ITRM20080684A1 - Uso di inibitori della tirosin chinasi c-abl per la preservazione degli oociti. - Google Patents
Uso di inibitori della tirosin chinasi c-abl per la preservazione degli oociti. Download PDFInfo
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Description
Uso di inibitori della tirosin chinasi c-Abl per la preservazione degli oociti
La presente invenzione concerne l’uso di inibitori della tirosin chinasi c-Abl per la preservazione degli oociti. In particolare, l’invenzione riguarda l’utilizzazione di inibitori della chinasi c-Abl allo scopo di preservare il numero di oociti nei follicoli primordiali dagli effetti delle sostanze genotossiche quali ad esempio la terapia antitumorale e quindi tutelare la fertilità delle pazienti, oppure nei casi di menopausa prematura o nelle tecniche di fecondazione assistita.
Nelle pazienti sottoposte a chemioterapia e/o radioterapia, gli oociti nei follicoli primordiali sono soggetti a stress genotossici in grado di provocare la degenerazione e la morte degli oociti stessi, causando menopausa e sterilità. In risposta a stress genotossici le cellule attivano un complesso sistema di segnali che porta all’arresto del ciclo cellulare o alla morte (Kastan, M.B. & Bartek, J. 2004; Zhou, B.B. & Elledge, S.J. 2000).
E’ noto che l’equilibrio tra la proliferazione e la morte cellulare è un meccanismo indispensabile per garantire l’omeostasi negli organismi multicellulari. La morte fisiologica della cellula avviene prevalentemente attraverso una forma di suicidio cellulare chiamato apoptosi, molto conservato durante l’evoluzione e influenzato da una varietà di stimoli regolatori. E’ ben noto, attualmente, il valore dell’omeostasi cellulare, infatti, le alterazioni del meccanismo che modula la sopravvivenza cellulare contribuiscono all’insorgere di un gran numero di patologie, prima di tutte il cancro.
Nonostante oggi un gran numero di bambine affette da cancro sopravvive fino all’età adulta, la qualità della loro vita è severamente influenzata dalla ridotta fertilità o addirittura sterilità che si osserva quale frequente effetto collaterale dovuto a radioterapia addominale e chemioterapia mediante agenti alchilanti.
Gli effetti collaterali che si osservano in seguito a trattamento chemioterapico e/o radioterapico sono a carico, in maniera non specifica, di tutte quelle cellule che si dividono rapidamente e anche delle cellule germinali. La severità di questi effetti collaterali è dipendente dalla dose, dal tipo di agenti citossici utilizzati e/o dalla dose (ed il frazionamento)dell’irradiazione somministrata.
Nel trattamento di diversi tumori vengono comunemente usati diversi tipi di agenti chemioterapici, raggruppati in cinque distinte classi in base al loro meccanismo di azione: agenti alchilanti, induttori di aneuploidia, inibitori di topoisomerasi II, antimetaboliti e radiomimetici. La chemioterapia particolarmente tossica per l’ovaia è quella che prevede l’utilizzo di agenti alchilanti, cyclophosphamide, busulphan, melphalan(Meirow et al 1999)ed il cisplatino e/o farmaci analoghi; questi ultimi in particolare sono capaci di indurre specificamente diversi tipi di danni cromosomici (Wallace et al 1989; Blommaert & Saris. 1995).
In teoria gli agenti chemioterapici dovrebbero essere utilizzati con un alto grado di specificità verso le cellule tumorali allo scopo di evitare molti dei più comuni effetti tossici collaterali associati con la terapia convenzionale. Le cellule germinali, tuttavia, sono particolarmente sensibili agli stress genotossici e per questo motivo la perdita (deplezione) degli oociti, postuma alle terapie antitumorali, è, ancora oggi, uno dei grandi problemi rimasti irrisolti.
Alla luce di quanto descritto sopra risulta pertanto evidente l’esigenza di poter disporre di un trattamento terapeutico in grado di proteggere gli oociti dai danni provocati dalle terapie antitumorali.
È noto che certe vie di trasduzione del segnale, super-attivate in molti tipi di cellule tumorali, svolgono anche funzioni cruciali nelle cellule normali, in particolare durante lo sviluppo. Ad esempio, la tirosina chinasi non recettoriale c-Abl è una proteina molto importante nello sviluppo, tuttavia, quando è super-attivata nel citosol, come nel caso della variante BCR-Abl generata per traslocazione cromosomica, causa tumore. Nelle cellule normali, c-Abl è prevalentemente localizzata nel citoplasma e la sua attività catalitica è fortemente controllata. In seguito a stress genotossico, tuttavia, l’attività catalitica di c-Abl viene stimolata e, sebbene non si conoscano in dettaglio i meccanismi molecolari, si pensa che c-Abl dal citosol traslochi nel nucleo, dove è in grado di fosforilare varie proteine nuclearisubstrato. Nel nucleo pertanto, l’attività catalitica di c-Abl è cruciale per indurre l’apoptosi delle cellule danneggiate in modo irreparabile dal momento che essa modula l’attività delle proteine della famiglia di p53 che sono i responsabili finali del suicidio cellulare. Infatti, l’accumulo dei fattori di trascrizione della famiglia di p53, indotto da rotture del doppio filamento di DNA consente l’induzione di geni bersaglio pro-apoptotici. Tale meccanismo molecolare è stato descritto sia per p53 che per p73 in diversi modelli cellulari: in entrambi i casi, anche se con dettagli molecolari leggermente diversi, l’attivazione da parte della tirosina chinasi c-Abl è risultata indispensabile (Gong et al 1999; Tsai, & Yuan 2003).
p53 svolge un ruolo chiave nella protezione della stabilità genomica nelle cellule somatiche (Levine 1997), mentre gli altri due membri della famiglia, p73 e p63, sono fondamentali durante la sviluppo e la differenziazione (Melino et al 2003).
