ITTO20060883A1

ITTO20060883A1 - Procedimento e microdispositivo a trasduzione ottica per l'identificazione e/o quantificazione di un analita in un campione biologico

Info

Publication number: ITTO20060883A1
Application number: IT000883A
Authority: IT
Inventors: Franco Calabi; Roberto Cingolani; Pier Paolo Pompa; Rosaria Rinaldi; Stefania Sabella
Original assignee: Consiglio Naz Delle Ricerche Infm; Fondazione Istituto Italiano Di Tecnologia
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2008-06-15
Also published as: WO2008072209A2; EP2122352A2; WO2008072209A3; US20090305291A1; ATE556029T1; EP2122352B1

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento e microdispositivo a trasduzione ottica per l'identificazione e/o quantificazione di

un analita in un campione biologico"

Di: CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE - INFM I-

STITUTO NAZIONALE PER LA FISICA DELLA MATERIA,

nazionalità italiana, Corso F. Perrone, 24,

16152 GENOVA

FONDAZIONE ISTITUTO ITALIANO DI TECNOLOGIA,

nazionalità italiana, Via Sicilia, 194, 00187

ROMA

Inventori designati : Pier Paolo POMPA, Stefania SA-BELLA, Rosaria RINALDI, Roberto CINGOLANI , Franco

