ITUB20155902A1

ITUB20155902A1 - Composizione farmaceutica cicatrizzante per uso topico

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Publication number: ITUB20155902A1
Application number: ITUB2015A005902A
Authority: IT
Original assignee: Nathura S P A
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-05-25
Also published as: WO2017089475A1; EP3380103A1

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce in termini generali ad una composizione cicatrizzante per uso topico comprendente un’efficace combinazione di principi attivi, utile in particolare per il trattamento di microlesioni e ferite dell’epitelio vulvare e/o vaginale.

Arte nota

In campo farmaceutico, l’associazione tra acido ialuronico e beta glucano è nota da diverso tempo per le proprietà vaso riparatone a livello cutaneo, per il trattamento vaginale, ad esempio per la cura di stati di atrofia o simili,

L’acido ialuronico (HA) è un glicosamminoglicano presente ad elevate concentrazioni nel tessuto connettivo e nella pelle. L’alta igroscopicità dell’HA è fondamentale per riconoscere la sua azione d’idratazione tissutale. Le caratteristiche chimico- fi siche dell’acido ialuronico sono alla base delle importanti proprietà lubrificanti di questa sostanza, e le applicazioni cliniche che ne sono derivate sono state principalmente quella di supplemento viscoso, di riparatore tessutale, di antiossidante e condroprotettore.

Nella pelle, inoltre, l’HA svolge un ruolo importante come scavenger dei radicali liberi e antiossidante, L’HA ad alto peso molecolare forma un confine viscoso attorno alle cellule in modo dose dipendente, e questo restringe il movimento delle specie reattive deH’ossigeno. Durante la cicatrizzazione l’acido ialuronico è coinvolto in varie risposte cellulari. Nella prima fase infiammatoria ΓΗΑ è accumulato nei tessuto leso e, a seguito di interazioni con specifiche molecole di legame, induce il rilascio di citochine infiammatorie migliorando finii [trazione delle cellule che migrano nel sito del danno. Durante la fase di granulazione, gli elevati livelli delibi A promuovono la proliferazione e la migrazione cellulare, mentre nella fase di rimodellamento 1ΉΑ contribuisce al processo di cicatrizzazione.

Per quanto riguarda il beta-glucano [(1 ,3)-(l ,6)-p-D-Glucano derivante generalmente dal fungo Plerotus Ostreatus o da lievito (100% Saccharomyces cerevisiae)], questo è un polisaccaride ad alto peso molecolare, noto come colloide idrofilo in grado di legare l’acqua e cederla allo strato corneo, È una sostanza funzionale idratante e protettiva che viene impiegata anche come coadiuvante la cicatrizzazione delle ferite, in particolare per l’applicazione su pelle sensibile. Il beta glucano possiede un ruolo chiave nella modulazione del sistema immunitario locale, compromesso in caso di infiammazione cronica.

Oltre all’applicazione per trattamenti cutanei a livello vaginale, l’acido ialuronico e il beta glucano trovano alche altre applicazioni topiche, specie se in combinazione con altri principi attivi, quali, ad esempio, sericina e/o bisabololo. A tal proposito, la sericina idrolizzata è nota per le sue proprietà filmogene, idratanti e protettive. La sericina, infatti, aiuta a migliorare l'elasticità della pelle, ha proprietà an ti smagliature, anti-aging, e antiossidanti.

L’alfa- bisabololo, invece, è un alcol sesquiterpenico monociclico che insieme al camazulene rappresenta un componente importante delfolio essenziale di Camomilla. E’ dotato di proprietà decongestionanti e lenitive. Il bisaboloio (purificato come forma alfa) è un principio attivo, noto per essere dotato di un’azione antiflogistica riscontrata nella letteratura dermatologica, stomatologica ed otorinolaringoiatrica.

A titolo di esempio, WO2014/ 170239 descrive una composizione comprendente sclareolide, un inibitore di tirosinasi, un fattore di protezione solare, un agente antiin fiammato rio e un agente desquamante che può contenere oltre all 'acido ialuronico e al betaglucano anche alfa- bisaboloio e sericina idrolizzata.

WO20 14/202851 descrive una composizione comprendente miele e altri componenti, tra i quali beta-glucano, acido ialuronico e bisaboloio. La composizione viene formulata in forma di ovuli vaginali.

US2 014/31 59 95 divulga una composizione per applicazione topica comprendente vitamina C, vitamina E e un antiossidante polifenolico, adatta anche per un’applicazione vaginale. Tra i possibili componenti aggiuntivi, tale composizione può comprendere acido ialuronico, beta-glucano e alfa bisaboloio.

