IT201600121482A1 - Fattore H per l’uso nel trattamento e/o prevenzione della formazione di eterotrombi in pazienti affetti da anemia falciforme - Google Patents

Description

DEfSCREZIONS

Campo di applicazione

La presente invenzione si riferisce al settore terapeutico, in particolare nel settore rivolto al trattamento e/o prevenzione della trombosi in pazienti affetti da emoglobinopatie.

Più in particolare, la presente invenzione riguarda il trattamento e/o prevenzione dell’adesione dei globuli rossi falcemici all’endotelio attivato e successiva formazione di trombi in pazienti affetti da anemia falciforme.

Arte nota

È noto che le emoglobinopatie sono condizioni patologiche caratterizzate dalla presenza di emoglobine anomale nei globuli rossi del sangue.

È noto altresì che l’anemia falciforme è appartiene alla famiglia delle emoglobinopatie.

In dettaglio, l’anemia falciforme ( sicke celi disease, SCD) è una malattia monogenica dei globuli rossi con carattere autosomico recessivo, che deriva da una mutazione puntiforme del gene della beta globina sul braccio corto del cromosoma 1 1 (codone 6) con un’inserzione nella beta catena amminoacidica dell’emoglobina di una vaiina al posto di un acido glutammico.

L’inserzione amminoacidica comporta la produzione di una forma di emoglobina patologica, nota come emoglobina S (HbS), in grado di polimerizzare quando deossigenata, aumentando la densità del globulo rosso in cui è contenuta<1>'<3>.

In questo modo, i globuli rossi densi e rigidi transitano con maggiore difficoltà nel torrente micro circolatorio e tendono ad aderire con facilità alla superficie dell’endotelio vascolare attivato dalla cascata infiammatoria<4>"<6>.

È altresì noto che tale facilità di adesione all’endotelio vascolare causa un rallentamento del flusso ematico a livello locoregionale che induce l’adesione di altri componenti cellulari del sangue (ad esempio i neutrofili) formando eterotrombi e, inoltre, promuove fenomeni di ipossia locale con sofferenza tissutale di tipo ischemico<4-6>.

È noto anche che tali eventi si compongono in una delle manifestazioni cliniche più gravi dell’anemia falciforme, ovvero la crisi vaso-occlusiva acuta.

Di conseguenza, la vascolopatia infiammatoria è considerata un elemento centrale nel danno acuto e cronico d’organo correlato con l 'anemia falcifo rme .

È altresì noto che in questo contesto infiammatorio sembra avere un ruolo cruciale il sistema del complemento (SC) e anche nell’attivazione della cascata della coagulazione, che porta a definire l’anemia falciforme come una patologia con importante stato protrombotico<1>.

È noto che il sistema del complemento è un importante componente dell’immunità innata, in cui agisce attivamente nella difesa da patogeni e nell 'omeostasi cellulare.

Il sistema del complemento è costituito da numerose proteine solubili di membrana in grado di interagire tra loro e con altre componenti del sistema immunitario. Le principali proteine del complemento sono normalmente presenti nel sangue sotto forma di precursori inattivi che vengono attivati solo in particolari condizioni, originando molecole biologicamente attive in grado di svolgere diverse funzioni effettrici.

È altresì noto che le vie di attivazione del complemento sono: (i) la via classica, che si attiva attraverso l’interazione con alcune classi di anticorpi a seguito della loro aggregazione su antigeni multivalenti; (ii) la via alternativa, che coinvolge la proteina C3, che si attiva spontaneamente senza anticorpi; e (iii) la via della lectina, che si attiva in presenza di residui di mannosio presenti sulla superficie microbica.

In condizioni fisiologiche, la via alternativa del complemento viene attivata spontaneamente e in modo continuativo per garantire la sorveglianza immunitaria e la rimozione di detriti cellulari<7>.

Nel corso di un’infezione batterica e/o di un’infiammazione cronica, tale via viene attivata e induce un’amplificazione della risposta infiammatoria .

Uno dei regolatori chiave della via alternativa del complemento è rappresentato dal fattore H (FH), una glicoproteina sierica di 150 kDa.

Il ruolo di FH consiste nell’inibire l’attivazione del complemento legandosi a C3b, ottenuto in seguito a clivaggio di C3 da parte di un enzima convertasi. Inoltre, FH agisce anche come cofattore del fattore I, che induce l’inattivazione proteolitica di C3b ed accelera il decadimento della convertasi della via alternativa del complemento (ovvero C3bBb)<8>.

FH è fondamentale in situazioni in cui vi sia un’ attivazione del complemento, con successiva deposizione C3b sulle cellule b

La regolazione della via alternativa si esplica sia in circolo che sulle superfici cellulari.

In fase fluida, il FH si lega tempestivamente al C3b circolante. Sulla superfìcie cellulare, Γ inattivazione di C3b dipende dal FH, che interagisce con varie proteine regolatrici di membrana. Infatti, FH ha una innata affinità per alcune molecole presenti sulla membrana cellulare tra cui i polianioni (es. acidi sialici, i glicosaminoglicani o i polisaccaridi solfati), che ne favoriscono il riconoscimento e del il legame con la componente attivata del complemento, C3b, presente sulla superficie cellulare<9-10>.

È noto che i pazienti affetti da anemia falciforme sono caratterizzati da un 'amplificata attivazione della via alternativa del complemento e da una contemporanea riduzione dei valori plasmatici di FH 11-12,

Ad oggi gli interventi terapeutici durante le crisi vaso-occlusive acute sono limitati e si basano essenzialmente su terapia di supporto (trasfusione, idratazione, trattamento del dolore). Questo si traduce in un’elevata morbidità e mortalità per crisi vaso-occlusiva acuta in pazienti falcemici giovani adulti.

Il problema alla base della presente invenzione è stato quello di mettere a disposizione una molecola che sia in grado di interferire con il meccanismo di adesione dei globuli rossi alFendotelio vascolare attivato dalla cascata infiammatoria, al Fine di prevenire crisi di tipo vaso -occlusive acute in pazienti affetti da anemia falcifome. Sommario dell' invenzione

La Richiedente ha trovato sorprendentemente che la somministrazione del fattore H o suo frammento è altamente efficace nel trattamento e / o prevenzione della formazione di eterotrombi in pazienti affetti da anemia falciforme, prevenendo l’adesione dei globuli rossi falcemici al tessuto endoteliale attivato dall’infiammazione.

Secondo le conoscenze attuali della Richiedente, non è mai stato riportato ad oggi che un intervento basato sulla prevenzione dell’adesione dei globuli rossi all’endotelio attivato mediante somministrazione di FH, o un suo frammento o una composizione contenente FH, influenzi la formazione di eterotrombi nel torrente micro circolatorio in pazienti affetti da anemia.

