IT202100019334A1 - Metodo per l’identificazione dell’intera sequenza della regione variabile delle catene pesanti e leggere di immunoglobuline - Google Patents
Metodo per l’identificazione dell’intera sequenza della regione variabile delle catene pesanti e leggere di immunoglobuline Download PDFInfo
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Description
?METODO PER L?IDENTIFICAZIONE DELL?INTERA SEQUENZA DELLA REGIONE VARIABILE DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DI IMMUNOGLOBULINE?
La presente invenzione concerne un metodo per l?identificazione dell?intera sequenza nucleotidica della regione variabile delle catene pesanti e/o leggere delle immunoglobuline in un campione biologico e la quantificazione della loro frequenza relativa. L?invenzione trova particolare impiego per l?identificazione di catene pesanti e leggere monoclonali, ovvero tumorali, in campioni biologici provenienti da pazienti affetti da una gammapatia monoclonale.
Le gammapatie monoclonali, tra cui il mieloma multiplo, la macroglobulinemia di Waldenstr?m, le gammapatie monoclonali di significato clinico (MGCS) e lo stadio presintomatico denominato gammapatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS), si verificano quando un linfocita B o una plasmacellula, che produce un anticorpo specifico, subisce un processo di trasformazione tumorale, che porta alla produzione di una popolazione di cellule identiche (cio? il clone linfocitario o plasmacellulare), che producono tutte lo stesso anticorpo (cio? l?anticorpo monoclonale o componente monoclonale). Ogni paziente ha una componente monoclonale unica, la cui sequenza pu? essere utilizzata come un'impronta digitale tumorale per tracciare la presenza del clone linfocitario o plasmacellulare.
Nella MGCS, il clone linfocitario o plasmacellulare sottostante ? solitamente piccolo e scarsamente proliferante, tuttavia i pazienti sviluppano un danno d'organo potenzialmente fatale che ? dettato dalla specifica sequenza della catena immunoglobulinica leggera/pesante del paziente in questione.
Il prototipo di MGCS ? l'amiloidosi sistemica da catene leggere immunoglobuliniche (amiloidosi AL), in cui un piccolo clone plasmacellulare (o talora linfocitario) secerne una catena leggera immunoglobulinica instabile, che va incontro ad un processo patologico di mal ripiegamento tridimensionale (il cosiddetto processo di misfolding), formando depositi sistemici extracellulari di fibrille di amiloide, esercitando citotossicit?, sovvertendo l'architettura dei tessuti e causando infine disfunzione (multi)-organo potenzialmente fatale.
Pertanto, il sequenziamento della componente monoclonale da un numero elevato di pazienti potrebbe consentire di approfondire le conoscenze, attualmente limitate, dei meccanismi molecolari alla base di queste malattie.
Inoltre, la conoscenza della sequenza della componente monoclonale nei singoli pazienti potrebbe migliorare gli approcci di medicina personalizzata, come la ricerca, con metodiche ad elevata sensibilit?, di cellule tumorali residue dopo la terapia nell?ambito delle valutazioni diagnostiche collettivamente indicate come lo studio della malattia minima residua (o malattia misurabile residua).
La specifica sequenza nucleotidica che codifica per una data catena pesante o leggera immunoglobulinica ? il risultato di un processo combinatorio ? detto ricombinazione V(D)J ? e mutazionale ? detto ipermutazione somatica ? che interessa frammenti di geni specifici durante lo sviluppo dei linfociti B e delle plasmacellule da essi derivanti.
Il sequenziamento delle catene pesanti e leggere delle immunoglobuline ? tecnicamente ostacolato dalla mancata conoscenza a priori di quali frammenti genici siano stati impiegati e dal fatto che i campioni biologici rilevanti (ad esempio, sangue midollare o sangue periferico) contengono tipicamente un numero elevato di linfociti B/plasmacellule che producono immunoglobuline diverse, con diverse sequenze.
In letteratura sono stati descritti metodi per il sequenziamento della regione variabile delle catene leggere o pesanti immunoglobuliniche in cellule derivate da sangue midollare, finalizzati ad individuare la sequenza clonale in pazienti con un clone linfocitario o plasmacellulare. In particolare, un metodo impiega una PCR inversa eseguita in singolo step, con DNA polimerasi senza attivit? di correzione di bozza, seguita da clonaggio, trasformazione batterica, e sequenziamento Sanger di singole colonie batteriche [1]. Nella fase di PCR inversa in singolo step il metodo sfrutta il fatto che la Taq polimerasi impiegata non sia dotata di attivit? di correzione di bozza e che l?enzima incorpori una A aggiuntiva in 3? alla fine della reazione di sintesi del DNA. Infatti, l?amplicone ottenuto, con la A aggiuntiva alle estremit? in 3? dei due filamenti, viene successivamente sottoposto a clonaggio secondo il sistema TOPO TA (che consente la ligazione delle A aggiuntive alle estremit? in 3? dell?amplicone con le T aggiuntive in 5? del costrutto per il clonaggio). L?impiego di una DNA polimerasi senza attivit? di correzione di bozza, necessario per consentire il successivo clonaggio con il sistema TOPO TA, ? tuttavia associato ad un rischio maggiore di incorporazione di un nucleotide sbagliato nel corso della PCR rispetto ai casi in cui si impieghi una DNA polimerasi con attivit? di correzione di bozza, quindi maggiormente accurata. In questo contesto, si noti come, in un esperimento in cui un plasmide contenente la porzione variabile di una catena immunoglobulinica a sequenza nota ? stato sequenziato impiegando questa metodica, ? stata rilevata una misincorporazione nucleotidica (C?T) in una colonia sulle sei colonie analizzate, per un totale di 2180 paia di basi analizzate (corrispondente ad un rate di errore di 4,6x10<-4 >paia di basi analizzate e pari al 16,6% dei cloni analizzati) [1]. L?amplicone ottenuto dopo la PCR inversa, caratterizzato dalla presenza delle A aggiuntive alle due estremit? 3? dei filamenti del DNA duplex, viene ligato all?interno di un plasmide pCR, contenente T aggiuntive alle due estremit? 5?. Il prodotto di ligazione viene quindi impiegato per trasformare un ceppo di E. coli competente. Dopo la trasformazione, i batteri vengono piastrati in condizioni selettive, colonie batteriche resistenti vengono selezionate, fatte crescere e successivamente lisate per ricavarne DNA plasmidico. Il DNA plasmidico cos? ottenuto viene digerito con EcoRI e i prodotti di digestione vengono esaminati mediante elettroforesi su gel di agarosio. I plasmidi che danno luogo ad un pattern di digestione compatibile con l?avvenuta incorporazione dell?amplicone della PCR inversa vengono quindi analizzati mediante sequenziamento Sanger, impiegando un oligonucleotide NotI antisenso come primer forward e il primer CLA (per la catena leggera ?) o CH1 (per la catena pesante ?) come primer reverse. Il cromatogramma ottenuto con il primer forward e il primer reverse per ciascun campione vengono confrontati per ottenere la sequenza consenso.
