JP2000128803A - ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体 - Google Patents
ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒ
ビター（ＴＦＰＩ）−２の生理的な役割を直接明らかに
することを可能にするとともに、ＴＦＰＩ−２の関与す
る種々の病態の解明または治療法の研究のために、ＴＦ
ＰＩ−１と交叉反応しない、ＴＦＰＩ−２に特異的な抗
体等を提供すること。 【解決手段】ＴＦＰＩ−１とは交叉反応しない、ＴＦＰ
Ｉ−２に特異的な抗体またはその断片、かかる抗体また
はその断片を有効成分として含有してなる血管平滑筋増
殖調節剤、およびかかる抗体またはその断片を含有して
なる血管の増殖に関連する疾患の診断薬。
ビター（ＴＦＰＩ）−２の生理的な役割を直接明らかに
することを可能にするとともに、ＴＦＰＩ−２の関与す
る種々の病態の解明または治療法の研究のために、ＴＦ
ＰＩ−１と交叉反応しない、ＴＦＰＩ−２に特異的な抗
体等を提供すること。 【解決手段】ＴＦＰＩ−１とは交叉反応しない、ＴＦＰ
Ｉ−２に特異的な抗体またはその断片、かかる抗体また
はその断片を有効成分として含有してなる血管平滑筋増
殖調節剤、およびかかる抗体またはその断片を含有して
なる血管の増殖に関連する疾患の診断薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗体に関する。さ
らに詳しくは、ティッシュ・ファクター・パスウェイ・
インヒビター−２抗体またはその断片、ならびにかかる
抗体またはその断片を含有する血管平滑筋増殖調節剤お
よび診断薬に関する。
らに詳しくは、ティッシュ・ファクター・パスウェイ・
インヒビター−２抗体またはその断片、ならびにかかる
抗体またはその断片を含有する血管平滑筋増殖調節剤お
よび診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管平滑筋細胞の増殖は、動脈硬化や経
皮経管冠状動脈形成術後の再狭窄の病因と密接に関連し
ている（Ross, R. (1993) Nature 362, 801-809 ）。血
管内皮細胞は、種々の機構からなる抗血栓性機能をも
ち、血液の流動性を維持する一方、傷害を受けた場合に
は、速やかに血栓を形成して傷害部位を保護する血栓性
機能ももっている。このような相反する機能をもつ内皮
細胞により、血液の恒常性が維持されており、そのバラ
ンスが動脈硬化等により崩れると、心筋梗塞や脳梗塞等
の種々の循環器疾患が引き起こされると考えられる。内
皮細胞の抗血栓性については、細胞表面に存在するアン
チトロンビンIII やトロンボモジュリンによる抗凝固作
用や、プロスタグランジンＩ2 （ＰＧＩ2 ）の産生によ
る抗血小板作用、組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−ＰＡ）の産生やプラスミノーゲンの結合による線
溶促進活性等が知られている。
皮経管冠状動脈形成術後の再狭窄の病因と密接に関連し
ている（Ross, R. (1993) Nature 362, 801-809 ）。血
管内皮細胞は、種々の機構からなる抗血栓性機能をも
ち、血液の流動性を維持する一方、傷害を受けた場合に
は、速やかに血栓を形成して傷害部位を保護する血栓性
機能ももっている。このような相反する機能をもつ内皮
細胞により、血液の恒常性が維持されており、そのバラ
ンスが動脈硬化等により崩れると、心筋梗塞や脳梗塞等
の種々の循環器疾患が引き起こされると考えられる。内
皮細胞の抗血栓性については、細胞表面に存在するアン
チトロンビンIII やトロンボモジュリンによる抗凝固作
用や、プロスタグランジンＩ2 （ＰＧＩ2 ）の産生によ
る抗血小板作用、組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−ＰＡ）の産生やプラスミノーゲンの結合による線
溶促進活性等が知られている。
【０００３】最近、抗凝固活性を有する新しいタイプの
インヒビターが血管内皮細胞で産生されることが明らか
となり、注目されるようになった。このインヒビター、
即ち、ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビ
ター(Tissue Facter PathwayInhibitor：ＴＦＰＩ）
（ＴＦＰＩは、ＴＦＰＩ−１と称されることもあり、以
下ＴＦＰＩ−１と略す）は、血管内皮細胞で合成され、
内皮上または血漿中に存在する（Jesty, J. ら、(1994)
Biochemistry 33, 12686-12694; Sprecher, C.A.ら、
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3353-3357; P
eterson, L. C.ら、(1996) Biochemistry 35, 266-272
）。ＴＦＰＩ−１は、外因性の凝固経路の初期工程を
阻害し、鬱血を調節する。ＴＦＰＩ−１は、第Ｘａ因子
のインヒビター、または第Ｘａ因子存在下での第ＶIIａ
因子−組織因子（ＴＦ）複合体のインヒビターである。
ＴＦＰＩ−１は、３つのタンデムドメインを有するKuni
tz型プロテアーゼインヒビターである。第１の阻害ドメ
インは、第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体と相互作用し、複合
体：第Ｘａ因子／ＴＦＰＩ−１／第ＶIIａ因子／ＴＦを
形成することにより、第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体の蛋白
分解活性を阻害する。第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体は、第
Ｘ因子および第ＩＸ因子を活性な酵素に変換する。第２
のドメインは、第Ｘａ因子と相互作用し、直接第Ｘａ因
子を阻害する。第３の阻害ドメインの機能は、ヘパリン
との結合である。第Ｖａ因子とともに第Ｘａ因子は、プ
ロトロンビンをトロンビンに開裂させ、フィブリンクロ
ットの発生に導く。
インヒビターが血管内皮細胞で産生されることが明らか
となり、注目されるようになった。このインヒビター、
即ち、ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビ
ター(Tissue Facter PathwayInhibitor：ＴＦＰＩ）
（ＴＦＰＩは、ＴＦＰＩ−１と称されることもあり、以
下ＴＦＰＩ−１と略す）は、血管内皮細胞で合成され、
内皮上または血漿中に存在する（Jesty, J. ら、(1994)
Biochemistry 33, 12686-12694; Sprecher, C.A.ら、
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3353-3357; P
eterson, L. C.ら、(1996) Biochemistry 35, 266-272
）。ＴＦＰＩ−１は、外因性の凝固経路の初期工程を
阻害し、鬱血を調節する。ＴＦＰＩ−１は、第Ｘａ因子
のインヒビター、または第Ｘａ因子存在下での第ＶIIａ
因子−組織因子（ＴＦ）複合体のインヒビターである。
ＴＦＰＩ−１は、３つのタンデムドメインを有するKuni
tz型プロテアーゼインヒビターである。第１の阻害ドメ
インは、第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体と相互作用し、複合
体：第Ｘａ因子／ＴＦＰＩ−１／第ＶIIａ因子／ＴＦを
形成することにより、第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体の蛋白
分解活性を阻害する。第ＶIIａ因子／ＴＦ複合体は、第
Ｘ因子および第ＩＸ因子を活性な酵素に変換する。第２
のドメインは、第Ｘａ因子と相互作用し、直接第Ｘａ因
子を阻害する。第３の阻害ドメインの機能は、ヘパリン
との結合である。第Ｖａ因子とともに第Ｘａ因子は、プ
ロトロンビンをトロンビンに開裂させ、フィブリンクロ
ットの発生に導く。
【０００４】一方、ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰＩ−１と構
造上類似している（Sprecher, C. A. ら、(1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 3353-3357; Peterson, L.