Nella linea germinale femminile l’induzione dell’apoptosi è modulata da p63, in particolare dall’isoforma TAp63. Infatti, nei topi transgenici che non esprimono l’isoforma TAp63, gli oociti nei follicoli primordiali sono resistenti alla deplezione indotta dallo stress genotossico. (Suh et al 2006; Liver et al 2008). p63 sembra quindi essere il garante della fedeltà del genoma nelle generazioni successive, anche se le basi molecolari che definiscono la sua funzione non sono ad oggi note.
Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che, negli oociti di topo, la risposta al danno al DNA indotti dalle terapie antitumorali coinvolge il pathway c-Abl/p63.
In particolare, gli autori della presente invenzione hanno trovato che, nelle linee cellulari modello, TAp63 viene fosforilato da cAbl su specifici residui di tirosina, principalmente la Y149, in seguito al trattamento con cisplatino. Questa modificazione induce una risposta apoptotica, mediata da p63, sia perché p63 stesso diventa più stabile, sia perché vengono trascritti alcuni geni pro-apoptotici bersaglio di p63.
Inoltre, è stato dimostrato che gli effetti di morte cellulare indotti mediante somministrazione di farmaci antitumorali in grado di provocare danni irreparabili nel DNA diminuiscono notevolmente quando il farmaco antitumorale è somministrato in associazione con un inibitore della tirosina chinasi c-Abl, come ad esempio Imatinib. Quest’ultimo dato supporta ulteriormente quanto trovato dagli autori della presente invenzione e cioè che le rotture al doppio filamento del DNA, indotte da farmaci, sono segnalate da c-Abl che, mediante la sua attività chinasica, modula l’output trascrizionale di p63 portando alla morte programmata la cellula danneggiata.
Pertanto, il trattamento con inibitori di c-Abl contestualmente alla convenzionale terapia antitumorale (chemioterapia e/o radioterapia) è in grado di evitare i gravosi effetti collaterali a danno delle gonadi per i quali, ad oggi, non esistono soluzioni terapeutiche.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l’uso degli inibitori della tirosin chinasi c-Abl per la preparazione di un medicamento per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali.
In particolare, la presente invenzione riguarda la protezione di detti oociti dagli effetti delle sostanze genotossiche che inducono apoptosi provocando danni al DNA come ad esempio la terapia antitumorale. Per terapia antitumorale si può intendere chemioterapia e/o radioterapia. Ad esempio, la chemioterapia può essere effettuata con almeno un chemioterapico scelto nel gruppo che consiste in cisplatino e suoi derivati come ad esempio carboplatino, oxaliplatino.
Inoltre, gli inibitori della tirosin chinasi c-Abl possono essere impiegati per il trattamento di patologie che riguardano ovaie anormali dal punto di vista fisiologico correlabili a forme specifiche di infertilità o anche a patologie ovariche quali menopausa prematura (Premature ovarian failure, POF).
Gli inibitori della tirosin chinasi c-Abl, quindi, possono essere usati per proteggere il pool degli oociti nei follicoli primordiali al fine di aumentare la longevità della fertilità femminile. Inoltre, la manipolazione delle dimensioni del pool dei follicoli primordiali può servire per regolare l’inizio e la durata della menopausa. Una donna affetta da menopausa prematura potrebbe prolungare la proprià fertilità e dilazionare l’inizio della menopausa. Bisogna sottolineare che gli inibitori della tirosin chinasi c-Abl possono bloccare i pathways di apoptosi fisiologica normalmente presenti e quindi causare un aumento dello sviluppo di follicoli primordiali. Donne poco fertili (subfertili) potrebbero acquisire un pool normale di follicoli primordiali ed aumentare la possibilità di concepire. In conclusione l’uso terapeutico degli inibitori di c-Abl può essere mirato a regolare la funzione delle ovaie ed il trattamento di eventuali patologie ovariche sopra menzionate.
Nella follicologenesi sono richiesti importanti passaggi che consentono all’oocita di raggiungere la competenza necessaria per essere in seguito fecondato.
Per competenza si intende l’abilità dell’oocita a riprendere e completare la meiosi ed inoltre a sostenere lo sviluppo embrionale pre-impianto dopo la fecondazione. La maggior parte dei follicoli primordiali esiste in uno stato quiescente con gli oociti arrestati nella profase I della meiosi. In animali sessualmente maturi, i follicoli lasciano il pool e vanno incontro alla transizione da follicoli primordiali a primari. L’inizio della transizione da primordiali a primari è stata vista essere stimolata quando il tessuto ovario è cresciuto in vitro (Wandji et al 1996; Hovatta et al 1999, Parrot and Skinner 1999, 2000; Nilsson et al 2001, 2002, Durlinger et al 2002; Kezele et al 2002, 2005; Nilsson and Skinner, 2002, 2003, 2004; Kezele and Skinner 2003). La crescita e sviluppo “in vitro” dei follicoli primordiali è stata recentemente proposta e sperimentata come una risorsa di oociti vitali per l’uso di tecnologie di riproduzione assistita (Hovatta, 2000; Picton and Golden 2000; Cortvrind and Smitz, 2001; Li et al 2001). L’identificazione di medicamenti che contribuiscono alla cura della salute degli oociti nei follicoli primordiali ha quindi un impatto potenziale sullo sviluppo di sistemi di crescita “in vitro” degli oociti nei follicoli primordiali per successive applicazioni cliniche quali fecondazione assistita.
