JP2000502450A - 蛍光偏光免疫アッセイによる診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 蛍光偏光免疫アッセイ（FPIA）法は流体容器に１またはそれ以上の種類の試薬ならびに検出および測定されるべき分析対象物を含むサンプルを添加し、それからサンプルの最初の偏光測定を行う。その後、これ以上のサンプルを容器に加えることなく、さらに試薬か容器中のサンプルに添加される。次いで、サンプルの２回目あるいは最後の偏光測定が行われ、そしてサンプル中の分析対象物の濃度が２回の偏光測定の値に基づき計算されるのである。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光偏光免疫アッセイによる診断法 産業上の利用分野 本発明は免疫アッセイ法、より特定的には測定する分析対象物を含有するサンプ ルを一回だけ流体容器に添加すればよい蛍光偏光免疫アッセイ法（fluorescence polarization immunoassay）に関連するものである。発明の背景 蛍光偏光免疫アッセイ法（FPIA）は液体サンプル中の分析対象物の存在を分析 する一般的な方法である。米国特許第5,391,740、4,939,264、4,585,862 および 4,492,762 号明細書（これら特許の関連する部分は参照により本明細書に組み 入れられているものとする）その他に記述されているように、この技術は一般に 蛍光物質と、目的とする分析対象物の濃度に依存した量で分析対象物に蛍光物質 を結合させる結合剤物質との混和液の希釈されたサンプルの偏光特性の測定から 成り立っている。 従来、ある種の内因性物質（例、ビリルビン）はその固有の 偏光特性を有するがゆえに FPIA の測定を妨害すると思われてきた。この妨害を 取り除く簡便な方法は「ブランク」の偏光特性を測定することである。すなわち 、サンプル、試薬および希釈液の、ただし蛍光物質は含まない混和液の状態で、 試薬（蛍光物質と結合物質を含む）とのインキュベーション後測定するサンプル の混和液の希釈度と等しいサンプル希釈度で偏光特性を測定する。「ブランク」 の偏光特性を実際のサンプルの偏光特性から引くと、サンプル中の他の構成成分 による妨害がない分析対象物／蛍光物質の偏光レベルが得られる（Jolley etal. ，Clin．Chem.，27(7):1189-1197，1981)。 ブランクの測定は手動の小さな免疫アッセイシステムで簡単に実施できる。一 つの方法は二つのキュベット中で二つの分析を行うものであり、その違いは一方 の分析がブランクであって、試薬混合物中に蛍光物質を含まないことである。二 つ目の方法は二つの分析を連続的に行うものである。サンプルと試薬（蛍光物質 は含まない）をキュベット中で混ぜ、ブランクの偏光特性を測定する。次いで追 加の試薬と共に追加のサンプルをキュベットに入れ（ブランク測定時と同じサン プルの希釈度に保つ）、インキュベーションに続いて最後の偏光特性を測定する 。 この二つの方法では、現在のあらゆる FPIA 分析システムと同じく、サンプルの 希釈度はブランク測定時と最後の偏光特性測定時において等しい。 ブランクの偏光特性を測定するこれらの方法は、米国特許第5,358,691 号明細 書（引用により本明細書に含まれているものとする）に記載されているデバイス と類似のデバイスで実施する場合のように高容量の自動化された免疫アッセイシ ステムで行う場合何かと問題が起こりうる。最初の方法では測定には二つの分析 キュベットを要する。従って、流れに組み込んだ(assembly-line)やり方でキュ ベットを処理するシステムの場合ブランクの測定毎に一つのキュベットを使用す るためシステムの処理能力が50％減退することになる。