JP2001037472A - 三次元細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】細胞の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維
持、向上させ、細胞形態を生体内に近い形態に保持でき
るような三次元形状に付形した三次元細胞培養基材、お
よびこの三次元細胞培養基材を用いた細胞培養方法を提
供する。 【解決手段】少なくとも１種類の糖鎖をスペーサー分子
を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細胞
培養基材を、三次元形状に付形することにより、三次元
細胞培養基材とする。糖鎖高分子としては、アルギン
酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸またはこれらの誘導体等
のカルボキシル基を有する糖鎖高分子が好ましく使用で
きる。細胞により特異な認識性を有する糖鎖を側鎖とし
て結合させているため、細胞と糖鎖との特異的相互作用
に起因して、細胞の増殖性、形態および機能を維持、向
上させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞の増殖性、形態お
よび機能を、生体内の細胞と同様に発現させることがで
きる、三次元形状に付形した三次元細胞培養基材、およ
びこの細胞培養基材を用いた細胞培養方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】近年の糖鎖工学の進歩には目ざましいも
のがある。例えば、植物細胞の細胞壁のプロテオグリカ
ン、糖脂質、糖タンパク質などが糖鎖を有する生体高分
子として挙げられるが、それぞれ細胞の安定化、細
胞の分化、増殖、接着、移動、細胞間相互作用や細胞
認識に関与していると考えられており、様々な報告がな
されている。さらに、これらの高分子の糖鎖が、互いに
機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいな
がら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明ら
かなっている。

【０００３】さらに、このような糖鎖は細胞を分化増殖
させ、細胞の接着に関与し、免疫、及び細胞の癌化との
関係が明確にされており、この糖鎖工学と、医学、細胞
工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展
開を計ることで様々な産業の展開が期待できる。

【０００４】その一例として、細胞表面の糖鎖や、糖鎖
レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、あるい
はエイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に関
する研究が活発化してきている（川野武弘、Bio Indust
ry, 14, 22-30(1997)）。また、細胞−細胞間の接着を
媒介する分子としてのセレクチン、コンタクチン、コン
タクトインヒビンなどの糖鎖認識タンパク質に関する研
究も、生体反応を理解する上で重要になってきている
（武内恒成、高橋直樹、細胞工学、16, 801-812(199
7)）。

【０００５】本発明者らは、従来から糖鎖の細胞特異的
な相互作用に着目し鋭意研究を行ってきており、例え
ば、アシアロ糖タンパク質レセプターに対するリガンド
のモデルとして、ガラクトースを側鎖に有するポリスチ
レンであるポリ−（Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−［Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコン
アミド］）（ＰＶＬＡと略記）を設計、合成した。例え
ば、このＰＶＬＡを細胞培養基材としてコートしたシャ
ーレ上での肝細胞培養実験において、ＰＶＬＡと肝実質
細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターとの特異的
親和力を介して肝実質細胞が選択的に培養され、ＰＶＬ
Ａコートシャーレという二次元基材環境下でも、肝実質
細胞自体がその形態を三次元化し、細胞集合体として特
異的に存在することを見出した（A. Kobayashi, M. Got
o, K. Kobayashi, T. Akaike, J. Biomater. Sci. Poly
mer Edn, 6, 325-342 (1994)）。しかしながら、このＰ
ＶＬＡは、合成高分子であるポリスチレンを主鎖として
有する構造であるため、生体分解性がないこと、抗原性
が発現する可能性があること、毒性を有する可能性があ
ること、といった欠点をもっている。

【０００６】一方、天然物であるコラーゲン、フィブロ
ネクチン、ラミニン等の接着タンパク質をコートしたシ
ャーレを用いて細胞の培養を行うこともなされている。
しかし、二次元的な培養であることにより、細胞の増
殖、細胞機能の発現などが十分に発揮されない。

【０００７】また最近では、天然または合成高分子のコ
ラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリイソプロピ
ルアクリルアミド等を、紫外線、放射線、化学架橋剤を
用いて架橋させて三次元形状の培養基材とし、これを用
いて細胞を培養する試みもなされている。しかし、細胞
の生着が良好でなく、細胞の増殖が抑制されることが多
いこと、細胞機能が低下すること、細胞形態が生体内と
は異なり伸展してしまうことなどの問題点があり、細胞
を良好に培養する系は得られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、細胞
の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、
細胞形態を生体内に近い形態に保持できるような三次元
形状に付形した三次元細胞培養基材を提供すること、さ
らにはこの三次元細胞培養基材を用いた細胞培養方法を
提供することを目的としてなされたものである。