EP2762139 riguarda una composizione con attività antimicotica, contenente luliconazolo e/o lanoconazolo che può comprendere anche acido ialuronico e sericina, in qualità di agenti idratanti, e che può essere applicata alla mucosa vaginale.

WO20 12/ 076409 si riferisce ad un gel per applicazione vaginale contenente una frazione di colostro arricchita di immunoglobine e fattori chemio tattici e fattori antimicrobici e/o antivirali parzialmente incapsulati in microbeads muco adesivi. Il gel può, inoltre, contenere sericina, con funzione idratante, filmo genica e tamponante.

CN 10380 159 descrive un gel per il trattamento deiracne che comprende tra gli altri ingredienti acido ialuronico, beta- giu cano e alfabisabololo.

Sebbene le composizioni deirarte rappresentino rimedi efficaci per il trattamento di infiammazioni e siano in grado di esplicare un’azione cicatrizzante a livello topico in diversi siti di azione, resta, tuttavia, la necessità di trovare una composizione cicatrizzante e/o vaso rigenerante che sia formulabile in crema, che sia utilizzabile attraverso somministrazione topica, e che abbia una specifica efficacia per il trattamento di microlesioni e ferite, in particolare dell’epitelio vulvare (uso esterno) e vaginale (uso interno). I richiedenti hanno ora trovato che un’opportuna combinazione di acido ialuronico, beta-glucano, sericina idrolizzata e glicerofosfoinositolo permette di ottenere un’azione vaso rigenerante migliorata, che rende la composizione così ottenuta particolarmente adatta per la somministrazione cutanea per il trattamento di problemi di cicatrizzazione, ad esempio post partum, post trattamenti fisici e/o stati ulcerativi di diversa origine.

Sommario dell' invenzione

In un primo aspetto, l’invenzione si riferisce ad una composizione farmaceutica o dermocosmetica per applicazione topica, comprendente: acido ialuronico, beta glucano, sericina idrolizzata, e glicerofosfoinositolo o un suo sale farmaceuticamente accettabile, ed, eventualmente, bisabololo.

In un ulteriore aspetto, l’invenzione riguarda Fuso di detta composizione come medicamento, preferibilmente come agente cicatrizzante e/o vaso rigenerante, ancor più preferibilmente come agente cicatrizzante, in particolare per il trattamento di microlesioni e ferite deirepitelio vulvare (uso esterno) e vaginale (uso interno) di diversa origine.

In una forma di realizzazione preferita, la composizione è intesa per l’uso topico, ed è in una forma farmaceutica adatta per applicazioni cutanee, ad esempio in forma di crema o gel.

In un ulteriore aspetto, rinvenzione si riferisce ad un processo per la preparazione della composizione di cui sopra, che comprende i passaggi di:

a) preparazione di una fase acquosa comprendente gli ingredienti non termolabili liquidi e in polvere;

b) preparazione della fase grassa per fusione dei grassi e miscelazione degli oli;

c) emulsione delle due fasi;

d) aggiunta degli altri ingredienti sciolti in soluzione acquosa.

Costituisce un aspetto aggiuntivo dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente acido ialuronico, beta glucano, e glicerofosfoinositolo, preferibilmente per uso come medicamento per via topica, ancor più preferibilmente come agente cicatrizzante e/o vaso rigenerante.

Descrizione dettagliata

Se non altrimenti specificato, il termine “percentuale in peso” (%p/p) indica il peso della sostanza rispetto al peso totale della composizione.

“Sale farmaceuticamente accettabile” comprende nel suo significato quei derivati del composto interessato in grado di mantenere o migliorare la tollerabilità e/o la biocompatibilità del composto da cui sono derivati.

Il termine “applicazione topica” indica una somministrazione mediante contatto diretto della presente composizione con il sito di azione a cui è destinata, tipicamente la cute e/o le mucose, esplicando in questo modo un’azione a livello locale.

Come sopra indicato, la composizione deirinvenzione, comprendente acido ialuronico, beta-glucano e sericina idrolizzata, è caratterizzata dal fatto di contenere almeno glicerofosfo inosi tolo o un suo sale farmaceuticamente accettabile, eventualmente in presenza di bisabololo. Tale associazione di componenti permette l’utilizzo della composizione come agente cicatrizzante, come agente ripartitore di stati atrofici e distrofici, e come riequilibrante delTambiente vaginale in generale.

Inoltre, la presente composizione risulta adatta per un’applicazione topica, in quanto può essere formulata in modo da consentirne Tapplicazione cutanea, ad esempio in forma di crema muco adesiva, permettendone l’applicazione locale in modo semplice e funzionale,

La composizione delTinvenzione, inoltre, permette di ottenere un’azione combinata e sinergica degli ingredienti che la compongono, esplicando, in particolare, una funzione cicatrizzante aumentata ed efficace.

