JP2000508709A - スクアラート染料類および蛍光配列決定法におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規スクアラート染料、および該染料とヌクレオシドまたはヌクレオチドのような生物学的に重要な化学種との付加物を記載する。この付加物は核酸蛍光配列決定法に有用な性質を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 スクアラート染料類および蛍光配列決定法におけるそれらの使用 本発明は種々の生物学的用途における一種の染料の使用に関する。この染料の 一部は本質的に新規化合物と主張される。発明の背景 自動化蛍光法の発達はＤＮＡ配列決定研究においてデータ生成の増大をもたら した。Ｓｍｉｔｈらの米国特許第５，１７１，５３４号はＤＮＡ蛍光配列決定シ ステムを記載した。Ｗａｇｇｏｎｅｒらの米国特許第５，２６８，４８６号はあ る種のシアニン染料抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の性質を記載しており、ま たＭｉｄｄｅｎｄｏｒｆの米国特許第５，２３０，７８１号およびＰａｔｏｎａ ｙの欧州特許第６７０ ３７４号はＤＮＡ配列決定における種々のシアニン染料 の使用を記載している。Ｂｅｒｇｅｒらの欧州特許第２１４ ８４７号は、一部 の染料が、特定結合パートナーを含む分析物中にスクアラート基を含有する他の シアニン染料の使用を記載している。他のスクアラート染料はＰｅａｓｅらの米 国特許第４，８３０，７８６号および続く分割特許並びにＡ Ｊ Ｇ Ｍａｎｋ らのＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６７，１７４２−８に記載されている。Ｃ ｕｓｈｍａｎらのＷＯ９３／０９１７２およびＫｒｕｔａｋらのＷＯ９４／１９ ３８７は熱可塑性樹脂およびインキに使用するためのスクアラート基含有シアニ ン染料を記載している。 生物学的に重要な化学種（以後生体分子という）をなるべく早く検出する方法 および概して感度に対する要望ならびにとくにＤＮＡ配列決定およびＤＮＡマッ ピング実験に対する要望がある。本発明の要約 １つの態様において本発明は生体分子と下記のようなスクアラート染料との付 加物を提供する。生体分子の例はペプチド、タンパク質、抗体、ポリサッカリド および薬剤である。好ましくは生体分子はヌクレオシドまたはヌクレオチドもし くは類似体またはオリゴヌクレオチドである。ヌクレオシドまたはヌクレオチド の類似体はヌクレオシドまたはヌクレオチドの誘導体または酵素を変性もしくは 重合させる正常のヌクレオシドまたはヌクレオチドの核酸に対する生物学的活性 を抑制するかまたは模倣する他の糖−複素環式化合物であることができる。ヌク レオチド類似体の例は配列決定反応に用いられるような、たとえばジデオキシヌ クレオチドのような連鎖停止剤である。この付加物は式Ｑ−Ｎ−ＣＯ−Ｓｑを有 し、式中Ｑはヌクレオシドまたはヌクレオチドもしくは類似体またはオリゴヌク レオチド残基のような生体分子であり、またＳｑはスクアラート染料の残基であ って、両者はＱのアミン基とＳｑのカルボキシル基の間に形成するアミド結合に よって結合する。あるいはまた結合を、他のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド付加物として公知のようにカルボン酸もしくはその誘導体、イソシアナート 、マレイミド、ヨードアセトアミド、またはホスホルアミダイトのような官能基 と、アミン、チオール、ヒドロキシまたは他の基のような求核基との間に形成さ せることでき、それによって求核性または求電子性反応基を染料に結合させるこ とができる。あるいはまた心部分にＯ−アルキルまたはＯ−アルケニルまたはＯ −アルキニルを含有するが分子の残部に他の反応性官能基を有しない染料をアミ ンまたはチオールまたはアルコール基と反応させて生体分子との共有結合をつく ることができる。 別の態様では本発明は固体担体上に固定された種の標識化を提供する。この１ つの例は固定された標識化オリゴヌクレオチドモノマーまたはＤＮＡ自動合成に 用いられる一方のアーム（ａｒｍ）を固体担体に固定した二官能性誘導染料であ ることができる。あとの工程で標識化オリゴヌクレオチドを担体から切断する。 他の用途は不均一ルミネセンスに基づく分析において用いられる適当に誘導され た固体担体の標識化であることができる。この例では標識は担体から切断しても しなくてもよい。 別の態様では本発明は定義したような付加物を用いることを含む改良蛍光配列 決定法を提供する。 スクアラート染料はＥＰ２１４ ８４７に記載されており、その開示は参照に より本明細書に組み入れられる。本発明の主要な態様は付加物に用いるのにとく に適するスクアラート染料の一族および前記の改良蛍光配列決定法に関する。こ の態様によれば本発明は式（Ｉ）、（II）、（IIａ）、（III），（IV）または （IVａ）のスクアラート染料を提供する。 （式中、各Ｚは独立してＯまたはＳまたはＣＲ¹ ₂であり ｎ＝１−３、 Ｒ¹は低級アルキル（炭素数１−４）であり、 各Ｒ²は独立してハロゲン、アルコキシ、第一、第二および第三級アミノ、ニ トロ、ＳＯ₃ ^-、および−Ｒ³−Ｘのような電子供与および電子吸引基から選ばれ るか、または１ないし５個の正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖または直鎖状の 最大３０個の炭素原子であり、 各Ｒ³は独立してアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン（１−２０個 の炭素原子）から選ばれるか、または１ないし５個のエーテル状酸素原子または アリーレン環または正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖または直鎖状の最大３０ 個の炭素原子であり、 少なくとも１つのＸは、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ₂のような求核性官能基であ るか、あるいはまた求核基と反応することができる原子団であり、この場合にＸ は好ましくは下記： ＣＯ₂Ｈ、酸ハロゲン化物または酸無水物のような活性カルボニル、ＣＯ活性 エステル、ＮＣＳ、Ｏホスホルアミダイト、ＮＣ（Ｏ）ＣＨ₂Ｉおよび から選ばれ、 存在するいずれか他のＸは独立してＨおよびＳＯ₃ ^-およびスクアラート染料（ それによって式（Ｉ）、（II）、（IIａ）、（III）、（IV）および（IVａ）の モノマーとして示される染料のダイマーおよびオリゴマーが考えられる）または 他の蛍光色素の残基から選ばれ、 各ｓおよびｍは０、１または２であり、 ＡはＯ、ＮＲ⁴またはＳであり、 Ｒ⁴はアルキル、アルケニル、アルキニルまたはＨであり、そして 各Ｙは独立してＸまたはＨである）。 式（Ｉ）、（II）および（IIａ）の化合物において少なくとも１つの基Ｒ²は ＳＯ₃ ^-であることができる。Ｘがホスホルアミダイトであるときを除き（ＳＯ₃ ^- 基は任意であるとき）、水性溶剤中に優れた溶解度を与えるために好ましくは１ ないし５個のＳＯ₃ ^-基が存在する。 染料中のスルホン酸基の存在は幾つかの利点、すなわち水溶性の増大、光安定 性の向上、明るさおよび周囲との相互作用の電位低下を与える。 タンパク質、抗体、ＤＮＡおよびＲＮＡのような生体分子は本質的に水溶性で あって、生物学的環境中でその機能を行うことができる。たとえばエタノールの ような有機溶剤を加えて溶液から沈殿させることによって単離させるための周知 の方法がある。反応性染料によって生体分子を標識化できるためには染料分子自 身が標識化する生体分子を沈殿または変性させない水性環境または水性有機混合 環境中に可溶でなければならない。前記スクアラート染料におけるスルホン酸基 の存在はその水溶性を著しく高める。したがってスルホン酸基を欠く実施例１３ の比較研究のために合成したスクアラート染料は、Ｈ₂Ｎ−ＤＮＡプライマーを 標識化するためには実施例５に記載したようにジオキサンの添加を要することが 認められた。ＤＮＡの上首尾の標識化の程度はこのような手段によって達成され るかも知れないが、比較的高い有機含量はおそらくタンパク質の沈殿かまたは変 性をもたらすであろう。ベンズインドール誘導体から誘導された実施例１３のス クアラート染料（１３ｃ）は当初非蛍光性であると判明した。染料を１％ＳＤＳ 洗浄剤溶液中で沸騰させて凝集、したがって蛍光の半消滅を防止することによっ て蛍光性が回復した。このような凝集は写真工業におけるシアニン染料について 周知である（Ｗｅｓｔ，ＷおよびＰｉｅｒｃｅ，Ｓ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ６９，１８９４（１９６５），Ｓｔｕｒｍｅｒ，Ｄ Ｍ，Ｓｐｅｃ Ｔｏｐ ｉｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（１９７４））。 実施例２の相当するスルホン化染料（２ｈ）を検討したときには、このような問 題には遭遇しなかった。 スクアラート染料におけるスルホネート基の存在は染料に全体的な正味の負電 荷を与える。これは生体分子との非特定疎水性相互作用の低下を助長する。ＤＮ ＡおよびＲＮＡは本来リン酸塩主鎖によって負に帯電し、したがって負に帯電し た染料は静電相互作用によって反発され、標識化を結合反応基／求核基の特定反 応に限定する。標識化の後でさえも、染料抱合体中の染料におけるスルホネート 基の存在は、スクアラート染料抱合体の操作中に遭遇したプラスチック成分との 疎水性相互作用をできるたけ少なくするように助長する。配列決定、とくに毛管 ゲル配列決定の適用においては、毛管壁被膜は負に帯電したＤＮＡに対してすで に最適にされているので、染料における負の電荷は、結果を著しく歪めると思わ れる毛管内の毛管壁被膜との逆相互作用染料を阻止する。 染料のアリール部分におけるスルホン酸基の存在は染料に著しい光安定性を付 与する。これは明るい光源に曝露したときに染料のｔ_1/2を測定した実施例１３ の表によって示される。アリールスルホネートを欠くスクアラート染料はすべて 最低のｔ_1/2を有する。２個のスルホン酸基の存在は光安定性をさらに増大する 。表中には比較のために市販のシアニン染料（Ｃｙ５^TM）も加えた。 反応基がホスホルアミダイトである場合にはスルホン酸基の欠如が好ましいが 必須ではない。ホスホルアミダイトヌクレオチドモノマービルディングブロック （ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）を用いて固体担体上にＤＮＡ／ＲＮＡを合 成することが出来ることは周知である。ユーザーの要求によって、成長しつつあ るＤＮＡ鎖中または末端５’もしくは３’にハプテンおよび染料を結合させるの に用いることができる一連のホスホルアミダイト標識もある。Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕ ｃａｇｅらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９，１９２５，（１９９３）。これらす べての方策に共通していることは、ホスホルアミダイトの活性化および付加の間 にリン（III）試薬との反応を阻止するためにホスホルアミダイト中のすべての 反応性求核ヒドロキシまたはアミノ官能性を確実に保護する保護計画である。Ｄ ＮＡ合成装置ではこれらホスホルアミダイト付加は通常有機溶剤、典型的にはア セトニトリル中で行われる。 本発明のスクアラート染料のアルコール誘導体は、インドレニニウム等の中間 体がカップルされているシクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート中心環 上のヒドロキシル種の保護に頼らずに容易に必要なホスホルアミダイト誘導体に 変えることができることを見出した。これは予期しない結果であり、またＰ．Ｔ ｈｅｉｓｅｎらが行った（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３３，５０３３ ，（１９９２））蛍光染料ホスホルアミダイトを生成させるのに要した複雑な合 成法と対照的である。スクアラート染料ホスホルアミダイト中のスルホン酸基の 欠如は、ＤＮＡ合成装置において好ましい反応溶剤としてアセトニトリルが依然 として使用できるので望ましい。スルホン酸基が存在する場合でさえもスクアラ ート染料のホスホルアミダイトが合成可能であることも認められている。いずれ のタイプの誘導体もＤＮＡプライマーを標識化し、次いで配列の情報をもたらす のに使用されている。実施例１１参照。 スクアラート染料の合成は一工程法か、スクアリン酸（ｓｑｕａｒｉｃ ａｃ ｉｄ）もしくはその誘導体と最初に１つ選んだ中間体との反応および必要な非対 称染料を生成するための好みの中間体との続く反応による「半染料」形構造物の 単離によって行うことができる。実施例１は好みの特定染料を調製するために使 用できる一連の中間体を提供する。芳香族環における置換基（Ｒ²）は染料の性 質、たとえば波長のシフトおよび安定性に対して著しい影響を与えることができ る。（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｙｅｓ，Ｖ ｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ １９７１，ｖ ｏｌ．４，ｃｈａｐｔｅｒ５，ｐａｒｔiiiｃ，ｐａｇｅｓ２２８−２４０．と くに２３０ページの表１参照）。また中間体は生体分子へカップリングさせるた めの必要な方策に基づく活性化カルボキシル誘導体への転化に対して選択するこ とができる一連のＸ誘導体、たとえばＯＨ、ＮＨ₂（それぞれ容易にホスホルア ミダイトまたはヨードアセトアミドに転化させることができる）およびカルボン 酸基をもたらす。したがってタンパク質におけるシステイン残基としてマレイミ ドまたはヨードアセトアミドスクアラート染料誘導体を必要とする場合には、５ ’−アミノアリルｄＵＴＰのようなヌクレオチドはスクシンイミジルエステルス クアラート誘導体を必要とする。接合に関する専門家は上記の接合方策を例示的 で あって、限定するつもりではないことを理解しよう。 芳香族環上の置換基（Ｒ²）の変異体によって誘発される変化、または共役芳 香族環（たとえばインドールの代わりにベンズインドール）の数の増大は概して 波長および安定性の比較的微妙な変化をもたらす。波長性のさらに著しい変化は 染料の中心環におけるｎを変えることによって誘発させることが出来る。これら の染料はスクアリン酸（ｎ＝１）、クロコン酸（ｎ＝２）、およびロジゾン酸（ ｎ＝３）（簡略化するため本明細書ではひとまとめにしてスクアラート染料と呼 ぶ）を原料とする。ｎの値は近似的最大励起波長を決定する：５７０−６９０ｎ ｍ ｎ＝１、６９０−７９０ｎｍ ｎ＝２、７９０−８９０ｎｍ ｎ＝３。 置換基として芳香族環上か、または複素環式芳香族環中の窒素から離れたリン カーアーム（ｌｉｎｋｅｒ ａｒｍｓ）に結合した官能基又は反応基を有する非 対称スクアラート染料の合成は実施例に示すように達成可能なプロセスである。 概して対称を利用することはいかなるプロセスにおいても全般的な合成収率を向 上させることができる。シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート中心環 （この場合ｎ＝１）および相当する誘導体（ここにｎ＝２または３）における変 性は全般的により効率的プロセスのみならず新規標識化位置をもたらすことがで きる。実施例７−１０はスクアラート染料をまずエーテル誘導体に変えた後つい でさらに生体分子に結合させるのに必要な官能性をもたらすために反応させるプ ロセスを提供する。はじめのエーテル誘導体の変性は、エーテル誘導体自身がア ミノ基と反応するので生体分子への結合には必ずしも必要ではない。中心環の変 性は合成しやすさを向上させるために用いることができるただ一つの方策ではな い。実施例１１ｈおよび１１ｋにおけるように二官能性スクアラート染料（たと えば２つの同一Ｘ基が存在する）のモノ保護がモノ反応性誘導体をもたらすこと もできる。またこの方法は必要に応じて第２の生体分子、固定相または染料との つぎの反応のための第２の官能基の脱保護を可能にする。 中心環の変性が染料の蛍光性を変えることも認められている。したがって初め のＯメチル置換基をＲ⁴ＮＭｅ基で置換すると驚異的に蛍光を減じて消活剤形染 料となることが見出された。染料の芳香族部分の置換基（Ｒ²）がニトロ基の場 合には同じような効果を得ることができる。 これらスクアラート染料は蛍光エネルギー転移（ＥＴ）に用いることができる 。この技術は励起供与体発色団から受容体発色団へ励起の共鳴転移をもたらす双 極子相互カップリングによって達成される（Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｔ（１９６５）ｉ ｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｓｔｎｂｕｌ ｌ ｅｃｔｕｒｅｓ，ｐａｒｔIIIＥｄ．Ｓｉｎａｎｏｇｌｕｒ，Ｏ（Ａｃａｄｅｍ ｉｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ｐｐ９３−１３７）。 蛍光ＥＴは生物分析では周知の有効な分光現象である（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ，Ａ ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９７８）４７ ８１９−８４６；Ｃａｒ ｄｕｌｌｏ，Ｒ．Ａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１ ９８８）８５ ８７９０−８７９４；Ｏｚａｋ Ｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．，（１９９２）２０，５２０５−５２１４；Ｃｌｅｇｇ Ｒ Ｍ ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）３１ ４８４６−４８５６およびＰ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９３）９０ ｐ２９９４ −２９９８；Ｓｅｌｖｉｎ Ｐ Ｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，（１９９４）９１ １００２４−１００２８）。 １つの例では、供与体染料が、たとえば適切なレーザーの波長における光を吸 収する。この供与体染料から放射されたエネルギーは第２の染料（受容体染料） に移される。この受容体染料は受容体染料が放射する通常の波長において蛍光と してエネルギーを放射する。たとえば供与体として約６３３ｎｍで吸収する２つ のインドリニウム中間体から誘導されるスクアラート染料および約６６５ｎｍで 吸収するベンズインドリニウム中間体を原料とする系を考えることができる。 この原理はＤＮＡ配列決定および分析を含む多くの生物学的検定に用いられて いる（Ｊｉｎｇｙｕｅ Ｊｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳＣＩ．ＵＳ Ａ（１９９５）９２ ｐ４３４７−４３５１）。 別の例では供与体から放射されたエネルギーを失活させるように受容体分子を 選ぶことができる。この受容体は失活剤とも呼ばれる。この原理は均一遺伝子検 出検定に用いられている（Ｔｙａｇｉ ＳらＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ（１９９６）１４（３）ｐ３０３−３０８）。上記のように供与体およ び／または受容体もしくは失活剤として使用できるスクアラート染料を設計する ことができる。 したがって本発明は、また下記を含む蛍光標識化複合体を提供する： ・ 第１の吸収及び放射スペクトルを有する第１または供与体蛍光色素； ・ 第２の吸収及び放射スペクトルを有する第２または受容体蛍光色素；前記第 ２蛍光色素の最大放射波長は前記第１蛍光色素の最大放射波長よりも長く、また 前記第２蛍光色素の吸収スペクトルの一部は前記第１蛍光色素の放射スペクトル の一部と重なり； ・ 前記第１及第２蛍光色素間の共鳴エネルギー転移の転移のために記第１およ び第２蛍光色素を共有結合させるための少なくとも１つのリンカー； ・ 標的化合物との共有結合を形成させることができる標的結合基； ここに前記第１および第２蛍光色素の少なくとも１つはスクアラート染料で ある。 