【０００９】

【課題を解決する手段】すなわち本発明は、少なくとも
１種類の糖鎖をスペーサー分子を介して側鎖として結合
させた糖鎖高分子からなる細胞培養基材を、三次元形状
に付形したことを特徴とする三次元細胞培養基材であ
る。

【００１０】さらに本発明は、この三次元細胞培養基材
を用いて細胞を培養することにより、細胞の増殖性、形
態および機能を維持、向上させることを特徴とする細胞
培養方法である。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の三次元細胞培養基材は、
糖鎖高分子を主鎖とし、この主鎖にスペーサー分子を介
して糖鎖を側鎖として結合させてなるものである。スペ
ーサー分子としてジアミンを用いた場合の一般的な構造
式を下記式（１）に示す。

【００１２】［式（１）］

【００１３】上記の式（１）中、［ ］内は糖鎖高分子
を表し、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、また
はこれらの誘導体等のカルボキシル基を有する糖鎖高分
子が好ましく使用できる。なお、ペクチン酸としては、
ペクチン酸を主成分とするペクチンも使用できる。本発
明においては、これら以外の糖鎖高分子であっても、側
鎖として糖鎖を導入できるものであれば種々の糖鎖高分
子を用いることができるが、上記で例示した糖鎖高分子
は食品や化粧品等の材料として広く使用されており、細
胞に対する親和性が良好なものであるため特に好まし
い。糖鎖高分子の分子量は一般的には３万〜２０万程度
のものが好ましく使用できる。分子量が低く過ぎる場合
にはゾル状態となるため、三次元形状に付形しにくくな
る傾向がある。

【００１４】上記式（１）中のＲは、糖鎖高分子に側鎖
として結合した糖鎖を表す。本発明における糖鎖は、糖
鎖高分子に側鎖として結合した状態で細胞と相互作用す
る糖残基を保持できるものであれば、いかなるものでも
使用でき、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノ
ース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラク
トサミン、ラクトース、マルトース、ラミナリビオー
ス、キトビオース、マルトビオース、ウロン酸関連物
質、硫酸糖等の単糖類、オリゴ糖類等が挙げられる。

【００１５】糖鎖高分子と糖鎖との結合はスペーサー分
子を介してなされるが、スペーサーとしては、上記式
（１）中で示したように、分子内にアミノ基を２個有す
るジアミンが好ましく使用できる。すなわち、ジアミン
中の１つのアミノ基とラクトン化した糖鎖の末端カルボ
キシル基との間でアミド結合を形成させ、ジアミン中の
もう１つのアミノ基と糖鎖高分子のカルボキシル基との
間で別のアミド結合を形成させることによって、糖鎖を
糖鎖高分子に効果的にかつ容易に導入することができ
る。式（１）におけるスペーサー分子中のＲ′は、アル
キル基あるはベンゼン環等を表し、ジアミンとしては、
エチレンジアミン、ヘキサエチレンジアミン、ジアミノ
キシレン等が挙げられる。ジアミン以外にも、２個の官
能基を分子内に有する化合物、例えばアミノエタノール
等もスペーサー分子として使用できる。アミノエタノー
ルの場合には、分子内のアミノ基と水酸基がそれぞれア
ミド結合とエステル結合により糖鎖高分子と糖鎖とを結
合させることができる。また、スペーサー分子を予め導
入した糖鎖高分子を糖鎖と結合させてもよく、スペーサ
ー分子を予め導入した糖鎖を糖鎖高分子と結合させても
よい。但し、糖鎖を直接糖鎖高分子のカルボキシル基に
導入できる場合は、スペーサー分子は必ずしも必要では
ない。

【００１６】糖鎖高分子に対する糖鎖の導入量は特に限
定されるものではないが、糖鎖高分子中のカルボキシル
基の数の１０〜５０％程度に糖鎖を導入することが好ま
しい。また、糖鎖高分子に導入する糖鎖は、１種類でも
よく、あるいは２種類以上の糖鎖を導入させてもよい。
細胞の種類によって特異な糖鎖認識性を有しているた
め、細胞による認識性の異なる糖鎖を２種類以上導入さ
せた糖鎖高分子を培養基材として用いる場合には、組み
合わせる糖鎖の種類や、それらの導入割合をコントロー
ルすることによって、細胞の増殖性、形態および機能を
任意にコントロールすることが可能となる。