Le sequenze ottenute con metodica Sanger sono analizzate mediante EMBL-GeneBank, VBASE e IMGT [1-3]. Il confronto delle sequenze ottenute da diverse colonie batteriche trasformate con l?amplicone ottenuto da un dato paziente consente di identificare una ?sequenza identica predominante?, che viene considerata come la sequenza della componente monoclonale [1]. Non esistono indicazioni precise circa il numero minimo di sequenze da analizzare, n? definizioni circa la predominanza in questo contesto. In studi in cui ? stata impiegata questa metodica, sono state analizzate in media 5 sequenze per paziente (intervallo: 3-12 sequenze totali ottenute) e la sequenza predominante ? risultata dalla corrispondenza di 4 sequenze in media per paziente (intervallo: 3-9 sequenze corrispondenti)[2].
La tecnica ClonoSeq per identificare porzioni di sequenze di immunoglobuline clonali in campioni biologici disponibile in commercio, si basa sulla combinazione di una multiplex PCR ? che utilizza primer multipli volti ad amplificare tutti i possibili frammenti genici di interesse ? e sul sequenziamento di brevi frammenti di DNA al fine di identificare le porzioni pi? abbondanti di sequenze nucleotidiche all'interno della regione variabile delle catene pesanti e leggere delle immunoglobuline. Tuttavia, non ? possibile ottenere la sequenza completa. L'applicabilit? di questo approccio varia dall'80% al 91% dei pazienti affetti da mieloma multiplo, poich? in un sottoinsieme di casi i metodi impiegati non identificano una sequenza sufficientemente espressa o sufficientemente unica per qualificarsi per il monitoraggio del tumore [4-6]. In uno studio di fattibilit? su 36 pazienti con amiloidosi AL e nessuna evidenza clinica di mieloma multiplo concomitante, tutti con una malattia clonale misurabile basata su elettroforesi sierica e immunofissazione e/o quantificazione delle catene leggere libere nel siero (con infiltrato plasmacellulare mediano del midollo osseo attorno al 15%), il metodo ClonoSeq ha identificato almeno una sequenza tracciabile in 31 dei 36 pazienti (88,5%)[7].
Gli autori della presente invenzione hanno ora messo a punto un metodo di identificazione dell?intera sequenza della regione variabile delle catene pesanti e/o leggere dei diversi isotipi di immunoglobuline presenti in un campione biologico che combina l?uso della PCR inversa a due step con DNA polimerasi ad alta fedelt?, che consente l'amplificazione accurata delle molecole di cDNA di interesse presenti nei campioni biologici con il sequenziamento in tempo reale di singole molecole di DNA.
Il metodo consente altres? di identificare parte della regione costante delle immunoglobuline.
La metodologia oggetto della presente domanda di brevetto (denominata SMaRT M-Seq, single molecule realtime sequencing of the M protein ? Figura 1) consente altres? di classificare le sequenze ottenute in base alla loro abbondanza relativa nel campione biologico in esame, consentendo l?analisi in parallelo di un numero elevato di campioni biologici. Se applicata a campioni biologici provenienti da pazienti affetti da una gammapatia monoclonale, SMaRT M-Seq consente l?identificazione di catene pesanti e/o leggere monoclonali (cio? tumorali).
Forma pertanto oggetto della presente invenzione un metodo per l?identificazione della sequenza intera della regione variabile della catena pesante e/o leggera di uno o pi? isotipi di immunoglobulina in un campione biologico comprendente le seguenti fasi:
i) estrazione di RNA intatto da detto campione biologico; ii) retrotrascrizione dell?RNA ottenuto nella fase i) e circolarizzazione del ds cDNA cos? ottenuto;
iii) PCR inversa a due step con DNA polimerasi ad alta fedelt? per l?amplificazione accurata con coppie di primer dirette contro la regione costante di ds cDNA circolarizzato trascritto dai geni di detti uno o pi? isotipi di catena leggera e/o pesante di immunoglobulina;
iv) sequenziamento in tempo reale di singole molecole di DNA, che consente di ottenere la sequenza completa della regione variabile di uno o pi? isotipi delle catene pesanti e/o leggere delle immunoglobuline presenti nel campione biologico.
Preferibilmente, la DNA polimerasi ad alta fedelt? che si usa nella fase iii) ? scelta tra Q5 High-Fidelity 2X Master Mix, New England Biolabs, M0492S; Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix, ThermoFisher Scientific, F565L; Platinum Taq DNA Polymerase High-Fidelity, ThermoFisher Scientific, 11304011.
In una forma preferita di realizzazione del metodo dell?invenzione ? possibile avere una ulteriore fase iv) di classificazione degli isotipi identificati nella fase v) in base alla loro quantit? relativa.
In una forma preferita di realizzazione dell?invenzione le immunoglobuline sono clonali, ovvero tumorali.
Preferibilmente, il suddetto campione biologico proviene dal midollo osseo di un paziente. In una forma alternativa di realizzazione il campione biologico ? una biopsia oppure sangue periferico.
Preferibilmente, il metodo viene applicato a campioni biologici di pazienti con gammapatia monoclonale.
Dette gammapatie monoclonali possono essere scelte dal gruppo che consiste in mieloma multiplo, macroglobulinemia di Waldenstr?m, gammapatie monoclonali di significato clinico (MGCS) o indeterminato (MGUS), o da amiloidosi sistemica da catene leggere (AL).
