JP2000157297A - 川崎病因子の検出法 - Google Patents
川崎病因子の検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 川崎病の発症期に検出可能な因子の検出法を
提供する。 【解決手段】 Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞数の増加、又はＶ
β６.５及びＶβ２.１陽性Ｔ細胞数の増加を指標とする
川崎病因子の検出法。
提供する。 【解決手段】 Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞数の増加、又はＶ
β６.５及びＶβ２.１陽性Ｔ細胞数の増加を指標とする
川崎病因子の検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、川崎病の発症に関
与する川崎病因子の検出法に関する。
与する川崎病因子の検出法に関する。
【０００２】
【従来技術と発明が解決しようとする課題】川崎病は、
１９６３年川崎冨作により初めて報告された乳幼児期に
認められる病気であり、近年では、人種毎の発症頻度が
異なるものの世界各地で発症例が報告されている。川崎
病は男児に好発し、その患者年齢としては４才以下が80
〜85％を占めているが、年長者にも発症が認められてい
る。また、冠動脈障害や冠動脈瘤による突然死をきたす
こともある。死亡頻度は、0.3〜0.5％であるが、乳幼児
における心臓疾患の主要原因でもある。また、後遺症と
して冠状動脈瘤及び狭窄を来すことがあり、心筋梗塞の
原因となる。発症初期におけるガンマグロブリン療法等
により冠動脈瘤形成頻度の減少が認められるものの、ガ
ンマグロブリン療法の無効例も多く存在している。川崎
病はその病態が、ブドウ球菌由来の細菌外毒素（TSST−
1：スーパー抗原の一種）による毒素性ショック症候群
（Toxic shock Syndrom: TSS）等に見られる全身性の症
状に類似しており、リンパ球、マクロファージ系の細胞
活性化を初めとした免疫学的変化顕著である（臨床免
疫,26(7): 738-744, 1994）。更には、患者の急性期末
梢血リンパ球においてＶβ２及びＶβ８陽性Ｔ細胞が選
択的に増加しているとの報告もあり（J., Kotozin, B.
L., Jujo, K., Melish, M.E., Glode, M.P., Kohsaka,
T. and Leung, D.Y.M. (1992) Selective expansion of
T cells expressing T-cell receptor variable region
s V beta 2 and V beta8 in Kawasaki disease, Proc N
atl Acad Sci USA 89, 4066; Abe J., Kotozin,B.L., M
eissner, C., Melish, M.E., Masato, T., Fuluton,
D., Romagne, F.,Malissen, B. and Leung, D.Y.M. (19
93) Characterization of T cell repertoire changes
in acute Kawasaki disease, J Exp Med 177,791; Curt
is, N., Zheng, R., Lamb, J.R. and Levin, M.(1995)
Evidence for superantigen mediated process in Kawa
saki disease, Arch Dis Child 72, 308; Donald et. a
l.,1995, J. Immunol. (1995), 155: 5018-5021)、その
発症にはスーパー抗原(SA)の関与が示唆されていた。
１９６３年川崎冨作により初めて報告された乳幼児期に
認められる病気であり、近年では、人種毎の発症頻度が
異なるものの世界各地で発症例が報告されている。川崎
病は男児に好発し、その患者年齢としては４才以下が80
〜85％を占めているが、年長者にも発症が認められてい
る。また、冠動脈障害や冠動脈瘤による突然死をきたす
こともある。死亡頻度は、0.3〜0.5％であるが、乳幼児
における心臓疾患の主要原因でもある。また、後遺症と
して冠状動脈瘤及び狭窄を来すことがあり、心筋梗塞の
原因となる。発症初期におけるガンマグロブリン療法等
により冠動脈瘤形成頻度の減少が認められるものの、ガ
ンマグロブリン療法の無効例も多く存在している。川崎
病はその病態が、ブドウ球菌由来の細菌外毒素（TSST−
1：スーパー抗原の一種）による毒素性ショック症候群
（Toxic shock Syndrom: TSS）等に見られる全身性の症
状に類似しており、リンパ球、マクロファージ系の細胞
活性化を初めとした免疫学的変化顕著である（臨床免
疫,26(7): 738-744, 1994）。更には、患者の急性期末
梢血リンパ球においてＶβ２及びＶβ８陽性Ｔ細胞が選
択的に増加しているとの報告もあり（J., Kotozin, B.
L., Jujo, K., Melish, M.E., Glode, M.P., Kohsaka,
T. and Leung, D.Y.M. (1992) Selective expansion of
T cells expressing T-cell receptor variable region
s V beta 2 and V beta8 in Kawasaki disease, Proc N
atl Acad Sci USA 89, 4066; Abe J., Kotozin,B.L., M
eissner, C., Melish, M.E., Masato, T., Fuluton,
D., Romagne, F.,Malissen, B. and Leung, D.Y.M. (19
93) Characterization of T cell repertoire changes
in acute Kawasaki disease, J Exp Med 177,791; Curt
is, N., Zheng, R., Lamb, J.R. and Levin, M.(1995)
Evidence for superantigen mediated process in Kawa
saki disease, Arch Dis Child 72, 308; Donald et. a
l.,1995, J. Immunol. (1995), 155: 5018-5021)、その
発症にはスーパー抗原(SA)の関与が示唆されていた。
【０００３】また、ガンマグロブリン療法が川崎病に奏
効するということも、川崎病の発症にスーパー抗原が関
与することを示唆している。即ち、ガンマグロブリン製
剤中にブドウ球菌由来スーパー抗原に対する抗体が存在
し、この抗SA抗体がSAによるＴ細胞活性化特異的に抑制
するとの報告（Takei, S., Arora, Y.K. and Walker,M.
(1993) Intravenous immunoglobulin contains specif
ic antibodies inhibitory to activation of T cell b
y staphylococcal toxin superantigens, J.Clin Inves
t, 91, 602-607)がある。しかしながら、その病因は未
だ解明されていない状態である。
効するということも、川崎病の発症にスーパー抗原が関
与することを示唆している。即ち、ガンマグロブリン製
剤中にブドウ球菌由来スーパー抗原に対する抗体が存在
し、この抗SA抗体がSAによるＴ細胞活性化特異的に抑制
するとの報告（Takei, S., Arora, Y.K. and Walker,M.