Pertanto, costituisce ulteriore aspetto della presente invenzione l’uso di inibitori della tirosin chinasi c-Abl, quali ad esempio Imatinib, Dasatinib, Nilotinib, INNO-406 e loro sali, per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali nella menopausa, quale ad esempio la menopausa prematura, o in vitro ad esempio nelle metodiche di fecondazione assistita.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione topica comprendente o consistente in almeno un inibitore della tirosin chinasi c-Abl come principio attivo in associazione con uno o più eccipienti e/o veicolanti farmaceuticamente accettabili. Più precisamente, gli inibitori della tirosin chinasi c-Abl possono essere scelti nel gruppo che consiste in Imatinib, Dasatinib, nipotini, INNO-406 e loro sali.
La composizione topica secondo l’invenzione può essere nella forma scelta nel gruppo che consiste in ovuli, cerotti, bende, crema, gel, soluzione, sospensione, sistemi a rilascio graduale e controllato o sostenuto.
La presente invenzione concerne, inoltre, l’uso della composizione come definita sopra per la preparazione di un medicamento per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali. In particolare, per preservazione degli oociti nei follicoli primordiali si può intendere protezione di detti oociti dagli effetti tossici della terapia antitumorale come ad esempio, la chemioterapia e/o radioterapia. In particolare, la chemioterapia può essere effettuata con almeno un chemioterapico scelto nel gruppo che consiste in cisplatino e suoi derivati, quali ad esempio come ad esempio carboplatino, oxaliplatino.
Inoltre, la composizione secondo l’invenzione può essere impiegata per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali nella menopausa, ad esempio, nella menopausa prematura o in vitro, ad esempio nelle metodiche di fecondazione assistita.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.
Figura 1 mostra l’accumulo della proteina TAp63 negli oociti a seguito dell’aggiunta del composto chemioterapico Cisplatino (CDDP) al mezzo di coltura. a) Immunofluorescenza con anticorpi usata qui per mostrare che in seguito all’aggiunta del chemioterapico (CDDP 20 µM), il DNA risulta danneggiato dopo 24 ore di trattamento. Nella figura è rappresentato un singolo ovocita con gli istoni H2AX fosforilati.
b) Analisi TUNEL evidenzia morte cellulare in seguito al trattamento prolungato con CDDP.
c) Il numero dei foci contenenti gli istoni H2AX fosforilati sono stati contati nei diversi tempi di trattamento con CDDP come indicato. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard, un totale di 100 ovociti sono stati contati per ciascun gruppo.
d) Immunofluorescenza con un anticorpo monoclonale anti p63 (4A4) in rosso su sezioni di ovaie di cuccioli nati da 5 giorni (P5), prima o dopo il trattamento con 2 ore di 20µM CDDP, o 1µM bleomicina (un altro chemioterapico utilizzato come controllo).
e) Western blot di estratti di ovaie cresciute in terreno MEM per due ore in presenza di diverse concentrazioni di CDDP (0.5 - 20 µM) oppure 1µM bleomicina rivelato con anticorpi anti p63 ed anti istone H2AX fosforilato. Il segnale rivelato dall’anticorpo anti tubulina è utilizzato come controllo per il caricamento degli estratti proteici nelle varie corsie del gel.
Figura 2 mostra l’influenza sull’attività trascrizionale del fattore trascrizionale p63 da parte del CDDP. a) la linea stabile di cellule SAOS-TAp63α è stata cresciuta per 20 ore con doxociclina (molecola simile alla tetraciclina in grado di indurre l’espressione della proteina p63) e successivamente trattata per un’ora con diversi agenti chemioterapici, 2µM doxorubicina (DOXO), 10µM Etoposide (ETO) e 20 µM CDDP. Le cellule sono state successivamente lisate ed analizzate con tecniche di western blot utilizzando un anticorpo monoclonale diretto contro p63.
b) Analisi al citofluorimetro della linea stabile SAOS-TAp63α cresciuta per 20 ore in presenza od assenza di doxociclina e successivamente trattata per 4 ore con CDDP laddove indicato.
c) Sul lato destro, è stato quantificato il segnale del trascritto di mRNA del gene pro-apoptotico BAX, normalizzato sul segnale di mRNA della proteina ribosomale RPS19 presa come controllo.
d) Saggi di luciferasi per verificare che il promotore di BAX risponde all’espressione di TAp63α ed è più attivato solo in seguito all’aggiunta di CDDP e non di DOXO. I risultati sono la media di due esperimenti indipendenti, ciascuno realizzato in triplicato.
e) Western blot di lisati di campioni usati per i saggi di luciferasi descritti nel punto d) rivelati con un anticorpo contro p63. Il segnale dell’actina è usato come controllo per il caricamento degli estratti proteici in ciascuna corsia del gel.
f) Estratti di cellule SAOS-2 cotransfettate con un costrutto esprimente il gene della luciferasi sotto il controllo del promotore p21 ed un vettore di espressione per p63 misurato 24 ore dopo il trattamento con 0 e 20 µM CDDP. I risultati sono una media di tre esperimenti indipendenti, ciascuna misura fatta in triplicato.
Figura 3 mostra l’attivazione di c-Abl da parte del CDDP, la sua traslocazione nel nucleo e successiva interazione con TAp63.
a) Immunoprecipitazione di estratti di cellule SAOS-2 trattate per 24 ore con le concentrazioni indicate di CDDP. Gli estratti sono stati immunoprecipitati con anticorpi policlonali (K-12) anti-Abl ed analizzati per western blot con anticorpi monoclonali contro c-Abl (Ab-3). Quattro esperimenti indipendenti sono stati eseguiti, quantificati e rappresentati (pannello di destra).
b) le cellule SAOS trattate con 5 µM CDDP per 6 ore (oppure non trattate) sono state colorate con anticorpi anti Abl, e falloidina (FITC) e Hoechst. Colorazione con Falloidina e con Hoechst rispettivamente sono stati usati per visualizzare il comparto citoplasmatico e nucleare rispettivamente. Scale bar è di 20µM.