第二の方法では必要なキ ュベットは一つだけであるが、別途に２回サンプルをキュベットに入れる必要が ある。この場合も、流れに組み入れたやり方で作動する自動化システムのときは 、システムのデザインと制作が極めて複雑になる。ブランクの偏光特性の測定を しなければならないためサンプルの二度目の添加は必然的に最初の添加よりも後 に行われる。流れに組み込んだ機械の場合この時間的な差は二度目のサンプルを 異なる場所で入れなければなら ないことを意味し、従ってサンプルは二個所の別の場所にある分析用キュベット 中に輸送するか、輸送管で運ばなければならない。こうしてサンプルを二回別々 に入れなければならないとなると測定機器が複雑になりコストが上昇し、サンプ ルの漏出や機器の汚染の危険性が増大する。このことから、分析過程において一 度のサンプルの添加のみでよい FPIA 分析試験を実施する方法は非常に大きな有 用性があるのである。発明の概要 本発明は単一の流体容器を用いて一回のみのサンプル添加で蛍光偏光免疫アッ セイ（FPIA）を実施する方法に関する。本明細書で使用する「単一の流体容器」 とは、偏光測定に先立ちサンプルと希釈液および試薬等を混ぜる容器をいう。 特に、蛍光偏光免疫アッセイ（FPIA）を実施する方法は、一回より多く、望ま しくは二回の蛍光偏光測定を行うものであり、そして単一の流体容器を用い、サ ンプル添加は一回のみである。 本発明の好ましい実施態様は、分析対象物の検出および／または濃度測定のた めに蛍光偏光免疫アッセイ（FPIA）を実施する方法であり、この方法は a)一種類以上の試薬と分析すべきサンプルとを流体容器に添加 し b)該サンプルの最初の偏光測定を行い、 c)該容器にさらにサンプルを添加することなく、該容器中の該サンプルにさらに 試薬を添加し、 d)二回目または最終の偏光測定を行い、 e)該サンプル中の分析対象物の濃度を該二回の偏光測定の値に基づき計算する という手順を含んでいる。 本発明によると分析対象物を含む該サンプルは手順 a)において一種類以上の 試薬と共に流体容器に添加される。 手順 b)における最初の偏光測定に先立ち、ある量のサンプルと試薬を当業界に おいて公知の手段、好ましくは吸引により取り出し、この量を最初の偏光測定に 利用することが多い。この時取り出す量はサンプルの混合物の容量の約二分の一 程度であることが特に望ましい。 手順 c)においてさらに試薬を添加する際には、得られるサンプルの希釈度が 手順 a)の後のサンプルの希釈度に対してある比率Ｘ（Ｘ倍）になるようにする 。Ｘの値は約二分の一に等しいことが望ましいが、どのような既知の測定可能な 希釈度の比 率でも利用可能であり、かつ当業者により使用されうる。ここで「希釈度」とは 、目的とする分析対象物を含むサンプルの希釈度のことであり、探知・測定され るべき未確認物である分析対象物そのものの濃度を指しているのではない。 希釈度の所望の比率Ｘがいったん決定されると手順 c)において二度目の FPIA の測定前に流体容器に加えるべき試薬の量を決定することが可能になる。加え るべき試薬の量は後述の式およびその変数を用いて決定することが出来る。特に 好ましい態様の場合、加えられる試薬の量は手順 b)の測定のために流体容器か ら取り出した量にほぼ等しい。ここでも、手順 c)の後のサンプルの希釈度は手 順 a)の後のサンプルの希釈度に対してある比率Ｘ、好ましくは約二分の一とす るべきである。必要ならば、手順 c）において試薬と共に追加の希釈液を加える ことができ、その際には、淵加する希釈液と試薬の総量が所望の希釈度の比率を 達成できるようなものとすることができる。ここでも注目するべきことは、手順 c)において追加的に試薬あるいは希釈液が添加されるといっても、流体容器に サンプルを追加することはないということである。言い換えれば、サンプルは流 体容器にただ一度のみ加える必要があるだけであり、これ は手順 a)の測定の開始前に行われる。 