CALABI

Depositata il: 14 DICEMBRE 2006

★* ;;DESCRIZIONE ;La presente invenzione si riferisce ad un procedimento e ad un dispositivo per l'identificazione ;e/o quantificazione, particolarmente in tempo reale, di un analita, in particolare una biomolecola presente in un campione biologico e trova applica PR/cp zione particolarmente nel settore dell'analisi diagnostica (analisi genomiche/proteomiche) e nella produzione di bio-chip. ;Nell'ultimo decennio si è avuta una consìderevole proliferazione dei bio-chip e numerose sono le terminologie attualmente presenti ad indicarli (gene-chip, gene-array, DNA micro-array, protein chip, lah-on-a-chip) . Sostanzialmente, tali chip, sviluppati sia in formati semplici o integrati in dispositìvi/architetture più complesse, sono strutture planari di diverso materiale (comunemente vetro o plastica) sulle quali vengono immobilizzate (per modificazione chimica della superficie o per sintesi in aitu) (bio)molecole, quali DNA, proteine e cellule capaci di effettuare un riconoscimento selettivo di molecole target [Fan, 2006]. ;La tecnologìa dei bio-chip ha rivoluzionato la biologia molecolare, trovando ampio utilizzo per gli studi di espressione di geni e di proteine (genomica/proteomica) in diversi campi quali la diagnostica sperimentale e clinica, la scoperta di nuovi farmaci (hiomarkers discovery) e la farmacogenomica . ;In effetti, sono state sviluppate diverse tipologie di chip per una gamma molto ampia di applicazioni, quali saggi enzimatici [Hadd, 1997], saggi di immunochimica [Wang, 2001], analisi di riconoscimento di polimorfismi in varianti geniche [Dunn, 2000], sequenziamento di acidi nucleici [Scherer, 1999] ed anche chip per la realizzazione, su scale microvolumetriche, di reazioni di ligazione e di amplificazione del DNA (reazione di ligasi a catena [Cheng, 1996] e reazione polimerasica a catena, PCR [Kopp, 1998; Daniel, 1998]). ;In particolare, data l'elevata specificità nella reazione di ibridazione tra sequenze di oligonucleotidi (appaiamento selettivo A-T, G-C), i chip a DNA sono stati sviluppati in maniera più rapida rispetto ai chip a proteine. Il mercato di questi ultimi, infatti, sebbene di enorme interesse per il mondo scientifico, ha subito un rallentamento rispetto a quello preannunciato alla nascita di tale tecnologia, data la complessità delle interazioni che sono alla base del meccanismo di bio-ricognizione tra specie molecolari proteiche [Bodovitz, 2005] . ;In generale, in un chip, l'evento di ricognizione tra la (bio)molecola e la specie target deve essere tradotto in un segnale rivelabile e misurabile. I trasduttori fisici che permettono la conversione del segnale possono essere di diverso tipo e si basano su differenti meccanismi di funzionamento: trasduzione ottica, elettrica, elettrochimica, o dispositivi sensibili a variazioni dì massa, di corrente o di frequenza [Wang, 2002; Murphy, 2006) . ;Nel vasto campo della biosensoristìca, i sensori ottici ricoprono però un ruolo cardine. La rivelazione ottica si basa essenzialmente sulla misura della fluorescenza che si sviluppa nel sito di bioriconoscimento in seguito all'evento di legame tra le specie interagenti (ad esempio tra oligonucleotidi complementari). Tipicamente, i formati più comuni di bio-chip prevedono che una delle due specie biomolecolari sia coniugata ad un marcatore fluorescente . ;I primi trasduttori ottici si avvalevano di schemi di rivelazione ottica abbastanza semplici: tipicamente, il segnale di fluorescenza derivava da un fluoroforo coniugato alla biomolecola target, e la rivelazione del segnale avveniva alla fine della reazione dì ibridazione (bio-riconoscimento). Tali approcci consentono una rivelazione puramente di tipo qualitativo, sulla presenza o meno della biomolecola target nella soluzione in esame (approccio on/off), ma non permettono di ottenere informazioni in real-time (di tipo quantitativo) sugli eventi di interazione degli analiti. ;Successivamente, sono stati sviluppati una serie di sistemi innovativi di rivelazione ottica, che consentissero una maggiore sensibilità e flessibilità dello schema di rivelazione. Per esempio, l'uso di fibre ottiche per la trasduzione del segnale ha trovato largo impiego, così come lo sviluppo di nuove strategie di detection (FRET, molecular beacons, TIRF, SPR, sonde fosforescenti, beads) o il design di nuovi marcatori fluorescenti (ad esempio il PicoGreen). ;Queste strategie, tuttavia, pur portando ad un notevole miglioramento nei limiti di rivelazione del segnale [Piunno, 1995; Ferguson, 1998], non consentono determinazioni quantitative delle biomolecole di interesse, soprattutto nei formati pianari, quali i micro-array, che prevedono l'immobilizzazione dì sonde specifiche per il bio-riconoscimento su un substrato solido. ;CN 1 358 867 descrive un dispositivo di tipo "gene chip" che impiega il fenomeno FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) per la rivelazione di acidi nucleici, ove il fenomeno FRET è indotto dallo scambio risonante di energia tra un fluoroforo donore e un fluoroforo accettore, legati uno alla specie sonda e l'altro alla specie bersaglio. ;W02006/066977 descrive l'impiego della risonanza FRET per la rivelazione di proteine, in cui una proteina marcata, comprendente un marcatore donore di energia e almeno un gruppo accettore, suscettìbile di accettare energia dal marcatore donore mediante trasferimento di energia