c) Le cellule SAOS-2 sono state trasfettate con TAp63α e dopo 6 ore dalla trasfezione le cellule sono state divise e piastrate in diverse piastre petri e dopo 18 ore dalla trasfezione le cellule vengono trattate per 6 ore con CDDP alle concentrazioni indicate. Le cellule trasfettate sono poi contestualmente analizzate per immunofluorescenza con anticorpi fluorescenti anti p63 (colore verde) e con anticorpi anti Abl (rosso). Scale bar è 20µM. Gli estratti totali sono stati poi analizzati con anticorpi anti p63 e anti β-tubulina. Un’aliquota equivalente a 1 mg di estratti totali è stata immunoprecipitata con anticorpi anti Abl (K-12) e analizzati per western blot con un anticorpo anti p63 e con un anticorpo anti c-Abl (pannello inferiore).
d) Estratti citosolici e nucleari di cellule SAOS sono state trattate con le concentrazioni indicate di CDDP per 24 ore e sono analizzate per western blot usando anticorpi anti Abl (K-12); Lamina e GAPDH sono invece usati come marcatori dei compartimenti nucleari e citosolici rispettivamente.
Figura 4 mostra la fosforilazione di TAp63 e la conseguente stabilizzazione da parte di mutanti di c-Abl costitutivamente attivati.
a) Le cellule 293 phoenix sono state trasfettate con un vettore di espressione fuso al tag HA-TAp63α e con quantità crescenti di plasmidi che esprimono un mutante di Abl attivato fuso al tag FLAG. Gli estratti cellulari sono stati analizzati con gli anticorpi indicati. Il segnale della neomicina fosfotrasferaseII (α-neo) è stato incluso per monitorare l’efficienza di trasfezione del vettore TAp63α mentre il segnale rivelato dall’anticorpo contro la tubulina è stato incluso per mostrare che il caricamento è simile in tutte le corsie del gel.
b) Le cellule 293 phoenix sono state trasfettate come mostrato in a). Dopo 20 ore, estratti totali crudi sono stati analizzati per western blot, o prima immunoprecipitati con gli anticorpi indicati e poi analizzati per western blot con anticorpi anti p63. Le sequenze aminoacidiche mostrano il confronto tra la sequenza di p73 e di p63.
c) L’attività luciferasica di estratti di cellule SAOS-2 cotransfettate in modo transiente con plasmidi di TAp63α e con plasmidi costituiti dal promotore di Bax fuso al gene reporter della luciferasi.
d) Le cellule SAOS-2 sono state silenziate per l’espressione di c-Abl. Dopo 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con CDDP come indicato per 24 ore. Gli istogrammi rappresentano la media di risultati di tre esperimenti indipendenti.
Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard.
e) Analisi al citofluorimetro delle cellule SAOS-TAp63α, indotte con doxiciclina (tet) per 20 ore, 24 ore dopo il trattamento con 20µM CDDP con o senza Imatinib. Le percentuali di cellule apoptotiche, determinate con analisi al citofluorimetro dopo colorazione con propidio di ioduro sono espresse come una percentuale di eventi “sub-G1 hypo-diploid”. I risultati mostrati sono la media di esperimenti in duplicato eseguiti indipendentemente.
f) Le cellule 293 Phoenix sono state trasfettate con il vettore di espressione HA-TAp63α insieme con i plasmidi che esprimono c-Abl selvatico o mutanti costitutivamente attivati, Dopo 24 ore le cellule sono state lisate e gli estratti totali sono stati immunoprecipitati con anticorpi specifici per c-Abl o p63 e analizzati per western blot con un anticorpo specifico contro la fosfotirosina (4G10). L’immunoprecipitazione delle proteine bersaglio è stata confermata ri-incubando il filtro con gli anticorpi indicati (pannelli inferiori).
g) Le cellule 293 Phoenix sono state trasfettate con vettori HA-TAp63α o con vettori mutati nei quali sono state sostituite le tirosine-bersaglio della chinasi c-Abl (Y149F) (Y149/Y171) (Y149/Y171/Y289F). Gli estratti totali sono stati direttamente analizzati per western blot con anticorpi anti p63. Il segnale della neomicina fosfotrasferasi II è stata usata per monitorare l’efficienza di trasfezione del vettore TAp63beta mentre il segnale della tubulina è inclusa per mostrare che il carimento delle proteine totali è uguale in tutte le corsie del gel.
h) Le cellule SAOS sono state trasfettate stabilmente con plasmidi che esprimono RNA antisenso (siRNA) (pSMS2-puro+) specifici per c-Abl (Ab9), o un RNA antisenso di controllo (S4) con un sequenza casuale. Le cellule trasfettate sono state coltivate per 2 settimane e trattate con 20µM CDDP per 6 ore. In seguito le cellule sono state colorate con Hoechst ed i nuclei condensati sono stati contati (pannello di destra).