C.ら、(1996) Biochemistry 35, 266-272 ）。ＴＦＰＩ
−２は、短い酸性アミノ末端領域、３つのタンデムKuni
tz型プロテアーゼ阻害ドメインおよび塩基性アミノ酸に
富むカルボキシ末端尾部を有する。ＴＦＰＩ−２は、ト
リプシンのアミド分解活性およびヒト第ＶIIａ因子とＴ
Ｆの複合体の活性を阻害する。ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰ
Ｉ−１と比べて、第Ｘａ因子のアミド分解活性に関して
は弱い阻害活性しか示さない。ＴＦＰＩ−２は、胎盤蛋
白質５、即ち、ＰＰ５と同一の蛋白質である（Miyagi,
Y.ら、(1994) J. Biochem. 116, 939-942 ）。ＴＦＰＩ
−２（ＰＰ５）は、以前に報告された第ＶIIａ因子／Ｔ
Ｆ複合体およびトリプシンを阻害する能力に加え、第Ｘ
Ia因子、プラスミン、血漿カリクレインおよびキモトリ
プシンの強いインヒビターである。
造上類似している（Sprecher, C. A. ら、(1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 3353-3357; Peterson, L.
C.ら、(1996) Biochemistry 35, 266-272 ）。ＴＦＰＩ
−２は、短い酸性アミノ末端領域、３つのタンデムKuni
tz型プロテアーゼ阻害ドメインおよび塩基性アミノ酸に
富むカルボキシ末端尾部を有する。ＴＦＰＩ−２は、ト
リプシンのアミド分解活性およびヒト第ＶIIａ因子とＴ
Ｆの複合体の活性を阻害する。ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰ
Ｉ−１と比べて、第Ｘａ因子のアミド分解活性に関して
は弱い阻害活性しか示さない。ＴＦＰＩ−２は、胎盤蛋
白質５、即ち、ＰＰ５と同一の蛋白質である（Miyagi,
Y.ら、(1994) J. Biochem. 116, 939-942 ）。ＴＦＰＩ
−２（ＰＰ５）は、以前に報告された第ＶIIａ因子／Ｔ
Ｆ複合体およびトリプシンを阻害する能力に加え、第Ｘ
Ia因子、プラスミン、血漿カリクレインおよびキモトリ
プシンの強いインヒビターである。
【０００５】血液凝固系における前記性質に加え、ＴＦ
ＰＩ−１の種々の動脈における内膜または平滑筋細胞に
対する抗増殖作用が報告されている。動脈硬化ウサギの
動脈損傷モデルにおいて、組換えＴＦＰＩ−１での処置
は、血管造影上の再狭窄を低下させ、新生内膜過形成を
減少させた（Jang, Y.ら、(1995) Circulation 92, 304
1-3050）。ミニブタの頸動脈でのバルーン誘導性動脈損
傷後の最初の２４時間における組換えＴＦＰＩ−１投与
によるＴＦ仲介性凝固の阻害は、その後の新生内膜形成
と管腔の狭窄を減少させるのに効果があるように思われ
る（Oltrona, L. ら、(1997) Circulation 96, 646-65
2）。組換えＴＦＰＩ−１は、培養ヒト新生児大動脈平
滑筋細胞に対して増殖阻害活性を示す（Kamikubo, Y.
ら、(1997) FEBS Lett. 407, 116-120）。このように、
ＴＦＰＩ−１は、種々の作用が明らかになり、医薬品へ
の応用研究が活発に行なわれているのに対し、構造上類
似のＴＦＰＩ−２に関してはその生理学的機能はほとん
ど知られていない。
ＰＩ−１の種々の動脈における内膜または平滑筋細胞に
対する抗増殖作用が報告されている。動脈硬化ウサギの
動脈損傷モデルにおいて、組換えＴＦＰＩ−１での処置
は、血管造影上の再狭窄を低下させ、新生内膜過形成を
減少させた（Jang, Y.ら、(1995) Circulation 92, 304
1-3050）。ミニブタの頸動脈でのバルーン誘導性動脈損
傷後の最初の２４時間における組換えＴＦＰＩ−１投与
によるＴＦ仲介性凝固の阻害は、その後の新生内膜形成
と管腔の狭窄を減少させるのに効果があるように思われ
る（Oltrona, L. ら、(1997) Circulation 96, 646-65
2）。組換えＴＦＰＩ−１は、培養ヒト新生児大動脈平
滑筋細胞に対して増殖阻害活性を示す（Kamikubo, Y.
ら、(1997) FEBS Lett. 407, 116-120）。このように、
ＴＦＰＩ−１は、種々の作用が明らかになり、医薬品へ
の応用研究が活発に行なわれているのに対し、構造上類
似のＴＦＰＩ−２に関してはその生理学的機能はほとん
ど知られていない。
【０００６】なお、最近、ＴＦＰＩ−２を認識する抗体
を含む診断薬が市販されているが、かかる抗体はＴＦＰ
Ｉ−１とも交叉反応することから、該抗体を用いた診断
では明確な病態との関連性を明らかにすることができな
いのが現状である。
を含む診断薬が市販されているが、かかる抗体はＴＦＰ
Ｉ−１とも交叉反応することから、該抗体を用いた診断
では明確な病態との関連性を明らかにすることができな
いのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、ＴＦＰＩ−２の生理的
な役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、
ＴＦＰＩ−２の関与する種々の病態の解明または治療法
の研究のために、ＴＦＰＩ−１と交叉反応しない、ＴＦ
ＰＩ−２に特異的な抗体等を提供することを目的とす
る。
術に鑑みてなされたものであり、ＴＦＰＩ−２の生理的
な役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、
ＴＦＰＩ−２の関与する種々の病態の解明または治療法
の研究のために、ＴＦＰＩ−１と交叉反応しない、ＴＦ
ＰＩ−２に特異的な抗体等を提供することを目的とす
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、平滑筋の
細胞増殖に関する内皮細胞の効果を研究するために、培
養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で覆われた１．
０μｍの膜を有する培養挿入物とウシ大動脈平滑筋細胞
で覆われたマイクロテストプレートを用いて調べたとこ
ろ、当該内皮細胞が挿入物中に存在する場合、当該平滑
筋細胞の増殖が見られた。そこで、培養ＨＵＶＥＣのコ
ンディション培地から平滑筋細胞の増殖活性（すなわ
ち、マイトジェン活性）を有する物質を精製し、そのＮ
末端アミノ酸配列を分析したところ、意外にも、当該マ
イトジェン物質は、血管平滑筋細胞に対して増殖阻害活
性を有するＴＦＰＩ−１と構造の類似したＴＦＰＩ−２
であることを発見した。さらに、本発明者らは、精製し
た組換えＴＦＰＩ−２を抗原としてＴＦＰＩ−２に特異
的な抗体を作製し、本発明を完成するに至った。
細胞増殖に関する内皮細胞の効果を研究するために、培
養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で覆われた１．
０μｍの膜を有する培養挿入物とウシ大動脈平滑筋細胞
で覆われたマイクロテストプレートを用いて調べたとこ
ろ、当該内皮細胞が挿入物中に存在する場合、当該平滑
筋細胞の増殖が見られた。そこで、培養ＨＵＶＥＣのコ
ンディション培地から平滑筋細胞の増殖活性（すなわ
ち、マイトジェン活性）を有する物質を精製し、そのＮ
末端アミノ酸配列を分析したところ、意外にも、当該マ
イトジェン物質は、血管平滑筋細胞に対して増殖阻害活
性を有するＴＦＰＩ−１と構造の類似したＴＦＰＩ−２
であることを発見した。さらに、本発明者らは、精製し
た組換えＴＦＰＩ−２を抗原としてＴＦＰＩ−２に特異
的な抗体を作製し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明の要旨は、（１） ティ
ッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター（ＴＦ
ＰＩ）−１とは交叉反応しない、ＴＦＰＩ−２に特異的
な抗体またはその断片、（２） ＴＦＰＩ−２がヒト由
来である前記（１）記載の抗体またはその断片、（３）
前記（１）または（２）記載の抗体またはその断片を
有効成分として含有してなる血管平滑筋増殖調節剤、
（４） 前記（１）または（２）記載の抗体またはその
断片を含有してなる、血管の増殖に関連する疾患の診断
薬、に関する。
ッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター（ＴＦ
ＰＩ）−１とは交叉反応しない、ＴＦＰＩ−２に特異的
な抗体またはその断片、（２） ＴＦＰＩ−２がヒト由
来である前記（１）記載の抗体またはその断片、（３）
前記（１）または（２）記載の抗体またはその断片を
有効成分として含有してなる血管平滑筋増殖調節剤、
（４） 前記（１）または（２）記載の抗体またはその
断片を含有してなる、血管の増殖に関連する疾患の診断
薬、に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の抗体またはその断片は、
ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター
（ＴＦＰＩ）−２に特異的な抗体またはその断片であっ
て、かつ、ＴＦＰＩ−１とは交叉反応しない抗体または
その断片である。
ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター
（ＴＦＰＩ）−２に特異的な抗体またはその断片であっ
て、かつ、ＴＦＰＩ−１とは交叉反応しない抗体または
その断片である。
【００１１】本発明の抗体またはその断片は、ＴＦＰＩ
−１とは交叉反応しない限り、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体またはそれらの断片のいずれでもよ
い。かかる抗体のクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、
ＩｇＧおよびＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好まし
い。ここで抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2 および
Ｆｃが含まれる。
−１とは交叉反応しない限り、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体またはそれらの断片のいずれでもよ
い。かかる抗体のクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、
ＩｇＧおよびＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好まし
い。ここで抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2 および
Ｆｃが含まれる。
【００１２】本発明の抗体またはその断片が認識し、当
該抗体を作製するための抗原としても用いられるＴＦＰ
Ｉ−２としては、ヒト、ウサギ、ラット等の哺乳動物由
来のものが挙げられるが、配列番号：１に記載のヒト由
来のＴＦＰＩ−２が好ましい。ＴＦＰＩ−２は、天然の
蛋白質、組換え蛋白質のいずれでもよく、抗原性を有す
る限りかかる蛋白質の部分ペプチドであってもよい。
該抗体を作製するための抗原としても用いられるＴＦＰ
Ｉ−２としては、ヒト、ウサギ、ラット等の哺乳動物由
来のものが挙げられるが、配列番号：１に記載のヒト由
来のＴＦＰＩ−２が好ましい。ＴＦＰＩ−２は、天然の
蛋白質、組換え蛋白質のいずれでもよく、抗原性を有す
る限りかかる蛋白質の部分ペプチドであってもよい。
【００１３】ＴＦＰＩ−２の製造方法としては、例え
ば、天然のＴＦＰＩ−２を発現している細胞のコンディ
ション培地から、マイトジェン活性を指標にして、天然
のＴＦＰＩ−２を精製する方法と、ＴＦＰＩ−２をコー
ドするＤＮＡを発現ベクターに組み込んで適当な宿主で
発現させた後に発現した組換えＴＦＰＩ−２を精製する
方法とが挙げられる。
ば、天然のＴＦＰＩ−２を発現している細胞のコンディ
ション培地から、マイトジェン活性を指標にして、天然
のＴＦＰＩ−２を精製する方法と、ＴＦＰＩ−２をコー
ドするＤＮＡを発現ベクターに組み込んで適当な宿主で
発現させた後に発現した組換えＴＦＰＩ−２を精製する
方法とが挙げられる。
【００１４】天然のＴＦＰＩ−２を精製する方法は、例
えば、参考例１に記載のように、ヒト臍帯静脈内皮細胞
（ＨＵＶＥＣ）のコンディション培地を限外濾過により
濃縮し、ヘパリンアフィニティーカラムを用いてマイト
ジェン活性画分を溶出した後、ProRPC HR 5/10カラム
（Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いるＬＣ−６
Ａ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム
（Shimadzu社製) によりマイトジェン活性画分を溶出す
る方法である。
えば、参考例１に記載のように、ヒト臍帯静脈内皮細胞
（ＨＵＶＥＣ）のコンディション培地を限外濾過により
濃縮し、ヘパリンアフィニティーカラムを用いてマイト
ジェン活性画分を溶出した後、ProRPC HR 5/10カラム
（Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いるＬＣ−６
Ａ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム
（Shimadzu社製) によりマイトジェン活性画分を溶出す
る方法である。
【００１５】組換えＴＦＰＩ−２を精製する方法は、例
えば、参考例２〜４に記載のように、ＴＦＰＩ−２のｃ
ＤＮＡをＰＣＲ等により調製し、哺乳動物発現ベクター
ｐＫ４Ｋにクローニングした発現ベクターを構築した
後、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）ｔｋ- ｔｓ１３細胞
等にリン酸カルシウム沈殿法等により形質転換し、メト
トレキサート（ＭＴＸ）等による選別の後、コンディシ
ョン培地を回収し、前記天然のＴＦＰＩ−２と同様に精
製する方法である。
えば、参考例２〜４に記載のように、ＴＦＰＩ−２のｃ
ＤＮＡをＰＣＲ等により調製し、哺乳動物発現ベクター
ｐＫ４Ｋにクローニングした発現ベクターを構築した
後、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）ｔｋ- ｔｓ１３細胞
等にリン酸カルシウム沈殿法等により形質転換し、メト
トレキサート（ＭＴＸ）等による選別の後、コンディシ
ョン培地を回収し、前記天然のＴＦＰＩ−２と同様に精
製する方法である。
【００１６】本明細書において「ＴＦＰＩ−１とは交叉
反応しない」とは、ＴＦＰＩ−２抗体を用いた通常の酵
素免疫アッセイ（ＥＩＡ）システムでＴＦＰＩ−１を測
定することができないこと、またはＴＦＰＩ−１および
ＴＦＰＩ−２を常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付してウエスタンブロ
ッティングした後、ＴＦＰＩ−２抗体によりＴＦＰＩ−
２しか検出できないことをいう。
反応しない」とは、ＴＦＰＩ−２抗体を用いた通常の酵
素免疫アッセイ（ＥＩＡ）システムでＴＦＰＩ−１を測
定することができないこと、またはＴＦＰＩ−１および
ＴＦＰＩ−２を常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付してウエスタンブロ
ッティングした後、ＴＦＰＩ−２抗体によりＴＦＰＩ−
２しか検出できないことをいう。
【００１７】本発明の抗ＴＦＰＩ−２抗体は、例えば、
Antibodies; A Laboratory Manual, Lane.H.D.ら
編、Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 N
ew York 1989年などに記載の方法に従って、前記精製
したＴＦＰＩ−２を抗原として用いて適切な方法で適切
な動物を免疫することにより、ＴＦＰＩ−２を認識する
抗体またはその活性を中和する抗体を容易に作製し、精
製することができる。さらに、作製された抗体がＴＦＰ
Ｉ−１とは交叉反応しないことを確認することにより、
ＴＦＰＩ−２に特異的な抗体が得られる。
Antibodies; A Laboratory Manual, Lane.H.D.ら
編、Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 N
ew York 1989年などに記載の方法に従って、前記精製
したＴＦＰＩ−２を抗原として用いて適切な方法で適切
な動物を免疫することにより、ＴＦＰＩ−２を認識する
抗体またはその活性を中和する抗体を容易に作製し、精
製することができる。さらに、作製された抗体がＴＦＰ
Ｉ−１とは交叉反応しないことを確認することにより、
ＴＦＰＩ−２に特異的な抗体が得られる。
【００１８】本発明の抗ＴＦＰＩ−２抗体の断片は、前
記精製された抗体にパパイン、ペプシン等の蛋白分解酵
素を作用させることにより得られる。
記精製された抗体にパパイン、ペプシン等の蛋白分解酵
素を作用させることにより得られる。
【００１９】抗体またはその断片の用途としては、アフ
ィニティークロマトグラフィーやｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニング等の研究用試薬、免疫学的診断薬、医
薬等が挙げられる。
ィニティークロマトグラフィーやｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニング等の研究用試薬、免疫学的診断薬、医
薬等が挙げられる。
【００２０】また、本発明は、前記抗体またはその断片
を有効成分として含有する血管平滑筋増殖調節剤を提供
する。
を有効成分として含有する血管平滑筋増殖調節剤を提供
する。
【００２１】本発明の抗体またはその断片を血管平滑筋
増殖調節剤に含有させる場合には、その形状は、溶液
状、懸濁状、乳液状、凍結乾燥品等とすることができ
る。凍結乾燥品は、使用直前に適当な溶媒、塩水、緩衝
液等に溶解して用いる。
増殖調節剤に含有させる場合には、その形状は、溶液
状、懸濁状、乳液状、凍結乾燥品等とすることができ
る。凍結乾燥品は、使用直前に適当な溶媒、塩水、緩衝
液等に溶解して用いる。
【００２２】本発明の抗体またはその断片は、ＴＦＰＩ
−２に特異的に結合して、その活性を中和する作用を有
するので、かかる抗体またはその断片を有効成分として
含有する本発明の血管平滑筋増殖調節剤は、以下のよう
な効果を奏する。即ち、ＴＦＰＩ−２の血管平滑筋細胞
の増殖促進作用、血液凝固作用の阻害等をイン・ビボま
たはイン・ビトロで阻止することが可能である。さら
に、ＴＦＰＩ−２が関与する疾患の治療剤または予防剤
としても有用である。
−２に特異的に結合して、その活性を中和する作用を有
するので、かかる抗体またはその断片を有効成分として
含有する本発明の血管平滑筋増殖調節剤は、以下のよう
な効果を奏する。即ち、ＴＦＰＩ−２の血管平滑筋細胞
の増殖促進作用、血液凝固作用の阻害等をイン・ビボま
たはイン・ビトロで阻止することが可能である。さら
に、ＴＦＰＩ−２が関与する疾患の治療剤または予防剤
としても有用である。
【００２３】本発明の血管平滑筋増殖剤を前記疾患の治
療剤または予防剤として使用する場合、非経口的に投与
することが好ましい。即ち、液剤、乳剤、懸濁液剤、リ
ポソーム剤等として静脈内、皮下、筋肉内等に注射する
ことができ、坐剤として直腸投与することもできる。こ
のような剤形は、医薬として許容される通常の担体、賦
形剤、結合剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、
等張剤等と本発明の抗体またはその断片とを配合するこ