L’ingrediente acido ialuronico è preferibilmente ad alto peso molecolare, inteso come avente un peso molecolare (PM) di almeno l,5xl0<6>Dalton, preferibilmente compreso tra 1,5 xlO<6>e 2,2xl0<6>Dalton,

In ogni caso, l’acido ialuronico è presente nella composizione farmaceutica dell'invenzione in quantità comprese tra circa 0,1% e 0,4% p/p essendo valori compresi tra circa 0,1% e 0,3% p/p particolarmente preferiti.

Analogamente all’acido ialuronico, anche il beta glucano e la sericina idrolizzata sono presenti nella composizione dell’invenzione in quantità comprese tra circa 0,1% e 0,4% p/p essendo valori compresi tra circa 0,1% e 0,3% p/p particolarmente preferiti.

Pertanto in una forma di realizzazione, la composizione delVin ve azione comprende acido ialuronico, beta-glucano e sericina idrolizzata nelle stesse quantità % p/p, preferibilmente comprese tra 0,1% e 0,3% p/p.

II beta-glucano può essere utilizzato con una purezza compresa tra 85% e 93%, essendo ottenuto preferibilmente per via biofermentativa dal lievito Saccharomyces cerevisiae, o per estrazione dal fungo Plerotus Ostreatus.

Esso conferisce alla composizione dell’invenzione migliorate proprietà idratanti e protettive, particolarmente utili nella cicatrizzazione delle zone vaginali trattate.

La sericina idrolizzata viene preferibilmente ottenuta dalla purificazione deila seta e permette di aumentare le proprietà filmo gene e idratanti della presente composizione, garantendo, inoltre, un’ottima biocompatibilità, È utilizzata nella composizione dell’invenzione in quantità comprese tra circa 0,1% e 0,4% p/p essendo valori compresi tra circa 0,1% e 0,3% p/p particolarmente preferiti.

La presente composizione è inoltre caratterizzata dal fatto di contenere come principio attivo anche ii glicerofosfoinositolo (GPl), o, preferibilmente, un suo sale farmaceuticamente accettabile. In una forma di realizzazione, detto sale è scelto tra: il sale di lisina e di colina, essendo quest’ultimo particolarmente preferito. La richiedente ha infatti notato che l’utilizzo del sale di colina risulta particolarmente utile nel caso in cui la presente composizione venga intesa come dispositivo medico.

Il glicerofosfoinositolo sale di colina è un principio attivo di origine vegetale, solitamente purificato dalla lecitina di girasole e disponibile in commercio,

Preferibilmente, il glicerofosfoinositolo o un suo sale farmaceuticamnete accettabile, è presente nella composizione dell’invenzione come soluzione acquosa in quantità comprese tra circa 0,1% e 0,3% p/p, essendo valori compresi tra circa 0,2% e 0,3% p/p particolarmente preferiti.

In una forma realizzatìva, la composizione dell’invenzione può inoltre contenere bisabololo, in forma racemica o, preferibilmente, come isomero alfa. Il bisabololo eventualmente utilizzato nella presente composizione viene preferibilmente estratto attraverso la distillazione in corrente di vapore dalia corteccia della pianta Vanillosmopis erythro pappa (nota anche come legno di candeia).

La composizione deU’invenzione comprende il bisabololo in quantità comprese tra 0% e 2% p/p, preferibilmente tra circa 0,1% e 1,5% p/p, ancor più preferibilmente tra circa 0,1% e 1% p/p. A questo proposito, l’utilizzo del bisabololo risulta particolarmente conveniente in quanto è in grado di esplicare un’azione decongestionante e lenitiva anche a piccole percentuali, senza provocare sostanzialmente alcun effetto collaterale.

In una forma di realizzazione, la composizione dell’invenzione, preferibilmente in forma di crema idrofila, comprende almeno:

acido ialuronico 0, 1-0,3 %p/p

beta-glucano 85% 0,1 -0,3 %p/p

sericina idrolizzata 0, 1-0,3 %p/p

alfa bisabololo 0, 1-0,2 %p/p

glicero fosfoinositolo 0,2-0, 3 %p/p

(sale di colina soluz. aq. 10%) 0,25 % p / p

Acqua depurata q.b. a 100%

In alternativa al beta-glucano 85%, la composizione preferita di cui sopra può contenere beta-glucano al 93% nelle stesse quantità %p/ p indicate.

