JP2000506277A - 被検体を測定する方法および検査ストリップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、担体材料の一端において塗布ゾーンを形成し、他端において吸引ゾーンを形成する、該担体材料上で液体を輸送するように互いに接触している１つ以上の吸収剤マトリクスと、可視的に検出可能な粒子標識化被検体結合パートナーを含み該塗布ゾーン内に配置または該塗布ゾーンに隣接するコンジュゲートゾーンと、該コンジュゲートゾーンに隣接するクロマトグラフゾーンと、被検体または非標識化被検体特異的結合パートナーを結合する固相結合パートナーを含み該クロマトグラフゾーンと吸引ゾーンとの間にある捕捉ゾーンとを含むクロマトグラフ検査ストリップ上で、被検体溶液を該塗布ゾーンに塗布し、該被検体の判定尺度として該捕捉ゾーンにおける結合標識を測定することによって被検体を免疫学的に測定する方法であって、該被検体溶液中でクロマトグラフィー的に移動可能で該捕捉ゾーンを通る蛍光染料を、該塗布ゾーンか、または該塗布ゾーンと該捕捉ゾーンとの間のマトリクスに適用し、該捕捉ゾーンの領域に配置された該蛍光染料を同時励起する間に該捕捉ゾーン内の直接標識化結合パートナーの存在を可視的に測定することを特徴とする方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 被検体を測定する方法および検査ストリップ 本発明は、粒子標識化結合パートナーを用いたクロマトグラフ検査ストリップ する検査ストリップに関する。 長い間、クロマトグラフ分析要素もしくは検査ストリップはまた、被検体を検 出するために被検体特異的結合パートナーの助けを借りて大幅に使用されてきた 。これらの検査要素は、被検体溶液のクロマトグラフィー移動によりいわゆる結 合/遊離分離(“bound/free”Trennung)が迅速に生じ得るために特にイムノアッ セイにおいてよく使用されてきた。この目的では、標識化結合パートナーは、捕 捉試薬を通る際に被検体の量に応じた量だけ直接または間接的に結合するため、 これを利用して測定できる。このような検査ストリップおよび測定方法はその他 にも欧州特許出願公開第0 186 799号、同第0 291 194号、同第0 323 605号、お よび同第0 250 137号明細書に記載されている。 近年、検出のためにいわゆる直接標識化結合パートナーの使用が増加しており 、これは直接標識化結合パートナーの標識が、酵素標識化結合パートナーとは対 照的に、酵素基質を加えることなく直接測定され得るためである。この場合、肉 眼で見ることのできる標識、特に染色ラテックス、着色ゾル、および金属ゾル( 特に金)等の粒子不溶性標識が有利となる。クロマトグラフィーイムノアッセイ において、これらの直接標識は、被検体が存在すると捕捉ゾーンの固定化結合パ ートナーによって固定され、被検体の有無についての判定尺度として可視的に測 定される。より高濃度の直接標識化結合パートナーを得るために、これらの捕捉 試薬は、好ましくは小さいスペースに線状に収容される。被検体が存在する場合 には、線状捕捉ゾーンにおいて肉眼で観察できる着色線が形成される。 ヒトの視覚では、特に被検体が少量の場合、捕捉ゾーンにおいて線が形成され たか否かの区別が困難であることがわかっている。特に、照明条件が悪いと、捕 捉ゾーンにおける着色が認知されないために、偽陰性の結果が判定される。 従って、本発明の目的は、可視的に検出可能な粒子標識化結合パートナーを用 いて、特に不十分な照明条件下および/または低濃度の被検体でも、クロマトグ ラフ検査要素上での確実な可視的な読み取りを可能にする方法および分析要素を 提供することである。一方、上記方法は、通常の日光の下にあっても読み取りに 不都合に影響を与えたり、読み取りを妨害したりするものであってはならない。 上記目的は、請求の範囲に記載する本発明により達成される。 