後記実験の部で示すように、スクアラートオリゴヌクレオチド抱合体はＤＮＡ 蛍光配列自動化決定にみごとに使用することができる。この適用において、この 抱合体は、より短い波長及びより長い波長で吸収する他の染料に勝るいくつかの 可能性ある利点を与えることができる。 １．６３２ｎｍレッドＨｅＮｅレーザーは、他のＤＮＡシーケンサー（ｓｅｑｕ ｅｎｃｅｒｓ）で用いられるＡｒｇｏｎイオン、ＧａＡｌＡｓ、ＹＡＧ及び５９ ４ｎｍＨｅＮｅレーザよりも著しく安い。 ２．オプチックス（ｏｐｔｉｃｓ）およびフィルターは他のシーケンサーで用い られる回折格子、ファイバーオプチックスおよび走査共焦点顕微鏡装置よりもは るかに簡単で安い。 ３．長い励起波長がソーダ石灰ガラス板の使用を可能にして、高価な低蛍光のホ ウケイ酸塩ガラスを使わないで済む。 ４．レッドレーザーはゲルや緩衝剤成分からの地色の蛍光を少なくし、さらには ノイズレベルに対する信号を増し、また感度を高める。 ５．スクアラート染料はシアニン類にような他の染料よりも光安定性がある。 ６．分光特性の異なる染料を注意深く選ぶことによってスラブ（ｓｌａｂ）また はキャピラリーゲル（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇｅｌ）系配列決定器械においてＤ ＮＡを１トラック（ｏｎｅ ｔｒａｃｋ）中で配列決定することができよう。 ７．全体的な染料の電荷対染料の親油性度を注意深く調節することによって、Ｄ ＮＡに接合させるときに整合性のあるゲル移動度を有するように染料対か染料セ ットを合成することができる。これによってユーザーのあらゆる生の配列データ の分析が容易になり、複雑な解析法やコンピューター生成結果に対する依存度が 減少する。 スクアラート染料は１−５個の正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖または直鎖 状の最大３０個の原子を包含することができる。好ましくは正に帯電した窒素原 子は第四級アンモニウム基、イミダゾール基またはピリジニウム基によって与え られる。 上記は帯電残基、たとえば負に帯電した染料を付与するスルホネート基の添加 によってスクアラート染料を変性することができる方法を示す。ある適用では、 中性または正に帯電した染料が必要かまたは有利である。種々の数の第四級窒素 種の染料への添加は、スルホネート基が存在しない場合に全体的に正に帯電する 染料をもたらすか、またはスルホネート基が存在する場合には全体的に負、中性 もしくは正に帯電した染料をもたらす。染料出発物質および／またはスクアリン 酸誘導体の選択によって与えられた染料の波長を変える能力と組合わせた上記は ＷａｇｇｏｎｅｒらがＷＯ９６／３３４０６に概説したように２Ｄゲルの適用に 適する整合性ある染料の合成を可能にする。実験例 実施例１ 染料合成のための中間体の合成 出発第四級化インドレニン類および関連誘導体をＲ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒら ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，４．１０５，Ｇ ．Ｐａｔｏｎａｙら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，２３９１および Ｅ．Ｂａｒｎｉら，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ，１９８５，２２，１ ７２７の方法に従って調製した。それぞれ代表的な例が含まれている。２，３，３−トリメチルインドレニン−５−スルホン酸カリウム（１ａ） 機械撹拌機を備えた２１の三つ口丸底フラスコに酢酸（３００ｍｌ）、３−メ チル−２−ブタノン（１６８ｍｌ，１．６ｍｏｌ）および４−ヒドラジノベンゼ ン（１００ｇ，０．５３ｍｏｌ）を加えた。次いでこれを還流下で３ｈ加熱した 後撹拌しながら一夜間冷却した。生成した紅色の沈殿を濾過して集めた後６０℃ で真空乾燥した。 この粗製物をメタノールに溶解してカリウム塩に変えた後ＫＯＨのイソプロピ ルアルコール飽和溶液を加えた。沈殿した黄色固体を濾過して集め６０℃で真空 乾燥した。 δ_H（２７０ＭＨ_Z，Ｄ₂Ｏ）７．１５（１Ｈ，ｓ），７．１１（１Ｈ，ｄｄ， ｊ＝７．０，１．２Ｈｚ），６．５２（１Ｈ，ｄ，ｊ＝７．０Ｈｚ），２．２１ （３Ｈ，ｓ），１．３８（６Ｈ，ｓ）。１−（４−スルホナトブチル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５ −スルホン酸カリウム（１ｂ） カリウム塩（１ａ）（１１．０ｇ，４０ｍｍｏｌ）および１，４−ブタンスル トン（６．５ｇ，４８ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロベンゼン（５０ｍｌ）中で 一緒に混合した後、撹拌しつつ１１０℃で８ｈ加熱した。次いで混合物を一夜間 冷却した。過剰の液体をデカントしてから残留物をイソプロピルアルコールとと もにすりつぶし、濾過して６０℃で真空乾燥した。ついでこれをＨＰＬＣで精製 した（Ｃ−１８，Ｈ₂Ｏ／ＭｅＯＨ）。 δ_H（２７０ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）８．０８（１Ｈ，ｓ）．７．９６（１Ｈ，ｄｄ， ｊ＝９．０，１．２Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｄ，ｊ＝９Ｈｚ），４．４８（２ Ｈ，ｔ，ｊ＝７．５Ｈｚ），２．２３（２Ｈ，ｔ，ｉ＝７．５Ｈｚ），２．０４ （３Ｈ，ｓ），１．９５（２Ｈ，ｍ），１．４８（６Ｈ，ｓ），１．３５（２Ｈ ，ｍ）。１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム− ５−スルホネート（１ｃ） （１ｂ）と類似の方法で合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）８．１０（１Ｈ，ｓ），７．９９（１Ｈ，ｄｄ， ｊ＝９．０，１．２Ｈｚ），７．２９（１Ｈ，ｄ，ｊ＝９．０Ｈｚ）．４．４８ （２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．５Ｈｚ），２．２９（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．４Ｈｚ），２． ０１（２Ｈ，ｍ），１．６１（６Ｈ，ｓ），１．３２−１．６０（４Ｈ，ｍ）； （２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ ｄ₆）８．０３（１Ｈ，ｓ），７．９６（１Ｈ，ｄ ，ｊ＝８．２４Ｈｚ），７．８４（１Ｈ，ｄ，ｊ＝８．２４Ｈｚ），４．４６（ ２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１４Ｈｚ），２．８６（３Ｈ，ｓ），２．２３（２Ｈ，ｔ， ｊ＝７．１４Ｈｚ），１．８４（２Ｈ，ｍ），１．５５（６Ｈ，ｓ），１．４１ （４Ｈ，ｍ）。 ６−ブロモ−３−オキサヘキサン酸 ＴＨＦ（５０ｍｌ）中でグリコール酸（２．０３ｇ，２６ｍｍｏｌ）および１ ，３−ジブロモプロパン（６．４１ｇ，３２ｍｍｏｌ）を撹拌しつつある溶液に 水素化ナトリウム（１．５６ｇ，６５ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温で１６ｈ 撹拌した。反応混合物を稀ＨＣｌ（１．０Ｍ，１００ｍｌ）で急冷した後、クロ ロホルム（３×５０ｍｌ）で抽出した。これをさらにブラインで洗い、乾燥し、 濾過して真空で蒸発乾固した。残留物をクロマトグラフィーで精製して標記化合 物を得た（２．９１ｇ，５７％）． δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）３．９５（２Ｈ，ｓ９，３．４１（２Ｈ，ｔ ， ｊ＝７．０Ｈｚ），３．２５（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．０Ｈｚ），１．５７（２Ｈ， ｍ）。１−（５−カルボキシ−４−オキサペンチル）−２，３，３−トリメチルインド レニニウム−５−スルホネート（１ｄ） ６−ブロモ−３−オキサヘキサン酸を用いて（１ｂ）と類似の方法により合成 した。 δ_H（Ｄ₂Ｏ）８．１０（１Ｈ，ｓ），７．９９（１Ｈ，ｄｄ，ｊ＝９．０．１ ２Ｈｚ），７．２９（１Ｈ，ｄ，ｊ＝９．０Ｈｚ），４．４８（２Ｈ，ｔ，ｊ＝ ７．５Ｈｚ），３．９５（２Ｈ，ｓ），３．２５（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．０Ｈｚ） ，１．６１（６Ｈ，ｓ），１．５７（２Ｈ，ｍ）。１−エチル−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホネート（１ ｅ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ ｄ₆）８．０２（１Ｈ，ｓ），７．９４（１Ｈ ，ｄ，ｊ＝８．２４Ｈｚ），７．８３（１Ｈ，ｄ，ｊ＝８．２４Ｈｚ），４．４ ８（２Ｈ，ｑ，ｊ＝７．１４Ｈｚ），２．８５（３Ｈ，ｓ），１．５４（６Ｈ， ｓ），１．４４（３Ｈ，ｔ，＝７．１４Ｈｚ）。１−ブチル−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホネート（１ ｆ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）０．８５（２Ｈ，ｔ），１．３５（２Ｈ，ｍ）， １．５０（６Ｈ，ｓ），１．８３（２Ｈ，ｑｕｉｎ），４．３６（２Ｈ，ｔ）， ７．８０（１Ｈ，ｍ），７．９１（１Ｈ，ｍ）および８．０２（１Ｈ，ａｐｐｓ ）１−エチル−２，３，３−トリメチルインドレニニウムヨウ化物（１ｇ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ ｄ₆）７．９７（ｍ，１Ｈ），７．８４（ｍ， １Ｈ），７．６３（ｍ，２Ｈ），４．４９（ｑ，２Ｈ，ｊ＝７．１４Ｈｚ），２ ．８５（ｓ，３Ｈ），１．５４（ｓ，６Ｈ），１．４５（ｔ，３Ｈ，ｊ＝７．１ ４ Ｈｚ）。１−（４−スルホナトブチル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５ −酢酸（１ｈ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ ｄ₆）１．５２（６Ｈ，ｓ），１．７４（２Ｈ ，ｑｕｉｎ），１．９６（２Ｈ，ｑｕｉｎ），７．７０（１Ｈ，ｓ）および７． ９６（１Ｈ，ｄ）。１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム臭 化物（１ｉ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆）７．８９（ｍ，１Ｈ），７．８６（ｍ， １Ｈ），７．６３（ｍ，２Ｈ），４．４７（ｔ，２Ｈ；ｊ＝７．４２Ｈｚ），２ ．８６（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｔ，２Ｈ；ｊ＝７．１４Ｈｚ），１．８３（ｍ ，２Ｈ），１．５５（ｓ，６Ｈ），１．４６（ｍ，４Ｈ）。１−ブチル−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−酢酸ヨウ化物（１ ｊ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．０５（３Ｈ，ｔ），１．４５−１．６０ （２Ｈ，ｍ），１．８５−２．０５（２Ｈ，ｍ），３．７５（２Ｈ，ｓ），４． ５０（２Ｈ，ｔ），７．５７（１Ｈ，ｄ），７．７０（１Ｈ，ｓ）および７．８ ０（１Ｈ，ｄ）。１−エチル−２，３，３−トリメチルベンズインドレニニウムヨウ化物（１ｋ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）１．５２（３Ｈ，ｔ），１．７８（１２Ｈ， ｓ９，２．９７（３Ｈ，ｓ），４．６４（２Ｈ，ｑ），７．７５（２Ｈ，ｑｕｉ ｎ）および８．２０−８．５０（４Ｈ，ｍ）。１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルベンズインドレニニ ウム臭化物（１ｌ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）１．５０−１．９５（４Ｈ，ｍ），１．８５ （１２Ｈ，ｓ），２．０５（２Ｈ，ｑｕｉｎ），２．３７（２Ｈ，ｔ），４．６ ５（２Ｈ，ｔ），７．７０（１Ｈ，ｔ），７．８０（１Ｈ，ｔ），８．０５（１ Ｈ，ｄ），８．１７（１Ｈ，ｄ）および８．３５（１Ｈ，ｄ）。５−ヨードペンチルアセテート ヨウ化ナトリウム（４５ｇ，０．３０ｍｏｌ）の乾燥アセトン（２００ｍｌ） 溶液に５−クロロペンチルアセテート（２６．５ｇ，０．１６ｍｏｌ）を加えた 。得られた淡黄色の溶液を還流下に６５ｈ加熱すると、その間に白色固体（塩化 ナトリウム）が分離した。最終混合物を室温に冷却し、濾過してＮａＣｌを取出 し、それをアセトン及びジエチルエーテルで洗った後５０℃で真空乾燥した。Ｎ ａＣｌの予想収量＝９．４ｇ；単離した収量＝９．４７ｇ（１００％）。 濾液及び洗浄液を合わせて溶剤を減圧で除去し、残留物を水とジエチルエーテ ルで分配させた。エーテル層を残してチオ硫酸ナトリウム水溶液及びブラインで 洗った後乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、溶剤を減圧で除去して標記化合物を薄 黄色の液体として得た。３９ｇ（９５％）。 δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．５０（２Ｈ，ｍ），１．６５（２Ｈ，ｍ ），１．８５（２Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ ₃−ＣＯＯ−），３．１ ８（２Ｈ，ｔ，ｌ−ＣＨ ₂−），４．０６（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ ₂−ＯＡｃ）。１−（５−アセトキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニニウムヨ ウ化物（１ｍ） 蒸留したばかりの２，３，３−トリメチルインドレニン（２．３９ｇ，１５ｍ ｍｏｌ）に５−ヨードペンチルアセテート（３．８４ｇ，１５ｍｍｏｌ）を加え 、ついでこの混合物を窒素雰囲気中で１００℃４ｈ加熱して、赤みを帯びたガム を得た。これを室温に冷却後、ジエチルエーテルで繰り返しすりつぶし、高真空 で乾燥して粘稠な赤みを帯びたガムを得た。６．１ｇ（９８％）。このものはさ らに精製せずにそのまま使用した。３−（５−アセトキシペンチル）−１，１，２−トリメチルベンズインドレニニ ウムヨウ化物（１ｎ） ５−ヨードペンチルアセテート（１９．４ｇ，７８ｍｍｏｌ）を５０℃に加熱 した後１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンズインドール（１６．２ｇ，７７ｍ ｍｏｌ）を加えた。この混合物を１００℃で４．５ｈ加熱した後室温に冷却した 。この固体化熔融物を１０％メタノール／ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解 した後ジエチルエーテル（４００ｍｌ）に溶解して生成物を沈殿させた。３０分 間撹拌後淡緑色の結晶を集めエーテルで洗い乾燥して（１ｎ）を得た。３３．１ ｇ（９２％）。 ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：３３９ δ_H（３００ＨＭｚ，ＣＤＣｌ₃）１．５５（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ ₂−），１．６ ８（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ ₂−），１．８３（６Ｈ，ｓ，インドール ＣＭｅ₂），１ ．９７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ ₃−ＣＯＯ−），２．０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ ₂−），３． ２（３Ｈ，ｓ，インドール Ｃ₂−ＣＨ ₃），４．０２（２Ｈ，ｔ，インドール Ｎ−ＣＨ ₂−），４．７８（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ ₂−ＯＡｃ），７．６−７．７ ５（２Ｈ，ｍ），７．８２（１Ｈ，ｄ），８．０３（２Ｈ，ｍ），８．０８（１ Ｈ，ｄ）。Ｎ−（３−ブロモプロピル）トリエチルアンモニウム臭化物 乾燥トルエン（５０ｍｌ）中で１，３−ジブロモプロパン（２０．０ｇ，１０ ０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５．０６ｇ，５０ｍｍｏｌ）を混合した。こ の溶液を窒素雰囲気中で１００℃で４ｈ加熱すると、その間に濃い白色固形物が 沈殿した。ついでこの混合物を冷却し、濾過して固体を集めトルエンおよびエー テルで洗い、５０℃で真空乾燥して標記化合物５．０ｇ（３６％）を得た。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）幅広いピーク。１．１７（９Ｈ，３×Ｎ⁺−Ｃ Ｈ₂−ＣＨ ₃），２．１５（２Ｈ，ＢｒＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂−），３．２６（８Ｈ， ４×Ｎ⁺−ＣＨ ₂），３．６２（２Ｈ，Ｂｒ−ＣＨ ₂−）。１−（（３−トリエチルアンモニウム）プロピル）−２，３，３−トリメチルイ ンドリウム二臭化物（１ｏ） 蒸留したばかりの２，３，３−トリメチルインドレニン（０．８ｇ，５ｍｍｏ ｌ）とＮ−（３−ブロモプロピル）トリエチルアンモニウム臭化物（１．５２ｇ ，５ｍｍｏｌ）を混合してアルゴン雰囲気中においた。ついでこの混合物を１４ ０℃で１．５ｈ加熱して濃赤色粘稠熔融物を得、冷却するとにガラスに固化した 。これをジエチルエーテル中で粉砕し、濾過して集め、沸騰アセトンですりつぶ し、メタノール／アセトニトリルで再結晶させて標記化合物を淡紅色粉末として 得た。７９５ｍｇ（３４％）。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１．２２（９Ｈ，ｔ，ｊ６．６Ｈｚ，３×Ｎ⁺ −ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．５５（６Ｈ，ｓ，インドール Ｃ３Ｍｅ₂），２．２１ （２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂−），２．９２（３Ｈ，ｓ，インドール Ｃ２ −Ｍｅ），３．２７（６Ｈ，ｑ，ｊ６．６Ｈｚ，３×Ｎ⁺−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），３ ．５１（２Ｈ，〜ｔ，−ＣＨ ₂−ＮＥｔ₃），４．５７（２Ｈ，〜ｔ，インドール Ｎ⁺−ＣＨ ₂−），７．６４（２Ｈ，ｍ），７．８６（１Ｈ，ｄ，ｊ６．５Ｈｚ ），８．１２（１Ｈ，ｄ，ｊ７．３Ｈｚ）。１−（（３−トリエチルアンモニウム）プロピル）−２，３，３−トリメチルベ ンゾチアゾリウム二臭化物（１ｐ） （１ｏ）と類似の方法により合成した。 １−ブタノール／アセトンで再結晶させた。 δ_H（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）１．１５（９Ｈ，ｔ，３×Ｎ⁺−ＣＨ₂−ＣＨ ₃） ，２．３（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂−），３．２５（６Ｈ，ｑ，３×Ｎ⁺− ＣＨ ₂−ＣＨ₃），３．４５（２Ｈ，〜ｔ，−ＣＨ ₂ＮＥｔ₃），４．６（２Ｈ，〜 ｔ，インドール Ｎ⁺−ＣＨ ₂−），７．４（１Ｈ，ｔ），７．６（１Ｈ，ｔ）， ８．０（１Ｈ，ｄ），８．１（１Ｈ，ｄ）。３−（３−アミノプロピル）−１，１，２−トリメチルベンズインドリウム臭化 物。ＨＢｒ（１ｑ） ＰａｔｏｎａｙらのＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５），６０，２３９１ に従って調製した。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１．７７（６Ｈ，ｓ，アンドール Ｃ１Ｍｅ₂ ），２．２４（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂−ＣＨ ₂−ＣＨ₂−），２．