Oltre ai componenti descrìtti, la composizione dell’invenzione può contenere ulteriori altri eccipienti funzionali noti nell’arte ed utilizzati dal tecnico del ramo per la preparazione di una crema, quali tipicamente: olio mandorle dolci (prunus dulcis), glicerina, deci! oleato, copolimero idrossietil acrilato/ sodio acriloildimetil taurato, glicole caprilico, esano- 1,2-diolo, acido poliacrilico reticolato, etilesil glicerina, sorbitano isostearato, polisorbato 60, lecitina, acido lattico, acido fitico, sodio ialuronato, sodio idrossido, tocoferolo, ascorbil palmi tato, acido citrico, copolimero idrossietil acrilato/ sodio acriiildimetil taurato, da soli o, preferibilmente, in miscela tra loro. Gli eccipienti sono presenti in una quantità complessiva compresa tra circa 10% e 18% p/p, essendo valori compresi tra circa 13% e 15% p/p particolarmente preferiti.

Eccipienti preferiti sono Folio di mandorle dolci e/o un polimero di acido acrilico reticolato con divinil alcol. In particolare, Folio di mandorle dolci contiene un'elevata percentuale di acido oleico e linoleico, e minori quantità di acido palmit.ico, stearico, laurico e miristico, Ancor più preferibilmente Folio di mandorle dolci è utilizzato in quantità comprese tra circa 3 e 5% p/p, mentre il polimero di acido acrilico reticolato con divinil alcol è utilizzato in quantità comprese tra circa 0,4 e 0,6% p/p.

Preferibilmente, la presente composizione per uso topico è in forma di crema idrofila muco adesiva, ancor più preferibilmente avente un pH compreso tra 3,5 e 5 circa. La formulazione in crema non solo permette di avere un prodotto facilmente applicabile a livello cutaneo, in quanto viene assorbita rapidamente, ma consente, inoltre, un’applicazione che non unge, poiché è una formulazione a base acquosa. La densità della crema idrofila è preferibilmente compresa tra circa 0,8 e 1,2 g/ml con una viscosità a 25° C (R6/20, 49%) compresa tra 20.000-30.000 mPas.

Secondo un ulteriore aspetto, 1 'invenzione si riferisce alla presente composizione, intesa ad esempio come dispositivo medico, per l'uso come medicamento, preferibilmente come agente cicatrizzante e/o vaso rigenerante, ancor più preferibilmente per il trattamento di microlesioni e ferite dell’ep iteli o vulvare (uso esterno) e vaginale (uso interno) di diversa origine. In altri termini, la presente composizione è utile per la preparazione di un medicamento ad azione cicatrizzante e/o vaso rigenerante, per applicazione topica.

La composizione dell 'invenzione è efficace anche per il trattamento di problemi di cicatrizzazione post partum, post riattamenti fisici e/o stati ulcerativi di diversa origine, e di atrofia, ad esempio post menopausa o dovuti a squilibri ormonali in genere. In una forma realizzativa, l’invenzione si riferisce alla composizione di cui sopra, come medicamento per applicazione topica (o cutanea), preferibilmente in forma di crema idrofila.

Nello specifico, la richiedente ha notato che la composizione dell'invenzione è in grado di coadiuvare il trattamento dei sintomi associati alle vaginiti atrofiche, quali secchezza, prurito, irritazione e dolore/ disagio, migliorando l’elasticità e II tono dei tessuti e favorendo il ripristino di un ambiente umido e più lubrificato.

Va notato che, oltre ad esplicare le azioni rigenerative della cute, la composizione dell’invenzione permette anche di esplicare un’azione lenitiva ed antiinfiammatorìa migliorata, associata ad una conveniente citotossicità, grazie alla combinazione dei principi attivi, come sopra descritto nel dettaglio, e come riportato nella qui acclusa parte sperimentale (si vedano Esempi 2 e 3).

Inoltre, i dati raccolti nell'Esempio 1 mostrano chiaramente che la presente composizione è in grado di favorire la migrazione delle cellule di cheratinociti e quindi favorire la rigenerazione della cute. La richiedente ha, infatti, studiato la capacità di riparare ferite artificiali indotte in vitro in monostrati di cellule, poiché tale capacità può essere considerata indizio di attività di riparazione cutanea m vivo. In maggior dettaglio, quando le cellule sono esposte a sostanze in grado di stimolare la loro capacità di migrare (elemento questo indispensabile nel processo di vaso rigenerazione e riparo delle ferite) cambiano forma e modificano l 'organizzazione del cito scheletro, trasformandosi da cellule a fenotipo stazionario in cellule a fenotipo migratorio, I fasci di microfilamenti contenenti molecole di adesione come viniculina e aerina e stress fìber che mantengono le cellule ancorate al substrato scompaiono o migrano alla periferia cellulare, consentendo la migrazione cellulare.

