JP2000502078A

JP2000502078A - 擬似アルギニン特性を有する３―アミノエチル―ｎ―アミジノ―２，５―ジヒドロピロール誘導体

Info

Publication number: JP2000502078A
Application number: JP09521726A
Authority: JP
Inventors: エン，リチャード; コネッチニー―ラップ，シルビア; クレル，ハンス―ウィリー; マルティン，ウルリヒ; サクラキッズ，クリストス
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1995-12-09
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2000-02-22
Also published as: TW455580B; DE69627184D1; CA2239908A1; EP0865445B1; ATE236192T1; AU1192097A; EP0865445A1; WO1997021725A1; US20020026034A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）（式中の記号は説明で示した意味を有する）の新規のアミジノピロリン誘導体並びにそれらの製造方法及び製剤中でのそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】擬似アルギニン特性を有する３−アミノエチル−Ｎ−アミジノ−２，５−ジヒドロピロール誘導体本発明は新規のアミジノピロリン誘導体、その製造方法及び製剤調製におけるそれらの使用に関する。一般式（Ｉ）の化合物はアルギニン擬似体の特性を有することが判明した。アルギニン擬似体は、例えば阻害剤中のアルギニン又はアルギニル残基を置換し得るファルマコフォアである。（Ｉ）の誘導体は、生物学的に活性な物質中の、特に治療的に活性な物質中のアルギニン又はすでに公知のアルギニン擬似体を置換し得る。特にそれらは、セリンプロテアーゼに対する阻害剤、例えばトロンビン又はトリプシン阻害剤に用い得る。トロンビンの阻害剤は、血中のフィブリノーゲンのトロンビン誘発性凝固、並びに血小板のトロンビン誘発性凝集を阻止する。したがって、それらは凝固血栓及び富血小板血栓の形成を防止し、例えば血栓症、卒中、心筋梗塞、炎症及び動脈狭窄といった病気を治療し、防止し得る。凝固カスケードの最終酵素であるトロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに分解し、これはＸＩＩＩ因子により架橋されて、血栓のための基質を形成する不溶性ゲルとなる。トロンビンは血小板上でその受容体のタンパク質分解により血小板凝集物を活性化し、このように血栓形成に関与する。血管が損傷された場合、これらの工程は出血を停止するために必要となる。正常環境下では、血漿中のトロンビンは測定可能な濃度では存在しない。トロンビン濃度の増大は血栓の形成を引き起こし、したがって、とりわけ工業国で非常に頻発する血栓塞栓性疾患を引き起こし得る。トロンビンは、プロトロンビンの形成に際して血漿中に容易に保持され、Ｘａ因子によりこれから放出される。トロンビンはＶ、ＶＩＩＩ及びＸＩ因子を活性化し、これらがその後Ｘ因子をＸａ因子に変換する。この手段によりトロンビンはそれ自体の放出を触媒し、これがトロンビン濃度の非常に迅速な増大が起こり得る理由である。したがって、トロンビン阻害剤及びＸａ因子阻害剤はトロンビンの放出、並びに血小板誘発性及び血漿性血液凝固を阻止し得る。トリプシンは、必要な場合に膵臓から分泌される消化酵素である。膵臓が損傷又は炎症を蒙るとトリプシンが放出され、これが組織破壊を引き起こし得る。トリプシン阻害剤はこの恐れを低減し、例えば膵炎を治療するのに用い得る。さらにこのようなアルギニン擬似体は、ＲＧＤを含有する配列を介してその受容体と結合する配位子の結合を阻害し得る活性物質中に取り込まれる。ＲＧＤは、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを表す。このような配位子は、例えばフィブリノーゲン、ビトロネクチン又はフィブロネクチンである。このような活性物質を用いて、血栓−塞栓性事象による疾患、例えば発作、心筋梗塞又は動脈閉塞性疾患、並びに炎症、骨粗鬆症又は腫瘍性疾患を治療し得る。本発明は、ファルマコフォアのような構造素子Ｉを含有する化合物、並びに構造Ｉの親物質から得られる当業者に公知の修正に関する：（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＹは同一であっても異なってもよく、水素又は有機残基を表す）。好ましい有機残基は、一般式Ｉの生物学的活性化合物を生じるようなものである。生物学的に活性なとは、とりわけ、植物保護のための物質及び好ましい薬理学的活性化合物を意味する。このような生物学的活性化合物のプロドラッグは、Ｉ式の好ましい構造に含まれる。プロドラッグは、生物学的活性化合物中でin vivo で代謝される物質である。プロドラッグの例としては、生体により、例えば肝臓代謝により遊離酸に変換されるエステルが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいのは、生物学的活性物質中のアルギニン土台又は公知の擬似アルギニン土台がＩ’式又はＩ''式の主鎖構造により置換されるような一般式Ｉの化合物の誘導体である：（式中、ジグザグ結合は、上記の生物学的活性化合物中では、アルギニンあるいは本発明のアルギニン擬似構造（Ｉ’）又は（Ｉ'')により置換される公知のアルギニン擬似土台の任意の化学結合の位置を表す）。薬理学的活性化合物の収集は、ＩＮＮ（国際非特許登録名）に関するデータベース中に見出される（参照により本明細書中に含まれる）。特に、Ｒ１，Ｒ２が水素、アミノ酸、ペプチジル、アルキルスルホニル又はアリールスルホニル残基を表し；Ｙが水素又は式ＣＯＸの残基を表し；Ｘが水素あるいはＯＲ３又はＮＲ１’Ｒ２’残基を表し；Ｒ３が水素あるいは低級アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、好ましくはエチルを表し；Ｒ１’，Ｒ２’は同一であっても異なってもよく、残基Ｒ１及びＲ２の意味を有する一般式（Ｉ）の化合物が好ましい。アミノ酸残基は、通常、天然又は非天然アミノ酸の残基を表す。非天然アミノ酸は、α−、β−、γ−及びω−アミノカルボン酸、並びにその誘導体と理解される。誘導体は特に、アミノ基又はカルボキシ基でアルキル化される化合物と理解される。脱カルボキシル化又は脱アミノ化される誘導体も含まれる。このようなアミノ酸及びその誘導体の例は、実施例及び好ましい化合物に記載されている。特に、これらは、Ｄ−アミノ酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、オルニチン、サルコシン、トラネキサム酸、Ａｄｃ［３−（２−アミノエチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−イル］−カルバミジン、Ａｄａ［（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ− １Ｈ−ピロール−３−イル）−アラニン］、Ｃｈａ［シクロヘキシル−アラニン］、Ｃｈｏｉ［２−カルボキシ−６−ヒドロキシ−オクタヒドロインドール］、ノルＬｅｕ（シクロ）−Ｇｌｙ［３−アミノ−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１− アゼピン−酢酸］、Ｐｃｓ［４−ピペリジンカルボン酸］、Ｐｉｐ［ピペコリン酸］、Ｐｌａ［フェニル酢酸］、Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ、ＨＯＯＣＣＨ₂−Ｐｈｅ、ＨＯＯＣＣＨ₂−Ｃｈａ、１−カルボキシ−ペルヒドロイソキノリン、Ｎ−シクロペンチルグリシン、ＥｔＳＯ₂−Ｐｈｅ、Ｎ−（ＢｕＳＯ₂−ＮｏｒＬｅｕ（シクロ）−Ｇｌｙ）である。ペプチジル残基は、任意の所望数の天然又は非天然の同一の又は異なるアミノ酸から成る残基と理解される。１〜５０個のアミノ酸を有するペプチジル残基が好ましく、１、２、３又は４個のアミノ酸を有するものが特に好ましい。アルキルとは、通常、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アルキル残基を意味する。アリールとは、通常、６〜１４個の炭素原子を有する炭素環、あるいはＯ、Ｎ又はＳから選択される１、２又は３個の異種原子を有する５又は６員複素環を意味する。非置換又は任意置換フェニル又はナフチル残基が好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素を示すアルギニン擬似体（Ｉ）は、十分公知の方法により製造される。前駆体（ＩＩ）からの製造が有益である。（式中、第一アミノ基は好ましくは無水フタル酸との反応により保護されてフタルイミドを生成し、次に第二アミノ基は好ましくはBannard et al.，Can．J．C hem．1958，1541に記載の方法によりアミノ化され、その後フタルイミド基は好ましくはヒドラジン水和物によりそしてその後の塩酸により処理により開裂される）。式（ＩＩ）（式中、Ｙは水素を表す）の化合物は、ａ）式(ＩＩＩ)：の化合物のアミド基を、好ましくはトリメチルクロロシランの存在下で水素化アルミニウムリチウム又はホウ水素化リチウムを用いて還元することにより、あるいはｂ）一般式（ＩＶ）；（式中、Ｒ５は保護基、例えばベンゾイル基、アルキルオキシカルボニル基又はベンジルオキシカルボニル基を示す）の化合物の環外二重結合を環内二重結合を有する異性体中で転位して、その後保護基を開裂する。環外二重結合の環内二重結合への転位は、M．I．Labouta et al.，Acta Chem．Scand．Ser．B．1982，66 9-674に記載されているのと同様に、灰汁、好ましくは水酸化ナトリウム溶液の存在下で実行される。この後、保護基Ｒ５の及びフタルイミド基を開裂することにより、そしてｃ）略図１に示した工程をもちいるために製造され得る：略図１略図１中の説明ａ）ＮａＢＨ₃ＣＮ／ＭｅＯＨ／ＲＴ；ｂ）ＰｈＣＯＣｌ／Ｐｙ／ＤＭＡＰ／ＲＴ；ｃ）ＤＢＵ／トルエン／ＲＴ／１６時間；ｄ）ＤＩＢＡＬ−Ｈ／ＴＨＦ／−７８℃；ｅ）Ａｃ₂Ｏ／Ｐｙ／ＤＭＡＰ／０℃；ｆ）ジメチルマロネート／Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄／ＴＨＦ／２０時間還流；ｇ）ＤＭＦ／ＮａＣｌ／Ｈ₂Ｏ／１５０℃／３０分；ｈ）ＬｉＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏ／１ＮＨＣｌ；ｉ）ジフェニル−ホスホリル−アジド／ＴＨＦ／ＮＥｔ₃／８０℃、１２時間；Ｃｌ₃ＣＣＨ₂ＯＨ／ＴＨＦ／ＣｕＣｌ／２時間還流；ｊ）４ＮＨＣｌ／１６時間；（２３）（略図２）／ＥｔＮ（ｉ−Ｐｒ）₂ ｋ）Ｚｎ／ＡｃＯＨ／ＲＴｌ）ジオキサン中４ＮＨＣｌ一般式（ＩＩ）（式中、Ｙはカルボキシル基を示す）の化合物は、略図２又は３に略記した工程に従って製造し得る。略図２化合物（ＩＩＩ）は、カルボキシル基、例えば塩化チオニル又はクロロギ酸イソブチルエステルを、その後アンモニアを活性化する試薬を用いて、一般式（ＸＩＶ）（式中、Ｒ５は上記の意味を有する）の化合物から生成される。その後、保護基は好ましくはジオキサン中の塩酸で、又はトリフルオロ酢酸で、又は氷酢酸中の臭化水素で開裂される。一般式（ＸＩＶ）の化合物は、例えばM．I．Labouta et al.，Acta Chem．Scand.Ser．B,1982,669-674から公知であり、あるいは本出版物に記載された方法により製造し得る。一般式（ＩＶ）の化合物は、Wittig反応により、一般式（ＸＶ）の化合物を化合物（ＸＶＩ）と反応させることにより生成される：（式中、Ｒは保護基を示す）。このWittig反応及び試薬（ＸＶＩ）は、Ch．Sellier et al.，Liebigs Ann Chem ．1992，317-324に記載されている。化合物（ＸＶ）は、A．G．Schultz，Tetrah edron 1980，1757-1761に記載されている。略図２に関する注釈： --Ｒ３及びＲ５は、上記の意味を有する； --Ｒ６は、アルキル又はアリール残基、例えばメチル、エチル、トリフルオロメチル、フェニル、トシル又は４−ニトロフェニル残基、好ましくはメチル又はトシル残基を示す； --Ｌは通常、スルホン酸残基、例えばメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸残基、あるいはハロゲン、例えば塩素、臭素、ヨウ素又はアセテートを示す； --ＭＨａｌは、金属ハロゲン化物、例えばＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＫＩ、ＭｇＣｌ₂又はＭｇＢｒ₂を示す； --式（Ｖ）の化合物は、Timothy L．et al.，J．Org．Chem.48,1129-1131 (19 83)に記載されている； --トリフェニルホスフィン（Ｐｈ₃Ｐ）の存在下でのＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド又はＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＣＳ、ＮＢＳ、ＮＩＳ）による式（Ｖ）のアルコールの式（ＶＩ）式のスルホン酸エステル又は酢酸エステルへの変換は、対応する文献の方法と同様に実行される（例えば、 RozwadowskaM.D.，Tetrahedron Asym．4,1619-1624(1993））； --Kazmaier U et al.，Tetrahedron 52，941-954（1996）に記載された方法と同様にClaisen 転位により、式（Ｘ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物に変換される； --式（ＸＩ）のアリルアルコールを生成するための式（ＸＩＩ）のエポキシドのエポキシド開環は、Joshi V.S．et al.，Tetrahedron，24,58'7-5830（1968）に記載された条件下で実行される； --式（ＸＩＩＩ）の化合物は、Grubbs H．et al.，J．Am．Chem.Soc.，114，7 324-7325（1992）に記載されている； --ジメチルスルホキシド中の金属ハロゲン化物による高温でのマロン酸エステルの脱カルボキシル化は、Krapcho A.P．et al.，Tet rahedron Lett.957（1973）に記載されている。略図３略図３中の説明ａ）４ＮＨＣｌ／１６時間；（２３）／ＥｔＮ（ｉ−Ｐｒ）₂ ｂ）（２４）／ＨＭＤＳ／ｎ−ＢｕＬｉ／−７８℃；ｃ）１ＮＨＣｌ／ＴＨＦ／ＲＴ／３０分; ｄ）Ｂｏｃ₂Ｏ／ＥｔＮ（ｉ−Ｐｒ）₂／アセトニトリル／１６時間；ｅ）ＬｉＯＨ／ＴＨＦ−ＭｅＯＨ−Ｈ₂Ｏ；ｆ）ジオキサン中４ＮＨＣｌ；ｇ）Ｃｌ₃ＣＣＨ₂ＯＣＯＣｌ／ＤＭＡＰ／Ｐｙ／ＲＴ／１２時間；ｈ）Ｚｎ／ＡｃＯＨ／ＲＴ一般式（Ｉ）の化合物のいくつかは、１つ又は数個の不斉中心を有する。そこで、光学的活性形態も互変異性体と同様に本発明の対象物である。本発明はさらに、一般式（Ｉ）の化合物のすべての塩に関する。塩は、主に酸付加塩である。生理学的に許容可能な塩は、製薬のために主として考慮に入れる。生理学的に用い得る式（Ｉ）の化合物の塩の例としては、生理学的耐容性無機酸、例えば塩酸、硫酸、亜硫酸又はリン酸による塩、あるいは有機酸、例えばメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸又はサリチル酸による塩が挙げられる。製剤製造のために、一般式（Ｉ）の物質及びそれらの塩を適切な薬学的担体物質、芳香剤、風味剤及び乾燥剤と混ぜ合わせ、そして例えば錠剤又は糖衣錠として形成され、適切な補助物質の付加を伴って水又は油、例えばオリーブ油中に懸濁又は溶解される。一般式（Ｉ）の物質及びそれらの塩は、液体又は固体形態で経腸的に又は非経口的に投与される。水は、好ましくは、安定剤、可溶化剤又は緩衝剤のような注射溶液中の通常の添加剤を含有する注射媒質として用いられる。