JP2000513214A - 軟骨内及び骨軟骨欠損を修復するための軟骨組織及びインプラントの製造方法並びにその方法を実施するための配置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本書に記載の方法は、軟骨及び少なくとも部分的に軟骨からなるインプラントの生体外製造に役立つ。本方法は、軟骨の細胞外基質を形成することができ、そうでなければ空の細胞隙（１）内に置かれ、軟骨の細胞外基質を形成するためにこの細胞隙（１）内に放置される、生きている細胞に基づいている。細胞隙内には１立方センチメートル当たり約５×１０⁷〜１０⁹個の細胞を含有するために必要な多数の細胞が導入される。細胞隙（１）は、少なくとも部分的に、細胞隙（１）を取り囲んでいる培地隙（２）から半透性壁（３）又は対流障壁として機能する開放有孔壁によって分離されている。開放有孔壁は、骨代用物質から作られているプレート（７）の形状を取っていてよく、さらに細胞隙（１）の底部に向けて配置されていてもよい。これは、細胞がこのプレート（７）上に沈着させられることを惹起し、細胞隙（１）上で生じた軟骨は孔又は不規則性表面内へ増殖し、従って代用骨プレート（７）とこれを被覆する軟骨層とからなるインプラントが作られ、軟骨増殖の結果として明確な形状を有するインプラントの２つの部分が相互に適合する。

Description

【発明の詳細な説明】 軟骨内及び骨軟骨欠損を修復するための軟骨組織及びインプラントの製造方法並 びにその方法を実施するための配置 技術分野 本発明は医療工学の分野にあり、第１独立クレームの前提部分に記載の方法、 つまり軟骨内及び骨軟骨欠損を修復するための軟骨組織及びインプラントの製造 方法に関する。さらに、本発明は当該方法を実行するための配置及び当該方法に 従って製造されたインプラントに関する。 背景技術 軟骨組織は、実質的に軟骨細胞と細胞外基質とからなる。細胞外基質は主とし てＩＩ型コラーゲンとプロテオグリカン類とから成り、それらの構成要素は細胞 間腔内に浸出し、そこで集合して巨大分子を形成している。軟骨細胞は、成人の 軟骨組織の体積の約５％を占めている。 柔軟に接合した骨の末端を被覆している関節軟骨は、負荷がかかる関節におい て負荷配分の機能を引き受けている。この機能のために、軟骨組織は圧力下で水 分を吸収したり再び放出したりすることができる。さらに、軟骨面は関節におけ る滑面として機能する。 軟骨には血管が分布していないため、特に成人において、そして再生されなけ ればならない軟骨片が少量でも超えた場合には、再生能力は極めて不良である。 しかし、関節軟骨はしばしば、自然に再生される可能性がある量よりはるかに多 量に、磨耗又は加齢による変性を示したり、あるいは事故のための損傷すること がある。軟骨層のこの種の欠損は罹患した関節に疼痛性の運動及びひずみを作り 出し、さらに骨を被覆している軟骨層の欠損のために関節滑液が骨組織と接触す るようになることから引き起こされる例えば炎症のような合併症をもたらすこと がある。 これらの理由からこれまでは、欠けている又は損傷した軟骨、特に関節軟骨を 相応の手術によって取り替える又は修復するための努力が払われてきた。 関節軟骨又は関節軟骨とその下にある骨組織とに関する欠損を、できる限り精 密な形状の穴を形成するために欠損場所を研磨し、中ぐり（ボーリング）又は穴 あけ（パンチング）によって例えば同一関節のよりひずみの少ない場所から同一 形状の軟骨及び骨の柱を切除し、この柱を穴の中に挿入することによって修復す ることは知られている。同様の方法で、数個の穴があるもっと大きな欠損が修復 される（モザイク形成術）。これらの方法は成功が得られるが、実際の問題が関 節のひずみの生じた部分からその関節のよりひずみの少ない部分へ実質的に移動 するのであって、従って現実的には解決されない。 さらにまた、例えば出版物ＵＳ−３７０３５７５（Ｔｈｉｅｌｅ）には、純粋 に人工のインプラント（例、タンパク質及び多糖類を含有するゲル）を用いて軟 骨の欠損を修復することが提案されている。しかし、限定された成功しか達成さ れないことが証明されており、このため、近年の開発では特に活気のある自己又 は同族細胞を基礎とする様々な方向でこの問題に対する解決策が考えられてきた 。活性のある軟骨細胞又は軟骨細胞の機能を引き受けることのできる活気のある 細胞は、例えば生体外（in vitro）で培養され、その後に植え込まれる；又は活 気のある軟骨細胞が人工インプラントに導入される；又は活気のある軟骨組織が 少なくとも部分的に生体外で培養され、その後に植え込まれる。これは、これら の近年の開発における目的が活気のある軟骨を生体外で製造し、そうした軟骨を 植え込む、又は欠損部位に軟骨形成細胞を移植し、その後それらの細胞が少なく とも軟骨に類似する組織を作り上げることにあることを意味している。 そうした方法の例は下記の出版物に記載されている： ＵＳ−４８４６８３５（Ｇｒａｎｄｅ）に記載の方法に従うと、患者から採取 された軟骨細胞が単層培養で増殖させられるが、さらにそれ以上増殖させるため には、その後ゲル又はスポンジの形状の三次元コラーゲン基質内に導入され、そ れらはその基質内で定着して不動化する。細胞増殖の約３週間後には、軟骨欠損 場所はコラーゲン基質と細胞からなる物質で充填されている。インプラントを欠 損場所に保持するためには、骨膜片をそれらに被せて縫合する。この種の移植組 織片領域での軟骨再生は移植組織片を用いない場合よりかなり良好である。 