JP2000508524A - 植物でのブラシノステロイド合成に関与するシトクロムｐ４５０型タンパク質をコードする核酸分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物におけるブラシノステロイド合成に関与するシトクロムＰ４５０型タンパク質をコードする核酸分子、その核酸分子を含有するトランスジェニック植物細胞および植物、ならびに、ブラシノステロイド合成に関与する他のタンパク質を同定する方法および植物においてブラシノステロイドまたはブラシノステロイドインヒビターとして作用する物質を同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物でのブラシノステロイド合成に関与するシトクロムＰ４５０型タンパク質を コードする核酸分子 本発明は植物でのブラシノステロイド合成に関与するシトクロムＰ４５０型タ ンパク質をコードする核酸分子、その核酸分子を含有するトランスジェニック植 物細胞および植物、ならびに、ブラシノステロイド合成に関与する他のタンパク 質の同定方法、および植物でブラシノステロイドとしてまたはブラシノステロイ ドインヒビターとして作用する物質の同定方法に関する。 １９７９年にブラシノライドと称する新規な植物成長促進因子がアブラナ （Brassica napus）の花粉から単離されそして新型のステロイドラクトンである と同定された。ブラシノライド様ステロイド化合物（ブラシノステロイド類と称 する）が試験した全ての植物種に非常に低い濃度で存在することが見いだされた （総説に関しては、Mandava，Ann．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biol．39( 1988)，23-52を参照のこと）。ブラシノライドの生理学的活性の初期の研究は、 この特定の因子が、(i)低温における植物実生の発芽および成長を促進し、(ii) 細胞表面上における皮質微小管およびセルロースミクロフィラメントの縦方向の 配置の誘発により細胞寸法の増加および伸長を促進し、(iii)導管要素を増幅さ せることにより木質部の分化を促進し、(iv)植物およびそれらの果実の乾燥重量 の有意な増加をもたらし、(v)葉の展開および拡大を促進し、(vi)オーキシン誘 発細胞成長に特徴的なＨ＋輸送および膜過分極を誘発し、(vii)クラウンゴール 腫瘍細胞の分裂および茎の放射方向の成長を阻害し、(viii)光成長植物のアント シアニン生成を抑制し、(ix)例えば暗所におけるシトキニンにより誘発される脱 黄化（de-etiolation）を阻害し、(x)暗所における組織老化を促進させるが明所 での植物の寿命を延長し、そして(xi)多数の細菌および真菌種（Mandava(1988) 、loc．cit.）に対する植物病原体耐性応答を誘発する。 ブラシノライド類の最初の単離およびそれを用いた生理学的研究の後に、推定 されている生合成中間体を代表する多くのブラシノステロイド化合物が種々の植 物種において同定された。これらの化合物のインビボ濃度が極端に低いことが見 いだされたため、これらの化合物の化学的合成法を開発するために努力がなされ た（総説に関しては、Adam and Marquardt，Phytochem．25(1986)，1787-1799を 参照のこと）。生理学的研究の結果を確認するために、これらの化合物は、ダイ ズ、トウモロコシ、イネおよび他の作物並びに樹木を使用する圃場実験で試験さ れた。しかしながら、圃場試験では、植物表皮を通してのステロイド類の劣悪な 吸収により噴霧または施肥に必要なステロイド類の量はかなりなものであること が示された。ブラシノライド類のいくつかの化学的合成法がそれ以後に報告され ているが、農業におけるそれらの実際的な使用はむしろ限定されている。ブラシ ノライド処理の費用はかなり高いため、それらの適用は他の既知の肥料および農 薬の適用と競合することができない。それゆえ、これらの化合物の実際の適用は 作物の毒性緩和剤としての不定期的適用以外は今までにほとんど取りやめになっ ている。 ほとんどの植物種におけるそれらの濃度は、例えばオーキシン類、サイトキニ ン類、アブシシン酸、エチレンおよびジベレリン類のような他の成長因子と比べ て非常に低いためこれらの化合物が実際に機能的な成長因子であることを生理学 的データが示していないと植物生理学者が主張したことから、見込みのある成長 調節剤としてのブラシノステロイド類に対する興味はさらに薄れた。さらに、ブ ラシノライド合成が欠損した植物突然変異体が得られず、これらの化合物が植物 成長および発育に必須であることを示すことができなかった。従って、ブラシノ ステロイド類は、生物学的機能を有するどうか疑問のあるあまり重要でない二次 的な植物代謝物であると分類された。 ブラシノステロイド類が実際に植物の見込みのある成長調節剤として使用でき ることを示しそしてこれらの物質の可能な利点および能力を開発できるようにす るために、ブラシノステロイド合成に関与する遺伝子の特性評価を可能にするで あろうブラシノステロイド合成が欠損した植物突然変異体を同定することが必要 であろう。 それゆえ、本発明の解決すべき問題はブラシノステロイド合成が欠損した植物 突然変異体を同定すること、および植物でのブラシノステロイド類の合成に関与 するタンパク質をコードする核酸分子を同定することである。 この問題は請求の範囲に特徴づけされている態様の提供により解決される。 すなわち、本発明はシトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼの生物学的活性、 より具体的には酵素活性、を有するタンパク質をコードするかまたはそのような タンパク質の生物学的に活性なフラグメントをコードするタンパク質をコードす る核酸分子に関する。そのような核酸分子は好適には配列番号２のアミノ酸配列 を含むタンパク質またはシトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼの生物学的活性 を有するそのフラグメントをコードする。より好ましくは、そのような核酸分子 は配列番号１の塩基配列、より具体的には示されたコード領域、または対応する リボヌクレオチド配列を含む。 本発明は配列番号３の塩基配列のエキソンによりコードされるようなアミノ酸 配列を有するタンパク質をコードするかまたはそのようなタンパク質のフラグメ ントをコードする核酸分子にも関するものであり、ここでタンパク質およびフラ グメントはシトクロムＰ４５０ドロキシラーゼの生物学的活性を有する。特に、 本発明は配列番号３の塩基配列、より具体的には示されたエキソンの塩基配列、 または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。 さらに、本発明は上記の核酸分子のいずれかにハイブリダイズし、そしてシト クロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼの生物学的活性を有するタンパク質またはそ のようなタンパク質の生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸分子並び に上記の核酸分子のいずれかに相補的な核酸分子にも関する。 本発明はまた、遺伝暗号の縮重のために配列が上記の核酸分子の配列とは異な るシトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼまたはその生物学的に活性なフラグメ ントをコードする核酸分子にも関する。 「ハイブリダイズする」とは、そのような核酸分子が従来のハイブリダイズ条 件下で、好適には例えばSambrook et al．(Molecular Cloning;A Laboratory Ma nual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harb or，NY(1989))により記載されているようなストリンジェントな条件下で、ハイ ブリダイズすることを意味する。 上記の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は一般的にはそのような分子を 有する植物から、好ましくは単子葉または双子葉植物から、特に農業、園芸業ま たは林業における植物、例えば作物植物、より具体的にはポアセアエ（Poaceae ）科のもの、他の澱粉生成性植物、例えばポテト、カッサバ、豆植物、油生成性 植物、例えばアブラナ、アマニなど、貯蔵物質としてタンパク質を使用する植物 、例えばダイズ、貯蔵物質としてスクロースを使用する植物、例えばサトウダイ コンまたはサトウキビ、樹木、観賞植物などから誘導することができる。好まし くは本発明による核酸分子はブラッシカセアエ（Brassicaceae）科に属する植物 から誘導される。上記の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は例えばｃＤＮ Ａまたはゲノムライブラリーのようなライブラリーから当技術で既知の技術によ り単離することができる。例えば、ハイブリダイズする核酸分子は、上記の核酸 分子またはそれらのフラグメントまたはそれらの相補体を標準的技術に従い該分 子とハイブリダイズさせることによりライブラリーをスクリ-ニングするために プローブとして使用することにより同定しそして単離することができる。プライ マーとして上記の核酸分子から誘導されるオリゴヌクレオチド類を使用するポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を適用することによってもそのような核酸分子の単 離が可能である。 「ハイブリダイズする核酸分子」という語はシトクロムＰ４５０型ヒドロキシ ラーゼの生物学的活性を有するタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグ メントをコードする上記の核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝子変 異体も含む。フラグメントは上記のタンパク質、またはその生物学的に活性なフ ラグメントをコードするのに十分な長さの核酸分子の一部であると理解される。 「誘導体」という語はこの概念ではこれらの核酸分子の塩基配列が１つもしくは それ以上の位置で上記の核酸分子の配列と異なっており、そして該核酸分子と高 度に相同性であることを意味する。相同性とは少なくとも４０％の配列同一性、 特に少なくとも６０％の、好ましくは８０％以上のそしてさらに好ましくは９０ ％以上の同一性をさすものであると理解される。上記の核酸分子の配列からの逸 脱は例えば置換、欠失、付加、挿入または組み換えの結果でありうる。 相同性はさらに、各々の核酸分子またはコードされたタンパク質が機能的にお よび／または構造的に同等であることを意味する。上記の核酸分子と相同性であ りそして該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、同じ生物学的機能を有 する修飾を示す該核酸分子の変異体、特に同じ生物学的機能を有するタンパク質 をコードするものである。それらは自然発生変異体、例えば他の植物変種もしく は種からの配列、または突然変異体である。これらの突然変異体は自然発生する こともあり、または突然変異誘発技術により得てもよい。さらに、これらの変異 体は合成により製造される配列であってもよい。対立遺伝子変異体は自然発生変 異体並びに合成的に製造されたかまたは遺伝子操作された変異体であってよい。 上記の核酸分子の種々の誘導体および変異体によりコードされるタンパク質は 固有の共通特性、例えば酵素活性、分子量、免疫学的反応性、コンフォメーショ ンなど、並びに物理的性質、例えば電気泳動度、クロマトグラフィーでの挙動、 沈降係数、至適ｐＨ、至適温度、安定性、溶解度、分光学的性質などを共有する 。 シトクロムＰ４５０タンパク質はいくつかの特徴により特徴づけることができ る。例えば、それらは一般的にはレダクターゼ類とインビボ複合体を生成する膜 に会合するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性モノオキシゲナーゼ類である。これらのタンパ ク質のＣＯ−複合体は４５０ｎｍの範囲の極大吸収を示す。 本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質は、好ましくはシトクロムＰ ４５０タンパク質に特徴的なドメイン、特にミクロソームシトクロムＰ４５０タ ンパク質に特徴的なもの、例えば保存されたＮ−末端膜固定ドメイン、プロリン に富んだドメイン、ヘム結合ドメインおよび酸素結合ドメインを含む（例えば、 Nebert and Gonzalez，Ann．Rev．Biochem．56(1987)，945-993を参照のこと） 。さらに、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質はステロイドヒドロ キシラーゼ類に特徴的なドメイン、具体的にはステロイド結合ドメイン、を含有 することが好ましい。好ましくはタンパク質はステロイドヒドロキシラーゼの酵 素活性を有する。 好ましい態様では、本発明による核酸分子はカタステロンからテアステロン(t easterone)への転換に関与するヒドロキシラーゼの酵素活性を有するシトクロム Ｐ４５０型タンパク質をコードする（図１を参照のこと）。この酵素活性は実施 例に記載されているような実験を行うことにより決定できる。 ある種のドメインの存在によりそしてそれらの酵素活性によりシトクロムＰ４ ５０タンパク質として分類できる本発明の核酸分子によりコードされるタンパク 質は既知のシトクロムＰ４５０に対し非常に低い（４０％以下の）相同性を全体 として示す。