Le coppie di primer della fase iii) dirette contro la regione costante di cDNA a doppio filamento circolarizzato trascritto dai geni di detti uno o pi? isotipi di catena leggera e/o pesante di immunoglobulina sono preferibilmente scelte dal gruppo che consiste in:
La presente invenzione verr? ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una forma preferita di realizzazione con particolare riferimento alle figure allegate, in cui:
- la Figura 1 mostra una rappresentazione schematica di SMaRT M-Seq. Lo scopo della metodica ? quello di ottenere l?intera sequenza della regione variabile di catene leggere immunoglobuliniche (Ig) pesanti e/o leggere espresse in un dato campione (?) e classificare le sequenze cos? ottenute in base alla loro abbondanza relativa, in modo da identificare potenziali sequenze dominanti (clonali), qualora nel campione biologico sia presente un clone di cellule B o plasmacellule(?). L'RNA totale viene estratto dal campione biologico, l'mRNA viene retrotrascritto utilizzando un oligo-d(T) ancorato e il DNA complementare a doppio filamento (ds cDNA) viene sintetizzato e circolarizzato (?). Due primer (in nero) che si appaiano alla regione costante dell'isotipo di interesse e che contengono una sequenza adattatrice vengono utilizzati nel contesto di una PCR inversa utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedelt? per ottenere un amplicone comprendente l'intera regione variabile (?). Due primer che si appaiano alla sequenza dell'adattatore e contenenti codici a barre molecolari identificativi di ciascun campione vengono utilizzati per generare ampliconi con codice a barre (?) che vengono utilizzati per la preparazione della libreria con adattatori ?a campana? (?) e sottoposti a sequenziamento di singole molecole di DNA in tempo reale (?). Approcci bioinformatici sono impiegati per analizzare i reads ottenuti e per estrarre le cosiddette sequenze di consenso circolare (CCS). Le analisi bioinformatiche e immunogenetiche, tra cui Vidjil e IMGT/HighV-QUEST, vengono utilizzate per esaminare i repertori e identificare i cloni dominanti (?).
- la Figura 2 mostra i risultati della validazione della metodica SMaRT M-Seq applicata alle catene leggere di immunoglobuline di diversi isotipi. Il pannello A riporta i livelli di espressione (in tonalit? di grigio) di diversi geni IGKV (sinistra) e IGLV (destra) valutati da SMaRT M-Seq, a partire da diluizioni seriali di RNA totale da cellule NCI-H929, secernenti la catena IGKV3-15 (a sinistra) o cellule ALMC-2, secernenti IGLV6-57 (a destra,) in RNA totale da cellule mononucleate di midollo osseo da un soggetto di controllo senza evidenza di cloni linfocitari/plasmacellulari. Il pannello B riporta i livelli di espressione di diversi geni IGKV (sinistra) e IGLV (destra) valutati mediante SMaRT M-Seq, a partire da cinque campioni replicati di midollo osseo (da A a E) di due pazienti (Pz. 01 e 02) affetti da amiloidosi AL, con un clone plasmacellulare che secerne una catena leggera clonale IGKV1-33 (sinistra) o IGLV2-14 (destra), rispettivamente. In entrambi i pannelli A e B i grafici a torta in scala indicano la dimensione molecolare del clone dominante identificato in ciascun campione testato. Il segno meno (-) indica campioni in cui nessun clone dominante ? stato identificato con Vidjil. In basso, allineamenti di sequenza della regione variabile clonotipica della catena leggera secreta dalle cellule NCI-H929 e ALMC-2 (A) o della catena leggera clonale del paziente 01 e del paziente 02 (B), valutati mediante clonaggio e sequenziamento Sanger o tramite SMaRT M-Seq (indicato dalla corrispondente diluizione, A, o dai 5 replicati tecnici, B), con il corrispondente gene di riferimento (ref.). In nero (? ref. seq.) sono indicate le singole mutazioni nella catena leggera clonotipica rispetto al corrispondente gene della linea germinale. FR: regione framework, CDR: regione determinante la complementarit?, Pz.: paziente.
- la Figura 3 mostra i risultati relativi alla applicazione del metodo secondo l?invenzione per l?identificazione della intera sequenza della regione variabile della catena leggera clonale in una coorte di pazienti affetti da amiloidosi AL. Il pannello A riporta i livelli di espressione di diversi geni IGKV (sinistra) e IGLV (destra) valutati mediante SMaRT M-Seq, a partire dal leftover diagnostico di sangue midollare di 84 pazienti affetti da amiloidosi AL analizzati in parallelo in un unico ciclo di sequenziamento. I grafici a barre indicano la dimensione molecolare del clone dominante identificato dall'analisi di Vidjil in ciascun campione testato. In due pazienti (*) il clone dominante ? stato identificato mediante l?analisi di IMGT/HighV-QUEST. Tre pazienti sono stati analizzati in duplicato (frecce). Il pannello B illustra gli allineamenti di sequenza della catena leggera clonale di sei pazienti, valutati mediante clonaggio e sequenziamento Sanger o SMaRT M-Seq (A-B indicano duplicati tecnici) con il corrispondente gene della linea germinale (ref.). In nero (? ref. seq.) sono indicate le singole mutazioni nella catena leggera clonotipica rispetto al corrispondente gene della linea germinale. FR: regione framework, CDR: regione determinante la complementarit?, Pz.: paziente.
- la Figura 4 mostra l?omologia di sequenza delle catene leggere clonali nella coorte di pazienti AL analizzata. E? riportata la Heatmap (in tonalit? di grigio) rappresentante i livelli di omologia di sequenza di 86 pazienti affetti da amiloidosi AL (17 ? e 69 ?, inclusi i pazienti 01 e 02). Tre pazienti sono stati analizzati in duplicato (frecce). Pz.: paziente.
- la Figura 5 mostra l?uso di geni immunoglobulinici germinali nell?amiloidosi AL. E? riportato il confronto delle frequenze relative dei geni IGKV e IGLV in due coorti di pazienti con amiloidosi AL sistemica valutati con SMaRT M-Seq (n=86, inclusi i pazienti 01 e 02) (in nero) o con spettrometria di massa (n=626) (in grigio). Allo scopo di meglio illustrare l?invenzione sono forniti i seguenti esempi illustrativi dell?invenzione ma non limitativi.
ESEMPIO 1: Descrizione dettagliata del metodo SMaRT M-Seq
Fase 1: Estrazione di RNA dal campione biologico L?RNA totale ? estratto dal campione biologico di partenza impiegando TRIzol (Life Technologies, 15596026).
Potrebbero essere impiegati anche altri metodi di estrazione di RNA da campioni biologici, purch? il metodo impiegato consenta di estrarre molecole di RNA intatte, come richiesto dalla successiva fase di PCR inversa. Il campione biologico ? stato lisato con TRIzol, seguendo le specifiche istruzioni del produttore. Se il materiale di partenza ? una sospensione cellulare, il pellet di cellule viene risospeso con TRIzol in relazione alla quantit? di materiale di partenza.