Pertanto, in un primo aspetto, la presente invenzione mette a disposizione il fattore H o un suo frammento per l’uso in un metodo di trattamento e/o prevenzione della formazione di trombi in pazienti affetti da anemia falciforme, mediante neutralizzazione o deplezione della proteina C3b.

Preferibilmente, detto fattore H o un suo frammento è selezionato dal gruppo costituito dal frammento 19-20 e dal frammento 6-8, preferibilmente è il frammento 19-20.

Preferibilmente, la concentrazione di detto fattore H o suo frammento è compresa tra 16nM e 20nM, preferibilmente è 18nM.

In un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione comprendente il fattore H o suo frammento per l’uso in un metodo di trattamento e/o prevenzione della formazione di eterotrombi in pazienti affetti da anemia falciforme, mediante neutralizzazione o deplezione della proteina C3b.

Preferibilmente, detta composizione comprende fattore H o un suo frammento, idrossiurea e almeno un vettore o adiuvante accettabile farmaceuticamente .

Preferibilmente, la concentrazione dell’idrossiurea nella composizione è scelta in modo da avere un dosaggio di somministrazione compreso tra 10 mg/ kg e 25 mg/ kg.

Preferibilmente, Talmeno un vettore o adiuvante accettabile farmaceuticamente è scelto tra acqua e soluzione fisiologica.

Preferibilmente, il frammento di detta composizione è selezionato dal gruppo costituito dal frammento 19-20 e dal frammento 6-8, preferibilmente è il frammento 19-20.

Preferibilmente, la concentrazione di detto fattore H o suo frammento della composizione è compresa tra 16nM e 20nM, preferibilmente è 18nM.

Breve descrizione delle figure

La figura 1A mostra un grafico a barre dei livelli plasmatici di C5a in soggetti di controllo (Ctrl) sani (AA) ed in individui affetti da sindrome falciforme ( sickle celi disease, SCD). I campioni di plasma sono stati analizzati tramite ELISA e i dati sono espressi come media ± DS (n=10 in ogni gruppo; *p<0.05 Crtl vs SCD).

La figura IB(a) rappresenta l’analisi Western-blot (Wb) con anticorpo specifico per FH del siero di soggetti di controllo (Ctrl) sani (AA) ed di individui affetti da anemia falciforme (SCD). Il FH commerciale e’ stato usato come controllo interno. I livelli di IgG sono stati utilizzati come controllo del corretto bilanciamento nella semina dei campioni nel gel. Viene mostrato un Western blot rappresentativo (29 pazienti analizzati in ogni gruppo ) .

La Fig. lB(b) rappresenta ranalisi densitometrica (DU: unità densitometrica) dei campioni analizzati (*p<0.05 Crtl vs SCD).

La figura 1C mostra un grafico dei livelli plasmatici di FH in soggetti di controllo (Ctrl) sani (AA) e in individui affetti da sindrome falciforme (SCD). I campioni di plasma sono stati analizzati tramite ELISA e i dati sono espressi come media ± DS (n=16 in ogni gruppo; *p<0.05 Crtl vs SCD).

La figura 1D mostra un grafico della correlazione tra i livelli plasmatici di fattore H (FH) ed emoglobina (Hb) in soggetti di controllo sani (Controllo: cerchio bianco) e in individui affetti da sindrome falciforme (SCD: cerchio pieno nero).

La figura 1E mostra un grafico della percentuale di globuli rossi (RBCs) C3b positivi (C3b+) in soggetti sani di controllo (Ctrl; AA) e in pazienti affetti da sindrome falciforme (SCD) (n=10 controlli; n=12 SCD). La linea tratteggiata indica la soglia di normalità pari ad una quota di globuli rosi C3b+ <0.5%. I dati sono espressi come media DS; *p<0.05 Crtl vs SCD.

La figura 2A mostra un grafico dell’adesione dei globuli rossi (RBCs) di donatore sano e di soggetto falcemico (SCD) su endotelio (EA926.hy) non attivato e attivato (mediante pre-trattamento con TNF-a) espressa come cellule /mm<2>. I dati rappresentati si riferiscono a 6 diverse prove sperimentali comparabili. Tutte le analisi statistiche sono state condotte usando il software thè IBM SPSS 20.0 (IBM Ine., Armonk, NY). L’adesione è stata espressa come valore medio con un intervallo minimo-massimo e sono state indicate le medie. I dati ottenuti sono stati quindi analizzati con test Mann-Whitney test {*) o Wilcoxon signedrank test (#) .

La figura 2B(a) rappresenta un’analisi di Western-blot (Wb) con anticorpo specifico per C5aR delle cellule endoteliali dopo gli esperimenti di flusso; corsia (lane) 1 e 2: in presenza o assenza di attivazione TNF-a mediata; corsia (lane) 3 e 4 in presenza di attivazione con TNF-α e di globuli rossi (RBCs) di controllo sano (Ctrl, AA) o di individui affetti da sindrome falciforme (SCD). Viene mostrato un Western blot rappresentativo di 6 pazienti diversi.

La Figura 2B(b) rappresenta Tanalisi de n sitometrica (DU: unità densitometrica) dei campioni analizzati; *p<0.05 TNF-a vs TNF-a e globuli rossi. I dati sono espressi come rapporto C5aR/actina, i valori sono presentati come media ± DS. L’actina è stata utilizzata come controllo della quantità di proteine caricate in ogni pozzetto del gel.

La figura 2C mostra un grafico di una curva dose-risposta: i globuli rossi di donatore sano (controllo: AA) e falcemico (sindrome falciforme; SCD) sono stati testati in perfusione per 6 minuti su endotelio non attivato e attivato in presenza di dosi crescenti di fattore H (FH). I dati mostrati sono il risultato di 6 diversi esperimenti.

La figura 3A mostra un grafico dell’adesione da soggetto falcemico (SCD) valutata in perfusione per 6 minuti su endotelio non attivato e attivato (+/- TNF-α) in presenza di FH alle concentrazioni finali rispettivamente di 9 nM e 18 nM. I dati mostrati sono il risultato di 6 esperimenti separati. Wilcoxon test: * indica la corrispondente significatività nella figura. Tutte le analisi statistiche sono state condotte usando il software thè IBM SPSS 20.0 (IBM Ine., Armonk, NY}. L’adesione è stata espressa come valore medio con un intervallo minimo-massimo e sono state indicate le medie. I dati ottenuti sono stati quindi analizzati con Wilcoxon signed-rank test per campioni appaiati. Si è considerato statisticamente significativo un valore di p<0.05 .