それゆえ、これらのタンパク質は新規であり、そして新しい基質特 異性を有するシトクロムＰ４５０タンパク質の新しいファミリーを構成する。 本発明による核酸分子は好ましくはＲＮＡまたはＤＮＡ分子、好ましくはｃＤ ＮＡまたはゲノムＤＮＡである。 本発明は、矮性並びに数種の他の形態学的および成長上の異常を示した、遺伝 子タギングにより発生した特定のアラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体が 特定のブラシノステロイド化合物の添加により野生型の表現型に復帰できるとい う発見に基づいている。さらに、突然変異した遺伝子および対応するｃＤＮＡが 単離され、そしてシトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼをコードするものであ ると同定されており、タギングされた突然変異体中でのその過剰発現が野生型の 表現型に復帰させることができる。さらに、トランスジェニック植物のｃＤＮＡ の過剰発現が農業、林業または園芸業用の改良された植物操作に有用である数種 の生理学的および表現型の変化をもたらすことも見いだされた。 本発明は上記の核酸分子が植物のブラシノステロイド合成に関与する酵素活性 を有するタンパク質をコードする証拠を提供する。さらに、本発明はこの酵素活 性が欠損する突然変異体が明確な生理学的および表現型の変化、例えば、矮性を 示し、それは特定のブラシノステロイド化合物の添加により逆転できること、並 びにそのような酵素活性を過剰発現する植物も例えば細胞伸長の増加のような表 現型の変化を示すことも示すものである。 それゆえ、本発明はブラシノステロイド類が植物成長調節剤として真に中心的 な重要性を有していることを初めて明確に立証し、そしてさらに （ｉ）ブラシノステロイド合成が欠損した突然変異体を同定するため、 （ｉｉ）植物のブラシノステロイド合成またはその調節に関与するタンパク質を コードする遺伝子を同定しそして単離するため、 （ｉｉｉ）改変されたブラシノステロイド合成性、並びにその結果として改変さ れた生理学的および／または表現型特性を有する植物を生成するため、並びに （ｉｖ）植物に対する見込みのあるブラシノステロイド類として作用しうる化合 物を同定するため の非常に有用な手段を与える。 本発明による核酸分子並びにそれらから誘導される分子の種々の可能な用途は 以下に詳細に記載されている。 一面において、本発明は上記の核酸分子と特異的にハイブリダイズする核酸プ ローブに関する。これは、それらが好ましくはストリンジェントな条件下で上記 の核酸だけとハイブリダイズし、そして他のタンパク質をコードする核酸分子と の交差ハイブリダイゼーションがないか、または非常に少ない交差ハイブリダイ ゼーションを示すことを意味する。本発明による核酸プローブは少なくとも１５ 個のヌクレオチドの核酸分子を包含する。核酸プローブ技術は当技術の専門家に は既知であり、そのようなプローブの長さを変え得ることを容易であろう。核酸 プローブは種々の用途に有用である。一つには、それらは本発明の核酸分子の増 幅用のＰＣＲプライマーとして使用できる。他方では、それらは例えばin situ ハイブリダイゼーションまたはノザーンブロットハイブリダイゼーションによる 植物での本発明の分子の発現の検出のための有用な手段でもあり得る。他の用途 は、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーの相同性スクリーニングにより本発明の 核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーショ ンプローブとしての使用である。上記のＲＮＡ分子に相補性である本発明の核酸 プローブはアンチセンス効果によるそのようなＲＮＡの発現の抑制用にまたはそ のようなＲＮＡ分子を特異的に開裂させる適切なリボザイムの構築用にも使用で きる。さらに、当技術の専門家にはそのような核酸プローブを特定の用途のため の適切なマーカーで標識できることが良く知られている。 本発明はまた、本発明の核酸分子を含有するベクター、特にプラシミド、コス ミド、ウイルス、バクテリオファージ、および、遺伝子操作で一般的に使用され ている他のベクターにも関する。 好ましい実施態様では、ベクター中に存在する核酸分子は原核細胞または真核 細胞中での核酸分子の発現を可能にする調節エレメントに連結される。発現は、 翻訳可能なｍＲＮＡ中への核酸分子の転写を含む。原核細胞または真該細胞中の 発現を確実にする調節エレメントは当技術の専門家に既知である。真核細胞の場 合には、それらは通常は転写の開始を確実にするプロモーター、並びに場合によ り転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。他の調 節エレメントには転写および翻訳エンハンサが包含される。 本発明はさらに、核酸分子が宿主細胞に対して外来性である上記の本発明のベ クターまたは核酸分子を含む宿主にも関する。 「外来性」とは、核酸分子が宿主細胞に関して異種であることを意味（これは 異なるゲノム背景を有する細胞または有機体から誘導されることを意味する）す るか、または宿主細胞に関しては同種であるが該核酸分子の天然の相当物とは異 なるゲノム環境に置かれていることを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞に 関して同種であるならそれは該宿主細胞のゲノム中でその自然の位置に位置して おらず、特にそれが異なる遺伝子により包囲されていることを意味する。この場 合には、核酸分子はそれ自体のプロモータの制御下であってもまたは異種プロモ ータの制御下であってもよい。宿主細胞中に存在する本発明のベクターまたは核 酸分子は宿主細胞のゲノム中に一体化されていてもよくまたはそれが染色体外で ある種の形態に保たれていてもよい。 宿主細胞は原核細胞または真核細胞、例えば細菌、真菌、植物または動物の細 胞であることができる。好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロミセス(Sacchar omyces)属のもの、特にＳ．セレヴィジエ(cerevisiae)種のもの、である。 本発明はさらに、シトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼの生物学的活性を有 する、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質または該タンパク質のフ ラグメントにも関する。 さらに、本発明は、本発明のタンパク質または該タンパク質の一部、すなわち そのようなタンパク質の特異的なフラグメントもしくはエピトープ、を特異的に 認識する抗体にも関する。特異的なエピトープまたはフラグメントは、例えば、 本発明によるタンパク質に特徴的なドメイン、例えば基質結合ドメインなど、を 構成するアミノ酸配列を含む。 これらの抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体並び に抗体のフラグメント、例えばＦａｂフラグメントなどであることができる。こ れらの抗体は、例えば、本発明のタンパク質の免疫沈澱、および免疫ローカリゼ ーションのため並びに、例えば組み換え生物中でのそのようなタンパク質の合成 を監視するため、および本発明によるタンパク質と相互作用するタンパク質の同 定のために使用することができる。 本発明の他の主題は、本発明のベクターまたは核酸分子の存在により、タンパ ク質の発現を可能にする条件下で該タンパク質を発現しうる本発明の宿主細胞の 培養およびこのようにして製造されるタンパク質の培養物からの回収を含む該タ ンパク質の製造方法である。使用される特定の構築物および条件により、タンパ ク質は細胞から、培養培地からまたは双方から回収できる。当技術の専門家には 、そのままのタンパク質を発現できるだけでなくタンパク質を融合タンパク質と して発現するか、またはタンパク質を宿主細胞の特定区画に向けたり培養培地中 へのタンパク質の分泌を確実にしたりするためのシグナル配列を追加できること が知られている。 本発明の核酸分子はブラシノステロイド合成を改変し、そして改変された、好 ましくは改良されたもしくは有用な表現型を有する植物を得るための植物細胞の 遺伝子操作に特に有用である。 それゆえ、本発明は、植物細胞での核酸分子の発現を可能にする調節エレメン トと連結されている、ゲノム中に安定的に一体化された本発明の核酸分子を含有 するトランスジェニック植物細胞にも関し、そしてここで核酸分子はトランスジ ェニック植物細胞に対し外来性である。外来性の意味に関しては、上述の通りで ある。 トランスジェニック植物細胞中の核酸分子の存在および発現が、植物細胞中で のブラシノステロイド合成に影響を与えるシトクロムＰ４５０型ヒドロキシラー ゼの生物学的活性を有するタンパク質の合成をもたらしそしてそのような細胞を 含有する植物での生理学的および表現型の変化をもたらす。 それゆえ、本発明は、本発明のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジ ェニック植物にも関する。 シトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼの生物学的活性を有するタンパク質の 発現により、このトランスジェニック植物は野生型植物に比べて種々の生理学的 、成長上のおよび／または形態学的変化を示す。例えば、これらのトランスジェ ニ ック植物は病原関連遺伝子の誘発増加（例えば、Uknes et al.，Plant Cell 4(1 992)，645-656を参照のこと）、改変された形態、具体的には成長の刺激、細胞 伸長の増加および／または刺激された木部分化による木形成(wood production) の増加を示すことができる。 さらに、これらのトランスジェニック植物は、低温における種子発芽の促進、 乾燥重量の増加、明所で成長中のアントシアニン生成の抑制および／または暗所 での例えばシトキニンにより誘発される脱黄化の阻害を示すことができる。 本発明による核酸分子の提供はさらに、上記のシトクロムＰ４５０型ヒドロキ シラーゼのレベルが低下しそしてその結果としてブラシノステロイド合成が欠損 したトランスジェニック植物細胞を生成する可能性も開く。これを実施するため の技術は当技術の専門家に既知である。これらには、例えば、アンチセンスＲＮ Ａ、リボザイム、アンチセンスおよびリボザイム機能を組み合わせた分子並びに ／またはコサプレッション効果を与える分子の発現が包含される。 植物細胞で上記の酵素活性の低下のためにアンチセンス方式を使用するときに は、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は好ましくは形質転換に使用され る植物種に関して同種源のものである。しかしながら、各々の酵素活性をコード する内因性核酸分子と高度の相同性を示す核酸分子を使用することもできる。こ の場合には、相同性は好ましくは８０％より高く、特に９０％より高くそしてさ らにより好ましくは９５％より高い。 トランスジェニック植物細胞中での本発明のタンパク質の合成減少が細胞中の ブラシノステロイド合成および／または代謝における変化をもたらす。そのよう な細胞を含むトランスジェニック植物では、これは種々の生理学的、成長上のお よび／または形態学的変化をもたらしうる。 それゆえ、本発明は上記のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニ ック植物にも関する。これらは、例えば、形態学的変化、例えば矮性、および／ または野生型と比べた成長上の変化、例えば暗所で発芽する実生の胚軸の伸長減 少、または雄性不妊を示すことがある。さらに、これらの植物は野生型植物と比 べた生理学的変化、例えば変化したストレス耐性、を示すことがある。 好ましくは、本発明のトランスジェニック植物は下記の特徴の少なくとも１つ を示す。 ・暗所における発芽から生ずる実生は野生型実生と比べて短い胚軸を有し、尖端 の鉤形突起(hook)を有しておらず、開放子葉を有し、および／または伸びた葉原 基(primordia)を有する。 ・胚軸中の表皮細胞列の長さは野生型植物と比べて約５倍減少する。 ・実生の根の中の表皮細胞列の長さは野生型植物と比べて約２０〜５０％減少す る。 ・胚軸の表皮細胞はセルロース繊維の厚い横列を示す（例えば、図２Ｄ、Ｅを参 照のこと）。 ・胚軸の表皮細胞は孔辺(stomatal guard)細胞の分化をもたらす垂直分裂を示す （図２Ｂ）。 ・子葉は通常は葉に特徴的な密な気孔および突起様構造(trichome)を示す（図２ Ｃ）。 ・暗所における光形態形成および脱黄化の脱抑制。 ・土壌で白色光下に成長させたとき、野生型植物と比べて２０〜３０倍の寸法減 少（矮性）。 ・葉の中での縦方向の葉肉細胞列の数の減少および柵状細胞の伸長不能。 ・葉の表皮の孔辺細胞の増幅および重複（図２Ｆ、Ｇ）。 ・茎の中の形成層の不等分裂。 ・木質細胞の犠牲による数外(extranumerary)の師部細胞列の生成。 ・雄性不妊をもたらす発芽中の花粉の伸長不能性。 ・ストレス応答遺伝子の異なる調節。 本発明はまた、本発明のタンパク質の過剰発現または該タンパク質の合成減少 を示す上記のトランスジェニック植物細胞を含む培養された植物組織にも関する 。 さらに別の面では、本発明は、本発明の核酸分子を発現するトランスジェニッ ク植物細胞を含有するかまたは上記のタンパク質の活性減少を示す細胞を含有す る本発明のトランスジェニック植物の収穫可能部分および繁殖材料にも関する。 収穫可能部分は原則的には植物の有用な部分、例えば、葉、茎、果実、種子、根 など、のいずれかであることができる。 