本発明は、担体材料の一端において塗布ゾーンを形成し、他端において吸引ゾ ーンを形成する、該担体材料上で液体を輸送するように互いに接触している１つ 以上の吸収剤マトリクスと、可視的に検出可能な粒子標識化被検体結合パートナ ーを含み該塗布ゾーン内に配置または該塗布ゾーンに隣接するコンジュゲートゾ ーンと、該コンジュゲートゾーンに隣接するクロマトグラフゾーンと、被検体ま たは非標識化被検体特異的結合パートナーを結合する固相結合パートナーを含み 該クロマトグラフゾーンと吸引ゾーンとの間にある捕捉ゾーンとを含むクロマト グラフ検査ストリップ上で、被検体溶液を該塗布ゾーンに塗布し、該被検体の判 定尺度として該捕捉ゾーンにおける結合標識を測定することによって被検体を免 疫学的に測定する方法であって、該被検体溶液中でクロマトグラフィー的に(chr omatographisch)移動可能で該捕捉ゾーンを通る蛍光染料を、該塗布ゾーンか、 または該塗布ゾーンと該捕捉ゾーンとの間のマトリクスに適用すること、並びに 、該捕捉ゾーンの領域に配置された該蛍光染料を同時刺激(gleichzeitiger Anre gung)する間に形成されるコントラストをもとに該捕捉ゾーン内の直接標識化結 合パートナーの存在を可視的に測定することを特徴とする、上記方法に関する。 本発明の更なる主題は、担体材料の一端において塗布ゾーンを形成し、他端に おいて吸引ゾーンを形成する、該担体材料上で液体を輸送するように互いに接触 している１つ以上の吸収剤マトリクスと、可視的に検出可能な粒子標識化被検体 結合パートナーを含み該塗布ゾーン内に配置または該塗布ゾーンに隣接するコン ジュゲートゾーンと、該コンジュゲートゾーンに隣接するクロマトグラフゾーン と、被検体または非標識化被検体特異的結合パートナーを結合する固相結合パー トナーを含み該クロマトグラフゾーンと吸引ゾーンとの間にある捕捉ゾーンとを 含むクロマトグラフ検査ストリップであって、該被検体溶液中でクロマトグラフ ィー的に移動可能な蛍光染料を、該塗布ゾーンか、または該塗布ゾーンと該捕捉 ゾーンとの間のマトリクスに適用することを特徴とする、クロマトグラフ検査ス トリップである。 検査ストリップは、担体材料上で本質的に互いに隣接して配置され且つ種々の ゾーンを形成する１つ以上の吸収剤マトリクスを含む。１つのゾーンにおいて、 同じまたは異なる材料からなる複数のマトリクスが存在することも有り得る。塗 布ゾーンおよびコンジュゲートゾーンに関しては、互いに前後に配置され、１つ のまたは異なるマトリクス材料からなり得る。しかし、塗布ゾーンおよびコンジ ュゲートゾーンは同一であってもよいし、１つのマトリクスまたは互いに上下に 配置された複数のマトリクスからなってもよい。 マトリクスは、毛管作用、および吸収性を有し、好ましくは繊維状または非繊 維状であり得る多孔質材料である。 適切な担体材料は、ガラス、金属またはプラスチックの層あるいはストリップ である。ポリスチレン等のプラスチック薄片からなるストリップが特に好ましい ことがわかっている。 マトリクスは、両面粘着テープを用いて担体材料に接着し得る。しかし、好ま しくはホットメルト接着剤が使用される。 マトリクスは、液体輸送路を形成し、試料塗布ゾーンの１つ以上のマトリクス に塗布された液体が毛管力によってコンジュゲートゾーン、クロマトグラフゾー ンおよび捕捉ゾーンを経て吸引ゾーンに到達するように担体材料上に配置される 。このため、種々のマトリクスが互いに液体接触している必要がある。これは、 マトリクスの端部同士が接触していれば達成される。ただし、マトリクスが部分 的 に重なっている方がより有利である。 特に低濃度の被検体の検出に充分な量の液体を、捕捉ゾーンを通るように輸送 するために、捕捉ゾーンに隣接するクロマトグラフィー材料が、捕捉ゾーンを通 る液体を可能な限り大量に吸引することが有利であることがわかった。この材料 (吸引ゾーン)が、被検体液体のほとんどまたは好ましくはその全体が捕捉ゾーン を通り得る量の液体を吸引し得る場合に特に有利である。 