ＵＳ−５０５３０５０（Ｉｔａｙ）に記載されている方法に従うと、軟骨細胞 又は軟骨細胞の機能を引き受けることのできる細胞が生体適合性吸収性基質（３ ２×１０⁶〜１２０×１０⁶／ｃｍ³）内に導入され、その基質内で細胞が不動化 される。この基質が植え込まれると、それによって軟骨様組織が生体内で形成す る。インプラントのために使用される軟骨細胞は、まず最初に単層培養で、その 後に懸濁させられて前もって培養され、それによって集合して３０〜６０ｃｅｌ ｌの集合体を形成する。 ＵＳ−４９６３４８９（Ｎａｕｇｈｔｏｎ）に記載されている方法に従うと、 やはり三次元人工基質がインプラントのための担体物質として使用される。この 基質は植込みに先行する細胞培養のために使用され、培養される細胞のより良好 な接着及びより良好な供給のために結合組織層で被覆される。三次元基質上での 生体外細胞再生後に、この基質が植え込まれる。植え込まれた細胞は生体内（in vivo）で軟骨組織を形成する。 ＰＣＴ−ＷＯ９０／１２６０３（Ｖａｃａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．）に記載され ている方法に従うと、やはり三次元基質が使用され、その基質は分解可能なポリ マー線維材料から構成されており、その基質上で細胞が定着する。基質上又は単 層細胞培養中で培養されてその後基質内に導入される細胞は、基質に付着させて 、従って不動化状態で植え込まれる。基質は生体内で分解され、細胞によって形 成される細胞外基質に徐々に置きかえられる。 ＵＳ−５３２６３５７（Ｋａｎｄｅｌ）に記載されている方法に従うと、軟骨 細胞は１．５×１０⁶ｃｅｌｌ／ｃｍ²の細胞密度を持つ単層のフィルター材料（ ０．４μｍの孔径を有するＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（登録商標）−ＣＭ）層に塗布さ れる。その単層の生体外培養は、その構造が明らかに天然軟骨に相当し、そうし たものとして植え込むことのできる薄い軟骨層を２〜４週間で産生する。 さらにまた、軟骨をいわゆる高密度細胞培養で培養できることも知られている 。細胞は担体に塗布され、単層培養のために使用されるより高密度で培養される 。培地は、細胞を担体上に載せてから１〜２時間後にのみ添加される。１〜３日 間の培養後、担体上の細胞層は収縮し、１ｍｍの範囲内の径を持ついわゆるミク ロスフェア（中心体）が形成される。さらに培養すると、これらのミクロスフェ ア の内側で軟骨様組織が形成され、それらの表面上では線維性軟骨（軟骨膜）が形 成される。インプラントのためには、この種の不均等質組織は適当ではない。 Ｓｉｔｔｉｎｇｅｒら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｏｌ．１７， Ｎｏ． １０，Ｍａｙ １９９６，Ｇｕｉｌｆｏｒｄ ＧＢ）は、生体外で軟骨を成長さ せるために活気のある細胞を三次元基質内に導入し、その後付加された基質を半 透膜内に封入することを提案している。軟骨成長中、この膜は細胞によって産生 され、細胞外基質を構成するために使用される化合物を培地が洗い流してしまう ことを防止する。この種の膜内に封入された細胞培養の植込みは、また免疫反応 を防止するためにも知られている。 上記に挙げた全ての方法は、少なくとも部分的に生体外で軟骨を製造する、つ まり人工条件下で活気のある天然細胞を使用して軟骨を製造することを試みてい る。これらの試みにおいて遭遇する問題は、これらの生体外条件における軟骨細 胞が比較的急速に線維芽細胞に脱分化する傾向を有しているという事実、又は極 めて特異的な培養条件下で線維芽細胞を軟骨細胞機能へ分化させることが可能で あるという事実にある。脱分化によって、軟骨細胞は中でも軟骨組織の最も重要 な化合物の１つであるＩＩ型コラーゲンを産生する能力を失う。 上記の方法に従うと、軟骨細胞の脱分化の問題は軟骨細胞を単層又は三次元基 質における相応して密な培養中に不動化することによって解決される。この方法 では軟骨細胞が実質的な脱分化を示すことなく繁殖し、天然軟骨の細胞外基質に 少なくとも類似する細胞外基質を形成することが証明されている。三次元基質は 主として細胞を不動化するためにだけ使用されるのではなく、上記の方法で製造 された軟骨組織のいずれもがまさに大きく低下したひずみにさえ抵抗できる安定 性を有していないので、植込み後に必要となる機械的安定性のためにも使用され る。 発明の開示 本発明の目的は、適切な軟骨組織又は少なくとも部分的にそうした軟骨組織か ら構成されるインプラントを生体外で製造できる装置を作ることであり、軟骨又 はインプラントは植込みのため、特に関節軟骨欠損における植込みに役立つ。こ の目的を達成するためには、生体外環境、つまりその環境において軟骨細胞又は 軟骨細胞の機能を果たす能力のある他の細胞が長期の培養期間に渡って脱分化せ ずにそれらの機能を積極的に実行する、又はその環境において細胞が分化して活 性な軟骨細胞になる、特に三次元のそうした環境を作ることが必要である。この 環境の問題を解決することによって、それらの天然機能に従って脱分化しない活 気のある軟骨細胞が軟骨に特徴的な細胞外基質を産生し、これと一緒に作られる べき軟骨組織を形成するので、目的の主要部分は達成される。 本発明に従って製造されるインプラントは、少なくとも部分的には生体外で製 造された軟骨組織から成り、特に軟骨内又は骨軟骨関節欠損の修復に適している 。