【００１７】２種類以上の糖鎖を糖鎖高分子に結合させ
る場合には、種類の異なる糖鎖を同時に糖鎖高分子に結
合させることもでき、あるいは、１種類の糖鎖を糖鎖高
分子に結合させた後、別種の糖鎖を引き続き糖鎖高分子
に結合させることもできる。

【００１８】糖鎖を側鎖として導入した糖鎖高分子の具
体例を構造式を示して以下に説明する。なお、糖鎖高分
子に対する糖鎖の結合は、高分子と低分子との反応であ
るためランダムに起こり、必ずしも図示の結合位置に限
られるものではない。

【００１９】［式（２）］

【００２０】上記式（２）で表される１−Ｎ−［Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコン
アミド］メチル−２−Ｎ′−メチルアミド−アルギン酸
（以下ＬＡ−ＡＧと略記する）は、ラクトビオン酸をエ
チレンジアミンの１つのアミノ基と結合させ、もう一方
のアミノ基とアルギン酸のカルボキシル基を結合させた
化合物である。

【００２１】［式（３）］

【００２２】上記式（３）で表される１−Ｎ−［Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコン
アミド］メチル−２−Ｎ′−メチルアミド−ヒアルロン
酸（以下ＬＡ−ＨＡと略記する）は、ラクトビオン酸を
エチレンジアミンの１つのアミノ基と結合させ、もう一
方のアミノ基とヒアルロン酸のカルボキシル基を結合さ
せた化合物である。

【００２３】［式（４）］

【００２４】上記式（４）で表される１−Ｎ−［Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコン
アミド］メチル−２−Ｎ′−メチルアミド−ペクチン
（以下ＬＡ−ＰＡと略記する）は、ラクトビオン酸をエ
チレンジアミンの１つのアミノ基と結合させ、もう一方
のアミノ基とペクチン酸のカルボキシル基を結合させた
化合物である。

【００２５】［式（５）］

【００２６】上記式（５）で表される化合物は、任意の
糖鎖Ｒを任意のスペーサー化合物の１つのアミノ基と結
合させ、もう一方のアミノ基とアルギン酸のカルボキシ
ル基を結合させた化合物である。

【００２７】［式（６）］

【００２８】上記式（６）で表される化合物は、任意の
糖鎖Ｒを任意のスペーサー化合物の１つのアミノ基と結
合させ、もう一方のアミノ基とヒアルロン酸のカルボキ
シル基を結合させた化合物である。

【００２９】［式（７）］

【００３０】上記式（７）で表される化合物は、任意の
糖鎖Ｒを任意のスペーサー化合物の１つのアミノ基と結
合させ、もう一方のアミノ基とペクチン酸のカルボキシ
ル基を結合させた化合物である。

【００３１】本発明においては、上述したような糖鎖を
側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細胞培養基材
を、三次元形状に付形することによって、三次元細胞培
養基材とする。三次元形状の付形方法は、一般の糖鎖高
分子（糖鎖を側鎖として結合させていない糖鎖高分子）
の付形方法として種々の文献に記載されている既知方法
を採用することができる。

【００３２】例えば、アルギン酸を糖鎖高分子とする培
養基材の場合、この培養基材溶液にカルシウムを添加す
ることにより、培養基材とカルシウムのコンプレックス
によるゲル状のビーズを作成することができる。また、
ヒアルロン酸を糖鎖高分子とする培養基材の場合、培養
基材の濃厚溶液を紫外線、放射線、化学架橋剤等で処理
してヒアルロン酸を架橋させたのち凍結乾燥するか、あ
るいは凍結乾燥したのち架橋させることにより、培養基
材のスポンジを作成することができる。また、アルギン
酸を糖鎖高分子とする培養基材の溶液とカルシウム溶液
とを混合してホモジナイズしたのち凍結乾燥することに
よりスポンジとすることができる。

【００３３】あるいはまた、ポリスチレンなどの担体
に、培養基材を吸着等の物理化学的方法あるいは共有結
合等の化学的方法等により担持させることにより、三次
元形状に付形することもできる。