Figura 5 mostra la riduzione dell’accumulo di TAp63α indotto dal chemioterapico e della morte degli oociti a seguito del trattamento con Imatinib.
a) Gli estratti provenienti dalle ovaie sono stati separati mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE, transferiti e rivelati con anticorpi anti p63 e con anticorpi anti Abl (K-12). Il segnale della lamina è usato come controllo di caricamento degli estratti proteici. Le bande sono state quantificate (pannello di destra).
b) Colorazione Tunel (rossa) di sezioni di ovaie coltivate prelevate da topoline nate da 5 giorni. Scale bar è 25µM
Figura 6 mostra la riduzione della deplezione degli oociti appartenenti ai follicoli primordiali indotta dal chemioterapico CDDP.
a) Analisi istologica di sezioni di ovaie di topolini di 9 giorni, prese tre giorni dopo l’iniezione di: soluzione salina (PBS), Imatinib (7.35mg/Kg), CDDP (5mg/Kg) insieme con Imatinib (7.35mg/Kg) e CDDP (5mg/Kg) da solo.
b) Immunoistochimica con anticorpi diretti contro p63 su sezioni di ovaie di topolini di 9 giorni prese dopo 3 giorni dalla iniezione. Il colore blu è per l’ematossilina.
c) Immunofluorescenza con anticorpi anti Msy-2 su ovaie di 9 giorni dopo 3 giorni dall’ iniezione di buffer salino (PBS), Imatinib (7.35mg/Kg), CDDP (5mg/Kg) insieme con Imatinib (7.35mg/Kg) e CDDP (5mg/Kg) da solo.
d) Istogramma di conte di ovociti nei follicoli primordiali/primari e secondari derivata dall’ analisi istologica, di conte di ovociti positivi alla colorazione di anticorpi anti Msy-2 e p63 presenti su sezioni mediane di ovaie sorelle tre giorni dopo l’iniezione. I risultati mostrati sono le medie di tre esperimenti indipendenti, 50 sezioni mediane di ovaie sono state contate per ciascun gruppo. Le barre di errore indicano la deviazione standard. I tre asterischi indicano che i valori medi degli esperimenti per il gruppo di ovaie trattate con CDDP+Imatinib e con CDDP sono statisticamente significativi e differiscono più di quello che è atteso in un evento casuale (P<<0.001 t-test di student). Scale bar è 25µM.
e) Diverse quantità di CDDP (0; 5mg/Kg=20; 10mg/Kg=40; 20mg/Kg=80) sono state iniettate in 4 diversi gruppi di topoline neonate (gruppi di 10). Una settimana dopo il trattamento con la droga le topoline sono stati pesate ed il loro peso medio è stato rappresentato in funzione della dose di CDDP.
f) Immunofluorescenza con anticorpi anti Msy-2 su ovaie di topoline di nove giorni, tre giorni dopo il trattamento con differenti quantità di CDDP.
g) Analisi istologica di ovaie di topoline di 9 giorni dopo tre giorni dal trattamento con CDDP (5mg/Kg). Il trattamento con il chemioterapico induce una morte consistente degli ovociti dei follicoli primordiali e primari, tuttavia il numero degli ovociti appartenenti ai follicoli secondari non sono affatto colpiti dal trattamento se si confronta il loro numero con quello delle topoline iniettate solo con soluzione salina. Le frecce rappresentano gli ovociti dei follicoli primordiali in sezioni di ovaie di topoline di nove giorni. Scale bar è 25µM.
Esempio 1: Studio dell’influenza di un composto chemioterapico sul pathway cAbl-p63
Materiali e Metodi
Coltura di ovaie isolate
Le ovaie sono state raccolte dal ceppo murino CD-1 (proveniente da Charles River, Italia) 5 giorni dopo la nascita, e mantenute in terreno MEM contenente BSA (albumina di siero bovino), antibiotici (75mg/L penicillina-G, 50mg/L di streptomicina sulphate) e 0.25 mM piruvato e N-acetyl L-cisteina (prodotti dalla Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Laddove indicato, il Cisplatino (CDDP), la Bleomicina e/o l’Imatinib sono aggiunti al terreno di coltura. Le ovaie sono state coltivate in terreno MEM, in costante agitazione a 37° e al 5% di CO2. Negli intervalli di tempo indicati il terreno è stato rimosso e le ovaie congelate in azoto liquido oppure fissate in paraformaldeide. Tutti gli esperimenti con gli animali qui descritti sono stati condotti in accordo alle direttive previste per il trattamento e cura di animali da sperimentazione.
Immunofluorescenza ed Immunoistochimica
Le ovaie isolate sono state processate e analizzate come descritto nelle informazioni supplementari. Lo studio istologico ed immunoistochimico delle ovaie è stato condotto tre giorni dopo le iniezioni. Istogrammi delle conte dei follicoli primordiali/primari e di quelli secondari di animali trattati con PBS,Imatinib, CDDP e CDDP più Imatinib sono stati ottenuti osservando sezioni mediane di ovaie. I valori P sono stati determinati con lo student’s t-test.
Trasfezione delle linee cellulari
Cellule 293 Phoenix TM sono state coltivate in terreno DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino ed antibiotici. SAOS-2 e le SAOS-TAp63α sono state cresciute in terreno RMPI contenente 10% di siero fetale bovino e antibiotici. L’espressione della proteina TAp63� è stata ottenuta aggiungendo doxycicina un analogo della tetraciclina (prodotta dalla SIGMA) al terreno di coltura.
Il cisplatino, l’etoposide e la doxorubicina sono stati sciolti nel dimetil sulfoxide e aggiunti al terreno di crescita alla concentrazione finale desiderata. Per gli esperimenti di silenziamento genico mediante la tecnica dell’ RNA interference le cellule sono state trasfettate utilizzando Lipofectamina (prodotta dall’Invitrogene) con un vettore pSM2-puro della Openbiosystem. Le cellule SAOS coltivate in presenza di puromicina per due settimane sono state trattate con cisplatino (CDDP) per 6 ore, in seguito fissate per essere osservate al microscopio ed inoltre lisate per l’analisi biochimica.
Immunoblotting ed immunoprecipitazione
Le cellule sono state lisate in presenza di inibitori di proteasi (i dettagli si riferiscono ai prodotti utilizzati nell’esperimento, tutti proveniente dalla SIGMA. Le ovaie sono state congelate in azoto liquido e omogeneizzate con un piccolo pestello direttamente nel tampone di lisi freddo. La concentrazione delle proteine è stata determinata con il metodo di Bradford. L’equivalente di 1/3 di ovaia è stato caricato in ciascuna corsia del gel di proteina per l’elettroforesi. I campioni sono stati bolliti per 5 minuti e caricati su un SDS-Page gel di 8% oppure 12% di acrilamide e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa (prodotta dalla Amersham Bioscience).