繁殖材料には、例えば、種子、果実、切穂、実生、根塊、根株などが包含され る。 植物細胞中でのセンスおよびアンチセンス方向における本発明の核酸分子の発 現のために、分子を植物細胞中での発現を確実にする調節エレメントの制御下に 置く。これらの調節エレメントは発現させようとする核酸分子に関して並びに形 質転換しようとする植物種に関して異種であっても同種であってもよい。一般的 には、そのような調節エレメントは植物細胞中で活性なプロモーターを含む。ト ランスジェニック植物の全ての組織中での発現を得るためには、好適には例えば ＣａＭＶの３５Ｓプロモータ（Odell et al.，Nature 313(1985)，810-812）ま たはトウモロコシのポリユビキチン遺伝子のプロモーター（Christensen et al. ,Plant Mol．Biol．18(1982)，675-689）の如き構成的プロモーターが使用され る。トランスジェニック植物の特定組織の中での発現を得るためには、組織特異 的プロモーター（例えば、Stockhaus et al.，EMBO J．8(1989)，2245-2251を参 照のこと）を使用することもできる。ポテトの根塊中または種々の植物種、例え ばトウモロコシ、ヴィシア（Vicia）、小麦、大麦など、の種子中で特異的に活 性であるプロモーターも知られている。発現を正確に制御できるようにするため に誘発プロモーターを使用してもよい。誘発プロモーターの例は熱ショックタン パク質のプロモーターである。 調節エレメントはさらに植物細胞中で機能的である転写および／または翻訳エ ンハンサを含んでいてもよい。 さらに、調節エレメントには転写停止シグナル、例えばその安定性を改良させ ることができる転写物に対するポリＡテールの追加を生ずるポリ−Ａシグナル、 が包含される。 本発明による核酸分子がセンス方向で発現される場合には、コード配列をタン パク質が植物細胞の所望する区画に位置されるような方法で改変することが原則 的に可能である。これらには、小胞体、液胞、ミトコンドリア、プラスチド、ア ポプラスト、細胞質などが包含される。所望する区画中での局在を確実にするこ の改変の実施方法およびシグナル配列は当技術の専門家に既知である。 植物への外来性ＤＮＡの導入方法も当技術で既知である。これらには、例えば 、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）または アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いるＴ−Ｄ ＮＡでの植物細胞または組織の形質転換（ＥＰ−Ａ１２０ ５１６、ＥＰ−Ａ １１６ ７１８、Hoekema in:The Binary Plant Vector System，Offsetdrkkeri j Kanters BV,Alblasserdam(1985),Chapter V;Fraley et al.,Crit.Rev.Plant S ci.4，1-46 and An et al.,EMBO J．4(1985),277-287）、プロトプラストの融合 、直接的遺伝子移入（例えばＥＰ−Ａ １６４ ５７５を参照のこと）、注入、 電気穿孔法、粒子衝突のようなバイオリスティック法および他の方法が包含され る。 上記の方法でほとんどの双子葉植物の形質転換が可能である。しかし、単子葉 植物の転換用にはいくつかの成功を収めた形質転換技術が開発されている。これ らには、バイオリスティック法を使用する形質転換（Wan and Lemaus，Plant Physiol.104(1994),37-48;Vasil et al.,Bio/Technology 11(1993),1553-1558） 、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性にされた細胞の電気穿孔、ガラス繊 維を用いるＤＮＡの導入などが包含される。 一般的には、本発明に従い改変することができそして本発明のタンパク質の過 剰発現または該タンパク質の合成減少を示す植物は所望する植物種から誘導する ことができる。それらは単子葉植物または双子葉植物であることができ、好適に はそれらは農業、林業または園芸業の当該植物種、例えば作物植物（例えば、ト ウモロコシ、イネ、大麦、小麦、ライ麦、カラス麦など）、ポテト、油生成性植 物（例えば、アマニアブラナ、ヒマワリ、ピーナッツ、ダイズなど）、ワタ、サ トウダイコン、サトウキビ、豆植物（例えば、インゲンマメ、エンドウマメなど ）、木材生成性植物、好適には樹木、などに属する。 本発明はさらに （ａ）暗所での発芽時にその実生が胚軸の伸長を示さないかもしくはほとんど示 さない、自然発生の、人工的に突然変異誘発されたまたは遺伝子操作された矮性 突然変異体をスクリーニングするステップ、 （ｂ）異なるブラシノステロイドまたはブラシノステロイド様化合物の添加によ り暗所での胚軸の伸長が刺激を受け得る、ステップ（ａ）で同定された矮性突然 変異体を同定するステップ、 （ｃ）ステップ（ｂ）で同定された矮性突然変異体を相補することができる遺伝 子を同定および単離するステップ、 （ｄ）単離された遺伝子およびそれによりコードされる産物の特性評価を行うス テップ を含む、植物でのブラシノステロイド合成またはその調節に関与するタンパク質 をコードする核酸分子の同定および単離方法も提供する。 この方法は、ブラシノステロイド合成が欠損した突然変異体が野生型植物と比 べて暗所で成長する実生の成長減少（矮性）および胚軸の伸長減少という顕著な 特徴を示すという発見に基づいている。これらの特徴により、ブラシノステロイ ド合成が欠損した植物突然変異体を選択することができる。これは、ブラシノス テロイド化合物の添加（ステップ（ｂ））により変異体表現型を相補することが 可能なら、確認することができる。種々のブラシノステロイド化合物が当技術の 専門家に既知である。それらは天然存在ブラシノステロイド類であってもまたは 化学的合成されたアナログであってもよい。植物に対するブラシノステロイド化 合物の適用方法は重要ではない。溶液の噴霧が好ましい。実際にブラシノステロ イド合成が欠損した同定された突然変異体から、突然変異された遺伝子を同定し 、単離することができる。 １つの可能性は、（ｉ）（例えばＴ−ＤＮＡまたはトランスポゾンによる）遺 伝子タギングにより複数の突然変異体を作成し、（ｉｉ）ステップ（ａ）および （ｂ）に従いブラシノステロイド合成が欠損した突然変異体を同定し、（ｉｉｉ ）ゲノムライブラリーを作成し、そして（ｉｖ）遺伝子のタギング用に使用され たＤＮＡの助けで突然変異遺伝子を単離することである。これがタギングされた 突然変異遺伝子の同定をもたらす。これを、次に野生型ｃＤＮＡおよびゲノムク ローンを標準的技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ、を使 用して単離するために使用することができる。そのような方法は原則的に実施例 に記載されており、上記事項も参照のこと。 あるいは、突然変異遺伝子の同定および単離は下記の通りにして行うこともで きる。（ｉ）突然変異の正確な遺伝子マップを作成し、次に（ｉｉ）比較的小さ い染色体フラグメント上に対応する遺伝子を運ぶ酵母人工染色体（ＹＡＣ）クロ ーンを単離し、（ｉｉｉ）これらのＹＡＣクローンを使用して対応するコスミド クローンを単離し、（ｉｖ）これらのコスミドクローンを突然変異の遺伝子相補 用に使用し、（ｖ）突然変異を相補することができるこれらのコスミドクローン を同定し、そして（ｖｉ）コスミドクローンの助けで対応するｃＤＮＡおよび／ またはゲノム配列を単離する。この工程は一般的にゲノムウォーキングとして知 られておりそして当技術の専門家に既知である。 同定されそして単離された遺伝子および／またはｃＤＮＡは引き続き標準的技 術、例えば制限酵素マップ作成および配列決定、により特性評価することができ る。コードされた産物の生物学的活性は既知のタンパク質との相同性比較、突然 変異体のインビボフィーディングアッセイなどにより決めることができる。 好ましい態様では、上記の方法は例えばアンチセンスＲＮＡを発現することに より上記の核酸分子で生成された本発明の酵素の活性減少を示すトランスジェニ ック植物を用いて実施される。 上記の方法は、それゆえ、本発明のタンパク質と同じ酵素性質を有するタンパ ク質をコードしそしてその結果としてこのタンパク質が欠損した突然変異体を相 補しうる核酸分子を、たとえタンパク質をコードする核酸分子が上記の核酸分子 にハイブリダイズしなくても、同定することができる。 それゆえ、本発明は上記の方法により得ることのできる核酸分子にも関する。 原則的には、ブラシノステロイド合成またはその調節に関与するタンパク質をコ ードする核酸分子は、その突然変異体が矮性および暗所における胚軸伸長の減少 をもたらす限り、この方法により同定できる。好ましくはそのような核酸分子は ブラシノステロイド合成経路の１つもしくはそれ以上の酵素段階に関与するタン パク質をそしてより好ましくは本発明によるタンパク質と同じ酵素性質を示すタ ンパク質をコードする。 ブラシノステロイド合成が欠損した植物突然変異体を、それらが矮性および暗 所において発芽する種子の胚軸の伸長減少を示す特徴により同定できるという認 識の提示により、本発明は植物でブラシノステロイドのように作用することがで きそしてその結果として植物での見込みのある成長因子を構成できる化学化合物 を同定するための簡単な方法を構築することができる。 それゆえ、本発明は、 （ａ）本発明のタンパク質の活性減少を示す本発明のトランスジェニック植物ま たは上記の方法のステップ（ａ）および（ｂ）により同定されているブラシノス テロイド合成が欠損した突然変異体を複数の化合物と接触させるステップ、およ び （ｂ）（ａ）で定義された植物または変異体において、ブラシノステロイド合成 における欠損を原因とする作用を相補することのできる化合物を決定するステッ プ を含む、植物でブラシノステロイドとして作用することのできる化合物の同定方 法も提供する。 この方法のステップ（ａ）で使用される植物は本発明のタンパク質の活性減少 を示しそしてその結果として矮性および暗所で発芽する実生の胚軸の伸長減少を もたらすブラシノステロイド合成の欠損を有する植物であってよい。あるいは、 矮性および暗所での胚軸の伸長減少を示しそして特定のブラシノステロイドの添 加により野生型表現型に復帰できるためブラシノステロイド合成が欠損している と同定されている他の植物突然変異体を使用してもよい。 野生型表現型に部分的にまたは完全に復帰できる化合物が植物用の見込みのあ る成長因子を構成できる。 別の面では、本発明は、 （ａ）本発明のタンパク質の活性減少を示しそしてその結果としてブラシノステ ロイド合成の欠損を示す本発明の植物の発芽種子、または実生が暗所での胚軸の 伸長減少を示しそして特定のブラシノステロイドの添加により正常な成長に復帰 できるような矮性突然変異体の発芽種子を複数の化合物と接触させるステップ、 および （ｂ）実生中の胚軸および／または根の正常な成長を回復できる化合物を決定す るステップ を含む、植物でブラシノステロイドとして作用することができる化合物の同定方 法にも関する。 さらに、本発明は、 （ａ）本発明の核酸分子を過剰発現しそしてその結果として改変されたブラシノ ステロイド合成並びに上記の生理学的および／または表現型変化を示す植物細胞 または植物を複数の化合物と接触させるステップ、および （ｂ）これらの細胞または植物での変化したブラシノステロイド合成から生ずる 効果の弱化をもたらす化合物を同定するステップ を含む、ブラシノステロイドのインヒビターとして作用することができるかまた はブラシノステロイドの生物学的活性を抑制することができる化合物の同定方法 にも関する。 本発明はまた、 （ａ）本発明のタンパク質の活性減少を示しそしてその結果としてブラシノステ ロイド合成の欠損を示す本発明の植物の発芽実生、または実生が暗所での胚軸の 伸長減少を示しそして特定のブラシノステロイドの添加により正常な成長を回復 できるような矮性突然変異体の発芽実生を、暗所で発芽する実生の胚軸の正常な 伸長を回復しうるブラシノステロイドと接触させそして同時に複数の化合物とも 接触させるステップ、および （ｂ）ブラシノステロイドと競合して胚軸の正常な成長を回復させる化合物を決 定するステップ を含む、植物でブラシノステロイドのインヒビターとして作用することができる かまたはブラシノステロイドの生物学的活性を抑制することができる化合物の同 定方法にも関する。 上記二つの方法により同定されるインヒビターは除草剤、農薬、または毒性緩 和剤として有用であると示すことができる。 改変された特性を有する植物の遺伝子操作用の本発明の核酸分子を使用する上 記の可能性および同種分子を同定するためのそれらの使用の他に、上記の核酸分 子を、例えば上記のシトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼと相互作用するタン パク質をコードする核酸分子の同定などのいくつかの他の用途のために使用して もよい。これは例えばいわゆる酵母「２−ハイブリッドシステム」の使用により 当技術で既知のアッセイにより行うことができる。このシステムでは、本発明の 核酸分子またはそれより小さいその部分によりコードされるタンパク質がＧＡＬ ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合される。この融合タンパク質を発現しそ してＧＡＬ４転写因子により認識される適当なプロモータにより駆動されるｌａ ｃＺレポーター遺伝子を含む酵母菌株は、活性化ドメインに融合された植物タン パク質を発現するであろうｃＤＮＡのライブラリーで形質転換される。それゆえ 、ｃＤＮＡの１つによりコードされるタンパク質がＰ４５０タンパク質を含む融 合タンパク質と相互作用しうるなら、この複合体はレポーター遺伝子の発現を導 くことができる。