分析対象物の濃度は一回目と二回目の偏光測定値の差から計算されることが最 も多く、その測定値のうちの少なくとも一つは手順 a)の後と手順 c)の後のサン プルの希釈度の違いを補償（補正）するために希釈度比率Ｘに従って調整される 。手順 e)において分析対象物の濃度は一回目と二回目の偏光測定の差から決定 するのが好ましく、最初の偏光測定値は上記の比率Ｘの値をその測定値に乗じる ことによって補正される。図面の簡単な説明 図１は自動免疫アッセイシステムの分析用キュベットと測定装置の概略図であ る。 図２は本発明の方法の一つに従ってアミカシン（Amikacin）の濃度を測定した 結果を従来の FPIA 測定と比較して示す FPIAのグラフである。 図３は本発明の方法の一つに従ってT4の濃度を測定した結果を従来の FPIA 測 定と比較して示す FPIA のグラフである。 図４は本発明の方法の一つに従ってカンナビノイドの濃度を測定した結果を従 来の FPIA 測定と比較して示す FPIA のグラフである。 図５は本発明の方法の一つに従って遊離エストリオールの濃度を測定した結果 を従来の FPIA 測定と比較して示す FPIA のグラフである。好ましい態様の詳細な説明 広い意味で本発明は分析試験を実施する方法に関連する。さらに特定すると、 蛍光偏光免疫アッセイを実施する方法に関する。特に本発明は、基準偏光値と第 二の偏光値を測定して、これらの値から体液中の分析対象物の濃度を決定する方 法に関する。特に本方法の優位であるところは、必要とするのはただ一個の流体 容器すなわちキュベットであり、体液サンプルも一回だけそのキュベットに移せ ばよい点である。本発明の方法では二回目のサンプル添加が必要ないのでスルー プットと効率が上昇する。様々な実施態様による本方法は IMx（登録商標）と T Dx（登録商標）の自動免疫アッセイ装置（Abbott Labs，AbbOttPark，IL）にお いて適切に実施可能であるが、さらに高容量の自動免疫アッセイシステムでも極 めてよく適応させられるはずである。 既に述べたように、分析対象物の検出および濃度測定を行うために蛍光偏光免 疫アッセイ（FPIA）を実施する方法は以下の 手順で行う。 a)一種類以上の試薬と分析するサンプルを流体容器にいれる。 b)該サンプルの最初の偏光測定を行う。 c)該容器中の該サンプルにさらに試薬を添加するが、該容器にはさらなるサンプ ルの添加は行わない。 d)二回目または最終の偏光測定を行う。 e)該サンプルの分析対象物の濃度を該二回の偏光測定の値に基づき計算する。 図１について述べると、本発明による分析試験の実施方法を実行するために用 い得る装置の基本的構造が図示されている。分析装置 10 は流体容器 12 を有し 、分析しようとするサンプル14 はその中に入れる。この流体容器は当業者に公 知で測定に用いられているいかなるものでもよく、例えば分析用キュベットがこ れにあたる。流体分注装置 16 は希釈液や分析用試薬などの各種液体を流体容器 12 に分注することが可能である。流体吸引装置 18 は流体容器 12 から流体を 除去し、測定用チャンバー 20にこれを運んでいくことが可能である。偏光検出 装置22は測定用チャンバー 20の近傍に配置されている。 本発明の実施態様である一般的分析の方法は例えば前記の 様々な米国特許明細書等において言及されているように当業者に公知の蛍光偏光 免疫アッセイの技術を用いる。これらの文献に記述されているものに類似する試 薬と希釈液、および他の当業界において入手可能なものは以下に述べる本発明の 実施の態様において用い得る。 本発明の方法の一つの実施様態は図１に示された装置の操作に関連して記述され る。この方法の手順 a)では、血液、血清、血漿、または尿などのような体液の サンプル 14 を流体容器 12 に入れる。