Gli esperimenti di immunoprecipitazione sono stati condotti incubando gli estratti proteici a 4 gradi in agitazione con anticorpi policlonali contro p63 (prodotti dalla Santa Cruz), contro Y99 della Cell Signalling, contro fosfotirosina della Upstate ed infine contro Abl (Santa Cruz). I complessi anticorpoantigene sono poi successivamente isolati utilizzando la proteinaA legata alle biglie di agarosio prodotta dalla Sigma-Aldrich e successivamente analizzati con tecniche di western blotting utilizzando anticorpi secondari coniugati.
Northern blotting
Le cellule SAOS-TAp63α sono state coltivate per 20 ore in presenza o meno di doxociclina. Dopo il trattamento con 5 o 20 µM di Cisplatino per 4 ore, l’RNA totale è stato estratto dalle cellule con etanolo e con il metodo della proteinasi K. L’equivalente quantità di RNA totale è stato separato su gel contenente formaldeide ed agarosio eppoi transferito su membrane di cellulosa (prodotte dalla Perkin Elmer Life Sciences). L’ibridazione è stata fatta sia con sonde specifiche per la proteina pro-apoptotica BAX che per la proteina ribosomale RPS19. Le sonde di RNA sono state preparate con la tecnica del « random primer » utilizzando un prodotto di digestione purificato come stampo. La quantificazione dei filtri di northern è stata ottenuta utilizzando il PhosphoImager e un software chiamato Image quant prodotto dalla Amersham Biosciences.
Analisi delle cellule al FACS (citofluorimetro) Le cellule sono state staccate con tripsina e analizzate dopo colorazione con propidio di ioduro. Per ciascun campione sono state analizzate un totale di 10000 di cellule.
Mutagenesi e misura dell’attività trascrizionale del gene reporter luciferasi
La mutagenesi sitodiretta dei residui di tirosina Y149, Y171, Y289 è stato ottenuta utilizzando un kit della Stratagene (Quickchange kit) seguendo le istruzioni suggerite dal manuale. L’attività trascrizionale del gene reporter della luciferasi è stata misurata utilizzando il kit “dual system” della Promega. Le cellule 24 ore dopo la trasfezione sono state trattate con cisplatino e doxorubicina per altre 24 ore ed infine analizzate.
Materiali Supplementari
Iniezione degli animali.
Topoline di 6 giorni sono state iniettate intraperitonealmente con CDDP con una siringa sterile (Becton Dickson). Il CDDP è stato dissolto in soluzione salina (PBS) ad una concentrazione finale di 1mg/ml. Imatinib, sale di metanosulfonato (LC laboratories) è stato dissolto in acqua.
Immunofluorescenza
Nei tempi indicati, il terreno è stato rimosso e le ovaie fissate con 4% paraformaldeide per 2 ore a 4 gradi, incluse in paraffina e tagliate in sezioni di spessore 5 µM. Le sezioni di tessuto sono stati deparaffinate e poi reidratate per 5 minuti in 0.01M sodium citrato nel forno a micronde per migliorare la reazione con l’anticorpo. Per la colorazione dei foci γH2AX, le sezioni sono state incubate in PBS-T (0.15%BSA, 0.1%Tween20 in PBS) per 1 ora prima dell’incubazione per tutta la notte a 4 gradi con l’anticorpo anti γH2AX della (Upstate) in PBS-T, Per la colorazione MSy-2, le sezioni sono state permeabilizzate per 30 minuti con PBS-0.1% Triton X, e bloccate in PBS-5%BSA ed incubate per tutta la notte a 4 gradi con l’anticorpo policlonale anti Msy-2 (un regalo di R. Schultz, della Università della Pensilvania). Le sezioni rivelate con anti p63 sono state bloccate con PBS-1% BSA per 1 ora ed incubate per un’ora con un anticorpo primario anti p63 (4°4, Santa Cruz). Dopo 3 lavaggi con PBS per 5 minuti sono stati aggiunti gli anticorpi secondari nella diluizone di 1:500 della Alexa 568 (Molecular Probes, Milan Italy) per un’ora a temperatura ambiente. Le sezioni sono state poi incubate con Hoechst, montate e analizzate con un microscopio ad immunofluorescenza convenzionale usando un microscopio Axioplan2 Zeiss.
Immunoistochimica
Le ovaie collezionate sono state fissate in Bouin e in MetaCarnoy Fluids, incluse in paraffina e tagliate in fette spesse 5-7µM. Le sezioni deparaffinate sono state reidradate nel forno a micronde per 1 minuto per facilitare la reazione con l’anticorpo. Le sezioni sono state lavate in PBS/Triton 0.1% poi bloccate in 10% di siero di capra (SIGMA) in PBS/Triton 0.1% per un’ora eppoi incubate con 4A4 (anticorpo anti p63 Santa Cruz per 2 ore). Anticorpi secondari coniugati alla perossidasi (Biorad) sono stati usati 1:200 nel siero al 10% di capra diluito in PBS-T per un’ora. I segnali sono stati sviluppati con il Kit AEC (SIGMA) come substrato. Le sezioni sono state controcolorate brevemente in ematossilina, deidradate e montate con il montante Eukit.