特に、低濃度の被検体を検出するために、結合物質が検査担体中に使用される が、これらは特異的結合対成分である。特異的結合対は、例えば、レクチンと対 応するサッカライド、ＤＮＡまたはＲＮＡと対応する相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ 、あるいは抗原とそれらと結合する抗体または抗体フラグメントである。ビオチ ンまたはストレプトアビジンもまた特異的結合対である。本発明においては、抗 原の検出のために抗体または抗体フラグメントを使用することを特に前提として いる。しかし、当業者であれば、これらの実施態様を他の特異的結合対に容易に 適用し得る。 移動可能な粒子標識化被検体特異的結合パートナー(コンジュゲート)を、試料 塗布ゾーン内に配置または隣接され得るコンジュゲートゾーンに含浸させる。本 発明において、この標識は通常の光の下で肉眼で可視的に検出できる。標識とし ての粒子は、好ましくは１〜100nmの大きさの不溶性粒子とされる。特に好まし いのは、着色ラテックス、着色リポソーム、セレン、テルル、カーボンブラック 、着色ゾル、金属ゾル(特に金が好ましい)である。 標識化被検体特異的結合パートナーの量は、好ましくは、被検体の予想量を超 えるものである。 吸収剤およびとりわけ多孔質プラスチック層または膜がコンジュゲート材料と して適していることがわかった(例えば、紙、毛織物(Vliese)、多孔質プラスチ ック層、または膜等)。大量のガラス繊維、あるいは/ならびに例えばポリエステ ル繊維および/または合成羊毛等の合成繊維を含む繊維マトリクスが特に適切で あることがわかった。欧州特許出願公開第0 326 135号明細書に記載の毛織物が 特に好ましい。２つ以上のマトリクスが試料塗布ゾーンに存在する場合には、そ れらが本質的に互いの上下に位置することが好ましい。 捕捉試薬を捕捉ゾーンに固定化する。これは、一方で、被検体特異的結合パー トナーとなり得る。しかし、これはまた、検査ストリップの塗布ゾーンに適用さ れるかまたは塗布ゾーンと捕捉ゾーンとの間に適用される移動可能な可溶性非標 識化被検体結合パートナーの結合試薬でもあり得る。捕捉試薬は、適用される自 由に移動可能なビオチン化被検体結合パートナーをストレプトアビジンゾーン通 過時に結合し得るストレプトアビジンである場合に好ましいことがわかった。 捕捉試薬は、例えば共有結合的に固定化する(例えば、欧州特許出願公開第0 3 74 778号明細書を参照のこと)等の当業者に公知の方法で固定化され得る。硝酸 セルロースまたはニトロセルロースエステルもまた、非常に多くの物質（例えば 、タンパク質または核酸)がこれらに吸収性をもって強力に結合して固定化のた めに化学的結合を必要としないため、捕捉ゾーンのマトリクスとして適している ことがわかった。 捕捉ゾーンに捕捉される標識化結合パートナーの可能な限り高い着色濃度を得 るために、クロマトグラフィーの方向に関して可能な限り小さい面積に捕捉試薬 を高い濃度で適用することが特に有利となる。従って、捕捉ゾーン中の捕捉試薬 を、検査ストリップの長手方向に対して垂直な細い線または帯として固定化する ことが好ましい。 数10分の１mmから数mmの幅、好ましくは0.5〜１mm幅の線が、約10^-12mol/lの 濃度の被検体の検出に極めて適していることがわかった。捕捉試薬は、カニュー レ、インクジェット、またはエアブラシによって線状に適用され得る。 これに関連して、捕捉試薬の量は、少なくとも１μg/cm²、特に好ましくは最 高40μg/cm²であることが有利である。 本発明によれば、被検体を試料塗布ゾーンに塗布する際またはその前に、蛍光 染料を塗布ゾーンかまたは塗布ゾーンと捕捉ゾーンとの間に可溶形態で含浸させ る。この蛍光染料は、外部光源によって(例えば、紫外線灯の下で)容易に励起で き、好ましくは可視レンジで発光するものである。さらに、蛍光染料は、検査ス トリップ上で被検体溶液と共にクロマトグラフする必要がある。