(1993) Intravenous immunoglobulin contains specif
ic antibodies inhibitory to activation of T cell b
y staphylococcal toxin superantigens, J.Clin Inves
t, 91, 602-607)がある。しかしながら、その病因は未
だ解明されていない状態である。
【０００４】従来、本症の診断は、1) ５日以上続く発
熱；2) 四肢末端の変化；硬性浮腫、紅斑等；3) 不定形
発疹；4) 両眼球結膜の充血；5) 口唇、口腔所見；口腔
の紅潮、イチゴ舌、口腔咽頭粘膜のびまん性発赤；6)
急性期における非化膿性頚部リンパ節腫眼からなる臨床
症状の内、５つ以上の症状を伴うことを基準として行わ
れている。しかし、必ずしもこれら主要症状が早期に揃
って出現するとは限らず、特に年長発症の場合には、重
症例が多い上、主要症状の出現に時間がかかることか
ら、早期に的確な診断を行うための基準の確立が強く求
められている。
熱；2) 四肢末端の変化；硬性浮腫、紅斑等；3) 不定形
発疹；4) 両眼球結膜の充血；5) 口唇、口腔所見；口腔
の紅潮、イチゴ舌、口腔咽頭粘膜のびまん性発赤；6)
急性期における非化膿性頚部リンパ節腫眼からなる臨床
症状の内、５つ以上の症状を伴うことを基準として行わ
れている。しかし、必ずしもこれら主要症状が早期に揃
って出現するとは限らず、特に年長発症の場合には、重
症例が多い上、主要症状の出現に時間がかかることか
ら、早期に的確な診断を行うための基準の確立が強く求
められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、川崎病の
的確な早期診断を確立するために、鋭意研究を重ねた結
果、川崎病の発症期の患者に、川崎病に特異的な因子の
存在を示唆する、科学的に検出可能な徴候が現れている
ことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発
明は、Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞数の増加、又はＶβ６.５及
びＶβ２.１陽性Ｔ細胞数の増加を指標とする、川崎病
因子の検出法を提供するものである。「川崎病因子」と
は、川崎病の臨床症状を顕在化させる因子を意味し、何
らかの原因で川崎病に罹患した患者の血中に存在する病
因物質を含む。そのような物質として、例えば、細菌性
スーパー抗原の可能性がある。スーパー抗原の代表例と
して、Ａ群連鎖球菌由来の外毒素（Streptococcal pyog
enic exptoxin C(SPEC))を挙げることができる。
的確な早期診断を確立するために、鋭意研究を重ねた結
果、川崎病の発症期の患者に、川崎病に特異的な因子の
存在を示唆する、科学的に検出可能な徴候が現れている
ことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発
明は、Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞数の増加、又はＶβ６.５及
びＶβ２.１陽性Ｔ細胞数の増加を指標とする、川崎病
因子の検出法を提供するものである。「川崎病因子」と
は、川崎病の臨床症状を顕在化させる因子を意味し、何
らかの原因で川崎病に罹患した患者の血中に存在する病
因物質を含む。そのような物質として、例えば、細菌性
スーパー抗原の可能性がある。スーパー抗原の代表例と
して、Ａ群連鎖球菌由来の外毒素（Streptococcal pyog
enic exptoxin C(SPEC))を挙げることができる。
【０００６】本発明の川崎病因子の検出法を実施するに
は、川崎病を疑われる患者から末梢血を得、ＴＣＲＶ領
域の遺伝子群を増幅し、ＴＣＲＶサブファミリーの発現
頻度を検出し、Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞、又はＶβ６.５陽
性Ｔ細胞及びＶβ２.１陽性Ｔ細胞の増加を評価する。
Ｔ細胞のＶβレパートリーは、当該技術分野で既知の任
意の方法で増幅し、発現を調べることができる。例え
ば、患者から末梢血を得、トータルＲＮＡを抽出し、既
知のアダプター付加ＰＣＲ（アダプターライゲーション
ＰＣＲ＝ＡＬ−ＰＣＲ）でＴＣＲＶ領域の遺伝子群を増
幅し、リバース・ドット・ブロット法（Reverse dot bl
otting）により、ＴＣＲＶサブファミリーに特異的なオ
リゴプローブを用いて、それらサブファミリーの発現状
態を調べ、ＴＣＲＶβ６.５、又はＴＣＲＶβ６.５及び
ＴＣＲＶβ２.１サブファミリーの発現頻度の有意な増
大（絶対的及び/又は相対的）を比較する。リバース・
ドット・ブロット法に用いるオリゴヌクレオチドプロー
ブは、ＴＣＲＶβサブファミリーに特異的であり、少な
くとも、ＴＣＲＶβ２.１及びＴＣＲＶβ６.５に対応す
るプローブを含むことを条件として任意である。本発明
の実施に用いることができるオリゴヌクレオチドプロー
ブの一例として、表７〜１３に記載のオリゴヌクレオチ
ドプローブが挙げられる。これらは配列番号１０及び１
１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（表１０のVB02-1及び表１１のVB06-4、それぞれＴ
ＣＲＶβ２.１及びＴＣＲＶβ６.５に対応する）と、配
列番号１２〜９６に記載のオリゴヌクレオチドを含む。
これらオリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、最終
的に得られたサブファミリーの発現頻度のデータから、
配列番号１０及び１１に記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブに対応するＴＣＲＶβ６.５、又はＴＣＲＶβ６.５
及びＴＣＲＶβ２.１サブファミリーの発現頻度が他の
サブファミリーの発現頻度よりも有意に高いことを指標
として、川崎病因子の存在を決定すればよい。
は、川崎病を疑われる患者から末梢血を得、ＴＣＲＶ領
域の遺伝子群を増幅し、ＴＣＲＶサブファミリーの発現
頻度を検出し、Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞、又はＶβ６.５陽
性Ｔ細胞及びＶβ２.１陽性Ｔ細胞の増加を評価する。
Ｔ細胞のＶβレパートリーは、当該技術分野で既知の任
意の方法で増幅し、発現を調べることができる。例え
ば、患者から末梢血を得、トータルＲＮＡを抽出し、既
知のアダプター付加ＰＣＲ（アダプターライゲーション
ＰＣＲ＝ＡＬ−ＰＣＲ）でＴＣＲＶ領域の遺伝子群を増
幅し、リバース・ドット・ブロット法（Reverse dot bl
otting）により、ＴＣＲＶサブファミリーに特異的なオ
リゴプローブを用いて、それらサブファミリーの発現状
態を調べ、ＴＣＲＶβ６.５、又はＴＣＲＶβ６.５及び
ＴＣＲＶβ２.１サブファミリーの発現頻度の有意な増
大（絶対的及び/又は相対的）を比較する。リバース・
ドット・ブロット法に用いるオリゴヌクレオチドプロー
ブは、ＴＣＲＶβサブファミリーに特異的であり、少な
くとも、ＴＣＲＶβ２.１及びＴＣＲＶβ６.５に対応す
るプローブを含むことを条件として任意である。本発明
の実施に用いることができるオリゴヌクレオチドプロー
ブの一例として、表７〜１３に記載のオリゴヌクレオチ
ドプローブが挙げられる。これらは配列番号１０及び１
１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（表１０のVB02-1及び表１１のVB06-4、それぞれＴ
