HU228695B1 - Nucleotide sequence mediating male fertility and method of using same - Google Patents

Description

A hibrid növények termesztésének fejlődése számottevő előnyöket eredményezhet a termesztett növények minőségében és menynylségében. A hibridizációs eljárások lehetővé teszik a hozamok növelését és a kívánatos tulajdonságok kombinálását, mint amilyenek a betegség- és rovarrezisztencia, a hő- és szárazságtörés, vagy a növények összetételének megváltoztatása. Ezek az eljárások gyakran a hímivarú szüiönövényre vannak alapozva, amelyek a pollent szolgáltatják a nőivarú szülőnövény száméra, hogy létrejöjjön a hibrid.

A szántóföldi növényeket olyan technikákkal termesztik, amelyek előnyt biztosítanak a növény megpcrzásí módjának, önmegporzó egy növény, ha az egyik virág virágpora ugyanazt a virágot vagy ugyanazon növényen egy másik virágot termékenyít meg. idegenmegporzás akkor történik, ha egy növény virágait egy másik növényről származó virágpor termékenyíti meg.

A káposzta (Brassioa) nemzetség növényei rendesen önsterilek és csak idegen megporzással terméksnyülnek. Az önbeporző növényeken — mint amilyen a szója vagy a gyapot - a no- és hímivarszervek anatómiailag egymás mellett helyezkednek el. A természetes beporzás során egy adott virág hímivarszerve által szolgáltatott virágpor (pollen) termékenyíti meg ugyanazon virág nőivé rszervét .

A kukorica (őea maya L.) egyedülálló helyzetet képvisel, mert mind önbeporzó, mind idegenheporzó technikákkal termeszthető. A kukoricának ugyanazon a növényen vannak hímvirágai, ameΛ 4

Ivek a címerben helyezkednek el, és vannak nővirá-gai, amelyek a kukorícacsőben helyezkednek el. A kukorica ön- vagy idegenbeporzéssel tsrmékenynihet meg. A kukorica természetes beporzása ügy történik meg, hegy a címerekből a virágport a szél viszi e csövek csúcsán kitüremfcedö „haj-ra, arai a bibeszálak tömege,

Sgy megbízható eljárás, amellyel a növények fertilitása szabályozható lenne, lehetőséget kínálna a. nővé.nynem.esítés javítására. Ez különösen igaz a kukoricahibridek nemesítésére, amelyek valamilyen hímsteril rendszeren alapulnak, és ahol egy nösteril rendszer csökkenthetné a termelési költségeket.

A knkorícahíbridek kifejlesztéséhez homozigóta, beltenyésztett vonalak kifejlesztésére, majd ezeknek a vonalaknak a keresztezésére és a hibridek kiértékelésére van szükség, A leszármazási vonalak termesztése és az ismételt kiválogatás az a két eljárás, amivel beitenyésztett vonalakat hozhatunk létre egy populációból, A nemesítő programokban a kívánatos tulajdonságokat kombinálják két vagy több beitenyésztett vonalból vagy különböző, széles alapú forrásokból egy memesitési „tulajdonság-készlet-be, amelyből új beitenyésztett vonalakat indítanak Önmegtermékenyítéssel és a kívánt fenotipusok kiválogatásával. Egy hibrid kukorica-változat két ilyen beltenyésztett vonal keresztezésének eredménye, amelyek mindegyikének egy vagy több olyan kívánatos tulajdonsága van, ami a másikból hiányzik, vagy amelyek kiegészítik egymást. Az új beltenyésztett vonalak más beltenyésztett vonalakkal keresztezhetők, majd as Így kapott hibridek megvizsgálhatok, hogy van-e gazdasági jelentőségük. Az első generációs hibrid leszármazottak jele Ey, A hibridek létrehozó.SSI/BZ • »‘»*V φ* £ ζ. 4 ^Λ * V *

Φ ν ».*·* . Φ'·χ > φ * $ φ \ y

Φ φ w *φ

ΓΥ k\ Υ Υ ‘Υ

X.· sk. \.χ.

aában csak az Εχ növényeknek van jelentőségük. Az Εχ életképesebb, mint a beltenyésztett szülők. Ez a hibridvigor vagy heterózis-hatás számos módón, Így példán! a fokozott vegetatív növekedésben vagy a nagyobb terméshozamban is megnyilvánulhat .

A hibrid kukorica-vetőmag hímsteril rendszerben állítható elő, ami magában foglalja a kézi címertelenitést í„címerezés) . A hibrid vetőmag termelése érdekében a elmert eltávolítják a beltenyésztett anyavonal· fejlődő növényeiről, amelyek a szintén beltenyésztett apavonal növényeivel váltakozó sorokba vannak elvetve. Ennek következtében — feltéve, hogy az ültetvény kellően izolált a kukorinapollen más forrásaitól - az anyavonal csöveit csak az apavonal virágpora termékenyítheti mag. Az így kapott magvak tehát hibridek, amelyekből hibrid növények fejlődnek.

A növények fejlődésének környezeti variációi miatt előfordulhat, hogy egyes növényeken a címer az anyavonal címerteienitése után jelenik csak meg, vagy a címeresük nem távolitják el teljesen a elmert. Sármi legyen is az ok, a következmény az, hogy az anyanövényeknek sikerül virágport termelniük és néhány közülük önbeporzássai fog megtermékenyülni, aminek következtében a beltenyésztett anyavonal magva! keverednek a termelni kívánt hibrid vetőmagvakkal. Ezek a magok nem olyan termöképesek, mint az Fy magvak, ráadásul a beltenyésztett anyavonal magyalnak jelenléte az eladott vetőmagban biztonsági kockázatot jelent a hibridet előállító cég számára.

Más megoldásként a beltenyésztett anyanövények géppel is címerezhetök. A gépi cimerezés körülbelül annyira megbízható, 7?. 381/SE * ‘ί* * * VAKv ** _ΨΛ * X * < 5 V *

Ζ ^ν - :

^Λ « *> ϊ *ν mint a kézzel végzett, de gyorsabb és olcsóbb, viszont a legtöbb cimerező gép több kárt tesz a növényekben, mint a kézi címerezés. így tehát jelenleg a címerteienitésnek nincs teljesen kielégítő módja, és folyamatosan szükség van olyan megoldásokra, amelyekkel tovább csökkenthetők a termelési költségek és megszüntethető az anyavonal önbeporzása a hibridvetőmag' termelése során.

A genetikai hímsteriiitás egy megbízható rendszere előnyös lehetne, A munkaigényes címerezés néhány genotípus esetében elkerülhető a citoplazmás hímsterii (CMS) beltenyésztett vonalak használatával, A fertilitást helyreállító gén hiányában egy CMS beltenyésztett vonal növényei a citopiazmában lévő faktorok miatt hímsterilek, Ezt a tulajdonságot kizárólag az anyanövények örökítik a kukoricában, mivel csak az anyanövény ad cit©plazmát a megtermékenyített maghoz. A CMS növények más, nem hímsterii vonalak pollenjével termékenyithetök meg, S másik beltenyésztett vonal pollenje tartalmazhatja azokat a géneket, amelyek a hibrid növényeket hímfértilíssé teszik, de hiányozhatnak is belőlük. Rendszerint ugyanazon hibrid cimertelenített normái kukoricával, illetve CMS vonallal termelt magvait keverik össze, hogy biztosítva legyen a megfelelő virágpor-mennyiség, amikor a hibrid növényeket termesztik és biztosítva legyen a díverzítás is.

A CMS vonalaknak azonban másféle hátrányaik is vannak. Az egyik egy már régen megfigyelt összefüggés a CMS egy meghatározott változata és bizonyos növénybetegségekre való érzékenység között. Ez a probléma elriasztölag hatott a CMS változatok széleskörű alkalmazására a hibrid kukoricák előállításában és negatívan befő77.Z8i.ZSS lyásoita a CMS általában vett használatát a kukoricában.

A genetikai sterilitás egyik típusa az US 4, 654,465: és

4,727,219 számú szabadalmi iratokban van leírva. A genetikai himsteriiitás ezen formája azonban több mutáns gén fenntartását követeli meg a genom különböző helyein, és egy bonyolult markerrendszert is igényel a gének nyomon követésére és a rendszer használatának megkönnyítésére. Az. US 3,861,705 és 3,710,511 számú szabadalmi iratokban is egy kromoszőma-transziokációs genetikai rendszer van leírva, ami hatásos lehetne, de bonyolult.

Számos próbálkozás történt az Ilyen hátrányok kiküszöbölésére.

így példán! Fabijanski és munkatársai több módszert fejlesztettek ki, amelyekkel növények himsteriils tehetők (EP-Q 85/3010153,8,

PCT/CA90/00037 és WO 90/08828 számé szabadalmi iratok). Az egyik módszer szerint egy hámszövet-spéciiikus promoterral kapcsolt gént juttatunk a növénybe, amely gén egy citotoxikus anyagot kódol. Fgy másik módszer egy antiszensz rendszeren alapul, ahol először azonosítanak egy, a fértintáshoz nélkülözhetetlen gént, majd annak antiszensz párját inszertálják a növénybe, Maríani és munkatársai is több, citotoxikus ás antiszensz rendszert írtak le (EP 89/401,194 számú szabadalmi írat), Más rendszerekben „represszor géneket alkalmaznak, amelyek gátolják más, a hímfertilitás szempontjából kritikus gének működését [FCT/GBSO/OöiOz (WO 90/08829) számú szabadalmi irat).

E rendszer egy még további javítása az US 5,478,369 számú

77.381/SSZa&Zíj>2 δ

« »««φ ΦΧ ΧΧΦΦ ί»*»

ΦΧ ♦ φ κ * * ♦ * χ φ χ χ χ φ * * χ χ φ φ χ *·* ΦΦ φφ Η Φφ szabadalmi iratban van leírva. A módszer ellenőrizhető hímsterílitást. hoz létre azáltal, hogy elnémítja a növény egyik, a hímfertilitáshoz nélkülözhetetlen, eredeti génjét, majd a natív

-DNS-t ugyanazon génnel helyettesíti, de most már egy indukálható prometerrai összekapcsolva, ami a gén kifejeződését szabályozza.

Ez a növény tehát konstitutívan steril, és csak akkor válik fér··· bilissé, ha promoter indukálódik és a hozzá kapcsolt hímfertilitási gén kifejeződik.

Észrevehető, hogy a himsterilitási rendszerekhez vezető munkák egyik esszenciális lépése a hímfertilitást befolyásoló gének azonosítása.

Egy ilyen gén különböző rendszerekben — köztük az itt leírtban is — arra lenne használható, hogy a hímfertilitást szabályozza. Korábban egy hi.mfértiUtas-gént azonosítottak az Arabzáopsis thaliana-ban és felhasználták hímstörli növények létrehozására [Aarts et al., Natúré 363, 715-717 (1933)j. áz egyik ilyen, a hímfertilitás befolyásoló gént az US S,473,369 számú szabadalmi iratban írták le. Jelen találmányban a feltalálok űj DNSmolekulákat és az általuk kódolt aminosav-szekvsnciskst írnak re, amelyek nélkülözhetetlenek a növények himfartiiítása szempontjából, valamint biztosítják a gén promoterát és: annak eszszeneiális szekvenciáit ís. Ezek minden olyan rendszerben alkalmazhatok, ahol a fertíiitás szabályozása hasznos lehet, köztük az alább leírtakban is.

«4 « XX r?. 3Si/:;s/Rft2ip2

Találmányunk egy olyan izolált nukleinsav—szekvenciát biztosít, amely az 5. száma szekvenciát (SSQ ID No. 5) tartalmazza, vagy amely az 5. számú szekvenciával nagyon szigorú körülmények között hibridizál, és egy hímszövet preferáló szabályozó régió funkciójával rendel kézi k.