La figura 3B mostra un grafico dell’adesione dei globuli rossi da soggetto falcemico (SCD) valutata in perfusione per 6 minuti su endotelio non attivato e attivato con TNF-α in presenza di FH e di due suoi frammenti 19-20 e 6-8, alla concentrazione finale di 18 nM. I dati mostrati sono il risultato di 6 diversi esperimenti. Tutte le analisi statistiche sono state condotte usando il software thè IBM SPSS 20.0 (IBM Ine., Armonk, NY). L’adesione è stata espressa come valore medio con un intervallo minimo-massimo e sono state indicate le medie. I dati ottenuti sono stati quindi analizzati con Wilcoxon signed-rank test per campioni appaiati. Si è considerato statisticamente significativo un valore di p<0.05 .

La figura 4 mostra un grafico di adesione dei globuli rossi (RBCs) da soggetto affetto da anemia falciforme valutata in perfusione per 6 minuti su endotelio attivato (trattato con TNF-α) in presenza della solo K emina (50 μΜ concentrazione finale) e di quest’ultima in copre senza di FH o del suo frammento 19-20, entrambi alla concentrazione finale di 18 nM. I dati mostrati sono il risultato di almeno 3 esperimenti separati. Tutte le analisi statistiche sono state condotte usando il software thè IBM SPSS 20.0 (IBM Ine., Armonk, NY). L’adesione è stata espressa come valore medio con un intervallo minimo-massimo e sono state indicate le medie. I dati ottenuti sono stati quindi analizzati con Wilcoxon signed-rank test per campioni appaiati. Si è considerato statisticamente significativo un valore di p<0.05 .

La figura 5 A mostra un grafico di una traiettoria esemplificativa di tre globuli rossi da donatore sano (controllo, AA) rappresentativi in una finestra di osservazione: ciascuna coordinata indica il centro del globulo in ogni fotogramma successivo (asse x= spostamento in orizzontale espresso in pm; asse y= spostamento in verticale espresso pm).

La figura 5B mostra un grafico di una traiettoria esemplificativa di tre globuli rossi falcemici (SCD) rappresentativi in una finestra di osservazione: ciascuna coordinata indica il centro del globulo in ogni fotogramma successivo (asse x= spostamento in orizzontale espresso in pm; asse y= spostamento in verticale espresso pm).

La figura 5C mostra un grafico di una traiettoria esemplificativa di tre globuli rossi falcemici trattati con FH (SCD FH) rappresentativi in una finestra di osservazione: ciascuna coordinata indica il centro del globulo in ogni fotogramma successivo (asse x= spostamento in orizzontale espresso in pm; asse y= spostamento in verticale espresso pm ) .

La figura 5D mostra un grafico di una traiettoria esemplificativa di tre globuli rossi falcemici trattati con frammento 19-20 di FH (SCD FH 19-20) rappresentativi in una finestra di osservazione: ciascuna coordinata indica il centro del globulo in ogni fotogramma successivo (asse x= spostamento in orizzontale espresso in pm; asse y= spostamento in verticale espresso pm ).

La figura 5E mostra un grafico dei valori assoluti della velocità trasversale istantanea di globuli rossi di soggetti controllo sani (AA), di pazienti affetti da anemia falciforme (SCD), pazienti affetti da anemia falciforme (SCD) in presenza di FH (SCD FH) o del suo frammento 19-20 (SCD FH 19-20). I dati sono espressi come media ±SD di 3 esperimenti separati su tre diversi individui sani o con anemia falciforme.

Descrizione dettagliata

Con il termine “anemia falciforme” si intende comprendere lo stato omozigote (SS) e gli stati di eterozigosi composte (SC o 5β) dell’emoglobina patologica (HbS) .

Con il termine “endotelio attivato” si intende un fenomeno per cui le cellule dell’endotelio vascolare espongono sulla loro superficie molecole di adesione come VCAM-1 (vascular celi adhesion molecule-1), ICAM-1 (inflammatory celi adhesion molecule-1) o CD36 in risposta ad uno stimolo infiammatorio, in particolare quello mediato da TNF-alfa.

Con il termine “eterotrombo” si intende una massa solida, costituita da globuli rossi, globuli bianchi, piastrine e fibrina, che si forma nei vasi sanguigni o nel cuore, in diverse condizioni patologiche (trombosi), e può talora disgregarsi, con formazione di emboli che danno luogo a una tromboembolia, localizzandosi in varie sedi.

Con il termine “frammento” riferito al fattore H, si intende un frammento della glicoproteina fattore H ottenuto mediante un procedimento secondo il metodo descritto nella pubblicazione scientifica di Jokiranta et al·.<27>.

Il fattore H o un suo frammento e composizioni secondo l'invenzione possono essere somministrati con qualsiasi sistema di somministrazione disponibile ed efficiente, comprendente, ma non limitato a, orale, buccale, parenterale, via inalatoria, applicazione topica, per iniezione, per via transdermica o rettale (per es. mediante supposte) in formulazioni di unità di dosaggio convenzionali farmaceuticamente accettabili e vettori, adiuvanti e veicoli non tossici.

Esempi di vettori e adiuvanti accettabili farmaceuticamente comprendono, ma non sono limitati a acqua e soluzione fisiologica.

La somministrazione per via parenterale comprende tecniche sottocutanee, endovenose, intramuscolari, iniezione o infusione in trasternale.

Le forme di dosaggio solide per la somministrazione per via orale comprendono, per esempio, capsule, compresse, polveri, granuli e gel. In tali forme di dosaggio solide, il composto agente terapeutico può essere miscelato con almeno un diluente inerte come, per esempio, saccarosio, lattosio o amido. Queste forme di dosaggio comprendono normalmente anche altre sostanze diverse da diluenti inerti, quali, ad esempio, agenti come magnesio stearato lubrificante.

I preparati iniettabili, per esempio soluzioni acquose o oleose iniettabili sterili o sospensioni, possono essere formulate secondo la tecnica nota e opzionalmente utilizzando un'adeguata dispersione, agenti umettanti e/o di sospensione,

II dosaggio medio giornaliero degli agenti terapeutici secondo la presente invenzione dipende da molti fattori, quali, ad esempio, la gravità della malattia e le condizioni del paziente (età, peso, sesso}.

La dose può variare generalmente tra 0,001 mg a 1500 mg al giorno di composto secondo l'invenzione, eventualmente suddivisi in più somministrazioni.

In considerazione della gravità dei fenomeno di crisi vasoocclusive acute in pazienti affetti da anemia falciforme, la presente invenzione consente di ottenere effetti di prevenzione e/o trattamento terapeutico della formazione di eterotrombi, attraverso la prevenzione dell’adesione dei globuli rossi all’endotelio attivato.

Il fattore H o un suo frammento e le composizioni secondo la presente invenzione sono adatti ad essere utilizzati nel trattamento della formazione di eterotrombi come singolo agente terapeutico o anche in combinazione con altri agenti impiegati per il trattamento di fondo di questa patologia come l’idrossiurea (HU).