di Forster, è esposto a energia elettromagnetica incidente per eccitare il gruppo donore e misurare l'emissione di fluorescenza del donore. ;Uno scopo della presente invenzione è quello di fornire un procedimento e un nuovo dispositivo a trasduzione ottica, che utilizzano il fenomeno FRET, e che permettono di effettuare una misura quantitativa e in tempo reale della specie molecolare bersaglio. ;Uno scopo particolare dell'invenzione è rivolto alla possibilità di analizzare quantitativamente il processo di amplificazione di DNA (Polymera.se Chain Reaction, PCR), poiché tale tecnologia, nelle sue diverse modalità {reverse transcriptional, RT-PCR; multiplex PCR; real-time PCR [Speers, 2006; Wrong, 2005]), combinata ai nuovi metodi di sintesi automatizzata degli acidi nucleici, fornisce un importante mezzo di ricerca nella diagnostica ed è ampiamente utilizzata nella genotipizzazione e nell'espressione fenotipica di antigeni patogeni o virali [Cockerill, 2003; Domiati-Saad, 2006]. ;Il principio di funzionamento della real-time POR si basa tipicamente sulla misura di un marcatore fluorescente, il cui segnale aumenta in misura proporzionale alla quantità di DNA amplificato in ogni ciclo di reazione. Generalmente, si avvale di sonde opportunamente coniugate a molecole fluorescenti che presentano diversi meccanismi di funzionamento (SYBR Green, TaqMan, Molecolar Beacons, Scorpions, Sunrise) [Wrong, 2005]. ;Attualmente, sono presenti diversi esempi di real-time PCR su chip. La miniaturizzazione di questa tecnologia fornisce notevoli vantaggi quali una maggiore velocità dei cicli termici, una significativa riduzione nel consumo di reagenti e dei campioni biologici, la portabilità del microdipositivo e la naturale possibilità di utilizzo per applicazioni di diagnostica al punto di cura [Lee, 2003]. ;In vista degli scopi sopra citati, costituisce oggetto dell'invenzione un procedimento, un dispositivo e un'apparecchiatura come definiti nelle rivendicazioni che seguono. ;Ulteriori vantaggi e caratteristiche del procedimento e del dispositivo secondo l'invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione che segue, effettuata con riferimento ai disegni annessi, in cui : ;la figura 1 è uno schema generale del dispositivo a trasduzione ottica secondo l'invenzione per analisi quantitative in tempo reale di biomolecole per genomica/proteomica; ;le figure 2A e 2B illustrano uno schema del dispositivo e del relativo sistema di rilevazione ottica per il monitoraggio in tempo reale di interazioni biomolecolari per analisi genomiche/proteomiche, in particolare riferito al caso in cui la biomolecola da analizzare è il DNA (reai-time PCR); in particolare la figura 2B illustra lo spettro di assorbimento dei nanocristalli (NCs) e del fluoroforo organico (Cy3), utilizzati nell'esempio di attuazione che segue con indicazione della lunghezza d'onda utilizzata per la radiazione di eccitazione e della lunghezza d'onda utilizzata per la rivelazione; ;la figura 3 è uno schema generale del microdispositivo secondo l'invenzione e del relativo sistema di rivelazione ottica per il monitoraggio in tempo reale di interazioni biomolecolari per analisi genomìche/proteomiche; ;la figura 4 è un'immagine di un prototipo di microreattore secondo l'invenzione; ;la figura 5 è la rappresentazione di una elettroforesi su gel di agarosio del plasmide pMPSV-RM1, amplificato in 5 μΐ di miscela di reazione di POR in un microreattore secondo l’invenzione; e ;la figura 6 è un diagramma che illustra il tipico andamento del segnale di fluorescenza nel microdispositivo secondo l'invenzione (secondo lo schema ottico di figura 2) per monitorare in tempo reale le interazioni biomolecolari per analisi genomiche/proteomiche, dove il segnale rilevato è quello del fluoroforo coniugato alla biomolecola di interesse in seguito all’interazione con il corrispondente sito di riconoscimento (eccitazione mediante FRET). ;Il dispositivo a trasduzione ottica oggetto dell'invenzione per la determinazione quantitativa di biomolecole in tempo reale, adattabile ad analisi genomiche e proteomiche, comprende una microcamera di reazione 1, destinata a ricevere una soluzione contenente il campione biologico includente l'analita o gli analìti A da rilevare; la microcamera di reazione comprende una parete 2, formata da un substrato solido rivestita, o almeno in parte rivestita, con un film sottile 3 di materiale polimerico (figura 1). ;In questo film sono uniformemente dispersi i nanocristallì fluorescenti NCs e alla sua superficie sono immobilizzate sonde specifiche S per gli analiti da determinare. ;Gli analiti A presenti nel campione biologico da rivelare e quantificare sono marcati direttamente (ad esempio per sìntesi nella microcamera) o indirettamente, con uno o più fluoroforì, opportunamente scelti. L'interazione specifica tra una biomolecola analita presente nel campione e le sonde immobilizzate sulla parete otticamente attiva della microcamera è rilevata tramite un processo di FRET tra NCs (che agiscono da donori) e i fluorofori legati alla biomolecola (che agiscono da accettori). ;Lo schema ottico è illustrato nelle figure 2A, 2B e 3, in cui sono riportati, rispettivamente, il caso in cui il dispositivo oggetto dell'invenzione è utilizzato per analisi di sequenze specifiche di acidi-nucleici (real-time PCR) e il caso generale in cui si vuole effettuare la determinazione quantitativa di