). During these growth stages In this connection, the Applicant has determined the ratio of mini-AdFVIII to helper virus AdHβ. Increased as the growth progressed. All applications are known to those skilled in the art. Vectors for helpers using PCR and Southern blots, which are common techniques of Provides an analysis of the ratio of the parameters. For all passages, 500 μl (3 of infected cells) Virus extract (obtained by two freeze / thaw cycles) Were used to infect a new subconfluent monolayer of 293 cells in the wells of the host. 1 hour of infection After a while, 1.5 ml of fresh medium (DMEM / 10% FBS) was added. Cell transformation As soon as the sexual effect (CPE) was completed, the cells were harvested and the virus was extracted again. At each passage, 0.5 ml of 2 ml was used, so this growth Have an amplification scale of 1: 4. Using the clarified crude lysate of all passages, Virus D by SDS / EDTA / proteinase K digestion and ethanol precipitation NA was purified. This viral DNA was used for PCR and Southern blot to Ad and, independently, helper Ad virus DNA was detected.   PCR was performed using primers specific for human FVIII cDNA and amplified. Should be treated with DNAse prior to DNA extraction to ensure any residual non-viral contamination plus Performed on virus from which mid DNA was removed. PCR as a template Of isolated viral DNA (1/20 of isolated viral DNA), final concentration 1 μ M FVIII primer # 1 (SEQ ID NO: 1; ACCAGTCAAAAGGGAG AAAGAAGA), FVIII primer # 2 (final concentration 1 μM) SEQ ID NO: 2; described as CGATGGTTCCTCACAAGAAATGT), And the following conditions: annealing at 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute A total of 35 cycles of polymerization and denaturation at 94 ° C for 1 minute. These results indicate that FVIII Minivirus was shown to be present during early passage (passage 3; data not shown) .   FIG. 36 shows the packaging system for the FVIII mini-Ad and, independently, the helper Ad. 4 shows the results of PCR amplification of the signal. PCR to packaging signal region I also went. PCR was performed using isolated viral DNA (isolated whole) as a template. 1/20 of viral DNA), 1 μM final concentration of packaged signal primer -# 1 (SEQ ID NO: 3; GGAACACCATGTAAGCGACGG), final concentration 1 μM of packaged signal primer # 2 (SEQ ID NO: 4; CCATCGAT AATAATAAAACGCCAACTTTTGACCCG) and the following conditions Annealed at 55 ° C. for 1 minute, polymerization at 72 ° C. for 1 minute, 1 minute at 94 ° C. 35 cycles of synthesis with denaturation between. Helper Ad packaging signal partially Deleted PCR products from the packaged signal deletion helper Shorter (177 bp) than that of the mini-Ad with a packaging signal (about 310 bp). bp). FVIII mini-Ad is not detected at early passage, but its presence is It was gradually detected in passages 3 to 6. The same results were obtained using Southern blot analysis. (FIG. 37). FVII as a probe in Southern blot analysis Ad DNA adjacent to the right ITR present in both I-MiniAd and HelperAd The fragment was used. Detected after PstI digestion of mini-Ad GT2063 and AdHβ The expected length of the resulting fragment is 3.3 and 2.2K, respectively. FIG. Are four of the FVIII mini-Ad DNAs independently isolated from passages 1-21. It is a compilation of Southern blots (AD). Equivalent to mini-AdFVIII A 3.3 Kb band was detected in DNA isolated from passages 5-21. FVI A stable increase in II mini-Ad DNA was detected up to passage 10 and thereafter until passage 12. FVIII mini-Ad decreased gradually. Of this FVIII mini-Ad DNA Cycles of increasing and decreasing levels were observed to occur in almost all four passages, This is accompanied by a parallel cycle of helper Ad DNA levels that starts slightly earlier. Followed. To determine these cycles more fully, the FV III The amounts of mini-Ad DNA and helper Ad DNA were quantified by concentration measurement. , And are plotted in FIG. Equal amount From markers (1Kb ladder markers from Gibco, Gaithersburg, MD) The intensity of the band was used to normalize the results of the different blots. Observed rhino The virus is a population of viruses produced in association with the defective interfering virus (in the system of the present invention). The virus population comprises FVIII mini-Ad) and helper virus Is consistent with the known kinetics of Understanding and controlling these cycles leads to optimal titers To determine at which passages the mini-Ad vector should be purified for It is important. Passages such as # 18 (P18) have low titers, but This results in a vector preparation that is rich in Ad (ie, P18 is one more than Helper Ad) It is believed to contain 0-fold more FVIII mini-Ad). # 20 (p20) Such passages may have a 1: 1 undesirable FVIII mini-Ad to helper Ad ratio. But contain high concentrations of FVIII mini-Ad and helper Ad.   Large scale amplification was performed at p20. About 10 each9Infected 293 cells (ATCC # Turn the 100 15 cm dish containing CRL 1573) as soon as the CPE is complete. Received. Thereafter, the crude lysate was prepared by three freeze / thaw cycles and the Ruth was extracted. The crude lysate is clarified by centrifugation and the step concentration of CsCl 35000X on gradient (3 layers of 1.5, 1.35 and 1.25 g / ml) Centrifuged at g for 1 hour. The bands corresponding to mini-Ad and helper-Ad were 1.35 g / ml second continuous C Further purification using an sCl gradient. 35,000 rpm (150,000Xg ) Were observed after centrifugation for 16 hours. Separately in phosphate buffered saline (PBS) containing 10% glycerol Dialysis was performed. Viral DNA was purified from aliquots of each band and mini-AdF VIII and helper levels were analyzed by Southern blot. Upper band (more Lightweight) mainly contains mini-Ads and the lower band mainly contains helper Ad I thought it was These results indicate that the FVIII mini-Ad genome (GT2063 = 31 Kb) is smaller than the helper Ad genome (AdHβ = 37.1 Kb). It was envisaged that the parent application of the present application (US 08/6 filed May 31, 1996) 59,961), the previous CsCl fraction for M32 mini-Ad It matches the drawing result. Embodiment 8 FIG. Testing of mini-AdFVIII in cell lines   FVIII mini-Ad (GT2063) was purified by CsCl as described above and FVIII production in host cells infected with this vector. This 293 and HepG2 cells were converted to albumin promoter Was used for their ability to use. Production of FVIII in these cells Was assayed 24 hours after infection by immunohistochemistry and functional assays. Purified FVI Add II mini-Ad vector to 0.5 ml medium Plus 4cmTwo6X10 in the wellFiveOf 293 and HepG2 cells Using. After incubating for 4 hours to adsorb the virus particles to the host cells, Was replaced with fresh medium. Lighter images including FVIII mini-Ad 293 cells were infected with 0.1 μl of the 1 / 100th dilution, and these cells were After performing immunohistochemical analysis for the presence of FVIII, approximately 1 0% stained positive for FVIII expression (FIG. 40, panels AD). The estimated titre in transduction units per milliliter is 6 × 109Transduction unit / Ml. 4 hours adsorption time, 4cmTwo0.5 ml adsorption volume Estimated titers are 0.42 and 0.56, respectively, taking into account , And a factor of 0.53 (49). Therefore, mini-AdFVII The actual titer of the I vector is 4.6 × 10TenEstimated as transducing factor / ml . Optical absorption at 260 nm reflects the number of virus particles per milliliter The titer thus determined is 3.6 × 10 for the light fraction of the FVIII mini-Ad.12 Particles / ml were determined. Therefore, the biological activity of FVIII mini-Ad is 78 One FVIII transduction unit can be calculated for each virus particle, Stay within tolerance levels recommended by the Pharmaceutical Administration.   The amount of functional FVIII in the supernatant of the transduced cells was determined using the chromogenic coaster FVII. I test (Pharmacia, Pisca (Taway, NJ). 1 million 293 cells or, independently, H To achieve 100% transduction of epG2 cells, an excess of purified vector was used. Infected. The infection conditions were as described above, and the supernatant (2 ml) 24 hours after infection Collected. To generate a standard curve, a standard human plasma sample is continuously run in cell culture medium. To give a final FVIII concentration range of 62.5-4000 ng / ml. These results are shown in FIG. F detected in HepG2 and 293 supernatants The amounts of VIII were 0.8 and 0.23 ng / ml, respectively. Accordingly Thus, the total amount of FVIII produced in 24 hours is 1 million HepG2 cells 1.6 ng, 0.46 ng per million 293 cells. Embodiment 9 FIG. Improvement of mini-AdFVIII in vivo   To generate vectors that can clone various expression cassettes A better vector system was achieved. Proximal albumin promoter region and Pm By excision of the human FVIII gene located between the eI and SalI sites The vector GT2063 was modified. This involves first connecting the SalI linker to Pme The PmeI site of GT2063 is converted to a SalI site by ligating to the site. Was achieved by converting to The obtained clone GT2072 was treated with SalI. And religate the proximal albumin promoter / hFVIII gene Unique SalI cloning for removing various expression cassettes A mini-Ad vector having a nicking site was created. Departure from such a cassette May be affected by an albumin gene enhancer located upstream . Each clone was analyzed to determine the level of transgene expression.   An expression cassette was prepared for insertion into this improved vector GT2072. Was. The expression cassette in this example is a cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter. And the elongation factor I (EF-I) promoter (which can act in a variety of cell types). And pyruvate phosphoenol carboxykinase (PEP) CK) gene contains a liver-specific promoter. EF-I and CMV promoter Indicates, independently of each other, full-length FVIII cDNA or B domain deletion (BDD) Used to drive expression of any of the factor VIII cDNAs (FIG. 42 and 43). Next, the EF-1 BDD FVIII flanked by SalI sites The cassette was cloned into the SalI site of GT2073 and the plasmid shown in FIG. A sumid was produced. Full length human FVIII coding region with CMV promoter An expression vector was also constructed which contained under the control of a cell, which is shown in FIG. Embodiment 10 FIG. Construction of Integrable AAV-ITR / Rep Based Vectors   Adeno-associated virus is a helper such as adenovirus or herpes virus. -Human non-pathogenic single-stranded linear parbowie that replicates only in the presence of virus Ruth. However, in the absence of helpers, AAV may Specifically integrated into the genome and maintained as a potential provirus (34) . The specific locus at which AAV integrates is located on chromosome 19q13.3-qter. And called AAVS1 (22-25, 35).   The mechanism of AAV integration has not been fully elucidated. However, two c Ils elements are associated with this process: AAV ITR and two forms Rep virus proteins (Rep78 and Rep68). AAV ITR (Inverted terminal repeats) are palindrome sequences at both ends of the AAV genome, It folds into an pinned structure and acts as a replication origin. Rep78 / 68 protein For quality, sequence specific DNA binding (36, 37), sequence and strand specific end Nuclease activity (38) and ATP-dependent helicase activity (38-40) Several activities have been described, including: These proteins are characteristic of ITR DNA. It is possible to bind to a defined sequence, thereby creating a break in the ITR hairpin. It facilitates a process called end digestion in which replication takes place. Rep binding mochi And truncation sites (trs) are present in both AAV ITR and AAVS1. Identified Has been shown to promote in vitro DNA replication in the presence of Rep. (28). In addition, Rep6.8 protein was used for AAV in vitro. It has also been shown that it can mediate complex formation between the ITR and the AAVS1 site (41 ). These findings implicate Rep's DNA binding and deletion at the ITR and AAVS1 sites. Nuclease activity is included during ITRs, along with restricted DNA synthase. Suggests to allow targeted integration of the included sequence (27).   AAV is considered as a candidate vector for gene therapy. However, that Limits on the size of exogenous DNA that it can accept (4.2 Kb); Difficulties in obtaining high titers in mock preparations and specific integration of recombinant AAV Loss causes problems in using this virus as a gene therapy vector You.   10.1 Plasmids for Testing AAV / ITR-Rep Integration System Construction   For incorporation of the AAV integration mechanism into the mini-Ad vector (FIG. 44), The applicant has opened a plasmid vector containing the adeno-associated viral elements required for integration. Tested. In the design of the present invention (FIG. 45), this vector (Including the Rus endogenous promoter) Rep expression cassette plus two AAVIs TR consists of a cassette for expression of an adjacent reporter gene. This Rep The expression cassette contains plasmid pSUB201. After PCR amplification of sequences 193 to 2216 of the AAV genome from (41) Obtained. This fragment starts on the right after the ITR and contains the p5 promoter and Re. Extends through the p78 coding region.   10.2 Testing of AAV / ITR-Rep integration system in cultured cells   Transiently transfected 293 cells and E1-non-expressing cell lines (Chang hepatocytes) Expression of Rep from this plasmid in addition to immunoprecipitation, using specific antibodies Were tested by Western blot. The results (FIG. 46) show two types of 4 shows that different forms of Rep are produced in 293 and Chang hepatocytes. Rep 78 appeared as a double white, and the product of the Rep52, p19 promoter was a single Appears as a band. For Chang hepatocytes, the signal is better for 293 cells Although strong, two major forms, also Rep78 and Re as doublets p52 is detected.   To test the specific integration capacity of these plasmids, a Rep expression cassette was used. However, the reporter gene expression cassette contains two AAV IT A control plasmid was constructed by leaving it between the Rs. 293 cells Was transfected with plasmid GT9003 or GT9004, and then G418 (0. (5 mg / ml) for 12 days. G418 resistant colonies were isolated and expanded Salt precipitation from genomic DNA from different colonies Extracted by (125). Genomic DNA is digested with EcoRI to produce AAVS1 Analyzed by Southern blot using the corresponding probe. EcoRI is AAV Selected because the S1 locus is contained within an 8 Kb EcoR1-EcoR1 fragment did. FIG. 47 (panel A) shows the 8 kb band corresponding to the normal sequence plus Plasmid GT9003 (Rep. 50% of analyzed resistant colonies derived from the expression plasmid) Shows that the AAVS1 locus was rearranged. Plasmid GT9004 No rearrangement was observed in colonies derived from this, indicating that this phenomenon was It shows that it depends on the expression of p. These results indicate that Rep was specific for the transgene. It suggested that integration could be driven. Next, these membranes are neo (FIG. 48, panel B). Profit In the band pattern, some AAVS1 rearrangements correspond to ne0 ( For example, clone 2L2), but probably because of the applied selection pressure It also suggests that frequent recombination events occur in the analyzed clones. Was.   10.3 Testing of AAV / ITR-Rep embedded systems without selective pressure   To rule out this possibility, plasmids GT9012 and GT9013 were used. Another set of experiments was performed. This In these plasmids, the reporter gene was GFP (Equorea victorum). Rear green fluorescent protein). This reporter uses cells for flow cytometry. Including, but not limited to, cell sorting and single cell cloning Suitable for isolation using the method, whereby the Eliminates the effects of applied selective pressure. Transfect 293 cells with any plasmid Entered. One day after transfection, it falls into the predetermined fluorescence range (so that the transfection phase Sort out cells by flow cytometry and remove single cells Was cloned in a 96-well plate. After 2-3 weeks of sorting, roll Knees were scored for fluorescence. Three independent experiments were performed and the results are shown in Table 2- l. Cloning efficiency (colonies generated per total number of seeding wells ) Showed some variability for GT913-induced cells, while the plasmid Transfections with GT9012 were generally constant. Plasmid G Approximately 50% of the colonies derived from T9012 fluoresce and are subsequently passaged. Maintain their fluorescence in contrast to those derived from plasmid GT9013 The results showed that 8% showed some fluorescence. The fluorescence intensity is weak, and the observation Consistent with integration of one or several copies of the GFP expression cassette into the cell genome . Interestingly, some colonies showed mosaicism of GFP expression. This One of the explanations is that After the cells begin to divide, an integration event occurs, which gives rise to two different populations It can be assumed to have been. In a parallel experiment, the GFP expression cassette was Transform cells with plasmid pCA-GFP (containing no viral sequences) containing alone Populated. Fluorescent colonies detected after single cell cloning in addition to sorting Not performed (Table 2-1). Taken together, these results show the built-in efficiency Is enhanced by the presence of the AAV ITR, but when Rep is expressed, 5 times higher. Targeted integration of GFP in AAVS1 Some colonies (fluorescent and non-fluorescent) were grown and analyzed for further analysis. DNA was extracted as described above. FIG. 48 (Panel A) shows the results for AAVS1. Figure 3 shows the results obtained by Southern blot using the probe. Plasmid GT In some colonies derived from 9012, AASV1 rearrangement was , Whereas rearrangement was not detected in GT9013-derived colonies. This indicates that the presence of Rep is required for targeted integration . Next, this membrane was searched for GFP and matched with the relocated band. Was checked (FIG. 48, panel B). Parent cell line 293 was negative as expected . 