蛍光染料を被検 体溶液と共に塗布しない場合には、被検体溶液のクロマトグラフィーの終了後に 蛍光染料が少なくとも捕捉ゾーンの前後の領域を覆うように、蛍光染料をクロマ トグラフィーの方向に対して垂直の大きい面積にわたって適用することが有利で ある。蛍光染料が面的に適用される塗布ゾーンと捕捉ゾーンとの間の部位は、蛍 光染料が被検体液体中で同時にクロマトグラフし、クロマトグラフィーの終了後 に蛍光染料が捕捉ゾーンの両端に位置するように選択される。当業者であれば、 過度の労力を有することなく、選択された蛍光染料の可溶性およびクロマトグラ フィー特性に応じて、捕捉ゾーンの手前にある検査ストリップマトリクスの１つ に含浸部位および含浸領域を確立することができる。 特に適切な蛍光染料は、AMF(アミノメチルフルオレセイン)、5(6)-カルボキシ フルオレセイン-N-ヒドロキシ-コハク酸イミドエステル(Fluos)、アクリジンオ レンジ、テキサスレッド、ローダミン、またはレゾルフィン(Resorufin)である 。 蛍光染料は、日光の下では無色または比較的薄い色、あるいは随意に直接標識 の色とは異なる配色にする。直接標識化コンジュゲートとは対照的に、蛍光染料 はこの時点では免疫結合パートナーに結合していない。さらに、蛍光染料は免疫 反応に影響を及ぼしてはならない。 実施のためには、イムノアッセイ試料液体を試料塗布ゾーンに塗布する。試料 液体は蛍光染料と混合され得る。しかし、好ましくは試料液体の塗布前に蛍光染 料を検査ストリップ上に含浸させる。 サンドイッチイムノアッセイにおいて、捕捉ゾーンに向かう被検体溶液のクロ マトグラフィーの間、被検体は標識化被検体結合パートナーと、および第二の非 標識化被検体結合パートナーとサンドイッチ複合体を形成する。これは、捕捉ゾ ーンにおいて固定化、または、捕捉ゾーンの捕捉試薬に対する特異的結合部位が あれば塗布ゾーンと捕捉ゾーンとの間に可溶性方式で含浸させる。被検体が結合 していない標識化結合パートナーは捕捉ゾーンを通過し、被検体が結合した標識 化結合パートナーは捕捉ゾーンに結合し、それらの色により被検体の有無が示さ れる。 本発明によれば、被検体溶液に溶解した蛍光染料は、少なくとも蛍光染料の一 部(しかし、蛍光染料全部ではない)が捕捉ゾーンを通るまで被検体溶液と共にク ロマトグラフするので、クロマトグラフィー終了後には捕捉ゾーンの両側を覆う 。 捕捉ゾーンを、適切な蛍光励起波長の光(例えば、紫外線光)で照射した場合、 意外なことに、被検体が存在する場合には、捕捉ゾーンに結合した非蛍光粒子標 識が、蛍光染料によって形成された蛍光背景に対して、例えば黒線として、非常 に際立って現れた。これにより被検体が少量の場合に、この蛍光コントラスト増 幅がない場合よりも、蛍光灯を用いて検査ストリップを単純に照らすだけで、特 に不十分な照明条件下においてもかなり少量の固相結合標識の有無が肉眼で検出 できるようになる。 一方で、意外なことに、被検体が存在しない場合には、偽陽性の結果を導き得 る、捕捉ゾーンと捕捉ゾーンの前後に接している蛍光背景との間のコントラスト 差は全く生じなかった。被検体が存在しない場合には、固相結合された非標識化 結合パートナーを含む捕捉ゾーンおよびその前後の領域は、共に蛍光灯下におい て均一な蛍光性を有していた。 本発明によるコントラスト増幅の更なる利点は、捕捉ゾーンが通常光の下で視 覚的に検出される場合においても蛍光染料が全く妨害しないことである。従って 、本発明による分析方法は、蛍光励起を伴わない従来技術(例えば、紫外線灯が ない場合等)でも質を落とすことなく、または蛍光励起によるコントラスト増幅 を伴う本発明でも随意に実施され得る。 本発明による方法は、10^-10〜10^-12mol/lの桁の非常に低濃度の被検体の存在 を検出することを可能にする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．