ＣＲＶβ２.１及びＴＣＲＶβ６.５に対応する）と、配
列番号１２〜９６に記載のオリゴヌクレオチドを含む。
これらオリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、最終
的に得られたサブファミリーの発現頻度のデータから、
配列番号１０及び１１に記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブに対応するＴＣＲＶβ６.５、又はＴＣＲＶβ６.５
及びＴＣＲＶβ２.１サブファミリーの発現頻度が他の
サブファミリーの発現頻度よりも有意に高いことを指標
として、川崎病因子の存在を決定すればよい。
【０００７】別法として、Ｖβ２.１及びＶβ６.５に特
異的なプライマーで増幅し、その後、増幅量を定量して
もよい。定量法としては、電気泳動に供し、ハウスキー
ピング遺伝子をインナーコントロールとして定量するこ
とができる。川崎病因子の存在は、ＴＣＲＶβ鎖におけ
る、Ｖβ２.１及びＶβ６.５を検出し、Ｖβ２.１とＶ
β６.５陽性Ｔ細胞が、川崎病発症期において発現量の
増加が健常人群コントロールの平均値に比べ有意に高い
場合を陽性、低い場合を陰性とする。その他のファクタ
ー、例えば、Ｔ細胞の増加がポリクローナルであるこ
と、各種炎症性サイトカインの増加、従来の症状の発現
も診断に際して補助的に用いることができる。
異的なプライマーで増幅し、その後、増幅量を定量して
もよい。定量法としては、電気泳動に供し、ハウスキー
ピング遺伝子をインナーコントロールとして定量するこ
とができる。川崎病因子の存在は、ＴＣＲＶβ鎖におけ
る、Ｖβ２.１及びＶβ６.５を検出し、Ｖβ２.１とＶ
β６.５陽性Ｔ細胞が、川崎病発症期において発現量の
増加が健常人群コントロールの平均値に比べ有意に高い
場合を陽性、低い場合を陰性とする。その他のファクタ
ー、例えば、Ｔ細胞の増加がポリクローナルであるこ
と、各種炎症性サイトカインの増加、従来の症状の発現
も診断に際して補助的に用いることができる。
【０００８】実施例１ 表１に示す川崎病患者２２名の治療前（発症期)、治療
後（７９日以上経過後）及び発熱を伴う川崎病以外の疾
患群の子供１４名、及び健常群の大人１０名について末
梢血中のＴＣＲＶレパートリーを表２に示すオリゴヌク
レオチドプライマーを用いるアダプター付加ＰＣＲ法で
増幅し、表７〜１３に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いるリバース・ドット・ブロット法でＴＣＲＶサ
ブファミリーの発現状態を調べ、ＴＣＲＶβ６.５及び
ＴＣＲＶβ２.１サブファミリーの発現頻度を解析し
た。 Ｉ． ＴＣＲＶ領域の増幅表１ 川崎病因子の検出対象
後（７９日以上経過後）及び発熱を伴う川崎病以外の疾
患群の子供１４名、及び健常群の大人１０名について末
梢血中のＴＣＲＶレパートリーを表２に示すオリゴヌク
レオチドプライマーを用いるアダプター付加ＰＣＲ法で
増幅し、表７〜１３に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いるリバース・ドット・ブロット法でＴＣＲＶサ
ブファミリーの発現状態を調べ、ＴＣＲＶβ６.５及び
ＴＣＲＶβ２.１サブファミリーの発現頻度を解析し
た。 Ｉ． ＴＣＲＶ領域の増幅表１ 川崎病因子の検出対象
【表１】
【０００９】表２ アダプター付加ＰＣＲ法及びＴＣＲ
αβcＤＮＡの増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライ
マー
αβcＤＮＡの増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライ
マー
【表２】
【００１０】表２のＴＣＲαβｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用
オリゴヌクレオチドプライマーの内、ＣＡ１（配列番号
４）、ＣＡ２（配列番号５）及びＣＡ３（配列番号６）
は２種類のＣα領域の共通部分に、ＣＢ１（配列番号
７）、ＣＢ２（配列番号８）及びＣＢ３（配列番号９）
は２種類のＣβ領域の共通配列上に、それぞれ対応する
よう設定されている。
オリゴヌクレオチドプライマーの内、ＣＡ１（配列番号
４）、ＣＡ２（配列番号５）及びＣＡ３（配列番号６）
は２種類のＣα領域の共通部分に、ＣＢ１（配列番号
７）、ＣＢ２（配列番号８）及びＣＢ３（配列番号９）
は２種類のＣβ領域の共通配列上に、それぞれ対応する
よう設定されている。
【００１１】（１）ｃＤＮＡの合成 表２に記載のＰＣＲプライマーＰ１０ＥＡ（配列番号
１）、Ｐ２０ＥＡ（配列番号２）及びＢＳＬ−１８（配
列番号３）を用いた。対象から末梢血５−１０mlを採取
し、Ficoll-Hypaque (ファルマシア社)を用いてＰＢＭ
Ｃと血清に分けた。Trizol-Reagents(BRL社)を使用し、
業者の指示に従って、ＰＢＭＣよりトータルＲＮＡを抽
出した。抽出したＲＮＡから、Adaptor−ligation ＰＣ
Ｒ法（Tsuruta, Y., Iwagami,S., Furue, S., Teraoka,
H., Yoshida, T., Sakata, T. and Suzuki, R. (1993)
Detection of human T cell receptor cDNAs (α、
β、γ、and δ）by ligation of a universal adaptor
to variable region J Immunol Methods 161, 7)によ
り、ＴＣＲ Ｖ領域を含む遺伝子群を増幅した。まず、
抽出されたＲＮＡから、ＢＳＬ−１８プライマー（表２
及び配列番号３）を用いて、１stストランドＤＮＡを合
成し、次いで、２ndストランドＤＮＡを合成し、フェノ
ール抽出し、次いでポリエチレングリコール（PEG)を用
いたＤＮＡ沈殿法で余分なＢＳＬ−１８を除去し、精製
した。
１）、Ｐ２０ＥＡ（配列番号２）及びＢＳＬ−１８（配
列番号３）を用いた。対象から末梢血５−１０mlを採取
し、Ficoll-Hypaque (ファルマシア社)を用いてＰＢＭ
Ｃと血清に分けた。Trizol-Reagents(BRL社)を使用し、
業者の指示に従って、ＰＢＭＣよりトータルＲＮＡを抽
出した。抽出したＲＮＡから、Adaptor−ligation ＰＣ
Ｒ法（Tsuruta, Y., Iwagami,S., Furue, S., Teraoka,
H., Yoshida, T., Sakata, T. and Suzuki, R. (1993)
Detection of human T cell receptor cDNAs (α、
β、γ、and δ）by ligation of a universal adaptor
to variable region J Immunol Methods 161, 7)によ
り、ＴＣＲ Ｖ領域を含む遺伝子群を増幅した。まず、
抽出されたＲＮＡから、ＢＳＬ−１８プライマー（表２
及び配列番号３）を用いて、１stストランドＤＮＡを合
成し、次いで、２ndストランドＤＮＡを合成し、フェノ
ール抽出し、次いでポリエチレングリコール（PEG)を用
いたＤＮＡ沈殿法で余分なＢＳＬ−１８を除去し、精製
した。
【００１２】（２）アダプターの付加 １）Ｐ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターの調製 RNaseを含有しない滅菌水(和光純薬）に溶かした各１０
０pmol／μｌのＰ２０ＥＡとＰ１０ＥＡ（配列番号２及