5 colonies outperformed 8 Kb band consistent with those obtained with AAVS1 And thus shows the specific incorporation of GFP in AAVS1. Overall And the results shown above show that A Plasmids containing AV ITR and Rep are frequently integrated into host genomic DNA And that the design is delivered by an adenovirus vector. It is suggested to be useful for incorporation of such sequences (FIG. 44). Table 2-1. Results of single cell cloning experiments *The number of colonies per number of seeded wells is shown.   **Number of colonies showing fluorescent cells 2 weeks after sorting per number of colonies Is shown. Embodiment 11 FIG. Site-specific integration of FVIII expression cassette   I to the plasmid associated with the expression of Rep78 Introduction of TR DNA Sequences Increases Integration of DNA Sequences of Interest into Cell Genome Enhancing is based on the parent application of the present application (US 08/6 filed May 31, 1996). 59,961), which was previously shown by the Applicants (56). This Prior inventions of the reporter gene flanked by AAV ITR sequences [ie, gene encoding neo or green fluorescent protein (GFP)] Combining a set (hereinafter referred to as an integration cassette) with an upstream Rep expression cassette (FIG. 44, panels AD). results of the experiment Is the integration of these plasmids (ie, GT9003 and GT9012). Plasmids lacking Rep activity (ie, GT9004 and GT901 It shows that it is about 10 times higher than 3). This data further shows that Rep Essential for efficient targeted integration of exogenous DNA into the genome Show. In view of these results, the present invention provides the advantages of Ad vectors (high-titer products, Large capacity for foreign DNA, high levels of infectivity of multiple cell types) and AA A hybrid vector having V integration capability is provided. This of the present invention The hybrid virus replicates as an adenovirus and has sufficient AAV for integration Contains elements.   The present invention relates to FVIII expression flanked by a Rep expression cassette and an AAV ITR. Includes mini-Ad vector with cassette (FIG. 44). Further foreign DNA ( 36k b) can be inserted into this vector. Further outpatients of this vector Sex DNA corresponds to the human albumin genomic sequence (non-coding). From Rep The current cassette contains 193 to 2216 bp of the AAV genome. This fragment is the ITR And extending through the p5 promoter and Rep78 coding sequence. Violated. For reasons described below, the fragment containing the seven tet operators is p 5 promoter and introduced by tet-KRAB repressor (42) Included to enable transcriptional repression of the rep gene.   High concentrations of Rep protein in cells are cytostatic, possibly It may interfere with the replication of the Ad vector. Therefore, live virus vectors To prevent the expression of Rep during growth, the tet-KRAV repressor is Can be provided as a switch. To this end, the present invention provides tet -Provides a 293 cell line stably expressing the KRAB repressor protein. Virus invades host cells that do not express the tet-KRAB repressor protein Expression of Rep occurs due to the absence of the repressor in those cells. Facilitates the integration of sequences flanked by AAV ITRs into the cell genome It is. The viral vectors thus generated are in vitro and in vitro. In the test, the frequency and specificity of the integration can be tested. Embodiment 12 FIG. AAVS1 cloning and vector construction   One aspect of the invention is a human AAV for use as an in vivo animal model. Methodology for generating transgenic mice with S1 integration site is there. This animal model contains a viral vector containing the AAV integration mechanism described above. Used for testing site-specific integration. The first aiming to develop this animal model The steps involve cloning the AAVS1 site and transferring the sequence to a mammalian expression vector. Insertion.   The AAVS1 human integration site was first described by Kotin et al. (50). It was cloned as a 2 kb EcoRI fragment, the first 4067 bp of which had the sequence It has been decided. Using this DNA sequence information, two types of oligonucleotide To design imers and subsequently use them as AAVS1-specific probes 253 bp PCR product. Upper primer U2493 (SEQ ID NO: No. 5: GCTGCTCTGGTGCGTTTCACTGAT) is an AAVS1 sequence A 23-mer extending to base pairs 2492-2515, the lower primer L2722 (SEQ ID NO: 6: TCACAAAGGGAGTTTTCCACACG) is also AAVS It is a 23-mer that extends to base pair 2722-2754 of one sequence. PCR amplification 100 ng of human genomic DNA as template and U2492 and L2722 primers at a final concentration of 1 μM (SEQ ID NO: 5, respectively) And SEQ ID NO: 6) as follows: 95 ° C., 4 min-1 cycle; 9 5 ° C., 0.5 minutes, 55 ° C., 0.5 minutes, 72 ° C., 1-35 cycles; 72 ° C., 7 Min-1 cycle. The 253 bp AAVS1-specific PCR product was (Genome System) (St. Louis, MO) where the human It was used for screening of the P1 genomic DNA library. 80-120kb 4 P1 clones in the size range (# 6576, 6577, 6578, 6579 ) Was identified as giving rise to the correct 253 bp AAVS1 PCR fragment. this To confirm that these clones contain the AAVS1 sequence, these four P1 Isolate DNA from the loan and use EcoRI alone or EcoRI with EcoRV. The digests were combined and used for Southern blot analysis. 253 bp AAVS1 feature For hybridization of blots using different PCR products as probes Thus, the 8.2 kb EcoRI fragment (FIG. 49A) and all the clones are expected. And the expected 5.2 kb EcoRI / EcoRV fragment (FIG. 49B). Which indicates that they represent an intact full-length copy of the human AAVS1 sequence. Indicates that it contains. The 8.2 kb EcoRI fragment was isolated from P1 clone # 6576. It was cloned into the EcoRI site of the mammalian expression vector pGKneo. The obtained 12.9 kb plus Mid pAAVS1-Neo, in addition to human AAVS1 sequences, Has a neomycin resistance gene (Neo) for selection (FIG. 50). Embodiment 13 FIG. Generation and characterization of AAVS1 (+) ES cell line   AASV1 strain used in generation of AAVS1 transgenic mice In order to generate a mouse embryonic stem (ES) cell line containing the pAVS1-Neo Transfection of Smid into mouse ES cells (129Sv agouti, Genome Systems) (FIG. 51). 25 μg of pAAVS1-Neo plasmid DNA was added to Xba I and linearized with Biorad Gene Pulsar. ulcer) on ES cells by electroporation (975 μFd, 252 v) Transfected. Transfected cells are selected for one week at 250 μg / ml G418 did. 24 neo-resistant (NeoR) Colonies are isolated and totipotent phenotype Grow and characterize by morphology to enrich cell lines that maintain A clone was obtained in which> 95% was "undifferentiated". 17 NeoR  ES clone Genomic DNA was isolated from the untransfected parental ES cell line in addition to 0ng as a template, primers U2492 and L2722 (each , SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; final concentration 1 μM) Used for CR. PCR conditions were: 95 ° C, 4 min-1 cycle; 5 minutes, 55 ° C, 0.5 minutes, 72 ° C, 1 minute-35 cycles; 72 ° C, 7 minutes-1 cycle It was Kuru. As shown in FIG. 52, 17/17 NeoR  ES clone 253 bp AAVS1 PCR product expected from PCR of derived DNA Was generated, while PCR analysis of DNA from untransfected control ES cells No available PCR product was produced. Southern blot analysis as control and AAV Performed on the S1 (+) ES cell line, the functional AAVS1 sequence was transfected and It was confirmed that the data was stored after the program was incorporated (FIG. 53). (Detection by PCR AAVS1 positive ES cell lines (AAV1 ES # 4 and ES # 3.16) ) Was digested with EcoRI combined with EcoRV, electrophoresed and blotted, Hybridized with 8.2 kb AAVS1 probe. ES # 4 and ES # Both the 3.16 cell line had the expected 5.2 kb and 3.0 kb EcoRI / E. Contains the coRV fragment, which indicates integration of the entire 8.2 kb AAVS1 sequence. (FIG. 53). Untransfected parental ES cells were prepared using this human AAVS1 specific probe. And showed no hybridizing band. AAV virus is in addition to humans Although integrated into the mouse genome, a mouse homolog of AAVS1 (which has yet to be identified) (Not shown) should be significantly different from the human sequence and should be different from the human AAVS1 probe. Are known to not cross-hybridize, and therefore do not Hybridization Was expected to be detected. These AAVS1 (+) cell lines ES # 4 And ES # 3.16 were used to generate AAVS1 transgenic mice. Pointing was used for the next blastocyst microinjection experiment. Embodiment 14 FIG. Generation of AAVS1 transgenic mice   To preserve the undifferentiated totipotent phenotype, the AAVS1-positive ES clone ES # 4 and ES # 3.16 in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF-anti-differentiation factor) And grown on a 1 ° murine embryonic fibroblast feeder layer with very low passage (P.2- P. 7). 3.5p. c. Blastocyst stage superovulation C57BL / 6 mice were collected and maintained in M16 embryo medium. 15-20 ES cells (AAVS1 ES # 4 or ES # 3.16) in the blastocoel of the 3.5-day embryo (Lietz) DM-ILB microinjection workstation ( Microinjection using Microinjection Workstation Was. Following microinjection, the embryos were returned to M16 medium and 5% CO 2TwoAt 37 ° C The blastocysts were incubated again for 2 hours to re-form the cavity. Next, 10-15 Injected blastocysts were injected with pseudopregnant CG6F 2.5 days after mating (pc).1Foster mother's womb Moved to After being transferred to the uterus, the blastocysts are implanted in the uterine wall and AA VS1-positive ES cells are taken into the inner cell mass of the embryo Rarely, they pass on their genetic information to embryo development, resulting in transgenes about 17 days later. Nick (chimera) descendants are born. Male chimeras with a high rate of more than 40 Zu) has been generated. High percentage of ES cell-derived agouti (brown) fur color genes Some examples of these chimeric founders demonstrating this are shown in FIG. Chimera mau PCR analysis was performed to detect the AAVS1 transgene in E. coli. genome DNA was isolated from AAVS1 chimeric and non-chimeric litter tails and these DNAs were   100 ng of AAVS1-specific primers U2492 and L2722 (which PCR analysis using SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) respectively at a final concentration of 1 μM Screened. PCR conditions were: 95 ° C, 4 min-1 cycle; . 5 minutes, 55 ° C, 0.5 minutes, 72 ° C, 1 minute-35 cycles; 72 ° C, 7 minutes-1 cycle It was an Icle. Correct 253 bp AAVS1 PCR product becomes a high rate chimera In the derived tail DNA, it was actually detected (FIG. 57, lane 7). La litter tail DNA or low-rate texture showing less than 10% agouti fur color chimerism La (FIG. 55, lanes 5 and 6, respectively). Accordingly To clone the human AAVS1 integration sequence and transform it into mouse embryonic stem cells These ES cells were microinjected into embryos at the blastocyst stage, and the resulting trans Succeeded in showing the presence of this human transgene in the genome of a transgenic mouse I have. These chimera founders Currently, to obtain germline transmission of the human AAVS1 transgene, wild-type C57BL / 6 females. Once germline transmission is achieved, its F Raising one heterozygous offspring to homozygous AAVS1 transgenic A usus system is obtained. Next, using this homozygous system, an AAV virus vector At the hybrid adenovirus / AAV virus vector, or AAVS1 site Others including the AAV ITR and Rep78 / 68 genes required for integration Testing of any AAVS1 site-specific integration of any plasmid vector Can be used. This AAV transgene was infected with the virus (IV Note). After entry) or by using a ligand-mediated DNA / liposome complex. Can be delivered to AAVS1 transgenic mice in vivo . Frequency of site-specific integration, stability of the integrated transgene and stable The duration of protein expression (ie, human factor VIII or IX) is It can be evaluated after incorporation into cells.   Application to transgenic mice in which the AAVS1 sequence has been integrated into the genome The efficiency of in vivo delivery of viral vectors containing deno-related integration elements is as follows: Can be tested by methods. Transgenic with the viral vector of the present invention The mice are injected intravenously or into the portal vein. This vector is part of a pharmaceutical composition, Well, and Lipids such as lipofectamine (Gibco / BRL) and / or liver-specific ligans It may or may not form a complex with the electrodes (79, 80). Virus on mouse After administration of the vector, blood samples are collected weekly for up to one year or more To assess the persistence of transgene expression. Viral vector effect The level of expression of the reporter or reporter gene can be determined by Northern blot, It is determined using techniques such as protection assays or PCR. Testing of FVIII mini-Ad In, FVIII is detected by an ELISA assay. Presence of transgene expression To determine the continuity, the expression water of the effector or reporter gene in each blood sample The criteria are compared to each other. To determine site-specific integration of the vector, Genomic DNA is isolated from liver tissue of an animal. Then, AAVS1-specific plug Genome D using primers containing sequences homologous to the sequence of this vector Perform NA PCR analysis. The A of the transgenic animal genome of this vector Site-specific integration at the AVS1 site allows for both AAVS1 and vector sequences. The resulting product contains The amplified PCR product is If it is integrated into the AAVS1 site of the product, it contains the vector sequence. Embodiment 11 FIG.   A. FVIII with the human AAVS1 integration sequence Transgenic mouse   AAV / ITR-Rep containing either neo or GFP reporter gene Transform vectors (GT9003 and GT9012, respectively) into human 293 cells Populated. The extracts of these cells were then analyzed by Southern blot for endogenous AA. This vector was assayed for site-specific integration at the VS1 site. AAVS The integration at 1 is performed using neo or GFP) bar of the AAV-ITR / Rep vector. John (GT9003 or GT9012, respectively) It was observed 50% of the time in samples obtained later. These results AAV ITR and Rep coding regions are highly efficient site features in AAVS1 It is sufficient to guide heterologous integration (56). AAV-ITR Mini-Ad-hFVIII vector containing the / Rep integration element Targets AVS1, integrates in a site-specific manner, and prolongs hFVIII An animal model system was developed to show that expression was maintained during the period.   The present invention relates to a transgene having a human AAVS1 integration site in its genome. Nick mice. This transgenic mouse is shown in FIG. Generated using embryonic stem cell manipulation techniques (43). 8.2 kb human AAVS1 sequence Construct an Expression Vector Containing Whole and Neo (or Neo) Selectable Markers . This AAVS1 / Neo vector is transformed into a totipotent mouse embryonic stem (ES) NeoR, AAVS1 by transferring to cells+An ES cell clone was obtained and subsequently Microinjection into the embryos of the male blastocyst stage is performed and transplanted into the uterus of the foster mother. After transplantation, this AA VS1+  ES cells resume normal embryonic development and their genomic information (human AAV (Including the S1 sequence) to the developing embryo. Chimeric (transgenic) progeny are E Identified by the presence of S cell induced agouti brown fur color. Next, the chimera founder Reared with type C57BL / 6 mice to obtain germline transmission of the transgene. F1 Heterozygotes are bred and their genomes are stably integrated with the human AAVS1 integration sequence. Obtain an integrated homozygous mouse line. The tail vein was then added to this mouse model. Alternatively, the AAV-ITR / mini-Ad-FVIII vector is injected via the portal vein, and In Vivo Transduction Efficiency, Integration with Human AAVS1 Sequence, and Transgene Expression Assess the persistence of B. Transgenic mice tolerized to human FVIII   An FVIII tolerized mouse model system is also provided by the present invention. Past, FVI II tolerization was achieved by transient injection of FVIII into neonatal mice. (44). The present invention relates to the control of promoters that act in a development-specific manner. Includes mice with the human FVIII gene under control. Such a promoter Α-fetal protein gene or embryonic globin gene, epsilon Including but not limited to Absent. The α-fetal protein promoter is early inactive in mature animals. It is an example of a stage-specific promoter (45). Embryonic globin gene, ip Shillong is another developmentally regulated gene that can be used in the present invention. It is an example. Under the control of the α-fetal protein promoter, the expression of the gene is Limited to the liver and dependent on liver-specific transcription factors for activation (46,47 ). Normal sites for FVIII expression and preferred target organs for FVIII gene delivery are Because of the liver, a liver-specific promoter element that is also developmentally regulated is preferred. New The α-fetal protein promoter (AFP) meets both of these criteria. You. α-fetal protein promoter does not work in undifferentiated ES cells , Induced during differentiation (48); which, as such, It can be used to control the expression of hFVIII in a transgenic mouse.   