このように本発明の核酸分子およびコードされるシトクロムＰ ４５０をシトクロムＰ４５０と相互作用するタンパク質、例えば植物および動物 中でシトクロムＰ４５０タンパク質と相互作用することが知られているタンパク 質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシドレダクターゼ および／またはシトクロムｂ５タンパク質を同定するために使用することができ る。 本発明のタンパク質またはそのような分子をコードする核酸分子と相互作用す るタンパク質を同定するための他の方法は、例えば、ファージディスプレイシス テムを用いるインビボスクリーニング並びにフィルター結合アッセイである。 さらに、本発明の核酸分子を植物栽培における分子マーカーとしておよび改変 されたシトクロムＰ４５０タンパク質、例えば変更された基質特異性を有するタ ンパク質の生成用に使用することができる。 さらに、本発明による核酸分子およびタンパク質を、所望の組換え生物、例え ば細菌、真菌、動物または植物でのテアステロンの製造に使用することもできる 。 さらに、本発明の核酸分子の過剰発現は植物／昆虫または一般的な植物／病原 体の相互作用の変更もしくは改変用に使用することもできる。病原体という語に は、例えば、細菌および真菌並びに原生動物が包含される。 本発明の核酸分子およびコードされるタンパク質並びに本発明の方法により同 定されるブラシノステロイド化合物を茎および葉（並びに他の植物器官）の制御 用に使用することができ、それらは全ての作物および樹木中の、すなわち木材生 産において対象となる植物での師部および木部の部分の制御を含む。 核酸分子、タンパク質および本発明による方法により同定されるブラシノステ ロイド化合物の他の可能な用途は、乾燥、浸透圧および他のストレスを含むより 良好なストレス耐性を有する植物の栽培または遺伝子操作において興味深い孔辺 細胞の分化および数の制御である。 図１はブラシノステロイドの生合成経路を示す（Fujioka et al.，Biosci．Bi otech．Biochem．59(1995)，1543-1547）。 図２は暗所および明所の実生の成長に対するｃｐｄ突然変異の影響を示す。 （Ａ）暗所においては、ｃｐｄ突然変異体（右）は短い胚軸および開放子葉を 示すが、野生型（左）では胚軸は伸長しておりそして子葉の鉤形突起(hook)は閉 じている。（Ｂ）胚軸表皮中の異常な細胞分裂および保護細胞分化および（Ｃ） ｃｐｄ突然変異体の子葉表皮中の空間的に近接した気孔。野生型（Ｄ）とは対照 的に、表皮細胞の長さはｃｐｄ突然変異体（Ｅ）中では減少しておりそしてそれ らの表面は横方向のセルロースミクロフィブリル（黒い矢印により示されている ）により覆われている。野生型（Ｆ）と比べて、ｃｐｄ突然変異体（Ｇ）の向軸 の葉の表皮はまっすぐな細胞壁および重複した気孔構造を示す。明所（Ｈ）では 、全ての器官における縦方向の成長阻害によりｃｐｄ突然変異体（左）は野生型 （右）より小さい（Ｉは突然変異体の拡大図）。野生型（Ｊ）およびｃｐｄ突然 変異体（Ｋ）の葉の断面は、葉肉細胞の寸法および伸長における差を示す。野生 型（Ｌ）およびｃｐｄ突然変異体（Ｍ）植物の茎断面中の師部（ｐ）および木部 （ｘ）細胞列の組織の比較。Ｄ−Ｅ、Ｆ−Ｇ、Ｊ−ＫおよびＬ−Ｍは同一倍率で ある。スケールバーはＤにおける２００μｍ並びにＪおよびＬにおける１００μ ｍを示す。 図３はｃｐｄ突然変異体およびＣＰＤ過剰発現植物の暗所および明所での遺伝 子発現の変更されたパターンを示す。 （Ａ）暗所において５週間にわたり１５ｍＭのスクロースを含む培地中で成長 させた野生型（左）およびｃｐｄ突然変異体（右）植物から調製されたＲＮＡの 、ＲＢＣＳ、ＣＡＢおよびＵＢＩ遺伝子プローブとのハイブリダイゼーション。 （Ｂ）ＲＮＡは、ガラスジャー中で白色光下で２週間にわたり成長させた野生型 （ｗｔ）、ｃｐｄ突然変異体（ｃｐｄ）および遺伝的に相補されたｃｐｄ（ｃｐ ｄ ｃｏｍｐ．）の実生から調製され、そしてＲＢＣＳ、ＣＡＢ、アルカリ性ペ ルオキシダーゼ（ＡＰＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタ チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒートショック７０（ＨＳＰ７０ ）、 リグニン−生成性ペルオキシダーゼ（ＬＰＥ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ） 、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ２）、Ｓ−アデノシル−メチオニンシンターゼ（Ｓ ＡＭ）、ヒートショック１８．２（ＨＳＰ１８．２）、アルコールデヒドロゲナ ーゼ（ＡＤＨ）、並びに病原関連性ＰＲ１，ＰＲ２およびＰＲ５遺伝子プローブ とハイブリダイズさせた。ＲＮＡサンプルの等しい充填量の確認のために、ブロ ットをＵＢＩ遺伝子プローブとハイブリダイズさせた（データは示されていない ）。定常状態のＣＰＤ ＲＮＡの水準に対する光、シトキニンおよびスクロース の影響を、１０日目の野生型実生（白色光中で１５ｍＭのスクロースの存在下で 成長させた）を０．１％（３ｍＭ）または３％（９０ｍＭ）のスクロースを含有 する培地に移すことにより評価した。これらの実生を暗所（Ｄ）または明所（Ｌ ）で、ＲＮＡ単離前にシトキニン（１．５μＭの６（γ，γ−ジメチルアリルア ミノ）−プリンリボシド）と共に（Ｄ⁺およびＬ⁺または無しで（ＤおよびＬ）さ らに６日間にわたり成長させた。 図４は野生型およびＴ−ＤＮＡタギングされたＣＰＤ対立遺伝子の染色体にお ける位置、物理的構造および転写を図式的に示す。 （Ａ）ｔｔｇ（透明な無毛種皮）、ｃｏ（コンスタンス）、ｈｙ５（長胚軸） およびＡＳＡ１（アントラニレートシンターゼ）遺伝子座の位置に対する、Ｔ− ＤＮＡ挿入部およびｃｐｄ突然変異の位置を示す、アラビドプシス(Arabidopsis )第５染色体（上の線）の図式的遺伝的連鎖マップ。第二の線はＣＰＤ遺伝子を 有するＹＡＣｃｏｎｔｉｇの位置を示す。ＣＰＤ遺伝子の図式的構造並びにｃｐ ｄ対立遺伝子中のＴ−ＤＮＡの挿入位置は中間に示されている。ＣＰＤ遺伝子の プロモータは矢印により示されており、エキソンは太い黒棒により示されている 。Ｔ−ＤＮＡ挿入部の構造がアグロバクテリウム(Agrobacterium）形質転換ベク ターｐＰＣＶ５０１３ＨｙｇのＴ−ＤＮＡのものと比較されている。Ｔ−ＤＮＡ 挿入部は、ｐＰＣＶ５０１３Ｈｙｇベクターのマップと比べると、オクトピンシ ンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子の一部および逆方向のｈｐｔ選択マーカー遺伝子をそ れぞれ有する２つのＤＮＡフラグメント（Ｔ−ＤＮＡ１およびＴ−ＤＮＡ２）か らなっている。ＣＰＤ遺伝子の図式的マップの上にあり且つＴ−ＤＮＡ挿入部の マップの下にある線は制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を示す。略語：ｃＭ、セ ン チモルガン；ｏｃｓ、オクトピンシンターゼ遺伝子、ｏｃｓδ、オクトピンシン ターゼ遺伝子フラグメント、ｈｐｔ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラー ゼ遺伝子、ｐＢＲ、ｐＢＲ３２２プラスミドレプリコン；ｏｒｉ、ｐＢＲ３２２ の複製起点；ｐｇ５、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子５のプロモーター；ｐｎｏｓ、ノパリン シンターゼプロモーター、ＬｂおよびＲｂ、Ｔ−ＤＮＡの左および右の境界配列 ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｐ、Ｐｓｔｌ、Ｒ、ＥｃｏＲＩおよび Ｋ、Ｋｐｎｌ．（Ｂ）野生型細胞懸濁培養（ｃ）、野生型およびｃｐｄ突然変異 体の実生（Ｓ）から調製されたＲＮＡを、ｈｐｔ−ｐＢＲセグメント（Ｔ−ＤＮ Ａ２）をフランキングするＰｓｔｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ植物ＤＮＡ−Ｔ−ＤＮＡ結 合フラグメントとハイブリダイズさせた。土壌で成長させた植物の実生および種 々の器官から調製されたＲＮＡを、プローブとしてのＣＰＤｃＤＮＡとハイブリ ダイズさせた。略語：ｓｔｅｍ ｉｎｆｌ．、花茎。 図５はｃｐｄ突然変異の遺伝的相補を示す。 （Ａ）ｍａｓ２’プロモーターにより働くＣＰＤｃＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡ によりタギングされたｃｐｄ遺伝子および植物遺伝子発現ベクターｐＰＣＶ７０ １のＴ−ＤＮＡの図式的マップ。Ｈｉｎｄｌｌｌ開裂部位はｃｐｄ遺伝子のマッ プの下そしてｐＰＣＶ７０１発現ベクターのマップの上にある黒い矢印により示 されている。フラグメントＡ、ＢおよびＣはＣＰＤｃＤＮＡプローブとハイブリ ダイズする野生型ＣＰＤ遺伝子のＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを示している。Ｔ はｃｐｄ突然変異体中のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズするＴ−ＤＮＡ−植 物ＤＮＡ結合フラグメントを示す。Ｘはｍａｓ２’プロモーターおよびＣＰＤｃ ＤＮＡの結合部を有するＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを示す。ｃＤＮＡプローブ の５'末端はｃｐｄ遺伝子中のＴ−ＤＮＡ挿入部位の非常に近くに位置するため 、ｃＤＮＡプローブは、Ｔ−ＤＮＡと結合された「Ａ」フラグメントの部分を有 する第二のＴ−ＤＮＡ−植物ＤＮＡ結合フラグメントを検出しなかった。略語： ＬｂおよびＲｂ、ｐＰＣＶ７０１発現ベクターのＴ−ＤＮＡの左および右の境界 、ｐｍａｓ、マンノピンシンターゼ遺伝子のプロモーター；ｐｎｏｓ、ノパリン シンターゼプロモーター；ｎｐｔ、カナマイシン耐性（ネオマイシンホスホトラ ンスフェラーゼ）遺伝子；Ａｇ７およびＡｇ４、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子４および７に そ れぞれ由来するポリアデニル化配列。（Ｂ）左：野生型、ｃｐｄ突然変異体およ びＣＰＤ過剰発現相補系からのＨｉｎｄｌｌｌ消化ＤＮＡの、ＣＰＤｃＤＮＡプ ローブとのサザーンハイブダイゼーション。ＤＮＡフィンガープリントは相補系 （ｃｐｄ相補体）およびｃｐｄ突然変異体系でのｍａｓプロモーターｃＤＮＡ結 合部（Ｘ）およびｃｐｄ特異的フラグメント（Ｂ、ＣおよびＴ）の存在、並びに 野生型標的部位（Ａ）の不在を示す。ｃＤＮＡプローブにより検出される他のフ ラグメントは６個の新しいＴ−ＤＮＡ境界フラグメントに相当する。それゆえ、 遺伝子分離およびＤＮＡフィンガープリントデータは、相補系ではｐＰＣＶ７０ １ベクターのタンデムＴ−ＤＮＡコピーが、独立分離を示す３つの遺伝子座に存 在することを示す。右：ＲＮＡは１４日目の野生型、ｃｐｄ突然変異体および相 補ｃｐｄ植物から調製され、そしてＣＰＤｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさ せた。（Ｃ）上部：土壌で白色光下に成長させた野生型（左）および相補ｃｐｄ 実生の表現型の比較。下部：野生型（左から最初の２枚の葉）、ｃｐｄ突然変異 体（３番目の葉）およびＣＰＤ過剰発現相補植物（右にある３枚の葉）の葉の形 態の比較。 図６は植物および動物由来のＣＹＰ９０および他のシトクロムＰ４５０タンパ ク質の間の配列相同性を示す。 ＣＹＰ９０はトウモロコシからのＣＹＰ８８（ＧＡ₁₂→ＧＡ₅₃ジベレリン１３ −ヒドロキシラーゼ；Winkler and Helentjaris，Plant Cell 7(1995)，1307-13 17）との最も高い配列相同性（２８％）を示すが、スラスピ・アルヴェンス（Th laspi arvense）のＣＹＰ７１Ｂ１（２３％の相同性、ＧｅｎＢａｎｋ（ｇｂ） Ｌ２４４３８）、ナスのＣＹＰ７６Ａ２（１９％の相同性、ｇｂ Ｘ７１６５７ ）およびエルサレム・アーティチョークのシンナメート４−ヒドロキシラーゼＣ ＹＰ７３（１７％の相同性、ｇｂ Ｚ１７３６９）を含む他の植物Ｐ４５０とは 、数個のドメインで異なる。ＣＹＰ９０およびＣＹＰ８８は、全ての他の植物Ｐ ４５０（Frey et al.，Mol．Gen．Genet．246(1995)，100-109）とは、配列比較 の下に示したように保存された位置Ｇ₇₆、Ｋ₃₃₇、Ｐ₃₅₀、Ｗ₃₇₅、Ｗ₃₈₄、Ｅ₃₉₃ 、およびＦ₃₉₆のアミノ酸交換により異なっている。ＣＹＰ９０は、動物Ｐ４５ ０の全ての保存されたドメイン、例えばＣＹＰ２Ｂ１（ｇｂ Ｊ００７１９）お よ びＣＹＰ２１Ａ２（ｇｂ Ｓ２９６７０）、および、基質−結合ドメインＳＲＳ ２とＳＲＳ３（Gotoh，J．Biol．Chem．267(1992)，83-90）を有するＣＹＰ２フ ァミリー（位置１３５−２４９）の中央可変領域との配列相同性を示す。膜固定 領域、プロリンに富んだドメイン並びにＯ₂−、ステロイド−およびヘム−結合 ドメインを含むミクロソームＰ４５０の保存されたドメインの位置は整列された 配列の上にある矢印により示されている。同一アミノ酸は反転印刷により示され ている。 図７はブラシノステロイドの相補によるｃｐｄ突然変異体表現型の野生型への 復帰を示す。 野生型（ｗｔ）およびｃｐｄ突然変異体実生を暗所（左）で５日間または明所 （右）で１４日間にわたり、ステロイドなし（−）または０．