このような添加剤は、例えば酒石酸塩及びクエン酸塩緩衝液、錯生成剤（例えばエチレンジアミン四酢酸及びその非毒性塩）及び高分子ポリマー、例えば粘度を調節するための液体ポリエチレンオキシドである。固体担体は、例えばデンプン、ラクトース、マンニトール、メチルセルロース、タルク、高分散性ケイ酸、高分子脂肪酸（例えばステアリン酸）、動物及び植物性脂肪、並びに固体高分子ポリマー（例えばポリエチレングリコール）である。経口投与に適した製剤は、風味剤及び甘味剤を任意に含有し得る。本化合物は、通常、体重７５kgについて１０−１５００mg／日の量で投与される。活性物質の含量が５〜５００mgの錠剤１〜２錠を２〜３回／日で投与するのが好ましい。錠剤は遅滞され得るが、その場合、投与されるのは２０〜７００mg の活性物質を含有する１〜２錠だけ１日１回でなければならない。活性物質は、１日１〜８回の注射により、又は連続注入により適用され得るが、この場合、５０〜２０００mg／日が通常適切である。図面の説明図１は、実施例２のＸ線構造からの酵素トリプシン（細棒）中のＤ−Ｐｌａ− Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃ（太棒）からのＡｄｃの立体構造である。ヒトトロンビン中の阻害剤ＤＦＰＲの立体構造をこの上に重ねる（阻害剤：球を伴う細棒、トロンビン：細線）。球は水分子を表す。実施例では、以下の略語を用いる：Ａｃ＝アセチルＡｄａ＝（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）− アラニンＡｄｃ＝［３−（２−アミノエチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−イル］−カルバミジンＡｓｐ＝アスパラギン酸Ｂｎ＝ベンジルＢｏｃ＝tert．ブチルオキシカルボニルＢｕ＝ブチルＣｂｚ＝ベンジルオキシカルボニルＣｈａ＝シクロヘキシルアラニンＣｈｏｉ＝２−カルボキシ−６−ヒドロキシ−オクタヒドロインドールＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンＤＩＢＡＬ−Ｈ＝水素化アルミニウムジ−イソビルＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジンＤＭＦ＝ジメチルホルムアミドｅｑ＝等価Ｅｔ＝エチルＦｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニルＧｌｙ＝グリシンＨＭＤＳ＝ヘキサメチルジシラザンｉ−Ｐｒ＝イソプロピルＭｅ＝メチルＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリンノルＬｅｕ（シクロ）−Ｇｌｙ＝３−アミノ−２−オキソ−ヘキサヒドロ−１ −アゼピン−酢酸Ｐｃｓ＝４−ピペリジンカルボン酸Ｐｈ＝フェニルＰｈｅ＝フェニルアラニンＰｉｐ＝ピペコリン酸Ｐｌａ＝フェニル乳酸Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルＰｒｏ＝プロリンｐｙ＝ピリジンＳｅｒ＝セリンｔ−Ｂｕ＝tert.-ブチルＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３− テトラメチルウロニウムテトラフルオルボレートＴＣＰ＝トリチルクロリド−ポリスチレンＴＨＦ＝テトラヒドロフランＴｒｏｃ＝２，２，２−トリクロリン−エトキシカルボニルＴｙｒ＝チロシンＴｒｐ＝トリプトファンｔ_R＝保持時間Ｖａｌ＝バリンＡｄａ及びＡｄｃのＣ、Ｎ、Ｏ−主鎖は、本発明の生物学的活性物質中のアルギニン又はアルギニン擬似体構造の代わりをする主鎖構造であるが、ここで、Ａｄａのカルボン酸基のＯＨ−機能は別の主鎖原子、例えばＣ、Ｎ又はＳに置換され得る。実施例に記載する化合物及び請求の範囲に記述する置換基のすべての意味を併有することにより得られる化合物の他に、本発明の意味の範囲内では以下のものが好ましい。１．Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｈａ−Ａｄｃ２．ＨＯＯＣＣＨ₂−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｄｃ３．ＨＯＯＣＣＨ₂−Ｄ−Ｃｈａ−Ｐｉｐ−Ａｄｃ４．１−カルボキシ−ペルヒドロイソキノリニル−Ｐｒｏ−Ａｄｃ５．１−カルボキシ−ペルヒドロイソキノリニル−Ｎ−シクロペンチル−Ｇｌｙ−Ａｄｃ６．ＥｔＳＯ₂−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｄｃ７．ＥｔＳＯ₂−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｎ−シクロペンチル−Ｇｌｙ−Ａｄｃ８．Ｎ−（ＢｎＳＯ₂−ノルＬｅｕ（シクロ））−Ｇｌｙ−Ａｄｃ９．３−（｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチル］−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ− キナゾリン−６−カルボニル｝−アミノ）−プロピオン酸１０．（４−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチル］−２−オキソ−オキサゾリジン−５−イルメトキシ｝ −フェニル）−酢酸１１．３−（｛１−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチルカルバモイル］−ピペリジン−３−カルボニル｝−アミノ）−３−ピリジン−２−イル−プロピオン酸１２．（４−｛［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール− ３−イル）−エチルアミノ］−アセチル｝−３−メトキシカルボニルメチル−ピペラジン−１−イル）−酢酸１３．［４−｛［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ −ピロール−３−イル）−エチル］−メチルアミノ｝−アセチル）フェノキシ］ −酢酸１４．｛７−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３ −イル）−エチルカルバモイル］−３−オキソ−４−フェネチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−２−イル｝−酢酸１５．３−（４−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）一エチル］−２−オキソ−イミダゾリジン−１−イル｝−フェニル）−プロピオン酸１６．４−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチル］−２−オキソ−イミダゾリジン−１−イル｝−シクロヘキサン）−カルボン酸１７．［５−（４−｛［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチルアミノ］−メチル｝−フェノキシメチル）−２−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−酢酸１８．［５−（｛４−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−ＩＨ−ピロール−３−イル）−エチルアミノ］−ピペリジン−１−イル｝アセチル）−２− カルボキシメトキシ−フェノキシ］−酢酸１９．（４−｛［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール− ３−イル）−エチル］−メチル−アミノ｝−［１，４’］ビピペリジニル−１’ −イル）−酢酸２０．３−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチルカルバモイル］−プロピオニルアミノ｝−酪酸２１．３−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチルカルバモイル］−プロピオニルアミノ｝−３−フェニル−プロピオン酸２２．３−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチルカルバモイル］−プロピオニルアミノ｝−３−ピリジン− ２−イル−プロピオン酸２３．３−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチルカルバモイル］−プロピオニルアミノ｝−ペント−４−イノン−カルボン酸２４．３−（２−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチル］−ウレイド｝−アセチルアミノ）−Ｎ−（カルボキシ−フェニル−メチル）−コハク酸２５．３−（２−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチル］−２−オキソ−テトラヒドロ−ピリミジン−１− イル｝−アセチルアミノ）−プロピオン酸２６．｛４−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３ −イル）−エチルアミノ］−シクロヘキシル｝−酢酸２７．３−（ブタン−１−スルホニル）−２−（４−｛［２−（１−アミジノ −２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチルアミノ］−メチル｝ −ベンジル）−プロピオン酸２８．２−｛２−［２−アミノ−３−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−プロピオニルアミノ］−アセチルアミノ｝−コハク酸２９．１−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール −３−イル）−エチル］−２−オキソ−オキサゾリジン−５−イルメチル｝−ピペリジン−４−カルボン酸３０．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ３１．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂ ３２．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ３３．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂ ３４．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ３５．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂ ３６．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ３７．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ₂ ３８．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ３９．Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ₂ ４０．Ｐｌａ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃ実施例１：Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃバイオマスの製造ｐＨ調節器を備えた２０リットルガラスシリンダー３本に滅菌濾過栄養培地を充填し、各々に、ゲッチンゲン大学の植物生理学研究所の藻類培養の収集物からのOscillatoria agardhiiの予備培養（株番号Ｂ３．８２）５０mlを接種し、８．５の一定ｐＨで、２０℃の温度で、滅菌濾過室空気を連続供給しながら、約１４日間インキュベートした。栄養培地ＣａＣｌ₂ x ２Ｈ₂Ｏ３．６mg、Ｃａ（ＮＯ₃）₂ｘ４Ｈ₂ Ｏ２０．３mg 、ＫＣｌ２．７mg、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．５mg、ＭｇＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ７６.０m g、ＮａＨＣＯ₃ ８４. 0mg、微量元素溶液１ ml、脱イオン水１０００ml 。微量元素溶液：Ｎａ₄ ＥＤＴＡ８７５mg、Ｃｏ（ＮＯ₃）₂ｘ６Ｈ₂Ｏ９．７mg、ＦｅＣｌ₂ ｘ６Ｈ₂Ｏ２８４mg、ＭｎＣｌ₂ｘ４Ｈ₂ Ｏ７２．２mg、Ｎａ₂ＭｏＯ₄ ｘ２Ｈ₂ Ｏ２５．２mg、ＺｎＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ４３．７mg、脱イオン水１０００ml（K．Zielinski，Dissertation，Univ．Freibu rg，1988，p.23）３x 20 ｌ培養のプロセッシング：採取時に、３つの２０₁培養を併合し、細胞と栄養溶液を静かに遠心分離（５０００ｇ、１０分間）して分離した。バイオマスを−２０℃で凍結させ、その後凍結乾燥した。凍結乾燥物（約３０ｇ）をメタノール１０００mlで１回、５０0 mlで２回抽出し、併合メタノール相を蒸発、乾燥した。メタノール抽出物（約７ｇ）を水５００mlに取って、毎回ブタノール５００mlで３回振って出した。ブタノール相を併合し、回転蒸発器上で４０℃で濃縮乾燥した。ブタノール抽出物を併合し（約５ｇ）、メタノール１５０mlに取って、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ−ＣＮ相（２５〜４０μm）２５ｇ上に吸収させ、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ−ＣＮカラム（カラム：５２ｘ３５６mm、移動相勾配：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸１００：０：０：１〜５０：５０：０．１)総容量５ｌ）上でクロマトグラフィー処理した。ＴＬＣ又はトロンビン時間延長検定を用いて同定されたＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃを含有する分画をプールし、回転蒸発器で４０℃で蒸発乾燥した。濃縮物（約１ｇ）をメタノール１００ml中に溶解し、シリカゲルＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐＳｉ６０（１５〜２５μm）に吸収させ、移動溶媒としてクロロホルム／メタノール／氷酢酸／水（６５：２５：３：４）１５００mlを用いてシリカゲルカラム（２６ｘ３６０mm）上でクロマトグラフィー処理した。プールし、濃縮したＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃを含有する分画（約２００mg）をさらに精製するためにメタノール３ml中に取り、移動溶媒として水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（７０：３０：０．１）を用いてＮｕｃｌｅｏｓｉｌ−１００ＲＰ１８（１０μm、カラム：２０ｘ２５０mm ）上での高圧液体クロマトグラフィーによりさらに分離した。Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃを含有する濃縮分画（２０mg ）をメタノールｌml中に取り、さらに高圧液体クロマトグラフィー（カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−１００ＲＰ１８、１０μm、２０ｘ２５０mm；移動溶媒：５０Mmリン酸塩緩衝液ｐＨ７．８／アセトニトリル（７０：３０））にかけた。Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃを含有するだけの分画を得た。これを約５ml水溶液に濃縮した。緩衝液を除去するために、水性濃縮物をＮｕｃｌｅｏｓｉ１−１００ＲＰ１８カラム（１５ｘ１００mm）に適用し、それによりＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ −Ｃｈｏｉ−Ａｄｃを固定相と結合させた。