【００３４】細胞培養基材を三次元形状に付形するに際
しては、糖鎖を側鎖として結合させた糖鎖高分子と、一
般の糖鎖高分子（糖鎖を側鎖として結合させていない糖
鎖高分子）との混合物からなる細胞培養基材を付形する
こともできる。

【００３５】上述した本発明による三次元細胞培養基材
を用いて細胞培養を行うには、従来から慣用されている
細胞培養方法をそのまま採用すればよい。例えばゲル状
のビーズからなる三次元細胞培養基材を用いる場合に
は、細胞培養基材の溶液中に細胞懸濁液を混合してお
き、これにカルシウムを添加してビーズに付形すること
により、細胞を内包したゲルビーズを作成することがで
き、このビーズを液体培地中で培養すればよい。

【００３６】また、予め作成したスポンジ状の三次元細
胞培養基材上に、細胞懸濁液を播種して、スポンジ内に
細胞を導入、内包せしめ、これを常法により培養すれば
よい。

【００３７】このようにして細胞を培養することによ
り、細胞のもつ特異な糖鎖認識性に起因して、細胞の生
着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、細胞
形態を生体内に近い形態に保持させることが可能とな
る。

【００３８】なお、上述の細胞培養に際しては、本発明
による三次元細胞培養基材の１種類のみを使用してもよ
いが、２種類以上を混合して使用することもできる。さ
らには、本発明による三次元細胞培養基材だけでなく、
必要に応じて例えば糖鎖高分子、コラーゲンなどの接着
タンパク質、各種の天然高分子等と本発明の三次元細胞
培養基材とを組み合わせて細胞培養に供することもでき
る。

【００３９】

【実施例】［実施例１］ＬＡ−ＡＧ（式（１））の合成 （ａ）１−Ｎ−［Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］メチル−２−Ｎ′−
メチルアミン（以下ＬＡ−ＥＤと略記する）の合成 下記の反応式に従って、ＬＡ−ＥＤを合成した。

【００４０】［反応式］

【００４１】先ず、M. Goto, et al., J. Controlled R
elease, 28, 223-233 (1994)に記載の方法により、ラク
トースのラクトン化を行った。概略は以下の通りであ
る。ラクトースを蒸留水に分散させてメタノールで希釈
する。その希釈した分散液を加温したヨウ素のメタノー
ル溶液に加え、撹拌した後、水酸化カリウム／メタノー
ル溶液をヨウ素の色が消失するまで徐々に添加する。引
き続き、反応液を氷冷し、析出した沈殿を濾取する。沈
殿を洗浄し、再結晶することにより酸カリウム塩を得
る。得られたカリウム塩を、イオン交換樹脂に通すこと
により酸型とし、その酸型の分画にメタノールを加えて
減圧濃縮して結晶を得る。その結晶を少量のメタノール
に溶かして、さらにエーテルを加えて沈殿させるという
操作を数回繰り返したのち、沈殿を凍結乾燥してラクト
ースラクトンを得た。

【００４２】上記で得られたラクトースラクトン５ｇを
ＤＭＳＯ５０ｍＬ（ミリリットル）に溶解し、これにエ
チレンジアミン２０ｇを加えて、環流下４時間反応させ
た。放冷し、沈殿を濾別した後、反応液をクロロホルム
の３００ｍＬに添加して、沈殿した白色結晶を濾取し
た。これをエーテル、少量の冷メタノールで洗浄し、５
ｇのＬＡ−ＥＤを得た。

【００４３】（ｂ）ＬＡ−ＡＧの合成 アルギン酸をＴＥＭＥＤ緩衝液（ｐＨ４．７）５０ｍＬ
に溶解し、縮合剤として水溶性カルボジイミド（ＷＳ
Ｃ）の０．９７ｇを加えて、１時間、室温で撹拌反応さ
せた。この溶液に、上記で得られたＬＡ−ＥＤの２ｇを
加えて、３日間、室温で撹拌反応させた。この溶液を純
水２０Ｌ（リットル）に対して透析を行い、透析終了
後、凍結乾燥して目的物を得た。この目的物の ¹Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルから、２．６９ｐｐｍエチレンジアミン
ＣＨ₂ ＣＨ₂ 、３．２５ｐｐｍアミドＮＨ、３．５−
４．５ｐｐｍラクトース、及びアルギン酸糖鎖が観測さ
れ、この目的物がＬＡ−ＡＧであることを確認した。糖
鎖の導入量は、約１５％と計算された。