Analisi morfologica dei nuclei
Cellule trattate e non trattate sono state colorate con 10mg/ml Hoechst 33258 per 5 minuti. Il contrasto di fase e la microscopia a fluorescenza sono stati usati per esaminare la morfologia cellulare e nucleare, Le cellule che mostrano una condensazione nucleare e frammentazione sono stati contate. Quattro campi di approssimativamente 200 celllule per campo sono state considerati per ciascun gruppo per quantificare le cellule apoptotiche,
Tunel Assays
Le sezioni di ovaie, dopo essere state permeabilizzate con PBS-0.1% Triton-X, sono state incubate con la reazione di Tunel della “in situ cell death detection kit, Fluorescein” (Roche Diagnostic) per 1 ora a 37 gradi in una camera umida, in seguito dopo 3 lavaggi da 5 minuti in PBS e colorate con Hoechst. Le sezioni sono state montate e analizzate con un filtro per la fluorescenza.
RISULTATI
Accumulo della proteina TAp63α negli ovociti a seguito dell’aggiunta del composto chemioterapico Cisplatino (CDDP) nel mezzo di coltura
Gli autori dell’invenzione hanno ottimizzato un saggio biologico per indagare se le ovaie, contenenti la maggior parte dei follicoli primordiali, quando sottoposte al trattamento con agenti chemioterapici, evidenziano accumulo/attivazione di p63 ed eventualmente la morte degli oociti.
Ovaie di cuccioli nati da 5 giorni (P5) sono state coltivate in vitro e trattate con gli induttori di danni al DNA CDDP o bleomicina per 2h. L’estensione del danno indotto al DNA dalle droghe è stato monitorato ibridando gli estratti ovarici con un anticorpo contro l’istone H2AX fosforilato, un marker di rotture del DNA doppio filamento. Le rotture del DNA doppio filamento sono state anche evidenziate in oociti con IF usando lo stesso anticorpo e contando il numero delle positività 0,8 e 24h dopo l’esposizione al CDDP (Fig.1a,c). IHC con l’anticorpo p63 su sezioni di ovaie dopo 2h di trattamento non ha evidenziato differenze di segnale nucleare tra oociti di controllo e quelle sottoposti al trattamento con il farmaco (Fig.1d). Tuttavia quando i lisati ovarici sono stati analizzati per western blot è stato osservato un accumulo transiente, dipendente dalla dose di CDDP, di TAp63 (Fig.1e). In fine un trattamento prolungato degli oociti con CDDP induce morte cellulare come conferma l’analisi di TUNEL (Fig.1b).
Influenza diretta dell’attività trascrizionale del fattore di trascrizione P63 da parte del CDDP
Allo scopo di capire i meccanismi molecolari che inducono l’accumulo di TAp63 ed eventualmente alla morte cellulare, gli inventori della presente invenzione hanno utilizzato la linea cellulare di osteosarcoma SAOS (che non esprime p53) stabilmente trasfettate con un costrutto in grado di esprimere l’isoforma TAp63α in maniera inducibile mediante trattamento con tetraciclina o doxiciclina. Dopo il trattamento con TET, queste cellule sono state trattate con 3 farmaci in grado di danneggiare il DNA: CDDP (20µM), doxorubicina (DOXO-2µM) o etoposide (ETO-10µM).
Dopo trattamento con DOXO ed ETO, una parte di TAp63 (10-30%) mostra una riduzione della mobilità elettroforetica mentre, in presenza di CDDP, si osserva un aumento transiente di 3 volte dei livelli di espressione di TAp63 (Fig.2a). Inoltre gli autori della presente invenzione dimostrano che:
1) dopo avere indotto l’espressione di p63 mediante trattamento con CDDP, l’analisi citometrica evidenzia un aumento dell’apoptosi (Fig.2b);
2) l’apoptosi è associata ad un marcato incremento dei livelli di Bax (Fig.2c);
3) dopo il trattamento con CDDP, l’attività dipendente da TAp63, misurata su un promotore Bax luciferasireporter, aumenta significativamente (Fig.2d,f).
Come controllo negativo è stato utilizzato il promotore di p21, inoltre non è stata rivelata una consistente up-regolazione del promotore di Bax dopo trattamento con DOXO e ETO (Fig.2d e dati non mostrati). Un trattamento prolungato con DOXO provoca un incremento della banda a migrazione ritardata di TAp63, allo stesso tempo, il prolungato trattamento con CDDP, provoca una riduzione dei livelli di p63 (Fig.2e). Questa riduzione dopo l’iniziale incremento (Fig.2a) è consistente con un modello di attivazione trascrizionale accoppiata alla degradazione di p63.
CDDP rende c-Abl competente ad interagire con TAp63 nel nucleo
Alla luce dei risultati precedenti è chiaro che il danno al DNA causato dal trattamento con CDDP attiva la tirosina chinasi c-Abl. Allo scopo di monitorare i livelli di c-Abl durante il trattamento con CDDP, le cellule trasfettate con TAp63 sono state coltivate per 24h in terreno arricchito con CDDP a varie concentrazioni poi sono state raccolte ed i lisati sono stati immunoprecipitati con anticorpi anti c-Abl. I livelli di c-Abl sono risultati aumentati di 1,8 volte dopo l’esposizione a CDDP 5µM (Fig.3a). Un risultato molto interessante concerne la traslocazione di c-abl dal citoplasma al nucleo di c-Abl nelle condizioni sperimentali appena descritte (Fig.3b,c,d). Questa traslocazione rende c-Abl competente ad interagire fisicamente con TAp63 che è costitutivamente presente nel nucleo. Inoltre, in accordo con questo risultato, solo quando le cellule SAOS2 trasfettate con TAp63 sono trattate con CDDP, le due proteine colocalizzano e coprecipitano (Fig.3b,c).