び１）を、１.５ｍｌスクリューキャップ付き滅菌チュ
ーブ内で１：１の割合で混合し、蓋をして７０℃で10分
間加熱し、室温まで徐冷した。得られたＰ２０ＥＡ／Ｐ
１０ＥＡ溶液を冷房室に移し10℃以下になった時点で−
70℃にて凍結させ、使用するまで−20℃で保存した。
０pmol／μｌのＰ２０ＥＡとＰ１０ＥＡ（配列番号２及
び１）を、１.５ｍｌスクリューキャップ付き滅菌チュ
ーブ内で１：１の割合で混合し、蓋をして７０℃で10分
間加熱し、室温まで徐冷した。得られたＰ２０ＥＡ／Ｐ
１０ＥＡ溶液を冷房室に移し10℃以下になった時点で−
70℃にて凍結させ、使用するまで−20℃で保存した。
【００１３】２）２本鎖ｃＤＮＡに対するアダプターの
付加 氷上で、２本鎖ｃＤＮＡ溶液（12.5μｌ）、x5 T4 DNA
Ligase Buffer (BRL;250 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM
MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT,25%(W/V) PEG8000)（5.0
μl = x1 buffer)、50 pmol/μl P20EA/P10EA アダプ
ター(5.0μl,10μＭ）、Ｔ4 DNA Ligase (BRL) （2.5μ
l)を混合し、合計２５.０μlの反応液をピペッティング
及びタッピングで良く攪拌し、4℃でFlash遠心した後、
16℃で20時間靜置した。反応終了後、4℃でFlash遠心し
た。次いで、アダプターを付加した２本鎖ｃＤＮＡをフ
ェノール抽出で精製し、ＰＥＧを用いるＤＮＡ沈殿によ
り余分なＰ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターを除去し
た。
付加 氷上で、２本鎖ｃＤＮＡ溶液（12.5μｌ）、x5 T4 DNA
Ligase Buffer (BRL;250 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM
MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT,25%(W/V) PEG8000)（5.0
μl = x1 buffer)、50 pmol/μl P20EA/P10EA アダプ
ター(5.0μl,10μＭ）、Ｔ4 DNA Ligase (BRL) （2.5μ
l)を混合し、合計２５.０μlの反応液をピペッティング
及びタッピングで良く攪拌し、4℃でFlash遠心した後、
16℃で20時間靜置した。反応終了後、4℃でFlash遠心し
た。次いで、アダプターを付加した２本鎖ｃＤＮＡをフ
ェノール抽出で精製し、ＰＥＧを用いるＤＮＡ沈殿によ
り余分なＰ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡアダプターを除去し
た。
【００１４】３）ＴＣＲ遺伝子Ｃ領域側に付いたアダプ
ターの切断 上記２）で得た34.0μlのアダプター付加２本鎖ｃＤＮ
Ａに、氷上で、0.1% Triton-X(5.0μｌ, 0.01%, TAKAR
A）,0.1% BSA (5.0μl, 0.01%, TAKARA), x10 buffer H
(5.0 μｌ, x1 buffer, TAKARA)を混合し、最後に Not
I (約５０Ｕ／μｌ, TAKARA）を加えて、合計50.0μｌ
の混合液をタッピングにより良く混合し、4℃でFlash遠
心を行った後、37℃で2時間靜置した。反応終了後、直
ちに氷上に移した。次いで、NotI処理した2本鎖ｃＤＮ
Ａをフェノール抽出して精製し、ＰＥＧを用いるＤＮＡ
沈殿法でNotI処理により生じたＰ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡ
アダプターを除去した。得られたＤＮＡを２０μｌの滅
菌水に懸濁し、‐20℃で保存した。
ターの切断 上記２）で得た34.0μlのアダプター付加２本鎖ｃＤＮ
Ａに、氷上で、0.1% Triton-X(5.0μｌ, 0.01%, TAKAR
A）,0.1% BSA (5.0μl, 0.01%, TAKARA), x10 buffer H
(5.0 μｌ, x1 buffer, TAKARA)を混合し、最後に Not
I (約５０Ｕ／μｌ, TAKARA）を加えて、合計50.0μｌ
の混合液をタッピングにより良く混合し、4℃でFlash遠
心を行った後、37℃で2時間靜置した。反応終了後、直
ちに氷上に移した。次いで、NotI処理した2本鎖ｃＤＮ
Ａをフェノール抽出して精製し、ＰＥＧを用いるＤＮＡ
沈殿法でNotI処理により生じたＰ２０ＥＡ／Ｐ１０ＥＡ
アダプターを除去した。得られたＤＮＡを２０μｌの滅
菌水に懸濁し、‐20℃で保存した。
【００１５】（３）ＰＣＲ ＰＣＲは、以下の表に示すプライマーセットを用いて行
った。表３ ＰＣＲ用プライマーセット
った。表３ ＰＣＲ用プライマーセット
【表３】
【００１６】１）第１回（１st）ＰＣＲ 上記（２）で最終的に２０μｌに調製したｃＤＮＡを0.
5ml滅菌チューブに１μlずつ分注し、氷上で保管した。
x10 ＰＣＲ用バッファー(Promega)、25mM MgCl2(Promeg
a)、P20EA/CA1及びP20EA/CB1プライマーセット（50pmol
/μl）、25mM dNTP mix(g)を氷上で解凍し、ボルテック
スで攪拌した後、Flash遠心により溶液を回収した。上
記の試薬を用い、α、β各500μl（10回分）の１stＰＣ
Ｒ溶液を氷上で以下の組成に従い調製した。
5ml滅菌チューブに１μlずつ分注し、氷上で保管した。
x10 ＰＣＲ用バッファー(Promega)、25mM MgCl2(Promeg
a)、P20EA/CA1及びP20EA/CB1プライマーセット（50pmol
/μl）、25mM dNTP mix(g)を氷上で解凍し、ボルテック
スで攪拌した後、Flash遠心により溶液を回収した。上
記の試薬を用い、α、β各500μl（10回分）の１stＰＣ
Ｒ溶液を氷上で以下の組成に従い調製した。
【００１７】表４ α、β鎖用１stＰＣＲ溶液
【表４】 混合物を良く攪拌し、Flash遠心したのち、α、β各４
９０μｌ(10回分）の1stＰＣＲ溶液を、先にｃＤＮＡを
分注しておいたチューブに４９μlずつ分注した。残っ
たＰＣＲ溶液は、ネガティブコントロールに用いた。
α、β各10本ずつのチューブにミネラルオイル（SIGM
A）約５０μlを分注し、合計１５０μlの混合液を用い
て以下の手順でＰＣＲ増幅を行った（変成94℃30秒を１
サイクル、変成94℃１分、アニール55℃、1.5分、伸長7
2℃、2分を２０サイクル、Last extension72℃、5分以
下で4℃で保存）。Flash遠心後、-70℃に靜置し、氷結
させた。室温に戻し、ミネラルオイルのみが解凍した時
点で、マイクロピペットによりこれを除去した。
９０μｌ(10回分）の1stＰＣＲ溶液を、先にｃＤＮＡを
分注しておいたチューブに４９μlずつ分注した。残っ
たＰＣＲ溶液は、ネガティブコントロールに用いた。
α、β各10本ずつのチューブにミネラルオイル（SIGM
A）約５０μlを分注し、合計１５０μlの混合液を用い
て以下の手順でＰＣＲ増幅を行った（変成94℃30秒を１
サイクル、変成94℃１分、アニール55℃、1.5分、伸長7
2℃、2分を２０サイクル、Last extension72℃、5分以
下で4℃で保存）。Flash遠心後、-70℃に靜置し、氷結
させた。室温に戻し、ミネラルオイルのみが解凍した時
点で、マイクロピペットによりこれを除去した。