水１００mlで洗浄後、Ｄ−Ｐｌａ− Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃを水／メタノール（１０：９０）２００mlで溶離した。メタノール溶出液を回転蒸発器で４０℃で蒸発乾燥した。精製Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃ約３mgを無色リン酸塩として得た。Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃに関する分析データａ）質量分析法：Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−ＡｄｃのＬＳＩＭＳスペクトルは、ＭＨ⁺ ６１７Ｄａで疑似分子イオンを生じた。陽性ＬＳＩＭＳモードでの高分解能測定はＭＨ⁺ ６１７．３４５Ｄａを生じたが、これにより中性化合物の元素組成としてＣ³⁴Ｈ⁴⁴Ｎ⁶Ｏ⁵を得た。分子イオンＭＨ⁺ のＭＳ／ＭＳスペクトルは、一連の娘イオンを生じたが、これはＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃに対して得られる化学構造を確証した。実験条件ピークマッチモードでの参照物質としてのＰＥＧに対してＬＳＩＭＳモードで約５０００の分解能で、化合物を測定した。実験データＬＳＩＭＳ選択ピーク（Ｍ／Ｚ：rel．int．）１３６：９２；１５４：１００；１７６：９；１９３：６；２３９：６；２８９：１４；３０７：１９；３３１：３；３５８：３４；３８１：２；３９９：６；４６９：２；５２５：３；５９３：７；６１７：８６；６４７：８；６６７：３；７１３：６．ＭＨ⁺ 選択ピークのＭＳ／ＭＳ（Ｍ／Ｚ：rel．int．）９４：１０；１２０：６４；１４０：３９；１５３：３；１８１：９；２０９：１６；２５０：２；２６８：７；３０５：１；３２０：１３；３４９：１；３７７：３；４５３：２；４６９：１６；５４０：３；５６５：５．断片（娘イオン）の割当（ｂ）Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃの酸総水解物のガスクロマトグラフィー分析分子成分Ｄ−Ｐｌａ及びＤ−Ｐｈｅは、キラル相に関するガスクロマトグラフィー分析によりＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃの酸総水解物中で検出できた。さらに、ピークは、４１９Ｄａ（Ｎ，Ｏ−ジトリフルオロアセチル−Ｃｈｏｉ−ｎ−プロピルエステルの分子イオン（Ｍ⁺））及び３３２Ｄａ（フラグメント［Ｍ−Ｃ（Ｏ）ＯＣ₃Ｈ］⁺）の２つの典型的質量を基礎にして、ＥＩ質量スペクトルを分子成分Ｃｈｏｉに割り当て得るＧＣ−ＭＳカップリングによりガスクロマトグラフィーで同定された。実験条件６Ｎ塩酸を用いて標本を２４時間加水分解し、塩酸の吹込み後に誘導した。ｎ−プロパノール中の４Ｎ塩酸０．５mlをＤ−Ｐｈｅ及びＣｈｏｉの検出のためにドライ水解物に付加し、反応混合物を３０分間、１１０℃に加熱した。余分の試薬を完全に放出させた。その後のアシル化を、無水トリフルオロ酢酸を用いて１５０℃で１０分間実施した。試薬を再び完全に放出させて、標本を溶媒中に取った。Ｄ−Ｐｌａの検出のために、メタノール中の４Ｎ塩酸０．５mlをドライ水解物に付加し、反応混合物を１０分間１１０℃に加熱した。余分の試薬を完全に放出させた。その後のアミノリシスを室温でｍプロピルアミンを用いて実行した。その後、それを７０℃でヘキサメチルジシラザンを用いて２０分間シリル化した。加水分解の誘導生成物を、キラル相に関してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ＣｈｉｒａｓｉｌＶａｌで被われた内径０．２８mm、薄膜厚０．２５μmの２０ｍ毛管を用いた。検出のためにフレームイオン化検出器を用いた。参照物質の場合と保持を比較して、Ｄ−Ｐｈｅ及びＤ−Ｐｌａにピークを割り当てた。Ｃｈｏｉの場合には、セクターフィールド質量分析法を検出のために用いた。（ｃ）ＮＭＲ分光法ＮＭＲ分光法により、実施例１の化合物の構造を明らかにし、確証した（２ＤＮＭＲ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ、ＣＯＳＹ（ＤＱＦ−Ｈ、Ｈ−ＣＯＳＹ、Ｅ．ＣＯＳＹ）ＴＯＣＳＹ、ＲＯＥＳＹ）。実施例２実施例１の化合物は、ウシセリンプロテアーゼトリプシンと同時結晶化する。セリンプロテアーゼ阻害剤Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃの高分解能結晶構造からウシトリプシンとの複合体中の阻害剤の結合性を得ることができた。アルギニン含有阻害剤との比較から、Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃがアルギニン擬似体を含有することが示された。阻害剤Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃは、主鎖に沿って、公知のトロンビン阻害剤（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＦＰＲ）に似ている。Ｎ末端（付加残基）、プロリン類似体（ヒドロキシ基を有する縮合環）及びＣ末端（カルボキシレ−トは認められず、グアニジノ基は部分的に５員環に統合される）に差異が認められる。トリプシンを有するＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−ＡｄｃのＸ線構造とトロンビン−ＤＦＰＲ複合体との比較（Bode，W.，Mayr，I.，Baumann，U. ，Huber,R.，Stone，S.,&Hofsteenge,J.（1989）．EMBO Journal 8,3467-3475）は、この類似性を明らかに示した。両方のＸ線構造を重ね合わせた場合、ＤＦＰＲ阻害剤はＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃの電子密度内にある。偏差は、上記の側鎖における差異に関してのみ生じる。上記の阻害剤構造の別個に同調されたＦｏ−Ｆｃ電子密度は、分子構築ブロックＡｄｃの化学的構造を確証した。５員環が明らかである。電子密度の立体幾何学は、アルギニンのＣに対する等価の位置の二重結合に対応する。密度の平面性もＮ等価位置の窒素原子と一致する。このことから、グアニジノ基が推論される。タンパク質構造を有する−先ず適切な幾何学的拘束を有し、その後いかなる拘束も有さない−阻害剤Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−ＡｄｃのＸ線構造のは、Ｄ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃの分子構築ブロックＡｄｃがアルギニン類似体として結合することを示した（図１）。別の環原子は、水分子を置換する。他の特定の水素架橋並びに対応する原子の立体位置は、ほとんど同じままである。Ｘ線構造分析の方法の説明結晶化：ウシβ−トリプシン（SIGMA）を再精製し（D.D.Schroeder，E.Shaw（1968））、凍結乾燥した。結晶化製剤のために、凍結乾燥物（７０％w/w βトリプシン、２０％ベンズアミジン、１０％ＣａＣｌ₂）3.5mgを蒸留水３Oμｌに溶解し、沈降溶液（１．６M硫酸アンモニウム、１００mMイミダゾール／Ｈ₂ＳＯ₄、ｐＨ６．０，０．０２％アジ化ナトリウム）と１：１で混合した。蒸気拡散（タンパク質溶液６μｌ滴／沈降溶液４ml）により結晶を生成した。連続浸漬：１）ベンズアミジンを除去するために精製採取溶液（２．５M硫酸アンモニウム、ＴＲＩＳ／ＨＣｌｐＨ８，１０mMＣａＣｌ₂）中で２時間２回、そして２）阻害溶液（採取溶液１７６μｌに溶解したＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃ１．７６mg）中で一夜：により結晶中でベンズアミジンはＤ−Ｐｌａ−Ｄ− Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃに置換された。データ収集、評価結晶を、Siemens社の４−サークルゴニオメーターを用いて配向した。Ｘ線源は、湾曲黒鉛モノクロメーターを装備した銅回転陽極Rigaku Rotaflex-発電器（４５KV，１２０ｍA）である。回折反射をSiemens X1000面積計算器を用いて測定した。１．６Ａの分解能に関して９９％の理論的完全性に対応して４つの配向の計２４６４の記録（幅０．１度）を成した（プログラムＡＳＴＲＯ（SiemensInd ustrial Automation，Inc.，Madison，WI.,USA）で概算）ＳＡＤＩＥ及びＳＡＩＮＴ（Siemens Industrial Automation，Inc.，Madison，WI）を用いて、自動指数付け及びデータ評価を実施した（表１参照）。表１：結晶学的データ及び改善統計学記録転向範囲：０．１度結晶検出除去：１１．６５cm 記録時間：９０秒記録総数：５４１＋５４１＋５４１＋８４１＝２４６４気泡寸法：６３．３１A、６３．５７A、６９．０６A、９０度、９０度、９０度。立体群：Ｐ２（１）２（１）２（１）総反射：６５５７２個別反射：４０６４８正の反射：３４４９７２シグマ選択後の正の反射：２８９６２総Ｒ−マージ（５〜１．５A）：４．２％分離後の完全性：分離分離シェルの％計２．９０６．００８５．３２６４８５．３２６４２．３５２．９０９５．２３３０９０．２２６１２．０６２．３５９１．３７６８９０．６０４９１．８８２．０６８３．５３２２８８．８６４２１．７５１．８８６８．６９５８８４．８７８４１．６５１．７５５０．７９９１７９．２８０４１．５７１．６５２８．７８９５７２．１６１１１．５０１．５７１４．５３４９６５．０３７６モデル改善（ｐ＝タンパク質、ｓ＝溶媒、ｊ＝阻害剤、ｒ＝剛体改善、ｃ＝Powell 共役勾配改善、ｔ＝Ｂ因子改善、ｂ＝結合、ａ＝角度）周期 ATOMS(p.s.i) %R因子(r.c.t)理想値からのRMS(b.a) １ 1630,23,0 28.7,27.2,23.4 0.007,1.97 ２ 1630,23,0 --,22.8,22.5 0.006,1.72 ３ 1630,23,34 --,21.7,21.5 0.007,1.74４ 1630,23,45 --,21.5,21.4 0.006,1.80 電子密度算出、解釈ＸＰＬＯＲ（Molecular Simulations Incorporated MSI AG，Basel Switzerla nd）を用いた構造的及びＢ因子改善後、Brookhavenデータバンク（ＩＴＬＤ，Ab ola，E.E.Bernstein，F.C.,Bryant，S.H.Koetzle，T.F. & Weng，J．（1987）in Crystallographic database-information Content.Software Systems,Scientif ic Applications，Allen．F.H.,Berghoff & G．Sievers，R.,eds.，Data Commis sion of the International Commission of the International Union of Cryst llography（Bonn/Cambridge/Chester，1987）,107-132））からのトリプシン（H .D.Bartunik，J．Summers，H.H.Bartsch,J．Mol．Bio．210,813,1989）の１．５ A分解Ｐ２（１）２（ｌ）２（１）Ｘ線構造を用いて、一次電子密度を同調させた。この密度は明らかに、阻害剤の一般配向を示した。さらに別の改善サイクルは密度を改善し、したがってＤ−Ｐｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｃｈｏｉ−Ａｄｃ中の塩基性基の結合性の確定を可能にした。さらに、阻害剤の他のすべての位置を同様に確定できたが、但し、オシラリンの一次フェニル環は、無秩序に結合すると思われる。実施例３：ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−Ｄ−Ｃｈａ−（Ｎ−シクロペンチル）−Ｇｌｙ−Ａｄｃ（ａ）４−オキソ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステル（J．Cooper et al.，J.Chem．Soc．Perkin Trans ．1,1993,1313-1318) ＴＨＦ１００ml中の水素化ナトリウム１．５８ｇ（６６mmol）の還流懸濁液に、ＴＨＦ１００mlに溶解したＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−グリシンエチルエステル１２．７９ｇ（６０mmol）及びエチルアクリレート７．１５ｇ（６６mmol）の溶液を滴下した。付加完了後、混合物を加熱し、さらに２時間還流した。透明溶液を室温に冷却し、１００mlエーテル／１００ml水上に注ぎ、１Ｎ塩酸とともに激しく攪拌しながらメチルオレンジを対照として酸性にした。層を分離させ、水性層をエーテルで３回抽出した。併合有機層を飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させた。残渣の短絡経路蒸留により４−オキソ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１− ｔｅｒｔブチルエステル３−エチルエステル１０．９２ｇ（７１％）を無色油として得た。沸点１１９〜１２２℃（０．２mbar）。これを冷凍庫内に長期間放置して、固化した。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０１１／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μｍフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃ ）。ｔ_R＝９．６８分ｍ／ｚ［％］＝１８５（２），１３０（１０），１１２（１８），８５（６），５７（１００）。ｂ）４−ヒドロキシ−ピロリジン−１．３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステルメタノール３０mlに溶解した４−オキソ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステル５．１５ｇ（２０mmol）の溶液に、シアノホウ水素化ナトリウム１．８８ｇ（３０mmol）及び少量のメチルオレンジを付加した。攪拌しながら、１Ｎ塩酸を滴下してｐＨを３に調整した（黄色から橙色に変色）。酸が消費されなくなってから、混合物を１時間攪拌した。溶媒を真空蒸発し、残渣を酢酸エチルと水の間に分配した。有機層を水で、次にブラインで２回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥して、蒸発させた。残留黄色油を、さらに精製せずに次の工程に用いた。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１２．４４分（ジアステレオマーの分離なし）ｍ／ｚ［％］＝２５９（Ｍ，０．３），２４１（０．７），２０２（５），１８６（７），１５８（１０），１１２（１４），６８（３１），５７（１００）。ｃ）４−ベンゾイルオキシ−ピロリジン−１．３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステルピリジン４０mlに溶解した上記の還元からの粗製４−ヒドロキシ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステル及びＤＭＡＰ２４４mg（２mmol）の氷冷溶液に、塩化ベンゾイル３．５１ｇ（２５mmol）を滴下した。付加完了後、氷浴を除去し、混合物を室温で２時間攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、氷上に注いだ。有機層を分離し、水、飽和ＣｕＳＯ₄、水及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。残留黄色油を、さらに精製せずに次の工程に用いた。