９８（３Ｈ，ｓ， Ｃ ２ＣＨ ₃），３．１０（２Ｈ，ａｐｐ ｑ，−ＣＨ ₂−ＮＨ₃ ⁺），４．７２（２Ｈ ，ｔ，ｊ７．０Ｈｚ，インドール Ｎ−ＣＨ ₂−），７．７０−７．８１（２Ｈ ，ｍ）＋８．２１−８．３９（４Ｈ，ｍ）＝６×ベンゾインドールアリール−Ｈ ，８．０３（３Ｈ，幅広ｓ，−ＮＨ ₃ ⁺）。３−（３−Ｎ−フタルイミドプロピル）−１，１，２−トリメチルベンズインド リウム臭化物（１ｒ） （１ｑ）と類似の方法により合成した。 δ_H（３３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．８４（６Ｈ，ｓ，インドール Ｃ１Ｍ ｅ₂），２．４４（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂−ＣＨ ₂−ＣＨ₂−），３．２４（３Ｈ，ｓ ，Ｃ２ＣＨ ₃），３．８６（２Ｈ，ｔ，ｊ７．１Ｈｚ，−ＣＨ ₂−フタルイミド） ，４．９９（２Ｈ，ｔ，ｊ７．２Ｈｚ，インドールＮ−ＣＨ ₂−），７．５８− ７．７６（７Ｈ，ｍ），７．９４−８．０２（３Ｈ，ｍ）。Ｎ−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムヨウ化物（１ｓ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．６（６Ｈ，ｔ，ベンゾチアゾールＮ−Ｃ Ｈ₂−ＣＨ ₃），３．５（３Ｈ，ｓ，ベンゾチアゾールＣ２−ＣＨ ₃），５．０（ ２Ｈ，ｑ，ベンゾチアゾールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），７．７５（１Ｈ，ｔ）＋７． ８５（１Ｈ，ｔ）＋８．１（１Ｈ，ｄ）＋８．３（１Ｈ，ｄ）＝４×ベンゾチア ゾールアリール−Ｈ_oδ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．６０（３Ｈ，ｔ，Ｎ ＣＨ₂ＣＨ₃），３．２３（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ），４．８６（２Ｈ，ｑ，ＮＣＨ₂Ｃ Ｈ₃），７．８２（１Ｈ，ｔ，ＡｒＨ），７．９５（１Ｈ，ｔ，ＡｒＨ），８． ２８及び８．３２（いずれも１Ｈ，重複ｄ，ＡｒＨ）。Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−２−メチルベンズチオゾリウム臭化物（１ｔ ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．５７，１．７１および２．００（いずれ も２Ｈ，ｍ），２．２６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），４．７７（２Ｈ，ｔ，Ｎ ＣＨ₂），７．８２および７．９３（いずれも１Ｈ，ｔ，ＡｒＨ）および８．２ １−８．４０（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）。３−エチル−１，１，２−トリメチルベンズインドレニニウム−７−スルホネー ト（１ｕ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（３００ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）１．４５（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＨ₃），１．５７（ ６Ｈ，ｓ，ＣＭｅ₂），４．４６８２Ｈ，ｑ，ＣＨ₂ＣＨ₃），７．７９，７．８ ４，８．０４および８．１８（いずれも１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）ならびに８．２６（ １Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）。１−（５−カルボキシペンチル）−１，１，２−トリメチルベンズインドレニニ ウム−７−スルホネート（１ｖ） （１ｂ）と類似の方法により合成して不溶性灰色粉末を得、これを直接使用し て生成物染料から構造確認が得られた。３−エチル−６，８−ジスルホナト−１，１，２−トリメチルベンズインドリウ ムトシレート（１ｗ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（３００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）１．３９（３Ｈ，ａｐｐ ｔ，インドールＮ−Ｃ Ｈ₂−ＣＨ ₃），１．５３（６Ｈ，ｓ，インドールＣ２Ｍｅ₂），２．１８（３Ｈ ，ｓ，トシレート−ＣＨ ₃），４．４０（２Ｈ，ｑ，ｊ７．５Ｈｚ，インドール Ｎ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），７．１５＋７．５０（いずれも２Ｈ，〜ｄ，４×トシレー トアリール−Ｈ），７．９２（１Ｈ，ｄ，ｊ９．５Ｈｚ），８．４２（１Ｈ，ｓ ），８．４９（１Ｈ，ｓ），８．７９（１Ｈ，ｄ，ｊ９．５Ｈｚ）。３−（５−カルボキシペンチル）−６，８−ジスルホナト−１，１，２−トリメ チルベンズインドリウム臭化物（１ｘ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（３００ＭＨｚ．Ｄ₂Ｏ）１．３０（２Ｈ，ｍ），１．４８（２Ｈ，ｍ）， １．５９（６Ｈ，ｓ，インドールＣ２Ｍｅ₂），１．８３（２Ｈ，ｍ），２．１ ９（２Ｈ，ｔ，ｊ７．２Ｈｚ，−ＣＨ ₂−ＣＯ₂Ｈ）．４．４１（２Ｈ，ｔ，ｊ７ ．５Ｈｚ，インドールＮ−ＣＨ ₂−），７．９２（１Ｈ，ｄ，ｊ９．５Ｈｚ）， ８．４０（１Ｈ，ｓ），８．５３（１Ｈ，ｓ），８．７９（１Ｈ，ｄ，ｊ９．５ Ｈｚ）１−ベンジル−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホネート（ １ｙ） （１ｂ）と類似の方法により合成した。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）１．６６（６Ｈ，ｓ，ＣＭｅ₂），５．８５ （２Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ₂），７．３７−７．４４（５Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ₂），７． ７７（いずれも１Ｈ，ｄ，ｊ８．４，４−ＣＨ），７．９１（１Ｈ，ｄｄ，ｊ１ ．５および８．４，６−ＣＨ）ならびに８．１１（１Ｈ，ｄ，ｊ１．５，７−Ｃ Ｈ）。 実施例２ インドレニニウム中間体からスルホン酸置換スクアラート染料の合成 本発明の染料の場合に対イオンの厳密な性質は測定しなかった。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−インドリニリデンメチル）−４−（１−（４−スルホナトブチル）−３，３ −ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイ リウム−１，３−ジオーレート（２ａ） ２−エトキシエタノール（１０ｍｌ）中の（１ｂ）（０．５６ｇ，１．３５ｍ ｍｏｌ）とスクアリン酸（０．４８，４．０５ｍｍｏｌ）の混合物を還流下で２ ０ｈ加熱した。ついで反応混合物を真空蒸発乾固し、ＨＰＬＣ（Ｃ−１８，Ｈ₂ Ｏ／ＭｅＯＨ）により精製して中間体スクアリン酸モノ付加物（λ_max（Ｈ₂Ｏ） ＝４２５ｎｍ）を得た。２−エトキシエタノール（１０ｍｌ）中で前記付加物（ ０．２７ｇ，０．６５ｍｍｏｌ）および（１ｃ）（０．１９ｇ，０．７１ｍｍｏ ｌ）を１６ｈ還流下で加熱した。２−エトキシエタノールを真空で除き残留物を ＨＰＬＣ（Ｃ−１８，Ｈ₂Ｏ／ＭｅＯＨ）で精製して標記化合物（２ａ）を得た 。 δ_H（２７０ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）７．８１（２Ｈ，ｓ），７．６５（２Ｈ，ｄ，ｊ ＝７．５Ｈｚ），７．３１−７．４３（２Ｈ，ｍ），６．２７（２Ｈ，ｍ），４ ．１１（４Ｈ，ｍ），２．８９（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４５（２Ｈ ，ｔ，ｊ＝７．０ＨＺｚ），１．４−２．０（２２Ｈ，ｍ）；λ_max（Ｈ₂Ｏ）＝ ６３１ｎｍ。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−インドリニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−ス ルホナト−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジ オーレート（２ｂ） ｎ−ブタノール（５０ｍｌ）中のスクアリン酸（１２１ｍｇ，１．０６ｍｍｏ ｌ）を、完全に溶解するまで還流下で加熱した。次いで（１ｃ）（５００ｍｇ， １．０６ｍｍｏｌ）を２ｈにわたり少しずつ加えた後混合物をさらに２ｈ還流下 に保った。１−エチル−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホ ネート（１ｅ）（４３９ｇ，１．０６ｍｍｏｌ）を１ｈにわたり少しずつ加えた 。さらに２４ｈ還流下で加熱後、混合物を外界温度に冷却して真空濃縮した。Ｈ ＰＬＣ（Ｃ１８，Ｈ₂Ｏ／ＭｅＯＨ）により残留物を精製して標記化合物をｎ− ブチルエステルとして得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３６ｎｍ；λ_em（ＭｅＯＨ）６５２ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）０．９２（３Ｈ，ｔ，ｊ＝７．３Ｈｚ），１ ．３８−１．９３（１３Ｈ，ｍ），１．７８（１２Ｈ，ｓ），２．３４８２Ｈ， ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０４（２Ｈ，ｔ，ｊ＝６．６Ｈｚ），４．０８−４ ．２８（４Ｈ，ｍ），６．０２（１Ｈ，ｓ），６．０４８１Ｈ，ｓ），７．２５ −７．３５（２Ｈ，ｍ）および７．８２−７．９２（４Ｈ，ｍ）。 上記染料ブチルエステル（１３ｍｇ）の水中（２ｍｌ）溶液に１Ｍ ＫＯＨ溶 液（０．５ｍｌ）を加えた。外界温度で一夜間撹拌した後混合物のＨＰＬＣ精製 を行い標記化合物をカリウム塩として得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３６ｎｍ；λ_em（ＭｅＯＨ）６４７ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．４０（３Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），１ ．４５−１．５８（２Ｈ，ｍ），１．６３−１．９３（４Ｈ，ｍ），１．７８（ １２Ｈ，ｓ），２．１９（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．４Ｈｚ），４．０９−４．２８（ ４Ｈ，ｍ），６．０３（１Ｈ，ｓ），６．０４（１Ｈ，ｓ），７．２５−７．３ ６（２Ｈ，ｍ）および７．８５−７．９２（４Ｈ，ｍ）。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−インドリニリデンメチル）−４−（１−ブチル−３，３−ジメチル−５−ス ルホナト−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジ オーレート（２ｃ） （１ｃ）、スクアリン酸および（１ｆ）から、（２ｂ）ブチルエステル（上記 参照）と同様に標記化合物をそのブチルエステルとして調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３８ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）０．９１（３Ｈ，ｔ，ｊ＝７．３Ｈｚ），１ ．０２（３Ｈ，ｔ，ｊ＝７．３Ｈｚ），１．２６−１．４４（２Ｈ，ｍ），１． ４４−１．６４（６Ｈ，ｍ），１．６４−１．９２（６Ｈ，ｍ９，１．７７（１ ２Ｈ，ｓ），２．３４（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０６（２Ｈ，ｔ，ｊ ＝６．６Ｈｚ），４．１５（４Ｈ，ｐｐ ｂｒ ｔ，ｊ＝６．９Ｈｚ），６．０ ２および６．０３（いずれも１Ｈ，ｓ），７．２８（２Ｈ，ａｐｐ ｄ，ｊ＝４ ．１Ｈｚ），７．８６（２Ｈ，ａｐｐ ｄ，ｊ＝４．１Ｈｚ）および７．８８（ ２Ｈ，ａｐｐ ｓ）。 続く加水分解によって標記化合物をカリウム塩として生成させ、以後の研究で はそれを使用した。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−インドリニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−イ ンドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（２ｄ ） （１ｃ）、スクアリン酸および（１ｇ）から、（２ｂ）ブチルエステル（上記 参照）と同様に標記化合物をそのブチルエステルとして調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３０ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）０．９２（３Ｈ，ｔ），１．２７−１．９２ （１３Ｈ，ｍ），１．７６（１２Ｈ，ｓ），２．３４（２Ｈ，ｔ），４．０４（ ２Ｈ，ｔ），４．１１（２Ｈ，ｂｒ ｔ），４．２３（２Ｈ，ｂｒ ｑ），５． ９５および６．０５（いずれも１Ｈ，ｓ），７．１９−７．３２（３Ｈ，ｍ）， ７．３３−７．４５（１Ｈ，ｍ），７．４９（１Ｈ，ｄ）および７．８０ないし ７．８８（２Ｈ，ｍ）。 上記ブチルエステル（約１１ｍｇ）のけん化および続く（２ｂ）（上記参照） と同様にクロマトグラフィー（Ｃ１８，Ｈ₂Ｏ／ＭｅＯＨ）による精製によって 標記化合物をカルボン酸カリウム（８ｍｇ）として得た。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．４２（３Ｈ，ｔ），１．４６−１．５８ （２Ｈ，ｍ），１．６２−１．９１（４Ｈ，ｍ），１．７６および１．７８（い ずれも６Ｈ，ｓ），２．１９（２Ｈ，ｔ），４．１１（２Ｈ，ｂｒ ｔ），４． ２１（２Ｈ，ｂｒ ｔ），５．９６および６．０４（いずれも１Ｈ，ｓ），７． ２０−７．３４（３Ｈ，ｍ），７．３４−７．４５（１Ｈ，ｍ），７．４５−７ ．５１（１Ｈ，ｍ），および７．８３−７．８９（２Ｈ，ｍ）。２−（１−（４−スルホナトブチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２ −インドリニデンメチル）−４−（１−（４−スルホナトブチル）−３，３−ジ メチル−５−カルボキシメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジ イリウム−１，３−ジオーレート（２ｅ） ， スクアリン酸（５５ｍｇ，０．４８４ｍｍｏｌ）を酢酸（５ｍｌ）、ピリジン （５ｍｌ）および無水酢酸（５００μｌ）の混合物に溶解して橙黄色の透明溶液 を得た。（１ｂ）（２００ｍｇ，０．４８４ｍｍｏｌ）を２回に分けて加えて（ １５分にわたり）緑色溶液を得た。さらに１５分後１−（４−スルホナトブチル ）−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−酢酸（１ｈ）（８５ｍｇ） を加え、３５分後に追加部分（８５ｍｇ）を加えた。得られた暗緑色の液を外界 温度で約２０ｈ撹拌し、真空で濃縮して、Ｈ₂Ｏ／ＭｅＯＨに再溶解した。ＨＰ ＬＣ（Ｃ１８，Ｈ₂Ｏ／ＭｅＯＨ）により粗染料を精製して３つの主要青色成分 の中央の１つを単離して標記化合物をピリジニウム塩として得た。酸性交換樹脂 （Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ，約１０ｍｌ）によるパーコレーション、水（２５ｍｌ） による溶離、および溶離液の真空濃縮によって標記化合物を遊離酸として得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３８ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）１．３５および１．４５（いずれも６Ｈ，ｓ）， １．７５（８Ｈ，ｂｒ ｓ），２．８０（４Ｈ，ａｐｐ ｂｒ ｔ），３．４０ （２Ｈ，ｂｒ ｓ），３．９５（４Ｈ，ｂｒ ｍ），７．００−７．３０（４Ｈ ，ｍ）および７．７０（２Ｈ，ｂｒ ｓ）。２−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデン メチル）−４−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−イ ンドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（２ｆ ） （１ｅ）、スクアリン酸および（１ｉ）から、（２ｂ）ブチルエステル（上記 参照）と同様に標記化合物をそのブチルエステルとして調製した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）０．９２（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃）， １．００−１．９０（１３Ｈ，ｍ），１．８２（１２Ｈ，ｓ，２×ＣＭｅ₂）， ２．３３（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），４．０２（２Ｈ，ｔ，ＣＯ₂ＣＨ₂），４ ．０８−４．２５（４Ｈ，ｍ，２×ＣＨ₂Ｎ），５．９６および６．０３（いず れも１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），７．１６−７．５５（５Ｈ，シリーズｍ，ＳｒＨ） および７．８２−７．９４（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）。 続く加水分解によって遊離酸を得た。 δ_H（２７０ｍｈＺ；ｃｄ₃ＯＤ）１．３８（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＨ₃），１．５ ５（２Ｈ，ｍ），１．６２−１．９５（４Ｈ，ｍ），１．７６（１２Ｈ，ｓ，２ ×ＣＭｅ₂），２．２０（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），４．１０−４．２５（４ Ｈ，ｍ，２×ＮＣＨ₂），５．９５および６．０５（いずれも１Ｈ，ｓ，ビニル Ｈ），７．１８−７．５０（５Ｈ，シリーズｍ，ＡｒＨ）および７．８０−７． ８９（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）。２−（１−ベンジル−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデ ンメチル）−４−（１−（５−カルボキシペンチル）−５−スルホナト−３，３ −ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３− ジオーレート（２ｇ） （１ｙ）、スクアリン酸及び（１ｃ）から、（２ｂ）ブチルエステル（上記参 照）と同様に標記化合物をそのブチルエステルとして調製した。 δ_H（２７０ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）０．３９（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃），０． ７０−１．５０（２２Ｈ，ｍ），１．８８（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ）， ３．５８（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＣＯ₂ＣＨ₂），３．８４（２Ｈ，ｂｒ，ＮＣＨ₂Ｃ Ｈ₂），４．９６（２Ｈ，ｂｒ，ＰｈＣＨ₂），５．６３および５．６７（いずれ も１Ｈ，重複ｂｒ ｓ，ビニルＨ），６．７０−７．２０および７．５６−７． ７８（１１Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）。 続く加水分解によって遊離酸を得た。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．