とにより製造することができる。
療剤または予防剤として使用する場合、非経口的に投与
することが好ましい。即ち、液剤、乳剤、懸濁液剤、リ
ポソーム剤等として静脈内、皮下、筋肉内等に注射する
ことができ、坐剤として直腸投与することもできる。こ
のような剤形は、医薬として許容される通常の担体、賦
形剤、結合剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、
等張剤等と本発明の抗体またはその断片とを配合するこ
とにより製造することができる。
【００２４】本発明の血管平滑筋増殖調節剤の投与量
は、治療または予防目的の疾患、患者の年齢、体重等に
より適宜調整することができるが、通常１回につき0.00
01mg〜1000mg、好ましくは0.001mg 〜1000mgであり、こ
れを１日当たり１〜３回程度投与するのが好ましい。
は、治療または予防目的の疾患、患者の年齢、体重等に
より適宜調整することができるが、通常１回につき0.00
01mg〜1000mg、好ましくは0.001mg 〜1000mgであり、こ
れを１日当たり１〜３回程度投与するのが好ましい。
【００２５】さらに、本発明は、本発明の抗体またはそ
の断片を含有する診断薬を提供する。
の断片を含有する診断薬を提供する。
【００２６】本発明の抗体またはその断片を診断薬に含
有させるために、その形状を、溶液状、懸濁状、乳液
状、凍結乾燥品等とすることができる。凍結乾燥品は、
使用直前に適当な溶媒、塩水、緩衝液等に溶解して用い
る。抗体またはその断片の含有量は、用いる診断方法に
応じて適宜決定すればよい。
有させるために、その形状を、溶液状、懸濁状、乳液
状、凍結乾燥品等とすることができる。凍結乾燥品は、
使用直前に適当な溶媒、塩水、緩衝液等に溶解して用い
る。抗体またはその断片の含有量は、用いる診断方法に
応じて適宜決定すればよい。
【００２７】本発明の診断薬は、免疫学的診断法に用い
られることが好ましく、具体的には、イムノブロット
法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳＡ）、蛍光測定法または発光測定法等が挙げられ
る。
られることが好ましく、具体的には、イムノブロット
法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳＡ）、蛍光測定法または発光測定法等が挙げられ
る。
【００２８】さらに、当該診断薬は、目的の診断法に応
じて、免疫学的反応を行なうための試薬、かかる反応の
検出用試薬を含んでもよい。免疫学的反応を行なうため
の試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出用試
薬としては、本発明の抗体もしくはその断片、または本
発明の抗体もしくはその断片と抗原との複合体を認識す
る標識された二次抗体、標識に対応した基質等の通常の
免疫学的診断法に用いられる試薬が挙げられる。ここで
標識とは、ビオチン、アルカリフォスファターゼ等が例
示される。
じて、免疫学的反応を行なうための試薬、かかる反応の
検出用試薬を含んでもよい。免疫学的反応を行なうため
の試薬としては、緩衝剤、塩等が挙げられる。検出用試
薬としては、本発明の抗体もしくはその断片、または本
発明の抗体もしくはその断片と抗原との複合体を認識す
る標識された二次抗体、標識に対応した基質等の通常の
免疫学的診断法に用いられる試薬が挙げられる。ここで
標識とは、ビオチン、アルカリフォスファターゼ等が例
示される。
【００２９】本発明の診断薬は、従来の診断薬とは異な
り、ＴＦＰＩ−２が関与する疾患を特異的に診断すると
いう効果を奏する。
り、ＴＦＰＩ−２が関与する疾患を特異的に診断すると
いう効果を奏する。
【００３０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでは
ない。
説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでは
ない。
【００３１】参考例１ ＴＦＰＩ−２の精製 ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ワリイシ(War
iishi, S.)ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 216,
729-735 (1995)に記載の方法に従って培養し、そのコン
ディション培地からＴＦＰＩ−２を精製した。８００ｍ
ｌのコンディション培地を、４℃で限外濾過膜（ＹＭ１
０、Amicon社製) により２０ｍｌに濃縮した。この２０
ｍｌの溶液を、予め５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で平衡化させておいたHiTrap Heparinアフィニ
ティーカラム（５ｍｌ、AmershamPharmacia Biotech社
製) にかけた。試料の適用後、当該カラムを５０ｍｌの
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で洗浄
した。ＴＦＰＩ−２を含むマイトジェン活性画分は、１
Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）の２０ｍｌで溶出された。溶出液をCentriprep
10 （Amicon社製)で０．５ｍｌまで濃縮した。当該濃
縮液を、ＬＣ−６Ａ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）システム（Shimadzu社製) を用いて、ProRPC HR
5/10カラム（Amersham Pharmacia Biotech社製) に注入
した。流速は１ｍｌ／分であり、２８０ｎｍでピークを
モニターした。当該カラムを、１５％アセトニトリル中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から１００％アセ
トニトリル中０．１％ＴＦＡまで形成された勾配で溶出
した（図１）。カラムから溶出したマイトジェン活性画
分を凍結乾燥させた。マイトジェン活性は、後述の参考
例５に記載の方法を用いて測定した。
iishi, S.)ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 216,
729-735 (1995)に記載の方法に従って培養し、そのコン
ディション培地からＴＦＰＩ−２を精製した。８００ｍ
ｌのコンディション培地を、４℃で限外濾過膜（ＹＭ１
０、Amicon社製) により２０ｍｌに濃縮した。この２０
ｍｌの溶液を、予め５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で平衡化させておいたHiTrap Heparinアフィニ
ティーカラム（５ｍｌ、AmershamPharmacia Biotech社
製) にかけた。試料の適用後、当該カラムを５０ｍｌの
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液で洗浄
した。ＴＦＰＩ−２を含むマイトジェン活性画分は、１
Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）の２０ｍｌで溶出された。溶出液をCentriprep
10 （Amicon社製)で０．５ｍｌまで濃縮した。当該濃
縮液を、ＬＣ−６Ａ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）システム（Shimadzu社製) を用いて、ProRPC HR
5/10カラム（Amersham Pharmacia Biotech社製) に注入
した。流速は１ｍｌ／分であり、２８０ｎｍでピークを
モニターした。当該カラムを、１５％アセトニトリル中
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から１００％アセ
トニトリル中０．１％ＴＦＡまで形成された勾配で溶出
した（図１）。カラムから溶出したマイトジェン活性画
分を凍結乾燥させた。マイトジェン活性は、後述の参考
例５に記載の方法を用いて測定した。
【００３２】表１に、増殖を停止したウシ大動脈平滑筋
細胞に対する各精製工程におけるマイトジェン画分の活
性を示す。前記一連の精製工程により、ＨＵＶＥＣの濃
縮コンディション培地からマイトジェン活性を有する物
質が約４２０倍に精製されたことが明らかとなった。
細胞に対する各精製工程におけるマイトジェン画分の活
性を示す。前記一連の精製工程により、ＨＵＶＥＣの濃
縮コンディション培地からマイトジェン活性を有する物
質が約４２０倍に精製されたことが明らかとなった。
【００３３】
【表１】
【００３４】前記最終精製工程後のマイトジェン活性画
分（０．１μｇ）を、Phast System（Amersham Pharmac
ia Biotech社製) を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付した。泳動後の蛋白質
は、クーマシーブリリアントブルーで染色した。使用し
た分子量マーカーは、Amersham Pharmacia Biotech社製
から入手した。この結果、３２ｋＤａの分子量を有する
蛋白質が精製されたことがわかった（図２、レーン
Ｂ）。
分（０．１μｇ）を、Phast System（Amersham Pharmac
ia Biotech社製) を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付した。泳動後の蛋白質
は、クーマシーブリリアントブルーで染色した。使用し
た分子量マーカーは、Amersham Pharmacia Biotech社製
から入手した。この結果、３２ｋＤａの分子量を有する
蛋白質が精製されたことがわかった（図２、レーン
Ｂ）。