una biomolecola (proteine, ligandi ecc.) . ;Nel primo caso sono riportati in figura, a titolo di esempio non limitativo, gli specifici parametri ottici di fabbricazione impiegati nel microdispositivo . ;Lo schema sfrutta le peculiari caratteristiche foto-fisiche dei processi FRET: l'efficienza dell'interazione donore-accettore è fortemente dipendente dalla distanza (d) relativa fra le due specie (tipicamente è funzione di d<~6>), per cui si possono avere dei trasferimenti risonanti di energia di eccitazione, dai NCs ai fluorofori bersaglio, solo per distanze tipicamente inferiori ai 10 nanometri. ;Nello schema di rivelazione ottica integrata nel microdìsposìtivo, tali caratteristiche fotofisiche implicano il fatto che si possa ottenere un processo efficiente di trasferimento energetico dai NCs ai fluorofori legati alle molecole bersaglio solo nel momento in cui tali biomolecole abbiano interagito specificamente con la relativa sonda (a meno di un background trascurabile e costante nel tempo dovuto alle biomolecole che statisticamente si trovano in soluzione nella regione compresa entro i primi 10 nm dalla superficie del film polimerico . ;Sfruttando le particolari proprietà spettrali dei nanocristalli (essenzialmente lo spettro di assorbimento molto esteso; vedasi ad esempio lo spettro di figura 2B), è possibile monitorare le interazioni biomolecolarì di interesse utilizzando una radiazione di eccitazione a bassa lunghezza d'onda (tipicamente UV-blu, per esempio nella figura 2B è stata scelta λ = 400 nm), che va ad eccitare in maniera efficiente NCs dispersi nel film polimerico, ma non i fluorofori bersaglio, e raccogliendo il segnale di fluorescenza nella regione spettrale di emissione dei soli fluorofori legati agli analiti da determinare (per esempio, nella figura 2, intorno a 630-650 nm). ;Il punto fondamentale di tale approccio è che tutte le biomolecole libere in soluzione non vengono eccitate, non essendo in grado di assorbire direttamente la radiazione di eccitazione, e, dunque, danno un contributo nullo al segnale di fluorescenza che si va a rivelare. Questa caratteristica permette, dunque, di monitorare in maniera selettiva, in tempo reale, e in modo quantitativo, le interazioni biomolecolari con le sonde specifiche, e di conseguenza, di analizzare e quantificare le biomolecole di interesse genomico/proteomico. ;I nanocristalli utilizzati nell'ambito dell'invenzione, sono preferibilmente nanocristalli colloidali di semiconduttori, preferibilmente di tipo core-shell; ad esempio, possono essere utilizzati i nanocristalli core-shell di tipo CdSe/ZnS. Altri materiali che sono spesso utilizzati per formare il core, sono per esempio: ZnSe, CdS, CdTe. Ovviamente sono possibili un'ampia gamma di altri materiali . ;Si intende tuttavia che 1<1>invenzione non è da intendersi limitata ad una specifica scelta di nanocristalli fluorescenti. ;In una forma di attuazione dell'invenzione, il film sottile di materiale polimerico può comprendere due o più tipologie di nanocristalli fluorescenti, aventi diverse caratteristiche di assorbimento spettrale . ;I fluorofori legati alle biomolecole possono essere comuni fluorofori organici commerciali, o qualsiasi altro tipo di fluoroforo innovativo, inclusi NCs, oligotiofeni, GFPs (Green Fluorescent Proteine), beads, sistemi ibridi), purché abbiano le caratteristiche adatte per agire da efficienti specie accettori nei processi FRET da parte di NCs dispersi nella matrice polimerica (essenzialmente devono presentare un buon overlap spettrale con NCs utilizzati) . ;L'emissione dei fluorofori legati alle molecole bersaglio può spaziare in un ampio inteirvallo spettrale (dal blu all'infrarosso) , in funzione della specifica applicazione biomolecolare. ;Gli analiti compresi nel campione biologico da analizzare possono essere marcati con fluorofori diversi che emettono in regioni spettrali distinte; la possibilità di utilizzare differenti coppie NCsfluoroforo, come coppia donore-accettore, permette così di effettuare analisi in parallelo su diversi analiti (multi-plexing) . ;A questo scopo è sufficiente monitorare simultaneamente l'emissione dei differenti fluorofori, raccogliendo i diversi segnali in differenti finestre spettrali. ;Il procedimento secondo l'invenzione non è evidentemente limitato alla rivelazione e quantificazione di specifici analiti; gli analiti da determinare possono ad esempio comprendere molecole di DNA, proteine e ligandi suscettibili di essere marcati con uno o più fluorofori. ;Tali analiti (composti bersaglio) possono essere presenti in un campione biologico o anche non biologico, quali i campioni clinici estratti da sangue, urina, feci, saliva, pus, siero, tessuti, soluzioni di fermentazione o terreni di coltura. Gli analiti (composti bersaglio) possono preferibilmente essere isolati, purificati, scissi, copiati e/o amplificati, se necessario mediante metodi noti al tecnico del settore. ;Analogamente, le sonde specifiche, immobilizzate alla superficie del sottile film polimerico, possono comprendere sequenze specifiche di ssDNA, anticorpi, recettori, aptameri ecc. ;Il film otticamente attivo, integrato nel microdispositivo secondo l'invenzione, è preferibilmente realizzato a partire da una soluzione di NCs e di un polimero, preferibilmente un elastomero, che viene depositata sul substrato solido, preferibilmente mediante spin-coating o altre tecniche di deposizione in