A találmány biztosít egy elvan transzformációs vektort is, amely az említett szekvenciát egy expresszi ós kazettában egy heterológ nukleotid-szekvenciához működőképesen kapcsolódva tartalmazza .

A találmány egy olyan izolált nukieinsavat is biztosit, amely a ü. számú nukleotíd-szekveneiát tartalmazó hámszövet preferáló szabályzó régió, vagy amely a 6, számú szekvenciával (SEQ

ID No. 6} nagyon szigorú körülmények között hibridizál,

As ábrák rövid leírása

1. ábra, A B592--7 himsteriiitás-gén lékusztérkepe.

2. ábra. Egy Scuthern-blot gél képe, amelyen egy himster Oltásra szegregált Mu gáncsaIádból származó DNS EccAi-vel emésztett és egy Múl próbával hibrtdizált fragmentumai láthatók.

3. ábra. Egy Northern-blot gél képe, amelyen a különböző szövetekből származó teljes RNS és egy, a 3S92-7 kiónból származó PatJ/Egiil fragmentum hibrid!zálásának eredménye látható.

4. ábra. A BS92-7 oDNS-ének nukleotíd- és fehérje—szekvenciaja (a cDNS szekvenciáját az 1. számú szekvenciavázlatban, a fehérje szekvenciáját a .2. számú szekvenoiavázlatban mutatjuk be.

o, ábra, A BS92-7 genomiális szekvenciája (a nukleotid-s.zekve.n~ ciát 3. szarná szekvencíavázlatban, a fehérje-szekvenciát a 4.

7?.3*l/3£/f8i2ip2 számú szekvencíavázlatban Kiutat juk be) 6. ábra, A SS9.2-7 genomiális szekvenciájának és cDNS-e szekvenciájának összehasonlítása,

7, ábra. Egy Northern-blot gél, amelyen a SS92-7 gén kifejeződése látható a mikrosporogenezís folyamatában.

S, ábra, A 8S92-7 teljes hosszúságú promctera (5. számú szekvenciavázlat ) ,

9, ábra,. Az oszlopdiagram, a BS92-7 esszenciális promoter kis (9-10 bp) szakaszainak restrikciós helyre irányított linker-szkenning szubsztitúciója utáni lueizeráz-aktivításokat mutatja be.

10, ábra, A BS92--7 promoter egyik esszenciális területe (6, számú szekvenciaváziat).

11, ábra, A 8S92-7 cirokcimer és a SS92-7 kukorica cDNS szekvenciáinak összehasonlítása (a cirok DNS-t a 7,, a fehérjéjét a 8.

számú szekvenciáváziaton mutatjuk be).

Hacsak másként nem definiáljuk, a találmányunkban előforduló összes technikai és tudományos fogaimat a szakemberek — akikre ez a találmány tartozik - által közönségesen használt értelemben alkalmazzuk. Hacsak mást nem állítunk, az alkalmazott vagy figyelembe vett technikák standard módszerek, amelyeket jól ismernek a szakemberek. Az anyagok, eljárások és példák csak bemutatásra és nem korlátozásra szolgálnak,

A genetikai hímsteriiitás egv mutáció, szupresszió vagy bármilyen más, a mikrosporogenezís egy adott lépésében nélkülözhe7. 331 rtm /mmi pz * * * »·»·'♦♦ * φ* φ i ♦ Φ * Φ * ΦΦ 4» * » » φ Φ ΦΦ» χ- «

Φ · X Φ Φ Φ Φ Λ .„

Χ*Φ ΦΦ ΦΦ X <·χ Φ φ φ; φ; χ

tétlen	génre irányuló hatás következménye lehet; a mikrosporoge-
nezís f Ezeket megkötő	egálom, alatt a pollenképződés teljes folyamatát értjük, a géneket együttesen hímíerttiltásé géneknek (vagy más ütésből hímsterilitási géneknek) nevezzük. Az egész fo~
lyamato.	? belül számos olyan lépés van, amelyben a gének működése
befóivá	sorja a fertilitást. Ezt megfelelően alátámasztani lát-
szik a	genetikai hímsteriiitás gyakorisága a kukoricában, A hím-
steril	mutánsok űj alléijelt fedezik fel az elit beltsnyésztstt
V 0 í ; Cl .1. (¾ K í a.inkíq	tél az adaptálatlan populációkig terjedő anyagokban. Nap- a genetikai hímsteriiitás kutatása főleg leíró jellegű
maradt,	Történtek erőfeszítések a kukorica sterilitási mechaniz-

nem is	meglepő, ha figyelembe vesszük a gének számát, amelyek a
himster	1 látásért felelősnek bizonyulhatnak,. Nem valószínű, hogy
egv mse. Az	ha.ni.zmus lenne alkalmazható az összes mutációra. US 5,478,369 számú szabadalmi iratban szerepel egy mód-
szer, i:	imrvel egy hímsterilitási gén ragasztható a kukorica 9,

egyetle	n hímsterílátási gén az MS2 volt, amit sohasem klónoztak
és szel	Evenáltak ÍAlbertsen és Phillips, Canad, J. Génét, Cyioi.
23, 195	-208 <1.931) J .. Az egyetlen fertílitás-gén, amit eddig kló-
noztak,	az Azabidopsís Aarts és munkatársai (lő. közi.) által

leírt, génje volt,

A teli

77.381/8S/OM»2 * Αίφφφ Φ X * * X * * « * * · * X Φ ΧΦ» « φ ν X Φ Φ

ΦΦΦ ΦΧ «χ φ φφ β χ ♦ '·' ΦΦ

Φ φ » Φ

ΦΦΦ φφ ián helyezkedik el és nélkülözhetetlen a hímfertilitáshoz. A lökasztérkép az 1. ábrán látható. A gén a fent leirt vagy másféle rendszerekben használható a hímfertilitás befolyásolására.

A sterilitásra szegregéit kukorica-család neve BS92-7, és azt találtuk, hogy van egy körülbelül 7,0 kbp méretű ScoRI-fragment urna, ami hibrid!záródik egy Múl próbával. A családból izoláltak egy genomlális kiönt, ami egy Múl transzpozont tartalmaz.

Egy próbát készítettünk a transzpozont határoló DMS-höl, és azt találtak, hogy az hibridizálódík a körülbelül 7,7 kbp öcoAl-fragmentummal. Ezt a próbát használtuk a cDNS-klőnok izolálására egy elmer oDNS-könyvtárból. Az BS92-7 cDNS-e 1230 bp méretű, és a Mu inszerciö a gén 2. exonjában fordul elő. A Northern-analízissel feltárt expressziós mintázatok cimerspeelfikus kifejeződést mutatnak, aminek csúcsa körülbelül a mikrosporogenezie kvartett stádiuma és kvartett-szétválási stádiuma között van.

A „szelektíven hibridizái kifejezés egy olyan nukleotid-szekvenciára utal, amely szigorú körülmények között kimutathatóan nagyobb (azaz a hátteret legalább kétszeresen meghaladó) mértékben hibrid!zálódik egy meghatározott nukieotid-szekvenciávai, mint egy nem célzott nukleinsavval.

A „szigorú körülmények vagy „szigorú hibridizációs körülmények kifejezések azokra a körülményekre utalnak, amelyek között egy próba kimutathatóan nagyobb (azaz a hátteret legalább kétszeresen meghaladó; mértékben bibrioixáiödik a céiszekvenciájá7; ο&ηνκ/κΑΚΑρζ *>'<·' val, mint más szekvenciákkal. A szigorú körülmények a célszekvenciától függenek és a polinukleotíd szerkezetétől függően különbözőek lesznek. A hibridizáiás és/vagy mosás szigorúságának szabályozásával olyan eslszskvenciák azonosíthatók, amelyek 100 %-ban komplementerek a próbával (homoiógía-vizsgáiat). Másrészt a szigorú körülmények úgy is beáliízhatók, hogy lehetővé tegyék a szekvenciák bizonyos fokú keveredését, amivel alacsonyabb fokú hasonlóságok is kimutathatók (heterolögía-vizsgáiat). Általában az ilyen típusú próbák hosszúsága körülbelül 1000-250 nukleotíd.

A nukleinsavak hibridizálásához részletes útmutatást találunk Tijssen; „Laboré tory Techrignes in Siocnejaistry and

Molecuiar Bioíogy - Bybrídiza tion wíth ttiscleic Ágid Brobes' (Elsevier, hév York, 1993), Ausufoel és munkatársai (eds.); „Current

Arotocois ín Eoíecoier Bioíogy (Wiley - intersoience, New York,

1995) és Samforook és munkatársai: „Abiecüiar Cloníng; A Laboratory bánnal (2. kiadás, Cold Spring Barbor Laboratory, Cola Spring

Harbor, 1939) kézikönyveiben.

A specifíoitás tipikusan a hibridizáiás utáni mosás függvénye, ahol a kritikus tényezők az utolsó mosőolöat íonerössége és hőmérséklete. A szigorú mosási körülmények között a hőmérsékletet általában körülbelül 5-2 *C~kal alacsonyabbra állítjuk be, mint az adott szekvencia olvadáspontja (¾) egy meghatározott ionerősség és pH esetében. A DKS „megolvadása (denaturálödása) egy keskeny hőmérséklet-tartományban következik be, és tulajdonképpen a kettős spirál szétválását jelenti a komplementer egyes . 3íU/'SS/KA3;ip2

Λ * ** szálakra. A folyamatot az átmenet középpontjának hőmérsékletével jellemezzük <T_B}, amit olvadási hőmérsékletnek is neveznek. Az olvadási hőmérséklet meghatározására számos képletet ismer a szakterület.

A találmány szerinti nukleotid-szekvenciák számára előnyös hibridizációs körülmények közé tartozik a 42 °C-on_f 500 g/1 formamid, 6X SSC-ben, ö g/i SDS és 100 μ-g/ml iazscsperma-DNS jelenlétében végzett hibridizáiás. Példaszerűen gyenge szigorűságú mosási körülményeket jelent a 42' °0--οη, 2X SSC-ben, 5 g/1 SDS jelenlétében, 30 percen át, majd ezt megismételve végzett hibridlzálás, Példaszerűen mérsékelt szigorűságú körülményeket jelent az 5-0 ^vC~on, 2X SSC-ben., 5 g/1 SDS jelenlétében, 30 percen át végzett és megismételt mosás. Példaszerűen erős szigorúsága. körülményeket jelent a 65 ^eC~on, 2X SSC-ben, 5 g/1 SDS jelenlétében, 30 percen át végzett és megismételt mosás, A találmány szerinti promoternak megfelelő szekvenciák a fenti körülmények bármelyike között nyerhetők. Találmányunkban az erősen szigorú körülményeket használjuk.

