JP2000175686A - 改変型シグナルペプチドをコードするdna - Google Patents
改変型シグナルペプチドをコードするdnaInfo
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Abstract
チドのアミノ酸配列のN末端領域に、少なくとも一個の
塩基性アミノ酸を付加したアミノ酸配列からなる改変型
シグナルペプチドをコードするDNA。 【効果】 本発明によれば、酵母などの宿主細胞での組
換え型タンパク質生産量を大幅に増大させることが可能
となり、サイトカインをはじめとする種々の組換え型タ
ンパク質製剤のコストダウンが実現するようになる。
Description
の分泌量を増大させるための改変型シグナルペプチドを
コードするDNA、該DNAを含む組換え型タンパク質
分泌発現用プラスミド、および該プラスミドによって形
質転換した形質転換体に関する。
れたタンパク質を膜透過させる機能を有する。分泌性タ
ンパク質はリボソームで合成される際にそのN末端に1
5から30残基のアミノ酸からなるシグナルペプチドと
連結された形の前駆体として合成される。シグナルペプ
チドは大まかに3つの構造から構成されている。N末端
に近い部分は塩基性領域あるいはN末端領域と呼ばれて
おり、アルギニンやリシンなどの塩基性アミノ酸が含ま
れていて、大腸菌などの原核細胞ではそれらの正電荷に
よって膜表面(負電荷を帯びている)とおそらくイオン
結合し、これを足がかりにしてシグナルペプチドは膜内
へ貫入してゆくと考えられている。そしてシグナルペプ
チドとタンパク質との結合部分が膜から出てくるとき
に、膜内に存在するシグナルペプチダーゼによって結合
部で切断され、タンパク質部分だけが膜を透過して成熟
タンパク質となる。原核細胞では膜透過は細胞外への分
泌を意味する。真核細胞では膜透過によっていったん小
胞体内に入り、細胞内輸送系によって細胞外へと分泌さ
れる。
組換え型タンパク質の生産が行われている。しかし、サ
イトカインなど複雑な構造を有するタンパク質は大腸菌
などの原核細胞では正しく合成することができず、活性
や安定性の低下が問題となっている。これに対して酵母
や昆虫細胞などの真核細胞では、野生型に近い構造をも
った活性の高い組換え型サイトカインを合成することが
可能である。しかし、生産量が十分ではなく、特に分泌
生産ではバチルス・ルビウスのような原核細胞生産系と
比べて生産量は大幅に劣っている。この原因のひとつが
シグナルペプチドである。真核細胞ではシグナルペプチ
ドの構造条件がまだ十分には解明されていないため、遺
伝子組換えによってタンパク質を分泌生産する際には、
それぞれのタンパク質の固有のシグナル配列をそのまま
利用している場合が多い。しかし、サイトカインのよう
な生体内での存在量の少ないタンパク質では、分泌能の
低いシグナルペプチドが付属しているため、それをその
まま使ったのでは分泌生産量の向上が見込めず、組換え
型タンパク質製剤のコスト高の原因ともなっている。
チドは、真核細胞において最も存在量の多いタンパク質
の一つである卵白リゾチームの分泌を担っており、真核
細胞用では分泌能力の高いシグナルペプチドとして組換
え型タンパク質の分泌生産に用いられている。例えば、
野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドを用いてヒ
トリゾチームを酵母で分泌させる系が確立されている
(特開平3−70474号公報)。しかしながら、この
生産系をもってしても生産量は必ずしも満足できるもの
とは言えず、分泌量を向上させるためにはさらなる改良
が必要である。
トリリゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列を遺伝
子操作によって改変することによって、組換え型タンパ
ク質の分泌量を増大させることを目的とする。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端領域
に、少なくとも一個の塩基性アミノ酸を付加することに
よってシグナルペプチドと粗面小胞体表面との親和性を
高め、組換え型タンパク質の分泌量の増大をはかること
に成功し、本発明を完成するに到った。
る野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドのアミノ
酸配列のN末端領域に、少なくとも一個の塩基性アミノ
酸を付加したアミノ酸配列からなる改変型シグナルペプ
チドをコードするDNA、詳しくは、配列番号1で表さ
れる野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドのアミ
ノ酸配列の第1、第2番目のアミノ酸の間に、少なくと
も一個の塩基性アミノ酸を付加したアミノ酸配列からな
る改変型シグナルペプチドをコードするDNAである。
本発明はまた、上記DNAを含有する、組換え型タンパ
ク質分泌発現用プラスミドである。さらに、本発明は、
上記プラスミドによって形質転換された形質転換体であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
をコードするDNAは、配列番号1で表される野生型ニ
ワトリリゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列(Ju
ng, A., Sippel, A.E., Grez, M. and Schutz, G. 198
0, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 77,5759-5763)を改変
したものである。本発明においてアミノ酸配列の改変
は、配列番号1に記載のアミノ酸配列のN末端領域に、
少なくとも一個の塩基性アミノ酸、具体的には、当該ア
ミノ酸配列の第1、第2番目のアミノ酸の間に少なくと
も一個の塩基性アミノ酸を付加する。ここで、付加する
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、リシン、ヒスチ