grado di garantire una distribuzione uniforme di NCs nella matrice polimerica; tipicamente, lo spessore del film polimerico varia da pochi nanometri a qualche decina di micron, ad esempio da 1 nm a 50 μπι; spessori preferiti sono dell'ordine da 10 a 100 nm . ;Il materiale polimerico utilizzato non deve essere otticamente attivo (in assenza di NCs deve presentare una fluorescenza intrinseca nulla o molto scarsa), essere trasparente nel campo spettrale che va dal vicino UV al visibile e all'infrarosso, e avere caratteristiche chimico-fisiche che permettano di disperdere in maniera uniforme NCs senza perturbarne in modo significativo le peculiari proprietà ottiche, e caratteristiche chimiche di superficie che consentano la funzionalizzazione chimica con molecole capaci di bio-ricognizione. ;In una forma di attuazione dell<1>invenzione sì può utilizzare un materiale polimerico con proprietà di resist elettronico (come ad esempio il PMMA) che permette di patternare la superficie otticamente attiva del dispositivo mediante tecniche litografiche . ;Il substrato che funge da supporto per la matrice polimerica non deve rispondere a particolari requisiti, se non quello di essere compatibile da un punto di vista fisico-chimico con il materiale polimerico utilizzato; ad esempio, si possono utilizzare silicio, silice, vetro, quarzo e materiale plastico . ;La camera di reazione può essere costituita da diversi materiali, ad esempio materiali polimerici o vetrosi, opportunamente funzionalizzati, passivati o meno, purché compatibili con la matrice polimerica integrata e con la soluzione contenente il campione ed i reagenti, che solitamente è una soluzione acquosa. ;La camera può essere prodotta mediante diverse tecniche, quali etching, embossing, moulding o qualsiasi altra tecnica di fabbricazione adatta. Nella camera di reazione può essere integrato un sistema idoneo di riscaldatori e/o raffreddatori, allo scopo di garantire il mantenimento di una temperatura controllata della soluzione presente nella camera, o la possibilità di effettuare degli specifici cicli termici in funzione della particolare applicazione . ;Un materiale attualmente preferito per la microcamera di reazione è il polidimetilsilossano (PDMS), che al momento è tra i materiali plastici di maggior utilizzo per la produzione di chip, sia in sistemi a sé stanti che integrati. Il PDMS presenta diversi vantaggi: è biologicamente inerte, non tossico, permeabile ai gas, poco costoso, aderisce facilmente ad altri materiali come vetro, polistirene e PMMA, fornendo così la possibilità di costruire sistemi ibridi costituiti da diversi materiali . ;Tuttavia, l'elevata idrofobicità e la scarsa reattività chimica dei gruppi esposti in superficie ne limitano l'utilizzo in molte applicazioni [Xiang, 2005]. Per migliorare le caratteristiche di idrofilìa della superficie, il PDMS può essere sottoposto a trattamenti di modifica superficiale mediante metodologie fisico-chimiche. ;A tal fine, il PDMS può essere trattato con plasma di ossigeno in condizioni sperimentali tali da ottenere una blanda modifica della superfìcie (idrolisi dei gruppi metossilici esposti) e non un vero e proprio etching. L'azione del plasma dì ossigeno risulta efficace, consentendo di ottenere tipici valori di angolo di contatto misurati in seguito al trattamento molto bassi, dell'ordine di 12,5° 6,25°. ;Allo scopo di migliorare la stabilità nel tempo di tale trattamento ed evitare che le superfici di PDMS così trattate ritornino a presentare caratteristiche idrofobiche in tempi brevi (ad esempio per tempi superiori alle 24 ore), possono essere effettuate procedure di passivazione della superficie. Una procedura preferita di passivazione è un trattamento con soluzione acida di di-ammino-PEG che consente dì ottenere buone caratteristiche di bagnabilità per tempi superiori a due settimane. ;La funzionalizzazione della superficie del film sottile otticamente attivo può essere realizzata mediante tecniche convenzionali note per la preparazione di bio-chip. In generale, sono possibili reazioni di idrolisi o di amminolisì dei gruppi metossilici liberi esposti ed attivazione dei gruppi risultanti con gruppi chimici reattivi (mono e/o bi-linker) per le (bio)molecole, come ad esempio oligonucleotidi , proteine e peptidi, con le quali si vuole funzionalizzare la superficie stessa. ;Uno dei metodi preferiti è la fissazione di molecole biologiche come proteine, peptidi o sequenze dì acidi nucleici mediante legame chimico con gruppi amminici presenti sulla superficie otticamente attiva, legati a mono-lìnkers attivanti quali la glutaraldeide. ;L'inserimento di gruppi amminici (che legano a loro volta i gruppi attivati sulla superficie) alle estremità terminali della catena di acidi nucleici è facilmente ottenuta mediante sintesi utilizzando nucleotidi amminati. ;Si intende che le molecole sonda possono essere legate alla superficie otticamente attiva secondo una disposizione a matrice, secondo le tecnologie di per sé note per la produzione di bio-chip. ;Esempio di attuazione ;Un prototipo di microreattore per la rivelazione ottica in tempo reale di analisi genomiche/proteomiche è stato realizzato utilizzando PDMS come materiale per la microcamera. Per migliorare le caratteristiche di idrofilìa della superficie, il PDMS è stato inizialmente trattato con plasma di ossigeno, come precedentemente indicato, per ottenere una blanda