【００４４】［実施例２］ＬＡ−ＡＧビーズを用いた肝
実質細胞の培養 （ａ）肝実質細胞の採取 肝実質細胞は、文献（A. Kobayashi, M. Goto, K. Koba
yashi, T. Akaike, J.Biomater. Sci. Polymer Edn, 6,
325-342 (1994)）記載の方法に従ってマウス肝臓より
採取、単離した。単離した肝実質細胞は、５％ウシ胎児
血清を含むウィリアムの培地Ｅで希釈して用いた。

【００４５】（ｂ）細胞含有ＬＡ−ＡＧビーズの作成 アルギン酸（１％、ｗ／ｖ）とＬＡ−ＡＧ（１％、ｗ／
ｖ）の混合生理食塩水溶液に、ウシ血清（ＦＣＳ：５
％、ｖ／ｖ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ：２０ｎｇ／
ｍＬ）、インスリン（Ｉｎｓ．：１０^-8Ｍ）をそれぞれ
括弧内に示した量となるように添加し、細胞濃度が８０
万ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように肝実質細胞を混合し
た。この細胞溶液を注射器に入れ２６（Ｇｘ1/2”)の針
を用いて１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液中に滴下し
て、ゲルビーズを形成させた。これにより平均直径約３
ｍｍのゲルビーズが作成される。このビーズは、５分間
以上インキュベートしてゲル化させている。

【００４６】次に、ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）で数
回洗浄した後、生理食塩水でさらに数回洗浄した。次
に、ゲルビーズ表面を０．０５％のポリ−Ｌ−リシン生
理食塩水溶液で５分間処理した後、生理食塩水で数回洗
浄した。次いで、ゲルビーズ表面を０．１５％のアルギ
ン酸水溶液で５分間コートした後、生理食塩水で数回洗
浄した。さらに、このビーズを５０ｍＭのクエン酸ナト
リウム水溶液で５分間処理した後、生理食塩水で３回洗
浄し、細胞含有ＬＡ−ＡＧビーズを作成した。ＬＡ−Ａ
Ｇに導入する糖鎖の含有量によっては、ＬＡ−ＡＧとア
ルギン酸とを混合せずに、ＬＡ−ＡＧ単独でビーズに付
形することも可能である。

【００４７】なお、比較のために、上記したアルギン酸
とＬＡ−ＡＧの混合生理食塩水溶液に代えて、アルギン
酸のみの生理食塩水溶液（２％、ｗ／ｖ）を用いて、上
記と全く同様に処理し、細胞含有アルギン酸ビーズを作
成した。

【００４８】（ｃ）細胞含有ＬＡ−ＡＧビーズの培養 上記で得られた細胞含有ＬＡ−ＡＧビーズを、 ＦＣＳ
（５％、ｖ／ｖ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｉｎ
ｓ．（１０^-8Ｍ）を添加したＬ１５培地で培養し、ビー
ズに内包された肝実質細胞の機能を評価した。比較のた
めに、細胞含有アルギン酸ビーズについても同様に培養
し、ビーズに内包された肝実質細胞の機能を評価した。

【００４９】（ｅ）肝実質細胞機能の評価 ゲルビーズ中の肝実質細胞の機能は、肝実質細胞から産
生されるアルブミンの量から評価した。アルブミンの測
定は、アルブミン測定キット（米国、バイオラド社製）
を用いて定法に従って行った。

【００５０】アルブミンの産生量を測定した結果を図１
に示す。ＬＡ−ＡＧゲルビーズで培養した肝実質細胞
は、培養８日目で０．０１５８μｇ／ｍＬのアルブミン
産生量であったのに対し、アルギン酸のみのゲルビーズ
で培養したものは、０．００７６５μｇ／ｍＬとなっ
た。このことから、ＬＡ−ＡＧゲルビーズで培養したも
のの方が、肝実質細胞の機能が維持、向上されているこ
とがわかる。

【００５１】また、ＬＡ−ＡＧゲルビーズ内で肝実質細
胞を培養した場合には、培養３日目から細胞数個からな
る細胞集合体が観察され、細胞の移動増殖が促進されて
いることがわかる。