TAp63α è fosforilato e stabilizzato da mutanti di c-Abl costitutivamente attivati
Per capire se l’attività chinasica di c-abl è responsabile per l’accumulo di p63 dopo trattamento con CDDP sono state cotrasfetttate transientemente 293 con TAp63 e quantità crescenti della forma costitutivamente attiva di c-Abl. L’overespressione della forma attiva di c-Abl aumenta i livelli di p63 in maniera dipendente dall’attività chinasica (Fig.4a). Inoltre con un immunoblot con antifosfotirosina su lisati cellulari immunoprecipitati con anti-p63 mè stato dimostrato che TAp63 è fosforilato solo quando coespresso con la forma attiva mutante di c-Abl (Fig.4f). Inoltre è stato dimostrato che c-Abl fosforila p63 principalmente sul residuo Y149 ed in misura minore su Y171 e Y289 (Fig.4a,g).
Allo scopo di capire se la fosforilazione di p63 mediata da c-Abl e la stabilità di p63 sono importanti per l’attivazione dei geni apoptotici gli autori hanno valutato l’effetto del silenziamento di c-Abl sull’attivazione p63-mediata del promotore di Bax dopo trattamento con CDDP. Nelle SAOS2, trasfettate con un plasmide che esprime TAp63 mutato nella tirosina target di c-Abl (Y149F) o specificamente downregolato con un RNAi di c-Abl, è stata evidenziata una riduzione significativa dell’attivazione di Bax mediata da p63 (Fig.4c,d). Infine, nelle SAOS-TAp63, trattate con CDDP in presenza dell’inibitore specifico di c-Abl Imatinib, gli autori dell’invenzione hanno riscontrato una riduzione significativa dell’apoptosi mediata da p63 (Fig.4e). In aggiunta è stato riscontrato che le cellule in cui è stato downregolato c-Abl sono resistenti all’apoptosi indotta da CDDP (Fig.4h) Riduzione dell’accumulo di TAp63α indotto dal chemioterapico e della morte degli ovociti a seguito di trattamento con Imatinib
Allo scopo di verificare anche se negli oociti l’accumulo di TAp63 indotto dal trattamento con CDDP è dipendente da c-Abl le ovaie di cuccioli nati da 5 giorni sono state coltivate in vitro fino a 24h in presenza di 20µM CDDP da solo oppure insieme all’Imatinib per gli intervalli di tempo indicati. I livelli di c-Abl nelle ovaie trattate con CDDP aumentano di 1,5 volte rispetto al controllo non trattato; tale incremento è completamente annullato dal concomitante trattamento di CDDP e Imatinib.
L’accumulo di c-Abl e p63 successivo al trattamento con CDDP, è causa di morte cellulare in linee cellulari come precedentemente descritto. Anche gli oociti, quando sono esposti al CDDP vanno incontro alla morte programmata, come dimostrato mediante analisi TUNEL. Sorprendentemente il trattamento contemporaneo di CDDP ed Imatinib è in grado di preservare la vitalità degli oociti riducendo drasticamente il numero di cellule che, in seguito a trattamento con agenti chemioterapici come CDDP, risultano positive al Tunel.
Riduzione della deplezione degli ovociti appartenenti ai follicoli primordiali indotta dalla chemioterapico CDDP a seguito di trattamento con Imatinib
Allo scopo di verificare se inibitori della tirosin chinasi c-Abl, come l’Imatinib, possono proteggere in vivo gli oociti primordiali, cuccioli di 6 giorni sono stati trattati con CDDP e/o Imatinib mediante una iniezione intraperitoneale (Fig.6f,g). A tre giorni dall’iniezione gli animali sono stati sacrificati, le ovaie sono state prelevate e sono stati contati i follicoli primordiali, primari e secondari. Il trattamento simultaneo di CDDP ed Imatinib riduce significativamente la perdita dei follicoli primordiali e primari che si osserva consistente dopo il trattamento con solo CDDP (Fig.6a,b,c,d).
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1) Uso degli inibitori della tirosin chinasi c-Abl per la preparazione di un medicamento per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali.
- 2) Uso secondo la rivendicazione 1, in cui per preservazione degli oociti nei follicoli primordiali si intende protezione di detti oociti dagli effetti tossici della terapia antitumorale.
- 3) Uso secondo la rivendicazione 1, per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali nella menopausa.
- 4) Uso secondo la rivendicazione 3, in cui la menopausa è la menopausa prematura.
- 5) Uso secondo la rivendicazione 1, per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali in vitro.
- 6) Uso secondo la rivendicazione 1, in cui gli inibitori della tirosin chinasi c-Abl sono scelti nel gruppo che consiste in Imatinib, Dasatinib, Nilotinib, INNO-406 e loro sali.
- 7) Composizione topica comprendente o consistente in almeno un inibitore della tirosin chinasi c-Abl come principio attivo in associazione con uno o più eccipienti e/o veicolanti farmaceuticamente accettabili.
- 8) Composizione secondo la rivendicazione 7, in cui gli inibitori della tirosin chinasi c-Abl sono scelti nel gruppo che consiste in Imatinib, Dasatinib, Nilotinib, INNO-406 e loro sali.
- 9) Uso della composizione come definita in ognuna delle rivendicazioni 7-8 per la preparazione di un medicamento per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali.
- 10) Uso secondo la rivendicazione 9, in cui per preservazione degli oociti nei follicoli primordiali si intende protezione di detti oociti dagli effetti tossici della terapia antitumorale.
- 11) Uso secondo la rivendicazione 9 per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali nella menopausa.
- 12) Uso secondo la rivendicazione 11, in cui la menopausa è la menopausa prematura.
- 13) Uso secondo la rivendicazione 9 per la preservazione degli oociti nei follicoli primordiali in vitro.
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| WO2005007687A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-01-27 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc | Compositions and methods for modulating ovarian follicular initiation |
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| WO2008152609A1 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-18 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Interferon alpha sequential regimen for treating cancers |
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2008
- 2008-12-19 IT IT000684A patent/ITRM20080684A1/it unknown
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