A promoter-teruieteket a szakemberek könnyen azonosíthatjak. Megkeressük az ATG motívumot tartalmazó, vélelmezett start-kodont, és a start-kodontői felfelé eső terület a vélhető promoter, A „promoter a DNS egy szabályozó területe, amely rendszerint tartalmaz egy TATA-boxot, ami az RNS-polimeráz-21-t irányítva megindítja az RNS szintézisét az adott kódoló szekvencia megfelelő transzkripciós kezdőhelyén. Egy promoter tartalmazhat még járulékos felismerő szekvenciákat is, amelyek általában a TATA-boxtői felfelé (5'irányban) helyezkednek el és a transz77,381/ss « *«#* ♦» »*«* ·, *« β * « > * « * ♦** * * « « 9 « ♦ * * * * *♦« «» ** * ♦* *·« ·♦ kripció megindulásának sebességét szabályozzák (ezeket nevezzük felső promoter-elemeknefc). Nyilvánvaló, hogy ha azonosítottuk a találmány szerinti promoter naklsotíd-szekvencíáját, akkor a szakembereknek nem okoz nehézséget a további szabályozó elemek azonosítása az adott promoter TATA-boxtói felfelé eső területén, így tehát a találmány szerinti promoter-terüietst általában tovább azonosíthatjuk a felső szabályozó elemek jelenléte alapján, amelyek a kódoló szekvencia szövetbeli vagy időbeni kifejeződéséért felelősek, fokozok vagy hasonlók lehetnek. Hasonlóképpen azok a promoter-elemek, amelyek lehetővé teszik a kifejeződést a kívánt szövetben, például hímszövetben, azonosíthatok, izolálhatok és más mag-promoterokkal a hímszövet preferáló kifejeződés megerősítésére alkalmazhatók,

A találmány szerinti, izolált promoter-szekvencia módosítható, hogy megfelelő mértékű kifejeződést biztosítson idegen (heterolőg) nukleotíd-szekvenciák számára. A teljes promoter-területnél kisebb szakaszok is használhatók és megőrizhetik a portok-specifikus kifejeződés vezérlésének képességét, Felismertük azonban, hogy a mRNS expressziójának szintje csökkenhet, ha részeket távolítunk el a promoter-szekvenciáből. Eszerint egy promotert mödosithatunk úgy, hogy gyenge vagy erős promoter legyen. Általában a „gyenge promoter kifejezés alatt egy olyan prοποί ért értünk, amely alacsony szinten működteti a kódoló szekvencia expressziéját. Az „alacsony színt körülbelül 1/10,OüO-tol körülbelül 1/iöO. OOO-íg, vagy körülbelül 1/500. OClQ-íg terjedő transzkriptumot jelent. Ezzel szemben egy erős promoter magas szinten működteti egy kódoló szekvencia expresszi-óját, ami körülbelül 1/10-töI körülbelül 1/100-ig, vagy körülbelül l/1000~ig

7?,3Sl/SE/KASi.pZ terjedő transzkriptumot jelent. Általában egy izolált promoter-szekvenciából legalább körülbelül 30 nukleotidot használunk sgy nukleotid-szekvencia expressziéjának működtetésére. Felismertük, hogy a transzkripció szintjének emeléséhez fokozok használhatók a találmány szerinti promcter-terüietekkei kombinálva. A. fokozó (enhancer) egy olyan nukleotid-szekvencia, amely serkenti egy promoter-terület kifejeződését, A fokozók ···· mint amilyen az SV40 fokozd terület, a 3SS .fokozó elem és a hasonlók — jói ismertek a szakterületen.

.A kisebb fragmentumok még mindig birtokolhatják a promoter szabályozó tulajdonságait, igy a deléciós analízis lehet az egyik módja az esszenciális területek azonosításának. A deléciós analízis a szabályozó terület mindkét, 5'- és 3'-végén végrehajtható, Fragmentumokat helyre irányított mutagenezissei, poiimeráz láncreakcióval végzett mutagenezissei és hasonlókkal nyerhetünk („Ddrected éíutagenesis; Λ .Fracticai Approaoh, IRL Press,

1391}, A 3'-öeléoiőkkal körülhatárolható az esszenciális terület és megtalálható a 3^f-vége, amellyel ez a terület működőképes módon kapcsolható egy tetszőleges promoter-raaghoz. Ha az esszenciális területet egyszer meghatároztuk, akkor egy exogén gén transzkripcióját szabályozhatjuk az esszenciális terület és egy promoter-mag együttesével, A promoter-mag bármely ismert promoter-mag lehet, mint amilyen a karfiol mozaik vírus 355 vagy 195 promotera (US 5,352,305), az ubíkvítin promoter (US 5,510,474), az IN2 promoter-mag (US 5,364,780) vagy a görvélyfu mozaik vírus promotera (Gruber et al., in: „Methods in Plánt AJoiecular Biology and Biotechclogy, pp. 89-119., CRC Press, 1993).

77.3Si/HE/RR2ÍpZ ♦·*·*

Az BS92-7 szabályozó területét 3 vélelmezett TATA-boxtól felfelé elhelyezkedő, körülbelül 270 bp hosszúságú területként azonosítottuk (S. ábra). A fent körvonalazott módszerrel megállapítottuk azt is, hogy a promoter egyik esszenciális területe a TATA-boxtól felfelé elhelyezkedő, a -112. bázispártéi a -93.-ig terjedő szakasz,

Promoter-szekvenoiák más növényekből Is izolálhatok jói ismert technikákkal a találmány szerinti promoter-szekvenciával matatott homolögíájuk alapján. Ezekben az eljárásokban az ismert promoter·- szekvencia egészét vagy egy részét használjak próbaként, ami szelektíven hibridizálódik más szekvenciákkal, amelyek egy adott szervezetből származó, klónozott genom-DNS fragmentumok populációjában (azaz egy genom-könyvtárban) vannak jelen. A nukleínsav-szekvenciák hibridizálásának módszerei jól ismertek a szakterületen,

A teljes promoter-szekvencia vagy annak egy része használható olyan próbaként, amely képes specifikusan hibridizálödni a megfelelő proraoter-szekvenciákkal. Ahhoz, hogy különböző körülmények között is elérjük a specifikus hibridizálödást, az ilyen próbáknak egyedi szekvenciákat kell. tartalmazniuk, amelyek előnyösen legalább körülbelül 10, és legelőnyösebben legalább körülbelül 20 nukleotíd hosszúságúak. Az ilyen próbák felhasználhatók a megfelelő promoter-szekvenolák sokszorozására egy kiválasztott szervezetből a poiimeráz láncreakció (PCR) jól ismert eljárásával, Ez a technika használható járulékos promoter-szekvenciáfc izolálására egy kívánt szervezetből vagy annak megállapítására, hogy a promoter-szekvencia jelen van-e a szervezetben.

7.331/SS * »φφχ χ·Φ »«»κ ♦ *

X» » Φ φ X ♦ ♦* »♦ « < « X * «Φ» « φ

Φ φ Φ » Φ X Φ φ Φ κ«« φφ χ« Φ «« ΦΦΧ X *

A szélesztett DNS-könyvtárak hibridizációs szűrővizsgálatára akár tarfoltokból, akár telepekből Innia és munkatársai (eds,):

„PüR Protocois, A Gulde to áfethoda and Applications (Acad,

Press, 1990) kézikönyvében találunk módszereket,

Továbbá, a találmány szerinti promoter a BS92-7 géntől eltérő nukleotid-szekvenciához is kapcsolható, hogy más heterológ nukleotid-szekvenciák is kifejeződhessenek. A találmány szerinti promoter nukieotíd-szekvenciája, valamint annak fragmentumai, és változatai expressziős keretekbe foglalhatok a heterológ nukleotíd-szekveneiákkai együtt, hogy kifejeződhessenek az adott növényben, pontosabban a növény hámszövetében. Egy ilyen expreszsziós keret a restrikciós helyek sokaságát kínálja a nukleotid~ szekvencia inszertálása száriéra, amely a promoter transzkripciós szabályozó hatása alá kerül. Ezek az expressziós keretek alkalmasak. bármely növény genetikai módosítására a kívánt fenotipuscs válasz elérése érdekében, A BS92-7 promotert tartalmazó expressziós vektorban idegen génként alkalmazható nuklectid-szekvenciákrs példaként említjük a komplementer nukleotid-egy~ ségeket, például az antíszensz molekulákat (kaliáz antiszensz

RNS, barnáz antiszensz RNS, kaikon-szintetáz antiszensz RNS,

MsáS antiszensz RNS), a ribozimeket és külső vezető szekvenciákat, egy sptamert vagy egyszáiű nukleotidokat, Az idegen nukleotid~szekvencia kódolhat auxinckat, rol.B-t, oitotoxinokat, difté17 ♦ ♦ X* φψ ♦ ♦χ X* * ««« »Χ9 ria-toxint, DAM-metiiézt, avidint, vagy egy prokariöta szabályozó rendszerből származhat. így például Marian! és munkatársai [badaré 347, 737' (1990}.]· kimutatták, hogy akár az AspergiJlus oryzae TI RNáza, akár a Baciilna anyio.Ligusiac.iens RNáza (amelyeket „barnáz-nak neveztek; a tapétámban kifejeződve a sejtek pusztulását és ezzel, hímsterílitást okoznak. Quaas és munkatársai [£vr. <7- .Sz ocdem. 173, 617 (1986)] leírták a TI P.Náz kémiai szintézisét, míg a barnáz-gén nukleotid-szekvenciáját Hartley derítette fel («7. Mól. Siói. 202, 913 {1988)). Az Agrobacterium rolS génje eqv enzimet kódol, amely megzavarja az mzopenes rc auxin-anyagcserét azáltal, hogy indulókat szabadit indoxil-p-glükozidokbél. Estrach és munkatársai [.EMBö J. 11, 3125 (1991) ], valamint Spena és munkatársai [Tbeor. Appl. 2e.net. 84,

520 (1992)1 kimutatták, hogy a ro.13 gén portok-specifikus kifejeződése dohányban zsugorodott porzókat eredményez, amelyekben nagy mértékben lecsökken a pollen képződés, így a rol.8 gén egy másik olyan gén, amely alkalmas a polientermelődés szabályozására. Slighfcon és munkatársai pi. Siói, Chem, 261, 108 (1985)] írták le a roIS gén nukleotid-szekveneiájéfc. A diftéria-toxínt kódoló gén DdS-molekuiáit az ATCC-től lehet megkapni (No. 39359 és

No. 67011; lásd még az EP-A 9079927 54.2 számú szabadalmi iratot) . A Dád-metiiáz génjét sterilitás okozására használták az

US 5,792,853 és 5,639,049, valamint a PCT/US95/15229 számú s

L / ;>£. ? i ki.·:

♦ φ * *

ΦΦ ΦφΦν X « Φ « φ φ

Φ V Φ ΦΦ κχ

Jf * * * * *»♦ φ φ φ φ ♦ φ Φ « » Κ Φ

ΦΦΦ φ* ΦΦ Φ ΦΦ *ΚΦ ΦΦΦ badalmi .iratokban leírt -eljárásokban. Az avidin gén alkalmazását sterilitás okozására az US 5,562,769 .számú szabadalmi iratban írtak le.

Amint említettük.., találmányunk biztosít olyan vektorokat, amelyek képesek a szóban forgó géneket kifejeztetni egy promoter szabályozó hatása alatt. A vektoroknak általában növényi sejtekben kell működniük. Idővel előnyösek lehetnek az olyan vektorok, amelyek ooli-ban is működőképesek (például fehérje termelése antitestek indukálásához, DNS szekvencia-analízise, inszertumok szerkesztése, mennyiségek előállítása nnkleinsavakbői}. Az zi coli-ban kifejeződő vektorokat és elkészítésük módját S-ambro-ok és munkatársai (id. aús kézikönyvében találhatjuk meg.

A transzformációs vektor, amely a találmány szerinti promoter-szekvenciát tartalmazza működőképes módon összekapcsolva egy idegen szekvenciával egy expressz ió-s keretben, tartalmazhatja még legalább egy gén nukleotíd-szekvemeiáját a gazdaszervezet kotranszformálása céljából. Más megoldásként a járulékos szekvencia egy másik transzformációs vektorban ís bejuttatható.

A transzformációs vektorban riporter-gének lehetnek jelen; as alkalmas riportergénekre számos példa van a szakirodalomban (Jefferson et ai., in: „Plánt Moiscular Síoiogy Hanual, pp.·'1-,33.,

Gelvin et ai._z (sds.), Kluwer Academic Publíshers, 1991; DsWet ez al., Hol. Celi. Bioi. y, 725-737 (1987); Goff et aí._z EMSO J.