【００５２】さらに肝実質細胞の顕微鏡観察から、肝実
質細胞を二次元形状のコラーゲンコートシャーレ上で培
養した際にみられる伸展した形態（図２の顕微鏡写真参
照）とは異なり、三次元形状のＬＡ−ＡＧゲルビーズで
培養した場合には球状の形態（図３の顕微鏡写真参照）
を取っていることが明らかとなった。このことから、Ｌ
Ａ−ＡＧゲルビーズ内で肝実質細胞を培養した場合に
は、生体内での肝実質細胞の形態が維持されていること
がわかる。

【００５３】［実施例３］ＬＡ−ＡＧスポンジを用いた
肝実質細胞の培養 （ａ）ＬＡ−ＡＧスポンジの作成 文献（L. Shapiro, S. Cohen, Biomaterials, 18, 583-
590(1997)）記載の方法に従って行った。即ち、ＬＡ−
ＡＧ（１％、ｖ／ｖ）とアルギン酸（１％、ｗ／ｖ）混
合水溶液を２４穴マルチプレートに１ｍｌ添加し、同量
の０．０１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム水溶液をゆっく
り添加した。これをホモジナイザー（６Ｇ、３１８００
ｒｐｍ）にて３分間ミキシングした後、−１８℃のフリ
ーザーで凍結させ、次いで凍結乾燥することにより、Ｌ
Ａ−ＡＧスポンジを作成した。

【００５４】比較のために、ＬＡ−ＡＧとアルギン酸の
混合水溶液に代えて、アルギン酸のみの水溶液（２％、
ｗ／ｖ）を用いて上記と全く同様に処理して、アルギン
酸スポンジを作成した。

【００５５】（ｂ）スポンジ上での肝実質細胞培養 実施例２に記載の方法によりマウス肝実質細胞を採取、
単離し、この細胞を、ＦＣＳ（５％、ｖ／ｖ）、ＥＧＦ
（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｉｎｓ．（１０^-8Ｍ）をそれぞれ
括弧内の量となるように含んだウィリアム培地Ｅに添加
し、細胞濃度が８０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにス
ポンジ上に播種した。これを所定時間インキュベートし
て、スポンジ上で培養された肝実質細胞の機能をアルブ
ミン産生量の測定により評価した。

【００５６】ＬＡ−ＡＧスポンジで培養した肝実質細胞
は、培養８日目で０．０１４４μｇ／ｍＬのアルブミン
産生量であったのに対し、アルギン酸のみのスポンジで
は０．００５４４μｇ／ｍＬとなった。

【００５７】［実施例４］ＬＡ−ＨＡスポンジを用いた
肝実質細胞の培養 （ａ）ＬＡ−ＨＡの合成 実施例１のＬＡ−ＡＧ合成方法に準じて行った。即ち、
ヒアルロン酸をＴＥＭＥＤ緩衝液（ｐＨ４．７）５０ｍ
Ｌに溶解し、縮合剤としてＷＳＣの０．９７ｇを加え
て、１時間、室温で撹拌反応させた。この溶液に、実施
例１で得られたＬＡ−ＥＤの２ｇを加えて、３日間、室
温で撹拌反応させた。この溶液を純水２０Ｌに対して透
析を行い、透析終了後、凍結乾燥して目的物を得た。こ
の目的物の ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、２．０ｐｐｍ
ヒアルロン酸のＣＨ₃ 、３．３０ｐｐｍアミドＮＨ、
３．３−４．６ｐｐｍラクトース、及びアルギン酸糖鎖
が観測され、この目的物がＬＡ−ＨＡであることを確認
した。糖鎖の導入量は、約１３％と計算された。

【００５８】（ｂ）ＬＡ−ＨＡスポンジの作成 文献（J. R. Glass, at el., Biomaterial, 17, 1101-1
108(1997)）記載の方法に従って行った。即ち、ＬＡ−
ＨＡ（１％、ｗ／ｖ）及びヒアルロン酸（１％、ｗ／
ｖ）を混合し、０．５％水酸化ナトリウム水溶液に分散
させた。この分散液に１，４−ブタンジエタノールジグ
リシジルエーテル（架橋剤）０．５μＬを加え、１６時
間反応させた。反応液を透析した後、−２０℃のフリー
ザーで凍結させ、次いで凍結乾燥することにより、ＬＡ
−ＨＡスポンジを作成した。