【００３５】精製された蛋白質を、Applied Biosystems
470A 気相シークエンサー(Perkin-Elmer 社製) を用い
る自動エドマン分解により、アミノ酸配列分析を行なっ
た。その結果、当該蛋白質は、Ｎ末端に、ＤＡＡＱＥＰ
ＴＧＮＮＡＥＩ（配列番号：３）のアミノ酸配列を有す
ることが明らかとなった。このＮ末端アミノ酸配列は、
シグナルペプチドが除去された後のＴＦＰＩ−２（ＰＰ
５）と同一のＮ末端アミノ酸配列であった。ＴＦＰＩ−
２の全アミノ酸配列を配列番号：１に示す。
470A 気相シークエンサー(Perkin-Elmer 社製) を用い
る自動エドマン分解により、アミノ酸配列分析を行なっ
た。その結果、当該蛋白質は、Ｎ末端に、ＤＡＡＱＥＰ
ＴＧＮＮＡＥＩ（配列番号：３）のアミノ酸配列を有す
ることが明らかとなった。このＮ末端アミノ酸配列は、
シグナルペプチドが除去された後のＴＦＰＩ−２（ＰＰ
５）と同一のＮ末端アミノ酸配列であった。ＴＦＰＩ−
２の全アミノ酸配列を配列番号：１に示す。
【００３６】参考例２ ＴＦＰＩ−２ｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築 ニイドメ(Niidome, T.) ら、Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 203, 1821-1827 (1994)に記載の方法に従って、
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII の単一の制限部位を含む哺乳
動物発現ベクターｐＫ４Ｋを用いて、ｐＫ４ＫＴ２と命
名した発現ベクターを構築した。即ち、ＴＦＰＩ−２ｃ
ＤＮＡを、ＴＦＰＩ−２のヌクレオチド３９−５４およ
び７６３−７８２にそれぞれ対応するセンスオリゴヌク
レオチド５’−ＡＴＧＧＡＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣ−
３’（配列番号：４）およびアンチセンスオリゴヌクレ
オチド５’−ＧＣＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡ
Ｔ−３’（配列番号：５）を用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により作製した。鋳型は、ＴＦＰＩ−２
ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）
(Stratagene 社製) であった。得られたＰＣＲ産物を、
ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(Takara Biomedical
s 社製) により平滑末端化し、同様に平滑末端化した前
記ｐＫ４Ｋベクターに連結した。当該ＰＣＲ産物の配列
は、自動ＤＮＡシーケンサー３７３Ａ(Applied Biosyst
ems, Perkin-Elmer Corp.)により、配列番号：２に記載
の第３９位〜第７８２位までのヌクレオチドに対応する
塩基配列を有することを確認した。
ommun. 203, 1821-1827 (1994)に記載の方法に従って、
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII の単一の制限部位を含む哺乳
動物発現ベクターｐＫ４Ｋを用いて、ｐＫ４ＫＴ２と命
名した発現ベクターを構築した。即ち、ＴＦＰＩ−２ｃ
ＤＮＡを、ＴＦＰＩ−２のヌクレオチド３９−５４およ
び７６３−７８２にそれぞれ対応するセンスオリゴヌク
レオチド５’−ＡＴＧＧＡＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣ−
３’（配列番号：４）およびアンチセンスオリゴヌクレ
オチド５’−ＧＣＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡ
Ｔ−３’（配列番号：５）を用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により作製した。鋳型は、ＴＦＰＩ−２
ｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）
(Stratagene 社製) であった。得られたＰＣＲ産物を、
ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(Takara Biomedical
s 社製) により平滑末端化し、同様に平滑末端化した前
記ｐＫ４Ｋベクターに連結した。当該ＰＣＲ産物の配列
は、自動ＤＮＡシーケンサー３７３Ａ(Applied Biosyst
ems, Perkin-Elmer Corp.)により、配列番号：２に記載
の第３９位〜第７８２位までのヌクレオチドに対応する
塩基配列を有することを確認した。
【００３７】参考例３ 形質転換と細胞培養 形質転換されていないベビーハムスター腎（ＢＨＫ）ｔ
ｋ- ｔｓ１３細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ス
トレプトマイシン（３０μｇ／ｍｌ）およびペニシリン
（３０ユニット／ｍｌ）を補足したDulbeccoの変法Eagl
e 培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｃｅｌｌ Ｐｈｅ
ｃｔ トランスフェクションキット(Amersham Pharmaci
a Biotech 社製) を用いる改変したリン酸カルシウム沈
殿法により、当該ＢＨＫｔｋ- ｔｓ１３細胞（２×１０
5 細胞）を、参考例２で作製した５μｇのｐＫ４ＫＴ２
ベクターで形質転換した。ＢＨＫＴ２と命名した形質転
換した細胞を、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させ
た。２５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）による選
別の後、細胞培養上清（コンディション培地）を回収
し、組換えＴＦＰＩ−２（ｒＴＦＰＩ−２）の単離のた
めに用いた。
ｋ- ｔｓ１３細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ス
トレプトマイシン（３０μｇ／ｍｌ）およびペニシリン
（３０ユニット／ｍｌ）を補足したDulbeccoの変法Eagl
e 培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｃｅｌｌ Ｐｈｅ
ｃｔ トランスフェクションキット(Amersham Pharmaci
a Biotech 社製) を用いる改変したリン酸カルシウム沈
殿法により、当該ＢＨＫｔｋ- ｔｓ１３細胞（２×１０
5 細胞）を、参考例２で作製した５μｇのｐＫ４ＫＴ２
ベクターで形質転換した。ＢＨＫＴ２と命名した形質転
換した細胞を、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させ
た。２５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）による選
別の後、細胞培養上清（コンディション培地）を回収
し、組換えＴＦＰＩ−２（ｒＴＦＰＩ−２）の単離のた
めに用いた。
【００３８】参考例４ 組換えＴＦＰＩ−２（ｒＴＦＰＩ−２）の精製 参考例１に記載と同様の方法を用いて、参考例３で得ら
れたＢＨＫＴ２のコンディション培地（１０００ｍｌ）
からｒＴＦＰＩ−２を精製した。精製されたｒＴＦＰＩ
−２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２、レーンＣに示す。
れたＢＨＫＴ２のコンディション培地（１０００ｍｌ）
からｒＴＦＰＩ−２を精製した。精製されたｒＴＦＰＩ
−２のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２、レーンＣに示す。
【００３９】その結果、天然のＴＦＰＩ−２と同じ分子
量（３２ｋＤａ）を有する蛋白質が精製されたことが明
らかとなった。
量（３２ｋＤａ）を有する蛋白質が精製されたことが明
らかとなった。
【００４０】参考例５ ｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活性 ウシ大動脈平滑筋細胞は、ロス(Ross)のエクスプラント
技法の改変法により成牛の大動脈の中間層から単離した
(Shirotani, M.ら、J. Pharmacol. Exp. Ther.259, 738
-744 (1990)) 。１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ
／ｍｌ）およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補
足したＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ2 を含む空気の加湿環
境下、３７℃でウシ大動脈平滑筋細胞を増殖させた。増
殖させた。培養用培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を３
日毎に交換し、約７日後にコンフルエント平滑筋細胞単
層を得た。細胞は、第２継代から第６継代まで使用し
た。当該細胞を０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴ
Ａ溶液で回収し、９６ウエルプレート（Ｎｕｎｋ社製）
にウエル当たり３，０００個の細胞密度で播種した。４
８時間後、当該細胞の増殖を０．１％ＦＣＳを含むＤＭ
ＥＭで停止させた。さらに４８時間後、新鮮な培地（Ｄ
ＭＥＭ＋０．１％ＦＣＳ）と種々の濃度の製造例４で精
製されたｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５００ｎＭ）