５２（２Ｈ，ｍ），１．６３−１．９０ （４Ｈ，ｍ），１．７５および１．８２（いずれも６Ｈ，ｓ，２×ＣＭｅ₂）， ４．１６（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＮＣＨ₂ＣＨ₂），５．３７（２Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｐｈ ＣＨ₂），６．０３および６．０７（いずれも１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），７．１６ −７．４０（７Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）および７．７２−７．９３（４Ｈ，ｍ，ＡｒＨ ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−ベンズインドリニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル− ５−スルホナト−２−ベンズインドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム −１，３−ジオーレート（２ｈ） （１ｕ）、（１ｖ）およびスクアリン酸から、（２ｅ）と同様に中間体「半染 料」の単離を含む２工程法によって標記化合物を調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６６４ｎｍ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｃ₄₂Ｈ₄₃Ｎ₂Ｓ₂Ｏ₈はＭ⁺８０２を要す）８２４（Ｍ⁺＋ Ｎａ），７１１。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−ベンズインドリニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル− ２−ベンズインドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオー レート（２ｉ） （１ｋ）、（１ｖ）およびスクアリン酸から、（２ｂ）と同様に標記化合物を 調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６６２ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．１５（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＨ₃），１．２ ５（２Ｈ，ｍ），１．４４（２Ｈ，ｍ），１．８８（２Ｈ，ｍ），１．９９（１ ２Ｈ，ｓ，２×ＣＭｅ₂），２．２５（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），４． １９（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＮＣＨ₂ＣＨ₂），４．２７（２Ｈ，ｂｒ ｑ，ＣＨ₂Ｃ Ｈ₃），５．９９および６．０４（いずれも１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），７．４１（ １Ｈ．ａｐｐ ｔ，ＡｒＨ），７．５６（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．９２（２Ｈ ，ａｐｐ ｔ，ＡＲｈ），８．０１（２Ｈ，ａｐｐ ｔ，ＡｒＨ），８．２４（ ２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）および８．４１（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ）。 遊離水酸基を有する染料の例については実施例１１および１２を参照されたい 。 実施例３ インドレニニウム及びチアゾリニウム中間体からスルホン酸置換スクアラート染 料の合成 ２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホナト− ２−インドリニリデンメチル）−４−（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデ ンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（３ａ） 中間体（１ｃ）、（１ｓ）、スクアリン酸及び塩基としての補足的キノリンか ら、実施例（２ｂ）と類似の方法で合成して染料生成物の粗混合物を得た。粗物 質の加水分解、ＨＰＬＣによる精製およびＨ⁺交換樹脂によるパーコレーション によって標記化合物を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３６ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）１．１８−１．８２（９Ｈ，ｍ），１ ．６４（６Ｈ，ｓ，２×Ｍｅ），３．９６（２Ｈ，ｂｒ），４．４５（２Ｈ，ｂ ｒ），５．５７および６．０９（いずれも１Ｈ，ｂｒ ｓ，ビニル−ＣＨ），７ ．１１（１Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．４０（１Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．４８−７． ７０（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．７７（１Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）および８．０７（１ Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）２−（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−４−（１−（４−ス ルホナトブチル）−３，３−ジメチル−５−カルボキシメチル−２−インドリニ リデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（３ｂ） 中間体（１ｈ）および（１ｓ）から、実施例（３ａ）と類似の方法で合成し、 ただしＨＰＬＣによる精製のみを行って標記化合物のモノキノリウム塩を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６４２ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）１．４３（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂ＣＨ₃），１．６ ８（６Ｈ，ｓ，２×Ｍｅ），１．９６（４Ｈ，ｂｒ），２．９１（２Ｈ，ｂｒ， ＣＨ₂ＳＯ₃ ^-），３．６３（２Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ₂），４．０５（２Ｈ，ｂｒ，Ｎ ＣＨ₂ＣＨ₂），４．４０（２Ｈ，ｂｒ ｑ，ＮＣＨ₂ＣＨ₃），５．７５および６ ．０７（いずれも１Ｈ，ｂｒ，ｓ，ビニル−ＣＨ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ａｒ Ｈ），７．２３（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ），７．３２（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），７．３ ８（１Ｈ，ｔ，ＡｒＨ），７．４６−７．６６（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．７５ −７．９５（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），８．０４（１Ｈ，ｔ，ＡｒＨ），８．１８（ ２Ｈ，ｔ，ＡｒＨ），８．８６（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）および９．０５（１Ｈ，ｄ ，ＡｒＨ）。 実施例４ スクアラート染料カルボン酸誘導体のスクシンイミジルエステルの合成 代表的な活性化法は、たとえば（２ｂ）に示す下記のようなものである カルボン酸誘導体（２ｂ）（カリウム塩）（８ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）のＤ ＭＦ（１ｍｌ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（１０．５μｌ，０．０６ｍ ｍｏｌ）およびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ チルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）（９ｍｇ，０．０３ｍｍｏ ｌ）を加えた。ＨＰＬＣ（Ｃ１８，２５ｍＭ ｐＨ７ リン酸塩緩衝液／ＭｅＣ Ｎ）によって反応をモニターし、完了すると窒素雰囲気にシールして標識化実験 に必要となるまでフリーザーに貯蔵した。 類似の方法で下記のスクアリン酸染料を活性化した。 （２ａ，ｃ−ｈ）、（３ａ）および（３ｂ） 実施例５ ＤＮＡ蛍光配列決定自動化のためのスクアリン酸誘導発蛍光団の使用 プライマーの合成 ＡＢＩ３９４型ＤＮＡ合成装置に関して確立された方法によってＭ１３（−２ ０）ユニバーサル１８量体（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １８ｍｅｒ）プライマーを調 製した。オリゴヌクレオチドの５’末端を、トリフルオロアセトアミド保護アミ ノリンカーアミダイト［Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ］により最終合成 サイクルにおいて脂肪族アミン基をカップリングさせることによって変性させた （ｍｏｄｉｆｉｅｄ）。使用したプライマー配列はＮＨ₂−ｔｇｔａａａａｃｇ ａａｃｇｇｃｃａｇｔであった。粗プライマーを３０％ＮＨ₄ＯＨ中において ５５℃で１６時間脱保護した後、フェノール／クロロホルム抽出に続くエタノー ル沈殿法を用いて精製して有機副生物およびアミン類を除いた。ＤＮＡは水中に １０Ｄ単位／μｌに溶解して−７０℃で貯蔵した。 プライマー標識化 スクアラート染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをＤＭＦまたは ＭｅＣＮ中に４−１０ｍｇ／ｍｌで供給した。プライマーを標識化するために、 染料溶液４０μｌをｐＨ８．０における１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５０ μｌおよびＮＨ₂−オリゴヌクレオチド１０μｌ［１００Ｄまたは３００μｇ］ と混合した。スルホン酸基を含まず（したがって全体的に中性電荷を有する）か つ４０％ＤＭＦにあまり溶解しないスクアリン酸染料の場合には、染料を溶解状 態に保ち、かつ標識化効率を高めるために１−４ジオキサンを１０−２０％ｖ／ ｖの最終濃度まで加えた。反応は＋４℃の暗所で６−１６ｈ持続させた。オリゴ ヌクレオチドを沈殿させ、取り込まれなかった染料を除くためにｐＨ５．０の酢 酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭまで加え、次いで９９．８％のエタノールを 水で３倍に薄めて加えることによって反応を停止させた。１５分間，１３０００ ｇで遠心分離後、ＤＮＡペレットを８０％エタノールで洗い、真空乾燥してｐＨ ８．０のＴＥ緩衝液１００μｌに溶解した。 プライマーの精製 ＨＰＬＣにより５μｍの担体サイズの２４ｃｍ×０．５ｃｍ Ｓｐｈｅｒｉ ｓｏｒｂ ＯＤＳ２カラムを用いてスクアリン酸染料標識化プライマーを残留非 共有結合染料および無標識化プライマーと分離させた。９５％溶剤Ａ／５％溶剤 Ｂから３０％溶剤Ａ／７０％溶剤Ｂへの勾配を１ｍｌ／分において使用した。Ａ ＝０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ６．８、Ｂ＝アセトニトリル。２６０ｎｍおよ び６３５ｎｍの両方で吸収する画分を集めて真空遠心分離で乾燥した。画分は１ ００μｌのＴＥ緩衝液中にプールして、配列決定の前に上記のようにエタノール で沈殿させて脱塩した。 ＤＮＡ配列決定 ２ｐｍｏｌのスクアラート染料−プライマーを２５μｌの容量の０．２ｐｍｏ ｌＭ１３ｍｐ８ファージＤＮＡと混合した。プライマー／鋳型混合物をＡ、Ｃ、 ＧおよびＴと呼ぶ６μｌずつの４つの部分に分けた。Ａｍｅｒｓｈａｍ ｋｉｔ ＲＰＮ２４３７［Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^TM標識化プライマー配列 決定キット］から２μｌの適当な酵素ヌクレオチド／緩衝液／プレミックスを加 え、反応はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６０ ０ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒで行った。試料は９５℃／３０秒：６０℃／３０秒 の２５サイクルの間に採取した。熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）後 、９０％ホルムアミド／５ｍＭ ＥＤＴＡ含有装入染料３μｌを加え、反応物を １０分間真空遠心分離にて濃縮した後、８０℃で２分間熱変性させてからＶｉｓ ｔｒａ ＤＮＡシーケンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）７２５中の６．１Ｍ尿素／ ５％ＨｙｄｒｏＬｉｎｋゲルに装入した。 電気泳動及び検出 Ｖｉｓｒａ ＤＮＡシーケンサー７２５はレーザーを３０ｍＷヘリウム−ネオ ン６３２ｎｍチューブおよびＨＶ電源に取り替えることによって改造した。オプ チカルフィルターは６４５ｎｍのロングパス（ｌｏｎｇ−ｐａｓｓ）に変えた。 ＳＱ５蛍光を検出するのに他の変更は必要ではなかった。ゲルは８−１０時間の 間１４００Ｖで移動させ、その間は３５℃以上に保った。Ｖｉｓｔｒａ Ｖ２． ０１ ソフトウエア及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｙｎＭＩＣＳ’ＩｍａｇｅＱｕ ａＮＴプログラムを用いて画像データを分析した。 結果 実施例（２ａ−ｈ）及び（３ａ−ｂ）はすべて配列のデータを示した。シグナ ル強度およびピーク解像度値は配列決定に通常用いられる市販のシアニン染料（ Ｃｙ５^TM）と同等であった。５５０の塩基に対して９８％以上の塩基呼び出し（ ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）精度が典型的である。 実施例６ ２色検出における染料標識化オリゴヌクレオチドの使用 １８量体オリゴヌクレオチドを、２つのシアニン染料（６ａ）および（６ｂ） ならびに本発明の染料（２ｆ）で別々に標識化した。これら染料オリゴヌクレオ チド抱合体の励起及び放射最大値を表１に示す。各標識化オリゴヌクレオチド１ ００ｆｍｏｌを１９％変性アクリルアミドゲル上の同じ溜め（ｗｅｌｌ）の中の 下記の対に装入した。 １． （６ａ）および（６ｂ） ２． （６ａ）および（２ｆ） ３． （２ｆ）および（６ｂ） 標識化オリゴヌクレオチドも別個に添加した。 変性条件下の電気泳動後、６３３ｎｍヘリウムネオンレーザー励起光源を有す るプロトタイプの走査型蛍光装置でゲルを走査させた。蛍光放射は３つの逐次走 査で集めた。適当な位置にある６４５ｎｍＲＧフィルター（ｓｃｈｏｔｔ）を有 する第１走査は生成するすべての蛍光を集めた。第２および第３の走査は６６０ ｎｍ ｄｆ₃₀および７００ｎｍ ｅｆｌｐフィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃ ａｌ）を有し、各染料からの蛍光を集めて識別した。 各染料対は６４５ｎｍＲＧフィルターからゲルの画像が確認され、蛍光色素分 離アルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）に実例となって、各染料の分光特性を同 定した。各走査からの画像は処理されて、重ね合わさった２色の画像を生成した 。 これらの画像は、（６ａ）と（６ｂ）および（２ｆ）と（６ｂ）を染料２色対 として用いることができることを示す。これらの染料は６３３ｎｍの励起波長に おいて効率よく励起して、分光的に分離して２色適用を関連づけることができる 。註 ６４５ｎｍＲＧは赤色ガラスのロングパスフィルターで６４５ｎｍ以下の光を 排除する。 ６６０ｄｆ₃₀フィルターは６６０ｎｍに中心があり＋／−１５ｎｍの許容範囲 を有する広域パスフィルター、すなわち６４５−６７５ｎｍからの光帯域を集め るフィルターである。７００ｅｆｌｐフィルターは７００ｎｍ以下の光を排除す る、すなわち７００ｎｍ以上を集めるロングパスフィルターである。 表１ 染料−オリゴヌクレオチド抱合体の分光特性染料18マー ＴＥ₈緩衝液の励起スペクトル最大値 ＴＥ₈緩衝液の放射スペクトル最大値 ２ｆ ６３０ｎｍ ６４２ｎｍ ６ａ ６５０ｎｍ ６６０ｎｍ ６ｂ ６８０−６８５ｎｍ ７００ｎｍ 実施例７ スクアラート染料のシクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート中心環の変 性 ２，４−ビス（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル） −シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（７ａ） １−エチル−２，３，３−トリメチルイントルニニウムヨウ化物（１ｇ）（３ ．１５ｇ，１０ｍｍｏｌ）、スクアリン酸（０．５７ｇ，５ｍｍｏｌ）およびｎ −ブタノール（４０ｍｌ）を混合して１６ｈ還流下で加熱した。ついで溶剤を蒸 発 させ、フラッシュクロマトグラフィー（０−５％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）により 生成物染料（７ａ）を単離した。収量＝１．７ｇ（７５％） λ_max（ＭｅＯＨ）＝６２８ｎｍ，λ_ex＝６３５ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．４−６．９（８Ｈ，ｍ），６．０（２Ｈ ，ｓ），４．１（４Ｈ，ｑ），１．８（１２Ｈ，ｓ），１．４（６Ｈ，ｔ）。 半染料種の３−ブトキシ−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インド リニリデンメチル）−シクロブト−３−エン−１，２−ジオン（７Ｂ）も単離さ れた。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝４２４ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．４−６．８（４Ｈ，ｍ），５．４（１Ｈ ，ｓ），４．８５（２Ｈ，ｔ），３．９（２Ｈ，ｑ），１．９（２Ｈ，ｍ），１ ．７（６Ｈ，ｓ）１．５（２Ｈ，ｍ），１．３５（３Ｈ，ｔ），１．０（３Ｈ， ｔ）３−メトキシ−２，４−ビス（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニ リデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１−オーレートメタスルフェート（ ７ｃ） スクアリリウム染料（７ａ）（１．０ｇ，２．２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（ ２０ｍｌ）に溶解して濃青色溶液を生成させた。これにジメチルスルフェート（ ５ｍｌ）を加え、ついで混合物を１６ｈ還流下で加熱した。得られた溶液を冷却 し、よく水洗した後乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、蒸発させて濃縮した。次に ジエチルエーテルをスクラッチしながら約１００ｍｌまで徐々に加えた。これに よってメチル化物（７ｃ）が金属に似た緑色針状結晶として晶出し、濾過してこ れを集め、新鮮なエーテルで洗って真空乾燥した。収量＝１．２４ｇ（９５％） 。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６３０ｎｍ，λ_ex（６２５），λ_em(ＭｅＯＨ)＝６３８ ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．４３−７．３８（４Ｈ，ｍ），７．