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１７．２８及び１７．３８分（シス／トランス異性体の１：１混合物）ｍ／ｚ［％］＝３１８（０．１），２９０（５），２６２（２），２４１（２），１８５（２９），１４１（１０），１１２（２３），１０５（５３），７７（２７），６８（１００），５７（９７）。ｄ）２，５−ジヒドロ−ピロール−１．３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステルドライトルエン７５mlに溶解した上記のベンゾイル化からの粗製４−ベンゾイルオキシ−ピロリジン−１，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステルの溶液に、ＤＢＵ４．１１ｇ（２７mmol）を付加した。暗色異質混合物を室温で１６時間攪拌した。この後、出発物質はＴＬＣ及びＧＣ分析では検出されなかった。混合物をシリカ（石油エーテル／酢酸エチル１：１で溶離）の短カラムを通して濾過し、蒸発させた。残留淡黄色油をバルブ−バルブ蒸留により、２，５−ジヒドロ−ピロール−１．３ −ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステル４．１６ｇ（８６％）を無色油として得た。沸点１１０℃／０．２mbar。これを冷凍庫内に放置して、徐々に蝋状塊に固化した。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１１．９４分ｍ／ｚ［％］＝２４１（Ｍ，１．４），１９６（０．４），１８５（１１），１４０（１４），１１２（１７），６８（２４），５７（１００）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．２７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４３，１．４４［２ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］^a，４．２５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），４．１５−４．２７（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），６．６６−６．７１（ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ^a回転妨害により２組の信号。 ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ。，７５ＭＨｚ） δ＝１４．１６，１４．２０（ｑ，−ＣＨ₂−ＣＨ₃）^*，２８．４５［ｑ，− Ｃ（ＣＨ₃）₃］，５１．７６，５１．９９，５３．６２，５３．８４（４ｔ，Ｃ −２，Ｃ−５）^*，６０．６９（ｔ，−ＣＨ₂−ＣＨ₃），７９．８４［ｓ，−Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１３２．２９（ｓ，Ｃ−３），１３６．４４，１３６．５５（２ｄ，Ｃ−４）^*，１５３．８６，１５４．０８（２ｓ，−ＮＣＯＯ−）^*，１６２．７５（ｓ，ＣＯＯＥｔ）ｐｐｍ．ｅ）３−ヒドロキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル −７８℃に冷却したＴＨＦ５０mlに溶解した２，５−ジヒドロ−ピロール− １，３−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ．ブチルエステル３−エチルエステル５．４３ｇ（２２．５mmol）の溶液に、ヘキサンに溶解した１ＮＤＩＢＡＬ−Ｈ溶液５０mlを滴下した。混合物を一夜室温に暖めた。ＴＬＣ分析が出発物質の完全消費を示した時点で、混合物を氷浴中で冷却し、水１．９０ｇを注意深く付加した後、１５％水性ＮａＯＨ１．９０ｇ及び水５．７０ｇを付加した。白色沈殿物を濾し取り、エーテルで全体を洗浄して、併合濾液を蒸発させた。残留淡黄色油をバルブ−バルブ蒸留して、３−ヒドロキシメチル−２，５−ジヒドロ −ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル４．１３ｇ（９３％）を無色油として得た。沸点１３０℃（０．２mbar）。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１１．３４分ｍ／ｚ［％］＝１９９（Ｍ，１），１４３（１０），１４２（１３），１２６（１３），１１２（１２），８０（１０），６８（４５），５７（１００）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．４４（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ），４．０９（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，４−Ｈ），４．１８（ｂｒ，ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＯＨ），５．６３（ｂｒ，ｄ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２８．５［ｑ，−Ｃ（ＣＨ₃）₃］，５２．８，５３．０，５３．２，５３．３（４ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５）^*，５７．７，５９．８（２ｄ，Ｃ−ＣＨ₂ＯＨ）誤り！原文の記号は明らかでない。７９．５［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２０．０，１２０．３（２ｄ，Ｃ−４）誤り！原文の記号は明らかでない。１３９．６（ｓ，Ｃ−３），１５４．４（ｓ，ＣＯＯｔＢｕ）ｐｐｍ． ^*回転妨害による２組の信号ｆ）３−アセトキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステルピリジン５０mlに溶解した３−ヒドロキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル４．１３ｇ（２０．７mmol）及びＤＭＡＰ２４４mg（２mmol）の氷冷溶液に、無水酢酸３．０６ｇ（３０ mmol）を付加した。混合物を０℃で３０分間、次に室温でさらに６０分間攪拌した。混合物を氷上に注ぎ、エーテルで２回抽出した。併合有機層を真空蒸発し、エーテル中に溶解して、飽和ＣｕＳＯ₄、水及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥した。蒸発させ、バルブ−バルブ蒸留して、３−アセトキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル４．８２ｇ（９７％）を無色油として得た。沸点１０５℃（０．２mbar）。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１１．８７分ｍ／ｚ［％］＝２４１（Ｍ，０．２），２２６（０．１），１８５（５），１６６（５），１２５（１８），１０８（３），８１（１３），８０（２３），５７（１００）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．４３，１．４４［２ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］^*，２．０４，２．０６（２ｓ，３Ｈ，ＯＯＣＣＨ₃）^*，４．０５−４．１２（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２− Ｈ，５−Ｈ），４．６１（ｂｒ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ₂Ｏ），５．６６−５．７３（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２０．７（ｑ，ＯＯＣＣＨ₃），２８．４［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，５３．０，５３．２，５３．３（３ｔ，２−Ｃ，５−Ｃ）^*，６０．８（ｔ，ＣＨ₂ＯＡｃ），７９．５［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２３．４，１２３．８（２ｄ，Ｃ−４）^*，１３４．５，１３４．６（２ｓ，Ｃ−３），１５４．１（ｓ，ＮＣＯＯ），１７０．５（ｓ，ＯＯＣＣＨ₃）ｐｐｍ．ｇ）２−（１−ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル−メチル）−マロン酸ジメチルエステルジメチルマロネート５．２８ｇ（４０mmol）を、ＴＨＦ８０ml中の水素化ナトリウム８６４mg（３６mmol）の氷冷懸濁液に注意深く付加した。その結果生じた透明溶液をＴＨＦ４０mlに溶解した３−アセトキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル４．８２ｇ（２０mmol）及びＰｄ（ＰＰｈ₃）₄ ４６２mg（０．４mmol）の溶液に付加し、混合物を加熱して、２０時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、エーテルで希釈して、飽和ＮＨ₄Ｃｌで急冷した。有機層を飽和ＮＨ₄Ｃｌ及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル４：１〜２：１）により精製し、バルブ−バルブ蒸留して、２−（１−ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル−メチル）−マロン酸ジメチルエステル４．８６ｇ（７７％）を無色油として得た。沸点１３０℃／０．２mbar. ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１４．０７分ｍ／ｚ［％］＝３１３（Ｍ，０．１），２５７（２７），２４０（５），１２６（３５），８２（５９），８０（３８），５７（１００）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．４３，１．４４［２ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］^*，２．６８（ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂），３．５７［ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ（ＣＯＯＣＨ₃）₂ ］，３．７１，３．７２［２ｓ，６Ｈ，ＣＨ（ＣＯＯＣＨ₃）₂］，３．９７− ４．１０（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．４４（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４ −Ｈ）ＰＰｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２８．０，２８．１（２ｔ，３−ＣＨ₂−）誤り！原文の記号は明らかでない。２８．５［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，５０．１［ｄ，ＣＨ（ＣＯＯＭｅ）₂］，５２．７（ｑ，ＯＣＨ₃），５３．１，５３．３，５４．５，５４．９（４ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５）^*,７９．４［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２１．０（ｄ，Ｃ−４），１３５．８（ｓ，Ｃ−３），１５４．１（ｓ，ＮＣＯＯ），１６９．０（ｓ，ＣＯＯＭｅ）ｐｐｍ．ｈ）３−（２−メトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステルＤＭＦ１４０mlに溶解した２−（１−ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル−メチル）−マロン酸ジメチルエステル４．５２ｇ（１４．４mmol）の溶液に、水１．９４ｇ（１０８mmol）及び塩化ナトリウム１．２６ｇ（２１．６mmol）を付加した。混合物を脱泡し、アルゴン雰囲気下で１５０℃で３０時間加熱した。この期間の後、出発物質はＴＬＣでは検出されなかった。混合物を室温に冷却し、エーテル２００mlで希釈して、水で、次にブラインで３回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させた。バルブ−バルブ蒸留して精製し、３−（２−メトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル３．３８ｇ（９２％）を無色油として得た。沸点１３０℃（０．２mbar）．ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝１２．６３分ｍ／ｚ［％］＝２５５（Ｍ＋，０．２），１９９（４８），１９６（２），１８２（１０），１２６（２６），８２（５４），８０（３２），５７（１００）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１３．２，１３．２［２ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］^*，２．３０−２．３５，２．４０−２．４４（２ｍ,各々２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂），３．５８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃），３．９１−４．００（ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．２９−５．３４（ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ．¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２３．７，２３．８（ｔ，３−ＣＨ₂）^*，２８．２［ｑ，Ｃ（ＣＨ ₃ ）₃］，３１．７（ｔ，ＣＨ₂ＣＯＯＭｅ），５１．４（ｑ，ＣＯＯＣＨ₃），５２．８，５３．１，５４．４，５４．７（４ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５）^*，７８．９［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１１８．９（ｄ，Ｃ−４），１３７．８（ｓ，Ｃ−３），１５３．９（ｓ，ＮＣＯＯ），１７２．８（ｓ，ＣＯＯＣＨ₃）ｐｐｍ．ｉ）３−［２−（２，２，２−トリクロルエトキシカルボニル）−アミノ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステルＴＨＦ／メタノール／水３：１：１４５mlに溶解した３−（２−メトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル３．５７ｇ（１４mmol）の溶液に、ＬｉＯＨ＊Ｈ₂ Ｏ１．１８ｇ（２８mmol）を付加し、混合物を室温で１時間攪拌した。溶液を水で希釈し、酢酸エチルで３回洗浄した。水性層を氷浴中で冷却し、メチルオレンジを対照しながら１Ｎ塩酸で酸性にした。混濁混合物をエーテルで３回抽出し、併合有機層をＭｇＳＯ，上で乾燥して、蒸発させて、無色固体３．４１ｇを得た。これは放置すると暗色に変わった。粗製酸をドライトルエン１４０mlに溶解し、ジフェニルホスホリルアジド４．０６ｇ（１４mmol）及びトリエチルアミン１．４７ｇ（１４．５mmol）を付加した。混合物を一夜８０℃に加熱した。溶媒を真空除去し、残留褐色油をＴＨＦ２０mlに溶解して、２，２，２−トリクロロエタノール３．１４ｇ（２１mmol）及び少量の塩化第一銅を付加した。