【００１８】２）第２回(２nd）ＰＣＲ 上記１）で増幅したＰＣＲ産物を、0.5ml滅菌チューブ
に５μlずつ、ネガティブコントロールとして増幅した
産物は２μｌを分注し、氷上で保管した。x10 ＰＣＲ用
バッファー(Promega)、25mM MgCl2(Promega)、P20EA/CA
2及びP20EA/CB2プライマーセット（5pmol/μl）、25mM
dNTP mix(TOYOBO)を氷上で解凍し、ボルテックスで良く
攪拌した後、Flash遠心により溶液を回収した。上記の
試薬を用い、α、β各500μl（10回分）の２ndＰＣＲ溶
液を氷上で以下の組成に従い調製した。
に５μlずつ、ネガティブコントロールとして増幅した
産物は２μｌを分注し、氷上で保管した。x10 ＰＣＲ用
バッファー(Promega)、25mM MgCl2(Promega)、P20EA/CA
2及びP20EA/CB2プライマーセット（5pmol/μl）、25mM
dNTP mix(TOYOBO)を氷上で解凍し、ボルテックスで良く
攪拌した後、Flash遠心により溶液を回収した。上記の
試薬を用い、α、β各500μl（10回分）の２ndＰＣＲ溶
液を氷上で以下の組成に従い調製した。
【００１９】表５ α、β鎖用２ndＰＣＲ溶液
【表５】 混合物を良く攪拌し、Flash遠心したのち、α、β各４
５０μｌ(10回分）の2ndＰＣＲ溶液を、先にｃＤＮＡを
分注しておいたチューブに４５μlずつ分注した。残っ
たＰＣＲ溶液のうち、18μlをネガティブコントロール
増幅に用いた。α、β各10本ずつのチューブにミネラル
オイル（SIGMA）を分注し、以下の手順でＰＣＲ増幅を
行った（変成94℃30秒を１サイクル、変成94℃１分、ア
ニール55℃、1.5分、伸長72℃、2分を２０サイクル、La
st extension72℃、5分以下で4℃で保存）。Flash遠心
後、-70℃に靜置し、氷結させた。室温に戻し、ミネラ
ルオイルのみが解凍した時点で、マイクロピペットによ
りこれを除去した。第2回のＰＣＲ産物５μｌに２μｌ
の電気泳動用色素を加えた。x１ＴＡＥ中で定電圧100ｍ
ｖの条件で、１％アガロース電気泳動を行い、サイズ分
画されたＤＮＡをエチジウムブロマイド染色し、トラン
スイルミネーターを用い、増幅を確認した。
５０μｌ(10回分）の2ndＰＣＲ溶液を、先にｃＤＮＡを
分注しておいたチューブに４５μlずつ分注した。残っ
たＰＣＲ溶液のうち、18μlをネガティブコントロール
増幅に用いた。α、β各10本ずつのチューブにミネラル
オイル（SIGMA）を分注し、以下の手順でＰＣＲ増幅を
行った（変成94℃30秒を１サイクル、変成94℃１分、ア
ニール55℃、1.5分、伸長72℃、2分を２０サイクル、La
st extension72℃、5分以下で4℃で保存）。Flash遠心
後、-70℃に靜置し、氷結させた。室温に戻し、ミネラ
ルオイルのみが解凍した時点で、マイクロピペットによ
りこれを除去した。第2回のＰＣＲ産物５μｌに２μｌ
の電気泳動用色素を加えた。x１ＴＡＥ中で定電圧100ｍ
ｖの条件で、１％アガロース電気泳動を行い、サイズ分
画されたＤＮＡをエチジウムブロマイド染色し、トラン
スイルミネーターを用い、増幅を確認した。
【００２０】３）第３回（３rd）ＰＣＲ（ビオチン付
加） 上記２）で増幅を確認したＰＣＲ産物を、0.5ml滅菌チ
ューブに１μlずつ分注し氷上で保管した。x10 ＰＣＲ
用バッファー(Promega)、25mM MgCl2(Promega)、P20EA/
CA3及びP20EA/CB３プライマーセット（50pmol/μl）、1
0mM dATP, dCTP, dGTP mix, 0.5mMdTTP mix, 0.5mM Bio
tin-21-dUTPを氷上で解凍し、ボルテックスで良く攪拌
した後、Flash遠心により溶液を回収した。上記の試薬
を用い、α、β各1000μl（10回分）の３rdＰＣＲ溶液
を氷上で以下の組成に従い調製した。
加） 上記２）で増幅を確認したＰＣＲ産物を、0.5ml滅菌チ
ューブに１μlずつ分注し氷上で保管した。x10 ＰＣＲ
用バッファー(Promega)、25mM MgCl2(Promega)、P20EA/
CA3及びP20EA/CB３プライマーセット（50pmol/μl）、1
0mM dATP, dCTP, dGTP mix, 0.5mMdTTP mix, 0.5mM Bio
tin-21-dUTPを氷上で解凍し、ボルテックスで良く攪拌
した後、Flash遠心により溶液を回収した。上記の試薬
を用い、α、β各1000μl（10回分）の３rdＰＣＲ溶液
を氷上で以下の組成に従い調製した。
【００２１】表６ α、β鎖用３rdＰＣＲ溶液
【表６】 混合物を良く攪拌し、Flash遠心したのち、α、β各１
０００μｌ(10回分）の3rdＰＣＲ溶液を、先に2ndｃＤ
ＮＡを分注しておいたチューブに１００μlずつ分注し
た。残ったＰＣＲR溶液のうち、２０μlをネガティブコ
ントロール増幅に用いた。α、β各10本ずつのチューブ
にミネラルオイル（SIGMA）を分注し、以下の手順でＰ
ＣＲ増幅を行った（変成94℃30秒を１サイクル、変成94
℃１分、アニール55℃、２分、伸長72℃、2.5分を２０
サイクル、Last extension72℃、5分以下で4℃で保
存）。Flash遠心後、-70℃に靜置し、氷結させた。室温
に戻し、ミネラルオイルのみが解凍した時点で、マイク
ロピペットによりこれを除去した。第３回のＰＣＲ産物
５μｌに２μｌの電気泳動用色素を加えた。x１ＴＡＥ
中で定電圧100ｍｖの条件で、１％アガロース電気泳動
を行い、サイズ分画されたＤＮＡをエチジウムブロマイ
ド染色し、トランスイルミネーターを用い、増幅を確認
した。
０００μｌ(10回分）の3rdＰＣＲ溶液を、先に2ndｃＤ
ＮＡを分注しておいたチューブに１００μlずつ分注し
た。残ったＰＣＲR溶液のうち、２０μlをネガティブコ
ントロール増幅に用いた。α、β各10本ずつのチューブ
にミネラルオイル（SIGMA）を分注し、以下の手順でＰ
ＣＲ増幅を行った（変成94℃30秒を１サイクル、変成94
℃１分、アニール55℃、２分、伸長72℃、2.5分を２０
サイクル、Last extension72℃、5分以下で4℃で保
存）。Flash遠心後、-70℃に靜置し、氷結させた。室温
に戻し、ミネラルオイルのみが解凍した時点で、マイク
ロピペットによりこれを除去した。第３回のＰＣＲ産物
５μｌに２μｌの電気泳動用色素を加えた。x１ＴＡＥ
中で定電圧100ｍｖの条件で、１％アガロース電気泳動
を行い、サイズ分画されたＤＮＡをエチジウムブロマイ
ド染色し、トランスイルミネーターを用い、増幅を確認
した。
【００２２】ＩＩ． Reverse dot blotting Reverse dot blottingは、以下の表７〜１３に記載の、
各ＴＣＲＶサブファミリーに特異的に対応する２０bp前
後のオリゴヌクレオチドプローブを用い、常法に従って
行った。表７〜９には、ＴＣＲＶα及びＣαのための一
本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）、表１０
から１３には、ＴＣＲＶβ及びＣβのための一本鎖オリ
ゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）が記載されてい
る。表７〜９ Reverse dot blotting用ＴＣＲＶα及び
ＣαのためのＳＳＯＰ
各ＴＣＲＶサブファミリーに特異的に対応する２０bp前
後のオリゴヌクレオチドプローブを用い、常法に従って
行った。表７〜９には、ＴＣＲＶα及びＣαのための一
本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）、表１０