３０ （２Ｈ，ｄ），７．１８（２Ｈ，ｄ），４．８６（３Ｈ，ｓ），４．３（４Ｈ， ｑ），３．７４（３Ｈ，ｓ），１．７３（１２Ｈ，ｓ），１．４６（６Ｈ，ｔ） 。 （７ｃ）は反応性で、Ｏ−Ｍｅ基はアルコールまたはアミンによって容易に置 換される。この事は後記する。３−ブトキシ−２，４−ビス（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニ リデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１−オーレート（７ｄ） 染料（７ｃ）（５０ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）をｎ−ブタノール（３ｍｌ） に溶解してｔ．ｌ．ｃ．（シリカ，１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）でモニターし ながら７０℃に加熱した。いったん初めの染料がすべて消費されると（３−４ｈ ）、溶液を冷却して蒸発させた。残留物をクロロホルム（１ｍｌ）に溶解してジ エチルエーテル（１５ｍｌ）で希釈して、フリーザーに１６ｈ放置後生成物が金 属様の緑色針状結晶として分離した。収量＝３６ｍｇ（アニオン未決定） λ_max（ＭｅＯＨ）＝６２８ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．５−７．０（８Ｈ，ｍ），５．９（２Ｈ ，ｓ），５．２（２Ｈ，ｔ），４．３（４Ｈ，ｑ），４．１（２Ｈ，ｔ），２． １（２Ｈ，ｍ），１．８（１２Ｈ，ｓ），１．７５−１．４（ｍ），１．１（３ Ｈ，ｔ），０．９（３Ｈ，ｔ）。３−ブチルアミノ−２，４−ビス（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インド リニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１−オーレート（７ｅ） 染料（７ｃ）（２００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ ）に溶解した。撹拌しつつあるこの溶液にｎ−ブチルアミンのジクロロメタン溶 液（ＣＨ₂Ｃｌ₂ １ｍｌ当たり約１滴）を０．１ｍｌ部分ずつ加えた。各添加後 初めの染料が存在しなくなるまで混合物をｔ．ｌ．ｃ．（シリカ，１５％ＭｅＯ Ｈ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）で分析した。次いで混合物を蒸発させ.、残留物をフラッシュ クロマトグラフィー（シリカ，４−１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製した。 これによって蒸発後１５４ｍｇの標記染料を無定形粉末として得た（アニオン未 決定）。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６４６ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）９．５（１Ｈ，幅広ｔ），７．６−６．９（ ８Ｈ，ｍ），６．５（１Ｈ，ｓ），５．７（１Ｈ，ｓ），４．７（２Ｈ，ｑ）， ４．０（２Ｈ，ｑ），３．８（２Ｈ，幅広ｑ），１．９（２Ｈ，ｍ），１．８（ １２ Ｈ，，２ｘ ｓ），１．６（２Ｈ，ｍ），１．５（３Ｈ，ｔ），１．４（３Ｈ， ｔ），１．０（３Ｈ，ｔ）。３−（７−（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）−６−ヒドロキシ−４−オ キサヘプチル）アミノ−２，４−ビス（１−エチル−３，３−ジメチル−２−イ ンドリニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１−オーレート（７ｆ） 染料（７ｃ）（５８ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍｌ）に溶 解し、これに７−（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）−６−ヒドロキシ− ４−オキサヘプチルアミン（ＥＰ０５２７１８４Ｂ１）溶液（２ｍｌのジクロロ メタン中に約０．３ｍｍｏｌ）を、ｔ．ｌ．ｃ．分析（シリカ，１５％ＭｅＯＨ ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）が完全な反応を示すまで、少量ずつ加えた。ついで溶液を蒸発さ せて残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ，４−１０％ＭｅＯＨ／Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂）で精製した。蒸発によって８５ｍｇの生成物を紫青色の発泡体として 得た（アニオン未決定）。 λ_max（ＣＨ₂Ｃｌ₂）＝６５２ｎｍ；λ_max（ＣＨ₂Ｃｌ₂＋ＣＣｌ₃ＣＯ₂Ｈ）＝ ６５２＋５０４ｎｍ。 上記は、実施例５に概略述べたと類似の方法を用いるＤＮＡ配列決定実験に用 いられた。結果は優れていた。しかし、標識化の方法はスクシンイミジルエステ ルを経るのではなく、プライマーの５’アミノ置換基による染料エーテル結合の 直接置換によるものであった。 実施例８ シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート環変性スクアラート染料の活性 エステル誘導体 ３−（Ｎ−メチル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アミノ−２．４−ビス（１ −エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−シクロブテンジ イリウム−１−オーレート塩化物（８ａ） ４−メチルアミノブタン酸塩酸塩（１５４ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）をメタノー ル（１０ｍｌ）と混合した。これにテトラブチルアンモニウムヒドロキシドのメ タノール溶液（１．０Ｍ，２．０ｍｌ，２．０ｍｍｏｌ）を加えた。次いでメチ ル化染料（７ｃ）（２８９ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加えて、混合物をさらに１ ５分撹拌した。この溶液をクロロホルムに注入し、大量の水で３回洗った後重炭 酸ナトリウム飽和水溶液で洗い、最後に０．１Ｍ ＨＣｌで洗った。この有機溶 液を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過して蒸発させた後、残留物をフラッシュクロマ トグラフィー（シリカ，５−２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）により精製して２１ ２ｍｇ（７２％）の標記染料（８ａ）を紫青色の粉末として得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６６０ｎｍ，λ_ex＝６５７ｎｍ，λ_em（ＭｅＯＨ）＝６ ７０ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．５−７．０（８Ｈ，ｍ），６．０（２Ｈ ， ｓ），４．３（４Ｈ，ｑ），３．８５（３Ｈ，ｓ），２．６（２Ｈ，ｍ），２． ２（２Ｈ，ｍ）．１．７（１２Ｈ，ｓ），１．４（６Ｈ，ｓ）。 実施例番号 可視吸光度（ＡＵ） 相対蛍光強度 （７ａ） ０．４８９ ７１３ （８ａ） ０．４８６ ２１ 表８．１ 染料（８ａ）における蛍光減少の例染料（８ａ）のスクシンイミジルエステルの合成 染料（８ａ）（５９ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍｌ）に溶 解した。この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１２ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ ）のアセトニトリル（２ｍｌ）溶液に続いてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ ジイミドのジクロロメタン溶液（１．０Ｍ，０．１２ｍｌ，０．１２ｍｍｏｌ） を加えた。この混合物を２４ｈ撹拌した後、濾過して蒸発させた。残留物をフラ ッシュクロマトグラフィー（シリカ，５−２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）により 精製して活性エステルを金属様赤色光沢を有する固体として得た。収量＝５５ｍ ｇ（８０％）。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６６０ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．６−７．７（８Ｈ，ｍ），６．０（２Ｈ ，ｓ），４．３（４Ｈ，≫ｑ），４．０（２Ｈ，幅広ｓ），３．７（３Ｈ，ｓ） ，２．９（２Ｈ，ｍ），２．７（４Ｈ，ｓ），２．３（２Ｈ，ｍ），１．７（１ ２Ｈ，ｓ），１．４（６Ｈ，ａｐｐ ｔ）。 実施例９ チアゾリニウム系スクアラート染料のシクロブテンジイリウム−１，３−ジオー レート中心環に対する変性 ２，４−ビス（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−シクロブテ ンジイリウム−１，３−ジオーレート（９ａ） ３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムヨウ化物（１ｓ）（１．５５ｇ， ５．０ｍｍｏｌ）、スクアリン酸（０．２８５ｇ，２．５ｍｍｏｌ）、キノリン （１．５ｍｌ）およびｎ−ブタノール（２０ｍｌ）を混合して窒素雰囲気中で７ ｈ還流下で加熱した。得られた濃緑色混合物をフリーザーで一夜間冷却した後濾 過して固体を集めた。この固体を少量の氷冷メタノールで洗った後ジエチルエー テルで洗い、真空乾燥して、標記染料（９ａ）を金属様黄緑色光沢を有する暗色 粉末として得た。収量＝０．７３ｇ（６８％） λ_max（ＭｅＯＨ）＝６５０ｎｍ，λ_em（ＭｅＯＨ）６６０ｎｍ δ_H（２７０ＮＨｚ，ＣＤＣｌ₃）７．６−７．０（８Ｈ，ｍ），５．９（２Ｈ ，ｓ），４．２（４Ｈ，ｑ），１．４（６Ｈ，ｔ）３−メトキシ−２，４−ビス（３−エチル−２−ベンゾチアリニルリデンメチル ）−シクロブテンジイリウム−１−オーレートメタスルフェート（９ｂ） 染料（９ｂ）（０．７３ｇ，０．７ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３０ｍｌ）に 溶解し、得られた濃青色溶液にジメチルスルフェート（３ｍｌ）を加えた。この 混合物を７ｈ還流下で加熱した後３日間放置した。ついで水洗して、有機層を残 し、水層をさらにクロロホルムで抽出した。有機抽出物を合わせて乾燥し（Ｍｇ ＳＯ₄）、濾過して、減圧で溶剤を除去して容積を約１５ｍｌにした。ジエチル エーテル（４０ｍｌ）を加えて生成物を沈殿させ、濾過して生成物を集めエーテ ルで洗い真空乾燥して標記染料（９ｂ）を得た。（１．０ｇ，１００％） ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ，１５％メタノール／ジクロロメタン。（９ｂ），Ｒｆ＝ ０．７５→（９ｂ），Ｒｆ＝０．３） λ_max（ＭｅＯＨ）６３２ｎｍ；λ_ex（ＭｅＯＨ）６４９ｎｍ，λ_em（ＭｅＯ Ｈ）６５８ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．２９（６Ｈ，ｔ，ｊ７．０Ｈｚ，２×ベ ンゾチアゾールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），３．３６（３Ｈ，ｓ，メタスルフェート− ＣＨ ₃），４．４４（４Ｈ，ｑ，ｊ７．０Ｈｚ，２×ベンゾチアゾールＮ−ＣＨ ₂ −ＣＨ₃），４．５１（３Ｈ，ｓ，スクアラート−ＯＭｅ），６．００（２Ｈ， ｓ，２×メチン＝ＣＨ−），７，３７（２Ｈ，ａｐｐ ｔ），７．５３（２Ｈ， ａｐｐ ｔ），７．２２（２Ｈ，ｄ，ｊ８．４Ｈｚ），８．０１（２Ｈ，ｄ，ｊ ８．１Ｈｚ）．３−ブチルアミノ−２，４−ビス（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメ チル）−シクロブテンジイリウム−１−オーレートメタスルフェート（９ｃ） メチル化染料（９ｂ）（１００ｍｇ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）およびｎ −ブチルアミン（０．２ｍｌ）と混合した。この混合物を室温で３０分間撹拌し 、その間に固体はすべて溶解した。ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；１５％メタノール／ ジクロロメタン。（９ｂ），Ｒｆ＝０．３→（９ｃ），Ｒｆ＝０．４５）。減圧 で溶剤を除きフラッシュクロマトグラフィー（シリカ；４−１０％メタノール／ クロロホルム）；粗製物ガムをジエチルエーテルですりつぶして金属様赤色光沢 を有する固体４３ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６５８ｎｍ；λ_ex（ＭｅＯＨ）６５７ｎｍ，λ_em（ＭｅＯ Ｈ）６７１ｎｍ。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）０．９６（３Ｈ，ｔ，ｊ７．３Ｈｚ，ブチル −ＣＨ ₃），１．３６−１．５１（８Ｈ，ｍ，２×ベンゾチアゾールＮ−ＣＨ₂− ＣＨ ₃＋−ＣＨ₂−），１．８３（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂−），３．５６（２Ｈ，ｑ ，ｊ７．１Ｈｚ，−ＨＮ−ＣＨ ₂−），４．１１＋４．４７（いずれも２Ｈ，ｑ ，ｊ７．０Ｈｚ，２×ベンゾチアゾールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），５．６３１（１Ｈ ，ｓ，メチン＝ＣＨ−），１０．１７（１Ｈ，幅広ａｐｐ ｔ）。３−（Ｎ−メチル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）アミノ−２，４−ビス（３ −エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１ −オーレート塩化物（９ｄ） ４−（メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（０．３１ｇ，２．０ｍｍｏｌ）をメタ ノール（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液にテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヒ ドロキシドのメタノール溶液（１Ｍ，４ｍｌ，４．０ｍｍｏｌ）に続いて染料（ ９ｂ）（０．５８ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた濃青色溶液を４０分 間撹拌した。ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；１５％メタノール／ジクロロメタン。（９ ｂ），Ｒｆ＝０．３→（９ｄ），Ｒｆ＜０．１）。 減圧で溶剤を除去して残留物を水ですりつぶした。濾過して金属様青銅色固体 を集めて水およびアセトンで洗った後真空乾燥して酸性染料（９ｄ）０．４３５ ｇ（８２％）を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６７０ｎｍ；λ_ex（ＭｅＯＨ）６７０ｎｍ，λ_em（ＭｅＯ Ｈ）６８６ｎｍ。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）１．３１（６Ｈ，ｔ，２×ベンゾチアゾール Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．９０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ₂−ＣＨ ₂−ＣＨ₂），２．２ ３（２Ｈ，ａｐｐ ｔ，−ＣＨ ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．３０（３Ｈ，ｓ，Ｎ−ＣＨ ₃ ），３．４５（２Ｈ，ａｐｐ ｔ，ＭｅＮ−ＣＨ ₂−），４．２８（４Ｈ，幅広 ｓ，２×ベンゾチアゾールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），５．８０（２Ｈ，ｓ，２×メチ ン＝ＣＨ−），７．２３（２Ｈ，ｄ），７．３６（４Ｈ，幅広ｍ），７．６７（ ２Ｈ，ｍ）。 実施例番号 可視吸光度（ＡＵ） 相対蛍光強度 （９ａ） ０．４９０ １１４０ （９ｄ） ０．４８５ １２４ 表９．１ 染料（９ｄ）における蛍光減少の例３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピルアミノ）−２，４ −ビス（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−シクロブテンジイ リウム−１−オーレートメタスルフェート（９ｅ） ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（３−アミノプロピル）カルバメートを用いて（９ｅ ）と類似の方法で合成した。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６５６ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．４０（９Ｈ，ｓ，ＣＭｅ₃），１．４８ （６Ｈ，ｔ，ｊ６．６，２×ＣＨ₂ＣＨ₃），１．９７（２Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ₂Ｃ Ｈ₂），３．３０（２Ｈ，ｂｒ ｑ，ＣＨ₂ＮＨ），３．６７（２Ｈ，ｂｒ ｑ， ＣＨ₂ＮＨ），３．７４（３Ｈ，ｓ，ＭｅＯＳＯ₃ ^-），４．１３および４．４４ （いずれも２Ｈ，ｂｒ ｑ，ＣＨ₂ＣＨ₃），５．６９（１Ｈ，ｓ，ビニルＨ）， ５．８９（１Ｈ，ｂｒ ｔ，ＮＨＢＯＣ），６．５８（１Ｈ，ｓ，ビニルＨ）， ７．１２−７．６０（８Ｈ，シリーズｍ，ＡｒＨ）および８．８３（１Ｈ，ｂｒ ｔ，ビニルＮＨ）。ＤＮＡ配列決定実験 実施例５に概説した方法と同様に、上記染料のスクシンイミジルエステルまた はエーテル誘導体による標識化を用いて、染料プライマー合成及び続く配列決定 実験を行った。結果はすぐれたものであった。 実施例１０ 中心で変性させたクロコン酸系染料の合成 クロコン酸染料（１０ａ） 米国特許第３７９３３１３号（１９７４）に概説されている方法に従って染料 （１０ａ）を調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）７５４ｎｍ（１０ａ）のメチル化による（１０ｂ）の生成 染料（１０ａ）（２５０ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）をクロロホルムに溶解して 濃黄緑色溶液を得た。これにジメチルスルフェート（１．５ｍｌ）を加え、混合 物を６０℃で４ｈ加熱して紫色の溶液を得た。ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ，１５％メ タノール／ジクロロメタン。（１０ａ）は黄緑色で乾燥すると青色になり、Ｒｆ ＝０．６→（１０ｂ）紫色、Ｒｆ＝０．４）。減圧で溶剤を除去して容積を約２ ｍｌにした後，ジエチルエーテルで希釈した。濾過して沈殿した固体を集め、さ らにエーテルで洗い、真空乾燥して（１０ｂ）３３０ｍｇ（１００％）を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）７６４ｎｍ（１０ｂ）のｎ−ブチルアミンとのカップリングによる（１０ｃ）の生成 メチル化染料（１０ｂ）（２０ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、 これにｎ−ブチルアミン（１滴）を加えた。溶液の色が急速に紫色から橙褐色に 変わった。ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；１５％メタノール／ジクロロメタン。（１０ ｂ）紫色、Ｒｆ＝０．４→（１０ｃ）橙褐色で乾燥すると紫になり、Ｒｆ＝０． ５５）。