サンプル 14 の体積すなわち容量はＶｓ として示す。流体容器 12 に流体を分注する流体分注装置 16 によりある量の最 初の試薬混合液を流体容器12に分注し、サンプル 14 と混ぜる。流体分注装置 1 6 から分注される体積はＶ₁とする。最初の試薬混合液は前処理試薬、抗血清、 希釈液の混合液を含み、これらは当業者に公知であり広く入手可能なものであり 、確認および測定されるべき分析対象物に依存することが多い。この時点におけ るサンプルの希釈度はサンプル体積をＶｓ総体積のＶｓ＋Ｖ₁で割った値として 定義され、これをＤ₁とする： 手順 b)では流体吸引装置 18 が好ましくは吸引によりサンプルと試薬の混合 液を一定量取り、これを読取り（測定）用チャンバー 20 に運んでいく。この時 吸引された混合液の体積をＶ_Aとする。偏光検出装置 22 が読取り用チャンバー 20の中にある混合液の偏光特性を読取る。これは通常垂直基準偏光（Ｖ_blank） と水平基準偏光（Ｈ_blank）から成り立つ。垂直基準偏光Ｖ_blankは垂直に偏光し た光により励起した後に垂直偏光をもって放出される蛍光である。水平基準偏光 Ｈ_blankは水平に偏光した光により励起した後に垂直偏光をもって放出される蛍 光である。次いで読取り用チャンバー 20 を空にし洗浄する。あるいは、流体を 吸引しないでＶ_Aをゼロとして流体容器 12 中で基準偏光の測定を行ってもよい 。どちらの場合もこの時点でサンプルの希釈度はＤ₁に等しく、流体容器 12 の 中に残っているサンプルの体積はＤ₁（Ｖ_S＋Ｖ₁−Ｖ_A）に等しい。 手順 c)では、流体分注装置 16 により二回目の試薬混合液を流体容器 12 に 一定量分注し、残留しているサンプル 14 および一回目の試薬混台液と混ぜる。 二回目の試薬混合物は、目的とする分析対象物に結合する蛍光物質と、目的とす る分析対象物に競合的に結合する抗体のような結合性物質を含む。流体容器 12 に分注された２回目の試薬混合物の体積はＶ₂とするが、これは、二回目の試 薬混合物を分注した後のサンプルの希釈度（Ｄ₂、これは吸引後に流体容器 12 中に残留しているサンプルの体積を二回目の試薬添加後の流体の総体積で割った 値と定義される）が、最初の試薬混合物分注後の混合液中のサンプルの希釈度に 対してある特定の比率Ｘ（例：1/2、1/3、1/4 など）となるように選択される。 ゆえに 従って、望ましいＸの値にするため、すなわち２回目の試薬添加後の希釈度を最 初の試薬添加後の希釈度で割った比を所望の値にするためには、体積Ｖ₂は に等しくしなけらばならない。 例として、希釈度を最初の希釈度の 1/2 (Ｘ＝1/2）にするた めには、Ｖ₂の値は となる。 本発明の特に好ましい具体例で、吸引される体積はサンプルと最初の試薬との 体積の和の半分に等しく、 従って二回目に分注される体積Ｖ₂はＶ_Aに等しい。 別の実施態様では、二回目の試薬添加後のサンプルの希釈度は一回目の試薬添 加後のサンプルの希釈度の 2/3 である（Ｘ＝2/3）。この状態に達するために、 Ｖ₂の値すなわち手順 c)で添加される試薬の量は この二つ目の場合では、もし吸引の体積が式（5）に示されるように最初の試薬 体積とサンプル体積の和の半分に等しければ、二回目の分注体積はＶ_Aの 1/2 に 等しい。当業者はＶ₂の他の式も所望の希釈度またはＸの値を決定することによ り簡単に確認することができる。 手順 d)では一定時間インキュベーシヨンした後、吸引装置 18 によりある体積の混合液を抜き出し、これを読取チャンバー 20に移動させる。 偏光検出装置 22は 読取りチャンバー 20 の中の混合液の偏光特性を読取る。こ れは通常垂直偏光（Ｖ_final）水平偏光(Ｈ_final）ら成る。