Oltre a ciò, la presente composizione risulta conveniente anche per quanto riguarda la facilità di preparazione,

A tal proposito, costituisce un ulteriore aspetto deirinvenzione un procedimento per la preparazione della composizione per uso topico come sopra descritta nel dettaglio, detto procedimento che comprende la preparazione di una fase acquosa comprendente i componenti non termolabili quali l’acido ialuronico, e il glicerofo sforno sitolo, e di una fase grassa o oleosa, seguita dal'e avulsione delle due fasi e dairaggiunta dei restanti componenti in soluzione acquosa.

In un ulteriore aspetto, l’invenzione si riferisce anche ad una composizione farmaceutica comprendente acido ialuronico, beta glucano, e glicerofosfoinositolo, preferibilmente per uso topico come agente cicatrizzante e/o vaso rigenerante. Detta composizione risulta utile nel favorire processi di cicatrizzazione cutanea e nel trattamento di microlesioni e ferite dell’epitelio vulvare e vaginale in genere.

L’invenzione verrà ora descritta con la seguente parte sperimentale, intesa per meglio comprenderne i contenuti, senza tuttavia limitarne la portata.

PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1: VALUTAZIONE IN VITRO DEL RIPARO DI FERITE SU COLTURE CELLULARI

Esempio 1.1: esecuzione dei test

Modello cellulare adottato

Il modello cellulare utilizzato per il test in vitro è rappresentato da cheratinociti umani stabilizzati (cellule HaCaT). La linea cellulare deriva da pelle adulta che mantiene completa capacità di differenziazione epidermica.

Preparazione del campione

Il campione è stato sciolto in terreno di crescita alla concentrazione di lmg/ml e successivamente diluito nel terreno di coltura e testato alle seguenti concentrazioni:

- 1000 pg/ml

- 100 pg/ mi

- 10 yg/ mi

Trattamento ed esposizione

Le cellule sono state trattate per 24 ore con il prodotto alle concentrazioni finali indicate nel terreno di coltura (DMEM 10% FBS).

Cellule trattate con il solo terreno sono state utilizzate come controllo negativo. Le cellule sono conservate in incubatore a 37°C con il 5% di C02. Il test è stato eseguito in triplicato.

Preparazione delle colture cellulari

Le cellule sono state piastrate a 30.000 celi ole /pozzetto in piastre sterili da 96 e lasciate crescere fino a confluenza nel terreno di coltura sopra descritto, prima di eseguire le ferite e applicare i campioni.

Esecuzione della ferita e esposizione delle cellule ai prodotti. Una volta a confluenza, viene eseguita una ferita artificiale per tutta la lunghezza del mono strato con un puntale sterile in plastica, su ogni campione. Il terreno di coltura delle cellule viene rimosso e sostituito con il terreno contenente le sostanze da testare, tranne nei controlli negativi.

Valutazione del riparo della ferita

Subito dopo l'esecuzione della ferita (T0) e a tempi diversi entro le 24h vengono eseguite osservazioni a fresco in microscopia a contrasto di fase dei campioni trattati e dei controlli con un microscopio Leica DM-IL IMC a ingrandimento tra 10X e 4X, con registrazione delle dimensioni della ferita in pm. Le immagini sono documentate con videocamera digitale Primocam. 5000 con il software per immagini ISCapture. A tempi diversi, normalmente dopo 2, 6, 24 h di trattamento vengono nuovamente effettuate misurazioni della ferita in ogni campione. Calcolando i valori medi registrati ai diversi tempi viene calcolata la percentuale di riparo della ferita e questa viene confrontata tra i campioni trattati rispetto al controllo negativo per dare un giudizio suireffìcacia.

Esempio 1.2: risultati e conclusioni

Tabella 1 : riduzione media % della ferita rispetto al TO(ds)

Controllo negativo 6,72 (1,9) 35,08 (7,9) Composizione*

8,46 (3,1) 30,19 (3,5) 1000gg/ml

Composizione*

10,78 (5,8) 37,28 (6,3) 10pg/ml

* La composizione dell'invenzione utilizzata comprende gli ingredienti richiesti per la sua formulazione come crema per uso topica, vale a dire:

acido ialuronico 0,2 %p/p

beta-glucano 85% 0,2 %p/p

sericina idrolizzata 0,2 %p/p

alfa bisabololo 0,1 %p/p

glicero fosfo ino sitolo 0,25 %p/ p

(sale di colina 10%)

eccipienti 13-15% p/p

acqua depurata q.b a lQ0%

Si può osservare come la presente composizione mostra un aumento nella capacità di riparo delle ferite in vitro già dopo 6 ore di trattamento,

ESEMPIO 2: VALUTAZIONE IN VITRO DELLA CITOTOSSICITÀ E DEL POTENZIALE ANTI-INFIAMMATORIO SU EPIDERMIDE 3D

Esempio 2.1: Citotossìcità

La citotossìcità è stata valutata attraverso il test MTT al termine dell’incubazione; test di sopravvivenza cellulare con epidermide umana 3D ricostituita in vitro per la valutazione del potenziale citotossico causato dal campione.