２×１０^-6Ｍのカ ンペステロール（ＣＬ）、カサステロン（ＣＴ）、テアステロン（ＴＥ）、３− デヒドロテアステロン（ＤＴ）、チファステロール（ＴＹ）、カスタステロン（ ＣＳ）またはブラシノライド（ＢＬ)を用いて成長させた。 図８は暗所で成長させたアラビドプシス突然変異体の胚軸伸長に対するブラシ ノステロイドの影響を示す。 各写真は暗所で５日間成長させた実生を示す。左から右に向かい、最初の実生 はステロイドの不在下で成長させ、第二のものはエルゴステロールで処置し、第 三のものはｅｐｉ−カスタステロンで処置しそして第四のものはｅｐｉ−ブラシ ノライドで処置した。ステロイドの濃度は０．１×１０^-6Ｍであった。（写真を 撮る前に、ある種の突然変異体中の胚軸の緑化を解明するため、顕微鏡で実生を 検査した。） 実施例は説明の例証となる。 実施例１ 細胞伸長および暗形態形成（skotomorphogenic development）の調節が不全な、 Ｔ−ＤＮＡでタギングした突然変異体の構築と同定 挿入突然変異原としてアグロバクテリウム・ツメフェシエンスＴｉプラスミド のトランスフア−ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）を使用して、高等植物において遺伝子タ ッグによる遺伝子突然変異を誘導するための遺伝子テクノロジーが開発された。 すなわち、アラビドプシス・サリアナの組織培養物の形質転換が、修飾されたＴ ｉプラスミド由来のベクター、すなわち、ｐｐｃＶ５０１３Ｈｙｇを使用して、 Konczら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),8467-8471)、Konczら（Plant Mol. Biol.20(1992b),963-976）およびKonczら（Specialized vectors for gene tagg ing and expression studics.In:Plant Molcecular Biology Manual Vol2,Gelvi n and Schilperoort(Eds.),Dordrecht,The Nethcrlands:Kluwer Academic Publ. (1994),1-22）に記載されるとおりにおこなわれた。異なる植物器官において、 植物の成長、とくに細胞の成長を制御する突然変異および相当する遺伝子を同定 することを目的として、この遺伝子タッグテクノロジーが、モデル植物アラビド プシス・サリアナを使用して、Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異体コレクションを作成す るのに使用された。 暗形態形成における胚軸および／または根の伸長が欠損した突然変異体をスク リーニングすることにより、劣性の構成的光形態形成および矮性（consitutive photomorphogenesis and dwarfism，ｃｐｄ）が同定された。野生型とは異なり 、ｃｐｄ突然変異体は、暗所において、胚軸が短く、頂端突起（apical hook） がなく、開いた子葉および長い葉原基を発達させた（図２Ａ，Ｂ）。野生型と比 較して、突然変異体実生では、胚軸の表皮細胞列の長さは少なくとも５倍短かか ったが、根では２０〜５０％短いだけであった。突然変異体の胚軸の表皮細胞は 、厚いセルロースマイクロフィブリル列が横断し（図２、Ｄ、Ｅ）、および孔辺 細胞の分化につながる垂直方向の分割を示した（図２Ｂ）。葉に特徴的な密な気 孔および突起様構造(trichome)もまた、突然変異子葉の表皮上で観察された（図 ２Ｃ）。暗所での５週間の成長において、突然変異体は多数のロゼット葉をつけ たのに対して、野生型の実生は、これらの条件下において葉を伸長することなく 子葉を開いた（図３A)。これらの表現型上の特徴は、暗所で成長させたｃｐｄ突 然変異体において光形態形成の阻害と脱黄化（de-etiolation）が起こっている ことを示した。これらの実生から調製された定常状態のＲＮＡの、ユビキチン（ ubiquitin；ＵＢＩ）遺伝子プローブを内部対照として使用したハイブリダイゼ ーションにより、突然変異体における脱黄化の形態学的兆候が、リブロース１， ５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）の小さいサブユニットおよ びクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードする光調節遺伝子の発現の増大を 伴うことが確認された（ＣＡＢ、図３Ａ）。 白光下において、土壌で育てられた場合、ｃｐｄ突然変異植物の大きさは、同 齢の野生型植物の２０〜３０倍小さくなった。光への暴露により突然変異体の根 の外皮における緑化およびクロロプラスト分化が引き起こされ（データは示さず ）、その結果、細胞伸長をさらに阻害し、葉柄、葉、花茎(inflorescence-stem) および花の器官の長さが全般的に短くなることとなった（図２ Ｈ、Ｉ）。組織 学的分析の結果、丸い形状の上偏生長突然変異葉において、縦方向の葉肉細胞列 の数が少なくなっており、柵状細胞が伸長していないことが示された（図２ Ｊ ＮＫ）。細胞壁は、突然変異体の軸側の葉表皮においてまっすぐに並んでおり、 このことは孔辺細胞の増幅と重複を示すものであった（図２ Ｆ、Ｇ)。突然変 異では、茎の断面図から、形成層が不均一に分裂しており、木部細胞を犠牲にし て多数の師部細胞列を産生していることが示されていた（図２ Ｌ、Ｍ)。ｃｐ ｄ突然変異体は、土壌でも生存することができ、野生型の大きさの卵と花粉を産 生した。しかし、突然変異体は、発芽において花粉が伸長しないために種ができ ず、雄生不稔であった。 実施例２ ｃｐｄ突然変異体の遺伝子分析 トリソミー分析およびリンケージマッピングをおこなうために、ｃｐｄ／＋株 を、記載されるとおりに（Koncz et al．(1992b)，loc．cit.）テスター株と交 配し、およびＭＳＡＲ培地における種子の発芽によりハイグロマイシン耐性Ｆ１ ハイブリッドを選択した（Koncz et al．(1994)，loc．cit.）。 突然変異体と野生型との異系交配後、アグロバクテリウム形質転換ベクターｐ ＰＣＶ５０１３Ｈｙｇ（Koncz et al．(1989)，loc．cit.）由来のハイグロマイ シン耐性（ｈｐｔ）マーカー遺伝子を含有する、一箇所のＴ−ＤＮＡ挿入をもつ ｃｐｄ突然変異株が共分離された。ｃｐｄ突然変異およびＴ−ＤＮＡ挿入は、以 下に記載されるように、第五染色体のトリソミックテスターおよび相反するｔｔ ｇマーカーを使用して、染色体５−１４．３（図４Ａ）にマッピングされた。 ｃｐｄ突然変異体と野生型との異系交配後、８種類のＦ２ファミリーから１２ ９７の野生型および４３７の矮性植物体が得られ（２．９７：１）、劣性ｃｐｄ 突然変異のモノゲニック分離について予想される比率の３：１に一致した（ｃ² ０．０３７、ホモジェニエティ２，５９９、Ｐ＝０．８５）。これらのＦ２ファ ミリーから、５３８３突然変異体がハイグロマイシンについてテストされ、すべ てが耐性を有し、Ｔ−ＤＮＡ挿入とｃｐｄ突然変異の強いリンケージが示された 。 ３：１の比率で突然変異を分離する他のトリソミックハイブリッドとは対照的 に、第５染色体トリソミックテスターＴ３１は、５８８野生型（３３６ハイグロ マイシン耐性および２５２ハイグロマイシン感受性）および６０ｃｐｄ突然変異 （すべてハイグロマイシン耐性）植物体という異常なＦ２比率を示した。突然変 異体に対する野生型比率（９．８：１）およびハイグロマイシン感受性に対する 耐性の後代比率（１．５７：１）は、シンテニーについて予想されうる比率（≧ ８：１および１．２５：１から２．４１：１の間）にマッチする。 相反する第５染色体のｔｔｇマ一カーを使用して、Ｔ−ＤＮＡ挿入片およびｃ ｐｄ突然変異が同時にマッピングされた。ｃｐｄ‐ｔｔｇマップ距離を決定する ために、ひとつは土壌で生長した植物体、もうひとつはＭＳＡＲ培地で発芽させ た後、１５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下で検定された実生を使用した 集団の二つのマッピング集団を作成した。土壌で生長した集団は、Ｆ２における 無毛ｔｔｇおよび矮性ｃｐｄ表現型についてスコア評価し、生殖能を有する植物 より得た種子は完全Ｆ３分析をおこなった。ｃｐｄを”ａ”およびｔｔｇを”ｂ ”とすると、土壌成長集団における実際のスコアはＡａＢｂが１０５４、ａａＢ が６８５、（外挿によればａａＢＢが４２４、ａａＢｂが２６１）、ＡＡｂｂが ３８７、ａＡｂｂが２６１、ＡａＢＢがＳ２４８、ＡＡＢｂが２５１、ＡＡＢＢ が２１およびａａｂｂが２５であった。後代分析の結果、ＡａＢｂ、ＡａＢＢお よびａａｂｂクラスがハイグロマイシン耐性で、これに対してＡＡｂｂ、ＡＡＢ ｂおよびＡＡＢＢはハイグロマイシン感受性クラスであった。コントロール下で 種子発芽をおこなったＭＳＡＲ培地上で評価された集団におけるデータは、Ａａ Ｂが８１５、ａａＢが５１２、ＡＡＢが１９３、ＡＡｂｂが３００、ａＡｂｂが １５９、ａａｂｂが１７であった。どちらのマッピング集団も、二重組み換えフ ラ クション（ｃｐｄ−ｔｔｇ）の頻度は同一であった。組み換え頻度および得られ たマップ距離を、記載されるとおり（Koncz et al.，Methods in Arabidops is Research; Singporc, World Scienticic, 1992a）、マキシマムライク リフッド法（Maximum likelihood method）によって計算した。これらのデータ から、土壌における不均一な種子の発芽を原因とする誤差を補正した、短いほう のマップ距離が認められ、結果としてｃｐｄ（５-１４．３）-ｔｔｇ（５-３５ ．５）間隔として２１．１８±０．８６ ｃＭとなった。１５２０の組み換え染 色体のスコア評価から、Ｔ-ＤＮＡにコードされるハイグロマイシン耐性マーカ ーおよびｃｐｄ突然変異との間に交差がないことが判明し、Ｔ−ＤＮＡ挿入がｃ ｐｄ座に位置することが示された。 Ｔ−ＤＮＡでタッグした座の物理的マップがＤＮＡハイブリダイゼーションに よって決定され、ｃｐｄ突然変異体が４．８ｋｂのＴ-ＤＮＡ挿入片を含有し、 これが内部で再アレンジメントされることが示された（図４Ａ）。 実施例３ Ｔ−ＤＮＡでタッグした座およびｃｐｄ座の野生型ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ の単離 Ｔ-ＤＮＡでタッグした座を単離するために、部分的にＭｂｏｌで消化してλ ＥＭＢＬ３ベクターのＢａｍＨＩサイトにｃｐｄ ＤＮＡをライゲーションして 、ゲノムＤＮＡライブラリーを構築した（Sambrook et al．(1989)loc．cit.） 。Ｔ−ＤＮＡでタッグした座は、ｃｐｄ突然変異体のゲノムＤＮＡライブラリー を構築することにより単離し、およびＴ−ＤＮＡ由来のプローブを用いてハイブ リダイゼーションすることによりマッピングした（図４Ａ）。 Ｔ-ＤＮＡ／植物ＤＮＡ挿入片接合部分をサブクローニングし、配列決定し、 アラビドプシスＹＡＣ（酵母人工染色体）クローンを単離することにより、Ｔ− ＤＮＡのゲノム位置を正確に決定するためのプローブとして使用した。ＹＡＣク ローン（図４Ａ）は、第５染色体のＡＳＡ１（アンスラニレートシンターゼ、ｃ ｈｒ５−１４．７）およびｈｙ５（長い胚軸座、ｃｈｒ５-１４．８）領域と重 複し（R．Shcmidt，未発表；Hauge et al.，Plant J．3(1993)，745-754）、遺 伝 子リンケージ分析によってＴ-ＤＮＡでタッグされたｃｐｄ突然変異について決 定されたマップ位置（ｃｈｒ５−１４．３）にマッチした。 Ｔ-ＤＮＡのｈｐｔ-ｐＢＲセグメントに隣接する植物ＤＮＡ配列（図４Ａ）は 、野生型実生および細胞懸濁培養物中に存在する１．７ｋｂのｍＲＮＡとハイブ リダイズしたが、ｃｐｄ突然変異体においてはいかなる転写物も検出できなかっ た（図４Ｂ）。 λＥＭＢＬ３の物理的マッピングに続いて、Ｔ-ＤＮＡ−植物ＤＮＡ接合部フ ラグメント（植物ＤＮＡ中のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌサイトに挟まれる 、図４Ａ）を、野生型アラビドプシスλＥＭＢＬ４ゲノムおよびλｇｔ１０ｃＤ ＮＡライブラリーから得た４ゲノムおよび４ｃＤＮＡクローンを単離するための プローブとして使用した。ＣＰＤ座を含有する酵母人工染色体クローンを同定す るために、野生型アラビドプシスＹＡＣライブラリーを、ｏｃｓＴ-ＤＮＡ−植 物ＤＮＡ接合部フラグメント（図４Ａ中、ＢａｍＨＩ-ＥｃｏＲＩフラグメント ）をプローブとして使用するハイブリダイゼーション（Koncz et al.(1992b),lo c.cit.)によってスクリーニングした。ＣＰＤｃＤＮＡ（ＥＭＢＬデータベース 、アクセッションナンバーＸ８７３６７；配列番号１）および遺伝子（ＥＭＢＬ データベース、アクセッションナンバーＸ８７３６８；配列番号３）の特性を評 価するために、これらのクローンをマッピングし、そのフラグメントをサブクロ ーニングして配列決定した。１７３５塩基のＣＰＤ転写物の５’末端は、ＡＴＧ コドンの１６６ｂｐ上流にマップされ、一方、ポリアデニル化シグナルは、１３ １塩基の３’-ＵＴＲ中のストップコドンの１０４ヌクレオチド下流に位置付け られた。 ＲＮＡハイブリダイゼーションのデータの裏付けとして、野生型ｃＤＮＡとＴ −ＤＮＡ挿入片の接台部およびゲノムＤＮＡ配列の塩基配列の比較の結果、Ｔ- ＤＮＡがコーディングドメインの転写を妨害する遺伝子のＡＴＧ開始コドンの３ ’側へ１０ｂｐ下流に挿入されていることが示された。 ＤＮＡ分析およびクローニング、ラムダファージライブラリーのスクリーニン グ、ＤＮＡおよびＲＮＡフィルターハイブリダイゼーション、および二本鎖ＤＮ Ａテンプレートのシークエンシングを、標準的な分子手法を使用しておこなった （Sambrook et al．