基準偏光と同様に、 垂直偏光Ｖ_blantは垂直方向に偏光した光による励起後に垂直偏光をもって放出 される蛍光であり、水平偏光Ｈ_finalは水平方向に偏光した光による励起後に垂 直偏光をもって放出される蛍光である。 その代わりに、手順 b)と同様にサンプル混合物の最終偏光特性は流体の吸引除 去を行うことなく流体容器内で測定してもよい。 手順 e)では、当分析におけるサンプルの全体的偏光特性を目的とする分析対 象物の濃度の再現性のある関数として、任意の単位（ｍＰ）で計算する。偏光は 一回目のサンプルの希釈度に対する二回目のサンプルの希釈度の比に等しい割合 （比率）によって値を調整した後計算される。２回目のサンプルの希釈度が最初 のサンプルの希釈度の 1/2 である場合（Ｘ＝1/2）。 一回目と二回目のサンプルの間の希釈度が 2/3、すなわちＸ＝2/3 である場合 、この値を上記の式中の 1/2 と置き換える。すでに言及したように、上記の計 算は当業者が利用しようとする希釈度の比により変化する。 分析試験によってはその実施の際に、サンプル 14 を試薬添加の前にあらかじ め希釈しておくことが望ましいものもある。この場合、サンプル 14 は、流体容 器 12の中に希釈液を分注し、その中でサンプルと混ぜ、かつ希釈することによ ってあらかじめ希釈することができる。希釈液は量的にはサンプルの体積の約 1 0 から 1000 倍を加えることができるが、望ましくは約 15 から 300 倍、特に 望ましいのは約 20 から 250 倍量である。次いでこのようにあらかじめ希釈し たサンプルの一部を容器から取り去り、廃棄する。流体容器 12 に残っている予 備希釈されたサンプルの体積がＶ_sと考えられ、試薬添加により得られる希釈度 は上記に述べたように計算し、管理する。当業者はさらに、最初の偏光測定も、 流体容器からサンプルを抜き出すことなくその中で行うことができることがわか るだろう。この場合、下に説明する計算は最初の偏光測定の前に流体容器からサ ンプルが除かれていないという事実を反映するように調整される。 本発明の方法は特に大容量免疫アッセイ測定システムに適合されうると考えら れる。また本発明の範囲内で、本明細書に記載した分析方法は、流体容器の中に 一回のみサンプルを添加することが特に望まれる分析対象物のすべての検出・測 定システムに適合でき、利用できる。 以下の実施例は本発明のいろいろな具体例を説明するものであるが、本発明の 範囲を限定するものと解釈されるものではない。実施例 実施例１ アミカシンの検出および測定 本発明の一つの実施態様としてアミカシンの一連の濃度既知の流体サンプル中で アミカシンの濃度測定を行った。分析に用い “S-Pot”および希釈液と称される）は Abbott Laboratories, 装置（同じく Abbott Laboratories より入手可能）を用いて分析を実施した。 １．サンプルチューブから 5μlを吸引し、キュベットに 795μ1の希釈液と共に 分注した。 ２．646μlのサンプル／希釈液の合液をキュベットから吸引し、廃棄容器に入れ た。 ３.20μlのP-Potと 626μlの希釈液を該キュベットに入れた。 ４．キュベット中の混合液を 34℃で５分間保温した。 ５.キュベット中の混合液 400μl(ブランク)を吸引し、opticalflowcellに入れ 光学特性（Ｈ_blankとＶ_blank）を測定した。 ６．15μlのT-Pot、13μlのS-Pot、 372μlの希釈液をキュベットに添加した。 ７．キュベット中の混合液を34℃で3.8分間保温した。 ８．400μlの混合液を吸引し、optical flowcellに入れ光学特性（Ｈ_finalとＶ_{f inal} ）を測定した。 ９．偏光を(7)式により計算した。 これらの測定の結果は図２に示し、従来のサンプル添加とブランク補正技術を用 いた FPIA 測定と比較した。