混合物を加熱して、２時間還流し、次に溶媒を蒸発させて、残渣をクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１〜２：１）により精製して、３−［２ −（２，２，２ −トリクロルエトキシカルボニル）−アミノ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル４．３１ｇ（７９％）を無色固体として得た。融点９７〜９８℃. ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，２００ＭＨｚ） δ＝１．４１［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．３１（ｂｒ，ｍ，２Ｈ，３− ＣＨ₂−），３．２９−３．３９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＮＨ），４．６７（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），５．４３（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５０ＭＨｚ） δ＝２８．６［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２９．２（ｔ，−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ），３９．２（ｔ，−ＣＨ₂ＣＨ₂−ＮＨ），５３．２，５３．４，５４．６，５４．９（４ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），７４．５（ｄ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），７９．５［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃]，９５．８（ｓ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），１２０．８，１２１．０（２ｄ，Ｃ−４），１３６．３（ｓ，Ｃ−３），１５４．２，１５４．６（２ｓ，ＮＣＯＯ）ｐｐｍ．ｊ）３−［２−（２，２，２−トリクロルエトキシカルボニル）−アミノ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンドライジオキサン１０mlに溶解した３−［２−（２，２，２−トリクロルエトキシカルボニル）−アミノ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．ブチルエステル１．９３６ｇ（５mmol）の氷冷溶液に、ジオキサン中の４Ｎ塩化水素１０mlを付加した。混合物を４℃で１６時間放置した。次に溶媒を加熱せずに真空蒸発させた後、高真空排気した。残渣をドライアセトニトリル２０mlに懸濁し、エチルジイソプロピルアミン７１１mg（５．５mmol）、その後Ｎ，Ｎ−ビス−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン１．６１４ mg（５．２ mmol）を付加した。透明溶液を室温で２時間攪拌し、次に溶媒を蒸留して、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１〜２：１）により精製し、無色固体２．２３４ｇ（８４％）を得た。融点１２１〜１２３℃。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，２００ＭＨｚ） δ＝１．４３［ｓ，１８Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．２７−２．３３（ｂｒ，ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂−），３．３８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＮＨ），４．３１（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），５．４７（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５０ＭＨｚ） δ＝２８．０，２８．１［２ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２９．０（ｔ，３−ＣＨ₂ ），３９．０（ｔ，ＣＨ₂−ＮＨ），５５．４，５６．０（２ｂｒ，ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），７４．５（ｄ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），７９．５，８２．０［２Ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，９５．６（ｓ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），１１９．９（ｄ，Ｃ−４），１３５．３（ｓ，Ｃ−３），１５０．４，１５４．０（４ｓ，ＮＣＯＯ，Ｎ＝Ｃ−Ｎ）ｐｐｍ．ｋ）３−（２−アミノ−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン氷酢酸２０mlに溶解した３−［２−（２，２，２−トリクロルエトキシカルボニル）−アミノ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ −ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン２．２３４ｇ（４．２２mmol）の溶液に、活性化亜鉛１．３１ｇ（４０ｇ−原子）を付加し、混合物をセライトを通して濾過し、メタノールで十分洗浄して、濾液を真空濃縮した。残渣を水に溶解して、固体水酸化ナトリウムで強アルカリ性にした。水性層をエーテルで３回抽出し、併合有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させて、３−（２−アミノ−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン６２２mg（４１％）を淡黄色非晶質固体として得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．４５［ｓ，１８Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．２１−２．２６（ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂−），２．８３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ₂ＮＨ₂），４．２８−４．３４（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．４６（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２７．８５，２７．９４［２ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３２．２（ｔ，３−ＣＨ₂），３９．５（ｔ，ＣＨ₂ＮＨ₂），５５．２，５６．７（２ｔ，Ｃ−２，Ｃ −５),約８１［ｂｒ，ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１１９．０（ｄ，Ｃ−４），１３６．１（ｓ，Ｃ−３），１５３．７（ｓ，ＮＣ００）ｐｐｍ．１）ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−Ｄ−Ｃｈａ−（Ｎ−シクロペンチル）−Ｇｌｙ−ＡｄｃドライＤＭＦ２５ml中のＮ−（ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル）−Ｎ− （ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル−メチル）−（Ｄ）−シクロヘキシルアラニル−Ｎ−シクロペンチルグリシン１．４１ｇ（０．８１mmol）、ジイソプロピルメチルアミン０．１５ml（０．９mmol）及びＴＢＴＵ０．２９ｇ（０．９mmol）の混合物を、室温で３０分間攪拌した。次に３−（２−アミノ−エチル）−２，５− ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン０．３ｇ（０．８５mmol）を付加し、７０時間攪拌した。溶媒を真空除去し、水を付加して、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを分離し、１ M.塩酸及び５％水性重炭酸ナトリウムで洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過し、溶媒を真空除去して、Ｎ−（２−｛［１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル）−カルボキサミジノ］−２，５−ジヒドロ−ピロール− ３−イル｝−エチル）−［Ｎ−（ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル）−Ｎ−（ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル−メチル）−Ｄ−シクロヘキシルアラニル− （Ｎ−シクロペンチルグリシン）］アミド０．３５ｇ（５１％）を無色油として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ８４７ＭＨ．ジオキサン中の４Ｎ塩化水素１０mlに溶解した上記の生成物（０．３５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液を５℃で２４時間貯蔵した。溶媒を真空除去し、油性残渣をジエチルエーテルで粉砕して、表題化合物を塩酸塩として定量的に得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ４９１ＭＨ． ¹Ｈ−ＮＭＲ（ｄ₆−ＤＭＳＯ，２５０ＭＨｚ） δ＝０．８−４．８ｐｐｍ（ｍ，広），５．６８（ｓ，１）．実施例４：Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｄｃ実施例３１に記載したのと同じ方法により、Ｂｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−ＯＨ（Bajusz et al.，J．Med．Chem．1990,33,1729-1735）及び３−（２−アミノ−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル）カルボキサミジン（実施例３ｋ）から、表題化合物を塩酸塩として合成した。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１２ＭＨ．実施例５：ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−Ｄ−Ｃｈａ−Ｐｒｏ−Ａｄｃ実施例３１に記載したのと同じ方法により、Ｎ−（ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニルメチル）−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−Ｐｒｏ−ＯＨ及び３−（２−アミノ−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．ブトキシカルボニル）カルボキサミジン（実施例３ｋ）から、表題化合物を塩酸塩として合成した。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ４６３ＭＨ．実施例６：１−｛３−［２−（１−アミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３− イル）−エチル］−２−オキソ−オキサゾリジン−５−イルメチル｝−ピペリジン−４−カルボン酸（ａ）トルエン１５ml及び濃水酸化ナトリウム溶液１５ml中のピペリジン −４−カルボン酸エチルエステル３．１ｇ及び臭化テトラブチルアンモニウム０．１ｇの混合物を室温で４時間攪拌し、その後、水５０mlと混合した。有機相を分離し、水性相を塩化メチレン毎回２０mlで３回振盪して、併合有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を真空除去した。（ｒａｃ）−１−オキシラン−２−イルメチルピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル２．１ｇを得た。ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２１３Ｍ⁺. ｂ）エタノール２０mlに溶解した実施例３ｋ）で調製したアミン３ｇ及び７ａ）で生成したオキシラン１．７３ｇの溶液を、還流しながら４８時間加熱した。その後、エタノールを真空除去し、残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／飽和メタノール性アンモニア８５／１５）により精製した。１-｛３−［２−（１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）− エチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロピル｝−ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル１．５ｇをこの方法で得た。ｃ）ジメチルホルムアミド５mlに溶解したアミノアルコール７ｂ）０．５ｇ及びカルボニルジイミダゾール０．４ｇの溶液を室温で２４時間攪拌した。その後、反応溶液を蒸発させて濃縮乾燥し、残渣を分取ＨＰＬＣ（Merck，Selec t B,メタノール／緩衝液（ｐＨ＝７．５）６５／３５）により精製した。１−｛３−［２−（１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−エチルアミノ］− ２−ヒドロキシ−プロピル｝−ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル０．３５ｇをこの方法で得た。ｄ）メタノール５mlに溶解したエチルエステル６ｃ）０．３５ｇ及び１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２mlの溶液を室温で１時間攪拌した。その後、メタノールを真空除去し、残渣をジオキサン中の４M ＨＣｌで室温で３時間処理した。次に溶媒を除去して真空乾燥した。表題化合物０．２ｇを塩酸塩として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ３６６［ＭＨ］．実施例７：Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒａ）３−（２−ベンズヒドリリデンアミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．−ブチルエステルＴＨＦ１０ml中のヘキサメチルジシラザン１．７７ｇ（１１mmol）及びｎ −ブチル−リチウム（ヘキサン中２．２９mmol/g)４．８０ｇ（１１mmol）から０℃で新たに調製し、−７８℃に冷却したリチウムヘキサメチルジシラジドの溶液に、ＴＨＦ１０mlに溶解したエチルＮ−（ジフェニルメチレン）−グリシネート３．０６ｇ（１１mmol）の溶液を滴下した。深橙色エノラート溶液をこの温度で３０分間攪拌し、次に、ＴＨＦ１０mlに溶解した実施例３ｆ）からの３ −アセトキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ． −ブチルエステル２．４１ｇ（１０mmol）及びＰｄ（ＰＰｈ₃）₄ ４２６mg（０．４mmol）の溶液を滴下した。混合物を一夜室温に暖めて、次にエーテルで希釈して、飽和重炭酸ナトリウムを付加して急冷した。