(1989)，loc．cit.）。ＲＮＡブロットのハイブリダイゼー ションには、以下のＤＮＡプローブが使用された。すなわち、ＲＢＣＳ（ＥＳＴ ＡＴＴＳ０４０２，ＧｅｎＢａｎｋ（ｇｂ）：Ｘ１３６１１）、ＣＡＢ １４０ （0hio ARabidopsis Stock Center（OASC）３８Ａ１Ｔ７，ｇｂ Ａ２９２８０ ）、アルカリペルオキシダーゼ（ＥＳＴ ＡＴＴＳ０３６６，ｇｂ Ｐ２４１０ ２）、非葉緑体ＳＯＤ（ＯＡＳＣ ２Ｇ１１Ｔ７Ｐ）、ＧＳＴ２（ｇｂ Ｌ１１ ６０１）、ＨＳＰ７０（ｇｂ Ｍ２３１０８）、リグニン形成ペルオキシダーゼ （ＥＳＴ ＡＴＴＳ０５９２，ｇｂ Ｐ１１９６５）、カルコンシンターゼ（Tr ezzini et al.，Plan tMol．Biol．21(1992)，385-389）、リポキシゲナーゼ（ Ｌｏｘ２，ｇｂＬ２３９６８）、Ｓ-アデノシル−メチオニンシンターゼ（ＯＡ ＳＣ ４０Ｇ２Ｔ７，ｇｂ Ｐ２３６８６）、Ｈｓｐ１８．２（ｇｂ Ｘ１７２ ９５）、ＡＤＨ（ｇｂ Ｍ１２１９６）、ＰＲ１、ＰＲ２およびＰＲ５（Uknes et al.，Plant Cell 4(1992)，645-656）である。 図４Ｂに示されるＲＮＡブロットは、Ｔ-ＤＮＡのｈｐｔ-ｐＢＲセグメントに 隣接する植物ＤＮＡ配列とハイブリダイズした（図４Ａ中、ＰｓｔＩ-Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント）。 実施例４ ｃｐｄ ｃＤＮＡおよびゲノムクローンの分析 ＣＰＤＤＮＡおよび由来するタンパク質配列の分析が、ＧＣＧおよびＢＬＡＳ Ｔコンピュータプログラムを使用しておこなわれた（Deveraux et al.,Nucl.Aci ds Rcs.12(1984),387-395;Altschul et al.,J.Mol.Biol.215(1990),403-410）、 およびＰ４５０配列の比較もおこなわれた（Gotoh，J．Biol．Chcm．267(1992) ，83-90;Nelson et al.,DNA12(1993),1-51;Frey et al.,Mol.Gen.Genet.246(199 5),100-109）。 ＤＮＡ配列分析の結果、ＣＰＤ遺伝子（配列番号３）は、コンセンサススプラ イシングサイトをエクソン-イントロン境界に有する８個のエクソン（図４Ａ） からなることが判明した。ＣＰＤｃＤＮＡ（配列番号１）は、いくつかの器官に 特異的なアラビドプシスｃＤＮＡライブラリーからの発現された配列タッグ（た とえば、ＥＳＴ ＥＭＢＬ Ｚ２９０１７およびＧｅｎＢａｎｋ Ｔ４３１５１ ） と９０％以上の相同性を示し、ＣＰＤ転写物が遍在することを示した。ｃＤＮＡ プローブ（図４Ｂ）でのハイブリダイゼーション分析は、実際に定常状態のＣＰ ＤｍＲＮＡのレベルは、根、葉および花においては同程度であるが、花茎および 緑の長角果（果実）においてはかなり低いことを示した。ＣＰＤ遺伝子の発現は 、光、シトキニン成長因子および炭素源として供給されたしょ糖などの外部シグ ナルにより制御されることが判明した。ＣＰＤｍＲＮＡのレベルは、暗所で成長 した野生型の実生において、培地のしょ糖濃度を増加させる（３ｍＭから９０ｍ Ｍに）、または低濃度のしょ糖で光をあてるかのいずれかにより上昇したが、特 に明条件において、シトキニンおよびしょ糖処理を組み合わせることにより減少 した（図３Ｂ）。 ＣＰＤｃＤＮＡの翻訳は、以下ＣＹＰ９０と称する５３，７８５ Ｄａのタン パク質をコードする４７２コドンの（配列番号２）領域を限定した。このタンパ ク質の推測されるアミノ酸配列は、データベース中において、ミクロソームのシ トクロムＰ４５０の保存されたＮ末端の膜固定され、プロリンリッチ、酸素およ びヘム結合ドメインに相同性、すなわちNebert and Gonzalez（Ann.Rev.Biochem .56(1987),945-993）により明らかにされた保存Ｐ４５０ドメインと５０〜９０ ％の配列同一性が見いだされた（図６）。このように、ＣＰＤ遺伝子のコードす るタンパク質は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの機能上で重要な全てのドメイン を有すると考えられる（Pan et al.，J.Biol.Chem.270(1995),8487-8494）。さ らに、配列の比較によっても、ＣＹＰ９０とステロイドヒドロキシラーゼの特定 のドメインとの間の相同性が示された。ラットのテストステロン−１６ａ−ヒド ロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｂ１；２４％同一性；Fujii-Kuriyama et al.,Proc.Nat l.Acad.Sci.79（1982）2793-2797）を含むＣＹＰ９０ファミリーのメンバーは、 このように、ステロイド基質結合ドメインＳＲＳ２およびＳＲＳ３を含む（Goto h,(1992),loc.cit.）、その中央の可変なドメイン（ポジション１３５-２４９、 図６）において、ＣＹＰ９０との配列類似性を示した。さらに、ヒトのプロゲス テロン−２１−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２１Ａ２；１９％同一性；White et a l.,Proc.Natl.Acad.Sci.83(1986),5111-5115）に代表されるＣＹＰ２１ファミリ ーにおいては、イントロン７および８の位置が、ＣＰＤ遺伝子のイントロン３お よび５に相当し、重 要な進化上の関係を示唆している（Nelson et al.,(1993),loc.cit.）。それで も、他のＰ４５０との全体的な配列の同一性が４０％未満であることから、ＣＰ Ｄ遺伝子産物は、新規なＰ４５０ファミリー、ＣＹＰ９０、に割り当てられ、進 化系統樹においては、トマトのＣＹＰ８５、ヒマワリのＣＹＰ８７(どちらも未 発表）およびトウモロコシのＣＹＰ８８とともにクラスターを形成する（Winkle r and Helentjaris,Plant Cell 7(1995),1307-1217;P450 Nomenclature Commi ttee,D.Nelson,私信）。 実施例５ ｃｐｄ突然変異の相補性 Ｔ−ＤＮＡ挿入片が実際にｃｐｄ突然変異に関与するということを証明するた めに、もっとも長い野生型ＣＰＤｃＤＮＡ（ＡＴＧコドンの４７ｂｐ上流まで伸 びる）のコーディングドメインを、大腸菌からアグロバクテリウムまで紺綬ゲー ト（conjugate）した植物遺伝子発現ベクターｐＰＣＶ７０１のＢａｍＨＩサイ ト中にクローニングし、記載されるように（Koncz et al.,(1994),loc．cit.） アグロバクテリウムの媒介によるアラビドプシス形質転換によりホモ接合ｃｐｄ 突然変異体中に形質転換させた。ｃＤＮＡは、オーキシン制御マンノピンシンタ ーゼ（ｍａｓ）２’プロモータの制御下において、ホモ接合ｃｐｄ突然変異体中 において発現された（図５Ａ、Koncz et al.，(1994)，loc．cit.）。ｐＰＣＶ ７０１が有するカナマイシン耐性遺伝子を利用して選択および再生されたトラン スジェニック植物は、すべて野生型で生殖能を有し、ｃｐｄ突然変異の遺伝的相 補性を示した。多くの相補的な系統（line）のカナマイシン耐性後代は、野生型 より大きい葉および花序枝をつけた。このような相補ｃｐｄ系統（図５Ｃ）のひ とつでは、２６８のカナマイシン耐性野生型および４のカナマイシン感受性ｃｐ ｄ突然変異後代を与えたことから、少なくとも３つの独立した分離ｐＰＣＶ ７ ０１Ｔ−ＤＮＡ挿入片を有した。ＤＮＡフィンガープリンティングにより、この 相補系統には、野生型が単一コピーのＣＰＤ遺伝子から産生するよりも、ずっと 多い量のＣＰＤ転写物を、ｍａｓ ２’プロモータにより駆動される複数のｃＤ ＮＡコピーから産生する複数のｐＰＣＶ７０１Ｔ−ＤＮＡ挿入片が存在すること が 確認された。 実施例６ ｃＤＮＡの過剰発現の影響 暗所で成長したｃｐｄ突然変異体（図３Ａ）と対照的に、明条件で成長した植 物では、ＣＰＤ転写物の不在または過剰発現が、光調節ＲＢＣＳおよびＣＡＢ遺 伝子の定常状態のＲＮＡレベルに影響することはなかった（図３Ｂ）。カルコン シンターゼ（ＣＨＳ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、リポキシゲナ ーゼ（ＬＯＸ２）、Ｓ−アデノシル−メチオニンシンターゼ（ＳＡＭ）およびヒ ートショック１８．２（Ｈｓｐ１８．２）遺伝子の転写レベルは、ｃｐｄ突然変 異体において増大しているのに対して、アルカリペルオキシダーゼ（ＡＰＥ）、 スパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー ゼ（ＧＳＴ）、ヒートショック７０（ＨＳＰ７０）またはリグニン形成ペルオキ シダーゼ（ＬＰＥ）などの他のストレス制御遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ｃｐｄ 突然変異体、野生型およびＣＰＤ過剰発現植物において同程度であった。病因関 連性遺伝子、ＰＲ１，２および５の発現は、ｃｐｄ突然変異において顕著に低か った。しかし、ｃｐｄを過剰発現する相補された系統において、ＣＰＤｃＤＮＡ の過剰発現は、これらのＰＲ遺伝子を有意に誘導することになった。 実施例７ ブラシノステロイドおよび他の植物成長因子によるｃｐｄ突然変異体の相補性 上記の配列相同性データは、ＣＹＰ９０の基質特異性を明確に予測するには十 分ではない（Nelson et al.，(1993)，loc．cit.）。従って、その合成にＰ４５ ０酵素が関与する全ての植物成長因子に対するｃｐｄ突然変異体の伸長反応を調 べた。 オーキシン（インドール−３−酢酸、ａ−ナフタレン酢酸、２，４−ジクロロ −フェノキシ酢酸）、シトキニン（６−ベンジル−アミノプリン、６−フルフリ ルアミノプリン、６−（γ、γ−ジメチルアリルアミノ）−プリンリボシド）、 アブシン酸、サリチル酸、メチル−ジャスモネートおよびレチノイン酸誘導体 （ビタミンＡアルデヒド、９−シス−レチナール、１３−シス−レチナール、ト ランス−レチノイル酸、１３−シス−レチノイル酸およびレチノール）を含む植 物成長因子を、最終濃度、０．０１，０．０５、０．１、０．５および０．１μ Ｍで使用し、一方、ジベレリン類（ジベレイン酸、ＧＡ３、ＧＡ４、ＧＡ７およ びＧＡ１３）は、ＭＳＡＲ種子発芽培地中、０．１、１、１０および１００μＭ にて使用した。 図１に一覧されるブラシノステロイドおよびテアステロン(teasterone)、チフ ァステロール(typhasterol)、カスタステロン(castasterone)およびブラシノラ イドのｅｐｉ異性体は、A．SakuraiおよびS．Fujioka（Institute of Physica l and Chemical Research(RIKEN)、日本）およびG．Adam（Institute for Pl ant Biochemistry，Halle、ドイツ）から入手した。ＢＲは、無菌条件下におけ る種子発芽に使用されるＭＳＡＲ培地中と類似の濃度（０．００５、０．０１、 ０．０５、０．１、０．５および１μＭ）で実験された（Konczら、(1994),loc. cit.）。バイオアッセイは、発芽１、２、５および１０日後、胚軸および根の長 さの測定、および視覚的調査および実生の写真によって評価した。土壌で成長さ せた突然変異植物には、０．１または１μＭのカスタステロンまたはブラシノラ イドの水溶液を噴霧した。 組織学的分析は、標準的な手法に従っておこなった（Feder and O'Brien，Am. J．Bot．55(1968)，123-142）。組織は、ホルマリン：酢酸：エタノール（９０ ：５：５）中で固定化、２−ヒドロオキシエチルメタクリレートに包埋し、ロー タリーマイクロトームを使用して１０μｍの切片にし、およびトルイジン−ブル ーで染色した。密着インプリントを作成するために、実生を３％の溶かしたアガ ロースに入れ、写真を撮る前に固まったキャリアから注意深く取り出した。 これらのバイオアッセイでは、オーキシン、ジベレリン、シトキニン、アブシ ン酸、エチレン、メチル−ジャスモネート、サリチル酸および様々なレチノイド 酸誘導体は、暗所または明所において成長させたｃｐｄ突然変異体の胚軸の伸長 を促進しなかった（データは示さず）。しかし、エシディソン様（ecdysone-lik e）植物性ステロイドの一種であるブラシノライド（０．００５×１０^-6Ｍの濃 度で使用）は、暗所および明所の両方において、ｃｐｄ突然変異実生の胚軸、葉 および葉柄における細胞の伸長を回復することが見いだされた。ブラシノライド 処理 はまた、突然変異体の雄性不妊を回復し、ホモ接合種子を生産させた。 テアステロン、３−デヒドロテアステロン、チファステロールおよびカスタス テロンなどのようなブラシノライドのＣ２３-ヒドロキシル化ブラシノステロイ ド（ＢＲ）前駆体の存在下（０．１〜１×１０^-6Ｍ）において成長させたとき（ Fujioka et al.，Biosci．Biotech．Biochem．59(1995)，1543-1547）、ｃｐｄ 突然変異体はまた、暗所および明所において野生型と識別できない（図７）。し かし、Ｃ２３ポジションにヒドロキシル基を有さないカサステロン (cathasterone)およびその前駆体カンペステロール(campesterol)(および、カン ペスタノール(campestanol)、６α−ヒドロキシカンペスタノールおよび６−オ キソカンペスタノール、Δ２２−６−オキソカンペスタノールおよび２２α、２ ３α−エポキシ−６−オキソカンペスタノール、データは示さず）は、ｃｐｄ表 現型を変えず、このことは、テアステロンへのカサステロン Ｃ２３ヒドロキシ レーションが、ｃｐｄ突然変異体に欠落していることを示唆するものである。