One of the objects of the present invention is to render tolerant to a xenogenic human FVIII protein. Is to provide a transgenic mouse. This transgenic Coomass can be isolated using adenovirus or AAV vector systems, or immunoisolated. In vivo delivery of human FVIII using FVIII secreting cells in the device Can be used for testing. In this system, human FVIII is generated Embryonic expression under the control of the AFP promoter in transgenic mice You. Thereby, HF VIII is considered "self" by the mouse and tolerance develops. Mouse is hFVII I tolerant to I, so that the xenogeneic human FVIII transgene is a therapeutic vector (Ie, delivered by AAV-mini-Ad-FVIII) No immune response occurs. Thus, the antigenicity of the viral vector backbone Accurate assessment of is a reliable measure of the persistence of gene expression in vivo Done. Also, the AFP-FVIII transgene is expressed only during embryogenesis ( Does not occur after the animal has matured), so that the correct concentration of hFVIII It is delivered to the liver of a transgenic mouse. Embodiment 16 FIG. Construction of AFP-FVIII-Neo vector   In order to achieve intrauterine tolerization of transgenic mice, time Can drive expression of human factor VIII in a regulated, embryo-specific manner Mouse fetal protein (AFP) promoter to generate efficient vector Was used. Plasmid GT2057 contains a 7.5 kb AFP promoter sequence. This sequence was first characterized by Urano et al. (33). Full length The 7.2 kb NotI fragment containing the factor VIII gene was cloned into pCMV-FVII. I (GT2051), and N20 behind the AFP promoter of GT2057. It was cloned into the otI site (FIG. 56). Then, A A cassette containing the FP promoter and the hFVIII gene was inserted into AatII / Sal Neo expression vector p; cloned into AatII / XhoI of GKNeo as an I fragment. It has become The resulting 20.2 kb vector, mAFP-hFVIII-pG KNeo (Fig. 56) regulates hFVIII gene by embryonic promoter (AFP) And has a Neo expression cassette for selection in mammalian cells You. Embodiment 17 FIG. Generation and characterization of AFP-FVIII (+) ES cell clone   AFP-hFVIII for use in generating transgenic mice To generate mouse embryonic stem (ES) cells containing the sequence, mAFP-hFVIII- The pGKNeo vector was stably transfected into mouse ES cells. 20 μg AF P-FVIII-Neo DNA was linearized with AatII and Bio-Rad G ES cells were transferred by electroporation using a pulser (975 μFd, 25 2v). After electroporation, ES cells were plated at 250 μg / ml on embryonic fibroblast feeder layer.   Growth in G418 and NeoRSelected for clones. 48 N eoRClones are picked, expanded and functional VIs are prepared using the Coatest kit. Factor II protein was analyzed. Tissue of any of these 48 clones FVIII was not detected in the culture supernatant. Genome DN A is 13 NeoR  Xb isolated from ES clones and untransfected parental ES cells digested with aI, cut 7.2 kb FVIII NotI from GT2051 Pieces were screened by Southern blot analysis using as a probe. 11 / 13 transfected clone contains the expected 7.8 kb Xbal fragment. , The hFVIII sequence as well as the 500 bp 3 'end of the AFP promoter. The presence was also confirmed. 4 of these AFP-FVIII (+) ES clones The analysis of the parental ES cell control in addition to that is shown in FIG. These results show that h The FVIII transgene is NeoRIndicates that it was present in the clone.   Test whether AFP promoter was functional in ES cells Therefore, the AFP promoter was used as an EcoRI / SalI fragment in Reporter Plus. Cloned into mid pEGFP-1 (Clontech) and converted to green fluorescent protein ( GFP; see FIG. 58). This pAFP-EGFP-1 plug Sumids were expressed in ES cells and HepG2 cells (expressing high levels of α-fetal protein). Hepatic cell line, which is known to be Equipped with a Nikon Diaphoto wide-area microscope equipped Green fluorescent cells were examined 24 hours later by direct visualization. GFP Was detected in the HepG2 cell line but not in mouse ES cells. Out Not shown (data not shown), AFP promoter is not active in undifferentiated ES cells. Although not used, it was confirmed to work in a differentiated hepatocyte line. These conclusions The result is that the AFP promoter is dormant in terminally differentiated F9 embryonic stem cells, Activated when induced to differentiate after treatment with retinoic acid (48). In cell lines where expression is expected Confirmed that mAFP-hFVIII-pGKNeo vector was functional For this purpose, mAFP-hFVIII-pGKNeo vector was added to HepG2 cells. After the transfection, the concentrated supernatant was used for the chromogenic Coatest FVIII assay (Pharmacia). A, Piscataway, NJ) for the expression of hFVIII protein. Was analyzed. 3.0 ng / 10 of human FVIII6Detected at a concentration of cells / 24 hours The AFP-FVIII construct is functional and has a 7.5 kb AF Tissue-specific and development-specific expression patterns of the P promoter / enhancer element It was confirmed that it had been saved. APF-FVIII vector is functional And that the AFP-FVIII (+) ES clone , Clone # 22 (FIG. 57, lane 3) based on its undifferentiated growth phenotype And used for blastocyst microinjection experiments. Embodiment 18 FIG. hFVIII tolerizing transgenic ma Generating a mouse   The present invention relates to a xenogeneic human factor VIII protein that is tolerized in utero. Provide transgenic mice. This transgenic mouse Using the adenovirus or AAV vector system, or US Pat. No. 417; 5,344,454; 5,421923; 5,453,278 5,545,223; or 5,569,462 FVIII secretion cells in the Una Cerasite immunoisolation device Used to test the delivery of human FVIII in vivo using vesicles. hFVI II regulates AFP promoter regulation in developing transgenic mice. In order to be expressed embryonic under the therapeutic vector (ie, AAV-mini-Ad-hF HVIII is delivered by the mouse immune system. Recognized as an original. As such, for the hFVIII protein Toleration occurs. This transgenic mouse was tolerized to hFVIII Cause an immune response to the "cross-species" human FVIII protein However, accurate evaluation of the antigenicity of the viral vector backbone and in vivo A realistic measure of the duration of gene expression can be determined. Also, AFP-FVI Because the II transgene is expressed primarily during embryogenesis, mature transgenic As a result of transduction with this vector in mice Thus, the amount of hFVIII protein expressed by the liver can be accurately determined.   The scheme for generating hFVIII tolerized transgenic mice is Is outlined in FIG. AFP-FVIII (+) ES clone # 22 Cells from E. coli were microinjected into C57BL / 6 blastocysts and transplanted into the foster mother's uterus . To date, four chimeric offspring have been produced using ES clone # 22. You. They were paired with wild-type C57BL / 6 mice and tested for germline transmission. Germline ancestors were bred and homozygous AFP-hFVIII transgenic Obtain the Kumas system. This chimeric progeny, by definition, has A in all of these tissues. To demonstrate mosaic expression of the FP-hFVIII transgene, generation of homozygous Without waiting, it can also be used directly for in vivo gene delivery experiments. In this scheme HFVIII protein is first added to the resulting transgenic animal. Antibody to human protein is raised by antigen administration by injection Screening confirms tolerization to hFVIII. Also, Of AFP-hFVIII tolerized transgenic mice in adult animals The "leaky" appearance of hFVIII is also tested. Small amount of hFVIII tamper Therapeutic vector if the protein is produced in an adult transgenic animal. Or the concentration of hFVIII delivered by the protein delivery device Quantify it accurately so that you can Transgenic animal is hFVII Tolerizing I and expressing endogenous human proteins at significant levels If not, use it to test the efficiency of in vivo delivery of hFVIII And gene delivery, tissue distribution, and delivery systems other than the transgene Response to other elements (ie, vector backbone, viral coat protein) Can be analyzed. Other parameters are also used for this transgenic animal. Can be tested. Embodiment 15 FIG. 2nd generation transgenic animal model   a.Of AFP-hFVIII tolerized mice with FVIII knockout mice Rearing   Targeted disruption (gene knockout) of the mouse factor VIII gene Transgenic mouse strains are available at John Hopkins University and Pennsylvania Obtained under a non-exclusive limited-use license linked to the University of A. This ma The mouse strain is severely deficient in mFVIII and is therefore a useful model for hemophilia A (51). Our transgenes tolerized to human factor VIII Nick mice are crossed entirely with mice lacking mouse factor VIII Thus, a “clean” model for testing in vivo delivery of hFVIII Files can be generated. Crossing with hFVIII In the absence of mouse FVIII with the corresponding potential, hFVI Exact quantification of II. In addition, this double transgenic mouse is used for gene therapy Provides a useful model of phenotypic modification of hemophilia A using   b.Mie transgenic mouse   A further aspect of the invention is to cross all three of the above transgenic animals. Generating a "triple transgenic" mouse model. Human FV As described in the preceding paragraph, which is tolerized to MIII and is deficient in mouse FVIII Mice are cross-bred with the AAVS1 transgenic mouse line. This triple The transgenic mouse model is based on AA by the AAV ITR / Rep recombination system. Site-specific integration at VS1 with an immune response to the tolerized transgene Delivery and long term expression of human FVIII transgenes Delivery by lack of cross-reactive mouse FVIII protein in addition to lack of body expression Accurate quantification of hFVIII as performed; and, finally, severe FVIII deficiency ( Our AAV-mini-Ad-hFV including genetic and phenotypic modifications of hemophilia A) It is preferably suitable for testing all aspects of the III vector system.   c.Transgenic tolerized to green fluorescent protein (GFP) mouse   GFP expression cassette integrated into various viral vectors as reporter gene Including a new mini-Ad vector, Convenient to develop AAV vectors and new versions of helper virus It is. Viral infection, propagation, helper complementation and in vivo delivery to target cells Is easily understood by visual detection of green fluorescence. Encoded by the transgene The immune response to the protein It has been shown that current stability can be negatively impacted (30). Injected into the mouse -Incorporated GFP transduction that can shorten the duration of GFP expression after To eliminate the immune response to the gene, a GFP tolerizing transgenic mouse To develop The AFP-EGFP-1 vector shown in FIG. Similar including rat insulin promoter (RIP) for pancreas-specific expression Can be used for this purpose.   Stable NeoR  RIP-GFP ES cell line [RIP-GFP (+) ES] To develop E. coli, the RIP-EGFP-1 vector (FIG. 60) was Used for transfection. RIP-GFP (+) ES cells were transformed with AFP-hFVIII AF in the same manner as described for the generation of the encapsulated mouse model (FIG. 59). Using the RIP-EGFP-1 vector instead of the P-hFVIII vector, Used to generate GFP tolerized transgenic mice. Generated in this way RIP-GFP tolerized mice were transformed with a novel adenovirus vector or GFP Develop other delivery systems that use genes as reporters To provide useful research tools for   AAVS1 transgenic mouse provided in Example 12, hFVIII tolerized transgenic mice and GFP tolerance of Example 19C All of the above transgenic animal models, including transgenic mice, are , Transgenes (pAAVS1-Neo, mAFP-hFVIII-p, respectively) Alternatively produced by direct DNA injection of GKNeo and RIP-EGFP-1) Can be made. This is an alternative to using the ES cell technology described above, Is injected into the male pronucleus of mouse single-cell ova to generate transgenic mice This is achieved by: For those skilled in the art, this is a transgenic mouse An obvious alternative to generating. Accordingly, the present invention is not discussed herein. (57-61). Embodiment 20 FIG. Design of episomal mini-Ad virus   Enables long-term expression of transgenes delivered by miniviral vectors As an alternative approach to providing an element of influencing, the present invention provides a method for mitigating infection of target cells. Site-specific to enable excision of self-replicating episomes from two viral sequences Provided is the design of a recombinase-based system.   Site-specific recombinase is widely used for DNA manipulation Have been. Site-specific recombinases are the exact set between two appropriate target sequences It catalyzes the exchange of DNA, which is cleaved at a specific site of DNA, and (For review, see ref. 111). Ba Cre / loxP system (111) derived from Cterio phage P1 or yeast Several systems have been identified and characterized, such as FLP / FRT (112) I have. Recognition sites (loxP and FRT) for both recombinases (cre and FLP) ) Share a common structure: they are adjacent to the central core region (crossover site). It has two inverted repeat elements (recombinase binding sites). (Depends on core area The orientation of these target sites affects the end result: on the same molecule Recombination between two parallel sites results in excision of the intervening sequence, each having a target site. To produce two molecules. Recombination between two antiparallel sites will result in inversion of the intervening sequence. Occurs. Recombination between two parallel sites in different molecules will result in adjacent target sites Resulting in the integration of the sequence. Excision is a better phenomenon than integration because it is an intramolecular phenomenon. Good.   In the design of the present invention, the recombinase has an eukaryotic cell origin of replication (ori). Used for excision of sequences. Mammalian ori sequences and binding factors have not been identified to date. Not levied. However, some viral ori sequences and replication The required viral proteins are characterized and assembled into a plasmid vector. Be impregnated Some examples include SV40 ori / T derived from simian virus 40. OriP / EBN from Ag (113) and Epstein-Barr virus A-1 (114) is included, but is not limited thereto. These elements A plasmid that replicates autonomously in eukaryotic cells and remains stable against selective pressure It enables the production of sumids. Contains oriP and expresses EBNA-1 The plasmid replicates once per cell cycle (115, 116) and in culture It is lost when the selective pressure is removed from the cells. However, non-dividing like hepatocytes There is in vivo data on the stability of episomal brasmid in cells Absent. In non-dividing cells (ie, differentiated cells) and without selection, It is anticipated that thesomes may remain stable for long periods. The present inventors have Transgene in non-dividing cells by incorporating an ori sequence into irs DNA I believe that it is possible to prolong the expression of   Episomal miniviruses include, but are not limited to: Not (Figure 61):   a) Recombinase expression cassette: in cells used for virus production Improper expression promotes excision of sequences contained between the two recombination sites, and The combinase must be expressed only in the target cells. Therefore, expression is Whether a transcriptional repressor binding sequence is added upstream of the promoter (eg, tet O) or pair Tissue-specific promoters (eg, albumin promoter, factor VIII pro Strictly controlled by using a motor).   b) Origin of replication (ori): This is the sequence and the duplication to initiate DNA replication. Any other elements required for production (eg, DNA binding that recognizes the origin sequence) Protein).   c) Transgene: this is the recombination site (5 order j and poly A signal sequence (3 order j) Can be any adjacent therapeutic or reporter gene. This is the DN It is expressed only in target cells upon cyclization of A.   d) Recombinase target site: two sites in parallel direction are required, one is Located between the promoter and the recombinase cDNA, the other is the therapeutic gene Located upstream of the cDNA.   e) Adenovirus ITR: This is required for minivirus replication and packaging. It is important.   f) Staffer DNA sequence: length that can package minivirus size If you need to increase up to. What is the length of the staff DNA sequence? DNA fragment.   In this design, no recombinase is expressed during the amplification of the minivirus. Miniu When the ills vector is delivered to the target cell, the promoter becomes functional and Is expressed and contained between the two recombinase target sites. The inserted sequence is excised and cyclized. Recombinase promoter is a transgene pro Becomes a motor, and the presence of an origin of replication enables stable maintenance of the plasmid Thus, stable expression of the transgene is guaranteed. Embodiment 21 FIG. Design of mini-Ad for cancer treatment   Currently, one of the most effective approaches to treating cancer using gene therapy is Alters tumor-host relationships and facilitates recognition and destruction of malignant cells using the immune system It is to be. In individuals with tumors, the lack of an effective immune response is partially Include weak immunogenicity of tumor cells, lack of immune costimulation, or tumor-specific immunosuppression Could be for any of the environment. Cytokine-mediated genes in tumor cells Transfer provides one of the strategies to boost the immune system and lead to a more effective anti-tumor response ( 117). Recently, many cytokine genes have been isolated, cloned and characterized It is attached. Certain of these immunomodulators, eg, IL-2, Administration produces a certain percentage of anti-tumor responses. However, clinical effects Due to the high concentrations required to achieve Is toxic. Extremely undesired effects and minimal therapeutic results with systemic administration Combination genetically processes tumor cells to produce cytokines themselves Stimulating efforts (118).   Genetically modified tumor cells are used as vaccines in animal models Has been used to stimulate anti-tumor responses (117, 119). Tumor-oriented site The appeal of Caine gene transfer is that locally produced cytokines More efficient and does not cause systemic toxicity. This cytokine (one kind Tumor antigens expressed on neoplastic cells at high local concentrations Creates an immunological microenvironment that cannot be reproduced by administration of exogenous cytokines Put out. This immunological microenvironment created by cytokine-producing tumor cells Is effective in generating cytotoxic T lymphocytes. Come in several different animal models In addition, cytokine-producing tumor cells reduce tumorigenicity and release immunologically important molecules. It has been shown to be effective for the current increase (117, 119). Early antitumor rejection Seems to be accompanied by a non-specific inflammatory response. However, cytokines Rejection of secretory tumor cells is most often due to T cell-dependent systemic tumor-specific immunity. Led to the generation of   Pre-existing requirements for tumor immunogenicity are established in most gene transfer models Not yet; however, many well-characterized tumor cell lines are high Highly differentiated and immunogenic. In some systems, non-immunogenic tumors It has been shown to generate immunity following tocaine gene transfer. In addition, tumor fingers In most gene transfer models, the rapid growth of these malignancies is due to the intervention of immunotherapy. Because it gives you little time to Does not help studies treating the host in the presence of pre-existing tumor burden (119 ).   