から１３には、ＴＣＲＶβ及びＣβのための一本鎖オリ
ゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）が記載されてい
る。表７〜９ Reverse dot blotting用ＴＣＲＶα及び
ＣαのためのＳＳＯＰ
【表７】
【表８】
【表９】
【００２３】表１０〜１３ Reverse dot blotting用Ｔ
ＣＲＶβ及びＣβのためのＳＳＯＰ
ＣＲＶβ及びＣβのためのＳＳＯＰ
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【００２４】表７〜１3に記載のオリゴヌクレオチドを
合成し、poly-T-tailを付加し、標識し、供給者の指示
に従ってHybond Nfp メンブレン(アマーシャム社)に固
相化した。次いで、上記Ｉ.に記載のアダプター付加Ｐ
ＣＲで増幅した遺伝子群を、固相化したメンブレン上の
オリゴマーに３７℃で１時間、指定のバッファー中でハ
イブリダイズさせ、標識に用いたビオチンと、アルカリ
フォスファターゼ標識したアヴィジンによるＡＭＰＤＤ
の発光量の強度に基づいて検出することにより、同定、
定量した。なお、ＴＣＲＶβ２.１及びＶβ６.５に特異
的なオリゴプローブＶＢ０２−１及びＶＢ０６−４の塩
基配列は配列番号１０及び１１に示されている。
合成し、poly-T-tailを付加し、標識し、供給者の指示
に従ってHybond Nfp メンブレン(アマーシャム社)に固
相化した。次いで、上記Ｉ.に記載のアダプター付加Ｐ
ＣＲで増幅した遺伝子群を、固相化したメンブレン上の
オリゴマーに３７℃で１時間、指定のバッファー中でハ
イブリダイズさせ、標識に用いたビオチンと、アルカリ
フォスファターゼ標識したアヴィジンによるＡＭＰＤＤ
の発光量の強度に基づいて検出することにより、同定、
定量した。なお、ＴＣＲＶβ２.１及びＶβ６.５に特異
的なオリゴプローブＶＢ０２−１及びＶＢ０６−４の塩
基配列は配列番号１０及び１１に示されている。
【００２５】川崎病患者２２名の治療前（発症期)、γ-
グロブリン投与時及び回復期における測定結果を図１及
び２に示す。さらに、川崎病患者２２名の治療前（発症
期）と回復期、発熱を伴う川崎病以外の疾患群の子供１
４名、及び健常大人１０名についてＴＣＲＶβ鎖のＶβ
２.１及びＶβ６.５の発現頻度を図３に示す。図１及び
２において、横軸のＶＡ及びＶＢは、表７〜１3に記載
の、Reverse dot blottingに用いたオリゴプローブの番
号を表し、縦軸は各サブファミリーの発現率（％）を示
す。なお、図１における１Ｄ，２Ｄ，３Ｄは、それぞ
れ、表２におけるＶＤ１，ＶＤ２，ＶＤ３に相当し、Ｖ
Ｂ０２−１はＶβ２.１を、ＶＢ０６−４はＶβ６.５を
表す。図１および２から、川崎病発症期にはＶβ鎖のＶ
β２.１及びＶβ６.５が高頻度で発現していることが分
かる また、図3からＴＣＲＶβ鎖については、川崎病発症期
の患者の場合、健常人コントロール及び川崎病回復期の
患者に比べて、Ｖβ２.１（P<0.05）及びＶβ６.５（P<
0.05）の使用頻度が有意に高いこと、他の疾患群と比較
した場合、Ｖβ６.５（P<0.01）の使用頻度が有意に高
いことが分かる。以上の結果は、川崎病の発症に関与す
る因子は、Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞、又はＶβ６.５陽性及
びＶβ２.１陽性Ｔ細胞の増加をもたらすこと、即ち、
これらＴ細胞の増加に基づいて検出することが可能であ
ることを示している。
グロブリン投与時及び回復期における測定結果を図１及
び２に示す。さらに、川崎病患者２２名の治療前（発症
期）と回復期、発熱を伴う川崎病以外の疾患群の子供１
４名、及び健常大人１０名についてＴＣＲＶβ鎖のＶβ
２.１及びＶβ６.５の発現頻度を図３に示す。図１及び
２において、横軸のＶＡ及びＶＢは、表７〜１3に記載
の、Reverse dot blottingに用いたオリゴプローブの番
号を表し、縦軸は各サブファミリーの発現率（％）を示
す。なお、図１における１Ｄ，２Ｄ，３Ｄは、それぞ
れ、表２におけるＶＤ１，ＶＤ２，ＶＤ３に相当し、Ｖ
Ｂ０２−１はＶβ２.１を、ＶＢ０６−４はＶβ６.５を
表す。図１および２から、川崎病発症期にはＶβ鎖のＶ
β２.１及びＶβ６.５が高頻度で発現していることが分
かる また、図3からＴＣＲＶβ鎖については、川崎病発症期
の患者の場合、健常人コントロール及び川崎病回復期の
患者に比べて、Ｖβ２.１（P<0.05）及びＶβ６.５（P<
0.05）の使用頻度が有意に高いこと、他の疾患群と比較
した場合、Ｖβ６.５（P<0.01）の使用頻度が有意に高
いことが分かる。以上の結果は、川崎病の発症に関与す
る因子は、Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞、又はＶβ６.５陽性及
びＶβ２.１陽性Ｔ細胞の増加をもたらすこと、即ち、
これらＴ細胞の増加に基づいて検出することが可能であ
ることを示している。
【００２６】ＩＩＩ．ＣＤＲ３領域の塩基配列の決定 治療前の発症期において、治療後の回復期より特に高い
割合でＶβ２.１及びＶβ６.５が発現しているサンプル
について、ＣＤＲ３領域（可変領域）の塩基配列を決定
した。即ち、アダプター付加ＰＣＲで増幅した産物を、
それぞれ、Ｖβ２.１及びＶβ６.５のための、ＶＢ０２
−１（表１０）とＣＢ３（表２）若しくはＶＢ０６−４
（表１１）とＣＢ３（表２）で、アダプター付加ＰＣＲ
と同じ条件下でＰＣＲ増幅し、アガロース電気泳動を行
った。ゲルから常法通り目的のＤＮＡを抽出した後、Ｔ
Ａクローニング法（Holton, T.A. and Ghanem, M.W. (1
991) A simple and efficient method for direct clon
ing of PCR products using ddT-tailed vectors Nucle
ic Acids Res 19, 1156)に従い、Ｖβ２.１及びＶβ６.
５の配列をもつＰＣＲ産物を、既知のベクター、ｐＧＥ
ＭＴのクローニングサイトに導入した。遺伝子導入され
たベクターを、電気穿孔法により、ＤＨ１０Ｂ由来の
Ｅ.coli K-12株に導入し、培養した。それぞれの形質転
換された大腸菌より抽出されたプラスミドは、Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼと、ＶＢ０２−１若しくはＶＢ０６−４
とＣＢ３プライマーのセットを用い、サンガー法(Sange
r ら、1987)によって塩基配列を決定した。該塩基配列
から予想されるアミノ酸配列を表１４及び表１５、１６
に示す。
割合でＶβ２.１及びＶβ６.５が発現しているサンプル
について、ＣＤＲ３領域（可変領域）の塩基配列を決定
した。即ち、アダプター付加ＰＣＲで増幅した産物を、
それぞれ、Ｖβ２.１及びＶβ６.５のための、ＶＢ０２
−１（表１０）とＣＢ３（表２）若しくはＶＢ０６−４
（表１１）とＣＢ３（表２）で、アダプター付加ＰＣＲ
と同じ条件下でＰＣＲ増幅し、アガロース電気泳動を行
った。ゲルから常法通り目的のＤＮＡを抽出した後、Ｔ
Ａクローニング法（Holton, T.A. and Ghanem, M.W. (1
991) A simple and efficient method for direct clon
ing of PCR products using ddT-tailed vectors Nucle
ic Acids Res 19, 1156)に従い、Ｖβ２.１及びＶβ６.