77. 7S7. .C ?AOp * *·«» «* * ** β * tf * χ * « · »:« ♦ ♦ β * ♦ « « * *« ν «♦ Φ * * X * Φ Μ * ♦ Φ* «Κ «« » β» *«» »»*

9, 2517-2522 {1990); Kain et al. ? BíoTecnníqaee 19, 650-655 (15955 és Chili et al., Current Bioi. 5, 325-3-30 (1996)).

A transzformált sejtek vagy szövetek szelektálására alkalmas markergének is lehetnek a transzfomáciő-s vektorban. Az ilyen gének közé tartoznak az antibiotikum- és herbícid-rezisztencfát kölcsönző gének, A szelektálható markergénekre nem korlátozó példaként említjük az alábbiakat: kioramfenikol-rezisztencla.

(Herrera-Estrelia. et al., 137B7 J, 987-992 {1983·} j, metotrexát-

-rezisztencia [Herrera-Estrelia et	al. ?	,Ma t ur e	303,	209-213
(1983); Meijer et ai.> Alant Mól.	Szol <	16, 8C	(7-820	(1991)],
higromícin-rezisztencia .('Waldron- et	a .·(.,·	Alant	Mól.	Szol, 5,
103-108 (1985); Ohijian et al.? Plánt Sci.	108, 2	19-227	(1995)3,

sztreptomiein-rszisztencia (Jones et al,, Mól, Gén, Génét, 210,

86-31 (1987} j, szpektinomioin-rezisztencia íBretagne-Sanard et al,, Transganie Rés. 5, 131-137 (1596)3, fcleomicin-rezí sztencia.

[Bilié et al., Alant Mól, Blol, 7, 171-176 (1990) szül fonalaidrezisztencia [Guerineau st al. , Alant Mól. Bioi, 15, 127-136 (1990)3 , bromoxiní 1-rezisztenc.ia [Stalker et al,? Science 242,

419-423 (1988)3, giifozát-rezisztencia [Shaw et al,? Science

233, 478-481 (1986)3 és fios-zfinotriein-reziszteneía (DeBiook et al.? EfflOJ. 6, 2513-2518 (1987)].

A transzformáció és/vagy traeszfekciö módja nem kritikus a találmányunk szempontjából; mindkét módszerhez számos eljárás áll rendelkezésünkre. Amint újabb eljárások válnak elérhetővé a

7?. 38*/&E/M2ip2

J»*««» növények, és más gazda sejtek transzformálására, azonnal közvetlenül alkalmazhatók. Ennek megfelelően a módszerek széles választékát fejlesztették ki egy DNS-szekvenciának egy gazdasejtbe juttatására, hegy elérjék a szekvencia transzkripcióját vagy transzkripcióját és transzlációját, ami a szervezet fenotipusa··· nak megváltozásához vezet. így tehát bármely eljárás alkalmazható, ha hatásos transzformációt érhetünk el általa.

Azok az eljárások, amelyekkel expresszién vektorok juttathatók növényi szövetekbe, széles választékban állnak rendelkezésre, és a megcélzott növénynek megfelelően választhatók meg. A növények széles körének transzformálására alkalmas eljárások a szaki r oda lomban vannak I.e írva (Miki et ai ., „Procednres tor Introducing Fóréi gn DNS intő Plancs, ín: „M&thc-ds in Plánt dólecnlar Biotechnology^ (már idézve) / Elein et al., Bi o/Technoloyy 10,- 268 (1932) és Neising et al,, Anna, név. Génét. 22,

421-477 (1933)3. így például a DNS-szerkezetet olyan technikákkal juttathatjuk be a növényi sejt genomjába, mint a mikrobáiövéses szállítás (Klein et ai.. Natúré 327, '70-73 (1987)3, az elektrcporáció [Fromm et al,, Proc, Páti. Arad. Sri. USA 82,

5824 (19853), a polletiiéngiikoios (2EG3 kicsapás [Paszkcwski et al., ΕΜΒΌ J. 3, 2717-2722 (1984)], a közvetlen génbevitel (WO 85/01856 és EP 8 275 069), az in vítro protoplaszt-transztcrmáció (US 4,634, 644) és a növényi protoplasstok vagy embriógén kallusz mikroinjekció-zása [Crossway, áfci. Gén. Génét. 202,

77.SSl/ES/FAZipZ «Φχ ***

179-185 (1985)] . Egy másik lehetőség a növényi -szövet közös tenyésztése az Agrobacferiü® tumefacíens-szel, ahol a DNS-szerketetet egy kettős vektor-rendszerben helyezzük el [US 5,591,616;

Ishída et aL, Natúré Biotechncicgy 14, 745-750 (1926; 1 . Ekkor ez A. tumefseiens virölenc.1.a~f.unk-cióí iránvitják a szerkezet mézére mát a növényi sejt DNS-ébe, miután a baktérium megfertőzte a sejtet (Horsoh et si,, Science 233, 496-498 (1984) ;

Fraley er al, , Proc. Nsii. ácsű. Ser. USA 8b, 4803 (i988) ] .

Az olaj repce transzformálásának standard módszereit Mcioney és munkatársai Írtak ie [Elánt Ceil Peports 8, 238-242 (1989)],

Gabona transzformálását Eromm és munkatársai fSio/Technology 8,

838 (1990)1 és Gordon-Ksmm és munkatársai (id. közi.) Írtak le.

Az Acrobacterrum elsősorban kétszíküeken alkalmazható, de néhány egyszikűt, igy a kukoricát is transzformáltak vele (lásd fent és az 08 5,550,318 számú szabadalmi iratot). A rizs transzformálását Hisi és munkatársai [Plánt J. 6, 271-282 (1994)], Christon és munkatársai [Trends Sictee.hr. 10, 239 (1292)] és Lee és munuatársas (Proc. Natl. Acad. Ser. USA 38, 6389 (r99r)] írtak le.

A búza a kukorica vagy a rizs transzformálására, használt eljáráshoz hasonló módon transzformálható, A cirok transzformálásé;

Casas és munkatársai (id. köri.}, illetve Wan és munkatársai [Plánt Physiol, 104, 37 (1924)] Írták le. A szója transzformálásáról számos közlemény szól, köztük az US 5, 015, 580 számú -szál:

>adalmi irat.

vmSi/BS/RASip;

ésé* j? L

Μ ♦♦

Az alábbi példák az útmutatást és illusztrálást szolgálják, de nem korlátozzák találmányunk oltalmi körét.

A BSS2-7 azonosítása ás kossegsegálása

Egy mutator (Mu) populációból olyan növénycsaládokat válogatunk ki, amelyek növényei zömmel himsterilek, egynek sem voltak porzói, vagy csak néhányon jelentek meg abnormális porzók, de egyben sem volt pollen. A hímsterilitás okául feltételezzük, hogy egy Mu elem integrálódott véletlenszerű módon egy génbe, ami a mikrosporogenezís bizonyos lépéseiért felelős, és megzavarta annak expressziéját. Sgy szegregálódő Fg család — amit SS92-7-ként jelölünk — növényeit felneveljük és a hímfertilitás vagy sterilitás szerint osztályozzuk:. Osztályonként körülbelül 20 növényről levélmintákat veszünk és izoláljuk belőlük a DNS-t.

A Mu és a sterilitás kapcsolatának igazolására Söuthern-analízist végzünk, ami a szakemberek által jól ismert technika. Ez a mindennapos eljárás magában foglalja a növényi DNS izolálását, restrikciós endonukieázokkal való feldarabolását, a DNS-darabok molekulatömeg szerinti frakcionáiásáf agarózgélen, majd átvitelüket nejlonmembránokra, hogy rögzítsük a szétválogatott DNS-t. Ezután, ezeket a membránokat egy radioaktív jelöléssel ellátott (a32y~ciCTp~t tartalmazó) próba-fragmentummal hibridizáljuk és SDS-oldattal mossuk [Southern, J. Moi. Siói. SS, 503-517 (1975)]. Egy szegregálódő Fg BS92-7 család növényeit felneveljük és hímfertilitás vagy sterilitás szerint osztályozzuk. Osztályonként körülbelül 20 növényről levélmintákat veszünk, amelyekből izoláljuk a DNS-t. Az 5 fertllis és 12 steril növényből

77.Z81/3Z w 23 «0 ΰυΛ-' ♦ 00 *0* gálódása látható a. steril fenotípussaí származó DES-t (körülbelül 7 μη) FooPl-vel emésztjük, majd a fragmentumokat 0,75 %~os agarőzgélen. szétválasztjuk. Az emésztett DNS-t nejionmembránra visszük át, a membránt a Mu transzpozon egy belső fragmentumával hibridizáljuk, A membrán autórádiógramján (2. ábra) egy 7 kbp méretű EcoAI fragmentum kőszegreEz az EooEl sáv szegregéi ódott a fertiiis növényben, ami arra utal, hogy az alléi heterozioóta vad típusú.

A í	rs > , v.	és (	5,0 kbp közötti mé~
a	DNS		iektroelúciöval ki-
	DNS-	-t a	Lambda Zap vektor-
ut	así	fása	szerint. A ligáit
	Go	Id (	Strataoene) készlet

Könyvtár készítés® és szűrővizsgálata

Ά oDNS-könyvtárak készítésének módja közismert a szakemberek körében és Sambrook és munkatársai már idézett kézikönyvében van leírva, A könyvtárakat az alábbi módon készítettük el.

Egy steríiis növényből származó DNS-t EooPI-uel emésztünk és egy preparativ gélen megfuttatunk, A retű DNS-sávokat kivágjuk a gélből, « nyerjük és etanoilal kicsapjuk. Ezt s ba {Stratagene™; ligáljuk a gyártó i DNS-t fágokba „csomagoljuk''' a Gigapac alkalmazásával. Körülbelül 500.000 tarfoltképzö egységet (PFU) szélesítünk, majd emelünk fel nitro-cellulóz membránokra. A membránokat a fiái próbával hibridizáljuk. A szűrővizsgálat harmadik körében egy tiszta kiónt kapunk. Az inszertumot plazmidként kivágjuk a fágból és BS327-0,1-nek neveztük el. A kiónból izolálunk egy határoló fragmentumot és ellenőrző próbaként alkalmazzuk az eredeti EcoAI fragmentum kos2egregáei6s vizsgálatához. A 7,0 kbp EooAl fragmentum homozigóta az összes steríiis

77.381/3S fi

X β Φ * φφ φ $ φ S S φ * φ *Μ «* ** novenyren, ami. megerősíti, ί megfelelő Mu fragmentumot izoláltuk

U Λ x rX fertiiís növények közül nyolc bizonyult heterozigötának a 7,0 kbp és egy 6,2 kbp EcoRI sávokra. A fertilis növények közül kettő volt homozigóta. a 6,2 kbp rcoPJ- sávra, ami feltételezhetően a vad típusú alléi.

3.

Expressziős analízis és a cDNS izolálása

A portok fejlődésére jellemző gének kifejeződését Northern-analizíssei mutatjuk ki a mikrosporogenezis különböző fázisaiban. A Northern~an.alízbs .is jól ismert eljárás a szakemberek körében; hasonlít a Southern-analizishez azzal az eltéréssel, hogy nem DNS-t, hanem mSdS-t izolálunk és viszünk fei a gélre. Ezután a mRNS-t híbridízáljuk a jelölt próbával [Potter et ad,, Proc.

lead. Scí, EISA 78, 6662-6666 (1981); Leonéit et ai., Mól.