それらはそうした欠損のあらゆる可能性のある深さに対して製造可能で、本発 明のインプラントを用いて修復された欠損は植込み後可能な限りすぐに通常の負 荷、つまり圧縮応力又はずり応力のいずれかによって作り出される負荷を支える ことができるようになる。 この目的は請求の範囲に規定されている方法によって達成される。 本発明の方法は、細胞によって産生して細胞外隙内に隔離される化合物の十分 な高濃度が短期間の初期に達成され、これが全培養期間に渡って維持されること が可能になれば、軟骨細胞は申し分のない軟骨組織を形成できるという所見に基 づいている。これらの条件下では、軟骨細胞の分化した機能が十分に保持される （それらが線維芽細胞に脱分化しない）、及び／又は相応する細胞、特に間葉幹 細胞又はその他の間葉細胞又は線維芽細胞さえ相応の機能へ分化させることが可 能である。 第１の条件は、少なくとも培養期間の開始時に細胞が細胞隙内で上記の濃度の ために必要な量の化合物を製造できるような密度の細胞が存在する細胞集団を作 ることによって満たされる。第２の条件は、上記の化合物が細胞外隙から洗い流 されることが防止される限定された細胞隙内に細胞集団を収容することによって 満たされる。 上記の化合物は特に、細胞外構造を作り上げるための構成要素として役立つ自 己分泌因子類及び物質類である。これらの構成要素は特に、プロテオグリカン凝 集体を作り上げるためのアグレカン類、結合タンパク質類及びヒアルロン酸塩類 、 及び最終的にはＩＩ型コラーゲン原線維を形成する予備段階のコラーゲン類であ る。 本発明に従うと、細胞は生体外培養に対して不動化されておらず、自由にでき る間隙、三次元の人工基質を含まずに上記の２つの条件が満たされている間隙、 しかし細胞が相互に対してどのように定着するかについては大きく細胞に任され ている間隙を有している。この種の自由な細胞隙においては、細胞はそれらの軟 骨細胞機能を十分に実践し、植込みのために十分な安定性を有していて植込み後 には通常の負荷の少なくとも一部を支えることのできる軟骨組織が培養され得る ことが明らかである。 本発明の方法に従うと、軟骨細胞機能を実践することのできる細胞が空の細胞 隙内に、つまり細胞隙において約５×１０⁷〜１０⁹ｃｅｌｌ／ｃｍ³の細胞密度 となるように培地だけを含有している間隙内に導人される。この密度はおよそ１ ０³μｍ³の細胞容量で約５％〜１００％の間隙占有率になる。 細胞隙は少なくとも部分的に透過性の壁を有しており、全培養期間を通して培 地が満たされている間隙内に導人され、培地は既知の方法で定期的に更新される 。培養期間中、細胞隙は培地内に静止させて配置される、又はその中で運動させ られる（細胞隙と細胞隙を取り囲んでいる培地との間の相対運動）。 細胞隙壁の透過性部分の透過性及び相対運動は、洗い流しの防止の条件が満た されるように細胞隙の相対寸法（再生される軟骨に依存する）に適合させられな ければならない。 全ての場合において、１０．０００〜１００．０００ダルトン（１０〜１００ ｋＤａ）の透過性を有する半透性壁領域（半透膜）が、特に攪拌培養及び大きな 寸法（の細胞隙三次元形態）にとって適当である。細胞外軟骨基質の巨大分子を 作り上げるための上記の自己分泌因子及び構成要素は、上記の透過性を有する膜 を通過できないような分子量を有している。 静止培養及び少なくとも１つの小さな寸法（薄層）を備えた細胞隙のためには 、半透性壁としてではなく単に対流障壁として有効である相当に大きな孔（１０ 〜２０μｍの領域まで）を有する開放孔壁で十分であること、そしてもしかする と細胞隙は一方の側で開放していてよいことが明らかである。 特に、運動させられず、所定密度範囲より下の領域内の密度で細胞を含有して いる細胞隙では、細胞は重力の方向で定着し、層の形で軟骨組織を形成する。よ り多くの三次元軟骨形状を産生させるためには、攪拌細胞隙が有利であることが 明らかである。 特異的培養及び特に特異的形状及びサイズの細胞隙に対しては、実験によって 最適配置（培地中での細胞隙の運動を伴う、又は伴わない）及び細胞隙の壁又は この壁の透過性部分各々の最適条件が決定されなければならない。 細胞隙は実質的に３つの機能を有している： −−細胞隙は、細胞が細胞の特異的機能性を失わないように十分な密度で（不 動化されていない）細胞の集団を１つにまとめて保持する； −−細胞隙は、細胞隙の形状を選択することによって形成される軟骨の形状が 制御されるように軟骨の増殖を制限する； −−細胞隙壁は、細胞への培地の供給を許容するが、細胞によって産生され、 軟骨の成長のために必要な物質の洗い流しを防止する。 部分的にのみ軟骨組織からなるインプラントを製造するためには、細胞隙の透 過壁の一部は下記により詳細に記載されるインプラント部分の機能を追加して有 することができる。 細胞隙内に持ち込まれるべき細胞は、軟骨細胞、間葉幹細胞又は他の間葉細胞 である。これらの細胞型は、軟骨組織、骨もしくは骨髄又は結合組織もしくは脂 肪組織から既知の方法で単離される。線維芽細胞の軟骨細胞への分化に影響を及 ぼす因子類が培地又は細胞隙に添加される場合、又はそれらが細胞隙に持ち込ま れる前に細胞がこの種の因子を用いて処理される場合は、線維芽細胞もまた適し ている。細胞はまた、細胞隙内に持ち込まれる前に生体外で増殖させることもで きる。 ドナー組織から特定の細胞型を単離することは必要ではない、つまりそうした 組織に通常含有されている種々の細胞の混合物をそうしたものとして細胞隙内に 持ち込むことができる。さらにまた、ドナー組織の細胞内基質からの細胞の完全 な分離もまた必要とされず、従っておそらく組織粒子又は分離された細胞と組織 粒子との混合物を細胞単独の代わりに細胞隙内に持ち込むことができることも明 らかである。