５の配列をもつＰＣＲ産物を、既知のベクター、ｐＧＥ
ＭＴのクローニングサイトに導入した。遺伝子導入され
たベクターを、電気穿孔法により、ＤＨ１０Ｂ由来の
Ｅ.coli K-12株に導入し、培養した。それぞれの形質転
換された大腸菌より抽出されたプラスミドは、Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼと、ＶＢ０２−１若しくはＶＢ０６−４
とＣＢ３プライマーのセットを用い、サンガー法(Sange
r ら、1987)によって塩基配列を決定した。該塩基配列
から予想されるアミノ酸配列を表１４及び表１５、１６
に示す。
【００２７】表１４ 川崎病発症期の患者から得たＶβ
２.１−陽性ｃＤＮＡクローンのＣＤＲ３のアミノ酸配
列（ｎ＝２、クローン数１０又は１１）
２.１−陽性ｃＤＮＡクローンのＣＤＲ３のアミノ酸配
列（ｎ＝２、クローン数１０又は１１）
【表１４】 表１４に記載の２１クローンのアミノ酸配列は、上から
順次、配列番号９７〜配列番号１１７のアミノ酸配列
に、それぞれ対応している。
順次、配列番号９７〜配列番号１１７のアミノ酸配列
に、それぞれ対応している。
【００２８】表１５〜１６ 川崎病発症期の患者から得
たＶβ６.５−陽性ｃＤＮＡクローンのＣＤＲ３のアミ
ノ酸配列（ｎ＝４、クローン数１０〜１２）
たＶβ６.５−陽性ｃＤＮＡクローンのＣＤＲ３のアミ
ノ酸配列（ｎ＝４、クローン数１０〜１２）
【表１５】
【表１６】 表１５に記載の２０クローンのアミノ酸配列は、配列番
号１１８〜１３７、表１６に記載の２３クローンのアミ
ノ酸配列は、配列番号１３８〜１６０に記載のアミノ酸
配列に、それぞれ対応している。表１４〜１６から明ら
かなように、同一のクローンは存在していない。これ
は、川崎病発症期におけるＶβ２.１、Ｖβ６.５ポジテ
ィブＴ細胞の発現量増加が、ポリクローナルであること
を示している。
号１１８〜１３７、表１６に記載の２３クローンのアミ
ノ酸配列は、配列番号１３８〜１６０に記載のアミノ酸
配列に、それぞれ対応している。表１４〜１６から明ら
かなように、同一のクローンは存在していない。これ
は、川崎病発症期におけるＶβ２.１、Ｖβ６.５ポジテ
ィブＴ細胞の発現量増加が、ポリクローナルであること
を示している。
【００２９】ＩＶ．各種サイトカインの測定 川崎病（発症期及び回復期）及び他の疾患群の血清につ
いて、Quantikine immunoassay kit (R & D system
社)、Cytoscreen immunoassay kit (BioSouce Internat
ional 社)、Human Interferon Gamma ELISA test kit(B
RL社)を用い、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ
−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α
量を測定した。結果を表１7に示す。表１7 川崎病の発症期及び回復期、及び他の疾患の患
者の、血清サイトカイン濃度
いて、Quantikine immunoassay kit (R & D system
社)、Cytoscreen immunoassay kit (BioSouce Internat
ional 社)、Human Interferon Gamma ELISA test kit(B
RL社)を用い、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ
−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α
量を測定した。結果を表１7に示す。表１7 川崎病の発症期及び回復期、及び他の疾患の患
者の、血清サイトカイン濃度
【表１７】 注：ａ）検出可能なサイトカイン濃度以下の血清濃度を
ゼロとして、平均値を算出した。表から、各種炎症性の
サイトカイン産生もＴＣＲ Ｖβ2.1やＶβ６.５同様、
川崎病回復期に比べ発症期において高い傾向が見られ
る。また、他の疾患群と比較した場合も、多くのサイト
カインが、その発症期で高い傾向にあることが分かる。
この結果は、末梢血中でＴ細胞が増加していることを示
している。以上の結果は、川崎病の発症には、スーパー
抗原が関与していること、さらには、Ａ群連鎖球菌由来
の外毒素 (SPEC)の関与を示唆するものである。
ゼロとして、平均値を算出した。表から、各種炎症性の
サイトカイン産生もＴＣＲ Ｖβ2.1やＶβ６.５同様、
川崎病回復期に比べ発症期において高い傾向が見られ
る。また、他の疾患群と比較した場合も、多くのサイト
カインが、その発症期で高い傾向にあることが分かる。
この結果は、末梢血中でＴ細胞が増加していることを示
している。以上の結果は、川崎病の発症には、スーパー
抗原が関与していること、さらには、Ａ群連鎖球菌由来
の外毒素 (SPEC)の関与を示唆するものである。
【００３０】
【産業上の有用性】原因が未解明であり診断の確定に時
間を要するために、重篤な症状に至る例が多い川崎病に
関連する因子を、その発症期に科学的な方法で検出する
手段を提供することにより、川崎病の早期診断、早期治
療を可能にすることができる。
間を要するために、重篤な症状に至る例が多い川崎病に
関連する因子を、その発症期に科学的な方法で検出する
手段を提供することにより、川崎病の早期診断、早期治
療を可能にすることができる。
【００３１】
【配列表】 <110> 塩野義製薬株式会社 Shionogi & Co., Ltd. <120> 川崎病因子の検出法 <130> 155380 <160> 160 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gggaattcgg 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 taatacgact ccgaattccc 20 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gactagtcaa agcggccgcg agctcttttt tttttttttt ttttt 45 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> tgttgaaggc gtttgcacat gca 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gtccatagac ctcatgtcta gca 3 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 actttgtgac acatttgttt gag 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gaactggact tgacagcgga agt 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 aggcagtatc tggagtcatt gag 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 actgtgcacc tccttcccat tca 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tcatcaacca tgcaagcctg a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 aaggctgctc agtgatcggt 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gaaacaagtt ggtggtcata tta 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 aaaggagaag cgatcggtaa c 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 gacactgtat attcaaatcc aga 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 atcaagggct ttgaggctga a 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 atcaacggtt ttgaggctga at 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gcattaaagg ctttgaggct g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 catcacggtt ttgaggctga a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 acagctcaat aaagccagcc a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 cacaggtcga taaatccagc a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 agagccagcc agtatatttc c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 gtggaagatt aagagtcacg c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 aacaacagaa tggcctctct g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 cctctctgat catcacagaa g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 ctgaaggtca cctttgatac c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 26 tgacaccagt gatccaagtt a 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 27 attccttagt cgctctgata gt 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 28 ttccttagtc ggtctaaagg g 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 29 tgggcgaaaa gaaagaccaa c 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 ggccaaagag tcaccgtttt a 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 catcaaaggc ttcactgctg a 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 32 gtggagaagt gaagaagctg a 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 33 agggacgata caacatgacc t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 34 gtcggtattc ttggaacttc c 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 35 aagattaagc gccacgactg t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 36 cgtttctctg tgaacttcca g 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 37 gaccaaagac tcactgttct a 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 38 cagctatggc tttgaagctg a 21 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 39 gaaggaagat tcacaatctc ct 22 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 40 ggacgatata gtgccactct t 21 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 41 gcatggaaga ttaattgcca ca 22 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 42 gactatacta acagcatgtt tga 23 <210> 43 <211> 21<212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 43 aacaaaagtg ccaagcacct c 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 44 tgacaaggga agcaacaaag g 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 45 aagtggaaga cttaatgccc c 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 46 caactctgga tgcagacaca a 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 47 aagactgact gctcagtttg g 21 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 48 agataactgc caagttggat ga 22 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 49 ggacgattaa tggcctcact t 21 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 50 gtcaggaaga ctaagtagca ta 22 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 51 ggagaacaga tgcgtcgtga 20 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 52 tggagaacag aagggtcatg a 21 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 53 tgaagaagca gaaaagactg ac 22 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 54 ctgtattcag ctggggaaga a 21 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 55 tcagagagag acaatggaaa ac 22 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 56 tatccagaac cctgaccctg 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 57 tgtaccagct gagagactct a 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 58 acaacagttc cctgacttgc a 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 59 ccatcaacca tccaaacctg a 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 60 gtctctagag agaagaagga g 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 61 ttgacaagtt tcccatcagc c 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 62 cttcagtgag acacagagaa a 21 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 63 attatgagga ggaagagaga ca 22 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 64 tattatgaga aagaagagag agg 23 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 65 tgacgagggt gaagagagaa a 21 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> 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Sequence <400> 77 tcaacagtct ccagaataag ga 22 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 78 caaaggagaa gtctcagatg g 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 79 caatggctac aatgtctcca g 21 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 80 ggtccctgat ggctacaatg 20 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 81 tgatggttat agtgtctcca g 21 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 82 ccgaatggct acaacgtctc 20 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 83 gtctctcgaa aagagaagag g 21 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 84 agtgtctctc gacaggcaca 20 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 85 gtgaaagagt ctaaacagga t 21 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 86 cacagatagt aaatgacttt cag 23 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 87 gatgagtcag gaatgccaaa g 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 88 ctcaatgccc caagaacgca 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 89 tctgaggtgc cccagaatct 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 90 tctgcagaga ggctcaaagg 20 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 91 ttcagtgact atcattctga act 23 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 92 attcttgggg cagaaagtcg a 21 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 93 ccaggaggcc gaacacttc 19 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 94 aacaggtatg cccaaggaaa g 21 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 