modifica della superficie con idrolisi dei gruppi metossilici esposti. ;Inoltre, per incrementare la stabilità del tempo del trattamento, si sono effettuate procedure di passivazione della superficie con l'impiego di soluzioni acide di di-ammino-PEG. Tale procedura è risultata di successo ed il dispositivo presentava buone caratteristiche di bagnabilità per più di due settimane . ;Il microreattore dì PDMS è stato realizzato versando una soluzione di PDMS ed agente polimerizzante, in opportuni rapporti di concentrazione, in stampi circolari metallici, le cui dimensioni impartiscono forma e spessore costanti al microreattore. In seguito a polimerizzazione della soluzione, effettuata in forno a 140°C per 30 minuti, la microcamera di PDMS è stata rimossa dalla forma metallica e raffreddata. ;Sono state ottenute microcamere con dimensioni idonee per volumi da 50 μ:^ fino a 5 \iL·,· un tipico prototipo di microcamera è illustrato nella figura 4 . ;E<1>stata inoltre investigata la possibilità di ottenere sistemi ibridi, costituiti da diversi materiali polimerici e si è realizzato un microreattore di PDMS con un fondo costituito da uno strato di PMMA funzionaiizzato secondo le procedure descritte nel seguito. Si sono anche realizzate diverse lamine di PDMS, al fine di chiudere l'intero sistema e prevenire così l'evaporazione di solventi, fenomeno quest'ultimo molto importante da controllare nei processi di PCR. ;Per la realizzazione del prototipo, si è scelto il PMMA come matrice polimerica per disperdere i nanocristalli , in quanto soddisfacente alle caratteristiche chimico-fisiche precedentemente enunciate. Come supporto della matrice polimerica, inizialmente si sono utilizzati diversi substrati (vetro, silice e PDMS) e per ognuno di questi si sono studiate le caratteristiche di compatibilità chimico-fisica con una soluzione di PMMA, in seguito a deposizione mediante spin-coating. Si sono preparati campioni di PMMA senza e con nanocristalli col loidali di semiconduttori (campioni standard e campioni otticamente attivi) ed il film ottenuto è stato caratterizzato mediante profìlometro, microscopia a forza atomica (AFM) e microscopia confocale. ;Le caratterizzazioni effettuate hanno evidenziato che il film polimerico ottenuto presentava ottime proprietà di uniformità. Inoltre, dall'analisi degli spettri di emissione di NCs, è emerso che questi ultimi erano dispersi in maniera omogenea all'interno del film e che presentano caratteristiche spettrali identiche a quelle misurate in soluzioni standard di NCs appena sintetizzati. ;In particolare, nello specifico esempio di attuazione, lo spessore dello strato di PMMA in cui sono stati dispersi NCs è stato ottimizzato a circa 40-50 nm, poiché i segnali di fluorescenza misurati in questo caso sono sufficientemente intensi per una rivelazione ottimale. ;Come precedentemente indicato, si intende che è possibile utilizzare film con spessori differenti, per cui la scelta dello spessore del film otticamente attivo non è particolarmente critica. Nel caso specifico, sono stati utilizzati NCs di tipo core-shell di CdSe/ZnS, che emettono a 530 nm; film polimerici con medesime caratteristiche ottiche e di uniformità sono stati ottenuti anche con NCs di differente dimensione, che emettono dal blu al vicino infrarosso. ;NCs sono stati dispersi in una soluzione di PMMA-950K (tipicamente con concentrazioni finali in clorobenzene = 1,9 x 10<s>M) . La soluzione dispersa così ottenuta è stata depositata sul substrato mediante spin-coating (parametri tipici: 3000 g per 40 secondi) e successivamente è stata indotta la polimerizzazione del PMMA per riscaldamento su piastra a 180°C per 2 minuti. ;Nell'esempio qui riportato di microdispositivo per determinazioni quantitative di sequenze di oligonucleotidì (real-time PCR), il film di PMMA, reso otticamente attivo da NCs in esso dispersi, è stato funzionalizzato per amminolisi con un monostrato di gruppi amminicì primari . Tali gruppi sono stati coniugati con oligonucleotidi con funzionalità ammìno terminale mediante un linker, quale la glutaraldeide . ;ssDNA immobilizzati sul PMMA costituiscono gli elementi di bio-riconoscìmento di DNA bersaglio complementari che rappresentano il prodotto risultante dalla reazione di amplificazione a catena Successivamente, si è passati alla rivelazione in real-time dell<1>evento di ibridazione tra le due specie (ssDNA immobilizzato e DNA bersaglio). ;Il DNA bersaglio era marcato con fluoroforo organico commerciale (Cy3), che presenta forte overlap spettrale con i NCs utilizzati e permette di effettuare la rivelazione ottica dell'interazione oltre i 600 nm (regione in cui NCs selezionati non emettono) . ;La rivelazione ottica è stata quindi effettuata mediante la misura del segnale di fluorescenza del marcatore Cy3 presente sul DNA bersaglio amplificato (secondo lo schema generale riportato nella figura 2A) in seguito all'interazione con ssDNA (sonde complementari immobilizzate, come prima descritto, sul film di PMMA otticamente attivo). ;Il segnale di fluorescenza del Cy3 deriva dall'eccitazione del microreattore a bassa lunghezza d'onda, specificatamente X *= 400 nm, che eccita selettivamente ed efficientemente NCs, ma non i fluorofori coniugati alle biomolecole libere in soluzione, e successivo trasferimento di energia (FRET) da NCs presenti nel PMMA al fluoroforo coniugato al DNA bersaglio (che ha interagito col DNA sonda).