Infatti, l’impiego di idrossiurea vantaggiosamente favorisce una riduzione di ne atro fi li e piastrine e modula l’espressione di antigeni di adesione dell’endotelio vascolare come VCAM-1 e ICAM-l<30-33>.

In particolare, gli agenti terapeutici secondo la presente invenzione offrono un nuovo approccio strategico per trattare e/o prevenire la formazione di eterotreombi nella microcircolazione e ridurre sensibilmente le insorgenze di crisi vaso -occlusive acute, migliorando la sopravvivenza e la qualità della vita di questi pazienti.

La presente invenzione sarà ulteriormente descritta con riferimento ai disegni allegati e certe realizzazioni, che sono fomiti qui di seguito a titolo illustrativo e non limitativo.

Esempio 1

I pazienti falcemici presentano attivazione della via alternativa del complemento associata a ridotti livelli di FH circolante,

I pazienti selezionati erano di discendenza africana, affetti da anemia falciforme e non erano in trattamento con idrossiurea né sottoposti a terapia trasfusionale da almeno 6 mesi. I pazienti sono stati studiati in condizione di benessere e in un periodo di tempo distante da crisi vaso-occlusive acute collegate alla patologia.

Sono stati analizzati i livelli sierici di C3 e C4 nei pazienti affetti da anemia falciforme (SCD) e quelli in pazienti sani di controllo e sono stati riscontrati i seguenti valori: livello di C3 pari a 1.01 g/L (intervallo 0.85-1.32 g/L) e di C4 pari a 0.27 g/L (intervallo 0.20-0.41 g/L)·

Tali parametri risultavano simili a quelli della popolazione sana. L’anafilotossina del complemento C5a era significativamente aumentata nei soggetti drepanocitici rispetto alla popolazione sana di controllo (Fig. 1A).

Successivamente sono stati valutati i livelli sierici di FH attraverso 2 differenti metodiche: immunoblot (Figg. IB(a) e (h)} ed ELISA (Fig. 1C) ed entrambi gli approcci hanno documentato una significativa riduzione dei livelli di FH nei soggetti SCD.

In particolare, è stata osservata una differenza di concentrazione piasmatica di FH (mediante tecnica ELISA) nei due gruppi pari a 150 pg/ml (significatività statistica determinata mediante test di Wilcoxon Ranksum) .

È stata quindi eseguita un’analisi statistica per valutare le possibili correlazioni tra livelli di FH osservati in pazienti affetti da anemia falciforme e l’emolisi (ad esempio, LDH) o l’anemia (ridotti livelli di emoglobina) .

La figura 1D mostra la diretta correlazione tra i livelli di FH e quelli dell’emoglobina.

Questi dati suggeriscono l’attivazione del complemento nei pazienti affetti da fibrosi cistica e la mancanza di regolazione dovuta ai bassi livelli di FH.

Tale ipotesi funzionale è stata confermata dalla presenza in circolo di una sotto popolazione di globuli rossi C3b+ non rilevabile nei controlli normali (0, 1-0,4%), come mostrato in figura 1E.

Poiché il riscontro di globuli rossi con C3b+ superiore a 0,5% è da considerare indicativo di un’attivazione della via alternativa del complemento, è stato verificato ex-vivo se FH utilizzato come agente a n ti- aderente, è in grado di prevenire /ridurre l’adesione dei globuli rossi falcemici alla superficie dell’endotelio vascolare attivato.

Esempio 2

U FH previene l’adesione dei globuli rossi falcemia alV endotelio vascolare attivato via TNF-a.

È stata valutata in tempo reale l’adesione dei globuli rossi di soggetti sani e di pazienti affetti da anemia falciforme ex-vivo sull’endotelio vascolare non attivato o attivato dalla citochina proinfiammatoria TNF-a<15>(test precedenti in microcamera di flusso hanno dimostrato l’adesione dei globuli rossi falcemici ex-vivo alla superfìcie del endotelio vascolare attivato cellulare ).

I globuli rossi sono stati separati dal plasma, lavati in tampone fosfato e risospesi in terreno privo di siero<16-17>.

È stato osservato un significativo aumento dell’adesione dei globuli rossi di soggetti falcemici all’endotelio TNF-α attivato rispetto ai controlli normali (Fig. 2A). Al termine degli esperimenti di flusso, i globuli rossi adesi sono stati lisati e le cellule endoteliali sono state sottoposte ad analisi in immunobloting con anticorpi specifici per il recettore del C5a (C5aR) .

La figura 2B(a) mostra un aumento dell’espressione di C5aR nell’endotelio attivato con TNF-α (corsia 2), la presenza di globuli rossi normali e patologici aumentava significativamente l’espressione di C5aR (corsie 3 e 4), dimostrando quindi che il passaggio dei globuli rossi sull’endotelio attivato aumenta l’espressione di C5aR sulla superficie dell’endotelio vascolare ex-vivo rispetto all’azione del solo TNF-α<18>. I dati ottenuti sono stati espressi in forma di grafico riportato in Fig. 2B(b).

Sulla base di questi dati, è stata valutata l’influenza di FH sull’adesione dei globuli rossi normali e patologici all’endotelio vascolare attivato, impiegando FH commercialmente disponibile fornito da EMD Millipore ed estratto da siero umano fornito da Merck-Millipore (purezza pari a > 95% valutata con metodica SDS-page)<19-21>.

La curva dose-risposta con FH ha evidenziato una significativa riduzione di adesione degli eritrociti con concentrazioni > 9 nM (dosi testate 9, 18, 27 nM; Fig. 2C).

In seguito, sono state utilizzate le concentrazioni di FH pari a 9 e 18 nM in esperimenti separati con globuli rossi patologici di tutti soggetti studiati.

È stato osservato che entrambe le concentrazioni di FH riducono in modo significativo l’adesione dei globuli rossi patologici aH’endotelio vascolare soprattutto alla concentrazione di FH pari a 18 nM (Fig. 3A).

Studi computazionali e di design proteico hanno individuato in due regioni del FH, il frammento 6-8<28>-<29>ed il frammento 19-20<27>, i siti putativi di interazione con il frammento C3b del complemento<22>.

Il frammento 19-20 è indispensabile per il legame del FH al C3b legato covalentemente alle cellule, mentre il framento 6-8 riconosce i glicosaminoglicani presenti sulle superfici cellulari<23-24>.

I dati in camera di flusso su endotelio TNF-α attivato hanno evidenziato la maggiore efficienza del frammento 19-20 (18 nM) nel prevenire l’adesione dei globuli rossi falcemici alla superficie dell’endotelio attivato rispetto al frammento 6-8 utilizzato alla stessa molarità (Fig. 3B).

Questi risultati hanno indicato che FH previene l’adesione dei globuli rossi falcemici alla superficie deirendotelio tramite la sua interazione con il C3b presente sulla superficie delle emazie patologiche (Fig. 1E).