水性層をエーテルで抽出し、併合有機層をブラインで洗浄して、ＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させた。残留油のフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１＋１％トリエチルアミンで溶離）により、３−（２−ベンズヒドリリデンアミノ− ２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．−ブチルエステル３．９１ｇ（８１％）を淡黄色油として得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３０ＯＭＨｚ） δ＝１．２７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４３［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．６６−２．７６（ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂−），３．７３−３．９９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−Ｎ），４．０４−４．０９（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ ＣＨ₃），５．４２（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ），７．１１−７．８１（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝１４．２（ｑ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），２８．５［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３３．１（ｔ，３−ＣＨ₂），５２．９，５５．１（２ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），６１．１（ｔ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），６３．９（ｄ，ＣＨ−ＮＨ₂），７９．１［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２１．９（ｄ，Ｃ−４），１２７．７，１２８．１，１２８．３，１２８．４，１２８．５，１２８．７（６ｄ，Ａｒ−ＣＨ），１３５．７，１３５．８（２ｓ，Ａｒ−Ｃ），１３９．３（ｓ，Ｃ−３），１５４．１（ｓ，ＮＣＯＯ），１７０．８（ｓ，Ｎ＝ＣＰｈ₂），１７１．２（ｓ，ＯＣＯＣＨ₂ＣＨ₃ ）ｐｐｍ．ｂ）３−（２−アミノ−２−エトキシカルボニル一エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル８０％エタノールに溶解した塩酸メトキシルアミンの０．５M溶液２５mlに、クロロホルム５mlに溶解した３−（２−ベンズヒドリリデンアミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．−ブチルエステル４４８mg（１mmol）の溶液を付加した。５分後、ＴＬＣ分析は、出発物質の完全消費を示した。混合物をさらに３０分間攪拌し、次に蒸発、乾燥した。残渣を水に溶解し、エーテルで２回洗浄した。１Ｎ水酸化カリウムを付加して水性層をアルカリ性にし、エーテルで３回抽出した。併合有機抽出物をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させて、３− （２−アミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール −１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル２１４mg（７５％）を生成し、これをＧＣにより精製した。ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ５８９０ＩＩ／ＨＰ５９７２；カラム：ＨＰ５，３０m x ２５mm ｘ０．２５μmフィルム厚、担体ガス：ヘリウム；温度勾配：５０℃３分間、次に２０℃／分〜２５０℃）。ｔ_R＝13．８４分ｍ／ｚ［％］＝２２７（Ｍ−Ｃ₄Ｈ₉，＜１），２１１（７），１８２（１０），１５５（１１），１３７（６），１２６（５６），１０８（１８），９４（２３），８２（１００），７４（２０），５７（９２）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．２３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４２［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．３５（ｄｄ，２Ｊ＝１４．２Ｈｚ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_aＨ_bＣＨＮＨ₂），２．５０−２．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_aＨ_bＣＨＮＨ₂ ），３．５４（ｄｄ，Ｊ＝８，５．５Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＮＨ₂），４．０２−４．１１（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），４．１３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），５．５１（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝１４．１（ｑ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），２８．５［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３４．５（ｔ，３−ＣＨ₂），５２．９（ｄ，ＣＨ−ＮＨ₂），５３．０，５４．８（２ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），６１．０（ｔ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），７９．３［ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２２．２（ｄ，Ｃ− ４），１３５．５（ｓ，Ｃ−３），１５４．１（ｓ，ＮＣＯＯ），１７５．０（ｓ，ＯＣＯＣＨ₂ＣＨ₃）ｐｐｍ．ｃ）３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２ −エトキシカルボニル−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸 −ｔｅｒｔ．−ブチルエステル塩化メチレン２mlに溶解した３−（２−アミノ−２−エトキシカルボニル− エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル２１４mg（０．７５mmol）及びピリジン１１９mg（１．５mmol）の氷冷溶液に、少量のＤＭＡＰを、その後塩化２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル２１２mg（１mmol）を付加した。混合物をエーテルで希釈し、水、飽和ＣｕＳＯ₄、水及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１で溶離）により残渣を精製して、３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２−エトキシカルボニル−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸−ｔｅｒｔ．−ブチルエステル３２０mg（９３％）を無色油として得た。これを直ちに次の工程に用いた。ｄ）３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２ −エトキシカルボニル−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’ −ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンドライジオキサン１．５mlに溶解した３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２−エトキシカルボニル−エチル］−２，５− ジヒドロピロール−１−カルボン酸−ｔｅｒｔ．−ブチルエステル３２０mg（０．６７mmol）の氷冷溶液に、ジオキサン中の４Ｎ塩化水素１．５mlを付加した。混合物を４℃で１６時間放置した。次に溶媒を加熱せずに真空蒸発した。残渣をドライアセトニトリル４ml中に懸濁し、エチルジイソプロピルアミン２１７mg（０．７mmol）を、その後Ｎ，Ｎ’ −ビス−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン９７mg（０．７５mmol）を付加した。その結果生じた透明溶液を室温で２時間攪拌し、次に溶媒を蒸留して除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１〜２：１）により精製して、無色気泡体３８０mg（９４％）を得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，２００ＭＨｚ） δ＝１．２１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４３［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．５３−２．６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨＮＨ），４．１６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），４．２９（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），５．５２−５．６１（ｍ，３Ｈ，−ＣＨＮＨ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５０ＭＨｚ） δ＝１４．１（ｑ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），２８．０，２８．２［２ｑ，Ｃ（ＣＨ₃ ）₃］，３１．８（ｔ，３−ＣＨ₂），５２．９（ｄ，ＣＨＮＨ₂），５５．４，５７．１（２ｂｒ，ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），６１．９（ｔ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），７４．７［ｔ，ＣＨ₂ＣＣＩ₃］，７９．５，８３．５［２ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，９５．３（ｓ，ＣＨ₂ＣＣｌ₃），１２１．４（ｄ，Ｃ−４），１３３．３（ｓ，Ｃ −３），１５４．０（ｓ，ＮＣＯＯ），１７１．１（ｓ，ＣＯＯＥｔ）ｐｐｍ．（ＢＯＣ−ＮＣＯＯ−及びアミジン−Ｎ−Ｃ＝Ｎ−信号はライン幅拡張のために見えない）ｅ）３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２ −カルボキシ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンＴＨＦ／メタノール／水３：１：１４mlに溶解した３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２−エトキシカルボニル一エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン２１９mg（０．３６mmol）の溶液に、ＬｉＯＨ＊Ｈ₂Ｏ３０mg（０．７２mmol）を付加した。室温で２時間攪拌後、出発物質はＴＬＣにより検出されなかった。混合物を水で希釈し、１Ｎ塩化水素を付加して酸性にして、酢酸エチルで３回抽出した。併合有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（エーテル＋１％酢酸で溶離）により精製して、３−［２−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル−アミノ）−２−カルボキシ−エチル］−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン（Ｔｒｏｃ −Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）−ＯＨ）１５６mg（７６％）を無色非晶質固体として得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，２５０ＭＨｚ） δ＝１．４２［ｓ，１８Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．５８−２．７９（ｂｒ，ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＨＮＨ），４．３０−４．３８（ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_aＨ_bＣＣｌ₃），４．７５（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_aＨ_bＣＣｌ₃），５．５３（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），５．９９（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ．ｆ）Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ出発物質としてＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−トリチル−ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼン樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＴＣＰ、負荷：０．５７mmol/g、 PepChem，Tubingen）を用いて、０．３mmolスケールで、ＳｙＲｏＩＩ多種ペプチド合成機（MultiSynTech，Bochum）上で、固相法により、表題化合物を合成した。タンパク質原性アミノ酸Ｇｌｙ及びＡｓｐのαアミノ基は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）により、Ａｓｐの側鎖カルボキシ基はｔｅｒｔ−ブチルにより保護された。非タンパク質原性アミノ酸Ａｄａを、Ｔｒｏｃ−Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）−ＯＨ（実施例８ｅから）として用いた。Ｆｍｏｃ−保護化アミノ酸をＤＭＦ中で３０分間、６倍余分にカップリングさせた。ＴＢＴＵ（１当量）及びＮＮＭ（１当量）を活性化試薬として用いた。ピペリジン／ジメチルホルムアミド（１：１ v/v）中で２ｘ１０分間、Ｆｍｏｃ基の開裂を実行した。Ｔｒｏｃ−Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）−ＯＨのカップリングは、０．０４８mmolの保護化アミノ酸（１．６５倍余分量）並びに活性化のために等量のＴＢＴＵ及びＮＭＭを用いて、１時間以内にＤＭＦ中で手動で実施した。２時間以内に、酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（３０：１０：７０）を用いて、ペプチドを樹脂から切り離した。