を、前記増殖停止細胞に同時に添加した。４８時間後、
Premix WST-1 細胞増殖アッセイシステム(Takara Biom
edical社製) を用いて、細胞の増殖アッセイを行なっ
た。前記システムは、テトラゾリウムから産生したホル
マゾンを６００ｎｍの参照波長とともに４２０ｎｍでア
ッセイする。得られた吸光度の値を、標準曲線から細胞
数に変換した（図３）。
技法の改変法により成牛の大動脈の中間層から単離した
(Shirotani, M.ら、J. Pharmacol. Exp. Ther.259, 738
-744 (1990)) 。１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ
／ｍｌ）およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補
足したＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ2 を含む空気の加湿環
境下、３７℃でウシ大動脈平滑筋細胞を増殖させた。増
殖させた。培養用培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を３
日毎に交換し、約７日後にコンフルエント平滑筋細胞単
層を得た。細胞は、第２継代から第６継代まで使用し
た。当該細胞を０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴ
Ａ溶液で回収し、９６ウエルプレート（Ｎｕｎｋ社製）
にウエル当たり３，０００個の細胞密度で播種した。４
８時間後、当該細胞の増殖を０．１％ＦＣＳを含むＤＭ
ＥＭで停止させた。さらに４８時間後、新鮮な培地（Ｄ
ＭＥＭ＋０．１％ＦＣＳ）と種々の濃度の製造例４で精
製されたｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５００ｎＭ）
を、前記増殖停止細胞に同時に添加した。４８時間後、
Premix WST-1 細胞増殖アッセイシステム(Takara Biom
edical社製) を用いて、細胞の増殖アッセイを行なっ
た。前記システムは、テトラゾリウムから産生したホル
マゾンを６００ｎｍの参照波長とともに４２０ｎｍでア
ッセイする。得られた吸光度の値を、標準曲線から細胞
数に変換した（図３）。
【００４１】図３より、ｒＴＦＰＩ−２は、用量応答様
式（１〜５００ｎＭ）で細胞の増殖を増加させることが
わかった。
式（１〜５００ｎＭ）で細胞の増殖を増加させることが
わかった。
【００４２】参考例６ ｒＴＦＰＩ−２によるＤＮＡ合成の誘導（１） 参考例５と同様に、ウシ大動脈平滑筋細胞を９６ウエル
プレートに播種し、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭによ
り細胞増殖を停止させた。４８時間後、新鮮な培地（Ｄ
ＭＥＭ＋０．１％ＦＣＳ）と種々の濃度の参考例４で精
製されたｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５００ｎＭ）
を、前記増殖停止細胞に同時に添加した。２４時間後、
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添
加し、Biotrak 細胞増殖ＥＬＩＳＡシステム(Amersham
Pharmacia Biotech 社製) を用いて、ＤＮＡ合成中のＢ
ｒｄＵのＤＮＡへの取り込みを１２時間後に測定するこ
とによりＤＮＡ合成の検出を行なった（図４）。
プレートに播種し、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭによ
り細胞増殖を停止させた。４８時間後、新鮮な培地（Ｄ
ＭＥＭ＋０．１％ＦＣＳ）と種々の濃度の参考例４で精
製されたｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５００ｎＭ）
を、前記増殖停止細胞に同時に添加した。２４時間後、
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添
加し、Biotrak 細胞増殖ＥＬＩＳＡシステム(Amersham
Pharmacia Biotech 社製) を用いて、ＤＮＡ合成中のＢ
ｒｄＵのＤＮＡへの取り込みを１２時間後に測定するこ
とによりＤＮＡ合成の検出を行なった（図４）。
【００４３】図４より、ＢｒｄＵは、ｒＴＦＰＩ−２刺
激により用量依存的にＤＮＡに取り込まれることがわか
った。
激により用量依存的にＤＮＡに取り込まれることがわか
った。
【００４４】参考例７ ｒＴＦＰＩ−２によるＤＮＡ合成の誘導（２） 参考例６において、０．１％ＦＣＳの代わりに１０ｎｇ
／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、Upstate 社
製) を使用すること以外は参考例６と同様に、ｒＴＦＰ
Ｉ−２によるＤＮＡ合成の誘導を行なった（図５）。
／ｍｌの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、Upstate 社
製) を使用すること以外は参考例６と同様に、ｒＴＦＰ
Ｉ−２によるＤＮＡ合成の誘導を行なった（図５）。
【００４５】図５より、０．１％ＦＣＳの代わりに１０
ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを使用した場合でも、ＢｒｄＵ
は、ｒＴＦＰＩ−２の用量依存的にＤＮＡに取り込まれ
ることがわかった。
ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを使用した場合でも、ＢｒｄＵ
は、ｒＴＦＰＩ−２の用量依存的にＤＮＡに取り込まれ
ることがわかった。
【００４６】製造例１ 抗ＴＦＰＩ−２ポリクローナル抗体の製造と精製 １ｍｌのＰＢＳに溶解した、参考例４で精製した１００
μｇのｒＴＦＰＩ−２を等量のFreundの完全アジュバン
ト（WAKO製）と混合させてエマルジョンを形成させた
後、日本白色種家兎に皮下注射することにより初回免疫
を行なった。５０日後、１ｍｌのＰＢＳ中１００μｇの
ｒＴＦＰＩ−２を等量のFreundの不完全アジュバント
（WAKO製）と混合させてエマルジョンを形成させたもの
を追加免疫（ブースト）に使用した。ブースト後２０、
４０日目に家兎の動脈より採血して血清を分離した後、
−８０℃で凍結保存した。
μｇのｒＴＦＰＩ−２を等量のFreundの完全アジュバン
ト（WAKO製）と混合させてエマルジョンを形成させた
後、日本白色種家兎に皮下注射することにより初回免疫
を行なった。５０日後、１ｍｌのＰＢＳ中１００μｇの
ｒＴＦＰＩ−２を等量のFreundの不完全アジュバント
（WAKO製）と混合させてエマルジョンを形成させたもの
を追加免疫（ブースト）に使用した。ブースト後２０、
４０日目に家兎の動脈より採血して血清を分離した後、
−８０℃で凍結保存した。
【００４７】得られた抗血清より、常法に従ってプロテ
インＧカラムを用いてＩｇＧ画分を精製した。
インＧカラムを用いてＩｇＧ画分を精製した。
【００４８】実施例１ 抗ＴＦＰＩ−２ポリクローナル抗体によるＴＦＰＩ−２
の検出 （１）ウエスタンブロッティングによる参考例４で精製
したｒＴＦＰＩ−２の検出 参考例４で精製したｒＴＦＰＩ−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付し、常法によりウエスタンブロッティングを行なっ
た。ブロッティングされた膜を、製造例１で精製した抗
ＴＦＰＩ−２ポリクローナル抗体、次いで、市販のアル
カリフォスファターゼ結合抗ウサギ抗体を用いて常法に
よりインキュベートし、発色によりｒＴＦＰＩ−２を検
出した。
の検出 （１）ウエスタンブロッティングによる参考例４で精製
したｒＴＦＰＩ−２の検出 参考例４で精製したｒＴＦＰＩ−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付し、常法によりウエスタンブロッティングを行なっ
た。ブロッティングされた膜を、製造例１で精製した抗
ＴＦＰＩ−２ポリクローナル抗体、次いで、市販のアル
カリフォスファターゼ結合抗ウサギ抗体を用いて常法に
よりインキュベートし、発色によりｒＴＦＰＩ−２を検
出した。
【００４９】その結果、本発明の抗体は、３２ｋＤａの
分子量を有するｒＴＦＰＩ−２を検出することがわかっ
た。
分子量を有するｒＴＦＰＩ−２を検出することがわかっ
た。
【００５０】（２）ウエスタンブロッティングによるヒ
ト血液中のＴＦＰＩ−２の検出 心臓カテーテル検査中のヒトヘパリン採血１０ｍｌをヘ
パリンカラムによりアフィニティー濃縮後、前記（１）
と同様にＴＦＰＩ−２を検出した。
ト血液中のＴＦＰＩ−２の検出 心臓カテーテル検査中のヒトヘパリン採血１０ｍｌをヘ
パリンカラムによりアフィニティー濃縮後、前記（１）
と同様にＴＦＰＩ−２を検出した。
【００５１】その結果、本発明の抗体は、ヒトの血液中
のＴＦＰＩ−２を検出することがわかった。本発明の抗
体をＥＬＩＳＡに用いることにより、血液中のＴＦＰＩ
−２を定量することも可能である。
のＴＦＰＩ−２を検出することがわかった。本発明の抗
体をＥＬＩＳＡに用いることにより、血液中のＴＦＰＩ
−２を定量することも可能である。
【００５２】実施例２ 抗ＴＦＰＩ−２ポリクローナル抗体の交叉反応性 ＴＦＰＩ−１（三光純薬製）および参考例４で精製した
ｒＴＦＰＩ−２を、実施例１（１）と同様にウエスタン
ブロッティングを行ない、アルカリフォスファターゼを
用いた発色反応により検出した結果、本発明の抗体は、
ＴＦＰＩ−１を認識しないことがわかった。
ｒＴＦＰＩ−２を、実施例１（１）と同様にウエスタン
ブロッティングを行ない、アルカリフォスファターゼを
用いた発色反応により検出した結果、本発明の抗体は、
ＴＦＰＩ−１を認識しないことがわかった。