Esempio 3

li fattore H migliora ex-vivo la traiettoria e la velocità di transito dei globuli rossi falcemici sulla superficie dell’ endotelio attivato con TNF-a.

Le registrazioni in tempo reale del comportamento pro-adesivo dei globuli rossi sono state analizzate tramite un algoritmo sviluppato appositamente (si veda il paragrafo “Metodi") che ha permesso di evidenziare il comportamento del tutto peculiare dei globuli rossi falcemici nel transito sull’endotelio vascolare attivato rispetto ai globuli rossi normali.

È stato osservato che il moto di ciascun globulo rosso falcemico è irregolare nello spazio e non uniforme nel tempo (Fig. 5A), come derivabile dalle traiettorie del moto di quest’ultimo proiettate nel piano cartesiano (in cui x corrisponde alla direzione del flusso e y alla direzione ad esso trasversale) e dalla presenza di frequenti fenomeni di “arresto e ripresa” determinati dai ripetuti urti contro l’endotelio vascolare attivato.

Diversamente, è stato osservato che il profilo del moto dei globuli rossi sani di controllo è regolare ed uniforme e si mantiene in ogni istante parallelo al flusso (Fig. 5 B).

I dati ottenuti evidenziavano che i globuli rossi sani transitano più rapidamente ed in modo rettilineo al flusso nella finestra di osservazione rispetto ai globuli falcemici (0.8- 1.2 secondi vs 1.7-2 secondi, rispettivamente; P<0.05 SCD vs controllo).

Inoltre, i globuli rossi falcemici mostravano un valore assoluto di velocità istantanea trasversale pari a 40.86+27.69 pm/s, mentre i globuli rossi sani mostrano una velocità istantanea di 5.64+4.93 pm/s, con una riduzione diminuzione media del 86.20% rispetto ai soggetti faìcemici.

È stata quindi testata l’influenza di FH sul moto dei globuli rossi ed è stato osservato che il fattore H, alla concentrazione di 18 nM, era in grado di regolarizzare la traiettoria dei globuli rossi faìcemici (Fig. 5 C), con una riduzione della componente trasversale della velocità a 7.71+6.75 pm/s (diminuzione media del 81.13% rispetto ai globuli rossi faìcemici non trattati).

È stata testata anche l’influenza del frammento 19-20 di FH sul moto dei globuli rossi ed è stato osservato che il frammento 19-20 di FH, alla concentrazione di 18 nM, era in grado di regolarizzare la traiettoria dei globuli rossi faìcemici (Fig. 5D), con una riduzione della componente trasversale della velocità rispetto ai globuli rossi faìcemici non trattati).

In figura 5E, viene mostrato il riepilogo dei singoli esperimenti e l’analisi statistica considerando la traiettoria nel tempo di osservazione prefissato come indicato negli esempi in figura 5A, 33, C, D. La figura 5E mostra come lo spostamento dei globuli rossi faìcemici dei campioni trattati con FH o con il suo frammento 19-20 è simile a quello del campione di controllo (AA).

Questi risultati mostrano che la presenza di FH contribuisce in modo importante sulla traiettoria ed i tempi di transito dei globuli rossi falcemici, riducendo pertanto la loro disponibilità ad aderire all’endotelio vascolare attivato.

Esempio 4

L’eme libero blocca attività funzionale del FH come agente antiadesivo.

L’anemia falciforme è caratterizzata da emolisi cronica con saturazione dei sistemi fisiologici di legame per emoglobina e per il gruppo eme (come aptoglobina e empopexina). I pazienti con drepanocitosi presentano livelli elevati del gruppo eme lìbero piasmatico che contribuisce all’attivazione e al danno dell’endotelio vascolare<34>.

Recentemente è stato evidenziato che il frammento 19-20 di FH è sede del legame del gruppo eme e che questa interazione riduce la capacità inibitoria del fattore H sull’attività del complemento<35>,

La figura 4, infatti, mostra che la presenza di eme libero riduce l’efficienza del FH nel prevenire l’adesione dei globuli rossi falcemici alla superficie dell’endotelio attivato con TNF-a, supportando la nostra ipotesi di lavoro di una disregolazione del FH nei soggetti falcemici.

Metodi

Saggio ELISA

Le concentrazioni piasmatiche di C5a e di FH sono state valutate utilizzando il test ELISA MicroVue C5a Plus (QUIDEL<®>, San Diego, CA, USA), secondo le istruzioni del produttore. I campioni di plasma sono stati analizzati utilizzando una diluizione 1:20 e Human Complement Factor H ELISA kit; Hycult Biotech, Uden, The Netherlands. (Serum samples were assayed in duplicate, at 1:800 diluition) .

Le concentrazioni sono state calcolate utilizzando le curve standard generate con norme specifiche fomite dai produttori. La densità ottica è stata misurata a 450 nm mediante il lettore di micropiastre TECAN Alba III (Tecan, Mànnedorf, CH}. Ogni campione è stato misurato in duplicato.

Western blot

I reagenti NaCl, TRIS, Tween-20, β-mercapto etanolo, glieina, glicerol o, blu di bromofenolo, sodio dodecil solfato (SDS), metanolo sono forniti da Sigma- Aldrich<®>; la poliacrilamide è fornita da Bio-Rad<®>(Biorad, Hercules, CA, USA}.

I livelli sierici di FH sono stati valutati in sieri di soggetti sani e pazienti affetti da SCD ad una diluzione di 1:20 e rilevati utilizzando l’anticorpo monoclonale anti-FH (L20/3), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA).

Per la valutazione di C5aR in cellule endoteliali dopo gli esperimenti di flusso, le proteine delle cellule endoteliali lisate in RIPA sono state quantificate mediante il test di analisi di proteine Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientifìc, Waltham, MA, USA).

In dettaglio, 60 mg di proteine sono state disciolte nel tampone di solubilizzazione (50 mM Tris pH 6.8, 100 mM βmercaptoetanolo, 2% v/v SDS, 10% v/v glicerolo, tre gocce di blu di bromofenolo) , sottoposte a corsa elettroforetica in gel di poliacrilamìde al 12% in condizioni riducenti e quindi assorbite su una membrana di PVDF utilizzando la struttura Mini Trans-Blot<®>Cell (Bio-Rad<®>). Le membrane sono state incubate con il tampone di bloccaggio (3% w/v BSA in tampone Tris-NaCl e 0.1% v/v Tween-20) e quindi esposte all’anticorpo monoclonale anti-C5aR umano (Abcam, Cambridge, UK), diluito 1: 1,000; in agitazione per una notte a 4°C. Dopo il lavaggio con TBS-T (TBS-T 10X, 50 mM Tris pH 7.5, 170 mM NaCl, 0.2% v/v Tween) e Tincubazione con l a n ti corpo secondario anti-topo HRP-legato diluito 1:5,000 (Abcam) per 1 ora a 22°C, gli immunocomplessi sono stati rivelati attraverso chemioluminescenza utilizzando il reagente ECL Plus (GE Healthcare Life B io Science s/Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Le immagini sono state acquisite mediante il sistema Image Quant Las Mini 4000 Digital Imaging System (GE Healthcare Life Sciences, Freiburg, Germany), ottimizzando il tempo di esposizione in base all Intensità delle bande delle proteine. Le membrane sono state successivamente lavate mediante l’aggiunta di una soluzione acida, in agitazione per 30 minuti a 37°C e incubate successivamente con l’anticorpo monoclonale anti-P-Actina umana diluito 1: 1,000 (ProSci Incorporated, Poway, CA, USA) per confermare l’eguale concentrazione di campione caricato sul gel e Γ efficienza del trasferimento elettroforetico. L’analisi densitometrica delle bande è stata realizzata utilizzando il software Quantity One (Bio-Rad<®>).