L?incubazione avviene per 5 minuti a temperatura ambiente per permettere la completa dissociazione del complesso di nucleoproteine. Eventualmente il campione lisato pu? essere conservato a -80?C.
Si aggiungono 200 ?L di cloroformio per ogni ml di TRIzol usato, e dopo agitazione vigorosa per 15 secondi il campione si incuba per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Segue centrifuga del campione a 4?C per 15 minuti a 12000 rcf. La fase acquosa viene trasferita in una nuova provetta, facendo attenzione a non prelevare le fasi sottostanti che devono essere eliminate. Si aggiungono 500 ?l di isopropanolo, si agita e poi si lascia in ghiaccio per 10 minuti. Anche in questo caso, se non si vuole procedere con lo step successivo, il campione pu? essere conservato a -20?C fino al giorno successivo. Segue centrifuga per 10 minuti a 4?C a 12000 rcf. Il precipitato totale di RNA ? visibile come un pellet bianco opaco sul fondo della provetta; la provetta ? mantenuta in ghiaccio e il surnatante viene rimosso. Si
aggiunge al pellet 1 mL di etanolo al 75% freddo. Segue
nuova centrifuga a 7500 rcf per 5 minuti a 4?C. Si
rimuove completamente il surnatante aspirandolo con una
micropipetta. I residui di etanolo potrebbero
determinare una possibile degradazione di RNA per cui ?
consigliabile lasciare evaporare l?etanolo per 10 minuti
o in alternativa centrifugare il campione a 7500 rcf per
2 minuti a 4?C aspirando il surnatante in eccesso. Si
aggiungono 20-50 ?L di acqua al pellet e si risospende
delicatamente. Il campione di RNA intatto estratto si
mantiene su ghiaccio.
A questo punto si determina la quantit? di RNA estratto
mediante spettrofotometro e/o fluorometro.
Prima di procedere alla fase successiva di sintesi del
cDNA a doppio filamento (ds cDNA) ? consigliabile
valutare l?integrit? dell?RNA estratto mediante corsa
elettroforetica su gel di agarosio o elettroforesi
capillare.
Fase 2: Sintesi, purificazione e precipitazione del ds
cDNA
Sono stati impiegati i seguenti reagenti:
? Anchored OligodT (0,5 ?g/?L): Invitrogen 12577011 ? dNTP mix 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): Invitrogen 10297018
? DTT 0.1 M: Invitrogen Y00147
? First Strand Buffer 5X: Invitrogen P/N Y02321 ? RNaseOUT(40U/?L): Invitrogen 10777019
? Superscript II Reverse Transcriptase (200 U/?L):
Invitrogen 18064014
? Second Strand Buffer 5X: Invitrogen 10812014
? RNasi H (2U/?L): Invitrogen 18021071
? E. Coli DNA Polimerasi I (10U/?L): Invitrogen 18010017
? E. Coli DNA ligasi (10U/?L): Invitrogen 18052019 ? T4 DNA polimerasi (5U/?L): Invitrogen 18005017
L?RNA totale estratto nella fase precedente viene
retrotrascritto in un cDNA a doppio filamento. La
retrotrascrizione avviene impiegando un oligod(T)
ancorato. Sono stati usati 500-1000 ng di RNA e portati
a volume totale di 10 ?L con acqua aggiungendo
nell?ordine i seguenti reagenti:
- 1 ?L di oligodT ancorato (0,5 ?g/ ?L)
- 1 ?L di enzima RNase out (40 U/ ?L)
Segue incubazione a 70?C per 10 minuti. Alla fine
dell?incubazione si applica una breve centrifuga e la
provetta viene posta in ghiaccio. Si aggiungono
nell?ordine i seguenti reagenti:
- 4 ?L di First strand reaction buffer 5X
- 2 ?L di DTT 0,1 M
- 1 ?L di dNTP mix 10 mM
Prima dell?incubazione, la provetta viene agitata
delicatamente e si applica una breve centrifuga al fine
di miscelare i reagenti.
Segue incubazione a 45?C per 2 minuti al fine di
equilibrare la temperatura.
Si aggiunge 1 ?L di Superscript II Reverse Transcriptase
(200 U/?L) e si incuba a 45?C per 60 minuti. Il volume
totale della reazione per la sintesi del primo filamento
di cDNA ? pari a 20 ?L.
Alla fine dell?incubazione si applica una breve
centrifuga e si ripone la provetta in ghiaccio.
Si continua con la sintesi del secondo filamento di cDNA
aggiungendo nell?ordine i seguenti reagenti:
? 93 ?L di acqua
? 30 ?L di Second strand reaction buffer 5X ? 3 ?L di dNTP mix 10 mM
? 1 ?L di E. Coli DNA ligasi (10 U/?L) ? 2 ?L di E. Coli DNA Polimerasi I (10 U/?L) ? 1 ?L di E. Coli DNA RNasi H (2 U/?L)
Prima di incubare, la provetta viene agitata
delicatamente e si applica una breve centrifuga al fine
di miscelare i reagenti.
Il volume totale della reazione per la sintesi del
secondo filamento di cDNA ? pari a 150 ?L. Si procede
con incubazione a 16?C per 2 ore.
Alla fine dell?incubazione, si aggiunge 1 ?L di T4 DNA
Polimerasi (5 U/?L) e si continua ad incubare a 16?C per
altri 5 minuti. Si applica una breve centrifuga e si
ripone la provetta in ghiaccio.
Si aggiungono 160 ?L di una miscela di fenolo -
cloroformio ? isoamil alcol (25:24:1), e si agita
vigorosamente per 15 secondi. Si lascia in incubazione
per 2-3 minuti fino alla separazione di fase.
Si centrifuga il campione a 4?C per 5 minuti a 12000
rcf. Si trasferisce solo la fase superiore in una nuova
provetta facendo attenzione a non prelevare le fasi
sottostanti.
Si aggiungono 160 ?L di tampone STE alla provetta
iniziale, agitati vigorosamente per 15 secondi e si
lascia ad incubare per 2-3 minuti fino alla separazione
di fase. Il campione viene centrifugato a 4?C per 5
minuti a 12000 rcf.
Solo la fase superiore viene trasferita nella nuova
provetta facendo attenzione a non prelevare le fasi
sottostanti che saranno eliminate. Il volume totale
della nuova provetta dovrebbe essere circa 300 ?L.