219, 225-234 (1939)1. A BS927-8.1 klónből egy

Δ?ί3 í	1. Aca
r χ.. .·.	u Gém
Psi	;l/3gfj.

gáláiban, amit magból, éretlen csőből, csíranövényből és címerből származó RRS-sei végzünk. Csak egyetlen jelet találtunk a eimer-RNS-ben, körülbelül a mikrosporogenezis kvartett stádiumában (3. ábra), A transzkriptura körülbelül. 1,4 kbp hosszúságé. Ugyanezt a próbát használjuk egy másik cDNS-konyvtár szűrővizsgálatához, amely a meiotíkuntól a késői egymagvúig terjedő stádiumú portokokböl származó mRNS-röl készült. S könyvtárból két kiónt — BS927-4.1 és 3.39-27-9.1 -· izoláltunk.

S zekvéneia-anali zis

A BS927-8.1 genom-kiönt és a két, BS927-4.1 és BS927-9.1

w* V <4 X*-* « * * * »» « < X * * If ad* Φ* cDNS-klónt a Lofstrand Labs Ltö. szekvenálta Sanger és munkatársai módszerével ÍRroo. Esti, Acad. Sói. USA 74, 5463-5467 (1977)1, A két cDNS-klón a molekulák 5' végénél, különbözik egymástól; a BS927-4.X tartalmaz egy TCTC ismétlődést, míg a BS9279,1 ne®. Ha ezeket a szekvenciákat Összehasonlítjuk a genom-DKSsel, akkor kitűnik, hogy a TCTC ismétlődés nincs jelen, és valószínűleg csk egy klónozás! műtermék a BS927-4.1 cDNS-ben. A. cDNS és a genom-DNS összehasonlítása hat exon és Öt íntron jelenlétét, fedte fel a genom-kiónban. A cDNS-szekvenciát a 4. ábrán, a genom- DNS-ét az 5, ábrán mutatjuk be. A cDCS/genom összevetés a 6. ábrán látható, és 95,95 %-os azonosságot mutat. A Múl inszertum a 2. exonban van. Sgy vélelmezett Met startkodon van a genom— klón 320. pozíciójában. A két cDNS-ből hiányzik ez a Met kodon, ezért azok nem. teljes hosszúságú gének. A BS927-4.1 cDNS további vizsgálata lehetővé tette a BS927-I1.1 klón izolálását. Ennek a kiónnak csak az 5'-végét szekvenáltuk, hogy meghatározzuk a kezdőpontját. Azt találtuk, hogy a BS927-11.1-ben két bázis hiány-

zik a MET k	ódonból	(A	; i Ό ; , SS e 2	a leghosszabb izolált cDNS. A
további expo	ressziös	vi	zsgáiatokat	a BS927-4.1 cONS-próbávai vé-
geztúk egy	Ν Ο Γ’ a ’ r Ϊ	i-b;	Lofc-on, ami	a mikrosporogenezís különböző
stádiumaiból	szárma'	zó	mRHS-eket fc	artaimazott. Jeleket a meíózis
11/kvartett	Ο ·ί— ·Α a -j s ·; tó’ x> Öl .\U. ÍX.ÍU V OaU	a középső	egymagvű stádiumig kaptunk; a
legnagyobb ’	íelek a	kv	ártott és )	c va r t e t1 - s z é t vá 1 á s s t á d i umo kb an
jelentek meg	(7. ábra) .

és esszenciális területeinek ezonosikése

A BS927-8.1 genom-klón összehasonlítása a BS927-T1.1, BS927-4 Ϊ81/ΚΕ '•dir 2 G ϊ·’

és BS327-9.1 cDNS-kl-ónokkai lehetővé tette a BS92.7 intronjalnak és exonjainak azonosítását, Ezzel lehetővé vált a nyílt leolvasási keretek meghatározása, amelyek egyike végignyúlik a cDNS.....

“Szekvenciák többségén, és legnagyobb valószínűséggel ez a BS927 gén fehérjekódoló szekvenciája. Megvizsgálva ennek kodonpreferenciáját és kizárva, az egyes ködötök harmadik pozíciójának véletlenszerű voltát, megerősítettük, hogy ez a szekvencia a fehér je-kódolo nyílt leovasásí keret. Az általa kódolt fehérje 5-2 %-os hasonlóságot (42 %-os azonosságot) mutatna a kukorica Al génjének fehérjéjével, ami a dihídroflavanol-reduktáz enzim, amire az antociánok és flofoafének bioszintézisében van szükség.

A portok-gének szabályozó területei, például· a promoterok, genom-alklónokban azonosíthatok funkció-analízissel, amit rendszerint a ríportsrgén expresszíójának a portok-szövetekben való megfígyelhefősege, illetve a portoktól eltérő szövetekben megfigyelhető hiánya vagy csökkent megjelenése erősít meg. Annak lehetőségét, hogy a szabályozó területek a transzláció kezdő helyétől „felfelé, azaz 5-irányban helyezkednek el, úgy vizsgáljuk, hogy egy, a területet magában foglaló QNS-fragmentumot expresszíös vektorokba alklőnozunk átmeneti expresszi ős kí sérletek céljára. Várható, hogy a kisebb szubgenom-fragmentumok fogják tartalmazni azokat a szakaszokat, amelyek elengedhetetlenek a hámszövet-preferáló kifejeződéshez. így például a CaMVISS és 35S promoterok esszenciális területeit nagyobb geuom-darabokból származó, viszonylag kis fragmentumokban azonosították (US 5,352, 605).

A megfelelő expressziős vektor — amellyel a funkcionális kifejeződés vizsgálható — és az eljárás, — amellyel, a vektor a

77.3S1/3E

A.

♦»-V ·»* *·'*’ gazdaszervezetbe juttatható — kiválasztása a gazdaszervezettől függ; az ilyen vektorok és eljárások jól ismertek a szakterületen. A vektorban lévő területek magukban foglalják azokat a szakaszokat, amelyek szabályozzák a transzkripció megindulását és folyamatát az eukariótákban. Ezekhez a területekhez működőképes módon kapcsolódik egy riportergén, például az UidA, amely β-glukuronídázt (GUS) vagy iucíferázt kódol. A növényi expressziós vektorok és riportergének leírását Gruber és munkatársai (iá. ííiü'i kézikönyvében találhatjuk meg. A GUS expressziős vektorok és génkeretek megvásárolhatók a Clonetech-től (Palo Alto, Ca.)., míg a luciferáz expressziós vektorokat és génkereteket a Prómega Corp. '{Madison, (ki. ) árusítja. A Ti plazmidokat és más Agzobacteríum-vektorokat Ishida és munkatársai (iá. közi.) írták le, illetve az US 5,591,616 számú, szabadalmi iratban szerepelnek.

Az expressziős vektorok, amelyek a feltételezett szabályozó területeket tartalmazzák a genom-fragmentumokban, bejuttathatók ép szövetekbe, például kifejlődött portokokba, illetve embriókba vagy kai!aszókba. A DNS bejuttatása történhet mikroszemcsés bombázással, injektálással, elektroporáciéval vagy Apróba Cheri um-közvetitésü génátviteliéi (Gruber et aí. , íd. hő Ishida et al., .iá. közi.; US 5,591,616). A növényi szövetek tenyésztésének általános módszereit ís a fentiekben találjuk meg.

Az átmeneti kifejeződés vizsgálatához kifejlődött, izolált portokokat helyezünk cimertenyésztő tápközegre (Pareddy és Petelinó, Crop Sói. J. 29, 1564-1566 (1989)], amit 0,5 % Phytagellei CSigma, St. Louís) vagy más szilárdító adalékkal szilárdítunk meg. Az expressziós vektor DNS-ét 5 órán belül juttatjuk be 77.3S1/SS

!$ * * * mikroszemcsés bombázással (1,2 pm átmérőjű szemcsék, 6880-7568 kPa nyomás) < A DBS bejuttatása után a portokokat 26 °C—-on inkubáljuk ugyanazon a tápközegen, 17 órán át, majd teljesszövet-homogenizátumot készítünk belőlük, aminek megmerjük a GUS- vagy

1uci£erá z-akt i vi tá sá t.

A BS227 valószínűsíthető transzlációs startkodonjától felfelé csak 319 bp DNS van jelen a 83927-8,1 genom-kiónban. Sgy kialakított Ncol restrikciós hely segítségévei az utóbbit a Xuciferázt és ^-gíukurcnidázt kódoló riportergénskhez kapcsoljuk megvizsgálandó, hogy van-e ennek a DNS-fragmentumnak promoterakt ivitása a növényi szövetben. Az aktivitást kimutattuk a portokokban, de nem a sziklevelekben, gyökerekben és kailuszokban, ami portok-preferálő vagy -specifikus promoter-aktivitást jelez.

Egy valószínű TATA-boxot figyeltünk meg a transzlációs startködömtől felfelé eső területen. Így tehát a »6927-8.1 genom- ki ón csak körülbelül 266 bázispárt foglal magában a lehetséges T.ATA-boxtól felfelé. A tipikus növényi génekben a transzkripció kezdchelye 26-36 bázíspárraí a TATA-box alatt van, ami a 36927 mENS-hez egy csak körülbelül 17-27 bp hosszúságú, nem lefordítható, 5’'-vezető szakaszt ad. A teljes, csak 319 bp hosszúságú BS927 sznbgenom-fragmentum — amely magában foglalja a nem. lefordítható vezető szakaszt, a transzkripció kezdőhelyét, a TATA-boxot és a TATA-boxtói felfelé eső szekvenciákat — elégségesnek bizonyult a promoter-aktívitáshoz (8. ábra, 5, számú szekvenciavázlat). A szakemberek tudják, hogy a promoter fúziója génekkel, nyílt leolvasási keretekkel, RNS-t kódoló szekvenciákkal, és hasonlókkal történhet akár a transzkripció, akár a transzlá77.3.gl/3Z

Ο (λ ció természetes kezdőhelyénél. vagy annak közelében, vagy a startkodontől lefelé. Az ábrán a vélelmezett TATA-boxot (TTTATAA) aláhúzással jelöljük. így tehát találmányunkhoz tartozik egy, az 5. számú szekvenoiavázlatban megadott (vagy azzal azonos, vagy azzal híbridízálódó) szekvenciájú DNS-molekula, aminek hámszövet-preferáló szabályozó funkciója van.

A szabályozó terület mindkét, 5' és 3' végén deléciés analízist végzünk: a fragmentumokat helyre irányított vagy PÜA-matagenezissel és hasonlókkal nyerjük („Direozed óíutagenesis; A

Rraoticai Approsoh''1RL Press, 1991) . A hámszövet-preferáló szabályozó terület 3'-vége meghatározható a TATA-box közelségéből vagy szükség esetén 3'-kivágásokkal, Ezután az esszenciális terület működőképes módon egy tetszőleges promoter-maghoz kapcsolható olyan restrikciós helyekre való klónozással, amelyeket közvetlenül a TATA-box feletti területen hoztunk létre klónozással, vagy a 3' deléciós analízissel ismertünk fel. Ha az esszenciális területet egyszer azonosítottuk, akkor egy idegen gén kifejeződését már vezérelhetjük a BS927 hámszövet-preferáló területével és egy promoter-msggai. A promoter-mag bármely ismert promoter-mag lehet, mint amilyen a karfiol mozaik vírus 35S vagy 19S promotera (US 5,352,605), az ubikvitín promoter-mag (US 5,510,474), az IN-2 promoter-mag (ÜS 5,510,474) vagy a görvélyfű mozaik vírus promotera (Órabér et el., id. mű). A promoter előnyösen egy hámszövet-preferáló gén promoter-mag ja vagy a CaMVuoS promoter-mag. Előnyösebben a promoter egy hámszövet-preferáló gén promotera, még előnyösebben a 3S927 promoter-mag.