Test di adesione dei qlobuli rossi in camera di flusso su endotelio attivato

Generazione un mono strato di cellule endoteliah immortalizzate.

Le cellule endoteliali EA926.hy umane immortalizzate sono state ottenute dalla linea di cellule endoteliali HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) e cresciute come mono- strato nel medium DMEM 10% FCS (Dulbecco' s modified Eagle Medium).

Per effettuare gli esperimenti in camera di flusso, le cellule EA926.hy sono state fatte crescere su vetrino e tenute in coltura sino al raggiungimento della confluenza (verificata al microscopio ottico).

Come controllo per validare le proprietà cito-adesive della linea immortalizzata, è stata usata una linea primaria di endotelio (HUVEC)<25>.

Le cellule endoteliali sono state trattate per 4 ore a 37<C>C con TNF-α (20 ng/mL) addizionato nel mezzo di coltura privo di siero.

Per verificare l'awenuta attivazione mediata dalla citochina, alcuni vetrini di cellule endoteliali non sono stati attivati e sono stati invece incubati in terreno privo di siero per un tempo equivalente a quello richiesto per il trattamento con TNF-a<15>.

- Marcatura e perfusione dei globuli rossi in camera di flusso. I globuli rossi di pazienti falcemici e di pazienti donatori sani sono stati separati tramite centrifugazione (2400 gpm per 3 minuti)<16>. Una volta rimosso il plasma e una sospensione costituita principalmente da leuciti e piastrine ( buffy-coat J, sono stati lavati in soluzione salina contenente 140 mmol di NaCl, 5 mmol di KC1 a pH 7.4 e 1% di albumina bovina. Le emazie sono state risospese nella stessa soluzione in presenza di CFDA-SE 70 pM (carbossifluoreseeina succinimidil estere diacetato) e mantenute in incubazione a 37°C per un'ora al buio.

I globuli rossi così marcati sono stati lavati tre volte con buffer fosfato (PBS) e risospesi nello stesso con ematocrito di 0.2% in presenza di albumina bovina 1%. I globuli rossi marcati sono stati quindi perfusi nella camera di flusso<17>.

I globuli rossi marcati, prima di venire perfusi sull’endotelio, sono stati sottoposti per 10 min ai seguenti trattamenti (uno per prova sperimentale) effettuati a 37°C:

- 1 . solo marcatura

- 2. incubazione con Fattore H alle concentrazioni di 9 e 18 nM

- 3. incubazione con frammento 19-20 del fattore H alle concentrazioni di 9 e 18 nM

- 4. incubazione con frammento 6-8 (peptide di controllo) del fattore H alle concentrazioni di 9 e 18 nM.

Gli stessi trattamenti sono stati fatti anche sull’endotelio che è stato successivamente perfuso con i globuli rossi marcati.

- Prove di perfusione e sistema di flusso

Per mimare le condizioni di flusso presenti all’interno dei vasi sanguigni, è stata utilizzata una cameretta di perfusione costituita da un supporto metallico, una membrana di silicone rettangolare (2,4 cm x 5 cm x 0.0125 mm; LPI) e da una struttura con due canali in plexiglass 26.

Una volta assemblata e sigillata con viti metalliche, la camera presenta un canale di ingresso e uno di uscita che possono essere collegati mediante dei raccordi di gomma alla pompa peristaltica che, grazie ad una siringa, è in grado di richiamare il flusso generando il gradiente di velocità desiderato (30 sec<1>)<3>.

Negli studi dinamici la sospensione contenente le emazie (HTC 0.2%), è stata perfusa su un mono strato di cellule endoteliali immortalizzate (EA926.hy) con uno gradiente di velocità pari a 30 sec<1>. La perfusione è stata seguita per 10 minuti, durante i quali sono stati esaminati dieci differenti sedi lungo una linea flusso-orientata ogni tre minuti per valutare l'adesione cellulare.

La camera di flusso è stata posizionata nell’apposito alloggiamento presente sul tavolinetto di un microscopio invertito equipaggiato con una illuminazione epifluorescente (Diaphot-TMD ; Nikon Instech, Shinagawa-ku, Japan), intensificata con una videocamera CCD (C-2400-87; Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan) e con i filtri appropriati.

L’area totale del campo ottico di osservazione corrisponde approssimativamente ad una superficie di 0.007 mm<2>. La sospensione cellulare è stata aspirata attraverso la camera con una pompa a siringa (Harvard Apparatus, Hollistone, MA) ad un flusso calcolato per ottenere sulla superfìcie endoteliale lo shear stress desiderato. Gli esperimenti sono stati registrati su supporto magnetico in tempo reale alla velocità di 25 immagini/ sec, che corrisponde ad un tempo di risoluzione pari a 0.04 sec.

Protocollo di lisi dei globuli rossi e delle cellule endoteliali dopo flusso.

Terminata la perfusione, il vetrino contenente l’endotelio e i globuli rossi adesi, è stato recuperato dalla camera di perfusione. Si è proceduto ad una lisi in due fasi: sono stati eliminati i globuli rossi adesi usando Tappo sito buffer “RBC lysis Buffer” (commercializzato da BD) portato alla concentrazione lx ed addizionano di inibitori di proteasi e metallo prò teasi (Sigma-Aldrich) e, successivamente, è avvenuta la lisi delle cellule endoteliali mediante RIPA buffer addizionato con gli stessi inibitori di cui sopra e incubato a temperatura ambiente per 8 minuti.

È stato quindi effettuato uno raschiamento del vetrino in modo da raccogliere il lisato ottenuto. Il lisato è stato perciò congelato per i test di proteomica.

Analisi di immagine (LB celi counter)

Ciascun video è stato digitalizzato e suddiviso in frame che successivamente sono stati analizzati mediante un software ideato e sviluppato dalla Richiedente nominato “LB Celi Counter”.