A questo punto si procede con la precipitazione del
dscDNA aggiungendo nell?ordine i seguenti reagenti:
? 100 ?L di acetato di ammonio
? 750 ?L di etanolo freddo
Si agita vigorosamente e si centrifuga a 4?C per 20
minuti a 12000 rcf. Si rimuove delicatamente il
surnatante e si risospende il pellet con 500 ?L di
etanolo al 75% freddo. Si centrifuga a 4?C per 10 minuti
a 12000 rcf e si rimuove delicatamente tutto il
surnatante. Anche in questo caso i residui di etanolo
potrebbero determinare una possibile degradazione del ds
cDNA, per cui ? consigliabile lasciare evaporare
l?etanolo per 10 minuti o in alternativa centrifugare il
campione a 12000 rcf per 2 minuti a 4?C aspirando il
surnatante in eccesso.
Il pellet viene risospeso in 10 ?L di acqua, agitando la
provetta delicatamente e applicando una breve
centrifuga. Se non si vuole procedere con lo step
successivo, il campione pu? essere conservato a -20?C.
Fase 3: Circolarizzazione del ds cDNA
Il cDNA a doppio filamento viene circolarizzato
impiegando una DNA ligasi (T4 DNA ligasi (1 U/?L)
Invitrogen 15224017).
La reazione viene preparata aggiungendo in una nuova
provetta i seguenti reagenti:
? 4 ?L di acqua
? 2 ?L di T4 DNA ligasi buffer 5X
? 3 ?L di ds cDNA
? 1 ?L di T4 DNA ligasi (1U/?L)
Prima di procedere con l?incubazione, si agita la provetta delicatamente e si applica una breve centrifuga al fine di omogenizzare i reagenti. Si incuba a 14?C per 16-20 ore.
Fase 4: Amplificazione della regione target della catena immunoglobulinica di interesse mediante PCR inversa La regione target della catena immunoglobulinica di interesse viene amplificata a partire dal ds cDNA mediante una PCR inversa in due step, impiegando una DNA polimerasi ad alta fedelt?. Nel primo step di PCR, l?isotipo immunoglobulinico di interesse viene amplificato e, contestualmente, vengono incorporati gli adattatori universali, per consentire la successiva marcatura degli ampliconi con apposito codice a barre molecolare, secondo il protocollo per il sequenziamento Pacific Biosciences. Nel secondo step di PCR, si effettua una seconda amplificazione e, contestualmente, viene incorporato il codice a barre molecolare, secondo il protocollo per il sequenziamento Pacific Biosciences. Si impiegano i seguenti reagenti:
- Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, M0492S)
- primer forward e reverse target-specifico universali (elencati nella seguente Tabella 1) - Barcoded Universal F/R Primers Plate ? 96 pozzetti(Pacific Biosciences, 101-629-100)
- Acqua (DNasi ed RNAsi free)
- MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, 28604)
Tabella 1
Si prepara la prima reazione di PCR (PCR 1) per ciascun
campione aggiungendo i seguenti reagenti in un volume
finale di 25 ?L:
? 12,5 ?L di Q5 High-Fidelity 2X Master Mix ? 1,25 ?L di Universal primer forward targetspecifico (10 ?M)
? 1,25 ?L di Universal primer reverse targetspecifico (10 ?M)
? 8 ?L di acqua
? 2 ?L di ds cDNA circolarizzato ottenuto in precedenza
La provetta viene agitata delicatamente e si applica una breve centrifuga al fine di omogenizzare i reagenti. Per ogni campione si crea un duplicato al fine di minimizzare l?impatto di eventuali errori di incorporazione di basi nucleotidiche durante i primi cicli di PCR.
Si procede all?amplificazione nelle condizioni mostrate nel seguito:
Tabella 2
Alla fine dell?amplificazione i duplicati di ogni campione vengono uniti. L?amplicone pu? comunque essere conservato a -20?C per qualche giorno.
Si prepara poi la seconda reazione di PCR (PCR 2) per ciascun campione aggiungendo i seguenti reagenti nel volume totale di 25 ?L:
? 12,5 ?L di Q5 High-Fidelity 2X Master Mix ? 2,5 ?L di F/R barcode primer ? 8 ?L di acqua
? 2 ?l di templato derivante dalla PCR 1 Si agita la provetta delicatamente e si applica una breve centrifuga al fine di miscelare i reagenti.
Si procede alla seconda amplificazione nelle condizioni illustrate nella seguente Tabella:
Tabella 3
Al termine dell?amplificazione i prodotti di PCR vengono visualizzati su gel di agarosio. Le bande dal gel vengono escisse e gli ampliconi vengono purificati tramite Mini Elute Gel extraction kit (Qiagen) in accordo con le linee guida del kit.
La quantificazione dei singoli ampliconi viene effettuata mediante fluorometro (Qubit).
Se si intendono sequenziare due o pi? campioni in parallelo, si effettua un pooling degli ampliconi dei diversi campioni in questione, unendo uguali quantitativi di amplicone per ciascun campione, seguendo le linee guida di Pacific Biosciences.
Fase 5: Sequenziamento di singole molecole di DNA in real-time
L?amplicone o il pooling di ampliconi generato nelle fasi precedenti sar? utilizzato per la creazione della libreria di sequenziamento mediante impiego degli adattatori a campana SMRT, sottoposto a sequenziamento in tempo reale di singole molecole di DNA per la generazione delle sequenze consenso circolari CCS), in accordo alle linee guida della Pacific Biosciences.
Si procede alla preparazione della libreria di SMRT bell in accordo con le linee guida del produttore (Pacific Biosciences).
Anche l?analisi bioinformatica per la generazione delle sequenze consenso circolari (CCS) e il demultiplexing, sono condotte secondo le linee guida della Pacific Biosciences.
Fase 6: Analisi delle immunoglobuline tramite analisi bioinformatiche/immunogenetiche
Per ciascun campione sequenziato, il relativo file contente le sequenze CCS in formato FASTA viene sottoposto ad analisi bioinformatiche/immunogenetiche. Le sequenze di ciascun campione sono caricate in formato FASTA utilizzando il software Vidjil (http://www.vidjil.org/).
Per ciascun campione si avvia l?analisi selezionando la sezione ?V(D)J recombinations? e scegliendo l?analisi ?multi+inc+xxx? (default: multi-locus, with same incomplete/unusual/unexpected recombinations).