しかし、例えば短時間の酵素分解によりもしかすると細胞外基質か ら細胞を部分的に分離することによって細胞隙内で必要な細胞密度を達成するこ とに注意を払わなければならない。 有利にも５〜１５％の血清が添加されている例えばＨＡＭ−Ｆ１２のような既 知の培地を用いると良好な結果を達成できることが明らかである。さらに、既知 の成長因子及び細胞の再生及び軟骨基質の形成を支援するその他の培地の構成要 素を培地に添加することができる。 本発明に従って作られた培養条件においては、軟骨細胞は生体活性のままであ って脱分化しないので間隙が約３週間の範囲内の培養期間中は軟骨組織で満たさ れていることが明らかである。形成されつつある軟骨組織は十分な機械的強さを 獲得するとすぐに細胞隙から取り出すことができ、例えばさらに培地中で自由に 浮遊させて培養することができる、又は使用直前まで細胞隙にとどまらせておく ことができる。 本発明の方法に従って製造される軟骨組織は、インプラント部分としてのイン プラントとして、もしくは自己細胞を含有しているときは細胞自己組織移植片と して使用される、又は科学的な生体外試験目的にも使用することができる。 下記の図は本発明、本発明を実行するための配置並びに本発明の方法によって 製造するインプラントの例を図示している。図示されている実施例は、関節にお ける軟骨内及び骨軟骨欠損の修復のためのインプラントである。しかし、本発明 を使用すると、さらにまた形成手術のための例えば耳介骨又は軟骨のようなその 他のインプラント、例えば鼻軟骨、眼窩底、耳甲介又はそれらの部分を製造する ことも可能である。 図面の簡単な説明 図１〜４は、軟骨組織の生体外製造のために本発明の方法を実行するための４ 種の例示的な配置（断面）を示している。 図５〜７は、天然関節軟骨と比較した種々の実験的軟骨培養（本発明に従った 培養及び既知の方法に従った参照培養）のコンドロイチン及びコラーゲン含量を 示している。 図８及び９は、本発明の方法に従って製造された軟骨の機械的特性を例示する ために、そうした軟骨を歪ませる力（図８）及び天然軟骨を歪ませる力（図９） を示している。 図１０〜１３は、本発明に従って製造されたした軟骨及び天然軟骨の光学顕微 鏡写真及び電子顕微鏡写真を示している。 図１４は、図２又は３に図示されている本発明に従って製造されたインプラン トを通しての断面を示しており、このインプラントは担体層と軟骨層とを含んで いる（２つの層の間の境界領域でのこれらの層に垂直な断面）。 図１５及び１６は、図１４に従った本発明のインプラントの実施態様を軟骨層 に垂直な断面で示している。 図１７〜２０は、本発明の方法に従って製造されたインプラントの軟骨内及び 骨軟骨関節欠損の修復のための適用の実施例を示している（軟骨層に垂直な断面 ）。 発明を実施するための最良の形態 図１は、本発明による軟骨組織の生体内製造のために、例示的な配置の断面を 示している。この配置は実質的に、その中に細胞が導入されており、培地隙２内 に配置されている限定された細胞隙１から構成される。細胞隙１と培地隙２との 間の境界の少なくとも一部は透過性壁、例えば半透膜３によって形成されている 。細胞隙１を培地隙２から分離している境界の残り部分は透過性ではなく、細胞 隙１に所定の形状を与え、半透膜を適所に保持する例えばプラスチック成分から 構成されている。 図示した実施例では、１個のインナーリング４と２個のアウタースナップリン グ５及び６が半透膜の２つの例えば実質的に円形部分と一緒に円形デイスクの形 状で細胞隙１を取り囲んでいる。 半透膜３は１０．０００〜１００．０００ダルトンの透過性を有している。こ れは例えば相応する透析用チューブと同一材料から構成される。 図１に示したのと同一方法でほとんどの様々な形状の細胞隙を作ることができ 、その間隙内に細胞を導入すると、その間隙においてこれらの細胞が軟骨組織を 作 り上げ、軟骨組織が実質的に細胞隙１の形状又は培養期間中に重力の方向へ下方 に向く細胞隙１の一部分の形状を呈することは明白である。 培地隙２は、既知の方法で培地が定期的に交換される自由に選択可能な間隙で ある。細胞隙１を培地隙２内で動かさなければならない場合は、培地隙は例えば スピナーボトルである。 図１に従った配置を用いると、本発明の方法は例えば下記のように実行される ： −−上記で詳細に説明した細胞、組織粒子又は細胞及び／又は組織粒子の混合 物を例えば培地中に懸濁させ、細胞密度が５×１０⁷〜１０⁹ｃｅｌｌ／ｃｍ³の 範囲内となるように自由な細胞隙内に導入する。 −−細胞隙を閉鎖し、培地隙内に導入し、約３週間の範囲内の期間に渡ってそ こに放置する。 −−細胞隙内で形成された軟骨組織を細胞隙から取り出し、培地上で自由に泳 がせながら培養するか、又はインプラントもしくは組織移植片として又は科学的 研究のために各々直接に使用する。 図１に従った細胞隙においては、軟骨組織からなるインプラント、例えば耳介 骨、鼻軟骨、眼窩低又はそれらの部分が製造される。 図２は、本発明の方法を実行するための別の細胞隙の実施形態を示している。 細胞隙１は扁平で、一方の側はおそらく生物学的に分解可能な骨代用物質から作 られた開放有孔性の剛性又は可塑性に変形可能なプレート７によって限定されて おり、他方の側は透過性壁、例えば半透膜３又はより粗い多孔性壁によって限定 されている。細胞隙は高さが例えば約３〜５ｍｍで、あらゆる扁平な形状及び範 囲を有している。 図２に示した細胞隙は、特に骨軟骨欠損の修復のためのインプラント製造のた めに適している。