In tal caso, il segnale di fluorescenza rivela-

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to aumenta in funzione del numero crescente di cieli di amplificazione del DNA (cicli POR), come si può osservare dal segnale misurato in real-time per 1 'amplificazione del plasmide pMPSV-RMl (figura 6). Dalla curva ottenuta è possibile ricavare informazioni quantitative sulle sequenze di DNA di interesse .

In sommario, il procedimento ed il dispositivo secondo l'invenzione presentano le seguenti caratteristiche innovative e vantaggi:

secondo lo schema ottico generale innovativo, l'elemento otticamente attivo (il film polimerico) è parte integrante del dispositivo e non è un fluoroforo che viene coniugato alle biomolecole o all'elemento di bio-riconoscimento;

1<1>applicabilità del sistema è molto ampia: va dalla real-time POR (senza però dipendere dal progetto di sequenze specifiche di oligonucleotidi, tipo i molecular beacons; può essere utilizzato, in principio, per rivelare qualsiasi sequenza di DNA) alla rivelazione di una classe molto ampia di interazioni biomolecolari in ambito genomico/proteomico: determinazioni quantitative di proteine, ligandì, ecc.;

il dispositivo ed il procedimento secondo l'in-

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venzione hanno ottime caratteristiche di efficienza e sensibilità:

ì) l'efficienza del segnale di trasduzione ottica è dato dal fatto che l'eccitazione del fluoroforo mediante processi FRET avviene non per singola interazione donore-accettore, ma attraverso interazioni multiple tra i vari NCs dispersi nel polimero (prossimi al sito di bio-riconoscimento) ed il fluoroforo accettore coniugato alla biomolecola bersaglio; inoltre, è ampiamente dimostrato in letteratura che NCs colloidali sono ottime specie donorì (in termini di efficienza) nei processi FRET; ii) l'alta sensibilità del procedimento e del dispositivo deriva dal fatto che, in combinazione all'ottenimento di segnali di fluorescenza abbastanza alti dalle biomolecole bersaglio, il segnale di background (rumore) è praticamente nullo, grazie al fatto che la radiazione di eccitazione non è in grado di eccitare alcuna specie nella camera di reazione (con emissione nella finestra spettrale di rivelazione) se non le biomolecole bersaglio che hanno interagito specificamente con il sito di bioriconoscimento;

il procedimento ed il dispositivo hanno la possibilità di analizzare singole specie biomolecola-

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ri, ma anche di effettuare determinazioni quantitative in parallelo mediante approcci del tipo multiplexing (scegliendo n coppie NCs-fluorofori come specie donore-accettore in processi FRET, è possibile monitorare n specie biomolecolari di interesse, utilizzando una singola lunghezza d'onda d'eccitazione e raccogliendo l'emissione in differenti regioni spettrali).

Inoltre, nel momento in cui si utilizza come materiale polimerico per realizzare il film otticamente attivo del dispositivo un materiale con proprietà dì resist elettronico (tipo PMMA), è possibile patternare il film mediante tecniche litografiche (per esempio e-beam litography), con risoluzioni fino a pochi nanometri.

Tale approccio consente dunque di ottenere, con grande precisione ed altissima risoluzione, matrici di pixel (ogni pixel è un differente elemento dì trasduzione ottica) per analisi quantitative di biomolecole in parallelo.

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reattore ottenuto per applicazioni di real-time PCR, si è effettuata dapprima l'amplificazione mediante PCR di un plasmide di interesse (pMPSV-RMl) a diversi volumi di reazione {25, 12, 6 e 3 μ!>). In questo caso, il microreattore è stato trattato preliminarmente con diverse procedure di passivazione {per esempio con soluzioni di BSA) e la rivelazione è stata effettuata al punto terminale della reazione con elettroforesi su gel di agarosio.

I risultati mostrano che la PCR avviene nel microreattore anche a volumi minimi di reazione (figura 5).

Nella figura 5, le bande luminose nelle corsie 3 e 5 corrispondono al DNA amplificato, le cui dimensioni sono paragonabili a quelle del marcatore di riferimento di 250 bp:

linea 1: markers;

linea 2 : campione standard in microreattore senza DNA templato;

linea 3: campione in microreattore con DNA templato;

linea 4: campione standard in provetta convenzionale senza DNA templato;

linea 5: campione in provetta tradizionale con DNA templato.