Parametro

Modello in vitro Parametro rilevato tossicologico

Epidermide umana

tridimensionale Citotossìcità

ricostituita

Scopo del test di citotossìcità

Il saggio di citotossìcità può essere eseguito al fine di valutare la potenziale irritazione di un prodotto o di una sostanza utilizzando colture di cheratinociti prelevati da cute umana. II test in vitro condotto su cellule derivate da tessuto cutaneo risulta essere un metodo sperimentale semplificato, ma in grado di dare molte informazioni sulle reazioni che possono verificarsi in viva. L'utilizzo inoltre di un modello tridimensionale di cute umana, dove è presente uno strato corneo ben differenziato, mima efficacemente l'assorbimento percutaneo che può verificarsi in vivo e consente di valutare gli effetti biologici che si verificano negli strati più profondi dei epidermide.

Sotto l'impulso di stimoli tossici e stressanti, quali esposizione a UV o a sostanze biologiche e chimiche in qualche modo aggressive, i cheratinociti aumentano la produzione ed il rilascio di alcune citochine e prostaglandine, come interleuchina-ΐα (11- la), interleuchina- 1 β (II- 1 β) , tumor necrosis factor-α (TNF-a) o ìnterferonc-a (ÌFN-a), Interleuchina 6 (IL-6), prostaglandina E2 (PGE2) e prostaglandina 2a (PGE2a) . Queste molecole sono mediatori solubili coinvolti nella genesi del processo infiammatorio cutaneo,

La comparsa o l'aumento di questi marcatori nel terreno di coltura delle cellule dopo l'esposizione a determinate sostanze, suggerisce l'innesco di una cascata di eventi prO -infiammatori e può quindi essere considerato un buon marcatore di potenziale proinfiammatorio/ prò-irritante.

L'insieme dei test di funzionalità eseguiti dalla Richiedente, è stato studiato per valutare il potenziale protettivo e inibitorio del prodotto testato nei confronti dell’irritazione cutanea indotta da moderati agenti irritanti quali il sodio lauri! solfato (SLS), utilizzando un modello di cellule della cute umana coltivate in vitro in pluristrato. Per valutare l’effetto anti-infiammatorio è stata indagata, tramite test ELISA specifici, rinibizione del rilascio di una citochina (IL-Ια) causato da SLS, in presenza della sostanza testata rispetto a campioni di cute non trattata. In condizioni fisiologiche normali, ì cheratinociti cutanei non stimolati producono costitutivamente piccole dosi di citochine e prostaglandine.

Trattamento ed esposizione

30μ1 di campione tal quale (60pl/cm2) sono stati applicati su ogni unità di epitelio, in duplicato, e l’esposizione è stata protratta per 24 ore a 37<D>C, 5% C02 . Al termine dell'esposizione si è proceduto ad eliminare il prodotto tramite lavaggi in tampone fosfato (PBS) e a valutare la vitalità cellulare tramite il test MTT. L’irritazione cutanea caratterizzata dal rilascio di IL- la è stata provocata mediante pretrattamento per 40 minuti con SLS 0,25%. Unità non irritate con SLS e trattate con 30,ul di PBS sono state utilizzate come controllo negativo.

Per l’analisi deU’IL-1 alpha sono stati eseguiti prelievi del terreno a 6 e a 24 ore. Come controllo negativo è stato prelevato il terreno di mantenimento delle unità mattate con PBS e il terreno di due unità di pelle trattate col solo campione non irritate, mentre come controllo positivo è stato utilizzato il medium di coltura di due unità di pelle trattate con una soluzione di SLS 0,25%.

Test di citotossicità (descrizione)

Π test MTT è semplice, accurato e fornisce risultati riproducibili. Questo metodo è stato sviluppato originariamente da Mossman, Il reagente chiave è il 3-[4,5-dimethylthìazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromi de o MTT, sostanza che dà un colore giallo in soluzione acquosa. La deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali taglia l’anello tetrazolico, portando alla formazione di cristalli di formavano color viola porpora insolubili in acqua. I cristalli vengono sciolti con una soluzione solubilizzante l’MTT.