インプラントは、扁平な細胞隙において増殖した軟骨組織だけ ではなく代用骨プレート７を含有している。従って、この代用骨プレート７は実 質的に２つの機能を有している：軟骨の成長中には細胞隙のための透過膜として 機能し、完成インプラントにおいては軟骨層のための付着基板として機能し、そ れによって植込み後はこの骨代用物は隣接する活気のある骨組織から入植する細 胞によって既知の方法で転移増殖される。 代用骨プレート７が上記の第２の機能を満たすことができるためには、培地隙 内の細胞隙の相応する配置によって、少なくとも初期細胞密度が細胞が定着傾向 を有するようなものである場合に対しては、細胞が代用骨プレート７の内面全体 に定着するように注意を払わなければならない。このために、細胞隙１は例えば 図２に示されているように、重力の影響のために細胞が代用骨プレート７上に定 着するように代用骨プレート７を下方に向けて静止するように配置されている。 さらに、代用骨プレート７は、細胞隙１内で成長する軟骨組織が中間領域にあ る代用骨プレート７と一緒に成長できるように、従ってずり応力に抵抗できる２ パートインプラントを形成するように形成しなければならない。この種の一緒に 成長することは、その上で軟骨が培養される代用骨プレートの少なくとも１つの 面の多孔性を、細胞外内骨基質内で作り上げられたコラーゲン原線維が孔内へ増 殖でき、骨代用坂内に新規軟骨をそのように固定できるように選択することによ って達成される。コラーゲン線維のこの種の固定のためには約１〜２０μｍの孔 が適切であることが明らかである。 さらに、軟骨を培養するために代用骨プレートの表面上に持ち込まれる細胞の 一部が不均一な場所又は孔に定着する場合は、増殖しつつある軟骨組織増殖があ る種の積極的な係合でこれらの不均一な場所及び孔において骨代用物質に連結し ているのが有利である。細胞は、不均一な場所又は少なくとも２０μｍ、理想的 には２０〜５０μのサイズを有している孔ではこれらが容易に定着することが明 らかである。 このため、代用骨プレート７は下記の条件を満たしていなければならない： −−細胞が代用骨プレートを通して培地から栄養供給を受けることができるた めに、代用骨プレートは連続管を形成する孔を含有していなければならない（開 放有孔性、open porosity）。 −−代用骨プレートが少なくとも大きな分子の洗い流しに対する対流障壁とし て役立つためには、孔は大きすぎてはならず、プレートの厚さは小さすぎてはな らない。 −−増殖している軟骨組織において作り上げられているコラーゲン原線維がプ レートの孔に付着させられるためには、孔は２０μｍ以下でなければならない。 −−細胞が代用骨プレートの表面上の不均一な場所又は孔で定着できるために は、成長しつつある軟骨層に面する表面の少なくとも一部分がそうした不均一な 場所又は少なくとも約２０μｍのサイズを有する表面孔（表面粗さ）を備えてい れなければならない。 相応して粗い表面を有し、２〜２０μｍの範囲内の孔径の開放有孔性を有し、 さらに０．５〜３ｍｍ、有利には０．５〜１．５ｍｍの厚さする代用骨プレート を用いると、申し分のない結果を達成できることが明らかである。約０．５〜１ ｍｍより大きな厚さのプレートを用いた場合は、代用骨プレートに面していない 領域もまたより粗い多孔性、例えば骨代用物質から既知であるような３００〜７ ００μｍまでのサイズの孔を有することができる。この種の多孔性は骨代用材料 の生体内血管分布に有利である。 骨代用物質としては、上記の開放有孔性を有し、剛性又は可塑性に変形可能な プレートへ加工処理できる有益にも生物学的に分解可能なそうした材料である、 既知の骨誘導性及び／又は骨伝導性材料が適切である。可塑性に変形可能なプレ ートは例えばＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及びヒドロキシアパタイト、又 はポリ乳酸から製造することができる。剛性プレートはリン酸三カルシウム、ヒ ドロキシアパタイト又は他の無機骨代用物質から形成することができる。 付着因子を用いての代用骨プレート７の処理は不必要である。 相応する開放有孔性の代用骨プレート７を含有する図２に従った細胞隙では、 生体外で軟骨組織が成長するだけではなく、前形成された一緒に成長する軟骨／ 骨中間領域を含有するインプラントも製造される。 図３は、本発明の方法を実施するためのさらに別の例示的な配置を示している 。原理的には、これは図１及び２に従った配置において実施される方法の組合せ である。代用骨プレート７は細胞隙１の透過壁の一部としては配置されておらず 、細胞隙が例えば半透膜３によって限定されている細胞隙内に存在する。この種 の配置においては、代用骨プレート７が対流障壁の機能を引き受ける必要がない こと、及びこのためにプレートの多孔性及び厚さを極めて自由に選択できること が明白である。 図３に示した配置は特に、細胞隙壁として取り扱うには複雑な、薄い、可塑性 に変形可能な代用骨プレート７に適切である。 図４は、代用骨プレートと一緒に成長させられる極めて薄い軟骨層を培養する ために特に適している細胞隙１のさらに別の実施形態を概略的に示している。図 １〜３に記載の細胞隙とは反対に、図４における細胞隙は少なくとも初期１〜２ 週間中は培養が静止培養条件下で発生しなければならないように上方に向かって 開口している。類似の既知の配置（例えばＵＳ−５３２６３５７，Ｋａｎｄｅｌ ）とは反対に、代用骨プレート７は細胞のための担体として備えられており、細 胞は単層としての担体には塗布されておらず、付着因子の助けを借りて不動化さ れてもいない。 