混合物を同一溶媒１５０μ ｌで５回洗浄後、濾液併合し、ヘプタン１０mlで釈して、濃縮した。酢酸を完全に除去するために、この操作を２回反復した。油性残渣をジオキサン中の４Ｎ塩化水素５mlに溶解した。この溶液に、エタンジチオール２７０μｌを付加し、混合物を室温で３時間攪拌した。次に溶媒を除去し、残渣をヘプタンに溶解して、エタンジチオールがほぼ完全に除去されるまで数回濃縮した。粗製ぺプチドをｔｅｒｔ−ブタノール／水（１：１）から凍結乾燥して、Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ・ＨＣ１１５mgを白色凍結乾燥物として得た。アミノ酸分析：Ｇｌｙ１．０９（１），Ａｓｐ１．００（１），Ｓｅｒ０．９５（１）；ペプチド含量：６９．９％ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６３１．１Ｍ⁺．実施例８：Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＴｒｐＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＴＣＰ樹脂５０mg（０．０３mmol）から出発して、実施例７ｆ）と同様の方法で、表題ペプチドを調製した。Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−ＨＣl １６mgを白色凍結乾燥物として得た。アミノ酸分析：Ｇｌｙ１．１９（１），Ａｓｐ０．０８（１），Ｔｒｐ１．００（１）；ペプチド含量：６１．２％ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ７３０．２Ｍ⁺．実施例９：Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＰｈｅＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＴＣＰ樹脂５０mg（０．０３mmol）から出発して、実施例７ｆ）と同様の方法で、表題ペプチドを調製した。Ｔｒｏｃ−Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＨＣl １４mgを白色凍結乾燥物として得た。アミノ酸分析：Ｇｌｙ１．０８（１），Ａｓｐ１．００（１），Ｐｈｅ０．９３（１）；ペプチド含量：６５．０％ｐｏｓ．ＬＳＩＭＳ：ｍ／ｚ６９２．１ＭＨ⁺. 実施例７〜９の化合物のＴｒｏｃ保護基は、標準化学反応により除去し得る。実施例１０：Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒａ）３−アセトキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−（Ｎ，Ｎ’− ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンドライジオキサン１0mlに溶解した実施例３ｆ）からの３−アセトキシメチル−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ．−ブチルエステル１．２１ｇ（５mmol）の氷冷溶液に、ジオキサン中の４Ｎ塩化水素１０mlを付加した。混合物を０℃で１６時間攪拌した。混合物を加熱せずに蒸発乾燥した後、高真空中で数時間排気した。暗色残渣をドライアセトニトリル２０ml中に懸濁し、エチルジイソプロピルアミン７７６mg（６mmol）を、次にＮ，Ｎ’−ビス−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル−１Ｈ−ピラゾール− １−カルボキサミジン１．７１ｇ（５．５mmol）を付加した。混合物を室温で２時間攪拌後、蒸発させて、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１〜２：１）により精製して、３−アセトキシメチル−２，５− ジヒドロ−ピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン１．８７ｇ（９７％）を無色粘性固体として得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．４５（ｓ，１８Ｈ，２ｔ−Ｂｕ），４．８３（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２− Ｈ，５−Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＯＡｃ），５．７２（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ），１０．２２（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，ＮＨ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２０．４（ｑ，ＯＯＣＣＨ₃），２７．７，２７．９［２ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃ ］，５５．０（ｂｒ，ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），６０．２（ｔ，ＣＨ₂ＯＡｃ），７９．３，８１．８（２ｂｒ，ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２２．４（ｄ，Ｃ−４），１３３．５（ｓ，Ｃ−３），１５０（ｂｒ，ｓ，ＮＣＯＯ），１５３．９（ｓ，ＮＣ＝Ｎ），１６２（ｂｒ，ｓ，Ｎ＝ＣＯＯ），１７０．２（ｓ，ＯＯＣＨ₂ ＣＨ₃）ｐｐｍ．ｂ）３−（２−ベンズヒドリリデンアミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンＴＨＦ８ml中のヘキサメチルジシラザン７１０mg（４．４mmol）及びｎ− ブチル−リチウム（ヘキサン中２．２９mmol/g) １．９２ｇ（４．４mmol）から０℃で新たに調製し、−７８℃に冷却したリチウムヘキサメチルジシラジドの溶液に、ＴＨＦ８mlに溶解したエチルＮ−（ジフェニルメチレン）−グリシネート１．０６９ｇ（４mmol）の溶液を付加した。橙色エノラート溶液を−７８ ℃で３０分間攪拌し、次に、ＴＨＦ１２mlに溶解した３−アセトキシメチル− ２，５−ジヒドロ−ピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン１．０３９ｇ（３．７mmol）及びＰｄ（ＰＰｈ₃）₄ ４２６mg（０．４mmol）の溶液を滴下した。反応混合物を２時間室温に暖めて、さらに１２時間攪拌した。混合物をエーテルで希釈して、飽和ＮａＨＣＯ₃を付加して急冷した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃及びブラインで洗浄して、ＭｇＳＯ₄上で乾燥して、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル１：５＋１％トリエチルアミンで溶離）処理により精製し、３ −（２−ベンズヒドリリデンアミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン１．０３ｇ（４７％）を無色非晶質固体として得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．２３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４６［ｂｒ，ｓ，１８Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．６８（ｂｒ，ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂−），３．９６（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，ＣＨ− Ｎ），４．１５（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），４．１６−４．２９（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．４１（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ），７．０７−７．６０（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝１３．９（ｑ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），２８．０［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３２．５（ｔ，３−ＣＨ₂，５５．２，５６．９（２ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），６０．９（ｔ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），６３．６（ｄ，ＣＨ−ＮＨ₂），７９，８１．６［２ｂｒ，ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，１２０．７（ｄ，Ｃ−４），１２７．５，１２７．８，１２８．４，１２８．５，１２８．６，１３０．２（６ｄ，Ａｒ−ＣＨ），１３４．８（ｓ，Ｃ−３），１３５．８，１３９．１（２ｓ，Ａｒ−Ｃ），１５０（ｂｒ，ｓ，ＮＣＯＯ），１５３．７（ｓ，ＮＣ＝Ｎ），１６２（ｂｒ，ｓ，ＮＣＯＯ），１７０．７（ｓ，Ｎ＝ＣＰｈ₂），１７１．２（ｓ，ＯＯＣＨ₂ＣＨ₃ ）ｐｐｍ．ｃ）３−（２−アミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンＴＨＦ２mlに溶解した３−（２−ベンズヒドリリデンアミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン１１８mg（０．２mmol）の溶液に、１Ｎ塩酸１mlを付加した。混合物を室温で３０分間攪拌した。水（５ml ）を付加し、水性層を分離して、エーテルで２回洗浄した。１ＮＮａＨＣＯ₃ を付加して水性層をｐＨ＝８．５とし、エーテルで５回抽出した。併合エーテル層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール２０：１）により精製して、３−（２−アミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ− ブトキシカルボニル）カルボキサミジン７９mg（９３％）を無色油として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．２２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４５［ｓ，１８Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．３３（ｄｄ，２Ｊ＝１６．６Ｈｚ，３Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_aＨ_bＣＨＮＨ₂），２．５４（ｄｄ，２Ｊ＝１６．６Ｈｚ，３Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ_aＨ_bＣＨＮＨ₂），３．５４（ｄｄ，３Ｊ＝８．１，５．３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ．Ｈ，ＣＨＮＨ₂），４．１３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），４．３３（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．５３（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝１３．９（ｑ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），２７．９［ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３４．１（ｔ，３−ＣＨ₂），５２．７（ｄ，ＣＨＮＨ₂），５５．３，５６．９（２ｄ，Ｃ−２，Ｃ−５），６１．１（ｔ，ＯＣＨ₂ ＣＨ₃），約８０［２ｂｒ，ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］,１２０．７（ｄ，Ｃ−４），１３４．６（ｓ，Ｃ−３），１５３．８（ｓ，ＮＣ＝Ｎ），１７４．６（ｓ，ＯＯＣＨ₂ＣＨ₃）ｐｐｍ．ｄ）３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニルーアミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ −ブトキシカルボニル）カルボキサミジンドライアセトニトリル１mlに溶解した３−（２−アミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１− （Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン７９mg （０．１９mmol）の溶液に、エチルジイソプロピルアミン４０mg（０．３mmol ）及びジ−ｔｅｒｔ．−ブチルジカルボネート（Ｂｏｃ₂Ｏ）６５mg（０．３m mol）を付加し、混合物を室温で１６時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル２：ｌ）により精製して、３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル−アミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ −ブトキシカルボニル）カルボキサミジン８３mg（７６％）を無色油として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，２００ＭＨｚ） δ＝１．２２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１．４２，１．４７，1．４８［３ｓ，各々９Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．４１−２．６６（ｂｒ，ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃ ），４．３２（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．０２（ｂｒ，ｍ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），５．５２（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，５０ＭＨｚ） δ＝１４．１（ｑ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），２８．１，２８．３，２８．５［３ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３１．８（ｔ，３−ＣＨ₂），４８．３（ｄ，ＣＨＮＨ），５２．０，５５．３（２ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），６１．６（ｔ，ＯＣＨ₂ＣＨ₃），１２１．３（ｄ，Ｃ−４），１３３．５（ｓ，Ｃ−３），１５３．９（ｓ，ＮＣ＝Ｎ），１７１．８（ｓ，ＣＯＯＥｔ）ｐｐｍ．ＮＣＯＯ−，Ｃ（ＣＨ₃）₃信号はライン拡張のために見えない。ｅ）３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル−アミノ−２− カルボキシ−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジンＴＨＦ／メタノール／水３：１：１５mlに溶解した３−（２−ｔｅｒｔ． −ブトキシカルボニル−アミノ−２−エトキシカルボニル−エチル）−２，５− ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’ −ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン２６７mg（０．