“LB Celi Counter” sfrutta la caratteristiche delle fotografie a lunga esposizione, nelle quali gli elementi mobili tendono a scomparire, mentre gli elementi immobili vengono impressi sull<1>immagine; allo stesso modo solo le cellule ferme vengono visualizzate.

Semplicemente effettuando una somma dei frame che costituiscono un campo di vista e dividendo per il numero di frame si ottiene una effetto analogo ad una lunga esposizione, L'immagine di partenza ha un fondo di illuminazione molto disomogeneo, per via della presenza di uno spot luminoso, al punto da rendere il fondo della zona centrale più luminoso rispetto ad un zona periferica con cellula adesa.

Per questo motivo è stato necessario effettuare una sottrazione del background con un calcolo del background dinamico, cioè su ogni immagine. E' stata utilizzata una funzione interpolante di 4 grado per tutte le righe delle immagini.

Per la parte di conta delle cellule si è sfruttato un algoritmo noto in letteratura fhttp: / /en. wikipedia.org/wiki/Flood fili).

Misurazione del movimento del singolo globulo rosso sull’endotelio attivato in condizioni di flusso.

Gli esperimenti sono stati eseguiti su un microscopio a fluorescenza invertito e registrati in tempo reale su video-cassetta alla velocità di 25 fotogrammi/ secondo, con una risoluzione temporale di 0,04 secondi.

Le cellule endoteliali attivate con TNF-α sono state seminate su un vetrino copri- oggetto che è stato successivamente alloggiato nella camera di flusso. Gli esperimenti sono stati eseguiti come riportato in precedenza.

Sequenze video selezionate sono state digitalizzate utilizzando il software VirtualDub.

L'analisi delle immagini è stata realizzata grazie all Stilizzo del software Volocity (Perkin Elmer) e di codici di programmazione sviluppati appositamente con Matlab R2014b (The MathWorks).

La traiettoria di ogni singolo globulo rosso è stato seguita utilizzando il software Volocity, dalla comparsa del globulo nel campo visivo sino alla sua scomparsa. Ciascun campo in questione corrisponde ad una regione fissa di 125 x 375 pixel, pari a un’ area di 50 x 150 micron (utilizzando il fattore di conversione di 0,4 micron / pixel) .

Per ciascun globulo rosso, ponendo la direzione del flusso sull’asse delle ordinate e la sua direzione perpendicolare sull’asse delle ascisse, sono stati calcolati il valore assoluto della velocità istantanea e il valore assoluto della velocità trasversale (espressi entrambe in pm/ secondo) grazie all’uso di MatLab.

Il calcolo si è basato proprio sulla definizione di tali entità fisiche:

| v | t = sqrt (vx 2 vy 2) t = sqrt ((Δχ / Δΐ) 2 (Ay / At) 2) t

| vy | t = | Ay / At | t = | (y t - y t-1) / (t - (t-1)) |

dove t corrisponde all’istante temporale in cui la valutazione è avvenuta e t-1 all’istante prima. Tutte le analisi computazionali sono state eseguite fotogramma per fotogramma per ciascun tempo di osservazione.

Analisi statistica

Le differenze nelle variabili di categoria sono state valutate usando il test di Fisher mentre il test di Wilcoxon Rank-sum è stato usato per la valutazione dell’eventuale effetto confondente dell’età dei soggetti. La significatività dei dati di adesione dinamica in camera di flusso sono stati valutati con t-test o con 2-way analisi di varianza (ANOVA) per misure ripetute tra soggetti sani e pazienti falcemici.

Tutte le analisi statistiche sono state condotte usando il software thè IBM SPSS 20.0 (IBM Ine., Armonk, NY). L'adesione è stata espressa come valore medio in un range minimo -massimo e sono state indicate le medie. I dati ottenuti sono stati quindi analizzati con Wilcoxon signed-rank test per campioni appaiati. Si è considerato statisticamente significativo un valore di P<0.05.

Misurandone dell’ attività funzionale di FH come agente antiadesivo in presenza di eme libero.

Gli esperimenti in presenza di emina sono stati condotti come descritto nella sezione a pag 24 e 25. Hemina, Numero CAS 16009-13-5 (ottenuta da Sigma-Aldrich) e’ stata aggiunta al mezzo di sospensione dei globuli rossi alla concentrazione di 50 uM come precedentemente descritto da Frimat M. et al (ref 35).

Bibliografia

1. De Franceschi L, Cappellini MD, Olivieri O. Thrombosis and sickle celi disease. Semin Thromb Hemost. 201 1;37(3):226-236.

2. De Franceschi L. Pathophisiology of sickle celi disease and new drugs for thè treatment. Mediterr J Hematol Infect Dis.

2009;l(l):e2009024.

3. Sabaa N, de Franceschi L, Bonnin P, et al. Endothelin receptor antagonism prevents hypoxia-induced mortality and morbidity in a mouse model of sickle-cell disease. J Clin lnvest. 2008; 118(5): 1924-1933.

4. Rato GJ, Hebbel RP, Steinherg MH, Gladwin MT. Vasculopathy in sickle celi disease: Biology, pathophysiology, genetics, translational medicine, and new research directions. Am J Hematol.

2009;84(9):6 18-625.

5. Hebbel RP. The systems biology-based argument for taking a bold step in chemoprophylaxis of sickle vasculopathy. Am J Hematol 2009;84(9): 543-545.

6. Hebbel RP. Adhesion of sickle red cells to endothelium: myths and future directions. Transfiis Clin Biol. 2008;15(l-2): 14-18.

7. Zipfel PF, Skerka C. Complement regulators and inhibitory proteins. Nat Rev Immunol. 2009;9(10):729-740.

8. Rodriguez de Cordoba S, Esparza-Gordillo J, Goicoechea de Gorge E, Lopez-Trascasa M, Sanchez-Corral P. The human complement factor H: functional roles, genetic variations and disease associations. Mol Immunol. 2004;41(4):355-367.

9. de Cordoba SR, de Jorge EG. Translational mini-review series on complement factor H: genetics and disease associations of human complement factor H. Clin Exp Immunol 2008; 151{1): 1-13.

10. Kajander T, Lehtinen MJ, Hyvarinen S, et al. Dual interaction of factor H with C3d and glycosaminoglycans in hostnonhost discrimination by complement. Proc Nati Acad Sci U S A.

2011; 108(7):2897-2902.

11. Koethe SM, Casper JT, Rodey GE. Alternative complement pathway activity in sera from patients with sickle celi disease. Clin Exp Immunol 1976;23(l):56-60.

12. Strauss RG, Asbrock T. Fonistal J, West CD. Alternative pathway of complement in sickle celi disease. Pediatr Res.

1977;ll(4):285-289.

13. Hebbel RP. Adhesive interactions of sickle erythrocytes with endothelium. J Clin lnvest. 1997; 100(11 Suppl):S83-86.

14. Montes RA, Eckman JR, Hsu LL, Wick TM. Sickle erythrocyte adherence to endothelium at low shear: role of shear stress in propagation of vaso-occlusion. Am J Hematol. 2002;70(3):2 16-227.