Ｂ Ｒの合成［２２Ｒ，２３Ｒ，２４Ｒ］-誘導体（Adam and Marquardt，(1986)，l oc．cit.）から、ｅｐｉ−テアステロンは、不活性であるが、ｅｐｉ−カスタス テロンおよびｅｐｉ−ブラシノライドはｃｐｄ表現型およびその［２２Ｒ，２３ Ｒ，２４Ｓ］−立体異性体を復帰させることが見いだされた。 特筆すべきことに、野生型実生の胚軸伸長反応は、暗所においてブラシノステ ロイドによる影響を受けず（図７）、このことは、この成長反応の飽和の可能性 があることを示ものであった。対照的に、明所における野生型実生のカスタステ ロンおよびブラシノライドによる処理により、胚軸の伸長が促進された（効力に 差異はあるが）。高濃度で（０．１〜１×１０^-6Ｍ）処理した場合、カスタステ ロンおよびブラシノライド（これらのｅｐｉ−立体異性体も同様であるが、他の ＢＲ前駆体は違った）は、明所における、野生型および突然変異植物体のどちら においても、異常な葉の拡大、上偏成長、老化、および発育遅延を引き起こした （図７）。 実施例８ ブラシノステロイド反応において作用をうける他の突然変異体の同定 生理学的データは、ジベレリンおよびステロイドの生合成に共通の前駆体が関 与すること（Ｄａｖｉｅｓ，Ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ （１９８７），Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：Ｍａｒ ｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆ Ｐｕｂｌ．）、およびＢＲが、明所においてエチレ ンの生合成を刺激すること（Ｍａｎｄａｖａ（１９８８），loc．cit.）を示し ている。にもかかわらず、エチレン生産（ｅｔｏｌ）、ジベレリン生合成（ｇａ ）および認識（ｇａｌ）に影響を有する突然変異体は、暗所において、ＢＲに反 応せず、ＢＲはエチレン耐性ｅｔｒｌ突然変異体における弱い胚軸伸長反応を促 進するだけである。このように、エチレン、ジベレリン、およびＢＲ反応に影響 を有する突然変異体は、明確に識別することができる。ｃｐｄ突然変異体および 野生型のアラビドプシス実生で暗所において実施されたＢＲバイオアッセイの結 果、ＢＲは野生型において胚軸の伸長を刺激することはないが、ＢＲ−欠損が短 い胚軸という表現型を引き起こし得ることを示している。ＢＲ生合成に欠陥があ る突然変異は、従って、短い胚軸を発達させることが予想され、これはブラシノ ライドおよびＢＲ前駆体により野生型まで回復されるはずである。また、ＢＲ認 識および／またはシグナリングに欠陥のある突然変異は、短い胚軸およびＢＲに 対して部分的または完全に感受性がないことが予想される。脱黄化突然変異体ｄ ｅｔ２は、ＢＲ生合成突然変異体であると考えられる。ＤＥＴ２遺伝子は、おそ らく、ブラシノライド生合成の第一段階において、カンペステロールからカンペ スタノールへの変換に必要である動物のステロイド−５ａ−レダクターゼをコー ドする（Ｌｉ，Ｊ．，Ｐ．Ｎａｇａｉ，Ｖ．Ｖｉｔａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｃｈｏ ｒｙ，私信）。ｄｅｔｌ、ｃｏｐ-１６、ｆｕｓ４、ｆｕｓ５、ｆｕｓ６、ｆｕ ｓ７、ｆｕｓ８、ｆｕｓ９、ｆｕｓ１１およびｆｕｓ１２などの他の脱黄化およ び構成的光形態形成突然変異体において、ＢＲは、暗所においてのみ胚軸の伸長 を促進する。ＣＯＰ１タンパク質を全く産生しないｃｏｐ-１３突然変異体（Ｍ ｃＮｅｌｌｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ６（１９９４），４８７-５００）は 、明らかにＢＲに対して感受性がない。対照的に、免疫学的に検出可能な量の突 然変異ＣＯＰ１タンパク質を合成する、より程度の軽いｃｏｐ１-１６突 然変異体（Ｍｉｓｅｒａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４（１９９４） ，２４２-２５２；Ｍｃｎｅｌｌｉｓら、（１９９４）loc．cit.）は、胚軸成長 を示してＢＲに反応する。ｆｕｓ６突然変異体は、類似の対立差を示すが、ｄｅ ｔ３突然変異体は、ＢＲに完全に感受性がない。このように、これらの突然変異 がＢＲ認識および／またはシグナリングに関与する制御機能に影響を与えている 可能性がある。 胚軸伸長に欠陥のある異なるアラビドプシス突然変異体に対するカスタステロ ンおよびブラシノライド（およびそのエピ異性体）の影響を、同様にテストした 。光による胚軸伸長の負の制御による錯綜を排除するため、突然変異体は暗所に おいてＢＲの存在または不在状態で生長させ、これらの胚軸の生長を、対照とし た未処理およびエルゴステロール処理実生のそれと比較した（図８）。明所にお いて矮性および胚軸および／または上胚軸の生長阻害を示すジベレリン生合成（ ｇａ５）または認識（ｇａｌ）における突然変異体（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｚｅｅｖａａｒｔ，ｉｎ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（１９９４） Ｍｅ ｙｅｒｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｓｏｍｅｆｉｌｌｅ（Ｅｄｓ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｇｏｒ，Ｎ．Ｙ．，５２３-５５３）は、野生型と同程度または 短い胚軸を形成したが、暗所において有意な胚軸の伸長（２０％より大きい）に よってＢＲに反応することはなかった。暗所で生長したエチレン過剰産生突然変 異体ｅｔｏｌ（Ｅｃｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８（１９９５），６６７-６ ７５）における胚軸生長の阻害も、ＢＲによる影響を受けなかった。これに対し て、ＢＲ処理は、エチレン耐性突然変異体ｅｔｒｌにおいて、胚軸の伸長速度を ５０から８０％刺激した（Ｅｃｋｅｒ（１９９５），loc．cit.)。オーキシン／ エチレン耐性ａｘｒ２突然変異体の胚軸伸長（Ｅｓｔｅｌｌｅ ａｎｄ Ｋｌｅ ｅ，ｉｎ：Ａｒａｉｄｏｓｉｓ（１９９４），Ｍｅｙｅｒｏｗｉｚ ａｎｄ Ｓ ｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ（Ｅｄｓ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｇｏｒ，Ｎ ．Ｙ．，５５５-５７８）は、ＢＲにより２から３倍に増大し、これは子葉の拡 大を促進したが、ａｘｒ２実生の根の生長を阻害した。野生型およびｇ ａ５、ｇａｉ１、ｅｔｏ１，ｅｔｒ１、およびａｘｒ２突然変異体は、明所にお いて、同程度のＢＲへの胚軸伸長（上胚軸／茎の生長は異なる）反応を示した。 ｃｐｄ突然変異体について観察されたように、カスタステロンおよびブラシノ ライドはｄｉｍ突然変異体（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９（ １９９５），９７-１０７）の表現型を暗所においておよび明所においても、野 生型にまで回復した（データは示さず）。これと対照的に、ｄｅｔ１、ｃｏｐ１ -１６、ｆｕｓ４、ｆｕｓ５、ｆｕｓ６、ｆｕｓ７、ｆｕｓ８、ｆｕｓ９、ｆｕ ｓ１１およびｆｕｓ１２突然変異体の胚軸の伸長は（Ｃｈｏｒｙ ａｎｄ Ｓｕ ｓｅｋ，ｉｎ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（１９９４），Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ（Ｅｄｓ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｇｏｒ，Ｎ．Ｙ．，５７９−６１４；Ｄｅｎｇ，Ｃｅｌｌ ７６（１９９４）， ４２３-４２６；Ｍｉｓｅｒａら、（１９９４），loc.cit.）、暗所においての み、ＢＲにより３から１０倍に刺激された。ＢＲはまた、ｄｅｔ１およびｆｕｓ ９突然変異体の子葉において、細胞の拡大とアントシアニンの蓄積を刺激した。 その対立遺伝子と比較して、ｃｏｐ１-１３およびｆｕｓ６−Ｇ突然変異体は、 カスタステロンおよびブラシノライドに反応しての子葉伸長を全く示さないまた はわずかに（１０から２０％）示すのみであったが、ｄｅｔ３突然変異体（Ｃｈ ｏｒｙ ａｎｄ Ｓｕｓｅｄ（１９９４），loc．cit.）は、ＢＲに対して完全 に感受性がないことが判明した。 本出願により提示されるデータは、ブラシノステロイドが植物の成長および分 化にきわめて重要なものであるという証拠を明白に提供するものである。 その発見以来（Ｇｒｏｖｅら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１（１９７９），２１６− ２１７）、ブラシノステロイド（ＢＲ）は、大半の植物種においてその濃度がき わめて低くその作用スペクトルが同時に遍在する成長因子であるオーキシン、ジ ベレリン、エチレンおよびサイトキニンの作用スペクトルで過剰状態であるため に、非必須の植物ホルモンであると考えられてきた。この見解を裏付ける主な論 拠は、細胞伸長を制御する光レセプターおよび光ホルモンの活性をモニターする 標準的なテストとして使用される暗所で実施される胚軸伸長アッセイにおいてＢ Ｒが不活性であることである（総論については、Ｄａｖｉｅｓ（１９８７），lo c．cit．：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．（１９９４））を参照 のこと）。本出願に記載されるデータは、胚軸伸長突然変異体の表現型はブラシ ノライドおよびその前駆体により野生型に復帰されるが、他の既知の植物成長因 子によっては復帰されないことを証明するものであることから、この論拠を明ら かに崩すものである。実験に使用したＢＲ前駆体は、ｃｐｄ突然変異体における 胚軸伸長欠陥は、ブラシノライド生合成における欠損が原因であることを示唆し ている。ブラシノライドは、多くの植物種において、明所において、表層のミク ロチューブルとセルロースマイクロフィラメントの縦方向へのアレンジメント、 葉の展開、木部の分化および胚軸の伸長を刺激することがこれまでに観察されて きている。ブラシノライドはまた、根の伸長、茎の放射方向の成長、アントシア ニン合成、および脱黄化を阻害することが報告されている（Ｍａｎｄａｖａ（１ ９８８）loc．cit.）。大半の器官における縦方向の細胞の伸長の阻害、外皮細 胞の表面上におけるセルロースマイクロフィラメントの横行アレンジメント、葉 の展開および木部分化の阻害、および暗所における脱黄化の誘導などといったｃ ｐｄ突然変異体の表現型の特徴は、ブラシノライド合成における突然変異につい て予測される表現型と一致する。さらに、プロゲステロン側鎖ヒドロキシラーゼ のＣＰＤ遺伝子とＣＹＰ２１遺伝子ファミリーの間のエクソン−イントロン境界 の保存、ＣＹＰ９０タンパク質と機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼのすべての 保存されたドメインとの相同性、およびＣＹＰ９０ドメインとＣＹＰ２テストス テロンヒドロキシラーゼの基質結合ドメインとの類似性はまた、ＣＰＤ遺伝子が Ｐ４５０ステロイドヒドロキシラーゼをコードする可能性を示唆するものである 。 シトクロムＰ４５０は、インビトロにおける人工基質として広く使用されるこ とが知られているが、インビボにおいて、詳細に解明されている立体特異的反応 をおこなう。その基質特異性は、基質結合ドメインに作用する突然変異により変 更することができることから、Ｐ４５０酵素の特異性は、インビボにおけるラベ ルした基質を使用した供給実験においてのみ判断することができる（Ｎｅｂｅｒ ｔ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ（１９８７），loc．cit.）。多様なシトクロム Ｐ４５０が、インビボにおける任意のある代謝変換に寄与するという事実を通常 は排除することができないことから、このような分析は、トランスジェニック器 官においてシトクロームＰ４５０が過剰に発現されるか、または特定のＰ４５０ が欠損した突然変異を使用する必要がある。ｃｐｄ突然変異体およびＣＰＤを過 剰に発現するトランスジェニック植物は、このように、ブラシノライド生合成に おけるカサステロンのＣ２３−ヒドロキシル化におけるＣＹＰ９０の必要性を確 認するために適切な材料を提供するものである（Ｆｕｊｉｏｋａら、（１９９５ ），loc．cit.）。 ｃｐｄおよびｄｅｔ２突然変異は、脱黄化および暗所における光誘導性のＲＢ ＣＳおよびＣ ＡＢ遺伝子の発現を含む、類似の表現型特徴を引き起こす。この ようにｃｐｄは、ｄｅｔ突然変異の新しいタイプであると考えることができる。 ｄｅｔｌｈｙ二重突然変異体の遺伝子の分析の結果、ｄｅｔ１およびｄｅｔ２は 、光レセプターのｈｙ突然変異に対して上位であることを示唆するものである。 従って、ｄｅｔ１およびｄｅｔ２は、脱黄化のマイナスの調節因子として、平行 して光シグナリング経路に作用することが提案されている（ＣｈｏｒｙａｎｄＳ ｕｓｅｋ（１９９４），loc．cit.）。ｄｅｔ１経路においては、ＤＥＴ１、Ｃ ＯＰ１およびある種のＦＵＳ遺伝子の産物は、暗所において光調節遺伝子の核レ プレッサーとして機能すると考えられている（Ｄｅｎｇ（１９９４），loc．cit .）；Ｑｕａｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８（１９９５），６７５-５８０）） 。