Al termine dell?analisi, si visualizza per ogni campione il risultato selezionando l?isotipo della catena sequenziata; si ottiene in questo modo l?elenco di tutti i cloni individuati, con le relative dimensioni clonali molecolari
I cloni ottenuti si ordinano in base alla frequenza relativa (campo ?Sort by size?). Nel caso di un campione ottenuto da un paziente con una gammapatia monoclonale, la sequenza originante dal clone ? tipicamente la prima sequenza ottenuta in termini di frequenza relativa, con una dimensione clonale molecolare superiore all?1% e maggiore del doppio rispetto alla seconda sequenza pi? frequente individuata. In pazienti con gammapatia biclonale, in pazienti in fase di attecchimento midollare dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche o in altre situazioni cliniche ? possibile riscontrare un pattern clonale pi? complesso.
Alla fine si verifica la sequenza clonale ottenuta in termini di produttivit? della catena immunoglobulinica sequenziata tramite il portale IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org) selezionando la specie e il tipo di isotipo sequenziato, caricando la sequenza clonale in formato FASTA.
L?analisi del software Vidjil pu? essere ripetuta su IMGT/HighV-QUEST, specie nel caso in cui l?analisi delle sequenze di un campione dia come risultato un segnale di allerta (triangolo giallo arancio con punto esclamativo, ?Few sequences analyzed?, o triangolo rosso con punto esclamativo ?Very few sequences analyzed? risultato di poche sequenze analizzate) oppure il primo clone riscontrato per dimensione clonale molecolare risulti indicato come ?smaller clones?. Tramite il portale IMGT/HighV-QUEST ? possibile caricare le sequenze ottenute in formato FASTA, lanciare l?analisi selezionando la specie e l?isotipo sequenziato.
ESEMPIO 2: Validazione del metodo SMaRT M-Seq
? stata eseguita la validazione del metodo SMaRT M-Seq descritto nell?esempio precedente, studiandone l'accuratezza, la ripetibilit? e la sensibilit?.
A questo scopo, ? stata utilizzata la linea di plasmacellule mielomatose umane NCI-H929[8] e la linea di plasmacellule amiloidogeniche umane ALMC-2[9], che secernono rispettivamente una catena leggera immunoglobulica ? o ?.
Impiegando tecniche standard di biologia molecolare, ? stata determinata la sequenza dell'intera regione variabile della catena leggera ? espressa dalla linea cellulare NCI-H929, che ? risultata originare da un gene IGKV3-15 (dati non mostrati).
Viceversa, per la linea cellulare ALMC-2, la sequenza dell'intera regione variabile della catena leggera ? espressa ? stata inclusa nella descrizione originale di questa linea cellulare [9]. ? stata verificata sperimentalmente la sequenza della catena leggera ? espressa delle cellule ALMC-2 in uso, confermando la provenienza da un gene IGLV6-57 e l'identit? del 100% con la sequenza pubblicata (dati non mostrati).
Al fine di testare la sensibilit? e l'accuratezza di SMaRT M-Seq nell?individuare l?intera sequenza della regione variabile di immunoglobuline clonali, 1 volume di RNA totale dalla linea plasmacellulare umana NCI-H929 o ALMC-2 ? stato unito a 9 volumi di RNA totale dal midollo osseo di un soggetto privo di cloni plasmacellulari rilevabili.
Quindi sono state preparate 6 ulteriori diluizioni seriali 1 a 10, sempre in RNA totale dal midollo osseo del soggetto di controllo (ottenendo quindi una diluizione finale dell?RNA della linea plasmacellulare da 10<-1 >a 10<-7>) in modo da mimare campioni di midollo osseo contenenti un clone plasmacellulare esprimente una catena leggera di tipo ? o ? progressivamente pi? piccolo. Questa procedura ha prodotto 16 campioni (8 campioni per il sequenziamento della catena leggera ? e 8 campioni per il sequenziamento della catena leggera ?, comprese le diluizioni da 10<-1 >a 10<-7 >e il donatore sano, per ciascun tipo di catena leggera).
I 16 campioni di RNA cos? ottenuti sono stati sottoposti ad amplificazione, aggiunta dei codici a barre molecolari, pooling (insieme a 10 campioni aggiuntivi, come specificato di seguito) e sequenziamento in tempo reale di singole molecole di DNA sulla piattaforma Pacific Biosciences RSII. Dopo il demultiplexing, ? stata ottenuta una mediana di 915 sequenze per campione (range interquartile: 757 ? 1.204 sequenze). Ciascun campione ? stato analizzato separatamente con Vidjil [10] per identificare le sequenze clonali dominanti in cieco, senza cio? sfruttare la conoscenza a priori della sequenza clonale della linea plasmacellulare impiegata per la generazione dei campioni sequenziati. In parallelo, i singoli file FASTA contenenti tutte le sequenze identificate in un dato campione sono stati ispezionati individualmente per verificare la presenza e la frequenza relativa della sequenza clonale prevista sulla base della conoscenza a priori della sequenza stessa.
Senza la conoscenza a priori della sequenza clonale prevista, l'analisi clonale di Vidjil ? stata in grado di identificare una sequenza clonale dominante fino alla diluizione 10<-2 >per campioni di midollo osseo addizionati con l?RNA della linea plasmacellulare NCI-H929 e sottoposti a sequenziamento della catena leggera ? e fino alla diluizione di 10<-3 >per campioni di midollo osseo addizionati con l?RNA delle cellule ALMC-2 e sottoposti a sequenziamento della catena leggera ? (Figura 2). Da notare, la sequenza clonale dominante identificata dall'analisi di Vidjil nei cinque campioni che hanno dato esito positivo (10<-1 >e 10<-2 >per la sequenza di catene leggere ? e da 10<-1 >a 10<-3 >per la sequenza di catene leggere ?), ha mostrato in tutti i casi una identit? del 100% rispetto alla sequenza nucleotidica prevista sulla base della sequenza delle catene leggere ? e ? espresse rispettivamente dalla linea NCI-H929 e dalla linea ALMC-2, dimostrando una accuratezza del 100% nella determinazione della sequenza clonale a livello del singolo paio di basi analizzate. Inoltre, la dimensione clonale molecolare ottenuta, che ? una misura della frequenza relativa delle sequenze clonali in un dato campione, ? risultata progressivamente inferiore nei campioni con una concentrazione decrescente dell'RNA originale della linea plasmacellulare, come atteso (Figura 2).