【００５９】比較のために、ＬＡ−ＨＡとヒアルロン酸
に代えて、ヒアルロン酸のみを用いて上記と全く同様に
処理して、ヒアルロン酸スポンジを作成した。

【００６０】（ｃ）スポンジ上での肝実質細胞培養 実施例２に記載の方法によりマウス肝実質細胞を採取、
単離し、この細胞を、ＦＣＳ（５％、ｖ／ｖ）、ＥＧＦ
（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｉｎｓ．（１０^-8Ｍ）をそれぞれ
括弧内の量となるように含んだウィリアム培地Ｅに添加
し、細胞濃度が８０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにス
ポンジ上に播種した。これを所定時間インキュベートし
て、スポンジ上で培養された肝実質細胞の機能をアルブ
ミン産生量の測定により評価した。

【００６１】ＬＡ−ＨＡスポンジで培養した肝実質細胞
は、培養８日目で０．０１６６μｇ／ｍＬのアルブミン
産生量であったのに対し、ヒアルロン酸のみのスポンジ
では、０．００４８３μｇ／ｍＬとなった。

【発明の効果】本発明の三次元細胞培養基材は、細胞に
より特異な認識性を有する糖鎖を側鎖として結合した糖
鎖高分子からなるものであるため、かような細胞培養基
材を用いて細胞を培養することにより、細胞と糖鎖との
特異的相互作用に起因して、細胞の生着、増殖を促進さ
せ、細胞機能を維持、向上させ、細胞形態を生体内に近
い形態に保持することができる。従って、生体内と同様
な増殖性および機能を維持した任意の形態の細胞を得る
ことが可能となり、例えばハイブリッド型人工肝臓等に
応用することも可能となる。

【００６２】さらに本発明の細胞培養基材は、糖鎖を結
合していないアルギン酸やヒアルロン酸等の糖鎖高分子
と同様に、容易に三次元形状を付与することができる。
特に、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン及びそれら
の誘導体からなる糖鎖高分子を用いれば、糖鎖を容易に
側鎖として導入することができ、製造コストも比較的安
価であるためディスポーザブルな製品とすることもでき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＬＡ−ＡＧゲルビーズとアルギン酸のみのゲル
ビーズについて、アルブミン産生量と培養日数の関係を
示すグラフである。

【図２】コラーゲンコートシャーレ上で培養した肝実質
細胞の形態を示す顕微鏡写真である。

【図３】ＬＡ−ＡＧゲルビーズで培養した肝実質細胞の
形態を示す顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B029 AA21 BB01 BB11 CC02 CC10 CC13 4B065 AA91X AC14 BB01 BC01 BC42 BC46 BC47 CA24 CA46 CA60

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１種類の糖鎖をスペーサー分
   子を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細
   胞培養基材を、三次元形状に付形したことを特徴とする
   三次元細胞培養基材。
2. 【請求項２】 少なくとも１種類の糖鎖をスペーサー分
   子を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子と、糖鎖を
   側鎖として結合させていない糖鎖高分子との混合物から
   なる細胞培養基材を三次元形状に付形したことを特徴と
   する三次元細胞培養基材。
3. 【請求項３】 前記糖鎖高分子がカルボキシル基を有す
   る糖鎖高分子及びその誘導体であることを特徴とする請
   求項１または２記載の三次元細胞培養基材。
4. 【請求項４】 前記糖鎖高分子がアルギン酸及びその誘
   導体であることを特徴とする請求項３記載の三次元細胞
   培養基材。
5. 【請求項５】 前記糖鎖高分子がヒアルロン酸及びその
   誘導体であることを特徴とする請求項３記載の三次元細
   胞培養用基材。
6. 【請求項６】 前記糖鎖高分子がペクチン酸及びその誘
   導体であることを特徴とする請求項３記載の三次元細胞
   培養基材。
7. 【請求項７】 前記糖鎖高分子が、２種類以上の糖鎖を
   側鎖として結合させた糖鎖高分子であることを特徴とす
   る請求項１〜６のいずれか一項記載の三次元細胞培養基
   材。
8. 【請求項８】 前記スペーサー分子がジアミンである請
   求項１〜７のいずれか一項記載の三次元細胞培養基材。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一項に記載した
   三次元細胞培養基材を用いて細胞を培養することによ
   り、細胞の増殖性、形態および機能を維持、向上させる
   ことを特徴とする細胞培養方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか一項に記載の
    三次元細胞培養基材の２種類以上を混合した細胞培養基
    材を用いて細胞を培養することにより、細胞の増殖性、
    形態および機能を維持、向上させることを特徴とする細
    胞培養方法。