【００５３】実施例３ 抗ＴＦＰＩ−２ポリクローナル抗体によるＴＦＰＩ−２
の血管平滑筋増殖作用の阻止 参考例６において、ｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５
００ｎＭ）を添加し、製造例１で精製した抗ＴＦＰＩ−
２ポリクローナル抗体の連続希釈物をさらに添加した
後、ＢｒｄＵの取り込みによるウシ大動脈平滑筋細胞の
ＤＮＡ合成の検出を行なった。
の血管平滑筋増殖作用の阻止 参考例６において、ｒＴＦＰＩ−２（最終濃度：０〜５
００ｎＭ）を添加し、製造例１で精製した抗ＴＦＰＩ−
２ポリクローナル抗体の連続希釈物をさらに添加した
後、ＢｒｄＵの取り込みによるウシ大動脈平滑筋細胞の
ＤＮＡ合成の検出を行なった。
【００５４】その結果、前記抗体の添加によりＤＮＡ合
成が抑制され、本発明の抗体は、ＴＦＰＩ−２の血管平
滑筋増殖作用を阻止することがわかった。
成が抑制され、本発明の抗体は、ＴＦＰＩ−２の血管平
滑筋増殖作用を阻止することがわかった。
【００５５】
【発明の効果】本発明により、ＴＦＰＩ−１と交叉反応
しない、ＴＦＰＩ−２に特異的な抗体またはその断片が
提供され、かかる抗体等によりＴＦＰＩ−２の生理的な
役割が直接明らかにされ、ＴＦＰＩ−２の関与する種々
の病態の解明または治療法の研究が進展する。また、か
かる抗体またはその断片を含有する血管平滑筋増殖調節
剤は、ＴＦＰＩ−２の関与する種々の病態の治療または
予防に効果を奏する。さらに、かかる抗体またはその断
片を含有する診断薬は、ＴＦＰＩ−２の関与する疾患の
診断に有用である。
しない、ＴＦＰＩ−２に特異的な抗体またはその断片が
提供され、かかる抗体等によりＴＦＰＩ−２の生理的な
役割が直接明らかにされ、ＴＦＰＩ−２の関与する種々
の病態の解明または治療法の研究が進展する。また、か
かる抗体またはその断片を含有する血管平滑筋増殖調節
剤は、ＴＦＰＩ−２の関与する種々の病態の治療または
予防に効果を奏する。さらに、かかる抗体またはその断
片を含有する診断薬は、ＴＦＰＩ−２の関与する疾患の
診断に有用である。
【００５６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SHIONOGI & CO., LTD. <120> Tissue Factor Pathway Inhibitor -2 Antibody <130> SG-10-002 <160> 5
【００５７】 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 1 Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu 35 40 45 Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe 50 55 60 Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu 65 70 75 80 Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys 85 90 95 Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys 100 105 110 Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly 115 120 125 Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr 130 135 140 Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe 165 170 175 Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly 180 185 190 Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys 195 200 205 Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala 210 215 220 Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe 225 230 235
【００５８】 <210> 2 <211> 979 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (39)...(743) <400> 2 ggacgccttg cccagcgggc cgcccgaccc cctgcaccat ggaccccgct cgccccctgg 60 ggctgtcgat tctgctgctt ttcctgacgg aggctgcact gggcgatgct gctcaggagc 120 caacaggaaa taacgcggag atctgtctcc tgcccctaga ctacggaccc tgccgggccc 180 tacttctccg ttactactac gacaggtaca cgcagagctg ccgccagttc ctgtacgggg 240 gctgcgaggg caacgccaac aatttctaca cctgggaggc ttgcgacgat gcttgctgga 300 ggatagaaaa agttcccaaa gtttgccggc tgcaagtgag tgtggacgac cagtgtgagg 360 ggtccacaga aaagtatttc tttaatctaa gttccatgac atgtgaaaaa ttcttttccg 420 gtgggtgtca ccggaaccgg attgagaaca ggtttccaga tgaagctact tgtatgggct 480 tctgcgcacc aaagaaaatt ccatcatttt gctacagtcc aaaagatgag ggactgtgct 540 ctgccaatgt gactcgctat tattttaatc caagatacag aacctgtgat gctttcacct 600 atactggctg tggagggaat gacaataact ttgttagcag ggaggattgc aaacgtgcat 660 gtgcaaaagc tttgaaaaag aaaaagaaga tgccaaagct tcgctttgcc agtagaatcc 720 ggaaaattcg gaagaagcaa ttttaaacat tcttaatatg tcatcttgtt tgtctttatg 780 gcttatttgc ctttatggtt gtatctgaag aataatatga cagcatgagg aaacaaatca 840 ttggtgattt attcaccagt ttttattaat acaagtcact ttttcaaaaa tttggatttt 900 tttatatata actagctgct attcaaatgt gagtctacca tttttaattt atggttcaac 960 tgtttgtgag actgaattc 979
【００５９】 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile 5 10
【００６０】 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 4 atggaccccg ctcgcc 16
【００６１】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artifical Sequence <400> 5 gccataaaga caaacaagat 20
【図１】図１は、ProRPC HR 5/10カラムを用いた逆相高
速液体クロマトグラフィーの結果を示す。図中、点線
は、１５％アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦ
Ａまでの勾配を示し、黒塗りのピークは、増殖を停止さ
せたウシ大動脈平滑筋細胞に対する細胞増殖活性を示
す。
速液体クロマトグラフィーの結果を示す。図中、点線
は、１５％アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）から１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦ
Ａまでの勾配を示し、黒塗りのピークは、増殖を停止さ
せたウシ大動脈平滑筋細胞に対する細胞増殖活性を示
す。
【図２】図２は、精製した天然のＴＦＰＩ−２（レーン
Ｂ）およびｒＴＦＰＩ−２（レーンＣ）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す電気泳動の写真である。レーンＡは、
分子量マーカーを示し、各バンドは、上から、ホスホリ
ラーゼｂ：９４ｋＤａ；ウシ血清アルブミン：６７ｋＤ
ａ；オブアルブミン：４３ｋＤａ；カルボニックアンヒ
ドラーゼｂ：３０ｋＤａ；ダイズトリプシンインヒビタ
ー：２０．１ｋＤａ；α−ラクトアルブミン：１４．４
ｋＤａである。
Ｂ）およびｒＴＦＰＩ−２（レーンＣ）のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す電気泳動の写真である。レーンＡは、
分子量マーカーを示し、各バンドは、上から、ホスホリ
ラーゼｂ：９４ｋＤａ；ウシ血清アルブミン：６７ｋＤ
ａ；オブアルブミン：４３ｋＤａ；カルボニックアンヒ
ドラーゼｂ：３０ｋＤａ；ダイズトリプシンインヒビタ
ー：２０．１ｋＤａ；α−ラクトアルブミン：１４．４
ｋＤａである。
【図３】図３は、ウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の
濃度（０〜５００ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェ
ン活性を示すグラフである。グラフの各点は、６回の平
均を示し、縦線は、標準偏差を示す。
濃度（０〜５００ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェ
ン活性を示すグラフである。グラフの各点は、６回の平
均を示し、縦線は、標準偏差を示す。
【図４】図４は、低濃度の血清により増殖を停止させた
ウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の濃度（０〜５００
ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活性をＢｒＤＵ
の取り込みによって測定したグラフである。グラフの各
点は、６回の平均を示し、縦線は、標準偏差を示す。
ウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の濃度（０〜５００
ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活性をＢｒＤＵ
の取り込みによって測定したグラフである。グラフの各
点は、６回の平均を示し、縦線は、標準偏差を示す。
【図５】図５は、ＰＤＧＦ添加のＤＭＥＭにより増殖を
停止させたウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の濃度
（０〜５００ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活
性をＢｒＤＵの取り込みによって測定したグラフであ
る。グラフの各点は、６回の平均を示し、縦線は、標準
偏差を示す。
停止させたウシ大動脈平滑筋細胞に対する種々の濃度
（０〜５００ｎＭ）のｒＴＦＰＩ−２のマイトジェン活
性をＢｒＤＵの取り込みによって測定したグラフであ
る。グラフの各点は、６回の平均を示し、縦線は、標準
偏差を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/53 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 CA25 DA36 DA77 FB03 4B024 AA01 AA11 BA61 BA80 CA04 EA04 GA11 HA11 4B064 AG01 AG21 AG26 BA14 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4C085 AA13 AA19 CC03 EE01 GG01 4H045 AA11 BA10 CA40 DA75 DA86 EA23 EA24 EA50 FA72 FA74 HA05
Claims (4)
- 【請求項１】 ティッシュ・ファクター・パスウェイ・
インヒビター（ＴＦＰＩ）−１とは交叉反応しない、Ｔ
ＦＰＩ−２に特異的な抗体またはその断片。 - 【請求項２】 ＴＦＰＩ−２がヒト由来である請求項１
記載の抗体またはその断片。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の抗体またはその
断片を有効成分として含有してなる血管平滑筋増殖調節
剤。 - 【請求項４】 請求項１または２記載の抗体またはその
断片を含有してなる、血管の増殖に関連する疾患の診断
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10296759A JP2000128803A (ja) | 1998-10-19 | 1998-10-19 | ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10296759A JP2000128803A (ja) | 1998-10-19 | 1998-10-19 | ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000128803A true JP2000128803A (ja) | 2000-05-09 |
Family
ID=17837762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10296759A Pending JP2000128803A (ja) | 1998-10-19 | 1998-10-19 | ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000128803A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8450275B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-05-28 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8466108B2 (en) | 2008-12-19 | 2013-06-18 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8962563B2 (en) | 2009-12-21 | 2015-02-24 | Baxter International, Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| CN110437335A (zh) * | 2008-08-04 | 2019-11-12 | 拜耳医药保健有限公司 | 针对组织因子途径抑制剂(tfpi)的单克隆抗体 |
| CN114751976A (zh) * | 2021-08-31 | 2022-07-15 | 河南农业大学 | 一种用于制备鸡tfpi2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用 |
-
1998
- 1998-10-19 JP JP10296759A patent/JP2000128803A/ja active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110437335A (zh) * | 2008-08-04 | 2019-11-12 | 拜耳医药保健有限公司 | 针对组织因子途径抑制剂(tfpi)的单克隆抗体 |
| US9777051B2 (en) | 2008-12-19 | 2017-10-03 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| US11001613B2 (en) | 2008-12-19 | 2021-05-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8466108B2 (en) | 2008-12-19 | 2013-06-18 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US9873720B2 (en) | 2008-12-19 | 2018-01-23 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8962563B2 (en) | 2009-12-21 | 2015-02-24 | Baxter International, Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| JP2017105851A (ja) * | 2010-03-19 | 2017-06-15 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ | Ｔｆｐｉ阻害剤および使用方法 |
| US8450275B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-05-28 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US9556230B2 (en) | 2010-03-19 | 2017-01-31 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| US10201586B2 (en) | 2010-03-19 | 2019-02-12 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| US9018167B2 (en) | 2010-03-19 | 2015-04-28 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| JP2013522291A (ja) * | 2010-03-19 | 2013-06-13 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | Ｔｆｐｉ阻害剤および使用方法 |
| US11793855B2 (en) | 2010-03-19 | 2023-10-24 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | TFPI inhibitors and methods of use |
| US10800816B2 (en) | 2012-03-21 | 2020-10-13 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| CN114751976A (zh) * | 2021-08-31 | 2022-07-15 | 河南农业大学 | 一种用于制备鸡tfpi2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用 |
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