In parallelo, per testare la riproducibilit? di SMaRT M-Seq per la rilevazione dei geni delle immunoglobuline clonali in campioni reali di midollo osseo da pazienti con una gammapatia monoclonale, sono stati selezionati due pazienti con amiloidosi AL alla diagnosi (paziente 01, con un clone plasmacellulare con restrizione di catene leggere ? e un infiltrato di plasmacellule nel midollo osseo pari al 6%, e paziente 02, con clone di plasmacellule con restrizione di catene leggere ? e un infiltrato di plasmacellule nel midollo osseo pari all?11%). La sequenza nucleotidica della regione variabile della loro catena leggera clonale ? o ?, rispettivamente, ? stata ottenuta attraverso un approccio standard costituito da amplificazione mediante PCR inversa, clonazione TOPO-TA, trasformazione di E. coli e sequenziamento di colonie multiple [1]. Queste analisi hanno dimostrato che il paziente 01 esprime una catena leggera clonale ? derivata dal gene germinale IGKV1-33, mentre il paziente 02 esprime una catena leggera clonale ? derivata dal gene germinale IGLV2-14. Successivamente, questi 2 campioni di RNA del midollo osseo dai pazienti 01 e 02 sono stati divisi in 5 diverse provette per ciascun paziente, e i 10 campioni risultanti (5 campioni replicati di RNA per il paziente 01 e 5 campioni replicati di RNA per il paziente 02) sono stati quindi processati in modo indipendente secondo il protocollo SMaRT M-Seq. In particolare, il pooling e il sequenziamento per questi 10 campioni sono avvenuti contestualmente ai 16 campioni provenienti dall'esperimento di diluizione seriale menzionato sopra. Dopo il demultiplexing, per questi 10 campioni ? stata ottenuta una mediana di 730 sequenze per campione (range interquartile: 603 ? 953 sequenze). Anche in questo caso, ogni campione ? stato analizzato separatamente con Vidjil per identificare le sequenze clonali dominanti in cieco, senza sfruttare la conoscenza a priori della sequenza paziente-specifica determinata con metodi convenzionali. Da notare, per entrambi i pazienti analizzati, la sequenza clonale ottenuta mediante SMaRT M-Seq ? risultata identica nei 5 campioni esaminati, con una identit? del 100% con la sequenza clonale ? o ? prevista, precedentemente ottenuta per ciascun paziente mediante metodi convenzionali (Figura 2), ad ulteriore conferma della accuratezza del 100% nella determinazione della sequenza clonale a livello del singolo paio di basi analizzate.
Inoltre, Vidjil ? stato utilizzato per determinare la dimensione clonale molecolare di ciascun campione, come risultato della frequenza relativa della sequenza clonale rispetto a tutte le sequenze ottenute in ciascun campione. I cinque campioni replicati dal paziente 01 hanno determinato una dimensione clonale molecolare basata sulla sequenza dell'89% (coefficiente di variazione, CV: 0,5%), mentre i cinque campioni replicati dal paziente 02 hanno determinato una dimensione clonale molecolare del 92,9% (CV: 0,7%) (Figura 2). Complessivamente, questi risultati dimostrano che SMaRT M-Seq pu? identificare in modo accurato e riproducibile l'intera sequenza della regione variabile di geni immunoglobulinici clonali a partire da un campione biologico. Infatti, in tutti i casi SMaRT M-Seq ha consentito di identificare sequenze clonali con identit? al 100% con sequenze ottenute con metodi convenzionali. Inoltre, il metodo ha mostrato un coefficiente di variazione <1% nel determinare la dimensione clonale molecolare del clone dominante e ha mostrato una sensibilit? dettata dal numero di sequenze totali per campione ottenute durante il sequenziamento (nell'intervallo 10<-2 >? 10<-3 >nel presente esperimento) e quindi suscettibile ad essere incrementata tramite analisi di un numero inferiore di campioni in parallelo e/o tramite impiego di una piattaforma con maggior profondit? di sequenziamento.
Successivamente, SMaRT M-Seq ? stato impiegato per l'identificazione di sequenze immunoglobuliniche clonali da cellule mononucleate del midollo osseo di una coorte di pazienti affetti da amiloidosi AL sistemica. A tal fine, sono stati analizzati 89 pazienti con amiloidosi sistemica AL o sospetta amiloidosi sistemica AL, con un campione di sangue midollare residuo dopo l?espletamento delle procedure diagnostiche disponibile a fini di ricerca.
SMaRT M-Seq ? stato eseguito sulla coorte di 89 pazienti, che sono stati analizzati in parallelo. In sei pazienti selezionati casualmente (pazienti 22, 37, 38, 39, 40 e 73), la sequenza della catena leggera amiloidogenica espressa ? stata ottenuta anche attraverso un approccio standard di clonazione e sequenziamento a scopo di confronto [1]. In 3 di questi pazienti (pazienti 22, 37, 38) SMaRT M-Seq ? stato eseguito in campioni di RNA in duplicato, processati ed analizzati in modo indipendente, mentre i restanti 86 pazienti della coorte sono stati analizzati come campioni individuali. Nel complesso, 92 campioni sono stati sottoposti ad amplificazione, incorporazione del codice a barre molecolare, pooling e sono stati quindi analizzati in un unico ciclo di sequenziamento utilizzando la piattaforma Pacific Biosciences Sequel, seguendo il protocollo SMaRT M-Seq. Dopo il demultiplexing, ? stata ottenuta una mediana di 3.118 sequenze per campione (range interquartile: 2.554 ? 3.671). Ciascun campione ? stato analizzato separatamente con Vidjil per identificare la sequenza clonale dominante e la dimensione clonale molecolare.
In tutti e 6 i pazienti per i quali la sequenza di catene leggere clonali era stata ottenuta anche con metodi convenzionali, SMaRT M-Seq ha identificato correttamente la sequenza di catene leggere clonali attesa, con identit? al 100% rispetto alla sequenza ottenuta con approcci standard di clonazione e sequenziamento (Figura 3). Inoltre, per i 3 pazienti analizzati in duplicato (pazienti 22, 37 e 38), le dimensioni clonali molecolari basate sulla sequenza dei due replicati tecnici sono risultate altamente comparabili (Figura 3). Questi risultati confermano ulteriormente l'accuratezza e la ripetibilit? di SMaRT M-Seq.