Recent studies have shown that reduced secretion of TGFβ by tumor cells is an important part of cancer gene therapy. It shows that the approach can be (120, 121). A set of experiments Fakhrai et al. Disclose rat gliasarcoma. Using antisense TGFβ to inhibit expression of its cytokines in cell lines Was. Immunization of tumor-bearing rats with the antisense-modified lung cells was performed using a control vector. Resulted in higher animal survival compared to immunization of animals with tumor cells modified in. different Using an approach, Isaka et al. Reported that cDNA coding decorin was added to skeletal muscle. Transfection can reduce the amount of fibrotic disease in rats It was possible. Decorin is a small proteoglycan that inhibits TGFβ expression . Therefore, two different approaches to inhibiting the expression of TGFb are In two different models.   In addition, co-stimulation of T cells by B7 has both positive and negative effects on T cell activation. New evidence has shown that it has a positive effect (122). Other T cells Are also suitable, such as ICAM-I, LFA-3 and VCAM-I (123). Common among those skilled in the art The consensus is that the most important of these costimulatory signals are on T cells. CD28 and its primary ligand B7-1 (CD80) and on the surface of antigen presenting cells What is brought about by interaction with B7-2 (CD86) (124). B7 cDNA transfected tumors in various model systems Tumor cells elicited strong anti-tumor responses against both modified and unmodified tumor cells . Similarly, CTLA-4, a molecule expressed on T cells, is much more potent than CD28. Binds B7-1 and B7-2 with high affinity. The results of some studies show that CTL A-4 acts as a negative regulator of T cell responsiveness and interacts with CTLA-4-B7 Blocking the inhibition caused by the application enhances the T cell response to tumor cells, and It has the potential to enhance antitumor activity. Leach et al. Describe CTLA- Injection of antibody into 4 resulted in tumors including pre-established tumors in a mouse model (124). This is a factor in the design of gene transfer experiments. Be careful not to obscure the desired effect with other potentially harmful effects. Indicates that you must pay.   The genetic basis of cancer includes abnormalities in oncogenes and / or tumor suppressor genes You. Both types are targets for cancer gene therapy. Cancer-related defects in tumor suppressor genes Tumor suppressor gene therapy that has been developed The strategy in treatment is gene replacement therapy, which involves the removal of wild-type tumor suppressor genes. Transfer to cancer cells to restore the normal function of the defective gene or to kill tumors Trigger an effect (124). Human tumor suppression cloned and characterized Genes include Rb, Wilms tumor (WT1), which is involved in childhood cancer , And neurofibromatosis (NF1); adenoma polyposis coli contributing to colorectal cancer (APC) and deletions in colon cancer (DCC); variants in a wide range of human cancers Includes p53 found in the form (see ref. 125 for review) . In recent years, two areas in the area of identification of new tumor suppressors or cancer susceptibility genes have been identified. An incident has occurred. First, p16 (major tumor suppressor 1, MTS1) and p16 Cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor population called 15 (MTS2) Were isolated from chromosomal region 9p21 (12 6-128). Second, a strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 is Isolated (129). p16 is deleted or mutated in a wide range of cancer cell lines P15 is potent in TGF-β-induced cell cycle arrest (130). All these tumor suppressor genes Among them, the one that has been used for cancer gene therapy is the p53 gene (131).   Our current efforts in gene therapy for cancer include tumor suppressor genes and immunomodulation of cancer. Nodal gene therapy can be applied to other molecules, such as tumor antigens, MHC molecules, cell adhesion molecules and others. In combination with the introduction of immunomodulators. The following are anti 1 is a general description of two designs of cancer super-Ad vectors.   21.1 Construction of First Version Anticancer Super-Ad Vector   Several combinations of immune molecules can be used to construct anti-cancer super-Ad vectors. Wear. This mini-Ad vector inhibits tumor growth or anti-cancer immune response in the host Can be carried by multiple genes that act to induce. This type of vector These are called anti-cancer super-Ad vectors. The first version of this super-Ad vector is , Human p53 cDNA, GFP marker gene, human IL2 cDNA, human GM-CSF cDNA, human B7-1 cDNA, human IL7 cDNA and Carries four dual expression cassettes of human IL12 p35 and p40 cDNA I do. This is also the case for the left and right Ad5 ITR and Ad5 packaging sequences. Small sequence (total 660 bp) and about 18 kb gene of human a-fetal protein gene It also has a nome sequence, reaching a size of over 30 kb (FIG. 62). Cassette 1 Indicates CMV promoter, human p53 cDNA, EMC-IRES, GFP gene And SV40pA. Cassette 2 contains EF promoter, human GM-CSF   cDNA, EMC-IRES, human IL12 cDNA and bovine growth hormone pA. Cassette 3 contains the SV40 promoter, human B7-1 cDNA, E Includes MC-IRES, human IL7 cDNA and SV40pA. Cassette 4 tk promoter, human IL12   p35 cDNA, EMC-IRES, human IL12 p40 cDNA and Contains bovine growth hormone pA (FIG. 64).   21.2 Construction of Second Version Anti-Cancer Super Ad Vector   The second version of the anti-cancer super-Ad vector has a structure similar to the first version , Containing adenovirus inverted terminal repeats at both the 5 'and 3' ends, and four separate Expression cassette. Some combinations of regulatory molecules and genes are It can be used in the construction of vectors. Examples described below are tumor cells Any type of mini-Ad vector that can be constructed to regulate the growth of It is not limited in point. Each expression cassette has a unique primer at the 5 'end. The motor is adjacent. In addition, each expression cassette is independent of the "terminal" gene. Of encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site to complete translation of Contains two genes linked by. The genes shown for this vector include: Cytokine genes represented by IL-2, IL-7, and GM-CSF A tumor suppressor gene represented by p53; represented by B7-1 and ICAM-1 Immune cell costimulatory molecules; and conserving immunosuppression, often associated with cancer. And anti-TGFβ and SCA to CTLA-4. Vector For efficient packaging within progeny virus Therefore, "staffer DNA" of human α-fetal protein is included. Star Fur DNA may include DNA fragments of any length. Second The general structure of a version of the anti-cancer super-Ad vector is shown in FIG. Embodiment 22 FIG. Other designs to improve the system   1. Mini-Ad vector with targeting ability. Gene Expression Targets Specific Cells Multiple mechanisms can be used to set the type or tissue. Such a mechanism One is related to the transcriptional targeting of cell types, cell type subsets or specific tissues. Give. Transcriptional targeting involves gene expression only in certain types of cells or tissues. Includes the use of transcription control units to drive current. Such transcriptional regulatory units are tissue-specific Called. Mini ad vectors are used to express reporter or effector genes. It is designed to include a driving tissue-specific transcriptional regulatory unit. In this way, A reporter or effector gene under the control of a tissue-specific transcriptional regulatory unit Expression is detected at high levels in certain tissues where this transcriptional regulatory unit is active . It may be preferable to limit gene expression to particular cell types or tissues. Therapeutic genes are often toxic when expressed in high amounts. Therefore, the gene Regulation of gene expression in certain tissues is a consequence of high levels of downregulation of certain therapeutic genes. May serve to protect the host from effects.   A further way to guide tissue-specific gene expression is to use ligands on cell types of interest. Use a helper virus that encodes a cell surface protein that is reactive to That is. For example, a helper virus can be used as a ligand for cell surface receptors. It can be processed to express. Recombinant packaging qualified DNA of the present invention Packaging of the construct allows for recombinant adenovirus binding to receptors on the cell surface. Ruth particles are generated. Further examples are antibodies or antibodies on the surface of the viral envelope. Includes recombinant adenovirus expressing fragments. Such a recombinant virus is Defective packaged helper virus and antibody or antibody fragment on the viral envelope By processing it to be expressed as a fusion protein or as a separate protein Can be generated. At least one adenovirus packaging sequence; A DNA molecule encoding at least one reporter or effector gene; Infection of transfected cells results in anti-reactivity to cell surface molecules on target cells. Recombinant adenovirus particles having the body or antibody fragments are produced. Like this , The recombinant adenovirus particles are responsible for the cell surface reactive with the antibody or antibody fragment. It specifically binds to cells in the host that express the surface molecule.   2. A mini-Ad vector having a local immunosuppressive function. Not suitable for certain autoimmune diseases Arising from a severe immune response. Hinder, stop or delay this autoimmune response Used for One method that can be used to direct immunomodulatory proteins to the site of such a reaction That is. This is an approach constructed from the mini-Ad genome, as shown in this application. This can be achieved by applying denovirus particles. Specific site It is possible to express a gene that encodes Such expression can result in a weakened immune response. Weakening in this immune response is self-immune This will reduce the symptoms of epidemics. Further examples include weakening of allergic reactions. Can be rare. Mini-Ad vector for antigens known to cause allergic reactions Can be coded. Delivered to cells by recombinant adenovirus particles Low or extremely high concentrations of antigens driven by this mini-Ad vector Some expression may cause tolerance. In addition, the expression of this antigen is It can be directed to tissues where the present can induce tolerance. These organizations are developing Thymus may be included. After desensitization, the host to which the recombinant adenovirus particles were delivered No allergic reaction due to interaction with the antigen. In this way, Administering recombinant adenovirus particles carrying engineered mini-Ad DNA molecules Thereby, one form of immunosuppression is achieved.   3. A mini-Ad vector that hybridizes to other elements. Described in this application Mini-Ad vector for preventing or eliminating viral infection and replication in a host It is also possible. The mini-Ad vector is used for the specific inheritance of the virus. Can be designed so that the target process can be obstructed or eliminated. Mini Ad The vector is an antisense that interferes with viral replication during the transcription or translation stages of infection. It can be designed to express nucleic acids. Interference can bind to messenger RNA, or Include those that bind to DNA and block transcription after integration into the viral genome It can be promoted by expression of antisense RNA or DNA. In addition, Ribozymes can be designed to target constant viral transcripts for disruption . "Decoy" molecules can also be encoded by mini-Ad vectors. This The bait is a transcription factor required for viral transcription. Its transcription factors are involved in binding to genes required for current and replication and driving its transcription. It may work by combining so that it is no longer available.   4. A mini-Ad vector that can be used for vaccination. Organism in which expression occurs To drive the expression of specific antigens or immunogens that act to generate immunity in Can be processed into a mini-Ad vector. Elicits an immune response and thereby immune Design mini-Ad vectors that drive expression of bacterial or viral genes that cause disease Can be For example, envelope proteins derived from retroviruses such as HIV The protein can be encoded with a mini-Ad vector. Including this mini-Ad vector Infecting host cells with recombinant adenovirus particles Immunity to the virus can be ensured. In addition, cancer-specific antigen Mini-Ad vectors can also be designed to drive expression. Expression of cancer antigen Host cells with recombinant adenovirus particles containing a mini-Ad vector directing This results in immunity to that type of cancer. Optimally, such immunity Other tumors that exist throughout the treated organism, let alone the primary tumor Metastases and micrometastases are also eradicated extensively. In addition, derived from parasites Mini-Ad vectors can be designed which encode for antigenic molecules. This mini Following administration of the recombinant adenovirus vector, including the Ad vector, the parasite Immunity to infection by   While a preferred form of the invention is shown and described in the drawings, The present invention is illustrated in the figures since variations in form are apparent to those skilled in the art. And should not be construed as limited to the particular form described and described. Instead of as described in the claims.

【手続補正書】 【提出日】平成１０年１２月３日（１９９８．１２．３） 【補正内容】 請求の範囲 １． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御 領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソ ーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウ イルスベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分 子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ２． 前記ゲノム組み込み配列が相同組換えアームを含む、請求項１に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ３． 前記相同組換えアームがアルブミンゲノム配列及びα−胎児タンパタ質ゲ ノム配列からなる群より選択される、請求項２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４． 前記相同組換えアームがＡｌｂ−Ｅ５、ＡＦＰ−３、又はＥＢＢ１４から なる群より選択される、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５． 前記ゲノム組換え配列がアデノ関連ウイルス逆末端反復（ＡＡＶ−ＩＴＲ ）を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ６． 前記エピソーム維持配列がヒトＤＮＡ複製基点配列を含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ７． ヒトテロメア配列をさらに含み、かつ前記エピソーム維持配列がヒトＤＮ Ａ複製基点配列を含む、請求項 １に記載の単離ＤＮＡ分子。 ８． 前記エピソーム維持配列がアルフォイドＤＮＡを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 ９． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点及び該ウイルス複製基点の活 性化に必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載 の単離ＤＮＡ分子。 １０． 前記エピソーム維持配列がＳＶ４０複製基点及びＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）を コードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １１． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点ｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１ をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １２． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 １３． 前記転写制御領域がα1−抗トリプシンプロモーターを含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 １４． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 １５． 前記転写制御領域がα−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結す る肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １６． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項１に記載の単離 ＤＮＡ 分子。 １７． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 １８． 前記エフェクター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコー ドする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １９． 前記エフェクター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ２０． 前記アデノウイルスＩＴＲがアデノウイルス５型（Ａｄ５）右ＩＴＲ及 びＡｄ５左逆末端反復を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２１． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２２． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２３． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足場点を含む、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２４． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２５． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ 分子。 ２６． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２７． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２８． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２９． 上流及び下流にＡＡＶ−ＩＴＲが隣接するレポーター又はエフェクター 遺伝子カセットを含む、感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に 有用な単離ＤＮＡ分子。 ３０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする核酸からなる群より選択される、請求項２９に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３２． アデノウイルスＩＴＲ配列、パッケージ化シグナル、ＡＡＶ ＩＴＲ配 列、転写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセッ トを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ３３． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項３２ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３４． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする遺伝子からなる群より選択される、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３５． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項３２に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３６． 前記転写制御領域がα1−抗トリプシンプロモーターを含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３７． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載 の単離ＤＮＡ分子。 ３８． 前記転写制御領域がα1−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結 する肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３９． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項３２に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ４０． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足 場点を含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４１． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分 子。 ４２． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮ Ａ分子。 ４３． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４４． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４５． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４６． Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムを含む単離ＤＮＡ分子であって、該Ｅ１欠 失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ 化されるように変更されたパッケージ化シグナルを該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノ ムが含む単離ＤＮＡ分子。 ４７． 前記弱力化パッケージ化シグナルがアデノ富化モチーフ（Ａ反復）の部 分的な欠失を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４８． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するように直接反復を含む、請求 項４６ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４９． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するようにＡ反復配列の直列反復 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５０． 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子であって、前記弱力化パッケージ化 シグナルが該ＤＮＡ分子上のタンパク結合部位に隣接して位置し、それにより該 タンパク質の該タンパク結合部位への結合がパッケージ化タンパク質と該弱力化 パッケージ化シグナルとの会合を妨げる単離ＤＮＡ分子。 ５１． 前記パッケージ化シグナルが前記Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノム内の野生 型ヘルパーＡｄゲノムに見出されるもの以外の位置に位置する、請求項４６に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ５２． 前記パッケージ化シグナルが、パッケージ化タンパク質に対する親和性 が野生型パッケージ化タンパク質よりも低い合成パッケージ化シグナルである、 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５３． 前記アデノウイルスゲノムがＥ１に加えてアデノウイルス遺伝子の欠失 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５４． Ａｄ Ｅ１遺伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細 胞であって、該配列がＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持 たない 細胞。 ５５． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、エフェクター又 はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれ かを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成 に作用的に関連する第１単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノ ウイルスタンパク質をコードしない第１単離ＤＮＡ分子、並びにＡｄヘルパーゲ ノムを含む第２単離ＤＮＡ分子を同時形質移入する工程； 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該第ＩＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノ ウイルスベクター粒子を含む方法。 ５６． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端 反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、エフェクター又はレポ ーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれかを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該細胞を、Ａｄヘルパーゲノムを含むＡｄヘルパーウイルスに感染させる工程 ；及び 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該ＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノウイ ルスベクター粒子を含む方法。 ５７． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項５５又は５６による方法。 ５８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含み 、かつ前記細胞がｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現する、請求項 ５５又は５６項による方法。 ５９． 前記転写制御領域が前記細胞内よりも標的細胞内においてより活性であ る、請求項５５又は５６による方法。 ６０． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサー／α−抗トリプシンプロモ ーター；及びｔｅｔＯ／ＣＭＶ プロモーターからなる群より選択され、前記細胞がｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサ ータンパク質を発現する、請求項５５又は５６による方法。 ６１． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項５５ 又は５６による方法。 ６２． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、又はヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項５５又は５６による方法。 ６３． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３と呼ばれるプラスミドである、請求項５ ５又は５６による方法。 ６４． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を含む組換えアデノウイ ルス粒子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードし ない組換えアデノウイルス粒子。 ６５． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６４ に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６６． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質、及びヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項６４に記載の組 換えア デノウイルス粒子。 ６７． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６４に記載の組換えアデ ノウイルス粒子。 ６８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項６４に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６９． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を生理学的に許容し得る バッファ中に含む医薬組成物であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない医薬組成物。 ７０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６９ に記載の医薬組成物。 ７１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項６９に記載の医薬組成物。 ７２． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６９に記載の医薬組成物 。 ７３． 治療上有効な量の請求項６９に記載の医薬組成物を患者に投与すること を包含する、血友病の治療方法。 ７４． 非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、ＡＡＶＳ１配列及び薬剤選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子を 形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子の発現により耐性が付与される薬剤の存在下におい て成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択す る工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫をＡＡＶＳ１配列の存在について検定する工程；及び ＡＡＶＳ１配列が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりそのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニッ ク動物が生じる方法。 ７５． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項７４に記載 の方法。 ７６． 前記ＤＮＡ分子が図５０に示されるｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏである、請求 項７４に記載の方法。 ７７． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトト ランスジェニック動物。 ７８． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ １配列を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物がマウスである 非ヒトトランスジェニック動物。 ７９． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ＦＶＩＩＩ様 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに有する、請求項７８に記載 の非ヒトトランスジェニック動物。 ８０． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ヒトＦＶＩＩ Ｉをコードする核酸をさらに有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニ ック動物。 ８１． 前記動物が血友病表現型、及び該動物のゲノムに安定に組み込まれてい る、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項 ７８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。 ８２． 前記動物が血友病表現型及び該動物のゲノムに安定に組み込まれている ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニック 動物。 ８３． そのゲノムに安定に組み込まれているＤＮＡ分子ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ 又はそれらの断片を有する、非ヒトトランスジェニックマウス。 ８４． 前記動物がマウスである、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニッ ク動物。 ８５． そのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれている非ヒトトランスジェニ ック動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ を含むウイルスベクターのイン・ビボ送達を試験するための方法であって、 生理学的に許容し得るバッファ中の、ＡＡＶ−ＩＴＲ配列を有するＤＮＡ分子 を含み、かつレポーター又はエフェクター遺伝子をコードするベクターを該動物 の静脈内又は門脈に注射する工程； 該動物から複数の血液試料を得る工程； 該血液試料における遺伝子発現の水準を測定して導入遺伝子の発現の持続を決 定する工程；及び 該動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する工程；及び ＡＡＶＳ１特異的プライマーを用いて該組織のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）分析を行って該動物のゲノムへの該ベクターの組み込みを検出する工程； を組み合わせて包含する方法。 ８６． 前記ゲノムＤＮＡに対する蛍光インサイツ・ハイブリダイゼーション分 析を行って、前記ＡＡＶＳ１配列の染色体位置を決定し、かつ前記ＡＡＶＳ１配 列での前記レポーター又はエフェクター遺伝子の組み込みを検出する工程をさら に含む、請求項８５に記載の方法。 ８７． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はア デノウイルスタンパク質をコードしない、請求項８５に記載の方法。 ８８． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びＲ ｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルス ベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパ ク質をコードしない、請求項８５に記載の方法。 ８９． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、ヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸、及びＲｅｐ発現カセットを含み 、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的 に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請 求項８７に記載の方法。 ９０． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されている非ヒトトランスジェニック動 物の生成方法であって、 胚幹細胞にヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸及び薬剤選択マーカー遺伝子を含 むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現により耐性 が付与される薬剤の存在下において該細胞を成長させることにより、そのゲノム 内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を、該子孫のゲノム内の該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の存在について検定す る工程；及び 該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニック動物が生 じる方法。 ９１． 前記ＤＮＡ分子が、合成プロモーター、発生的に調節されるプロモータ ー又は組織特異的プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制 御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９２． 前記ＤＮＡ分子が、α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロ モーター及びα−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモー ターの制御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９３． 前記ＤＮＡ分子が図５７に示されるｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮ ｅｏを含む、請求項９０に記載の方法。 ９４． 前記動物がマウスである、請求項９０に記載の方法。 ９５． ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓特異的プロモーターの転写制御の下に含む ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞であっで、該ＤＮＡ分子が薬剤選択マーカー遺伝子を さらに含む胚幹細胞。 ９６． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９７． α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα−抗 トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下 に、そのゲノムに組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、ヒトＦＶＩ ＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９８． 図５７に示されるＤＮＡ分子ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏ又 は、それらの断片を有し、前期マウスのゲノムに組み込まれているトランスジェ ニックマウス。 ９９． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されている非ヒトトランスジェニッ ク動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、合成プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生的に調節さ れるプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下に緑色 蛍光タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子のタンパク質産生物の発現により耐性が付与される 薬剤の存在下において成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含 む胚幹 細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の存在について検定する工程；及び そのゲノム内に緑色蛍光タンパク質遺伝子配列が検出されている子孫をホモ接 合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それにより緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されたトランスジェニック動物 が生じる方法。 １００． 前記動物がマウスである請求項９９に記載の方法。 １０１． 前記組織特異的プロモーターが肝臓特異的である、請求項９９に記載 の方法。 １０２． 前記組織特異的プロモーターがα−胎児タンパク質プロモーター、ア ルブミンプロモーター及びα1−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択 される、請求項９９に記載の方法。 １０３． 前記ＤＮＡ分子が図６０に示されるＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図５９ に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より選択される、請求項９ ９に記載の方法。 １０４． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されているトランスジェニックマ ウス。 １０５． そのゲノムに安定に組み込まれている、図６０に示されるＢＳ由来Ｒ ＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図５９に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より 選択されるＤＮＡ分子を有するトランスジェニックマウス。 １０６． そのゲノム内にＡＡＶＳ１配列を含む非ヒトトランスジェニック緑色 蛍光タンパク質寛容化動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ及び緑色蛍光タンパク質遺伝子 を含むベクターのイン・ビボ送達を試験する方法であって、 該ベクターを該動物に注射する工程； 該動物から血液試料を単離し、該血液試料を緑色タンパク質の存在について分 析する工程； 該動物から肝臓組織を単離する工程； ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列 をコードする核酸の存在について該肝臓組織を分析する工程； 該肝臓組織の凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡技術を用いて該凍結切片を緑色蛍 光タンパク質の存在について分析する工程； を組み合わせて包含し、 緑色蛍光タンパク質の存在は該トランスジェニック動物内で検出される方法。 １０７． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項１０６に 記載の方法。 １０８． 図４２に示される、ＧＴ２０７４と呼ばれるＤＮＡ分子。 １０９． 図４３に示される、ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩミニと呼ばれるＤＮＡ分 子。 １１０． 図６０に示される、ＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１と呼ばれるＤＮＡ分子。 １１１． 図５６に示される、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏと呼ばれ るＤＮＡ分子。 １１２． 図６０に示される、ＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰと呼ばれるＤＮＡ分 子。[Procedure amendment] [Date of submission] December 3, 1998 (1998.12.3) [Contents of amendment] Claims 1. It contains adenovirus inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration sequences or episomal maintenance sequences, all of which are of the infectious replication defective recombinant adenovirus vector. An isolated DNA molecule operatively associated with production, wherein the remainder of said DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 2. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said genomic integration sequence comprises a homologous recombination arm. 3. 3. The isolated DNA molecule of claim 2, wherein said homologous recombination arm is selected from the group consisting of an albumin genomic sequence and an α-fetal protein genomic sequence. 4. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said homologous recombination arm is selected from the group consisting of Alb-E5, AFP-3, or EBB14. 5. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said genomic recombination sequence comprises an adeno-associated virus inverted terminal repeat (AAV-ITR). 6. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said episomal maintenance sequence comprises a human DNA replication origin sequence. 7. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising a human telomere sequence, and wherein said episomal maintenance sequence comprises a human DNA replication origin sequence. 8. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said episomal maintenance sequence comprises alfoid DNA. 9. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the episomal maintenance sequence comprises a viral replication origin and a nucleotide sequence encoding a protein required for activation of the viral replication origin. 10. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said episomal maintenance sequence comprises an SV40 origin of replication and a gene encoding a T antigen (T-Ag). 11. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the episomal maintenance sequence comprises a gene encoding a viral origin of replication oriP and EBNA-1. 12. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said transcription control region comprises a human albumin promoter. 13. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the transcription control region comprises an α 1 -antitrypsin promoter. 14． 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said transcription control region comprises a liver-specific enhancer. 15. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the transcription control region comprises a liver-specific enhancer operably linked to an [alpha] -antitrypsin promoter. 16. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the transcription control region comprises a tet-operon (tetO) operably linked to a cytomegalovirus promoter (CMV). 17． 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 18. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said effector gene encodes a protein having FVIII-like activity. 19. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said effector gene encodes human FVIII. 20. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the adenovirus ITR comprises an adenovirus type 5 (Ad5) right ITR and an Ad5 left inverted terminal repeat. 21. 2. The method according to claim 1, wherein the adenovirus inverted terminal repeat comprises an Ad5 right ITR and an Ad5 left ITR, the transcription control region comprises a human albumin promoter, and the effector gene encodes a protein having FVIII-like activity. Isolated DNA molecule. 22. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the adenovirus inverted terminal repeat comprises an Ad5 right ITR and an Ad5 left ITR, the transcription control region comprises a human albumin promoter, and the effector gene encodes human FVIII. 23. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the packaging signal comprises a packaging scaffold point. 24. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, comprising a plurality of packaging signals. 25. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, comprising a plurality of synthetic packaging signals. 26. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising a gene encoding a modified Ad envelope protein capable of binding to a target cell membrane. 27. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising a modified adenovirus gene encoding a gene product having an altered function or structure when compared to a wild-type gene product. 28. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising an E4 gene operably linked to a transcription control region. 29. An isolated DNA molecule useful for generating an infectious replication-deficient recombinant adenovirus vector comprising a reporter or effector gene cassette flanked by AAV-ITR upstream and downstream. 30. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 31. 30. The isolated DNA molecule of claim 29, wherein said effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a nucleic acid encoding a human FVIII protein. 32. Contains adenovirus ITR sequences, packaging signals, AAV ITR sequences, transcription control regions, reporter or effector genes, and Rep expression cassettes, all of which are operatively involved in the generation of infectious replication-defective recombinant adenovirus vectors. An isolated DNA molecule, the remainder of the DNA molecule not encoding an adenovirus protein. 33. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 34. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a gene encoding a human FVIII protein. 35. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a human albumin promoter. 36. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises an [alpha] 1 -antitrypsin promoter. 37. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a liver-specific enhancer. 38. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a liver-specific enhancer operably linked to an [alpha] 1 -antitrypsin promoter. 39. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a tet-operon (tetO) operably linked to a cytomegalovirus promoter (CMV). 40. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein the packaging signal comprises a packaging scaffold point. 41. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein the isolated DNA molecule comprises a plurality of packaging signals. 42. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, comprising a plurality of synthetic packaging signals. 43. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, further comprising a gene encoding a modified Ad envelope protein capable of binding to a target cell membrane. 44. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, further comprising a modified adenovirus gene encoding a gene product having an altered function or structure when compared to a wild-type gene product. 45. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, further comprising an E4 gene operably linked to a transcription control region. 46. An isolated DNA molecule comprising an E1-deleted helper Ad genome, wherein the packaging signal is modified such that the E1-deleted helper Ad genome is packaged less frequently than a wild-type helper Ad genome. An isolated DNA molecule contained in the helperless Ad genome. 47. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein said attenuating packaging signal comprises a partial deletion of an adeno-enriched motif (A repeat). 48. 49. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the attenuation packaging signal comprises direct repeats such that the affinity of the packaged protein for the attenuation packaging signal is reduced. 49. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the attenuation packaging signal comprises tandem repeats of the A repeat sequence such that the affinity of the packaged protein for the attenuation packaging signal is reduced. 50. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the weakening packaging signal is located adjacent to a protein binding site on the DNA molecule, thereby binding the protein to the protein binding site. An isolated DNA molecule that prevents association of the packaged protein with the weakened packaging signal. 51. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the packaging signal is located in the E1-deleted helper Ad genome at a position other than that found in the wild-type helper Ad genome. 52. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the packaging signal is a synthetic packaging signal that has a lower affinity for the packaged protein than a wild-type packaged protein. 53. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein said adenovirus genome comprises a deletion of an adenovirus gene in addition to E1. 54. A cell stably transfected with a DNA molecule comprising the Ad E1 gene sequence, the cell having no sequence overlapping the genome of the E1-deleted helper Ad genome. 55. A method for producing a recombinant adenovirus vector, comprising the steps of: adenovirus reverse transfecting a cell stably transfected with a DNA molecule comprising an Ad E1 gene sequence having no sequence overlapping with the genome of an E1-deleted helper Ad genome; Including terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration or episomal maintenance sequences, all of which affect the generation of infectious, replication-defective, recombinant adenovirus vectors. A first isolated DNA molecule, the remainder of which is co-transfected with a first isolated DNA molecule that does not encode an adenovirus protein, as well as a second isolated DNA molecule that includes the Ad helper genome. Preparing a cell-free lysate of the cells; The method wherein the cell-free lysate comprises an infectious replication-impaired recombinant adenoviral vector particle comprising the I DNA molecule. 56. A method for producing a recombinant adenovirus vector, comprising the steps of: adenovirus reverse transfecting a cell stably transfected with a DNA molecule comprising an Ad E1 gene sequence having no sequence overlapping with the genome of an E1-deleted helper Ad genome; Including terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration or episomal maintenance sequences, all of which affect the generation of infectious, replication-defective, recombinant adenovirus vectors. Transfecting an isolated DNA molecule, wherein the remainder of the DNA molecule does not encode an adenovirus protein; infecting the cell with an Ad helper virus comprising the Ad helper genome. Preparing a cell-free lysate of the cells; The combined result in, the cell-free lysates, the method comprising the infectious replication-impaired recombinant adenoviral vector particle containing the DNA molecule. 57. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said DNA molecule further comprises an AAV-ITR and a Rep expression cassette. 58. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said DNA molecule further comprises an AAV-ITR and a Rep expression cassette, and said cells express a tet-KRAB repressor protein. 59. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said transcription control region is more active in target cells than in said cells. 60. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said transcription control region is selected from the group consisting of a liver specific enhancer / [alpha] -antitrypsin promoter; and a tetO / CMV promoter, and wherein said cells express a tet-KRAB repressor protein. 61. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 62. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, or a human FVIII gene. 63. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said DNA molecule is a plasmid called GT2063. 64. It contains adenovirus inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration sequences or episomal maintenance sequences, all of which are of the infectious replication defective recombinant adenovirus vector. A recombinant adenovirus particle comprising a DNA molecule operatively associated with production, wherein the remainder of the DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 65. 70. The recombinant adenovirus particle of claim 64, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 66. 65. The recombinant adenovirus particle of claim 64, wherein said effector gene encodes a neomycin resistance gene, a protein having FVIII-like activity, and human FVIII. 67. 65. The recombinant adenovirus particle of claim 64, wherein said DNA molecule is GT2063. 68. 65. The recombinant adenoviral particle of claim 64, wherein said DNA molecule further comprises an AAV-ITR and a Rep expression cassette. 69. It contains adenovirus inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration sequences or episomal maintenance sequences, all of which are of the infectious replication defective recombinant adenovirus vector. A pharmaceutical composition comprising a DNA molecule operatively related to production in a physiologically acceptable buffer, the remainder of the DNA molecule not encoding an adenovirus protein. 70. 70. The pharmaceutical composition according to claim 69, wherein the reporter gene encodes a green fluorescent protein. 71. 70. The pharmaceutical composition according to claim 69, wherein the effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a human FVIII gene. 72. 70. The pharmaceutical composition according to claim 69, wherein said DNA molecule is GT2063. 73. 70. A method of treating hemophilia comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 69. 74. A method for producing a transgenic non-human animal, comprising: transfecting embryonic stem cells with a DNA molecule containing an AAVS1 sequence and a drug selection marker gene; in the presence of a drug to which resistance is imparted by expression of the drug selection marker gene Selecting embryonic stem cells containing the DNA molecule in their genome by growing in step; microinjecting the embryonic stem cells into blastocysts; transplanting the blastocysts into a foster mother; Breeding the progeny; testing the progeny for the presence of the AAVS1 sequence; and breeding the progeny in which the AAVS1 sequence is detected to homozygosity, thereby incorporating the AAVS1 sequence into its genome. How transgenic animals are produced. 75. 75. The method of claim 74, wherein said non-human transgenic animal is a mouse. 76. 75. The method of claim 74, wherein said DNA molecule is pAAVS1-Neo shown in FIG . 77. A non-human transgenic animal having an AAVS1 sequence stably integrated into its genome. 78. A non-human transgenic animal having an AAVS1 sequence stably integrated into its genome, wherein the animal is a mouse. 79. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal further comprises a gene that encodes a protein having FVIII-like activity, which is stably integrated into the animal's genome. 80. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal further comprises a nucleic acid encoding human FVII I, which is stably integrated into the animal's genome. 81. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal has a gene encoding a protein with FVIII-like activity that is stably integrated into the genome of the animal with the hemophilia phenotype. 82. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal has a hemophilia phenotype and a human FVIII gene that is stably integrated into the genome of the animal. 83. A non-human transgenic mouse having the DNA molecule pAAVS1-Neo or a fragment thereof stably integrated into its genome. 84. 84. The non-human transgenic animal of claim 83, wherein said animal is a mouse. 85. A method for testing the in vivo delivery of a viral vector comprising an AAV-ITR to a non-human transgenic animal having an AAVS1 sequence integrated in its genome, comprising: Injecting a vector comprising a DNA molecule having an AAV-ITR sequence and encoding a reporter or effector gene into the vein or portal vein of the animal; obtaining a plurality of blood samples from the animal; genes in the blood sample Determining the level of expression of the transgene by measuring the level of expression; and isolating genomic DNA from liver tissue of the animal; and polymerase chain reaction (PCR) of the tissue using AAVS1-specific primers. Performing an analysis to detect the integration of said vector into the genome of said animal. How to free. 86. 86. The method of claim 85, further comprising performing a fluorescence in situ hybridization analysis on the genomic DNA to determine a chromosomal location of the AAVS1 sequence and detecting integration of the reporter or effector gene in the AAVS1 sequence. the method of. 87. The DNA molecule comprises an adenovirus ITR sequence, an AAV ITR sequence, a transcriptional control region, a reporter or effector gene, and a Rep expression cassette, all of which are operatively associated with the production of an infectious replication-deficient recombinant adenovirus vector. 86. The method of claim 85, wherein the remainder of said DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 88. The DNA molecule comprises an adenovirus ITR sequence, an AAV ITR sequence, a transcription control region, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a Rep expression cassette, all of which are of the infectious replication-defective recombinant adenovirus vector. 86. The method of claim 85, operatively associated with production, wherein the remainder of said DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 89. The DNA molecule comprises an adenovirus ITR sequence, an AAV ITR sequence, a transcriptional control region, a nucleic acid encoding human FVIII, and a Rep expression cassette, all of which are operative in generating an infectious replication-defective recombinant adenovirus vector. 89. The method of claim 87, wherein the remainder of said DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 90. A method for producing a non-human transgenic animal that is tolerized to human FVIII, comprising transfecting embryonic stem cells with a DNA molecule comprising a nucleic acid encoding human FVIII and a drug selection marker gene; Selecting the embryonic stem cells containing the DNA molecule in their genome by growing the cells in the presence of an agent to which resistance is imparted by expression of the protein encoded by the gene; Implanting the blastocyst into a foster mother; breeding the resulting progeny; assaying the progeny for the presence of the human FVIII gene in the genome of the progeny; Rearing the progeny in which the human FVIII gene has been detected to homozygosity; Tolerized how transgenic animals occurs for VIII. 91. 90. The method of claim 90, wherein said DNA molecule comprises a human FVIII gene under transcriptional control of a promoter selected from the group consisting of a synthetic promoter, a developmentally regulated promoter, or a tissue-specific promoter. 92. 91. The method of claim 90, wherein said DNA molecule comprises a human FVIII gene under the control of a promoter selected from the group consisting of an alpha-fetal protein promoter, an albumin promoter and an alpha-antitrypsin promoter. 93. 90. The method of claim 90, wherein said DNA molecule comprises mAFP-hFVIII / pGKNeo shown in Figure 57 . 94. 91. The method of claim 90, wherein said animal is a mouse. 95. An embryonic stem cell comprising a DNA molecule comprising a human FVIII gene under transcriptional control of a liver-specific promoter, wherein said DNA molecule further comprises a drug selectable marker gene. 96. Transgenic mice that have been tolerized to human FVIII. 97. Under the transcriptional control of a promoter selected from the group consisting of an α-fetal protein promoter, an albumin promoter and an α-antitrypsin promoter, tolerize human FVI II having the human FVIII gene integrated into its genome. Transgenic mice. 98. A transgenic mouse having the DNA molecule mAFP-hFVIII / pGKNeo or a fragment thereof shown in FIG. 57 and integrated into the genome of the mouse. 99. A method for producing a non-human transgenic animal that has been tolerized to green fluorescent protein, said embryonic stem cell having a promoter selected from the group consisting of a synthetic promoter, a tissue-specific promoter and a developmentally regulated promoter. Transfecting a DNA molecule containing a green fluorescent protein gene under the transcriptional control of the gene; growing the gene in the presence of a drug to which resistance is imparted by expression of a protein product of the drug selectable marker gene; Selecting an embryonic stem cell containing the DNA molecule into a blastocyst; injecting the blastocyst into a foster mother; rearing the obtained progeny; Testing for the presence of the green fluorescent protein gene sequence; and the green fluorescent protein gene sequence in its genome Rearing the offspring in which is detected to homozygosity, thereby producing a transgenic animal tolerized to green fluorescent protein. 100. 100. The method of claim 99, wherein said animal is a mouse. 101. 100. The method of claim 99, wherein said tissue-specific promoter is liver-specific. 102. 100. The method of claim 99, wherein said tissue-specific promoter is selected from the group consisting of an α-fetal protein promoter, an albumin promoter, and an α 1 -antitrypsin promoter. 103. 60. The method of claim 99, wherein said DNA molecule is selected from the group consisting of BS-derived RIP-pEGFP shown in Figure 60 and AFP-pEGFP-1 shown in Figure 59 . 104. Transgenic mice tolerized for green fluorescent protein. 105. A transgenic mouse having a DNA molecule stably integrated into its genome, selected from the group consisting of BS-derived RIP-pEGFP shown in FIG. 60 and AFP-pEGFP-1 shown in FIG. 59 . 106. A method for testing the in vivo delivery of a vector comprising an AAV-ITR and a green fluorescent protein gene to a non-human transgenic green fluorescent protein tolerized animal comprising an AAVS1 sequence in its genome, comprising: Isolating a blood sample from the animal and analyzing the blood sample for the presence of green protein; isolating liver tissue from the animal; polymerase chain reaction (PCR) analysis to identify the green fluorescent protein Analyzing the liver tissue for the presence of a nucleic acid encoding a gene sequence; preparing a frozen section of the liver tissue and analyzing the frozen section for the presence of green fluorescent protein using fluorescence microscopy techniques. The presence of the green fluorescent protein is detected in the transgenic animal. Law. 107. 107. The method of claim 106, wherein said non-human transgenic animal is a mouse. 108. A DNA molecule called GT2074, shown in FIG. 109. A DNA molecule called pCMV-hFVIII mini, shown in FIG. 110. The DNA molecule designated AFP-pEGFP-1 shown in FIG. 111. A DNA molecule called mAFP-hFVIII / pGKNeo, shown in FIG. 56 . 112. The DNA molecule called BS-derived RIP-pEGFP shown in FIG .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/465 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 アレマニー、ラモン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー204 カントリー ドライブ 1904 (72)発明者 ダイ、イファン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー304 カントリー ドライブ 1908 (72)発明者 ジョゼフス、スティーヴン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク クレアウッド サークル 366 (72)発明者 バラーグ、クリスティナ アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー204 カントリー ドライブ 1904 (72)発明者 アヤレス、デイヴィッド アメリカ合衆国 60046 イリノイ州 リ ンデンハースト ハイ ポイント ドライ ブ 2186 (72)発明者 シュナイダーマン、リチャード アメリカ合衆国 60074 イリノイ州 パ ラタイン ナンバー６ ペンシルヴェニア ドライブ 638 【要約の続き】 増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄの イン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニッ クマウスモデルを生成するための設計及び方法も報告す る。──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 C12Q 1/68 A 7/00 C12N 5/00 B C12Q 1/68 A61K 37/465 (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Invention Alemany, Ramon United States 60030 Grace Lake, Illinois, 204 Country Drive 1904 (72) Inventor Die, Iphan United States 60030 Grace Lake, Illinois, 304 Country Drive 1908 (72) Inventor Josephs, Steven United States 60030 Grace, Illinois Lake Cle Wood Circle 366 (72) Inventor Ballag, Christina United States 60030 Grace Lake, Illinois 204 Country Drive 1904 (72) Inventor Ayares, David United States 60046 Lindenhurst High Point Drive, Illinois 2186 (72) Inventor Schneiderman , Richard United States 60074 Palatine, Illinois Number 6 Pennsylvania Drive 638 [Continued Summary] Can be amplified. The present invention also reports designs and methods for generating a transgenic mouse model that can be used for in vivo mini-Ad testing.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御 領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソ ーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウ イルスベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分 子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ２． 前記ゲノム組み込み配列が相同組換えアームを含む、請求項１に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ３． 前記相同組換えアームがアルブミンゲノム配列及びα−胎児タンパク質ゲ ノム配列からなる群より選択される、請求項２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４． 前記相同組換えアームがＡｌｂ−Ｅ５、ＡＦＰ−３、又はＥＢＢ１４から なる群より選択される、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５． 前記ゲノム組換え配列がアデノ関連ウイルス逆末端反復（ＡＡＶ−ＩＴＲ ）を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ６． 前記エピソーム維持配列がヒトＤＮＡ複製基点配列を含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ７． ヒトテロメア配列をさらに含み、かつ前記エピソーム維持配列がヒトＤＮ Ａ複製基点配列を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ８． 前記エピソーム維持配列がアルフォイドＤＮＡを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 ９． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点及び該ウイルス複製基点の活 性化に必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載 の単離ＤＮＡ分子。 １０． 前記エピソーム維持配列がＳＶ４０複製基点及びＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）を コードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １１． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点ｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１ をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １２． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 １３． 