アミカシンの正確な測定を可能にするという点で本 方法の有効性は明らかである。実施例２ T4の検出と測定 本発明の方法の一つの実施態様を、ホルモンであるT4の一連の濃度既知のサン プル中でその濃度測定に用いた。分析に用い および希釈液と称される)はAbbott Laboratories,Abbott Park, Abbott Laboratoriesより入手可能）を用いて分析を実施した。 １．14μlのS-Pot、25μlのP-Pot、7μlのサンプルを 747μlの希釈液といっし ょにキュベットにいれた。 ２．キュベット中の混合液を34℃で５分間保温した。 ３.キュベット中の混合液400μl(ブランク)を吸引し、opticalflowcellに入れ光 学特性（Ｈ_blankとＶ_blank）を測定した。 ４.10μlのT-Potと 372μlの希釈液をキュベットに添加した。 ５．キュベット中の混合液を 34℃で3.8分間保温した。 ６．400μlの混合液を吸引し、optical flowcellに入れ光学特性（Ｈ_finalとＶ_{f inal} ）を測定した。 ７．偏光を(7)式により計算した。 これらの測定の結果は図３に示し、従来のサンプル添加方法とブランク補正技 術を用いた FPIA 測定と比較した。カーブは一致していないがT4濃度の関数とし ての偏光スパン（polarization span）の変化は従来の技術を用いた場合に近似 であり、このことはT4の正確な測定を可能にするという点で本方法の有効性を証 明するものである。実施例３ カンナビノイドの検出と測定 本発明の方法の一つの実施態様をあるカンナビノイドの一連の濃度既知のサン プル中でその濃度測定に用いた。分析に用い “P-Pot”および“S-Pot”)はAbbott Laboratories,Abbott Park, Abbott Laboratoriesより入手可能）を用いて分析を実施した。 １．18μlのサンプル、11μlのP-Pot,，22μlのS-Potを749μlのW-Potといっし ょにキュベットにいれた。 ２．キュベット中の混合液を 34℃で５分間保温した。 ３.キュベット中の混合液 400μl(ブランク)を吸引し、opticalflowcell に入れ 光学特性（Ｈ_blankとＶ_blank）を測定した。 ４．11μlのT-Pot、6μlのP-Pot、11μlのS-Potおよび 372μｌのW-Potをキュベ ットに添加した。 ５．キュベット中の混合液を 34℃で3.8分間保温した。 ６．400μlの混合液を吸引し、optical flowcellに入れ光学特性（Ｈ_finalとＶ_{f inal} ）を測定した。 ７．偏光を(7)式により計算した。 これらの測定の結果は図４に示し、従来のサンプル添加とブ ランク補正技術を用いた２組の FPIA 測定と比較した。カーブは一致していない がカンナビノイドの濃度の関数としての偏光スパンの変化は従来の技術を用いた 場合に近似であり、このことはカンナビノイドの正確な測定を可能にする本方法 の有効性を証明するものである。実施例４ 遊離エストリオールの検出と測定 本発明の方法の一つの具体例をあるエストリオールの一連の濃度既知のサンプ ルを用いそのホルモンの遊離濃度を測定する regents(“T-Pot”,“P-Pot”,“S-Pot”および希釈液)はAbbottLaboratories， Abbott Park，IL より入手可能であり、改良さ 能）を用いて分析を実施した。 １．10μlのS-Pot、14μlのP-Pot、34μlのサンプルを 742μlの希釈液と共にキ ュベットに入れた。 ２．キュベット中の混合液を 34℃で５分間保温した。 ３.キュベット中の混合液400μl（ブランク）を吸引し、opticalflowcellに入れ 光学特性（Ｈ_blankとＶ_blank）を測定した。 ４．10μlのT-Potおよび 390μlの希釈液をキュベットに添加 した。 ５．キュベット中の混合液を 34℃で3.8分間保温した。 ６．400μlの混合液を吸引し、optical flowcellに入れ光学特性（Ｈ_finalとＶ_{f inal} ）を測定した。 ７．偏光を(7)式により計算した。 これらの測定の結果は図５に示し、従来のサンプル添加とブランク補正技術を 用いた２組の FPIA 測定と比較した。カーブは一致していないが遊離エストリオ ールの濃度の関数としての偏光スパンの変化は従来の技術を用いた場合に近似で あり、このことは遊離エストリオールの正確な測定を可能にするという点で本方 法の有効性を証明するものである。 本発明をそのさまざまな具体例について述べてきたが、当業者は本明細書と請 求の範囲に記載した本発明の思想と範囲から外れることなくこれらのあらゆる改 変を発想し実施することが出来よう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年６月２３日（１９９７．６．２３） 【補正内容】 ３.キュベット中の混合液 400μl（ブランク）を吸引し、opticalflowcell に入 れ光学特性（Ｈ_blankとＶ_blank）を測定した。 ４．10μlのT-Potおよび 390μlの希釈液をキュベットに添加した。 ５．キュベット中の混合液を 34℃で3.8分間保温した。 ６．400μlの混合液を吸引し、optical flowcell に入れ光学特性（Ｈ_finalとＶ_final ）を測定した。 ７．偏光を(7)式により計算した。 これらの測定の結果を、従来のサンプル添加とブランク補正技術を用いた２組 の FPIA 測定と比較して、図５に示す。カーブは一致していないが遊離エストリ オールの濃度の関数としての偏光スパンの変化は従来の技術を用いた場合に近似 であり、このことは遊離エストリオールの正確な測定を可能にするという点で本 方法の有効性を証明するものである。 本発明をそのさまざまな具体例について述べてきたが、当業者は、本明細書と 請求の範囲に記載した本発明の思想と範囲から外れることなくこれらの種々の改 変を発想し実施することが出来よう。請求の範囲 １． 単一の流体容器と一回のみのサンプル添加を用いる蛍光偏光免疫アッセイ （FPIA）の実施方法。 ２． 蛍光偏光を二回以上測定することを含み、単一の流体容器と１回のみのサ ンプル添加を用いる蛍光偏光免疫アッセイ(FPIA)の実施方法。 ３． 分析対象物の検出および濃度測定のために、 a)一種類以上の試薬と分析するサンプルを流体容器に入れ、 b)該サンプルの最初の偏光測定を行い、 c)、該容器に更にサンプルを添加することなく、該容器中の該サンプルにさらに 試薬を添加し、 d)二回目または最後の偏光測定を行い、 e)該二回の偏光測定の値に基づいて、該サンプル中の分析対象物の濃度を計算す る 手順を含む蛍光偏光免疫アッセイ(FPIA)の実施方法。 ４． 該サンプルが手順 a)の後に特定の希釈度にある請求項３に記載の方法。 ５． 手順 c)において、試薬の添加により得られる該サンプル の希釈度が手順 a)の後の該サンプルの希釈度に対してある比率にＸなるように 試薬を添加する請求項４に記載の方法。 ６． 手順 e)において、一回目と二回目の偏光測定の差から分析対象物の濃度 を計算し、その測定の少なくとも一つを、手順a)の後と c)の後の該サンプルの 希釈度の差を補償するように調整する請求項５に記載の方法。 ７． 手順 e)において、分析対象物の濃度を一回目と二回目の偏光測定の差か ら計算し、その際該第一回目の偏光測定を、該測定結果に該比率Ｘを乗じること により調整しておく請求項６に記載の方法。 ８． さらに、手順 b)の前に該容器から一定量のサンプルと試薬を除く手順も 含む請求項３に記載の方法。 ９． 手順 b)で行われる測定は手順 b)の前に該容器から除いた一定量のサンプ ルと試薬に対して行う請求項８に記載の方法。 １０． 手順 b)の前に抜き取られるサンプルと試薬の該一定量はキュベット中 の該サンプルと該試薬の容量の約 1/2 に等しく、該抜き取られる量は該キュベ ットから吸引される請求項９に記載の方法。 １１． 手順 c)において該試薬の添加によりサンプルが希釈さ れ、この希釈度は手順 a)の後のサンプル希釈度の約 1/2 と等しくＸが約 1/2 に等しい請求項５に記載の方法。 １２． 該手順 c)において該試薬と共に追加の希釈液が添加され、その量は該 手順 b)の前に除去された該サンプル、希釈液および試薬の量に等しい、請求項 ５に記載の方法。 １３． 該手順 c)において該試薬と共に追加の希釈液を添加する際に、該添加 希釈液および添加試薬の容量は、該サンプルの希釈度が該手順 a)の後の希釈度 の約 1/2 に等しくなりＸが約1/2 に等しくなるような容量とする請求項１１に 記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 単一の流体容器と一回のみのサンプル添加を用いる蛍光偏光免疫アッセイ （FPIA）の実施方法。 ２． 蛍光偏光を二回以上測定することを含み、単一の流体容器と１回のみのサ ンプル添加を用いる蛍光偏光免疫アッセイ(FPIA)の実施方法。 ３． 分析対象物の検出および濃度測定のために、 a)一種類以上の試薬と分析するサンプルを流体容器に入れ、 b)該サンプルの最初の偏光測定を行い、 c)、該容器に更にサンプルを添加することなく、該容器中の該サンプルにさらに 試薬を添加し、 d)二回目または最後の偏光測定を行い、 e)該二回の偏光測定の値に基づいて、該サンプル中の分析対象物の濃度を計算す る 手順を含む蛍光偏光免疫アッセイ(FPIA)の実施方法。 ４． 該サンプルが手順 a)の後に特定の希釈度にある請求項３に記載の方法。 ５． 手順 c)において、試薬の添加により得られる該サンプル の希釈度が手順 a)の後の該サンプルの希釈度に対してある比率Ｘになるように 試薬を添加する請求項４に記載の方法。 ６． 手順 e)において、一回目と二回目の偏光測定の差から分析対象物の濃度 を計算し、その測定の少なくとも一つを、手順a)の後と c)の後の該サンプルの 希釈度の差を補償するように調整する請求項５に記載の方法。 ７． 手順 e)において、分析対象物の濃度を一回目と二回目の偏光測定の差か ら計算し、その際該第一回目の偏光測定を、該測定結果に該比率Ｘを乗じること により調整しておく請求項６に記載の方法。 ８． さらに、手順 b)の前に該容器から一定量のサンプルと試薬を除く手順も 含む請求項３に記載の方法。 ９．手順 b)で行われる測定は手順 b)の前に該容器から除いた一定量のサンプル と試薬に対して行う請求項８に記載の方法。 １０． 手順 b)の前に抜き取られるサンプルと試薬の該一定量はキュベット中 の該サンプルと該試薬の容量の約 1/2 に等しく、該抜き取られる量は該キュベ ットから吸引される請求項９に記載の方法。 １１． 手順 c)において該試薬の添加によりサンプルが希釈さ れ、この希釈度は手順 a)の後のサンプル希釈度の約 1/2 と等しくＸが約 1/2 に等しい請求項５に記載の方法。 １２． 該手順 c)において該試薬と共に追加の希釈液が添加され、その量は該 手順 b)の前に除去された該サンプル、希釈液および試薬の量に等しい、請求項 ５に記載の方法。 １３． 該手順 c)において該試薬と共に追加の希釈液を添加する際に、該添加 希釈液および添加試薬の容量は、該サンプルの希釈度が該手順 a)の後の希釈度 の約 1/2 に等しくなりＸが約1/2 に等しくなるような容量とする請求項１１に 記載の方法。