15. Lu ZY, Chen WC, Li YH, et al. TNF-alpha enhances vascular celi adhesion molecule-1 expression in human bone marrow mesenchymal stem cells via thè NF-kappaB, ERK and JNK signaling pathways. Mol Med Rep. 2016;14(l):643-648.

16. Barabino GA, Mclntire LV, Eskin SG, Sears DA, Udden M. Endothelial celi interactions with sickle celi, sickle trait, mechanically injured, and normal erythrocytes under controlled flow. Blood. 1987;70(1): 152-157.

17. Guchhait P, Dasgupta SK, Le A, Yellapragada S, Lopez JA, Thiagarajan P. Lactadherin mediates sickle celi adhesion to vascular endothelial cells in flowing blood. Haematologica, 2007;92(9):1266-1267.

18. Laudes IJ, Chu JC, Huber-Lang M, et al. Expression and function of C5a receptor in mouse microvascular endothelial cells. J Immunol 2002;169(10);5962-5970.

19. Zipfel PF, Jokiranta TS, Hellwage J, Koistinen V, Meri S, The factor H protein family. Immunopharmacology. 1999;42(l-3):53-60.

20. Fearon DT, Austen KF. Activation of thè alternative complement pathway due to resistance of zymosan-bound amplification convertase to endogenous regulatory mechanisms. Proc Nati Acad Sci U SA 1977;74(4); 1683-1687.

21. Pangburn MK, Muller-Eberhard HJ. The alternative pathway of complement. Sprìnger Semin Immunopathol 1984;7(2-3): 163-192.

22. Wu J, Wu YQ, Ricklin D, Janssen BJ}Lambris JD, Gros P. Structure of complement fragment C3b-factor H and implications for host protection by complement regulators. Nat Immunol 2009; 10(7) :728-733.

23. Morgan HP, Schmidt CQ, Guariento M, et al. Structural basis for engagement by complement factor H of C3b on a self surface. Nat Struct Mol Biol. 201 1; 18(4) :463-470.

24. Schramm EC, Roumenina LT, Rybkine T, et al. Mapping interactions between complement C3 and regulators using mutations in atypical hemolytic uremie syndrome. Blood. 2015;125(15):2359-2369.

25. Bauer J, Margolis M, Schreiner C, et al. In vitro model of angiogenesis using a human endothelium-derived permanent celi line: contributions of induced gene expression, G-proteins, and integrins. J Celi Physiol. 1992;153(3):437-449.

26. Mazzucato M, Cozzi MR, Battiston M, et al. Distinct spatio-temporal Ca2+ signaling elicited by integrin alpha2betal and glycoprotein VI under flow. Blood, 2009;114(13):2793-2801.

27. Sakari Jokiranta T., Hellwage J, Koistinen V, Zipfel P., and Meri S., Each of thè Three Binding Sites on Complementi Factor H Interacts with a Distinct Site on C3b, The Journal of Biological Chemistry, Voi. 275, No. 36, Issue of September 8, pp. 27657-27662, 2000.

28. Christoph Q. Schmidt, Andrew P, Herbert, David Kavanagh, Carina Gandy, Christopher J. Fenton, Bàrbel S. Blaum, Malcolm Lyon, Dusan Uhrin and Paul N. Barlow, A New Map of Glycosaminoglycan and C3b Binding Sites on Factor H, J Immunol 2008; 181:2610-2619.

29. Hugh P Morgan, Christoph Q Schmidt, Mara Guariento, Barbel S Blaum, Dominic Gìllespie, Andrew P Herbert, David Kavanagh, Haydyn D T Mertens, Dmitri I Svergun, Conny M Johansson, Dusan Uhrin, Paul N Barlow e Jonathan P Hannan, Structural basis for engagement by complement factor H of C3b on a self surface, Nat Struct Mol Biol. 2011 Apr; 18 (4) : 463-70.

30. Platt OS, Hydroxyurea for thè treatment of sickle celi anemia, NBngl JMed. 2008 Mar 27;358(13): 1362-9.

31. Saleh A, Hillen H, Duits A. Levels of endothelial, neutrophil and piatele!- specific factors in sickle celi anemia patients during hydroxyurea therapy. Acta Haematol 1999;102:31-37.

32. Charache S, Mechanism of action of hydroxyurea in thè management of sickle celi anemia in adults, Semin Hematol. 1997 Jul;34(3 Suppl 3): 15-21.

33. Yarbro JW, Mechanism of action of hydroxyurea, Semin Oncol. 1992 Jun;19{3 Suppl 9): 1-10.

34. Vinchi F, De Franceschi L, Ghigo A, Townes T, Cimino J, Silengo L, Hirsch E, Altruda F, Tolosano E,, Hemopexin therapy improves cardiovascular function by preventing heme-induced endothelial toxicity in mouse models of hemo^dic diseases, Circulation.

2013 Mar 26; 127(12): 1317-29.

35. Frimat M, Tabarin F, Dimitrov JD, Poitou C, Halbwachs-Mecarelli L, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT, Complement activation by heme as a secondary hit for atypical hemolytic uremie syndrome, Blood 2013 Jul 11; 122(2) :282-92.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1. Fattore H o un suo frammento per l’uso in un metodo di trattamento e/o prevenzione della formazione di eterotrombi in pazienti affetti da anemia falciforme, mediante neutralizzazione o deplezione della proteina C3b.
2. 2. Fattore H o un suo frammento per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto frammento è selezionato dal gruppo costituito dal frammento 19-20 e dal frammento 6-8, preferibilmente è il frammento 19-20.
3. 3. Fattore H o un suo frammento per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la concentrazione di detto fattore H o suo frammento è compresa tra 16nM e 20nM, preferibilmente è 18nM.
4. 4. Composizione comprendente il fattore H o suo frammento per l’uso in un metodo di trattamento e/o prevenzione della formazione di eterotrombi in pazienti affetti da anemia falciforme, mediante neutralizzazione o deplezione della proteina C3b.
5. 5. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 4, in cui detta composizione comprende fattore H o un suo frammento, idrossiurea e almeno un vettore o adiuvante accettabile farmaceuticamente scelto preferibilmente tra soluzione fisiologica e acqua.
6. 6. Composizione per l’uso secondo la rivendicazione 4 o 5, in cui detto frammento è selezionato dal gruppo costituito dal frammento 19-20 e dal frammento 6-8, preferibilmente è il frammento 19-20.
7. 7. Composizione per l’uso secondo una qualunque delle rivendicazioni da 4 a 6, in cui la concentrazione di detto fattore fi u sUu frammento è compresa tra 16nM e 20nM, preferibilmente è 18nM.