前記転写制御領域がα1−抗トリプシンプロモーターを含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 １４． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 １５． 前記転写制御領域がα−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結す る肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １６． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項１に記載の単離 ＤＮＡ分子。 １７． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 １８． 前記エフェクター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコー ドする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １９． 前記エフェクター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ２０． 前記アデノウイルスＩＴＲがアデノウイルス５型（Ａｄ５）右ＩＴＲ及 びＡｄ５左逆末端反復を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２１． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２２． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２３． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足場点を含む、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２４． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２５． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求 項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２６． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２７． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２８． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２９． 上流及び下流にＡＡＶ−ＩＴＲが隣接するレポーター又はエフェクター 遺伝子カセットを含む、感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に 有用な単離ＤＮＡ分子。 ３０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする核酸からなる群より選択される、請求項２９に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３２． アデノウイルスＩＴＲ配列、パッケージ化シグナル、ＡＡＶ ＩＴＲ配 列、転写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセッ トを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイル スベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の 残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ３３． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項３２ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３４． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする遺伝子からなる群より選択される、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３５． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項３２に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３６． 前記転写制御領域がα1−抗トリブシンプロモーターを含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３７． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載 の単離ＤＮＡ分子。 ３８． 前記転写制御領域がα1−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結 する肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３９． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項３２に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ４０． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足場点を含む、請求項３２ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４１． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分 子。 ４２． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮ Ａ分子。 ４３． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４４． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４５． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４６． Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムを含む単離ＤＮＡ分子であって、該Ｅ１欠 失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ 化されるように変更されたパッケージ化シグナルを該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノ ムが含む単離ＤＮＡ分子。 ４７． 前記弱力化パッケージ化シグナルがアデノ富化モチーフ（Ａ反復）の部 分的な欠失を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４８． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するように直接反復を含む、請求 項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４９． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するようにＡ反復配列の直列反復 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５０． 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子であって、前記弱力化パッケージ化 シグナルが該ＤＮＡ分子上のタンパク結合部位に隣接して位置し、それにより該 タンパク質の該タンパク結合部位への結合がパッケージ化タンパク質と該弱力化 パッケージ化シグナルとの会合を妨げる単離ＤＮＡ分子。 ５１． 前記パッケージ化シグナルが前記Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノム内の野生 型ヘルパーＡｄゲノムに見出されるもの以外の位置に位置する、請求項４６に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ５２． 前記パッケージ化シグナルが、パッケージ化タンパク質に対する親和性 が野生型パッケージ化タンパク質よりも低い合成パッケージ化シグナルである、 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５３． 前記アデノウイルスゲノムがＥ１に加えてアデノウイルス遺伝子の欠失 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５４． Ａｄ Ｅ１遺伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細 胞であって、該配列がＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持 たない細胞。 ５５． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、エフェクター又 はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれ かを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成 に作用的に関連する第１単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノ ウイルスタンパク質をコードしない第１単離ＤＮＡ分子、並びにＡｄヘルパーゲ ノムを含む第２単離ＤＮＡ分子を同時形質移入する工程； 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該第１ＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノ ウイルスベクター粒子を含む方法。 ５６． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、 エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維 持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルス ベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残 部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子を形質移入する工 程； 該細胞を、Ａｄヘルパーゲノムを含むＡｄヘルパーウイルスに感染させる工程 ；及び 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該ＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノウイ ルスベクター粒子を含む方法。 ５７． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項５５又は５６による方法。 ５８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含み 、かつ前記細胞がｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現する、請求項 ５５又は５６項による方法。 ５９． 前記転写制御領域が前記細胞内よりも標的細胞内においてより活性であ る、請求項５５又は５６による方法。 ６０． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサー／α−抗トリプシンプロモ ーター；及びｔｅｔＯ／ＣＭＶプロモーターからなる群より選択され、前記細胞 がｔｅ ｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現する、請求項５５又は５６による方 法。 ６１． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項５５ 又は５６による方法。 ６２． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、又はヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項５５又は５６による方法。 ６３． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３と呼ばれるプラスミドである、請求項５ ５又は５６による方法。 ６４． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を含む組換えアデノウイ ルス粒子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードし ない組換えアデノウイルス粒子。 ６５． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６４ に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６６． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質、及びヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項６４に記載の組 換えアデノウイルス粒子。 ６７． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６４に記載の組換えアデ ノウイルス粒子。 ６８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項６４に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６９． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を生理学的に許容し得る バッファ中に含む医薬組成物であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない医薬組成物。 ７０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６９ に記載の医薬組成物。 ７１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項６９に記載の医薬組成物。 ７２． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６９に記載の医薬組成物 。 ７３． 治療上有効な量の請求項６９に記載の医薬組成物を患者に投与すること を包含する、血友病の治療方法。 ７４． 非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、ＡＡＶＳ１配列及び薬剤選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子を 形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子の発現により耐性が付与される薬剤の存在下におい て成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択す る工程， 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫をＡＡＶＳ１配列の存在について検定する工程；及び ＡＡＶＳ１配列が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりそのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニッ ク動物が生じる方法。 ７５． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項７４に記載 の方法。 ７６． 前記ＤＮＡ分子が図５２に示されるｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏである、請求 項７４に記載の方法。 ７７． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトト ランスジェニック動物。 ７８． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトト ランスジェニック動物であって、該動物がマウスである非ヒトトランスジェニッ ク動物。 ７９． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ＦＶＩＩＩ様 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに有する、請求項７８に記載 の非ヒトトランスジェニック動物。 ８０． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ヒトＦＶＩＩ Ｉをコードする核酸をさらに有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニ ック動物。 ８１． 前記動物が血友病表現型、及び該動物のゲノムに安定に組み込まれてい る、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項 ７８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。 ８２． 前記動物が血友病表現型及び該動物のゲノムに安定に組み込まれている ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニック 動物。 ８３． そのゲノムに安定に組み込まれているＤＮＡ分子ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ 又はそれらの断片を有する、非ヒトトランスジェニックマウス。 ８４． 前記動物がマウスである、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニッ ク動物。 ８５． そのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれている非ヒトトランスジェニ ック動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲを含むウイルスベクターのイン・ビボ送達を試験 するための方法であって、 生理学的に許容し得るバッファ中の、ＡＡＶ−ＩＴＲ 配列を有するＤＮＡ分子を含み、かつレポーター又はエフェクター遺伝子をコー ドするベクターを該動物の静脈内又は門脈に注射する工程； 該動物から複数の血液試料を得る工程； 該血液試料における遺伝子発現の水準を測定して導入遺伝子の発現の持続を決 定する工程；及び 該動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する工程；及び ＡＡＶＳ１特異的プライマーを用いて該組織のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）分析を行って該動物のゲノムへの該ベクターの組み込みを検出する工程； を組み合わせて包含する方法。 ８６． 前記ゲノムＤＮＡに対する蛍光インサイツ・ハイブリダイゼーション分 析を行って、前記ＡＡＶＳ１配列の染色体位置を決定し、かつ前記ＡＡＶＳ１配 列での前記レポーター又はエフェクター遺伝子の組み込みを検出する工程をさら に含む、請求項８５に記載の方法。 ８７． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、 請求項８５に記載の方法。 ８８． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、 ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転写制御領域、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコ ードする遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不 全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部 はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請求項８５に記載の方法。 ８９． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、ヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸、及びＲｅｐ発現カセットを含み 、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的 に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請 求項８７に記載の方法。 ９０． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されている非ヒトトランスジェニック動 物の生成方法であって、 胚幹細胞にヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸及び薬剤選択マーカー遺伝子を含 むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現により耐性 が付与される薬剤の存在下において該細胞を成長させることにより、そのゲノム 内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を、該子孫のゲノム内の該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の存在について検定す る工程；及び 該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニック動物が生 じる方法。 ９１． 前記ＤＮＡ分子が、合成プロモーター、発生的に調節されるプロモータ ー又は組織特異的プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制 御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９２． 前記ＤＮＡ分子が、α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロ モーター及びα−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモー ターの制御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９３． 前記ＤＮＡ分子が図５８に示されるｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮ ｅｏを含む、請求項９０に記載の方法。 ９４． 前記動物がマウスである、請求項９０に記載の方法。 ９５． ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓特異的プロモーターの転写制御の下に含む ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞であって、該ＤＮＡ分子が薬剤選択マーカー遺伝子を さらに 含む胚幹細胞。 ９６． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９７． α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα−抗 トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下 に、そのゲノムに組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、ヒトＦＶＩ ＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９８． そのゲノムに組み込まれているＤＮＡ分子ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐ ＧＫＮｅｏ又はそれらの断片を有するトランスジェニックマウス。 ９９． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されている非ヒトトランスジェニッ ク動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、合成プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生的に調節さ れるプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下に緑色 蛍光タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子のタンパク質産生物の発現により耐性が付与される 薬剤の存在下において成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含 む胚幹細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の存在について検定する工程；及び そのゲノム内に緑色蛍光タンパク質遺伝子配列が検出されている子孫をホモ接 合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それにより緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されたトランスジェニック動物 が生じる方法。 １００． 前記動物がマウスである請求項９９に記載の方法。 １０１． 前記組織特異的プロモーターが肝臓特異的である、請求項９９に記載 の方法。 １０２． 前記組織特異的プロモーターがα−胎児タンパク質プロモーター、ア ルブミンプロモーター及びα1−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択 される、請求項９９に記載の方法。 １０３． 前記ＤＮＡ分子が図６２に示されるＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び 図６０に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より選択される、請求項９ ９に記載の方法。 １０４． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されているトランスジェニックマ ウス。 １０５． そのゲノムに安定に組み込まれている、図６２に示されるＢＳ由来Ｒ ＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図６０に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より 選択されるＤＮＡ分子を有するトランスジェニックマウス。 １０６． そのゲノム内にＡＡＶＳ１配列を含む非ヒトトランスジェニック緑色 蛍光タンパク質寛容化動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ及び緑色蛍光タンパク質遺伝子 を含むベクターのイン・ビボ送達を試験する方法であって、 該ベクターを該動物に注射する工程； 該動物から血液試料を単離し、該血液試料を緑色タンパク質の存在について分 析する工程； 該動物から肝臓組織を単離する工程； ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列 をコードする核酸の存在について該肝臓組織を分析する工程； 該肝臓組織の凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡技術を用いて該凍結切片を緑色蛍 光タンパク質の存在について分析する工程； を組み合わせて包含し、 緑色蛍光タンパク質の存在は該トランスジェニック動物内で検出される方法。 １０７． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項１０６に 記載の方法。 １０８． 図４２に示される、ＧＴ２０７４と呼ばれるＤＮＡ分子。 １０９． 図４３に示される、ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩミニと呼ばれるＤＮＡ分 子。 １１０． 図６０に示される、ＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１と呼ばれるＤＮＡ分子。 １１１． 図５８に示される、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏと呼ばれ るＤＮＡ分子。 １１２． 図６２に示される、ＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰと呼ばれるＤＮＡ分 子。[Claims] 1. It contains adenovirus inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration sequences or episomal maintenance sequences, all of which are of the infectious replication defective recombinant adenovirus vector. An isolated DNA molecule operatively associated with production, wherein the remainder of said DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 2. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said genomic integration sequence comprises a homologous recombination arm. 3. 3. The isolated DNA molecule of claim 2, wherein said homologous recombination arm is selected from the group consisting of an albumin genomic sequence and an α-fetal protein genomic sequence. 4. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said homologous recombination arm is selected from the group consisting of Alb-E5, AFP-3, or EBB14. 5. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said genomic recombination sequence comprises an adeno-associated virus inverted terminal repeat (AAV-ITR). 6. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said episomal maintenance sequence comprises a human DNA replication origin sequence. 7. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising a human telomere sequence, and wherein said episomal maintenance sequence comprises a human DNA replication origin sequence. 8. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said episomal maintenance sequence comprises alfoid DNA. 9. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the episomal maintenance sequence comprises a viral replication origin and a nucleotide sequence encoding a protein required for activation of the viral replication origin. 10. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said episomal maintenance sequence comprises an SV40 origin of replication and a gene encoding a T antigen (T-Ag). 11. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the episomal maintenance sequence comprises a gene encoding a viral origin of replication oriP and EBNA-1. 12. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said transcription control region comprises a human albumin promoter. 13. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the transcription control region comprises an α 1 -antitrypsin promoter. 14． 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said transcription control region comprises a liver-specific enhancer. 15. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the transcription control region comprises a liver-specific enhancer operably linked to an [alpha] -antitrypsin promoter. 16. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the transcription control region comprises a tet-operon (tetO) operably linked to a cytomegalovirus promoter (CMV). 17． 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 18. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said effector gene encodes a protein having FVIII-like activity. 19. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said effector gene encodes human FVIII. 20. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the adenovirus ITR comprises an adenovirus type 5 (Ad5) right ITR and an Ad5 left inverted terminal repeat. 21. 2. The method according to claim 1, wherein the adenovirus inverted terminal repeat comprises an Ad5 right ITR and an Ad5 left ITR, the transcription control region comprises a human albumin promoter, and the effector gene encodes a protein having FVIII-like activity. Isolated DNA molecule. 22. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the adenovirus inverted terminal repeat comprises an Ad5 right ITR and an Ad5 left ITR, the transcription control region comprises a human albumin promoter, and the effector gene encodes human FVIII. 23. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein the packaging signal comprises a packaging scaffold point. 24. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, comprising a plurality of packaging signals. 25. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, comprising a plurality of synthetic packaging signals. 26. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising a gene encoding a modified Ad envelope protein capable of binding to a target cell membrane. 27. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising a modified adenovirus gene encoding a gene product having an altered function or structure when compared to a wild-type gene product. 28. The isolated DNA molecule of claim 1, further comprising an E4 gene operably linked to a transcription control region. 29. An isolated DNA molecule useful for generating an infectious replication-deficient recombinant adenovirus vector comprising a reporter or effector gene cassette flanked by AAV-ITR upstream and downstream. 30. 2. The isolated DNA molecule of claim 1, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 31. 30. The isolated DNA molecule of claim 29, wherein said effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a nucleic acid encoding a human FVIII protein. 