A további — például linker-szkenníng-gel, egy jói ismert 77.3S2/SE· további módszerrel végzett ···· mutációs analízissel kisebb szakaszok azonosíthatók, amelyek a portok-preferáló kifejeződéshez szükséges szekvenciákat tartalmazzák. Szék a mutációk a működést módoséthatják, például a kifejeződés szintjét, időziteffcségét vagy a szövetet, ahol történik. A mutációk azonban némák is lehetnek, amelyeknek nincs megfigyelhető hatása.

A fenti eljárásokat használjuk a BS927 promoter esszenciális területeinek azonosítására. Miután a promotert a lu.ciferáz markergénhez kapcsoltuk, mutációs analízist, végzünk. A SS7 genomklón 319 bp hosszúságú promoter/nem lefordítható vezető területe 266 bp-t tartalmaz a feltételezett TATA-boxtól felfelé. Ha ennek a felfelé eső szakasznak a felső (körülbelül) felét egy fÜuJ restrikciós helyig kivágjuk, akkor az átmeneti promoter-aktivitás körülbelül az egytizedére csökken a portokokhan, de nem szűnik meg teljesen. Sgy Belli restrikciós hely beépítése a feltételezett TATA-boxtól számolt -15-től -10-ig terjedő pozíciókba nem befolyásolja különösebben az aktivitást, de ha ezt a klőnozóhely-módositást deléciöval kombináljuk, az aktivitás megszűnik.

Linker-szkenning analízist végzünk a feltételezett TATAboxtól számított -ló-tői a -261 pozícióig terjedő területen,, zömmel 10 bp-os lépésekben, a 9. ábrán látható módon. Az oszlopdiagram x-tengelyén az egyes, 7-10 helyettesített bázispárt tartalmazó szegmentumok vannak feltüntetve. Az y-tengelyen a normalízálfc iuciferáz-aktivitás van megadva a vad típusú promoter aktivitásának százalékában. A 1inker-szkennig szerkezetek és a vad típusú kontroli egyaránt magukban foglalják a SglH klónozó helyet. A minimális promoter a 10. ábrán látható (a TATA-boxot

77.33VBS «33— Jjif // ♦ ΦΦ κ»' aláhúzás jelöli). Egyetlen kritikus területet azonosítottunk a -112 és -9.3 pozíciók között, mig további, jelentős hatású területek vannak a -161 és-152, a -141 és -132, valamint a -92 és -83 pozíciók között. A körülbelül -102 és -93 pozíciók közé eső szakasz a P-motivum két, egymást átfedő másolatát tartalmazza, amiről tudjuk, hogy részt vesz más portok-specifikus promoterok felső területének működésében, valamint olyan oromoterokéban is, amelyeket a kukorica P génjének terméke aktivál. A myb-homológ P gén szabályozza a kukorica virágzatában a flobafén-pígmentáciöt azáltal, hogy közvetlenül aktiválja a .£lavonoid-foioszintézis génjeinek sorát tGrotewald et al ., Ceii 7 6, 543-553' (1994)1.

A BS92-7 promoter felhasználása az MS4S gén működtetésére

Az M.S45 gén egy himfertilítás-gén a kukoricában, amelynek mutációi megszakítják a mikrosporogenezist a mikrospörák vakuolizálásával, amitől a növény hímsterillé válik. Ha a klónozott kukorica MS45 gént bejuttatjuk egy ilyen .hímsteril növénybe, akkor a gén pótolhatja a mutánst és helyreállítja a hímfertílátást , Az MS45 gén és promotere teljes leírását az US .5,478, 369 és 6,037,523 számú szabadalmi iratokban találjuk meg, amelyeket referenciaként tartunk számon. A PHF6641 egy pUC8 plazmid, ami az MS45 gén promoterát és kódoló területét — az íntronokkal együtt — tartalmazza, ahol a 1-3335. nukleotidok egy Adói DNSfragmentumként vannak klónozva a 35S::PAT szelektálható markergén fölé (lásd a fenti leírásokat). Helyre irányított mutagenezissel egy Nóol restrikciós enzim felismerő helyet hozunk létre az MS45 gén transzlációs start-kodoniánál (az 1389. nukleotid).

77.3SVBS

Λ» Α Λ »* φ* X* bgy 4,7 kbp BindlTI-BcoRI fragmentumot ···· ami az MS45-35S::BAT mutagenízált változatát tartalmazza — klónozunk a pSBll plazmádba, amiből hiányzik a 35S GúS és 35S BAR géneket hordozó ScoRI DNS-fragmentum: igy kapjuk meg a PHPlö890 plazmidot. A ΡΗΡΪ2025 plazmidot úgy készítjük el, hogy az MS45 promotert kicseréljük a B.S92-7 prcmct orral. Ezt a plazmidot Agrobseteríum segítségével, juttatjuk be olyan kukorica-növényekbe, amelyek az MS4 5 gén mutációja következtében hlmsterilek. Mind a 22 transzformációs esemény a himfertilis fenotípus halyreáÍrását eredményezte, Fehér jekivonatokat készítettünk a mikrospőra-fejlödés tetrád-felszabadulástól a korai vskuolizálödásig terjedő stádiumaiban lévő portokokból. Az ímmonbiot-analízis azt mutatta, hogy az MS45-fehérje csaknem a vad típus szintjén fejeződik ki, ha a kukori-

ca	BS92-7 promctera műi	didteti a gént	. Kontrollként egy	vad tipu-
sú	MS45 génnel rendelk	ezo, beitényé5	sztett vonal MS-45	fehérjéje
szó	Igáit. így tehát a	BS92-7 p r omol	:.e.r képes egy gén	megfelelő
szí	ntű kifejeztetésére	és ezzel egy	hlmsteríi mutáns	vonal hím-

fsriiitásának helyreállítására. Az eredményeket az 1, táblázatban foglaljak össze.

a. BS7 promotex aXkalmazásávaX ,38I/£

A BS92-7 promoter emellett képes egy citotoxikus gén k.ifejeztetésére is, amivel egy hímfertilis genotípus, hímsteríilé tehető. A. hímsterll növényeket létrehozó szerkezetek az alábbiak szerint készíthetők el. Ehhez az £. coli DNS-adenín-metüáz (DAM) génjét használjuk fel (US 5, 792, 853; MS45::DAM-35SPA7 PHPI2634) .

A ÓAM gént helyre irányított mutagenezíssel [Su és El-Gewley, Gene 69, 81-89 (1988;) módosítjuk és egy nmei restrikciós helyet viszünk he a 186, nukleotídnái, a DAM gén Indító ATG kohonjától kilenc nukleotid távolságra 5' irányban. Egy 1,4 kbp Híndlll-Ncol fragmentum - ami a PHPG054 plazmádban a kukorica MS4 5 promcterát tartalmazza — Ncol helyét dKTP-vel feltöltjük T4 DNS-polimeráz segítségével, majd a fragmentumot ligáljuk a Szsal helyre, ami a DAM gén 5* végét tartalmazza. A gén transzkripcióját a burgonya proteinéz-inhibitor II gén (Pínl.15 3' -szekvenciájának (2-31-0. nukleotídok; An et ai. , Plánt Celi 1, 115-122 (1589/1 hozzáadásával termináljuk.

A PHP12634 ÍMS45::DAM-35SPAT) kukorica transzformációs vektor megszerkesztéséhez a 2,5 kbp kimére gént — ami az MS45 promotert, a DAM gént és a Pi.nll 3' nem lefordítható területet tartalmazza -- egy HindIJI~.NöoI fragmentumként klónozzuk a pSBll vektorba, a 35S::PAT géntől felfelé (a pSBH a pBB31-ből származik; hiányzik belőle az az EccPi fragmentum, ami. a 35SGUS és 353BAP géneket tartalmazza) . A. PAT gén a Strepfcosryces virídccbromaganes fosztinctríoin-aoetii-transzferáz génjét kódolja (6557. nukleotídok; lásd EB 0 275 957 A; génbanki azonosító száma A02774). A gén a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promoterának és ‘UZSÁ/SS

Franck et a 1.. , Cél 1 21, 2:85-294 (1980>j A 35S:

terminátor szakaszának transzkripciós szabályozó hatása alatt áll (a 6906-743:9. és 7439-7632. nukleotidok; US 5,352,605;

komponenst egy xVcoJ-Kpnl fragmentum foglalja magában, ahogy az a pDfí.51 expreszsziós keret leírásában szerepel [Píetrzak et al., Náci. Acids kés. IV 5857-5663 (1986) j,

A PHP12635 vektort (SS7::D6M/35S;:PAT) úgy készítjük el, hogy a PHP12634 MS45 promoterát kicseréljük a BS7 proaoterra.

A következő kísérletben a BS92-7 promotert használjak a DAMmetiláz sterilitás-gén {DAM} transzkripciódának vezérlésére. A vad típusú kukoricát agy olyan vektorral is transzformáljuk, amiben a DAM gént az MS45 promoter működteti. A 2. táblázatban látható, hogy a SS92-7: :.DAM' transzformánsok 100 %-a. himeter.il, szemben az HS45::DAM transzforvánsokkal, amelyek közül csak 25 % bizonyult hlmsteríinek.

l

Allélizmus

A SS927-8.1 kiónt térképezzük egy ECS RFLP populációban az EcoPÍ restrikciós enzimmel. A. klón a 7. kromoszóma hosszú karján helyezkedik el a bnll5.40 és az umcllOa markerek között. Az ms7 hímsteril mutáns az egyetlen ismert hímsteríiitás-gén, ami a 7,

3SÍ/3S w/·

ÍZ kromoszómán található. Az allélek keresztezését a SS92-7 mutáns és ^az ? törzsvonal között végeztük el. A keresztezésből származó utódok szegregáiódtak a bim.steriiitásra, ami azt jelzi, hogy ugyanazon gén felelős a mutáns fenotipusért mind a BS92-7, mind az ms7 családban.

Az sis7 izolálása

Az ms7-5.1 kiónt megtisztítjuk és olyan belső primerek segítségével szekvenáljuk, amelyeket a SSS'2-7 szekvenáiásához már elkészítettünk. Az m.s 7-bői levezetett fehérje csak egyetlen szeri nnel tartalmaz több aminosavat, mint a BS92-7-ból levezethető

különbség a két	gén kbz
romoter-szakasza	.bán. Az
ifejesődécsel va	ló vizsgí
okokban aktiv.
: említettük, a	SS92-7
orica hímsteril	mutáció
Ltás lén fel. A	gén nővé

rilitás befolyásolása céljából.

10, példa:

A BS92-7 cirokcbisr RT-PCR ás a BS92-7 kukorica cDNS összehasonlítása

A cirokban azonosítottuk a BS92-? egy homológját. A cirokBS92-7 cDhS-t izoláltuk a kukorica BSS2-7 gén primőrjeinek alkalmazásával egy polímeráz láncreakcióban, ahol a eirokeímer c DNS·-ét használtuk terápiát ként. Az Így kapott cDNS~fragmentumot a fent leírt módon szekvenáltuk, majd összehasonlítottuk a kuko77.. 381/BE bk.

ζ rica BS92-7 cDNS-ével, A nukletid-szekvencíák összehasonlítását a 11. ábrán mutatjuk be, ahol látható, hogy a nukleotíd-szekvenclák azonossága 89,.1 %-os, míg a belőlük levezethető fehérjeszekvenciák azonossága 94 %-os,

A fentiekből nyilvánvaló, hogy a BS92-7 gén nélkülözhetetlen a növények himfertilitásához.

Látható tehát, hogy találmányunk végül minden célját elérte.