溶液をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ；１０％メタノール／ジ クロロエタン）により精製してアミノ染料（１０ｃ）１０ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）７６８ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）０．９８（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₃ＣＨ₂ＣＨ₂）， １．５０−２．００（１０Ｈ，ｍ，２×ＣＨ₂ＣＨ₃およびＮＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂） ，４．３０（２Ｈ，ｍ，ＮＨＣＨ₂），４．５０および４．９０（いずれも２Ｈ ， ｂｒ ｑ，２×ＣＨ₂ＣＨ₃），６．５０（１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），７．２−７． ８（９Ｈ，ｍ，ビニルＨ＋８×アリールＨ）および１１．１５（１Ｈ，ｂｒ，Ｎ ＨＣＨ₂）。（１０ｂ）の４−（メチルアミノ）ブタン酸へのカップリング ４−（メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（３１ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）をメタノ ール（５ｍｌ）に溶解した後テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキシドのメ タノール溶液（１Ｍ，０．４ｍｌ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。これに（１０ｂ ）（６０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を加えると褐色液になった。ｔ．ｌ．ｃ．（シ リカ；１５％メタノール／ジクロロメタン。（１０ｂ）紫色、Ｒｆ＝０．４→（ １０ｄ）褐色、Ｒｆ＜０．１）。次いで減圧で溶剤を除去し、残留物を分取ｔ． ｌ．ｃ．（シリカ；メタノール４０％；クロロホルム６０％）により精製して酸 性染料（１０ｄ）２０ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）７８８ｎｍ 実施例１１ スクアラート染料のホスホルアミダイト誘導体の合成 染料ホスホルアミダイト（１１ｃ）の合成 ３−メトキシ−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２−イ ンドリニリデンメチル）シクロブト−３−エン−１，２−ジオン，ナトリウム塩 （１１ａ） １−エチル−２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホネート（ １ｅ）（１．３３ｇ，５ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール（１２ｍｌ）に溶解し、得 られた溶液にソジウムメトキシド（０．２７ｇ，５ｍｍｏｌ）を加えて、混合物 を固体がすべて溶解するまで撹拌した（５分）。次いで３，４−ジメトキシシク ロブト−３−エン−１，２−ジオン（０．７１ｇ，５ｍｍｏｌ）を加え、得られ た混合物を窒素雰囲気中で４ｈ還流下で加熱した。黄緑色の混合物を０℃で１６ ｈ冷却した。沈殿した黄色固体を濾過して集め氷冷したエタノールおよびジエチ ルエーテルで洗った後５０℃で真空乾燥して標記化合物（１１ａ）０．６７ｇ（ ３４％）を得た。λ_max（ＭｅＯＨ）４２２ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）１．３（３Ｈ，ｔ，インドールＮ−ＣＨ₂− ＣＨ ₃），１．６（６Ｈ，ｓ，インドールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），４．６（３Ｈ， ｓ，−ＯＭｅ），５．６（１Ｈ，ｓ，メチン−ＣＨ＝），７．１（１Ｈ，ｄ）， ７．８（２Ｈ，ｍ）。２−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデン メチル）−４−（１−（５−ヒドロキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−イ ンドリニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１ １ｂ ） 中間体（１ｍ）（４１５ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）および半染料（１１ａ）（３ ５０ｍｇ，０．８９ｍｍｏｌ）を乾燥１−ブタノール（１０ｍｌ）中で混合し、 混合物を６ｈ還流下で加熱して濃青色の溶液を得た。そのとき反応はＵＶ／ＶＩ Ｓ（メタノール溶液，λ_max１６３２ｎｍ）およびｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ−１８シリ カ；エタノール５０％：水５０％。Ｒｆ＝０．３における１個の青いスポット） によって完了したように思われた。 アセテート染料は単離しなかった。溶剤を減圧で除去して残留物をメタノール （５ｍｌ）に再溶解した。この溶液に炭酸カリウム（２００ｍｇ）を加え、混合 物を約１ｈ撹拌した（Ｃ−１８シリカ；エタノール５０％：水５０％。染料−Ｏ Ａｃ，Ｒｆ＝０．３→（１１ｂ），Ｒｆ＝０．４）。この混合物を分取ＨＰＬＣ （Ｃ−１８カラム；水→メタノール勾配）により精製して標記化合物（１１ｂ） ４５０ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３２ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−幅広いスペクトル）１．２６（３Ｈ，ｔ，イ ンドールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．４５（４Ｈ，ｍ，２×−ＣＨ ₂−），１．６ ７（１４Ｈ，２×インドールＣＭｅ₂および−ＣＨ ₂−），３．３８（２Ｈ，−ＣＨ ₂ −ＯＨ），４．０９（４Ｈ，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−），４．３９（１Ｈ ，−ＯＨ），５．７７＋５．８０（いずれも１Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝）， ７．１６（１Ｈ，ｍ）＋７．２４（１Ｈ，ｄ）＋７．３３（２Ｈ，ｍ）＝４×イ ンドールアリール−Ｈ，７．５１（１Ｈ，ｄ）＋７．５９（１Ｈ，ｄ）＋７．６ ６（１Ｈ，ｓ）＝スルホン化インドールアリール−Ｈ。ホスフィチル化によるホスホルアミダイト染料（１１ｃ）の生成 ヒドロキシ染料（１１ｂ）（２５０ｍｇ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ ド（５ｍｌ）に溶解した。得られた溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン （０．１７ｍｌ）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホ ルアミダイトを０．０５ｍｌずつ、ｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ−１８シリカ；エタノール ５０％：水５０％。（１１ｂ），Ｒｆ＝０．４→（１１ｃ），Ｒｆ＝０．５）で モニターしながら添加した。３回分（合計０．１５ｍｌ）を加えた後反応が完了 したように思われた。この溶液は次に直接ＤＮＡ自動合成装置で使用した。染料ホスホルアミダイト（１１ｆ）の合成 ２−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−４−（ １−（５−アセトキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメ チル）−シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１１ｄ ） 中間体（１ｍ）（４１５ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）および３−ブトキシ−４−（ １−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−シクロブト− ３ −エン−１，２−ジオン（７ｂ）（３３９ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を無水１−ブ タノール（１０ｍｌ）と混合し、得られた混合物をさらに１６ｈ還流下で加熱し て、濃青色の溶液を得た。減圧で溶剤を除去し、残留物をフラッシュクロマトグ ラフィー（シリカ；４−１０％メタノール／ジクロロメタン）で精製して標記染 料（１１ｄ）４２０ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６２８ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．３８（３Ｈ，ｔ，ｊ７．１Ｈｚ，インド ールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．４７（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ ₂−），１．６５−１． ８５（１６Ｈ，ｍ，２×インドールＣＭｅ₂および２×−ＣＨ ₂−），２．０２（ ３Ｈ，ｓ，ＣＨ ₃−ＣＯＯ−），４．００（４Ｈ，幅広，２×インドールＮ−ＣＨ ₂ −），４．０４（２Ｈ，ｔ，ｊ６．４Ｈｚ，−ＣＨ ₂−ＯＡｃ），５．９２− ５．９４（いずれも１Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝），６．９６（２Ｈ，ｍ）＋ ７．１３（２Ｈ，ｍ）＋７．３０（４Ｈ，ｍ）＝８×インドールアリール−Ｈ２−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドレニリデンメチル）−４−（ １−（５−ヒドロキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメ チル）−シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１１ｅ） アセテート保護染料（１１ｄ）（４００ｍｇ）のメタノール（２０ｎｌ）溶液 に炭酸カリウム（２００ｍｇ）を加えた。混合物をｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；１０ ％メタノール／ジクロロメタン。（１１ｄ），Ｒｆ＝０．６→８１１ｅ），Ｒｆ ＝０．３５）でモニターしながら室温で撹拌した。２ｈ後減圧で溶剤を除去し、 残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ；４−１０％メタノール／ジク ロロメタン）により精製して標記化合物（１１ｅ）３３８ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６２８ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．３７（３Ｈ，ｔ，ｊ７．２Ｈｚ，インド ールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．５４（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ ₂−），１．６７−１． ８８（１６Ｈ，ｍ，２×インドールＣＭｅ₂および２×−ＣＨ ₂−），２．４５（ １Ｈ，幅広ｓ−ＯＨ），３．６７（２Ｈ，ｔ，ｊ６．２Ｈｚ，−ＣＨ ₂−ＯＨ） ，４．０４（４Ｈ，幅広，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−），５．９２＋５．９８ （い ずれも１Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝），６．９７（２Ｈ，ｍ）＋７．１２（２ Ｈ，ｍ９＋７．３０（４Ｈ，ｍ９＝８×インドールアリール−Ｈ。ホスフィチル化によるホスホルアミダイト染料（１１ｆ）の生成 ヒドロキシ誘導染料（１１ｅ）（２０５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気 中で乾燥ジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解した。この青色溶液にＮ，Ｎ−ジイソ プロピルエチルアミン（０．１ｍｌ）に続いて２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ ソプロピルクロロホスホルアミダイト（５滴）を添加し、混合物を室温で１．５ ｈ撹拌した。ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；１０％メタノール／ジクロロメタン。（１ １ｅ），Ｒｆ＝０．３５→（１１ｆ），Ｒｆ＝０．５５）。次いで混合物を１０ ％トリエチルアミン／酢酸エチルで希釈して１０％炭酸ナトリウム水溶液および ブラインで洗った。この有機溶液を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、濾過して、減圧で溶 剤を除去した。得られたガムを短いシリカプラグ（ｓｉｌｉｃａ ｐｌｕｇ）に より精製（５−１５％トリエチルアミン／ジクロロメタン）して、溶剤除去後標 記化合物（１１ｆ）（１５０ｍｇ）を得た。次にこの溶液はＤＮＡ自動合成装置 に直接使用した。ホスホルアミダイト染料（１１ｌ）の合成 ２−４−ビスー（１−（５−ヒドロキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−イ ンドリニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１ １ｇ） 中間体（１ｍ）（４．３５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）および３，４−ジヒドロキ シシクロブト−３−エン−１，２−ジオン（５７０ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）を乾 燥１−ブタノール（２０ｍｌ）中で混合し、得られた混合物を１６ｈ還流下で加 熱して濃青色溶液を得た。ｔ．ｌ．ｃ．分析によって３種の青色生成物が認めら れた（シリカ；１５％メタノール／ジクロロメタン。Ｒｆ＝０．８，０．６５お よび０．５５）。溶剤を減圧で除去して残留物をメタノール（２０ｍｌ）に溶解 してから炭酸カリウム（５００ｍｇ）を加えた。この混合物を室温で２ｈ撹拌し た；（シリカ；１５％メタノール／ジクロロメタン。Ｒｆ＝０．８，０．６５お よび０．５５→Ｒｆ０．５５のみ）。溶剤除去後残留物を水とジクロロメタンで 分配させ、有機層を残して、水およびブラインで洗った後乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄） 、濾過して減圧で溶剤を除去した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ；４ −１５％メタノール／ジクロエタン）により粗染料を精製して標記化合物（１１ ｇ）１．４７ｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３０ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．５２（４Ｈ，ｍ，２×−ＣＨ ₂−），１ ．６５−１．９０（２０Ｈ，ｍ，２×インドールＣＭｅ₂および４×−ＣＨ ₂−） ，２．７（２Ｈ，幅広，２×−ＯＨ），３．６６（４Ｈ，ｔ，ｊ６．２Ｈｚ，２ ×−ＣＨ ₂−ＯＨ），４．０２８４Ｈ，幅広，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−），５ ．９６（２Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝），６．９７（２Ｈ，ｄ，ｊ７．７Ｈｚ ）＋７．１２（２Ｈ，ｔ，ｊ７．３ａＨｚ）＋７．３０（４Ｈ，ｍ）＝８×イン ドールアリール−Ｈ。２−（５−ヒドロキシペンチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチ ル）−４−（１−（（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）ペンチル）−３， ３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１， ３−ジオーレート（１１ｈ） ビスヒドロキシ染料（１１ｇ）（１．１４ｇ，２．０ｍｍｏｌ）及び４，４’ −ジメトキシドリチルクロリド（０．７５ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン （１０ｍｌ）に溶解して窒素雰囲気中で室温下１６ｈ撹拌した。ｔ．ｌ．ｃ．分 析（シリカ；１０％メタノール／ジクロロメタン）は未反応物（１１ｇ）（Ｒｆ ＝０．２５）、生成物（１１ｈ）（Ｒｆ＝０．４５）及び若干のビス保護化合物 （Ｒｆ＝０．９）の３つの青いスポットを示した。反応はメタノール（１ｍｌ） の添加によって停止させた後５分間撹拌してから溶剤を減圧で除去した。次いで 青色成分をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ；１−１０％メタノール／ク ロロホルム）によって分離した。ビス保護化合物を含む画分は集めてトリクロロ 酢酸（０．５ｇ）で１時間処理した後未反応染料を含む画分と一緒にした。（１ １ｇ）はさらに回収して上記のように再反応させた。反応及び精製後、生成物（ １１ｈ）は、最初の反応からのものと合わせると合計１．１８ｇを得た。 λ_max(ＣＨ₂Ｃｌ₂）６３４ｎｍ。トリクロロ酢酸の添加は４１６ｎｍおよび５ ０４ｎｍに、ＤＭＴカチオンに相当する余分のピークを示した。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．０２（４Ｈ，ｍ，２×−ＣＨ ₂−），１ ．５１−１．８８（２０Ｈ，ｍ，２×インドールＣＭｅ₂および４×−ＣＨ ₂−） ，２．４（１Ｈ，幅広，−ＯＨ），３．０３（２Ｈ，ｔ，ｊ６．０Ｈｚ，−ＣＨ ₂ −ＯＤＭＴ），３．６６（２Ｈ，ｔ，ｊ６．２Ｈｚ，−ＣＨ ₂−ＯＨ），３．７ ６（６Ｈ，ｓ，２×Ａｒ−ＯＭｅ），１４．００８４Ｈ，幅広，２×インドール Ｎ−ＣＨ ₂−），５．９２＋５．９８（いずれも１Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝ ），６．７８（４Ｈ，ｍ），６．９４（２Ｈ，ｍ），７．０９−７．４０（１５ Ｈ，ｍ）。ホスフィチル化によるホスホルアミダイト染料（１１ｉ）の生成 染料（１１ｈ）（２２０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン （２ｍｌ）に溶解し、この濃青色溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロビルエチルアミン（ ０．１ｍｌ）を加え、続いて２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルチルク ロロホスホルアミダイト（０．１ｍｌ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混 合物を室温で撹拌して、反応をｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；酢酸エチル５０％：アセ トニトリル５０％。（１１ｈ），Ｒｆ＝０．３５→（１１ｉ），Ｒｆ＝０．６５ ）でモニターした。２ｈ後混合物を酢酸エチル（２５ｍｌ）で希釈して５％炭酸 水素ナトリウム水溶液およびブラインで洗った後乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、厚さ０ ．５ｃｍのシリカプラグで濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶剤を減圧で除去し たのち、乾燥トルエン溶液から再蒸発させた。次いで残留物を高真空で乾燥して 、ｔ．ｌ．ｃ．（シリカ；酢酸エチル５０％：アセトニトリル５０％。１つの青 いスポットＲｆ＝０．６５）で再分析して、直接ＤＮＡ自動合成装置にかけてＤ ＮＡの配列決定に使用した。