32. Contains adenovirus ITR sequences, packaging signals, AAV ITR sequences, transcription control regions, reporter or effector genes, and Rep expression cassettes, all of which are operatively involved in the generation of infectious replication-defective recombinant adenovirus vectors. An isolated DNA molecule, the remainder of the DNA molecule not encoding an adenovirus protein. 33. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 34. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a gene encoding a human FVIII protein. 35. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a human albumin promoter. 36. The transcription control regions alpha 1 - anti tributyl including thin promoter, isolated DNA molecule according to claim 3 2. 37. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a liver-specific enhancer. 38. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a liver-specific enhancer operably linked to an [alpha] 1 -antitrypsin promoter. 39. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said transcription control region comprises a tet-operon (tetO) operably linked to a cytomegalovirus promoter (CMV). 40. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein said packaging signal comprises a packaging scaffold point. 41. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, wherein the isolated DNA molecule comprises a plurality of packaging signals. 42. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, comprising a plurality of synthetic packaging signals. 43. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, further comprising a gene encoding a modified Ad envelope protein capable of binding to a target cell membrane. 44. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, further comprising a modified adenovirus gene encoding a gene product having an altered function or structure when compared to a wild-type gene product. 45. 33. The isolated DNA molecule of claim 32, further comprising an E4 gene operably linked to a transcription control region. 46. An isolated DNA molecule comprising an E1-deleted helper Ad genome, wherein the packaging signal is modified such that the E1-deleted helper Ad genome is packaged less frequently than a wild-type helper Ad genome. An isolated DNA molecule contained in the helperless Ad genome. 47. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein said attenuating packaging signal comprises a partial deletion of an adeno-enriched motif (A repeat). 48. 50. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the attenuation packaging signal comprises direct repeats such that the affinity of the packaged protein for the attenuation packaging signal is reduced. 49. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the attenuation packaging signal comprises tandem repeats of the A repeat sequence such that the affinity of the packaged protein for the attenuation packaging signal is reduced. 50. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the weakening packaging signal is located adjacent to a protein binding site on the DNA molecule, thereby binding the protein to the protein binding site. An isolated DNA molecule that prevents association of the packaged protein with the weakened packaging signal. 51. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the packaging signal is located in the E1-deleted helper Ad genome at a position other than that found in the wild-type helper Ad genome. 52. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein the packaging signal is a synthetic packaging signal that has a lower affinity for the packaged protein than a wild-type packaged protein. 53. 47. The isolated DNA molecule of claim 46, wherein said adenovirus genome comprises a deletion of an adenovirus gene in addition to E1. 54. A cell stably transfected with a DNA molecule comprising the Ad E1 gene sequence, the cell having no sequence overlapping the genome of the E1-deleted helper Ad genome. 55. A method for producing a recombinant adenovirus vector, comprising the steps of: adenovirus reverse transfecting a cell stably transfected with a DNA molecule comprising an Ad E1 gene sequence having no sequence overlapping with the genome of an E1-deleted helper Ad genome; Including terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration or episomal maintenance sequences, all of which affect the generation of infectious, replication-defective, recombinant adenovirus vectors. A first isolated DNA molecule, the remainder of which is co-transfected with a first isolated DNA molecule that does not encode an adenovirus protein, as well as a second isolated DNA molecule that includes the Ad helper genome. Preparing a cell-free lysate of the cells; The method wherein the cell-free lysate comprises an infectious replication-impaired recombinant adenovirus vector particle comprising the first DNA molecule. 56. A method for producing a recombinant adenovirus vector, comprising the steps of: adenovirus reverse transfecting a cell stably transfected with a DNA molecule comprising an Ad E1 gene sequence having no sequence overlapping with the genome of an E1-deleted helper Ad genome; Including terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration or episomal maintenance sequences, all of which act to generate infectious, replication-defective, recombinant adenovirus vectors Transfecting an isolated DNA molecule, wherein the remainder of the DNA molecule does not encode an adenovirus protein; infecting the cell with an Ad helper virus comprising the Ad helper genome. Preparing a cell-free lysate of the cells; The combined result in, the cell-free lysates, the method comprising the infectious replication-impaired recombinant adenoviral vector particle containing the DNA molecule. 57. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said DNA molecule further comprises an AAV-ITR and a Rep expression cassette. 58. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said DNA molecule further comprises an AAV-ITR and a Rep expression cassette, and said cells express a tet-KRAB repressor protein. 59. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said transcription control region is more active in target cells than in said cells. 60. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said transcription control region is selected from the group consisting of a liver-specific enhancer / [alpha] -antitrypsin promoter; and a tetO / CMV promoter, and wherein said cells express a tet-KRAB repressor protein. 61. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 62. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, or a human FVIII gene. 63. 57. The method according to claim 55 or 56, wherein said DNA molecule is a plasmid called GT2063. 64. It contains adenovirus inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration sequences or episomal maintenance sequences, all of which are of the infectious replication defective recombinant adenovirus vector. A recombinant adenovirus particle comprising a DNA molecule operatively associated with production, wherein the remainder of the DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 65. 70. The recombinant adenovirus particle of claim 64, wherein said reporter gene encodes a green fluorescent protein. 66. 65. The recombinant adenovirus particle of claim 64, wherein said effector gene encodes a neomycin resistance gene, a protein having FVIII-like activity, and human FVIII. 67. 65. The recombinant adenovirus particle of claim 64, wherein said DNA molecule is GT2063. 68. 65. The recombinant adenoviral particle of claim 64, wherein said DNA molecule further comprises an AAV-ITR and a Rep expression cassette. 69. It contains adenovirus inverted terminal repeats (ITRs), packaging signals, transcription control regions, effector or reporter genes, and either genomic integration sequences or episomal maintenance sequences, all of which are of the infectious replication defective recombinant adenovirus vector. A pharmaceutical composition comprising a DNA molecule operatively related to production in a physiologically acceptable buffer, the remainder of the DNA molecule not encoding an adenovirus protein. 70. 70. The pharmaceutical composition according to claim 69, wherein the reporter gene encodes a green fluorescent protein. 71. 70. The pharmaceutical composition according to claim 69, wherein the effector gene is selected from the group consisting of a neomycin resistance gene, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a human FVIII gene. 72. 70. The pharmaceutical composition according to claim 69, wherein said DNA molecule is GT2063. 73. 70. A method of treating hemophilia comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 69. 74. A method for producing a transgenic non-human animal, comprising: transfecting embryonic stem cells with a DNA molecule containing an AAVS1 sequence and a drug selection marker gene; in the presence of a drug to which resistance is imparted by expression of the drug selection marker gene Selecting an embryonic stem cell containing the DNA molecule in its genome by growing in the step; a step of microinjecting the embryonic stem cell into a blastocyst; a step of transplanting the blastocyst into a foster mother; Breeding the progeny; testing the progeny for the presence of the AAVS1 sequence; and breeding the progeny in which the AAVS1 sequence is detected to homozygosity, thereby incorporating the AAVS1 sequence into its genome. How transgenic animals are produced. 75. 75. The method of claim 74, wherein said non-human transgenic animal is a mouse. 76. 75. The method of claim 74, wherein said DNA molecule is pAAVS1-Neo shown in FIG. 77. A non-human transgenic animal having an AAVS1 sequence stably integrated into its genome. 78. A non-human transgenic animal having an AAVS1 sequence stably integrated into its genome, wherein the animal is a mouse. 79. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal further comprises a gene that encodes a protein having FVIII-like activity, which is stably integrated into the animal's genome. 80. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal further comprises a nucleic acid encoding human FVII I, which is stably integrated into the animal's genome. 81. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal has a gene encoding a protein with FVIII-like activity that is stably integrated into the genome of the animal with the hemophilia phenotype. 82. 79. The non-human transgenic animal of claim 78, wherein the animal has a hemophilia phenotype and a human FVIII gene that is stably integrated into the genome of the animal. 83. A non-human transgenic mouse having the DNA molecule pAAVS1-Neo or a fragment thereof stably integrated into its genome. 84. 84. The non-human transgenic animal of claim 83, wherein said animal is a mouse. 85. A method for testing the in vivo delivery of a viral vector comprising an AAV-ITR to a non-human transgenic animal having an AAVS1 sequence integrated in its genome, comprising: in a physiologically acceptable buffer; Injecting a vector comprising a DNA molecule having an AAV-ITR sequence and encoding a reporter or effector gene into a vein or portal vein of the animal; obtaining a plurality of blood samples from the animal; Determining the level of expression of the transgene by measuring the level of expression; and isolating genomic DNA from liver tissue of the animal; and polymerase chain reaction (PCR) of the tissue using AAVS1-specific primers. Performing an analysis to detect the integration of said vector into the genome of said animal. How to free. 86. 86. The method of claim 85, further comprising performing a fluorescence in situ hybridization analysis on the genomic DNA to determine the chromosomal location of the AAVS1 sequence and detecting integration of the reporter or effector gene in the AAVS1 sequence. the method of. 87. The DNA molecule comprises an adenovirus ITR sequence, an AAV ITR sequence, a transcriptional control region, a reporter or effector gene, and a Rep expression cassette, all of which are operatively associated with the production of an infectious, replication-defective, recombinant adenovirus vector. 86. The method of claim 85, wherein the remainder of the DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 88. The DNA molecule comprises an adenovirus ITR sequence, an AAV ITR sequence, a transcription control region, a gene encoding a protein having FVIII-like activity, and a Rep expression cassette, all of which produce an infectious, replication-defective, recombinant adenovirus vector. 86. The method of claim 85, wherein the remainder of the DNA molecule is operatively associated with and does not encode an adenovirus protein. 89. The DNA molecule comprises an adenovirus ITR sequence, an AAV ITR sequence, a transcriptional control region, a nucleic acid encoding human FVIII, and a Rep expression cassette, all of which are operative in generating an infectious replication-defective recombinant adenovirus vector. 89. The method of claim 87, wherein the remainder of said DNA molecule does not encode an adenovirus protein. 90. A method for producing a non-human transgenic animal that is tolerized to human FVIII, comprising transfecting embryonic stem cells with a DNA molecule comprising a nucleic acid encoding human FVIII and a drug selection marker gene; Selecting the embryonic stem cells containing the DNA molecule in their genome by growing the cells in the presence of an agent to which resistance is imparted by expression of the protein encoded by the gene; Implanting the blastocyst into a foster mother; breeding the resulting progeny; assaying the progeny for the presence of the human FVIII gene in the genome of the progeny; Rearing the progeny in which the human FVIII gene has been detected to homozygosity; Tolerized how transgenic animals occurs for VIII. 91. 90. The method of claim 90, wherein said DNA molecule comprises a human FVIII gene under transcriptional control of a promoter selected from the group consisting of a synthetic promoter, a developmentally regulated promoter, or a tissue-specific promoter. 92. 91. The method of claim 90, wherein said DNA molecule comprises a human FVIII gene under the control of a promoter selected from the group consisting of an alpha-fetal protein promoter, an albumin promoter and an alpha-antitrypsin promoter. 93. 91. The method of claim 90, wherein said DNA molecule comprises mAFP-hFVIII / pGKNeo shown in Figure 58. 94. 91. The method of claim 90, wherein said animal is a mouse. 95. An embryonic stem cell comprising a DNA molecule comprising a human FVIII gene under transcriptional control of a liver-specific promoter, wherein said DNA molecule further comprises a drug selectable marker gene. 96. Transgenic mice that have been tolerized to human FVIII. 97. Under the transcriptional control of a promoter selected from the group consisting of an α-fetal protein promoter, an albumin promoter and an α-antitrypsin promoter, tolerize human FVI II having the human FVIII gene integrated into its genome. Transgenic mice. 98. A transgenic mouse having the DNA molecule mAFP-hFVIII / p GKNeo or a fragment thereof integrated into its genome. 99. A method for producing a non-human transgenic animal that has been tolerized to green fluorescent protein, said embryonic stem cell having a promoter selected from the group consisting of a synthetic promoter, a tissue-specific promoter and a developmentally regulated promoter. Transfecting a DNA molecule containing a green fluorescent protein gene under the transcriptional control of the gene; growing the gene in the presence of a drug to which resistance is imparted by expression of a protein product of the drug selectable marker gene; Selecting an embryonic stem cell containing the DNA molecule into a blastocyst; injecting the blastocyst into a foster mother; rearing the obtained progeny; Testing for the presence of the green fluorescent protein gene sequence; and the green fluorescent protein gene sequence in its genome Rearing the offspring in which is detected to homozygosity, thereby producing a transgenic animal tolerized to green fluorescent protein. 100. 100. The method of claim 99, wherein said animal is a mouse. 101. 100. The method of claim 99, wherein said tissue-specific promoter is liver-specific. 102. 100. The method of claim 99, wherein said tissue-specific promoter is selected from the group consisting of an α-fetal protein promoter, an albumin promoter, and an α 1 -antitrypsin promoter. 103. 61. The method of claim 99, wherein said DNA molecule is selected from the group consisting of RIP-pEGFP from BS shown in Figure 62 and AFP-pEGFP-1 shown in Figure 60. 104. Transgenic mice tolerized for green fluorescent protein. 105. A transgenic mouse having a DNA molecule stably integrated into its genome, selected from the group consisting of RIP-pEGFP shown in FIG. 62 and AFP-pEGFP-1 shown in FIG. 60. 106. A method for testing the in vivo delivery of a vector comprising an AAV-ITR and a green fluorescent protein gene to a non-human transgenic green fluorescent protein tolerized animal comprising an AAVS1 sequence in its genome, comprising: Isolating a blood sample from the animal and analyzing the blood sample for the presence of green protein; isolating liver tissue from the animal; polymerase chain reaction (PCR) analysis to identify the green fluorescent protein Analyzing the liver tissue for the presence of a nucleic acid encoding a gene sequence; preparing a frozen section of the liver tissue and analyzing the frozen section for the presence of green fluorescent protein using fluorescence microscopy techniques. The presence of the green fluorescent protein is detected in the transgenic animal. Law. 107. 107. The method of claim 106, wherein said non-human transgenic animal is a mouse. 108. A DNA molecule called GT2074, shown in FIG. 109. A DNA molecule called pCMV-hFVIII mini, shown in FIG. 110. The DNA molecule designated AFP-pEGFP-1 shown in FIG. 111. A DNA molecule designated mAFP-hFVIII / pGKNeo, shown in FIG. 112. A DNA molecule called BS-derived RIP-pEGFP shown in FIG. 62.
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