La soluzione viola risultante viene misurata spettrofotometricamente. Un aumento o diminuzione delle cellule vitali ha per risultato un cambiamento concomitante nella quantità di formazano che si forma e che può essere considerato come un indicatore del grado di citotossicità causato dall’esposizione alle sostanze irritanti.

Al termine del trattamento, la vitalità cellulare viene valutata incubando i tessuti con MTT per 3 ore in una piastra da 24 pozzetti (lmg/ml; 0,3ml per pozzetto). I cristalli di formazano precipitati vengono poi estratti utilizzando isopropanolo (2 mi) e quantificati spettrofotometricamente in una piastra da 96 pozzetti (200pl/well),

La piastra viene agitata su un agitatore a piastra assicurandosi che tutti i cristalli si siano sciolti ed abbiano formato una soluzione omogenea. Viene letta Tassorbanza a 550 nm con un colorimetro (Teca n modello Sunrise remote) equipaggiato con un lettore di piastre sottraendo la lettura del fondo a 690 nm.

Il risultato è espresso come vitalità cellulare in percentuale secondo la formula:

% di vitalità cellulare ~ [OD(550 nm - 690 nm) prodotto testato/ OD(550 nm - 690 nm) controllo negativo] x 100.

Esempio 2.2: risultati

Il trattamento dell' epidermide 3D con SLS 0,25% per 40 minuti ha causato una mortalità cellulare del 15% dopo 24 ore. Il campione delia presente composizione testato ha mostrato una mortalità cellulare del 61% dopo 24 ore di trattamento.

Tabella 2: sopravvivenza cellulare su epidermide 3D dopo 24 ore di esposizione vs controllo non trattato (ds)

Composizione* 38,81

Composizione* SLS 0,25% 10,91

SLS 0,25% 84,63

Idrocortisone 17 butirrato SLS

103,90

0,25%

Controllo negativo (tampone

100,00

fosfato)

La composizione dell'invenzione utilizzata comprende: acido ialuronico 0,2 %p/p

beta-glucano 85% 0,2 %p/p

sericina idrolizzata 0,2 %p/p

alfa bisabololo 0,1 %p/p

glicero fosfoinositolo 0,25 %p/p

(sale di colina 10%)

eccipienti 13-15% p/p

acqua depurata q.b a 100%

ESEMPIO 3: VALUTAZIONE IN VITRO DEL POTENZIALE ANTI-INFIAMMATORIO SU EPIDERMIDE 3D

Il potere antiinfiammatorio della composizione dell’invenzione è stato valutato mediante inibizione del rilascio di mediatori cellulari dell'infiammazione (IL-la) dopo stress indotto con SLS.

Parametro

Modello in vitro Parametro rilevato tossicologico

inibizione del

Epidermide umana

potenziale protridimensionale IL-la

infiammatorio dopo

ricostituita

stress con SLS

Esemplo 3.1: produzione di citochine

IL- la è stata dosata nel terreno di coltura delle unità di epidermide trattata e non, utilizzando la metodica ELISA (Enzymelinked i mimmo sor ben t assay) di tipo diretto, cioè lo sviluppo di colore è direttamente proporzionale alla quantità di citochine presenti nel mezzo di coltura.

50.ul di campione vengono incubati per 1,5 ore a temperatura ambiente in una piastra caricata con l’anticorpo primario specifico per la citochina in esame. Al termine deirincubazìone i campioni vengono lavati 5 volte con una soluzione di lavaggio. Quindi vengono aggiunti ΙΟΟμΙ di anticorpo secondario biotinilato e incubati per un’ora a temperatura ambiente. I campioni vengono nuovamente lavati 5 volte con la soluzione di lavaggio e incubati per 30 minuti con la soluzione di streptavidina coniugata con perossidasi (HP). Dopo 5 lavaggi viene aggiunto il substrato colorimetrico per la rivelazione della citochina legata alla piastra. La lettura viene fatta a 450nm e la concentrazione di citochina è determinata utilizzando come riferimento una curva standard, Il limite di sensibilità di questo test risulta essere inferiore a 3pg/mL

Esempio 3.2; risultati

1 campioni sono stati testati suirepidermide al fine di valutare un’eventuale diminuzione nella produzione di IL- la, indotta con pretrattamento con SLS allo 0,25%. (tabella 3.1.2, 1), indice di effetto anti-infia imato rio .

Tabella 3: inibizione del rìlascìo di IL~1 alpha dopo trattamento con il campione .