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'identificazione e/o quantificazione di un analita bersaglio presente in un campione, particolarmente un campione biologico, comprendente l'operazione di porre a contatto detto analita bersaglio legato ad un fluoroforo con una molecola sonda immobilizzata su di un supporto, per permettere un legame specifico tra detto analita bersaglio e detta molecola sonda, caratterizzato dal fatto che detta molecola sonda è fissata sulla superficie di un supporto rivestito con una pellicola comprendente una matrice polimerica, in cui sono dispersi nanocristalli fluorescenti, suscettibili di indurre un fenomeno di trasferimento risonante di energia (FRET) con detto fluoroforo e comprendente inoltre le operazioni di irradiare detta pellicola di rivestimento del supporto con una radiazione di lunghezza d'onda tale da eccitare selettivamente i nanocristalli, ma non il fluoroforo legato a detto analita bersaglio e rivelare il segnale di fluorescenza nella regione spettrale di emissione del solo fluoroforo legato all'analita bersaglio .
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta matrice polimerica 33 è formata da un materiale polimerico non otticamente attivo e trasparente nel campo spettrale che va dal vicino UV all'infrarosso.
3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detta matrice polimerica è formata da un materiale polimerico con proprietà di resìst elettronico.
4 . Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detta matrice polimerica comprende polimetìlmetacrilato (PMMA).
5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, caratterizzato dal fatto che detti nanocristalli fluorescenti comprendono nanocrìstalli colloidali di semiconduttore.
6 . Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, caratterizzato dal fatto che detti nanocristalli sono di tipo core-shell.
7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, caratterizzato dal fatto che detto fluoroforo presenta overlap spettrale con detti nanocristalli .
8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta pellicola polimerica comprende due o più ti- 34 pologie di nanocristalli aventi distinte caratteristiche spettrali di emissione fluorescente.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che il campione sottoposto ad analisi comprende analiti bersaglio marcati con una pluralità di fluorofori che emettono in regioni spettrali distinte ed in cui detta pellicola di rivestimento comprende una corrispondente pluralità di tipologie di nanocristalli fluorescenti, scelti in modo tale per cui ciascuna tipologia di nanocristalli è suscettibile di indurre un fenomeno di trasferimento risonante di energia (FRET) con un rispettivo fluoroforo.
10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto analita bersaglio è scelto tra una molecola di acido nucleico, proteine e ligandi.
11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, per il monitoraggio in tempo reale di un processo di amplificazione di acidi nucleici, in cui l'analita bersaglio è un acido nucleico in corso di amplificazione.
12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che sulla superficie di detta pellicola di rivestimento è immobilizzata una pluralità di molecole sonda, disposte secondo una matrice predeterminata.
13. Microdispositivo a trasduzione ottica per l'identificazione e/o quantificazione di un analita bersaglio in un campione, particolarmente un campione biologico, caratterizzato dal fatto che comprende una camera di reazione, atta a ricevere una soluzione comprendente un campione biologico includente analiti bersaglio legati ad un fluoroforo, una pellicola sottile associata ad una parete di detta camera comprendente una matrice polimerica includente nanocristalli fluorescenti dispersi in detta matrice, detti nanocristalli essendo suscettibili di indurre un fenomeno di trasferimento risonante di energia (FRET) con detti fluorofori ed una pluralità di molecole sonda fissate a detta pellicola di rivestimento.
14. Microdispositivo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che detta matrice polimerica è formata da un materiale polimerico non otticamente attivo e trasparente nel campo spettrale che va dal vicino UV all'infrarosso.
15. Microdispositivo secondo le rivendicazioni 13 o 14, caratterizzato dal fatto che detta matrice polimerica è formata da un polimero con proprietà dì 36 resist elettronico.
16. Microdisposìtivo secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che detta matrice polimerica è formata da polimetilmetacrilato (PMMA).
17. Microdispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 16, caratterizzato dal fatto che in detta matrice polimerica sono dispersi nanocristalli colloidali di semiconduttore, preferibilmente di tipo core-shell.
18. Microdispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 17, caratterizzato dal fatto che in detta matrice polimerica sono disperse due o più tipologie di nanocristalli fluorescenti aventi distinte caratteristiche di emissione spettrale.
19. Apparecchiatura per l'identificazione e/o quantificazione di un analìta bersaglio presente in un campione biologico, comprendente un microdispositìvo a trasduzione ottica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 18 e comprendente inoltre una sorgente di radiazione, atta ad emettere una radiazione con una lunghezza d'onda tale da eccitare selettivamente detti nanocristalli e mezzi di rivelazione del segnale di fluorescenza emesso nella regione spettrale di emissione dei fluorofori legati agli analiti bersaglio. 37