ジン、好適にはアルギニンであり、付加する数は1〜3
個、好ましくは2個または3個である。
グナルペプチドをコードするDNAは、リン酸ジエステ
ル法などの通常のオリゴヌクレオチド化学的合成法によ
って合成すればよい。また、目的とする改変型シグナル
ペプチドのアミノ酸配列に基づいて遺伝子改変用プライ
マーを作製し、該プライマーを用いて野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドをコードするDNAを含むベ
クターにアニーリングし、常法にてPCRを行うことに
よって、目的とする改変型シグナルペプチドをコードす
るDNAを含む断片を増幅して得ることができる。
るDNAは、その下流に所望の分泌性タンパク質をコー
ドするDNAを連結し、これを適当なベクターに組み込
むことにより、分泌発現用プラスミドを構築することが
できる。改変型シグナルペプチドをコードするDNAと
分泌性タンパク質をコードするDNAの連結は、従来公
知の方法、例えばT4リガーゼなどを用いる酵素反応に
従えばよい。
るDNAと分泌性タンパク質をコードするDNAの連結
遺伝子を組込むためのベクターとしては、該ベクターに
挿入した連結遺伝子を宿主内で転写、翻訳できるような
ものであれば特に限定はないが、プロモーター、ターミ
ネーター、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、選
択マーカーなどが含まれているような適当なベクター、
例えば、pHIL-D2 、pHIL-S1 、pPIC9 、pESP-1、pESP-
2、pESP-3、pAUR101 、pAUR112 、pAUR123 、pAUR224
などの市販ベクターを用いることができる。
適当な宿主を公知の方法にて形質転換し、培養すること
により、融合タンパク質が細胞内(リボソーム)で合成
され、続いて細胞外に成熟タンパク質として効率よく分
泌される。上記の分泌発現用プラスミドで形質転換する
宿主としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、
ピキア・パストリス、サッカロマイセス・ポンベなどの
酵母、Spodoptera frugiperda 由来のSf9 及びSf2 、Tr
ichoplusia ni 由来のHIGHFIVE などの昆虫細胞、カイ
コなどの昆虫類、チャイニーズハムスターオバリー(C
HO)細胞などの動物細胞が挙げられる。
た宿主により分泌発現させるのに適したタンパク質とし
ては、例えば、リゾチーム、インターフェロンα、イン
ターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキ
ン1 〜18、成長ホルモン、上皮増殖因子、エリスロポエ
チンなどが例示される。形質転換した宿主を培養するた
めの培地・培養条件は、その宿主の培養に常套的に用い
られるもので行えばよい。また、培養終了後、細胞外に
分泌、蓄積された成熟タンパク質は、自体公知の方法に
従って、分離し、精製することができる。
の分離は、培養上清を遠心分離により採取するか、また
はペリペラズム画分を浸透圧ショック法により採取する
ことにより行うか、あるいはグラスビーズなどによって
細胞を物理的に破砕して採取する。また、分離した成熟
タンパク質は、通常のタンパク質の精製法、例えば塩
析、電気泳動、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィーなどに従って精製する
ことができる。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例1〕 (改変型ニワトリリゾチームシグナルペ
プチドによる組換え型タンパク質の分泌発現) (1) 改変型ニワトリリゾチームシグナルペプチドによ
る組換え型タンパク質発現用プラスミド(pCSHY−
R2、pCSHY−R3)の構築 ニワトリリゾチームシグナルペプチドとヒトリゾチーム
が連結されたアミノ酸配列をコードする人工遺伝子(Jig
ami, Y., Muraki, M., Harada, N., and Tanaka, H. 19
86, Gene, 43 : 273-279) を、大腸菌−酵母シャトルベ
クター(YEp51)及びENO1プロモーター領域遺
伝子と連結して、野生型ニワトリリゾチームシグナルペ
プチドによるヒトリゾチーム分泌発現系(pFJ105
3)を構築した(図1)。
ペプチドのN末端領域に、アルギニン残基を2つ(改変
型シグナルペプチド1)挿入したアミノ酸配列(図2、
配列番号2)、または3つ挿入した(改変型シグナルペ
プチド2)アミノ酸配列を設計した(図2、配列番号
3)。次に、上記改変型シグナルペプチド1、2のアミ
ノ酸配列に基づいてそれぞれ以下の遺伝子改変用のプラ
イマーを作成した。 遺伝子改変用プライマー1:(ctgacagctagagtcgacgtca
tgaggagaaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggct
gctctggggaaggtt : 配列番号4) 遺伝子改変用プライマー2:(ctgacagctagagtcgacgtca
tgagaaggagaaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctg
gctgctctggggaaggtt:配列番号5)
記遺伝子改変用プライマー1と逆プライマー1(gccaag
cttgatcattagacaccacaaccttgaacgta:配列番号6)を用
いたPCR法によってpFJ1053中のヒトリゾチー
ム遺伝子を連結したニワトリリゾチームシグナルペプチ
ドを増幅した(図1)。また、同様に、改変型シグナル
ペプチド2については、上記遺伝子改変用プライマー2
と逆プライマー1を用いたPCR法によってpFJ10
53中のヒトリゾチーム遺伝子を連結したニワトリリゾ
チームシグナルペプチドを増幅した(図1)。