図５〜７は、本発明の方法（実質的に図１に略述した実験的配置）を用いた実 験の結果を示している。半透膜として透析用チューブを使用した。 軟骨細胞は既知の分離方法を用いてウシ肩関節から分離した。これらの細胞を 透析用チューブ内に導入し、これらを培養期間中にスピナー・ボトルに移動させ たところ、それによって細胞はチューブの最も下の端部上に定着した。５〜１５ ％の血清を含有するＨＡＭ−Ｆ１２を培地として使用した。この培地は２日間お きに取り換えた。 図５は、本発明の方法に従って製造された軟骨組織の培養期間（２０、２９及 び４９日間）の長さの関数としての硫酸コンドロイチン及びコラーゲン含量をウ シ（年齢：１８月齢）肩関節から採取した軟骨の相応する数値と比較して示して いる。結果は、天然軟骨におけるより生体外製造軟骨における方が硫酸コンドロ イチンの含量が高いこと、しかしコラーゲン含量は相当に低いことを示している 。 図６及び７もまた、培養期間（０、７、２０及び４０日間）の長さの関数とし ての、参照培養Ａ及びB中、及び本発明の方法に従って製造された軟骨組織（Ｃ ：定着した細胞の領域における細胞隙中の軟骨増殖；Ｄ：定着した細胞の上方の 細胞隙中の培地）の４０日間の培養期間後の硫酸コンドロイチン（図６）及びコ ラーゲン（図７）含量を示している。参照のために、軟骨細胞をアルギン酸塩球 中に包埋し、静止培養（参照Ａ）及びスピナー・ボトル（参照Ｂ）中で培養した 。 図６及び７により、本発明に従った実験装置における軟骨構造を用いると参照 実験におけるより相当に大きな成功が得られることが明白である。 図８及び９は、本発明に従って製造された軟骨（培養条件については上記参照 ）の機械的特性を例示するために、本発明に従って製造された軟骨（図８）及び 天然軟骨（図９）について実施された応力実験の結果を天然ウシ軟骨の機械的特 性と比較して示している。実験は一定速度（１μｍ／ｓ）を用いて軟骨にパンチ を押し入れ、パンチ力を記録しながら２００μｍの貫入深さでパンチを停止させ ることから構成されている。この力は最初は貫入深さにほぼ比例して上昇するが 、パンチの停止後は減少する（軟骨組織の液体損失のための粘弾性力低下）。 ２枚の図８及び９は、時間（ｓ）の関数としてのニュートン（Ｎ）で表したパ ンチ力を示している。図８では、貫入深さ（行程）の記録はμｍで示されている 。 本発明に従って製造された軟骨を用いての応力実験（図８）を径２０ｍｍを有 するパンチを用いて実行したところ、約０．８Ｎ／ｃｍ²の最大圧を示した。天 然軟骨を用いた実験を径５ｍｍを有するパンチを用いて実行したところ、約３０ Ｎ／ｃｍ²の最大圧を示した。 本発明に従って製造された軟骨の相当に小さな最大圧は、図１０〜１３と関連 させて説明することができる。これらの図は本発明に従って製造された軟骨（図 １０及び１１）及び中間帯からのヒト軟骨（図１２及び１３）の光学顕微鏡写真 （図１０及び１１）及び電子顕微鏡写真（図１２及び１３）を示している。 図１０及び１１は明白に、本発明の方法に従って製造された軟骨が生体外で培 養された軟骨にとっての成長段階と解釈できる天然軟骨より相当に多量の軟骨細 胞を含有していることを示している。軟骨細胞中にオルガネラ（細胞小器官）（ 矢印でマークされている）を容易に視認できる図１２及び１３によって同様の解 釈が示唆されている。天然軟骨においては、オルガネラは細く、合成活性がほと んどないことを示唆している。本発明に従って製造された軟骨においてはそれら は顕著に拡大しており、強度の合成活性を、つまり成長段階を示唆している。 本発明に従って製造された軟骨組織についてのさらに詳細な電子顕微鏡による 検討では、コラーゲン原線維が密な網を形成しているが、それらは天然軟骨（成 長完了後）におけるよりはまばらであること、そしてそれらは任意の方向に配列 されていることが示されている。このため、本発明に従って製造される軟骨組織 はある種の未発達の、しかし生体内で（植込み後に）「成熟」軟骨に発達する能 力を有している軟骨組織であると見なされなければならない。 図１４は図２〜４のうちの１つに従っている配置において製造されたインプラ ントの軟骨組織と代用骨プレートの間の中間領域を通る組織学的切片（倍率約１ ００倍）を概略的に示している。軟骨組織１０及び代用骨プレート７は、代用骨 プレート７の不均一な表面場所内に軟骨組織が増殖しているために積極的な係合 手段で中間領域において相互に連結されている。 図１５及び１６は、図２〜４（軟骨層１０を通る断面）と結び付けて説明され た方法に従って製造されているインプラントの実施形態を例示的に示している。 これらのインプラントは、図１４に示されているように、軟骨組織が代用骨プレ ート７と一緒に増殖する中間領域を含んでいる。 ２、３週間の培養期間後、その上に増殖した軟骨層１０を含んでいる代用骨プ レート７が細胞隙の他の壁成分から分離される。植込み前に、軟骨層１０及び代 用骨プレート７から構成されるインプラントは、必要な場合は望ましいサイズ及 び形状に小さくされ、及び／又は骨代用物質の別の断片１２に固定させられる。 細胞隙から取り出したインプラントを加工処理するためには、例えば穴あけ、 レーザー切断又は研磨のような一般的外科方法を使用する。代用骨プレートを拡 大するには、既知の有益な生物学的に分解可能なセメントを用いて、類似の又は 相違する骨代用物質の別の断片１２を軟骨層１０の反対側の代用骨プレート７の 一方の側に付着させる。 