６３mmol）の溶液に、ＬｉＯＨ＊Ｈ₂Ｏ５０mg（１．２２mmol）を付加した。室温で３０分間攪拌後、出発物質はＴＬＣにより検出されなかった。混合物を１ＮＨＣ１を付加して酸性にし、水で希釈して、エーテルで３回抽出した。併合有機抽出物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄ 上で乾燥して、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル−アミノ−２−カルボキシ−エチル）−２，５−ジヒドロピロール−１−（Ｎ，Ｎ’−ジ−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル）カルボキサミジン（Ｂｏｃ−Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）−ＯＨ）９８m g（３１％）を無色非晶質固体として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ＭＨｚ） δ＝１．３９，１．４４［２ｓ，９Ｈ，１８Ｈ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，２．４９− ２．６７（ｂｒ，ｍ，２Ｈ，３−ＣＨ₂），４．３３（ｂｒ，ｍ，４Ｈ，２−Ｈ，５−Ｈ），５．３０（ｂｒ，ｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），５．５６（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，４−Ｈ）ｐｐｍ． ¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ＭＨｚ） δ＝２７．７，２８．９，２８．０［３ｑ，Ｃ（ＣＨ₃）₃］，３１．３（ｔ，３−ＣＨ₂），５２．０（ｄ，ＣＨＮＨ），５５．３，５６．９（２ｔ，Ｃ−２，Ｃ−５），８０．０，８０．９（２ｓ，Ｃ（ＣＨ₃）₃），１２１．１（ｄ，Ｃ −４），１３３．６（ｓ，Ｃ−３），１５３．２（ｓ，Ｎ＝ＣＮ），１５５．２（ｂｒ，ｓ，ＮＣＯＯ），１７６．５（ｓ，ＣＯＯＨ）ｐｐｍ．ｆ）Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＴｙｒＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＴＣＰ樹脂５０mg（０．０３mmol）から出発して、実施例８ｆ）と同様の方法で、表題ペプチドを調製した。Ｔｒｏｃ−Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）−ＯＨの代わりに、実施例１２ｅ）からのＢｏｃ−Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）− ＯＨをＮ末端アミノ酸のために用いた。Ａｄａ−Ｇ１ｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＨＣｌ１２mgを白色凍結乾燥物として得た。アミノ酸分析：Ｇｌｙ１．０５（１），Ａｓｐ０．９６（１），Ｔｙｒ１．００（１）；ペプチド含量：６１．１％ｐｏｓ．ＬＳＩＭＳ：ｍ／ｚ５３４．３ＭＨ⁺. 実施例１１：Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂ 出発物質としてトリチルクロリド−ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼン（ＴＣＰ：負荷：０．９６mmol/g；PepChem.Tubingen）及びＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（NovaBiochem．Laufelfingen）を用いて、ＡＣＴ９０自動ペプチド合成機（Advanced ChemTec．Louisville，Kentucky）で固相法により、表題化合物を合成した。Ｆｍｏｃ−保護化ジペプチドアミド（３２０．４ｍｇ；０．７２ mmol）をジクロロメタン４mlに溶解した。１当量Ｎ−メチル−モルホリン（ＮＭＭ）を付加後、溶液をドライＴＣＰ樹脂４４４mg（０．４８mmol）に投入した。５分後、さらに１３０μｌのＮＭＭを付加して、溶液中のＮＭＭの送料を．８０mmolとした。混合物をさらに６０分間振盪した。次に、メタノール０．５ mlを付加して、残留トリチルクロリド基をキャップした。さらに２０分後、樹脂を濾し取って、ジクロロメタン、ＤＭＦ及びメタノールで洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した。樹脂の負荷は、０．０５７mmol/gであると確定された。ピペリジン／ジメチルホルムアミド（１：１ v/v）で２ｘ１０分間処理して、Ｆｍｏｃ基を除去した。その後３０分以内に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをカップリングした。その後３０分以内に、ＴＢＴＵ（１当量）及びＮＭＭ（１当量）を活性化剤として用いて、２回のカップリング操作で。３０倍余分に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをカップリングさせた。上記と同様の操作でＦｍｏｃ基を除去後、Ｂｏｃ−Ａｄａ（Ｂｏｃ₂）−ＯＨを、２．５倍余分量の保護化アミノ酸並びに活性化のための等量のＴＢＴＵ及びＮＭＭを用いて、１７時間以内にＤＭＦ中で手動でカップリングさせた。樹脂からの切り離し及びペプチドの脱保護化は、実施例８ｆ）にしたがって実施した。ヘプタンの代わりにトリフルオロエタノール（２ml）を用いて、脱保護化ペプチドを溶解させた。ジエチルエーテル１６mlを付加して、この溶液から粗製ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、上清を捨て、沈殿物をｔｅｒｔ−ブタノール／水（１：１ v/v）から凍結乾燥した。Ａｄａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂・ＨＣｌ（２８mg）を白色凍結乾燥物として得た。アミノ酸分析：Ｇｌｙ１．０５（１），Ａｓｐ１．０３（１），Ｐｈｅ０．９７（１）；ペプチド含量：６７．４％ｐｏｓ．ＬＳＩＭＳ：ｍ／ｚ５０２．３ＭＨ⁺. 実施例１２：薬理学的実験の説明トロンビン時間臨床的凝固診断の一般的試験は、トロンビン時間である。このパラメーターは、フィブリノーゲンに及ぼすトロンビンの作用及び血餅の形成を検出する。トロンビンの阻害剤は、トロンビン時間の増大を引き起こす。血漿を採取するために、健常ドナーからの新鮮な血液９部をクエン酸ナトリウム溶液（０．１１mol/l）１部と混合し、室温で１０分間、約３０００rpmで遠心分離した。ピペットで血漿を取り出し、室温で約８時間保存し得る。クエン酸塩血漿２００μｌを球形凝固器（ＫＣ１０，AmelungCompany）中で３７℃で２分間インキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＤＭＳＯに溶解した活性物質の溶液１０μｌを予熱トロンビン試薬（Boehringer Mannheim，GmbH;約３U/mlウマトロンビン及び０．０１２５M Ｃａ2⁺を含有）１９０μｌに付加した。この２００μｌ溶液を血漿に付加した時にストップウォッチを押して、凝固が始まる時点を測定した。対照測定では、トロンビン時間は約２４秒で、濃度によって実施例３の化合物により増大された（試験濃度／トロンビン時間の増大：５μＭ／＞３００＊秒，０．５μM／９６秒，０．０５μM／９秒）［＊５分後に実験を中止した］。トロンビン阻害総容量１mlのポリスチレン半微量キュベット中で、基質Ｈ−（Ｄ）−Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２２３８Ｋａｂｉ）及びヒトトロンビン（Sigma, 特異活性＝２１５０ＮＩＨ−単位／mg）を用いて、ｐＨ＝７．５で、２５℃で、０．２M塩化ナトリウム及び０．５％ポリエチレングリコール６０００を含有する０．１Mリン酸塩緩衝液中で、動態測定を実施した。予備実験では、式（Ｉ）の化合物がトロンビンを迅速に阻害するか又は徐々に阻害するかを測定した。このために、先ず、０．０３ＮＩＨ単位のトロンビンを基質及び活性物質の１００μM溶液に付加することにより、反応を開始した。第二の実験では、５分間インキュベートしておいたトロンビンと活性物質の溶液に基質を付加した。時間に伴うｐ−ニトロアニリドの濃度の増大を、４０５nm（ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計 Lamda-2、Perkin-ElmerCompany）で１２分間、分光光度測定によりモニタリングした。両方の実験で得られた測定曲線は線状で平行であり、式（Ｉ）の活性物質は迅速トロンビン阻害剤である。阻害定数Ｋｉは、以下のように確定した：基質を１００μM、５０μM、３０μM、２０ μMの濃度で付加し、各基質濃度で、阻害剤を用いずに測定を実施し、３つの測定は種々の濃度の式（Ｉ）の阻害剤の存在下で実施した。反応は、トロンビンの付加により開始された。ｐ−ニトロアニリドの形成により引き起こされる４０５ nmでの吸光度の増大を、１２分間の間監視した。測定点（時間対吸光度）を２０秒間隔でＰＣに移した。速度Ｖ０（阻害剤を用いない場合の秒測定値当たりの吸光度の変化）及びＶｉ（阻害剤を用いた場合の測定値）は、線状回帰によりデータから確定した。基質濃度が１５％未満に低減された場合には、各測定値の一部のみを用いた。一測定シリーズ（一定阻害剤濃度、可変性基質濃度）から、Ｋｍ’及びＶｍａｘを下記の等式に対する非線状適合により確定した：最後に、Ｋｉは、下記の等式に対する非線状適合により、測定値の全シリーズから確定した：ミカエリス定数Ｋｍは、全測定値で３．８＋２μMであった。実施例４の化合物はトロンビンを阻害する。トリプシンの阻害ウシ膵臓トリプシン（Sigma）１０mgを１m M塩酸１００ml中に溶解し、冷蔵庫に保存した。そのうち２０μｌを１ｍＭ塩酸９８０μｌと混ぜ合わせた。そのうち２５μｌを各測定に用いた。測定は、トロンビンに関して上記したように実行した。Ｋｍ＝４５μM。実施例１の化合物はトリプシンを阻害し、阻害定数Ｋｉは１００ｎＭである。ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａフィブリノーゲンＥｌｉｓａは、下記の文献に記載された検定の変法である：Nachman，R.L．& Leung，L.L.K.(1982); J．Clin．Invest ．69:263-269及びWright，P.S．et al.,(1993); Biochem．J．293:263-267. 微量滴定プレートを一夜、２μg/ml単離活性化ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体で覆った。数回洗浄して未結合受容体を除去後、プレートの表面を１％カゼインで遮断して、それを再び洗浄した。試験物質を必要濃度で付加し、プレートを振盪しながら１０分間インキュベートした。ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の天然配位子であるフィブリノーゲンを付加した。１時間インキュベート後、未結合フィブリノーゲンを数回洗浄して除去し、ＥＬＩＳＡ計器で４０５nmでの光学的密度を測定することにより、ペルオキシダーゼ−共役抗フィブリノーゲンモノクローナル抗体により、結合フィブリノーゲンを測定した。フィブリノーゲン−ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ相互作用の阻害は、低光学的密度を生じる。濃度／作用曲線により、ＩＣ50値を確定した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月１３日（１９９８．１．１３）【補正内容】請求の範囲１.式Ｉ：（式中、Ｒ₁，Ｒ₂は同一であっても異なってもよく、水素、α−、β−、γ− 又はω−アミノ酸又はその誘導体、１〜５０個のアミノ酸を有するペプチジル残基、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルスルホニル、Ｃ₆〜Ｃ₁₄アリールスルホニル残基、あるいは１，２又は３個のヘテロ原子を有する５又は６員ヘテロアリールを示し、Ｙは水素又は式ＣＯＸの残基を示し、Ｘは水素、ＯＲ₃又はＮＲ₁’Ｒ₂’残基を示し、ここでＲ3は水素又はＣ，〜Ｃ。アルキルを示しＲ₁’，Ｒ₂’は同一であっても異なってもよく、残基Ｒ₁及びＲ₂の意味を有する）化合物、及びそれらの任意に活性な異性体、並びに薬理学的に許容可能なその塩又はプロドラッグ。２．慣用的担体及び補助剤の他に請求項１に記載の一般式Ｉの少なくとも１つの化合物を含有する薬理学的組成物。３．血栓塞栓性事象、骨粗鬆症、炎症又は腫瘍性疾患による疾患の治療のための製剤組成物の製造のための請求項１記載の式Ｉの化合物の使用。４．式Ｉ：（式中、ＹはＨ又はＣＯＯＨを示す）の化合物、又は第一アミノ基、カルボン酸基及びアミジノ基が任意に保護されるその誘導体。５．式Ｉ’又はＩ''：の主鎖構造を包含する生物学的活性物質の製造のための請求項４記載の式Ｉの化合物の使用。６．製薬液活性化合物中でのアルギニン又は公知のアルギニン擬似構造を置換するための式Ｉ’又はＩ''：の主鎖構造の使用。７．アミノ又はカルボキシル基でのペプチジル残基が互いに別々に０〜５０アミノ酸のアミノ酸鎖長を有するペプチド中でのアルギニンを置換するための式Ｉ ’又はＩ''：の主鎖構造の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ 43/00 ６４３ＤＡ６１Ｋ 31/40 31/40 Ｃ０７Ｋ 5/02 Ｃ０７Ｋ 5/02 5/06 5/06 5/10 5/10 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クレル，ハンス―ウィリードイツ連邦共和国，デー―82377 ペンツベルグ，ザグスピッツシュトラーセ 14 ア (72)発明者マルティン，ウルリヒドイツ連邦共和国，デー―80469 ミュンヘン，ホルツシュトラーセ 19 (72)発明者サクラキッズ，クリストスドイツ連邦共和国，デー―69469 バインハイム，ローゼンブルネンシュトラーセ 25

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：（式中、Ｒ１，Ｒ２及びＹは同一であっても異なってもよく、水素又は有機残基を示す）の化合物、及びそれらの任意に活性な異性体並びに薬理学的に許容可能なその塩又はプロドラッグ。２．Ｒ１，Ｒ２が同一であっても異なってもよく、水素、アミノ酸、ペプチジル、アルキルスルホニル又はアリールスルホニル残基を示し、Ｙが水素又は式ＣＯＸの残基を示し、Ｘが水素、ＯＲ３又はＮＲ１’Ｒ２’残基を示し、Ｒ３が水素又は低級アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル又はブチルを示し、そしてＲ１’，Ｒ２’は同一であっても異なってもよく、残基Ｒ１及びＲ２の意味を有する、請求項１記載の式Ｉの化合物、及びその任意に活性な異性体、並びに薬理学的に許容可能なその塩又はプロドラッグ。３．慣用的担体及び補助剤の他に請求項１又は２のいずれかに記載の一般式Ｉの少なくとも１つの化合物を含有する薬理学的組成物。４．血栓塞栓性事象、骨粗製鬆症、炎症又は腫瘍性疾患による疾患の治療のための薬理学的組成物の製造のための請求項１又は２のいずれかに記載の式Ｉの化合物の使用。５．アルギニン構造又は上記アルギニン構造の公知の擬似体を包含する化合物中でのアルギニン擬似体としての構造式Ｉ：（式中、ＹはＨ又はＣＯＲ３を示し、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は蒸気の化合物のアルギニン又は公知のアルギニン擬似体構造の異なる残基を示す）の使用。