グして塩基配列を確認したところ、予定する配列を有す
ることが確認された。これら遺伝子を制限酵素(SalI及
びHindIII)で切り出して上記と同じ大腸菌−酵母シャト
ルベクターに挿入し、改変型ニワトリリゾチームシグナ
ルペプチドによるヒトリゾチーム分泌発現系(pCSH
Y−R2、pCSHY−R3)を構築した(図1)。
ペプチドによる組換え型タンパク質の分泌 pCSHY−R2をパン酵母KK4 株に導入し、ロイシン
欠損培地で遺伝子発現コロニーを選択した。得られた組
換え型酵母を液体培地で4日間振盪培養し、培養上清を
回収した。培養上清中の組換え型ヒトリゾチームの存在
を確認するために、培養上清を細菌(M.lysodeikticus)
の細胞壁と混合し、溶菌活性を調べたところ、90ユニッ
ト以上の高い活性を示し、改変型ニワトリリゾチームシ
グナルペプチドによって組換え型ヒトリゾチームが分泌
されていることが示唆された。
換カラム(Mono S HR5/5, ファルマシア) で組換え型ヒ
トリゾチームを精製した。濃縮液をカラムに流したとこ
ろ、市販のヒトリゾチームを流した時と同じ塩濃度(NaC
l ; 190mM)で溶出され、培養上清中の組換型ヒトリゾチ
ームが市販のヒトリゾチームと物理化学的に同一のもの
であることが確認された。精製された組換え型ヒトリゾ
チームの吸光度(280nm)から濃度を測定したところ、分
泌量は培養液1リットル当たり4.65mgだった(図2)。
また、同様にしてpCSHY−R3をパン酵母KK4 株に
導入し、精製された組換え型ヒトリゾチームの吸光度
(280nm)から濃度を測定したところ、分泌量は培養液1
リットル当たり3.95mgだった(図2)。
グナルペプチドによるヒトリゾチーム発現系(pFJ1
053)では、同様にして測定した分泌量は培養液1リ
ットル当たり2.05mgだった(図2)。以上より、アルギ
ニン残基を挿入した本発明の改変型ニワトリリゾチーム
シグナルペプチドは野生型ニワトリリゾチームシグナル
に比べて約2倍の組換え型タンパク質分泌能を示した。
の組換え型タンパク質生産量を大幅に増大させることが
可能となり、サイトカインをはじめとする種々の組換え
型タンパク質製剤のコストダウンが実現するようにな
る。
acgta 38
す。
ナル配列のアミノ酸配列、およびこれらによる酵母系で
のヒトリゾチームの分泌量を示す。
Claims (6)
- 【請求項1】 配列番号1で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端領域
に、少なくとも一個の塩基性アミノ酸を付加したアミノ
酸配列からなる改変型シグナルペプチドをコードするD
NA。 - 【請求項2】 配列番号1で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列の第1、第2
番目のアミノ酸の間に、少なくとも一個の塩基性アミノ
酸を付加したアミノ酸配列からなる改変型シグナルペプ
チドをコードするDNA。 - 【請求項3】 配列番号1で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列の第1、第2
番目のアミノ酸の間に付加される塩基性アミノ酸が、Ar
g−Arg である、請求項2記載のDNA。 - 【請求項4】 配列番号1で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列の第1、第2
番目のアミノ酸の間に付加される塩基性アミノ酸が、Ar
g−Arg−Arg である、請求項2記載のDNA。 - 【請求項5】 請求項1から4のいずれか1項に記載の
DNAを含有する、組換え型タンパク質分泌発現用プラ
スミド。 - 【請求項6】 請求項5に記載のプラスミドによって形
質転換された形質転換体。
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JP10356062A JP3136356B2 (ja) | 1998-12-15 | 1998-12-15 | 改変型シグナルペプチドをコードするdna |
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014132876A (ja) * | 2013-01-11 | 2014-07-24 | National Agriculture & Food Research Organization | リゾチームの製造方法 |
US8853160B2 (en) | 2001-07-31 | 2014-10-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | GLP-1, exendin-4, peptide analogs and uses thereof |
JP2014223064A (ja) * | 2013-04-24 | 2014-12-04 | 東ソー株式会社 | シグナルペプチドおよびそれを用いたタンパク質製造方法 |
JP2015065936A (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-13 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ニワトリリゾチーム由来の分泌シグナルペプチドを用いたブタリゾチームの製造方法 |
-
1998
- 1998-12-15 JP JP10356062A patent/JP3136356B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JP2015065936A (ja) * | 2013-09-30 | 2015-04-13 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ニワトリリゾチーム由来の分泌シグナルペプチドを用いたブタリゾチームの製造方法 |
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