77-.3S1Z8S / '?

: .... ....

{.SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE) SEQGEEGE LTSTTNG <110> Pioneer Hi-Hred Ihtex-natioaal, Inc.

<120:> Kncieotide S-equences Mediating Maié Particity and Method cr 2sing_: Satóe <130> 1147~PCT <1.10 ÜS 60/2 67,527 <14 0· 2001-02-00 <160 S

<17 0	EastSSQ fór	ííirídows	Versien	4.0
<210>	1
<21.1>	119 7
<21.2>	aa
<2:13>	Zea	maya
7,;,; ? >
<221 >	COS
<222>	(2) .	..(934)
<400>	1
2 2 tg	3. £ £	lÉ'Ö1· ülOo	aag	20'	aae gta	tgc	gta aco geo geo	tca ggc	11t
Var	Thr	Sex· Sex	Lys	Gry	Lys Val.	Cys	Vai Thr Giv Aia	Ser Gly	Phe
1			5				:w	15

gt 1 Val

geo Alá

tét Ser

tgg Trp 20

ett Let

a Lé He

aaa Lys

«99 Arg

ctc Len 25

ctc Let

gag Gin

tet Ser

gga Gly

tat Tyr 30

est his

g7g Val

97

gta

222

aet

gtc

agg

gac

cca

gga

aat

CSC

eaa

a a a

aea

gcc

cac

ott

14 5

Val

Giy

Thr 35

Val

Arg

Asp

Pro

Gly 40

Asn

P 3.8

Gin

Lys

Thr 15

A.ia

his

Len

t-22

333

tta

cet.

22«

got

aaa

gag

agg

ctg

caa

ate

gtg

cga

get

aat

193

Trp

Lys 50

Len

Pro

Giy

Aia

Lys 55

Gin

Arg

Let

Gin

He 60

Vai

Arg

Aia

Asn

ctg

ttg

gaa

gaa

772

a go

ttc

gae

agc

gcc

27 0

a tg

geo

tgt

gag

29 <

211.

Lea 65

Let

Gin

Sít

Gly

Ír 7ö:

Phe

Asp

Ser·

Aia

Var 7.5

bet

Aia

Cys

Gin

(ily 80

gta

ttc

cac

de r

gca

tcc

ccc

gtc

ere

get

aaa

ccc

gac

tet

aet

agc

28 3

Val

Phe

His

Thr

Aia 85

Ser

Pro

Vai

Let

Ara 20

Lys

Pre

Asp

Ser

Thr 95

Ser

aag

gag

gac

a~g

ct c

gtc

cet.

2«9

gtg

aac

227

aet

ctg

a.ac

gtg

ctg

037

Lys

Gla

Asp

Thr 100

Let

Val

Pre

Aia

Val 105

Asn

Giy

Thr

Len

Asn 110

Val

Len

aga

te g

tgc

aag

aag

aae

ccc

ttc

ctg

aaa

agg

gtc

gtc

Ctt

aeg

tet

385

Arg

Ser

Cys 115

Lys

Lys

Asn

Pro

Phe 120

Let

Lys

Arg

Val

vai 125

Len

Thr

Ser

teg

teg

tet

gcc

<?tg

agg

atc

agg

gac

gac

ggt

ggc

cag

tcc;

agt

acc

43

c

Ser

•Sár

Síi r

Alá

Val

arg

He

Arg

Asp

Asp

Gny

Giy

Gin

Ser

Ser

Asn

130

.13.3

140

arc

'Γ.Γ’.'ίί

ctg

gac

gaa

a cg

aca

tgg

aqc

tcc

gtg

CCS

A-.· U-

tcc

gag

aag

48

11c

Sex

Lee

Asp

Glu

Thr

Thr

Trp

Ser

Ser

Val

Pro

Leu

Gys

Gin

Lys

143

ISO

155

160

ctg

cat

eta

tgg

£ at

•gcc

cta

gcc

aag

gta

ttt

gag

aaa

gcc

gcg

C

9

Met

Kis

Leu

Trp

Tyr

Alá

Lee

Alá

Lys

Vai

Phe

Alá

Giu

lys

Ara

Alá

’ r\

170

175

tg g

gag

ttc

gcc

aa_g

gag

aac

ggc

atc

C & c

ett

gtg

act

gtc

ctc

ccg

b /

Trp

Sic

Phe

Alá

Lys

Glu

Asn

Gly

He

Asp

Leu

Var

Thr

Var

Leu

Pro

ISO

105

150

reg

ttc

gtg

atc

A?

ccc

agt

ttg

t CC

CCC

gag

C13

ege:

gt t

<iCC

get

ή 3

9

Se?c

Phe

Val

lie

G £ V

Pro

Ser

Leu

Ser

His

Glu

Leu

Gys

Vai

Thr

Alá

193

200

205

tea

gac

g te

cta

ege

eta

ttc

C$&

ggc

gac

acg

gca

sgg

ttc

acc

tcc

57

3

Ser

Asp

Val

Leu

Oly

Leu

Phe

GFi.

Gly

A.sp

Thr

Alá

Arg

Phe

Ser

Ser

210

215

220

t a c

gga

ag a

atg

900

tac

gtc

cac

atc

gac

gac

gtt

gtg

agc

agc

cac

72

3

Tyr

Oly

A ·: g

Met:

Oly

Tyr

Val

His

He

Asp

Asp

Vai

Alá

Ser

Ser

His

225

230

235

240

atc

ctg

gtg

tac.

cag

gcc

CCC

cac

gcc

gcc

ggg

3. C 0'

tac

ctg

tgc

agc

~i Z' / o

13

He

Leu

Val

Tyr

Glu

Val

Pro

G JLFt

Alá

Gly

.Arg

Tyr

Leu

Cys

Ser

24 3

250

255

tea

ctg

ctg

ctg

g&e

3,<aC

gac

gsg

ctg

gt c

•CCC

teg

c£c

gcg

£ a 3:

ccc

3 3.

7

Ser

Val

Val

iea

Asp

Asn

Asp

Glu.

Leu

VH.

Ser

Ser

Leu

Alá

Lys

Atg

260

265

270

tac.

ctg

ata

ttc

ccc

ata.

ccc

egg

agg

ctg

aac

agc

ccc

tac

ggc

aag

86

Tyr

arc

He

Phe

Pro

He

Pro

Arg

Arg

Len

Ara

Ser

Pro

Tyr

Giy

Lys

2? 5

230

205

cag

tcc

tac

cag

ctg

aac

acg

::cg

«.ag

ctg

cag

999

ctg

ggc

ttc

aag

91

3

G-ΐΓί

Ser

Tyr

Gin

Leu

Asn

Thr

Ser

Lys

Leu

<7 in

Gly

Leu

Giy

Phe

Lys

230

2 35

300

ttc

aga

ggg

gtg

cag

gag

atg

ttc

gac

ca c

tmJC

gtg

cag

tcc

eto

aaa

88

•t .L

Phe

Arc

Gly

Vai

Gin

Glu

Met

Phe

Asp

Asp

Gys

Vai

Gin

Ser

Len

Lys

303

310

515

320

gac

cag

99*

C£C

ctg

ctg

gag

t gt:

CCC

ctg

tga

aotgcgstgg gggtgcctcc 10

14

Asp

Gin

Gly

Kis

Leu

Leu

Glu

Gys

Pro

Leu

*·

325

330

tgtgaacgce -cgttt-t-tttt tttcffccaat sattocacgt catgteaegg tgtcctcgcg 1074 cagactgcta ctgteaggtg t-oagggcg-tc atagotca-cg ggctotacgg ct.acatgaat 1134 aaaatgtcac -gctagctcgt catttgcttt gccatttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactc 1194 gag 1137 <2r0> 2 <211> 330 <212> PAP <213> Les maya

Λ « ** »»

<4 0C Val

;> 2 Thr

Ser

Ser

Lys

Giy

i,y:s

Val

Gys:

Var.

Thr

Gry

Ai 3

Ser

Οίν-

Phe

1 Val

Aj. a

Ser

Trp

5 Len

ile

Lys

Arg

Leu

10 Leu

Gls

Ser

Gly

Tyr

Ιο' His

Val

Val

Giy

Tar

20* Val.

Arg

Asp

Pro

Giy

25 Asn

isis

Gin

Lys

Thr

30 Ara

his

Leu

Trp

Lys

35 Leu

Pro

Giy

Alá

Lys

4 0 Gla

Arg

Lea

Gin

lie

45 Val

Arg

Alá

Asn

Len

50 Leu

Glu

Glu

Giy

Ser

55 Phe

Asp

Ser

Alá

Val

SO Met

Alá

Gys

Glu

Giy

65 Val

Phe

Kis

Thr

Alá

70 Ser

Pro

Val

Leu

Al a

75 Lys

Pro

Asp

Ser

Thr

80 Ser

Lys

Gin

Asp

Thr

35 Leu

Val

Pro

Alá

Val

90 Asn

Gly

Thr

2,eu.

Asn

95 Val

Leu

Arg

Ser'

Gye

100 Lys

Lys

Asn

Pro

Phe

105 Len

Lys

Arg

Var

Val

210 Leu

Thr

Ser

Ser

Ser

115 Ser

Alá

Val

Arg

2 la

1:20' Arg

Asp

Asp

Ο .ί. y

Gly

125 Gin

Ser

Ser

Asn

Ha

130 Ser

Leu.

Asp

Gla

Thr

2 35 Thr

Trp

Ser

Ser

Va.i.

140 Pro

Leu

Cys

Gin

l,ys

145 Mát

mis

Len

T rp

Ty.r

150 Al a

Leu

Ál a

Lys

Val

1.55 Phe

Ara

Glu

Lys

Alá

160 Alá

Trp

Glu

Phe

Ál a

165 Lys

Gin

.Asa

Gly

lie

170: Asp

Len

Val

Thr

Val

175 Len.

Pro

Ser

Phe

Val

180 Tle

Giy

Pro

Ser

Leu

185 Ser

His

Grr

Leu

Cys

190 Val

Thr

Ara

Ser

Asp

195 Val

Leu

Giy

Leu

Phe

200 Gin

Gly

Asp

Thr

Ara

205 Arg

Phe

Ser

Ser

Tyr

210 Giy

Arg

Mát

Giy

Tyr

215 Val

His

lie

Asp

Asp

220 Vei

Alá

Ser

Ser

His

225 Ile

Leu

Val

Tyr

G Te

230 Val

Pro

Gin

Alá

Alá

235 Gly

Arg

Tyr:

2,ea

Gys

240 Ser

Ser

Vei

Val.