Degli 89 pazienti sequenziati, in 84 pazienti ? stato possibile stabilire una diagnosi finale di amiloidosi sistemica AL, mentre nei restanti 5 casi non ? stato possibile confermare la diagnosi di amiloidosi sistemica AL a causa della mancanza di dimostrazione istologica di depositi di amiloide oppure perch? ? stata posta una diagnosi alternativa.
Negli 84 pazienti sequenziati con diagnosi finale di amiloidosi AL la catena leggera amiloidogenica era di tipo ? in 16 casi (19%) e di tipo ? in 68 casi (81%). La mediana di infiltrazione plasmacellulare del midollo osseo ? risultata pari al 9% (intervallo 1 - 30%). In 5 di questi pazienti (pazienti 12, 32, 35, 44 e 47) l?elettroforesi con immunofissazione di siero e urine eseguita con metodiche standard ha dato esito negativo ed il rapporto ?/? della concentrazione delle catene leggere libere sieriche ? risultato nella norma, a riprova della presenza di un clone plasmacellulare particolarmente piccolo e difficilmente rilevabile. In questi 5 casi la presenza di una gammapatia monoclonale era stata dimostrata mediante elettroforesi con immunofissazione su gel di agarosio ad alta risoluzione [11-12], eventualmente associata a citometria a flusso multiparametrica del sangue midollare eseguita con metodica standard o con metodica ad alta sensibilit? di nuova generazione (Next Generation Flow, NGF, sensibilit? pari a 10<-6>)[7].
In questo esperimento, SMaRT M-Seq ha consentito di identificare una sequenza clonale di catene leggere immunoglobuliniche in tutti e 84 i pazienti (dimensione clonale molecolare mediana: 88,3%, range interquartile: 70,7 ? 93%). La dimensione clonale molecolare identificata tramite SMaRT M-Seq ha mostrato una correlazione significativa con la percentuale di infiltrato plasmacellulare del midollo osseo (p<0,0001) (dati non mostrati).
Le sequenze clonali ottenute da 86 pazienti con amiloidosi AL confermata (17 ? e 69 ?, includendo anche i pazienti 01 e 02) sono state allineate. La sequenza di ogni paziente si ? rivelata unica, come previsto (Figura 4).
Di quei 5 degli 89 pazienti sequenziati in cui non ? stato possibile confermare una diagnosi finale di amiloidosi AL, in 2 casi (paziente 07 e 16) era presente una gammapatia monoclonale, mentre nei restanti 3 casi (pazienti 03, 08 e 29) gli accertamenti eseguiti (inclusi elettroforesi con immunofissazione di siero e urine e quantificazione delle catene leggere libere sieriche) hanno escluso la presenza di un clone midollare. In questo contesto, SMaRT M-Seq ha identificato una sequenza clonale in entrambi i pazienti con una gammapatia monoclonale (con una dimensione molecolare clonale del 53,7% e 4,3%, rispettivamente) e in nessuno dei 3 pazienti senza clone plasmacellulare rilevabile (dati non mostrati).
Dopo aver ottenuto l?intera sequenza variabile delle catene leggere delle immunoglobuline prodotte dal clone plasmacellulare di ciascun paziente analizzato, sono stati determinati i geni/alleli germinali IGKV e IGLV impiegati in ciascun caso, utilizzando la piattaforma IMGT/V-QUEST. Tra gli 86 pazienti con amiloidosi sistemica AL sequenziati mediante SMaRT M-Seq (inclusi i pazienti 01 e 02), i geni germinali ? pi? comuni sono risultati i geni IGKV1-33 e IGKV4-01 (24% ciascuno dei pazienti AL 17 ?) e i geni germinali ? pi? comuni sono risultati i geni IGLV6-57 (26% dei 69 pazienti AL ?), IGLV2-14 (17%), IGLV3-01 (17%) e IGLV1-44 (10%). Complessivamente, i geni germinali ? e ? pi? frequenti (IGLV6-57, IGLV2-14, IGLV3-01, IGLV1-44, IGKV1-33 e IGKV4-01) insieme rappresentavano il 66% di tutti i cloni.
La composizione e le frequenze relative dei geni germinali ? e ? utilizzati nell'intera coorte di 86 pazienti analizzati mediante SMaRT M-Seq sono risultate in accordo con i risultati di Kourelis et al. [14], che hanno studiato l'utilizzo del gene germinale in una coorte pi? ampia di pazienti AL attraverso cromatografia liquida/spettrometria di massa tandem (LC-MS) in biopsie di tessuti con depositi di amiloide, pur non identificando l'intera sequenza della regione variabile delle catene leggere amiloidogeniche [14] (Figura 5). Tale osservazione corrobora ulteriormente la dimostrata capacit? di SMaRT M-Seq nell?individuare correttamente la sequenza immunoglobulinica clonale in campioni biologici di pazienti con gammapatia monoclonale.
Claims (7)
1. Metodo per l?identificazione della sequenza intera della regione variabile della catena pesante e/o leggera di uno o pi? isotipi di immunoglobulina in un campione biologico, comprendente le seguenti fasi:
i) estrazione di RNA intatto da detto campione biologico; ii) retrotrascrizione dell?RNA ottenuto nella fase i) e circolarizzazione del ds cDNA cos? ottenuto;
iii) PCR inversa a due step con DNA polimerasi ad alta fedelt? per l?amplificazione con coppie di primer dirette contro la regione costante di ds cDNA circolarizzato trascritto dai geni di detti uno o pi? isotipi di catena leggera e/o pesante di immunoglobulina;
iv) sequenziamento in tempo reale di singole molecole di DNA, che consente di ottenere la sequenza completa della regione variabile di uno o pi? isotipi delle catene pesanti e leggere delle immunoglobuline presenti nel campione biologico.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, ulteriormente comprendente una fase v) di classificazione degli isotipi identificati nella fase iv) in base alla loro quantit? relativa.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detti isotipi sono ?, ?, ?, ?, ? ? e ?.
4. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui dette immunoglobuline sono clonali, ovvero tumorali.
5. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui detto campione biologico proviene da un paziente affetto da gammapatia monoclonale.
6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detta gammapatia monoclonale ? scelto dal gruppo che comprende mieloma multiplo, macroglobulinemia di Waldenstr?m, gammapatie monoclonali di significato clinico (MGCS) o indeterminato (MGUS).
7. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui dette coppie di primer della fase iii) dirette contro la regione costante di cDNA a doppio filamento circolarizzato trascritto dai geni di detti uno o pi? isotipi di catena leggera e/o pesante di immunoglobulina sono scelte dal gruppo che consiste in:
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