95 cacccgaggt cgctgtgtt 19 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 96 gctgtgtttg agccatcaga a 21 <210> 97 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Val Gly Asn Gly Tyr 1 5 10 15 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 20 25 <210> 98 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Glu Asp Ser Ser 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Leu Thr Val Val 20 25 <210> 119 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Thr Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Trp Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 120 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ile Lys Thr Asp Pro Arg Arg 1 5 10 15 Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 <210> 121 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Ser Gly Gly Gly Glu 1 5 10 15 Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 20 25 <210> 122 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gln Gly 1 5 10 15 Gln Gly Lys Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 20 25 30 Leu <210> 123 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Leu Ala Gly Ala Phe 1 5 10 15 Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 124 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Ile Thr Asp Thr 1 5 10 15 Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 <210> 125 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 30 <210> 126 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gln Glu 1 5 10 15 Asn Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 127 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Gly 1 5 10 15 Arg Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 30 <210> 128 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Glu Leu Gly Phe 1 5 10 15 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 20 25 <210> 129 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Lys Leu Phe Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Ser Val Leu 20 25 <210> 130 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Asp Gln 1 5 10 15 Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu 20 25 <210> 131 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Pro Gln Ser Gly His Ala 1 5 10 15 Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 132 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Phe Thr Asp Thr 1 5 10 15 Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 <210> 133 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Pro Pro Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 20 25 <210> 134 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Lys Trp Thr Gln 1 5 10 15 Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 20 25 <210> 135 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Arg Glu Gly Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 <210> 136 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Gly Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 30 <210> 137 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Ala Gln Gly Ala 1 5 10 15 Ala Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 30 <210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Val Asp 1 5 10 15 Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu 20 25 30 <210> 139 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Gln Gln Gly Gly Gly 1 5 10 15 Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val 20 25 30 <210> 140 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Ser Leu Val 1 5 10 15 Asp Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu 20 25 30 <210> 141 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15 His Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 142 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Asp Glu Arg Glu 1 5 10 15 Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 <210> 143 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Ser Thr Arg 1 5 10 15 Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 144 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 145 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ala Leu Val Arg 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 20 25 30 Thr <210> 146 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Thr Gly Gly Gly 1 5 10 15 Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Thr Thr Asp Ala 1 5 10 15 Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 20 25 30 <210> 148 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ala Ile Ala Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ala Gly Gln Gly Ser 1 5 10 15 Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 20 25 30 <210> 150 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Leu Val Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 20 25 30 <210> 151 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Leu Gly Gln Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 20 25 30 <210> 152 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Val Asp Thr Ile 1 5 10 15 Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val 20 25 <210> 153 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Gly Thr Ser Gly 1 5 10 15 Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 154 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Gly Arg Gly Asn 1 5 10 15 Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu 20 25 30 <210> 155 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ala Ile Arg Gly 1 5 10 15 Ala Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val 20 25 30 Leu <210> 156 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Thr Ser Gly 1 5 10 15 Ala Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 20 25 30 <210> 157 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Val Thr Pro 1 5 10 15 Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 20 25 30 <210> 158 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ile Pro Arg Leu Gly 1 5 10 15 Gln Gly Ala Ser Gly Ala Asn Val Leu Thr Phe Gly Ala Gly Ser Arg 20 25 30 Leu Thr Val Leu 35 <210> 159 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 30 <210> 160 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Ile Pro Gly Leu 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 20 25 30
【図１】 川崎病患者（２２名の）発症期、γグロブリ
ン投与期、及び回復期の末梢血におけるＶα鎖サブファ
ミリーの使用頻度（％）を示すグラフ。
ン投与期、及び回復期の末梢血におけるＶα鎖サブファ
ミリーの使用頻度（％）を示すグラフ。
【図２】 川崎病患者（２２名の）発症期、γグロブリ
ン投与期、及び回復期の末梢血におけるＶβ鎖サブファ
ミリーの使用頻度（％）を示すグラフ。
ン投与期、及び回復期の末梢血におけるＶβ鎖サブファ
ミリーの使用頻度（％）を示すグラフ。
【図３】 川崎病患者２２名の治療前と回復期、発熱を
伴う川崎病以外の疾患群の子供１４名、及び健常な大人
１０名についてＴＣＲＶβ鎖のＶβ２.１及びＶβ６.５
の発現頻度を示すグラフ。
伴う川崎病以外の疾患群の子供１４名、及び健常な大人
１０名についてＴＣＲＶβ鎖のＶβ２.１及びＶβ６.５
の発現頻度を示すグラフ。
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Claims (4)
- 【請求項１】 Ｖβ６.５陽性Ｔ細胞数の増加、又はＶ
β６.５及びＶβ２.１陽性Ｔ細胞数の増加を指標とする
川崎病因子の検出法。 - 【請求項２】 川崎病が疑われる患者の末梢血中のＴＣ
ＲＶ領域の遺伝子群を増幅し、ＴＣＲＶサブファミリー
の発現頻度を検出し、ＴＣＲＶβ６.５及びＴＣＲＶβ
２.１サブファミリーの発現頻度の有意な増大を指標と
する請求項１記載の検出法。 - 【請求項３】 川崎病が疑われる患者の末梢血中のＴＣ
ＲＶ領域遺伝子群をアダプター付加ＰＣＲ法で増幅し、
少なくとも配列番号１０及び１１に記載の塩基配列で示
されるオリゴヌクレオチドプローブを含むＴＣＲＶサブ
ファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用
いるリバース・ドット・ブロット法により、ＴＣＲＶβ
サブファミリーの発現頻度を検出し、ＴＣＲＶβ６.５
サブファミリー、又はＴＣＲＶβ６.５及びＴＣＲＶβ
２.１サブファミリーの発現頻度が、他のサブファミリ
ーの発現頻度よりも有意に高いことを指標とする請求項
１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 さらに、ＴＣＲＶβ２.１及びＴＣＲＶ
β６.５陽性ｃＤＮＡクローンのＣＤＲ３領域の塩基配
列を決定し、ＴＣＲＶβ２.１及びＴＣＲＶβ６.５陽性
Ｔ細胞数の増加がポリクローナルであることを確認する
ことをも含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10341661A JP2000157297A (ja) | 1998-12-01 | 1998-12-01 | 川崎病因子の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10341661A JP2000157297A (ja) | 1998-12-01 | 1998-12-01 | 川崎病因子の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000157297A true JP2000157297A (ja) | 2000-06-13 |
Family
ID=18347821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10341661A Pending JP2000157297A (ja) | 1998-12-01 | 1998-12-01 | 川崎病因子の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000157297A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1517995A2 (en) * | 2002-07-03 | 2005-03-30 | Institute For Scientific Research, Inc. | Compositions and methods for the detection of human t cell receptor variable family gene expression |
| JP2007205842A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Kobeshi Chiiki Iryo Shinko Zaidan | 川崎病の判定方法及びそのためのキット |
| WO2009019657A3 (en) * | 2007-08-06 | 2009-08-06 | Univ Cattolica Sacro Cuore | Means for diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis |
| EP2281065A4 (en) * | 2008-04-16 | 2011-08-31 | Hudsonalpha Inst For Biotechnology | METHOD OF EVALUATION AND COMPARISON OF IMMUNO-DIRECTORIES |
-
1998
- 1998-12-01 JP JP10341661A patent/JP2000157297A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1517995A2 (en) * | 2002-07-03 | 2005-03-30 | Institute For Scientific Research, Inc. | Compositions and methods for the detection of human t cell receptor variable family gene expression |
| EP1517995A4 (en) * | 2002-07-03 | 2007-07-11 | Inst Scient Res Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING THE EXPRESSION OF GENES OF THE VARIABLE HUMAN T-CELL RECEPTOR FAMILY |
| JP2007205842A (ja) * | 2006-02-01 | 2007-08-16 | Kobeshi Chiiki Iryo Shinko Zaidan | 川崎病の判定方法及びそのためのキット |
| WO2009019657A3 (en) * | 2007-08-06 | 2009-08-06 | Univ Cattolica Sacro Cuore | Means for diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis |
| EP2281065A4 (en) * | 2008-04-16 | 2011-08-31 | Hudsonalpha Inst For Biotechnology | METHOD OF EVALUATION AND COMPARISON OF IMMUNO-DIRECTORIES |
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