染料ホスホルアミダイト（１１ｌ）の合成 ２−（４−ビス（１−（５−ヒドロキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−ベ ンズインドリニリデンメチル）−シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレー ト（１１ｊ） 染料（１１ｇ）と類似の方法で合成した。２．９６ｇ（４３％）。 λ_max（ＭｅＯＨ）６６３ｎｍ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．５０（４Ｈ，ｍ，２×−ＣＨ ₂−），１ １．６６（４Ｈ，ｍ，２×−ＣＨ ₂−），１．８６（４Ｈ，ｍ，２×−ＣＨ ₂−） ，１．９７（１２Ｈ，ｓ，２×インドールＣＭｅ₂），３．４（２Ｈ，ｓ，２× −ＯＨ），３．６２（４Ｈ，ｔ，２×−ＣＨ ₂−ＯＨ），４．０７（４Ｈ，幅広 ，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−），５．９７（２Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝） ，７．２２（２Ｈ，ａｐｐ ｔ），７．３２（２Ｈ，ａｐｐ ｔ），７．４７（ ２Ｈ，ｔｄ），７．７９（４Ｈ，ａｐｐ ｔ），８．１０（２Ｈ，ｄ）。２−（５−ヒドロキシペンチル−３，３−ジメチル−２−ベンズインドリニリデ ンメチル）−４−（１−（（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）ペンチル） −３，３−ジメチル−２−ベンズインドリニリデンメチル）−シクロブテンジイ リウム−１，３−ジオーレート（１１ｋ） 染料（１１ｈ）と類似の方法によって合成した。１．５８ｇ（３８％）。 λ_max（ＭｅＯＨ）６６３ｎｍ ＭＳ（ＮＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：９３９ δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．４−１．９８１２Ｈ，ｍ，６×−ＣＨ ₂ −），１．９８２＋１．９８５（いずれも６Ｈ，ｓ，２×インドールＣＭｅ₂） ，２．９８（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ ₂−ＯＤＭＴ），３．６３（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ ₂− ＯＨ），３．６７（３Ｈ，ｓ，ＭＭＴ−ＯＭｅ），４．０４（４Ｈ，幅広，２× インドールＮ−ＣＨ ₂−），５．９３＋５．９９（いずれも１Ｈ，ｓ，２×メチ ン−ＣＨ＝），６．６９（２Ｈ，ｍ），７．１−７．２４（１０Ｈ，ｍ），７． ２８−７．３６（６Ｈ，ｎ），７．４５−７．５３（２Ｈ，ｍ），７．７０−７ ．８３（４Ｈ，ｍ），８．０８−８．１６（２Ｈ，ｍ）。 染料モノマーのＤＮＡプライマーへの組み込みおよび配列決定における使用 Ｐｈａｒｍａｃｉａ“Ｐａｃ”ベース アミダイト［実施例（１１ｆ）］また はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ“Ｕｌｔｒａ−Ｍｉｌｄ”アミダイト［（１１ｃ ），（１１ｉ）］を用いて、ＡＢＩ ３９４型 ４カラムＤＮＡ合成装置にかけ て染料プライマーを合成した。他のすべての合成試薬はＡＢＩから得た。オリゴ ヌ クレオチドは、カップリング時間を手動で延長させる染料−アミダイトのカップ リング反応以外は標準サイクルを用いて０．２μｍｏｌスケールで調製した。 使用したプライマー配列は−２１ Ｍ１３ ユニバーサル１８量体 ５’ｔｇ ｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ ３’であった。担体からの切断に続く脱保 護は３０％ＮＨ₄ＯＨを用い６０℃で２０分行うか（１１ｆ）、または０．０５ Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃のＭｅＯＨ溶液で２５℃で２ｈ行った。脱保護後粗オリゴヌクレオ チドを真空濃縮した後１０分の１の容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム及び３倍量の無 水エタノールを加えて沈殿させた。数分間の１３０００ｇによる遠心分離後ＤＮ Ａペレットを７０％エタノールで洗い１００μｌの９５％ＴＥ緩衝液／５％アセ トニトリルに溶解してＨＰＬＣに備えた。分光分析用に１つの画分を用い、ＤＮ Ａと染料との吸光係数の比から概略の標識化率を判断した。オリゴヌクレオチド の最終精製は、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ２Ｃ１８カラム［５μ］を用いる ＨＰＬＣにより、０．１Ｍ酢酸アンモニウム及びアセトニトリルを溶離掖とし、 １ｍｌ／分において５−７０％アセトニトリル勾配を用いて行った。検出は２６ ０ｎｍおよび６４０ｎｍで行い両波長で吸収する画分を集めた。これらを上記の ように真空濃縮してエタノールで沈殿させた。ＤＮＡペレットはＴＥ緩衝掖に溶 解してＯＤ２１５−７５０ｎｍスペクトルを測定した。プライマーはＤＮＡ配列 決定のために２ｐｍｏｌ／μｌに希釈した。 配列決定実験は実施例５に概説したように行い優れた結果を収めた。実施例１２ ホスホルアミダイトへの転化に適するヒドロキシスクアラート染料誘導体の合成 ２−（１−（１３−ヒドロキシ−７−アザ−６−オキソトリデカニル）−３，３ −ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−エチ ル−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−シク ロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１２ａ） ＮＨＳエステルとしての染料（２ｂ）の活性化 染料（２ｂ）（１００ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジ ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロ ホスフェート（７０ｍｇ，０．１７ｍ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルア ミン（１０滴）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中で混合して濃 青色溶液を得た。染料−ＮＨＳエステルを得る反応をｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ−１８シ リカ；メタノール４０％：水６０％。（２ｂ）Ｒｆ＝０．２，ＮＨＳエステルＲ ｆ＝０．３）によってモニターした。反応は２ｈ後に完了した。生成物はさらに 処理することなく次の反応に使用した。２−（１−（１３−ヒドロキシ−７−アザ−６−オキントリデカニル）−３，３ −ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−エチ ル−３，３−ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−シク ロブテンジイリウム−１．３−ジオーレート（１２ａ） 上記混合物に６−アミノヘキサン−１−オール（２５ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ） を加えて、混合物をｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ−１８シリカ；メタノール５０％：水５０ ％。ＮＨＳエステルＲｆ＝０．４，（１２ａ）Ｒｆ＝０．５５）でモニターしな がら室温で撹拌した。反応は１ｈ後完了した。粗染料をジエチルエーテルで沈殿 させ、真空乾燥した後分取ＨＰＬＣ（Ｃ−１８シリカカラム；水→メタノール勾 配）により精製した。標記化合物（１２ａ）の収量＝７０ｍｇ。２−（１−（１４−（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）−１３−ヒドロキ シ−１１−オキサ−７−アザ−６−オキソテトラデカニル）−３，３−ジメチル −５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３ −ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−シクロブテンジ イリウム−１，３−ジオーレート（１２ｂ） ＮＨＳエステルとしての染料（２ｂ）の活性化 実施例（１２ａ）に記載したように染料（２ｂ）（４０ｍｇ，０．０５ｍｍｏ ｌ）を反応させて、ＮＨＳエステルを得、それを精製することなく使用した。２−（１−（１４−（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）−１３−ヒドロキ シ−１１−オキサ−７−アザ−６−オキソテトラデカニル）−３，３−ジメチル −５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３ −ジメチル−５−スルホナト−２−インドリニリデンメチル）−シクロブテンジ イリウム−１，３−ジオーレート（１２ｂ） 上記混合物に７−（４，４’−ジメトキシドリチルオキシ）−６−ヒドロキシ −４−オキサヘプチルアミン（３０ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）を加えて、絶え ず撹拌した。反応をｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ−１８シリカ；エタノール５０％：水５０ ％。ＮＨＳエステルＲｆ＝０．８，（１２ｂ）Ｒｆ＝０．６）によってモニター した。１ｈ後反応は完了し、ジエチルエーテルを加えて染料を沈殿させた。粗製 物を分取ｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ−１８シリカ；メタノール６０％：水４０％）により 精製して純染料（１２ｂ）５５ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３６ｎｍ；λ_em（ＭｅＯＨ） δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１．１−１．３５（５Ｈ，ｍ），１．４−１ ．７（１８Ｈ，ｍ，インドールＣＭｅ₂および３×−ＣＨ ₂−），１．９７（２Ｈ ，ｔ，Ｒ−ＣＨ ₂−ＣＯＮＨ−），２．８５（２Ｈ，ｍ，グリコール−ＣＨ２− ），２．９４（２Ｈ，ｍ，グリコール−ＣＨ２−），３．１０（１Ｈ，ｍ，グリ コー ル−ＣＨ−），３．２８（４Ｈ，ｍ，−ＣＯＮＨ−ＣＨ ₂−および−ＣＨ ₂Ｏ−グ リコール），３．６４（６Ｈ，ｓ，２×Ａｒ−ＯＭｅ），４．０４（４Ｈ，幅広 ｍ，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−），４．８１（１Ｈ，ａｐｐｄ，−ＯＨ），５ ．７４（２Ｈ，ｓ，２×メチン−ＣＨ＝），６．７９（４Ｈ，ｍ）＋７．０８− ７．２８（９Ｈ，ｍ）＝×ＤＭＴアリール−Ｈ，７．３２（２Ｈ，ｍ）＋７．５ ５（２Ｈ，ｍ）＋７．６１（２Ｈ，ｍ）＝６×インドールアリール−Ｈ，７．６ ９（１Ｈ，ｔ，−ＣＯＮＨ−）。 実施例１３ 非スルホン化スクアラート染料の合成とスルホン酸誘導スクアラート染料との光 安定性の比較 ２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリ デンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメ チル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１３ａ） （２ｂ）ブチルエステル（上記参照）、（１ｉ），スクアリン酸および（１ｇ ）と同様に標記化合物をそのブチルエステルとして調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３０ｎｍ；λ_em（ＭｅＯＨ）６４３ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）０．９３（３Ｈ，ｔ，ｊ７．３），１．３− １．９２（１３Ｈ，ｍ），１．７８（１２Ｈ，ｓ），２．３２（２Ｈ，ｔ，ｊ７ ．３），３．９−４．２（４Ｈ，ｍ），４．０６（２Ｈ，ｔ，ｊ６．７），５． ９４（１Ｈ，ｓ），５．９７（１Ｈ，ｓ），６．−７．０５（２Ｈ，ｍ），７． １１−７．２５（２Ｈ，ｍ）および７．２６−７．４５（４Ｈ，ｍ）； 実施例（２ｂ）と類似の方法でブチルエステルをけん化して標記化合物（１３ ａ）を得た。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）１．４０（３Ｈ，ｔ，ｊ７．３），１．６０ −２．００（６Ｈ，ｍ），１．７８（１２Ｈ，ｓ），２．４２−２．５０（２Ｈ ，ｍ），３．９５−４．１８（４Ｈ，ｍ），５．９０−６．００（１Ｈ，ｂｒ ｓ），６．０５−６．１５（１Ｈ，ｂｒ ｓ），６．９３−７．０８（２Ｈ，ｍ ），７．１０−７．２５（２Ｈ，ｍ）および７．２８−７．４５（４Ｈ，ｍ） 実施例（４）に記載した方法に従って（１３ａ）のスクシンイミジルエステル への活性化を行った。２−（１−ブチル−３，３−ジメチル−５−カルボキシメチル−２−インドリニ リデンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリデン メチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１３ｂ） 実施例（２ｂ）ブチルエステル（上記参照）、（１ｊ）、スクアリン酸および （１ｇ）と同様に標記化合物をそのブチルエステルとして調製した。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３２ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）０．９０（３Ｈ，ｔ），０．９８（３Ｈ，ｔ ，１．２０−２．１０（７Ｈ，ｍ），１．８０（１２Ｈ，ｓ），３．６５（２Ｈ ，ｂｒ ｓ），３．９０−４．２０（６Ｈ，ｍ），５．９５（２Ｈ，ｓ），６． ８５−７．０５（２Ｈ，ｍ）および７．１５−７．４５（５Ｈ，ｍ）。 実施例（２ｂ）と類似の方法でブチルエステルをけん化して標記化合物（１３ ｂ）を得た。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）０．９５（３Ｈ，ｔ），１．３５−１．５５ （５Ｈ，ｍ），１．７０−１．９０（１４Ｈ，ｍ），３．７０（２Ｈ，ｓ），３ ．８０−４．２０（４Ｈ，ｍ），５．９６および６．００（いずれも１Ｈ．ｓ） ，６．９２（１Ｈ，ｄ），７．００（１Ｈ，ｄ），７．１５（１Ｈ，ｄ）および ７．３２−７．４１（１Ｈ，ｍ） 実施例（４）に記載した方法に従って（１３ａ）のスクシンイミジルエステル への活性化を行った。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−ベンズインド リニリデンメチル）−４−（１−エチル−３，３−ジメチル−２−ベンズインド リニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１３ｃ） ２−ブタノール（２０ｍｌ）中の（１ｋ）（１１９ｍｇ）、（１ｌ）（１６２ ｍｇ）、スクアリン酸（３７ｍｇ）および酢酸カリウム（９８ｍｇ）の混合物を １０ｈ１００℃で加熱した後真空濃縮した。ＨＰＬＣ（Ｃ₁₈イソクラチック（ｉ ｓｏｃｒａｔｉｃ）ＭｅＯＨ）による残留物の精製によって標記化合物（１３ｃ ）を得た。 δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）１．４５（３Ｈ，ｔ），１．７６（２Ｈ，ｍ ），１．８５−２．０５（４Ｈ，ｍ），２．０７（１２Ｈ，ｓ），２．４８（２ Ｈ，ｍ），４．１０−４．２８（４Ｈ，ｍ），５．９８および６．１２（いずれ も１Ｈ，ｓ）， 実施例（４）に記載した方法に従って（１３ｃ）のスクシンイミジルエステル への活性化を行った。２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−インドリニリ デンメチル）−４−（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）−シク ロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１３ｄ） 中間体（１ｌ）およびスクアリン酸から調製した中間体半染料ならびに中間体 （１ｓ）から合成して、実施例（２ｂ）に従ってｎ−ブチルエステルを得た。 けん化によって遊離酸（１３ｄ）を得、これを実施例（４）に従ってＮ−スク シンイミジルエステルに変えた。 λ_max（ＭｅＯＨ）６３８ｎｍ δ_H（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）１．４６（３Ｈ，ｔ，ＣＨ₂Ｍｅ），１．６ ３−２．０７（６Ｈ，ｍ），１．７５（６Ｈ，ｓ，２×Ｍｅ），２．４６（２Ｈ ，ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），３．９５（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＮＣＨ₂ＣＨ₂），４．２５ （２Ｈ，ｑ，ＮＣＨ₂ＣＨ₃），５．９３および６．００（いずれも１Ｈ，ｓ，２ ×ビニルＣＨ），６．９０（１Ｈ．ｄ，ＡｒＨ），７．０４−７．５４（６Ｈ， シリーズｍ，ＡｒＨ）および７．６１（１Ｈ，ｄ，ＡｒＨ）２−（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−２−ベンズインド リニリデンメチル）−４−（１−メチル−３，３−ジメチル−２−インドリニリ デンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオーレート（１３ｅ） １，２，３，３−テトラメチルイントルニニウムヨウ化物およびスクアリン酸 から調製した中間体半染料ならびに中間体（１ｌ）から合成して実施例（２ｂ） に従ってｎ−ブチルエステルを得た。 けん化によって遊離酸（１３ｅ）を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）６４４ｎｍ 遊離酸：δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）１．７０−１．８０（１２Ｈ，ｍ， インドールＣＭｅ₂＋３×ＣＨ₂），２．０５（６Ｈ，ｓ，ベンズインドールＣＭ ｅ₂），２．４７（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ），３．５７（３Ｈ，ｂｒ ｓ，インドールＮＣＨ₃），４．１６（２Ｈ，ｂｒ ｔ，ベンズインドールＮＣ Ｈ₂−），５．８８＋６．１４（いずれも１Ｈ，ｓ，ビニルＨ），７．００（１ Ｈ，ｄ），７．１３（１Ｈ，ｍ），７．２６−７．３６（３Ｈ，ｍ），７．４３ （１Ｈ，ａｐｐ ｔ），７．５８（１Ｈ，ａｐｐ ｔ），７．８９（２Ｈ，ａｐ ｐ ｔ），８．２０（１Ｈ，ｄ）。 インドリニウム系スクアラート染料の光安定性実施例 全体的電荷 スルホン酸アリール基の数 スルホン酸アルキル基の数 Ｔ_1/2（分） Ｃｙ５^TM −１ ２ ０ ２６．４ １３ａ ０ ０ ０ ２５．４ １３ｂ ０ ０ ０ ２６．１ ２ｆ −１ １ ０ ４０．４ ２ｄ −１ １ ０ ５１．０ ２ｅ −３ １ ２ ６１．２ ２ｃ −２ ２ ０ ８１．３ ２ａ −３ ２ １ ８８．５ ２ｂ −２ ２ ０ ９４．９ ベンズインドール系染料実施例 全体的電荷 スルホン酸アリール基の数 スルホン酸アルキル基の数 Ｔ_1/2（分） １３ｃ ０ ０ ０ ２２．４ ２ｈ −２ ２ ０ ３８．９ チアゾリウム／インドリニウム混合系スクアラート染料の光安定性実施例 全体的電荷 スルホン酸アリール基の数 スルホン酸アルキル基の数 Ｔ_1/2（分） １３ｄ ０ ０ ０ ７．７ ３ｂ −１ ０ １ １０．７ ３ａ −１ １ ０ １５．２実施例１４ エネルギー転移カセット（Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ）の合成 ２，４−ビス（１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スル ホナト−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオ ーレート（１４ａ） 中間体（１ｃ）（１．