% inibizione Ì|èliÈ§S®l<'>:%ifcSbizi0nè.'i·' Composizione* 49,70 67,80

Composizione*

213,32 11,54% 1322,84 0,96

SLS 0,25%

SLS 0,25% 241,15 1334,84

Idrocortisone

17 bu tirrato 159,16 34% 541,46 59,44

SLS 0,25%

Controllo 0,00 5,64

negativo

{tampone

fosfato)

* La composizione dell’invenzione utilizzata comprende;

acido ialuronico 0,2 %p/p

beta-glucano 85% 0,2 %p/p

sericina idrolizzata 0,2 %p/p

alfa bisabololo 0,1 %p/p

glicero fosfoinositolo 0,25 %p/p

(sale di colina 10%)

eccipienti 13-15% p/p

acqua depurata q.b a 100%

Viene evidenziato in pg/ml il rilascio di IL- 1 alfa nel medium di coltura deH'epidermide 3D dopo 6 h e 24 h di esposizione al prodotto testato e dopo stimolazione con una soluzione di SLS 0,25% .

Come si può notare, in presenza di SLS 0,25% vi è un rilascio di IL-1 che aumenta progressivamente da 6 a 24 ore di esposizione. La presente composizione è risultata in grado di ridurre la produzione di IL- 1 alfa indotta da SLS 0,25%. IL campione provoca un rilascio di interleuchina superiore al controllo negativo, probabilmente dovuto alla mortalità cellulare riscontrata a 24h.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica per applicazione topica, comprendente: acido ialuronico, beta-glucano. sericina idrolizzata, e glicerofo sforno sitolo o un suo sale farmaceuticamente accettabile.
2. Composizione secondo la rivendicazione 1, inoltre comprendete bisabololo, preferibilmente in quantità comprese tra 0 e 2% in peso rispetto al peso totale della composizione.
3. Composizione secondo la rivendicazione 2, in cui detto bisabololo è in forma purificata come isomero alfa.
4. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, in cui detto sale farmaceuticamente accettabile di glicerofosfoinositolo è un sale di colina.
5. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, in cui detto acido ialuronico è presente in quantità comprese tra 0,1% e 0,4%, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso rispetto al peso totale della composizione.
6. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, in cui detto beta-glucano è presente in quantità comprese tra 0,1% e 0,4%, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso rispetto al peso totale della composizione.
7. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, in cui detta sericina idrolizzata è presente in quantità comprese tra 0,1% e 0,4%, preferibilmente tra 0,1% e 0,3% in peso rispetto al peso totale della composizione.
8. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, in cui detto glicerofosfoinositolo o un suo sale farmaceuticamente accettabile è presente in quantità comprese tra 0,1% e 0,3%, prefei'ibilmente tra 0,2% e 0,3% in peso rispetto al peso totale della composizione.
9, Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, comprendente almeno: acido ialuronico 0,1 -0,3 %p/p beta-glucano 85% 0, 1-0,3 %p/p sericina idrolizzata 0, 1-0,3 %p/p alfa bisabololo 0,09-0,12 %p/p glicero fosfoi n o sitolo 0, 2-0,3 %p/p (sale di colina 10%) acqua depurata q.b. a 100%
10. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, inoltre comprendente uno o più eccipienti scelti tra: olio mandorle dolci (prunus dulcis}, glicerina, decil oleato, copolimero idrossietil acrilato /sodio acriloildimetil taurato, glicole caprilico, esano- 1,2-diolo, acido poliacrilico reticolato, etilesil glicerina, sorbitano isostearato, polisorbato 60, lecitina, acido lattico, acido fitico, sodio ialuronato, sodio idrossido, tocoferolo, ascorbil palmitato, acido citrico, copolimero idrossietil acrilato/ sodio acrilildimetil taurato, da soli o, preferibilmente, in miscela tra loro,
11. Composizione secondo la rivendicazione 10, in cui detti eccipienti sono presenti in quantità comprese tra 10% e 18 % in peso rispetto al peso totale della composizione.
12. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, in forma di gel o crema, preferibilmente crema idrofila.
13. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti, per l'uso come medicamento.
14. Composizione per l'uso secondo la rivendicazione 13, come agente cicatrizzante e/o vaso rigenerante.
15. Composizione per l'uso secondo la rivendicazione 14, come agente cicatrizzante.
16. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione lo, come agente cicatrizzante per condizioni post partum, post trattamenti fisici e/o stati ulcerativi di diversa origine, di atrofia, post menopausa o dovuti a squilibri ormonali, o per il trattamento di microlesioni e ferite dell'epitelio vulvare e vaginale.
17. Composizione comprendente: acido ialuronico, beta glucano, e glicerofosfoinositolo o un suo sale farmaceuticamente accettabile.
18. Composizione secondo la rivendicazione 17, per uso come medicamento, preferibilmente mediante somministrazione per via topica.
19. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 18, come agente cicatrizzante e/o vaso rigenerante