担体材料の一端において塗布ゾーンを形成し、他端において吸引ゾーンを形 成する、該担体材料上で液体を輸送するように互いに接触している１つ以上の吸 収剤マトリクスと、 可視的に検出可能な粒子標識化被検体結合パートナーを含み該塗布ゾーン内に配 置または該塗布ゾーンに隣接するコンジュゲートゾーンと、 該コンジュゲートゾーンに隣接するクロマトグラフゾーンと、 被検体または非標識化被検体特異的結合パートナーを結合する固相結合パートナ ーを含み該クロマトグラフゾーンと吸引ゾーンとの間にある捕捉ゾーンと を含むクロマトグラフ検査ストリップ上で、被検体溶液を該塗布ゾーンに塗布し 、該被検体の判定尺度として該捕捉ゾーンにおける結合標識を測定することによ って被検体を免疫学的に測定する方法であって、 該被検体溶液中でクロマトグラフィー的に移動可能で該捕捉ゾーンを通る蛍光 染料を、該塗布ゾーンか、または該塗布ゾーンと該捕捉ゾーンとの間のマトリク スに適用すること、ならびに 該捕捉ゾーンの領域に配置された該蛍光染料を同時励起する間に該捕捉ゾーン 内の直接標識化結合パートナーの存在を可視的に測定することを特徴とする、前 記方法。 ２．固相結合された結合パートナーに対する結合部位を有する移動可能な非標識 化被検体特異的結合パートナーが、前記塗布ゾーン内、または該塗布ゾーンと前 記捕捉ゾーンとの間に適用される、請求項１に記載の方法。 ３．前記捕捉ゾーンが線状である、請求項１または２に記載の方法。 ４．前記標識が金属標識である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。 ５．前記標識が金である、請求項４に記載の方法。 ６．前記捕捉ゾーンにおいてストレプトアビジンが固定化される、請求項１から ５のいずれか１項に記載の方法。 ７．前記蛍光染料を前記塗布ゾーンに含浸させる、請求項１から６のいずれか１ 項に記載の方法。 ８．前記蛍光染料を前記コンジュゲートゾーンに含浸させる、請求項１から６の いずれか１項に記載の方法。 ９．前記吸引ゾーンが、標識化コンジュゲートの全体が前記捕捉ゾーンを通り得 るような量の液体を吸引する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 10．担体材料の一端において塗布ゾーンを形成し、他端において吸引ゾーンを形 成する、該担体材料上で液体を輸送するように互いに接触している１つ以上の吸 収剤マトリクスと、 可視的に検出可能な粒子標識化被検体結合パートナーを含み該塗布ゾーン内に配 置または該塗布ゾーンに隣接するコンジュゲートゾーンと、 該コンジュゲートゾーンに隣接するクロマトグラフゾーンと、 被検体または非標識化被検体特異的結合パートナーを結合する固相結合パートナ ーを含み該クロマトグラフゾーンと吸引ゾーンとの間にある捕捉ゾーンと を含むクロマトグラフ検査ストリップであって、 該被検体溶液中でクロマトグラフィー的に移動可能な蛍光染料を、該塗布ゾー ンか、または該塗布ゾーンと該捕捉ゾーンとの間のマトリクスに適用することを 特徴とする、前記検査ストリップ。 11．固相結合された結合パートナーに対する結合部位を有する移動可能な非標識 化被検体特異的結合パートナーを、前記塗布ゾーン内か、または該塗布ゾーンと 前記捕捉ゾーンとの間に位置させる、請求項10に記載の検査ストリップ。 12．前記捕捉ゾーンが線状である、請求項10または11に記載の検査ストリップ。 13．前記標識が金属ゾルである、請求項10から12のいずれか１項に記載の検査ス トリップ。 14．前記標識が金である、請求項10から13のいずれか１項に記載の検査ストリッ プ。 15．前記捕捉ゾーンにおいてストレプトアビジンが固定化される、請求項10か ら14のいずれか１項に記載の検査ストリップ。 16．前記蛍光染料を前記塗布ゾーンに含浸させる、請求項10から15のいずれか１ 項に記載の検査ストリップ。 17．前記蛍光染料を前記コンジュゲートゾーンに含浸させる、請求項10から15の いずれか１項に記載の検査ストリップ。 18．前記蛍光染料がアミノフェニルフルオレセインである、請求項10から17のい ずれか１項に記載の検査ストリップ。