４２ｇ，３．０ｍｍｏｌ）とスクアリン酸（０．１７ｇ ，１．５ｍｍｏｌ）を無水１−ブタノール（１０ｍｌ）中で混合した。得られた 混合物を１１０℃で６５ｈ加熱した。この間に濃緑青色を生じ、若干の暗色固体 が存在した。溶剤を減圧で除去した後残留物をメタノール（１５ｍｌ）に再溶解 して水酸化カリウム（０．５ｇ，９．０ｍｍｏｌ）の水（１０ｍｌ）溶液を加え た。この溶液を２０ｈ撹拌した。ｔ．ｌ．ｃ．分析（Ｃ１８−シリカ；メタノー ル５０％：水５０％。Ｒｆ＝０．６における主要青色スポット）。次いで溶液を 酢酸で中和してから分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水→メタノール勾配）で精製して標 記染料（１４ａ）を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６３８ｎｍ；λ_ex（ＭｅＯＨ）＝６３６ｎｍ；λ_em＝６ ４４ＮＭ。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）１．５２（４Ｈ，ｍ），１．７０（４Ｈ，ｍ ），１．７７（１２Ｈ，ｓ，インドールＣＭｅ₂），１．８６（４Ｈ，ｍ），２ ．３５（４Ｈ，ｔ，ｊ７．３，２×−ＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ），４．１７（１２Ｈ，幅広 ｓ，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−），６．０３（２Ｈ，ｓ，２×ビニル−ＣＨ＝ ），７．３３（２Ｈ，ｄ，ｊ７．７Ｈｚ），７．８６−７．９０（４Ｈ，ｍ）。３−（３−（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）プロピルアミノ）−２，４− ビス（３−エチル−２−ベンゾチアゾリニリデンメチル）シクロブテンジイリウ ム−１−オーレートメタスルフェート（１４ｂ） 染料（９ｂ）（５６０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ） に溶解した。得られた濃青色溶液にｔ−ブチル−Ｎ−（３−アミノプロピル）カ ルバメート（１９０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物をｔ．ｌ．ｃ ．（シリカ；１０％メタノールのジクロロメタン溶液。（９ｂ）Ｒｆ＝０．２→ （１４ｂ）Ｒｆ＝０．３）によって反応が完了するまで室温で撹拌した。次いで この溶液を水洗し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、溶剤を減圧で除去して容積 を約５ｍｌにした。生成物はさらにジエチルエーテルを加えて沈殿させ、得られ た固体を集めてエーテルで洗い、３５℃で真空乾燥して標記染料（１４ｂ）（６ ４０ｍｇ）を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６５８ｎｍ；λ_ex（ＭｅＯＨ）＝６５８ｎｍ；λ_em＝６ ７０ＮＭ。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）１．４０（９Ｈ，ｓ，−ＣＭｅ₃），１．４ ８（６Ｈ，ｔ，ｊ７．０Ｈｚ，チアゾールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．９７（２Ｈ ，ｑｕｉｎ，−ＣＨ₂−ＣＨ ₂−ＣＨ₂−），３．３１および３．６６（いずれも ２Ｈ，ｑ，ＮＨ−ＣＨ ₂−），３．７９（３Ｈ，ｓ，メタスルフェート），４． １３および４．４４（いずれも２Ｈ，ｑ，チアゾールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），５． ６９（１Ｈ，ｓ，ビニル−ＣＨ＝），５．８９（１Ｈ，幅広ｔ，ＢＯＣ−ＮＨ− ），６．５８（１Ｈ，ｓ，ビニル−ＣＨ＝），７．１２−７．２０（２Ｈ，ｍ） ，７．２８−７．３６（３Ｈ，ｍ），７．４２−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．５ ８（１Ｈ，ｄ），８．８３（１Ｈ，幅広ｔ，スクアラート−ＮＨ−ＣＨ₂−）。３−（（アミノプロピル）アミノ）−２，４−ビス（３−エチル−２−ベンゾチ アゾリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１−オーレートトリフルオロ アセテート，トリフルオロ酢酸塩（１４ｃ） 保護染料（１４ｂ）（２５０ｍｇ）をクロロホルム（４ｍｌ）に溶解した。こ の濃青色溶液にトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加えると溶液は黄褐色に変わった 。この混合物を１ｈ撹拌し、減圧で溶剤を除去した。残留物を４ｍｌの１０％メ タノール／ジクロロメタンに再溶解すると青色を保った。ジエチルエーテルを加 えて染料を沈殿させて固体を集め、新しいエーテルでよく洗い、５０℃で真空乾 燥して標記アミン染料（１４ｃ）２４５ｍｇを得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６５６ｎｍ；λ_ex（ＭｅＯＨ）＝６５７ｎｍ；λ_em＝６ ７１ｎｍ。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１．２７−１．３６（６Ｈ，２×重複ｔ，チ アゾールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃），１．９５（２Ｈ，ｑｕｉｎ，−ＣＨ₂−ＣＨ ₂−Ｃ Ｈ₂−），２．９６８２Ｈ，幅広，−ＣＨ ₂−ＮＨ₃ ⁺），３．７２（２Ｈ，ｑ，− ＮＨ−ＣＨ ₂−），４．３３−４．４５（４Ｈ，２×重複幅広ｑ，チアゾールＮ −ＣＨ ₂−ＣＨ₃），５．９１および６．２３（いずれも１Ｈ，ｓ，ビニル−ＣＨ ＝），７．３２−７．４２（２Ｈ，ａｐｐ ｑｕｉｎ．），７．４９−７．５８ （２Ｈ，ｍ），７．６５−７．７５（２Ｈ，２×ｄ），７．８４（３Ｈ，幅広ｓ ，−ＮＨ ₃ ⁺），７．９４−８．０２（２Ｈ，２×ｄ），８．９８（１Ｈ，幅広ｔ ，スクアラート−ＮＨ−ＣＨ₂−）。（１４ａ）の（１４ｃ）へのカップリングによるＥＴカセット（１４ｄ）の生成 二酸染料（１４ａ）（６０ｍｇ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍ ｌ）に溶解して、この濃青色溶液にＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（２ ７ｍｇ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５０μｌ）を加えた。こ の混合物を室温で１ｈ撹拌した。ｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ１８シリカ；メタノール５０ ％：水５０％。（１４ａ）Ｒ_f＝０．５→モノＮＨＳエステル，Ｒｆ＝０．３５ およびビスＮＨＳエステル，Ｒ_f＝０．２）。次いで上記混合物にＮ，Ｎ−ジイ ソプロピルエチルアミン（１５０μｌ）及びアミン染料（１４ｃ）（４５ｍｇ） を加えて、この混合物をさらに２ｈ撹拌した。ｔ．ｌ．ｃ．（Ｃ１８シリカ；メ タノール８５％：水１５％。（１４ａ）Ｒ_f＝０．９５，アミン（１４ｃ）Ｒ_f＝ ０．１，生成物（１４ｄ）Ｒ_f＝０．５５）。ジエチルエーテルで沈殿させて粗 染料を単離した。粗固体を分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８シリカ；水→メタノール勾配） により精製して化合物染料（１４ｄ）を得た。 λ_max（ＭｅＯＨ）＝６３８ｎｍ、短い波長と長い波長のショルダー（ｓｈｏ ｕｌｄｅｒ）を有する。 λ_ex（ＭｅＯＨ）＝６４０ｎｍ；λ_em＝６７１ｎｍ。 δ_H（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１．１７−１．３５（８Ｈ，ｍ，２×チアゾ ールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃および−ＣＨ ₂−），１．５０−１．７２（２４Ｈ，ｍ， ２×インドールＮ−ＣＨ₂−ＣＨ ₃および６×−ＣＨ ₂−），２．０３（２Ｈ，幅 広ｔ，−ＣＨ ₂−ＣＯＮＨ），２．１８（２Ｈ，ｔ，７．２Ｈｚ，−ＣＨ ₂−ＣＯ₂ Ｈ），３．０７および３．５２（いずれも２Ｈ，幅広，ＮＨ−ＣＨ ₂−），４． ０４（４Ｈ，幅広，２×インドールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），４．３８（４Ｈ，幅広 ，２×チアゾールＮ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），５．７７（２Ｈ，ｓ，インドールビニル −Ｈ），５．８５および６．３１（いずれも１Ｈ，ｓ，チアゾールビニル−Ｈ） ，７．２１−７．３９（４Ｈ，ｍ，４×アリール−Ｈ），７．４３−７．７２（ ８Ｈ，ｍ．８×アリール−Ｈ），７．８７−７．９９（３Ｈ，ｍ，２×アリール −Ｈおよび−ＣＯＮＨ−），８．８２（１Ｈ，幅広ｔ，スクアラート−ＮＨ−Ｃ Ｈ₂−）。 実施例１５ 溶液相ならびに固相アプローチを用いるスクアラート染料標識化ペプチドの合成 代表例 ：固相におけるペプチドの合成 固相Ｆｍｏｃ化学を用いて、セリンタンパク質キナーゼ基質ペプチド（ＮＨ₂ −ＡＲＲＶＴＳＡＡＲＲＳ−ＯＨ）を合成し、合成の最後にＮ−末端Ｆｍｏｃ基 を除去した。ペプチドは１００ｍｇの樹脂から切断し、トリフルオロ酢酸、水、 チオアニソールおよびエタンジチオール（９５：２．５：５：２．５ｖ／ｖ，２ ｍｌ）の混合物を用いて９０分間脱保護した。粗ペプチドは冷ジエチルエーテル から沈殿させ、遠心分離し、真空乾燥した後水に溶解し、セミ分取ＨＰＬＣによ りＶｙｄａｃ Ｃ−１８逆相カラムを用い、４ｍｌ／分の流速および水／０．１ ％ＴＦＡから６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの勾配で３０分間にわたっ て精製した。検出は２３０ｎｍにおいて行った。８．５分で溶離する主ピークを 集め、冷凍乾燥して１０ｍｇの所望のペプチドを白色固体として得た。染料−ＮＨＳエステルの調製 スクアラート染料（２ｉ）（８８ｍｇ，０．１１７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミド（２０ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）およびＮ−シクロヘキシル −Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホ ネート（４５ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）ならびに４−ジメチルアミノピリジンの １つの小結晶を磁気撹拌子を備えた丸底フラスコに入れて乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ） を加えた。混合物を外界温度で１６ｈ撹拌した後溶剤を減圧で除去し、青色残留 物を乾燥ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。固相標識化 １００ｍｇのペプチド樹脂（ペプチド０．０３ｍｍｏｌ以下に相当）を１．５ ｍｌのポリプロピレン製Ｖバイアルに秤取した後０．４ｍｌの染料−ＮＨＳエス テル溶液に続いて０．６ｍｌの乾燥ＤＭＳＯと０．０２ｍｌのジイソプロピルエ チルアミンを加えた。バイアルは１８ｈの間外界温度にある暗所のローラー上に 置いた。樹脂は濾過し、２×１ｍｌのＤＭＳＯ、２×１ｍｌのメタノールおよび 最後に２×１ｍｌのジクロロメタンで洗った後真空乾燥した。樹脂を上記のよう に２ｍｌの脱保護混合物で処理して樹脂から標識化ペプチドを切断して、保護基 を除去した。ペプチドはジエチルエーテルから青色固体として沈殿させた。これ は上記のような未標識化ペプチドと同様に処理した。ＨＰＬＣ精製によって２２ ．５分後に青色のピークが溶離し、これを集め、凍結乾燥して３ｍｇの青色固体 を得た。質量分析の結果１９３３ｍ．ｕ．にピークを示した（スクアラート染料 標識化ペプチドの理論分子量＝１９３０）。溶液相標識化 ポリプロピレン製Ｖバイアル中で５．０ｍｇ（０．００４ｍｍｏｌ）のペプチ ドに０．３ｍｌの染料−ＮＨＳ溶液を加え、さらに０．７ｍｌの乾燥ＤＭＳＯと ０．０２ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた後、バイアルを暗所のロー ラー上に１８ｈ置いた。次いで上記に概説したと同じ条件を用い、セミ分取ＨＰ ＬＣにかけて混合物を分離した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウエスト，リチャード・マーティン イギリス国ユーエックス８・１エックステ ィー，ミドルセックス，アクスブリッジ, ページズ・レイン 38 (72)発明者 ブリッグス，マーク・サミュエル・ジョナ サン イギリス国エイチピー６・６エヌキュー, バッキンガムシャー，アマーシャム，パー ク・プレイス 109 (72)発明者 カミンズ，ウィリアム・ジョナサン イギリス国エイチピー23・４ビーイー，ハ ートフォードシャー，トリング，ソーント ゥリー・ドライブ ５ (72)発明者 ブルース，イーアン・エドワード アイルランド国カウンティ・ミース，ダン スラフリン，グリーンアール 37

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式（Ｉ）または（II）または（IIａ）のスクアラート染料。 （式中、各Ｚは独立してＯまたはＳまたはＣＲ¹ ₂であり、 ｎ＝１−３、 ｓおよびｍはそれぞれ０、１または２であり、 Ｒ¹は低級アルキル（炭素原子が１−４個）であり、 各Ｒ²は独立して電子供与基および電子求引基から選ばれるか、または１ない し５個の正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖状の最大３０個の炭素 原子であり、 各Ｒ³は独立してアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン（炭素原子が １−２０個）から選ばれるか、または１ないし５個のエーテル状酸素原子または アリーレン環または正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖状の最大３ ０個の炭素原子であり、 少なくとも１つのＸはＯＨ、ＳＨまたはＮＨ₂のような求核性官能基であるか 、あるいはまた求核試薬と反応することができる基であり、 また存在する他のＸは独立してＨおよびＳＯ₃ ^-および式（Ｉ）または（II）ま たは（IIａ）のスクアラート染料および他の蛍光色素の残基から選ばれ、 ただし少なくとも１つのＲ²はＳＯ₃ ^-で、かつ／または少なくとも１つのＸは ホスホルアミダイトであるものとする。） ２．式（III）または（IV）または（IVａ）のスクアラート染料。 （式中、各Ｚは独立してＯまたはＳまたはＣＲ¹ ₂であり、 ｎ＝１−３、 ｓおよびｍはそれぞれ０、１または２であり、 Ｒ¹は低級アルキル（炭素原子が１−４個）であり、 各Ｒ²は独立して電子供与基および電子求引基から選ばれるか、または１ない し５個の正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖状の最大３０個の炭素 原子であり、 各Ｒ³は独立してアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン（炭素原子が １−２０個）から選ばれるか、または１ないし５個のエーテル状酸素原子または アリーレン環または正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖状の最大３ ０個の炭素原子であり、 少なくとも１つのＸはＯＨ、ＳＨまたはＮＨ₂のような求核性官能基であるか 、あるいはまた求核試薬と反応することができる基であり、 また存在する他のＸは独立してＨおよびＳＯ₃ ^-および式（III）、（IV）また は（IVａ）のスクアラート染料および他の蛍光色素の残基から選ばれ、 ＡはＯ、ＮＲ⁴またはＳであり、 Ｒ⁴はアルキル、アルケニルまたはＨであり、かつ 各Ｙは独立してＸまたはＨである。） ３．少なくとも１つのＲ²がＳＯ₃ ^-である請求項１または請求項２記載のスク アラート染料。 ４．ｎが１でＺが−Ｃ（ＣＨ₃）₂である請求項１ないし請求項３のいずれか１ つの項記載のスクアラート染料。 ５．１ないし５個のＳＯ₃ ^-基が存在する請求項１ないし請求項４のいずれか１ つの項記載のスクアラート染料。 ６．少なくとも１つのＸがＣＯ₂Ｈ、活性カルボキシル、ＣＯ活性エステル、 ＮＣＳ、Ｏホスホルアミダイト、ＮＣＯＣＨ₂ｌおよび から選ばれる請求項１ないし請求項５のいずれか１つの項記載のスクアラート染 料。 ７．各Ｒ²が独立してハロゲン、アルコキシ、第一、第二および第三級アミン 、ニトロならびに−Ｒ³Ｘから選ばれる請求項１ないし請求項６のいずれか１つ の項記載のスクアラート染料。 ８．生体分子と請求項１ないし請求項７のいずれか１つの項記載のスクアラー ト染料との付加物。 ９．ヌクレシドまたはヌクレオチドもしくは類似体またはオリゴヌクレオチド または核酸と式（Ｉ）もしくは（II）もしくは（IIａ）もしくは（III）もしく は（IV）もしくは（IVａ）のスクアラート染料との付加物。 （式中、各Ｚは独立してＯまたはＳまたはＣＲ¹ ₂であり、 ｎ＝１−３、 Ｒ¹は低級アルキル（炭素原子が１−４個）であり、 各Ｒ²は独立してハロゲン、アルコキシ、第一、第二および第三級アミノ、ニ トロ、ＳＯ₃ ^-、ならびに−Ｒ³−Ｘのような電子供与基および電子求引基から選 ばれるか、または１ないし５個の正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖もしくは直 鎖状の最大３０個の炭素原子であり、 各Ｒ³は独立してアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン（炭素原子が １−２０個）から選ばれるか、または１ないし５個のエーテル状酸素原子または アリーレン環または正に帯電した窒素原子を含む分枝鎖もしくは直鎖状の最大３ ０個の炭素原子であり、 少なくとも１つのＸはＯＨ、ＳＨまたはＮＨ₂のような求核性官能基であるか 、あるいはまた求核試薬と反応することができる基であり、この場合にＸは好ま しくは下記の ＣＯ₂Ｈ、酸ハロゲン化物または酸無水物のような活性カルボキシル、ＣＯ活 性エステル、ＮＣＳ、Ｏホスホルアミダイト、ＮＣ（Ｏ）ＣＨ₂ｌおよび から選ばれ、 存在する他のＸは独立してＨおよびＳＯ₃ ^-およびスクアラート染料（これによ って式（Ｉ）、（II）、（IIａ）、（III）、（IV）および（IVａ）のモノマー として示される染料のダイマーおよびオリゴマーが考えられる）、または他の蛍 光色素の残基から選ばれ、 ｓおよびｍはそれぞれ０、１または２であり、 ＡはＯ、ＮＲ⁴またはＳであり、 Ｒ⁴はアルキル、アルケニル、アルキニルまたはＨであり、かつ 各Ｙは独立してＸまたはＨである。） １０．該付加物が式Ｑ−Ｎ−ＣＯ−Ｓｑを有し、式中Ｑはヌクレオチドもしく はヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレオチド残基であり、またＳｑはスクア ラート染料の残基であり、この両者がＱのアミン基とＳｑのカルボキシレート基 との間に形成されるアミド結合によって結合されている請求項９記載の付加物。 １１．請求項９または請求項１０記載の付加物を使用することを含む改良蛍光 配列決定法。 １２．下記： ・ 第１の吸収及び放射スペクトルを有する第１または供与体蛍光色素； ・ 第２の吸収及び放射スペクトルを有する第２または受容体蛍光色素、前記第 ２蛍光色素の最大放射波長は前記第１蛍光色素の最大放射波長よりも長く、また 前記第２蛍光色素の吸収スペクトルの一部が前記第１蛍光色素の放射スペクトル の一部と重なり； ・ 前記第１及第２蛍光色素間の共鳴エネルギー転移の転移のために前記第１お よび第２蛍光色素を共有結合させるための少なくとも１つのリンカー； ・ 標的化合物との共有結合を形成させることができる標的結合基； を含み、 さらに前記第１および第２蛍光色素の少なくとも１つが請求項１ないし請求項 ７のいずれか１つの項記載のスクアラート染料である蛍光標識化複合体。