植込み後には、天然環境からの骨形成細胞が代用骨プレート７及び付着させら れた断片１２の開放有孔性骨代用物質内に移動し、微小血管が材料の孔内へ増殖 する。この結果、天然骨組織が発達し、徐々に分解する骨代用物質（７、１２、 １３）に取って代わる。これによって、生体外で培養された軟骨が中間領域１１ において鉱化する（mineralized）ことが予測される。 図１７〜２０は、本発明のインプラントの例示的な実施形態を用いて修復され ている軟骨内及び骨軟骨欠損を示している。 図１７は、穿孔又は研磨によって作られた限定された形状を有する軟骨内欠損 、つまり天然軟骨層２０内に存在し、軟骨層２０の下の骨組織には影響を及ぼし て いない欠損を示している。この種の欠損は、ヒト症例では最大約３ｍｍの深さを 有しており、ある程度の軟骨表面に影響を及ぼす可能性がある。１片の軟骨組織 １０’が準備された欠損部内に挿入されているが、軟骨組織は例えば図１に従っ た配置において培養され、培養後に軟骨組織が必要なら切断又は穴あけによって 欠損部の形状に適合させられた。 欠損部にインプラントを申し分のなく固定させるためには、少なくとも小さな インプラントについては植え込み時にインプラントを弾性的に僅かに変形させる （押して適合させる）ことで十分である。もっと大きな欠損部については、イン プラントは既知の手段を用いて、例えば、インプラント上に縫合又は糊付けされ ている骨膜片を用いて、天然軟骨とインプラントの間に糊（例、フィブリン糊） を導入して、又はインプラントを周囲天然軟骨に縫合することによって固定する 。 図１８は、植込みのために限定された形状（骨組織における約１０ｍｍまでの 表面範囲、約３ｍｍまでの深さ）を有する開口部を穿孔することによって準備さ れている小さな骨軟骨欠損部、つまり天然軟骨組織２０だけではなくその下にあ る骨組織２１にまで影響を及ぼしている欠損部を示している。この欠損部は、１ 本又は数本のピンを用いてインプラントが固定される、図１５に従ったインプラ ントを用いて修復されている。２本のピンが示されている。１本のピン２２．１ は外科医によってその表面からインプラントを通して打ち込まれており、もう１ 本のピン２２．２は前もってインプラントの代用骨プレート７に配置されていて インプラントの表面を押すことによって骨に打ち込まれる。 明らかに、図１８に従った欠損部においてはピン以外の他の固定手段を用いて インプラントを固定することもまた可能である。 図１８から、修復された領域においては関節を歪ませるときに骨２１と軟骨２ ０の間の中間領域上で作用する相当に大きなずり応力が、生体外で成長した軟骨 層が代用骨プレート７と一緒に成長した場所である中間領域１１によって引き受 けられることを見て取ることができる。 図１８に示されているような生体外で培養された軟骨層１０と代用骨プレート ７からなるインプラントの代わりに、図１７に示されているのと同様の方法で、 同一欠損を充填物質で満たし、さらに生体外で（代用骨プレートを使用せずに） 培養された軟骨組織片を用いて修復することができる。そうした場合においてず り応力を引き受けるためには、例えばインプラントを通してまっすぐに到達する ピン２２．１が用意されなければならない。 図１９は、深さ２０〜３０ｍｍを有し、図１６に従った本発明のインプラント の植込みによって修復されている準備された骨軟骨欠損を示している。ずり応力 はやはり軟骨層１０と代用骨プレート７が一緒に増殖する領域によって引き受け られる。セメント結合部１３が天然骨２１内に配置されているので、ずりによっ て歪むことはなく、従ってピンによって強化される必要がない。 図１８に示されている修復は、孔の下部を骨代用物質で充填し、おそらくセメ ント層１３によって図１５によるインプラントを植え込むことによっても実施で きる。 より大きな骨軟骨欠損部に対しては、図１９に従った複数のインプラントを用 意できる（モザイク形成術）。 図２０は、大きくて深い骨軟骨欠損部を示している。これは極めて大きいので 修復されるべき軟骨領域をもはや均一な領域に近づけることができない。この種 の欠損部は、上記で指摘したように、モザイク形成術を用いて修復することがで きる。しかし、本発明のインプラントは表面サイズに関して限定されておらず、 代用骨プレート７は可塑性に変形可能な材料から作ることができるので、この欠 損部は図２０に従って図１５によるインプラントを用いてより容易に修復されて いる。このために、欠損部は骨２１内に数ミリメートルの深さ及び限定された形 状に切り開かれ、より深い領域にはプラスチック製骨代用物質が充填され、イン プラントが欠損部に配置されて適切な手段を用いて固定されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビットマン，ペドロ スイス チューリッヒ ツェーハー―8057 ゼミナールストラッサ 46 (72)発明者 マイニル―ヴァルレット，ピエール スイス ベルン ツェーハー―3005 ヴィ ルトストラッサ ９ (72)発明者 ザーゲル，クリストフ，ペー. スイス フリースヴィル ツェーハー― 3055 オーベレ シュミーデ（番地なし) 【要約の続き】 する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 軟骨組織及び軟骨組織を含有するインプラントを生体外で製造する方法 であって、前記方法が細胞外軟骨基質を産生する能力を有する生体の細胞から出 発しており、細胞が細胞隙１ｃｍ³当たり約５×１０⁷〜１０⁹ｃｅｌｌの細胞密 度で細胞隙（１）内に持ち込まれること、細胞外基質を形成するために細胞が細 胞隙（１）内に残されること、それによって細胞隙（１）が少なくとも部分的に これを取り囲んでいる培地隙（２）から半透膜壁又は対流障壁として機能する開 放有孔性壁によって分離されることを特徴とする方法。 ２． 細胞隙（１）内に持ち込まれる細胞が軟骨細胞、間葉幹細胞、線維芽細 胞又は前記細胞の混合物であること、又は少なくとも１つの前記細胞の型を含有 している組織粒子が細胞隙（１）内に持ち込まれることを特徴とする請求項１に 記載の方法。 ３． 細胞が細胞隙（１）内に持ち込まれる前に細胞培養で増殖させられるこ とを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４． 培養期間中に細胞隙（１）が培地隙（２）内に静止して配置される又は その中で運動させられること、及び少なくとも細胞隙壁の一部が１０．０００〜 １００．０００ダルトンの透過性を有する半透膜からなることを特徴とする請求 項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５． 骨代用物質から作られている開放有孔性の剛性又は可塑性に変形可能な プレート７が細胞隙内に配置されていることを特徴とする請求項４に記載の方法 。 ６． 細胞隙（１）が培養期間中に培地隙（２）内に静止して配置されている こと、及び少なくとも細胞隙壁の一部が約２０μｍの径の孔を有する開放有孔層 として設計されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方 法。 ７． 開放有孔層が骨代用物質から作られているプレート（７）であること、 及び細胞隙（１）内に持ち込まれた細胞がプレート（７）上で定着するようにプ レート（７）が配置されるように細胞隙（１）が配置されていることを特徴とす る請求項６に記載の方法。 ８． 半透膜（３）によって又は対流障壁として機能する開放有孔層によって 、取り囲んでいる培地隙（２）から少なくとも部分的に分離されている細胞隙（ １）を含んでいることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を 実施するための配置。 ９． 半透膜（３）が１０．０００〜１００．０００ダルトンの透過性を有す ることを特徴とする請求項８に記載の配置。 １０． 対流障壁として機能する層が１〜２０μｍの開放有孔性及び０．５〜 ３０ｍｍの厚さを有することを特徴とする請求項８に記載の配置。 １１． 細胞隙（１）が実質的に平行な２つの面を備えた扁平な形状を有して いること、及びこれら２つの面が半透膜（３）又は開放有孔層によって形成され ていることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の配置。 １２． 開放有孔層が生物学的に分解可能な又は分解不可能な骨代用物質から 作られた剛性又は可塑性に変形可能なプレート（７）であること、代用骨プレー ト（７）が細胞隙の底部を形成するように培地隙（２）内の細胞隙が配置されて いることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の配置。 １３． 代用骨プレート（７）が細胞隙の内側に面して少なくとも２０μｍの 範囲の粗さを備えた面を有していることを特徴とする請求項１２に記載の配置。 １４． 代用骨プレート（７）が細胞隙に面していない側で３００〜７００μ ｍの有孔性を有していることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の配置。 １５． 細胞隙が代用骨プレート（７）の外側でさらに透過性壁を含有してい ることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の配置。 １６． 細胞隙が請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の配置の一部である 、少なくとも部分的に開放有孔性骨代用物質からなる壁によって限定されている 細胞隙。 １７． その表面が生体外で培養された軟骨層（１０）で少なくとも部分的に 被覆されている開放有孔性骨代用物質から作られているプレート（７）を含有し ており、それによって前記軟骨層（１０）の軟骨組織が骨代用物質にこの物質の 孔及び表面不均一さ内に成長することによって固定されることを特徴とする請求 項５〜７のいずれか１項に記載の方法を用いて製造されるインプラント。 １８． 骨代用物質から作られているプレート（７）が、少なくとも軟骨層（ １０）に面する領域において、１〜２０μｍの径の孔を含有しており、０．５〜 ３０ｍｍの厚さを有していることを特徴とする請求項１７に記載のインプラント 。 １９． 骨代用物質から作られているプレート（７）が骨代用物質から作られ ている別の部分（１２）にセメント層（１３）によって連結されていることを特 徴とする請求項１７又は１８に記載のインプラント。 ２０． 剛性又は可塑性に変形可能であることを特徴とする請求項１７又は１ ８に記載のインプラント。 ２１． 軟骨内又は骨軟骨関節欠損を修復するためのインプラントを製造する ための請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。 ２２． 耳介骨、鼻軟骨、眼窩底、耳甲介又はそれらの部分を製造するための 請求項１〜４又は６のいずれか１項に記載の方法の使用。 ２３． 軟骨内又は骨軟骨関節欠損の修復のための請求項１７〜２０のいずれ か１項に記載のインプラントの使用。