さて、ｄｅｔ２およびｃｐｄとｄｉｍ突然変異体がＢＲにより野生型に復帰す ることから、推定されるｄｅｔ２光シグナリング経路（Ｃｈｏｒｙ ａｎｄ Ｓｕ ｓｅｋ（１９９４），loc．cit.）は、ブラシノステロイド経路であると考えら れる。このことは、ＢＲが暗所において脱黄化を阻害することを示すデータと一 致する（Ｍａｎｄａｖａ（１９９８），loc．cit.）。我々のデータもまた、明 所において、ｃｐｄ突然変異がストレス制御性のカルコン合成（ＣＨＳ）、アル コールデヒドロゲナーゼ、ヒートショック１８．２、リポキシケナーゼ、Ｓ−ア デノシル−メチオニン合成遺伝子の活性化を引き起こすことを示している。この ことは、ＢＲがアントシアニン合成を阻害することを示す観察（すなわち、ＣＨ Ｓにより制御される；Ｍａｎｄａｖａ（１９８８），loc．cit.）およびｄｅ ｔ２突然変異体においてＣＨＳ遺伝子も誘導されること（Ｃｈｏｒｙら、Ｐｌａ ｎｔ Ｃｅｌｌ ３（１９９１），４４５−４５９）と相関する。ＣＰＤ機能（ およびその結果としてｄｅｔ２／ＢＲ経路）は、従って、植物において防御およ びストレス反応を制御することが知られている脂質ハイドロパーオキシドシグナ ル（すなわち、ジャスモネート）の発生に関与するリポキシゲナーゼを調整する ことにより、ストレスシグナリングを負の方向に制御すると考えられる（Ｆａｒ ｍｅｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（１９９４），１４２３−１４３ ７）。野生型アラビドプシスをシトキニンで処理すると、ｄｅｔ２突然変異の表 現型模写がおこることが観察されている（Ｃｈｏｒｙら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．１０４（１９９４），３３９-３４７）。同じく、我々のデータはＣＰ Ｄ遺伝子の転写がシトキニンによりダウンレギュレーションされ、これはＢＲの 生合成を調節する可能性があることを示している。ＣＰＤ遺伝子の発現もまた、 光および利用可能な炭素源（たとえばしょ糖）による制御を受け、光とＢＲシグ ナリングのあいだに複雑な制御上の相互作用が存在することを示唆している。こ のように、ｃｐｄおよびｄｅｔ２突然変異は、間接的に光調節性の遺伝子の発現 に影響を及ぼしているにすぎない可能性がある（たとえば、ストレス反応の調節 を介して）。ｄｉｍ突然変異体の研究から、胚軸の伸長の阻害は、暗所において 、光誘導性のＲＢＣＳ、ＣＡＢおよびＣＨＳ遺伝子の発現に影響を与えない可能 性があることが示される（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、（１９９５），loc.cit.）。 ｄｉｍ突然変異体の表現型特徴は、ｃｐｄおよびｄｅｔ２突然変異体の表現型特 徴とほぼ同一であること、および我々の前駆体供給実験がｄｉｍがＢＲ生合成に おいてチファステロールの前の欠損を引き起こすことを示唆することから、この ことは非常に興味深いことである。従って、ｈｙ座との組み合わせを含む、ｄｅ ｔ２、ｃｐｄ、およびｄｉｍ突然変異体の比較分析が、光誘導性の遺伝子の調節 がブラシノライドおよび／またはそのブラシノステロイド前駆体によりどのよう に影響を受けるのかを解明することが必要である。 ｄｅｔ２とは違って、ｄｉｍ突然変異は、チューブリンＴＵＢＩ遺伝子発現を 特異的に調節することにより細胞の伸長をコントロールするということが提唱さ れている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、（１９９５），loc．cit.）。実際に、現在 入手可能な遺伝子データでは、ｄｅｔ１およびｄｅｔ２突然変異により同定され るシグナリング経路が光シグナリングに排他的に関与していることを証明できな い（Ｍｉｌｌａｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２８（１９９４），３２５ -３４９）。従って、ＤＥＴ、ＣＯＰ、ＦＵＳ、およびＣＰＤ遺伝子も、その突 然変異が暗所において胚軸伸長の阻害を引き起こすために、細胞伸長の正の制御 因子であると考えることができる。ＢＲが、ｄｅｔ１、ｃｏｐ１およびｆｕｓ突 然変異の引き起こす細胞伸長欠損を相補できるという事実は、遺伝子モデルによ り提唱されるように（Ｃｈｏｒｙ ａｎｄ Ｓｕｓｅｄ（１９９４），loｃ．ci t.）、ｄｅｔ１とｄｅｔ２経路のあいだに密接な相互作用があることを示唆する ものである。ｃｏｐ１-１３突然変異体のＢＲ非感受性は、実際に、ＢＲ反応に おいてＣＯＰ１ ＷＤ−タンパク質（Ｄｅｎｇら、Ｃｅｌ１７１，（１９９２） ，７９１-８０１）が関与する可能性を示すものかもしれない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/02 9/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ (72)発明者 アルトマン，トーマス ドイツ連邦共和国，デー―12209 ベルリ ン，ローレンツシュトラッセ 64 (72)発明者 マチュア，ジャイディープ, シンガポール，シンガポール 118 240, サイエンス パーク ドライブ １，59 エー ザ フレミング，ラボラトリー オ ブ プラント セル バイオロジー，エヌ ユー エス，インスティテュート オブ モーレキュラー バイオロジー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼの酵素活性を有するタンパク質また はそのタンパク質の生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸分子であっ て、 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｂ）配列番号１の塩基配列のコーディング領域を含有する核酸分子、 （ｃ）配列番号３の核酸分子、 （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、 および （ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれかひとつの核酸分子に遺伝暗号の結果として縮 重する核酸分子、 からなるグループから選択される核酸分子。 ２．コードされるタンパク質がカサステロンのテアステロンへの変換に関与する ヒドロキシラーゼである、請求の範囲第１項に記載の核酸分子。 ３．ＤＮＡである、請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸分子。 ４．請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の核酸分子と特異的にハ イブリダイズする核酸プローブ。 ５．請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクタ ー。 ６．核酸分子が、原核細胞または真核細胞においてその核酸分子の発現を可能と する調節エレメントと連結している、請求の範囲第５項に記載のベクター。 ７．請求の範囲第５項または第６項に記載のベクターまたは請求の範囲第１項か ら第３項のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。 ８．細菌、真菌、植物または動物の細胞である、請求の範囲第７項に記載の宿主 細胞。 ９．請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の核酸分子によりコード されるタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメント。 １０．請求の範囲第９項に記載のタンパク質もしくはフラグメントまたはそのエ ピトープを特異的に認識する抗体。 １１．請求の範囲第７項または第８項に記載の宿主細胞を、核酸配列の発現を可 能とするような条件下で培養し、得られたタンパク質を細胞培養物より回収する 、請求の範囲第９項に記載のタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメン トの調製方法。 １２．ゲノム中に安定に組み込まれた、植物細胞において核酸分子の発現を可能 とするような調節エレメントと連結された請求の範囲第１項から第３項のいずれ か一項に記載の核酸分子を含有するトランスジェニック植物細胞。 １３．請求の範囲第１２項に記載の植物細胞を含有するトランスジェニック植物 。 １４．そのブラシノステロイド合成が改変されている請求の範囲第１３項のトラ ンスジェニック植物。 １５．以下の特徴の少なくともひとつを示す、請求の範囲第１３項または第１４ 項に記載のトランスジェニック植物。 ・病原体に対する反応の改善。 ・形態の改変。 ・細胞伸長の増大。 ・木形成の改変。 １６．ゲノム中に安定に組み込まれた請求の範囲第１項から第３項のいずれか一 項に記載の核酸分子またはその一部を含有するトランスジェニック植物であって 、前記核酸分子またはその一部の発現により、細胞中において請求の範囲第９項 に記載のタンパク質の合成の低下が引き起こされるトランスジェニック植物。 １７．アンチセンス、リボザイムおよび／またはコサプレッシヨン作用により低 下が達成される、請求の範囲第１６項に記載の植物細胞。 １８．請求の範囲第１６項または第１７項に記載の植物細胞を含有するトランス ジェニック植物。 １９．ブラシノステロイド合成の欠損を示す、請求の範囲第１８項に記載のトラ ンスジェニック植物。 ２０．以下の特徴の少なくともひとつを示す、請求項１８または１９のトランス ジェニック植物。 ・矮性。 ・暗所で発芽した種子の胚軸の伸長の低下。 ・ストレス耐性の改善。 ・雄性不妊。 ２１．請求の範囲第１２項または第１６項に記載の植物細胞を含有する培養植物 組織。 ２２．請求の範囲第１２項に記載の細胞を含有する、請求の範囲第１３項から第 １５項のいずれか一項に記載の植物の収穫可能部分。 ２３．請求の範囲第１６項または第１７項に記載の細胞を含有する、請求の範囲 第１８項から第２０項のいずれか一項に記載の植物の収穫可能部分。 ２４．請求の範囲第２項に記載の細胞を含有する、請求の範囲第１３項から第１ ５項のいずれか一項に記載の植物の繁殖材料。 ２５．請求の範囲第１６項または第１７項に記載の細胞を含有する、請求の範囲 第１８項から第２０項のいずれか一項に記載の繁殖材料。 ２６．植物におけるブラシノステロイド合成またはその調節に関与するタンパク 質をコードする核酸分子を同定する方法であって、 （ａ）暗所において発芽する実生が、胚軸の伸長をまったく示さないかほとんど 示さない、自然発生矮性変異体、変異誘発矮性変異体または遺伝子工学的に作成 された矮性変異体をスクリーニングするステップ、 （ｂ）異なるブラシノステロイドまたはブラシノステロイド様化合物を添加する ことにより、暗所における胚軸の伸長が刺激され得る、ステップ（ａ）で同定さ れた矮性変異体を同定するステップ、 （ｃ）ステップ（ｂ）で同定された矮性変異体を相補することができる遺伝子を 同定および単離するステップ、 （ｄ）単離された遺伝子およびそれによりコードされる産物の特性評価を行うス テップ を含む方法。 ２７．矮性変異体が請求の範囲第１８項から第２０項のいずれか一項に記載の植 物である、請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２８．請求の範囲第２６項または第２７項に記載の方法により得ることのできる 核酸分子。 ２９．植物においてブラシノステロイドとして作用することができる化合物を同 定する方法であって、 （ａ）ブラシノステロイド合成に欠損を示す請求の範囲第１６項に記載のトラン スジェニック植物、または請求の範囲第２６項に記載の方法のステップ（ａ）お よび（ｂ）により同定される変異体を、複数の化合物に接触させるステップ、お よび （ｂ）（ａ）で定義された植物または変異体中において、ブラシノステロイド合 成における欠損を原因とする作用を相補することのできる化合物を決定するステ ップ を含む方法。 ３０．植物においてブラシノステロイドとして作用することができる化合物を同 定する方法であって、 （ａ）ブラシノステロイド合成に欠損を示す請求の範囲第１６項に記載の植物、 または請求の範囲第２６項に記載の方法のステップ（ａ）および（ｂ）により同 定される変異体の発芽中の種子を、複数の化合物に接触させるステップ、および （ｂ）実生の胚軸および／または根の正常な成長を回復させることのできる化合 物を決定するステップ を含む方法。 ３１．ブラシノステロイドのインヒビターとして作用できる、またはブラシノス テロイドの生物学的活性を抑制することのできる化合物を同定する方法であって 、 （ａ）請求の範囲第１２項に記載の植物細胞または請求の範囲第１３項から第１ ５項に記載の植物を複数の化合物に接触させるステップ、および （ｂ）これらの細胞または植物においてブラシノステロイド合成が変化したこと による作用を弱める化合物を決定するステップ を含む方法。 ３２．ブラシノステロイドのインヒビターとして作用できる、またはブラシノス テロイドの生物学的活性を抑制することのできる化合物を同定する方法で、 （ａ）ブラシノステロイド合成における欠損のために暗所において発芽すると きの胚軸の伸長が低下した、請求の範囲第１６項に記載の植物または請求の範囲 第２６項に記載の方法の(ａ）および（ｂ）のステップにより同定される変異体 の発芽実生と、胚軸の正常な伸長を回復させることのできるブラシノステロイド および同時に複数の化合物を接触させるステップ、および （ｂ）ブラシノステロイドと競合して胚軸の正常な伸長を回復させる化合物を決 定するステップ を含む方法。