Lea

245 Asp

As n

Asp

Glu

Lea

250 Val

Ser

Ser

Leu

Alá

255 Lys

Arg

Tyr

Pro

Tle

200 Phe

Pro

2:1.«·

Pr o

Arg

265 Arg

lu-u

Aon

Ser

Pro

270 Tyr

Gly

Lys

Gin

Ser

275 Tyr

Gla

Asn

Thr

2S0 Ser

Lys

Leu

Gin

Gly

285 Lea

Gly

Phe

Lys

Phe

290 Arg

Giy

Val

Gin

Glu

295 Két

Phe

Asp

Asp

Cys

300 Val

Gin

Ser

Leu

Lys

305 Asp

Gin

Giy

His

Leu 325

31G Lea

Gin

Gys

Pro

Le»· 330

315

320

<21ö> 3 <2U> 2541 <212> LKA <2I3> Sea xnays < 4 0 0 > 3 gaattctcgfc ctctgcaatc cacctagaaa tgtaictgot cttctctaga ccagtgtcta ci «aggot:: r agggactgtc attacsttaa

C CSCC&S ctcggcggtc cgtgccgtgg agcgacgcgt t.actgt.g.at.c atgttccfcgc gctgagaaca grtgcctott agggacoocg taartettga aagacagecc a&ctgaaecg taaaoagtgg aaagtggafca ctctttctch •asgcaaatgg cgcsgtcgcc tacttatcac aooaacttat cciggafcga ttgcaaatct acctccsacc aacccagcfcfc sccaaagthg tgctgahasy argz.gcgatt attgctctt't cgatgcttta taagagaagg ttggtcagca t cgatctctg tggtgacctc aagcaaggg-c aaggtatgcg Laacoggggc cgotta ·: caa «cggctcctc gagtctggat atcat-gtggt gtatf. fcgcga aatatcatta ctatcgtatc agtcct-cttt tteocaattt tttotttttt ttttttggta acccacaa-gg sec 1tt ggaa a11a cetggo getaaegaga ggctgcaa a t

120 ISO 24 0 300 360 420 400 54 0 600

Χ ν*« 40X0 ί '· *>« * * 0 X * ». Μ

X 0-40 0 00 X 0

0X0 * * X 4 cgtgcgagcfc tgfcatteeac •fccgccgcata aagcgcgttg tgeatggtgc tegtgcasga aggateaggg tccgtgccac ctctctgfcca tegtegtcce agaa-agcggc cgfc fcngtgat gccfcattcca agafcgactgg cccaccccca cgacgacgtt cctgtgcagn cccgatafctc ttttaagatc cccctacggc gttcag-aggg cctgct-ggag gggtfc.gcgtc tcacggtctc fcacatgaata cgaacttccg afcgatggtga. ggtttggatg tttgtccact aaa-gccacaa tagtgsgcat. tacact;:: rgfc. aaaccgtacg gatcfcgttgg actgcatccc tatatatgca catcfcaccgfc aggaggacac agaacccgtt aogacggtgg tccgcgagaa tcgatctcaa ttttgttgfct gtgggagtfec cggg ccca gt aggtatteát aaacaagagg ggcgacaagg gcgágcagcc tcagtggtgc cceataccce tcfcgaaeggg aagcagtcgt gtgcaggsga tgccecctgfc ccgaacccgc ct-cgcgcaga aaaacgtcac fctegc·; gtgt tcggaggcag gacgaatggc gg.acgg.cact agagagaatg gcacacctgt ssaecascca tggctggcgc aagaagggsg ecgtcetcgc i. a ί.·..· -..gga a c acgtgaagct gctcgtccct cctgaaaagg ccagtccagt g-atgcatgtg aecgtgátét cacccgaagc gccaaggaga ttgtcccacg etcaatoatt tatacatata caaggttcag acatcctggt c gg λ c a a c g a ggaggtcagt agagccgtgt a ce>~ g c t g a .c fc gtt agat giga siC i. g g ::í .fc tgttaatfccg ctgctactgt geregteatt gtgettótgg gca eegg fc gt tccaccafccg agenfc eaa ga aatgtacagt atttacatgc accaaccaac c cfctcgaeagc a a«a eccg & c atgcatccta agetatetaa gcggtgaacg gtegteetta aacatétege agatártáét gaaaaacaeg fcatggtatgc a cggcat cga aactstgcgt cgtaegtgfcfc· tatactetet et- cg t a c gga gtacgaggcc egagetggte egt cgtegeg gcatggtccg caagtcgaag c <. g e gt <jt-.ag g g ggt g cc .. c fcfc. tttttfcte cagggcgfcca tgctttgect ctgccggtcg gtgcgtgcga atefegagtea fctcagtctca g <. ζ. *v eangcc afcgcatgfcac casgcaagea gccgtgatgg tctacfcagca ctgeagcctt getaagetgt gtaetetgaa egterecgtc tggacgaasc gaacagfcgtc catgegegca Ce t ctgCC-a-ctCí ccttgfcgaet taccgcttea etggtfctfceg gttccfcecte agaatgeggt ccccaggccg tccfccgctcg tegtetggat fctetgetgca etgcaggggc fcegeteaaag cgcc.tgt.gaa ttcsafcaatt: t ag et cacgg tttttfcfcfcgg ccttgtcggt tcaaecgaae treggatttt aateeeaaat acagctcact seecccsccc afceaageaaa cctgfcgsggg aggcatgcca ttcfcatacgg tt fcfccatgca cgtgctgaga gtctgcggtg gaeatggage fcacfcctetet caegttgceg gtatttgeag gtceteeegt gsegteetag tatgttaaat cccccccccc acgtccacat ccgggaggta cgaaacgcta gfcgegfcgcca •ggctgaacag tgggctteaa aceagggaca egegeeggtt ecaegteatg gctctccggc gttcgttcfc.g gtggcgacfcg gccatgtggc gaaeegctgs e e e fc e a e ge age-tcaaaag eeactsefctg eaeaeagage

660 720 780 840 300 360 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1300 1440 1800 1560 1820 1 €80 1740 10 00 1060 1020 1580 2040 2100 2160 2220 2280 2340 24 00: 24 60 2520 2541 <210.> 4 <211> 330 <212> FF.T <213> 2«a maya <40C> 4

Val 1

Thr

Ser

Ser

Lys s

Gly

Lys

Val

eys:

Val 10:

Thr Gly Aia

Ser

Gly 15*

Phe

Val

Aia

Ser

Trp

Lett

lle

Lys

Arg

Lea

Len

Gla

Ser

Gly

Tyr

His

Val

20

25

30

Val

G.:.y

Thr

Val

Arg

Asp

Pro

Gly

Asn

His

Gla

Lys

Thr

Alá

His

Len.

35

40

45

Trp

Lys

Le a

F re

Gly

Alá.

Lys

Gla

.Arg

Lea

G in

Tie

Val

Arg

Aia

Asn

50

55

6 0

est;

Lee

Glt

Gin

Gly

Ser

Fhs

Asp

Ser

.Alá

Val

fcíet

Aia

Cys

Gl.ti

Gly

65

70

75

80

Val

The

His

Tar

Alá

Ser

Pro

Val

Le a

A.ls

Lya

Pro

.Asp

Ser

Thr

Ser

SS

50

95

Lys

Gla

Asp

Tar

Lett

Val

Pro

Aia

Val

Asn

Gly

Thr

Len

Asa

Val

Lee.

100

105

110

Arg

3-ar

Cys

Lys

Lys

Asn

Pro

Phe

Let;

.Lys

Arg

Val

Val

Lan

Thr

Ser

125

120

125

Ser

Ser

Ser

Alá

Val

Arg

lle

Arg

Asp

.Asp

Gly

GI y

Gin

Ser

Ser

Asa

130

135

140

11«

Ser

Lea

Asp

Gin

Tar

Thr

Trp

Ser

Ser

Val

Pro-

Leu

Cys

Giu

nys

140

150

155

160

>« ~

Met

His

Lee

Trp

Tyr Alá Leu Alá Lys Val

Phe

Alá

Giu Lys Ara 175

Ara

IS 5

170

Trp

Gla

Phe

Alá

Lys

Glu

ASU.

Gly

Ile

Asp

Lee

Vai

Thr

Vai

Le e

Pro

180

185

180

Ser

Phe

Val

Ile

Gl y

Pro

Ser

Lee

Ser-

His

Gle

Leu

Gys

Vai

Thr

Aia

ISO

200

205

Ser

Asp

Val

leu

Gly

Leu

Phe

Gin

Giy

Asp

Or

Alá

Arg

Phe

Ser

Ser

210

215

220

Tyr

Gly

Arg

Két

Giy

Tyr

Val.

His

lie

Asp

Asp

Val.

AJ. a

Ser

Ser

His

Ó '> - V. ¢. ..·

230

235

240

Ile

Leu

Val

Tyr

Glu

Val

Pro

Gle

Alá

Alá

Gly

Arg

Tyr

Lee

Gys

Ser

245

250

255

Ser

Vai

Vai

Lee

Asp

Asn

Asp

Glu

Lee

Vai

Ser

Ser

Lee

Als

tys

.Arg

2 80

2S5

270

Tyr

Pro

lie

Phe

Pro

lie

Pro

Arg

.Arg

Leu

Asn

Ser

Pro

Tyr

eo. y

Lys

275

2 8(5

285

Gin

Ser

Tyr

Glu

Lee

Asn

Thr

Ser

Lys

Lee

Gin

Giy

Leu

Gi y

Phe

Lys

230

2 85

300

8 te

Arg

Gly

Vai

Gin

Gle

Met

Phe

Asp

Asp

Gys

Vai

Gin

Sex-

Leu

Lys

385

310

313

320

Age

Sin

Gly

His

leu

Lee

Glu

Gys

Pro

Leu

325

330

<210 5 <210 322 <212> LNA <213> Zea mays <400 5 gaattcfccgt ctcggcggte aactgaaccg taaacagtgg aaagtggata ctctttctct 60 ctctgcaatc cgtgccgt-gg aagcaaatgg cgcagtcgcc tacttatcsc. accas-cttst 120 cacctagaaa agcgacgcgt cctggatcga ttgcaaatct acctccaacc aacccagctt 18G tgtatctgct tactgtgatc accaaagttg tgctgatacg atgtgcgafcfc attgctcttt 240 cttctctaga atgt'tcctgc cgatgctfcta t-aagagaagg fctggtcagca tcga-tctctg 300 ecagtgtcta gctgagaaca tg 322 < 2 a 0 > 6 <210 187 <212> DNA <213> Zea maya <400> 0 cgcgtcctgg atcgattgca aatctacctc caacceaces agctttgtat ctgcttactg SO tgatcsccaa agtfcgtgcüg atscgatgtg cgattattga tctttcfcfcct ctagaatgtt 120 cctgccgatg ctttataaga gaaggttggt cagcatcgat ctctgccagt gtctagctga 180 gaacatg 187

<210 <210 <212> <218>	7 537 LKA Scrghnxa bicéior
<220>
<220	GLS
<222>	ír; . ..	.(535)

<4Ö0> 7

gta

acc

ggg

get

to&

GG'V

ttt

att

gee

tet

tgg

ett

atc

aaa

egg

ctg

Z, C;

Val

Thr

Gl. y

-A.Ü. 3

Ser

Gi y

The

He

Aia

Ser

Trp

let

He

Lys

Arg

Let

1

5

10

15

ctc

gsg

tet

gga

tat

03 0

gtg

gta

GGG

act

gr c

aga

esc

003

gga

aat

Q (7

Leó

Gla

Ser

Gly

Tyr

Kis

Vai

Vai

Gly

Thr

Val

Arg

Asp

Pre

Gly

Asn

20

25

30

CSC

caa

sas

aca

gca

C&C

ett

tgg

3 3 iíi

t c a

cet

OGt

gee

3 3 3

gag

agg

144

Kis

Gin

Lys

Thr

Aia

His

hat

Trp

Lys

Lee

Pro

Gly

Aia

Lys

Git

Arg

35

4 0

4 5

ctg

c« 3

att

gtg

oga

get

gat

ctg

ttg

gaa

gaa

GGG

agc

ttt

gsc

aat

j. y.z

Let

Gin

He

Vs I

Arg

Al a

Asp

Let

Len

Gin

Et r y

Se r

Phe

Asp

Asn

SG

55

60

<jCt

gtc

atg

gae

tgt

gat

ggc

gtc

ttc

cac

act

gca

tcc

cet

gtc

O-t'C

ο λ o

A ia

Val

Me

A.sp

Cys

Asp

Gly

Vai

The

Kis

Thr

Aia

Ser

Pro

Vai

Len

65

70

75

80

get

& 3 3

tet

gat

tet

agt

agc

sae

gsg

gaa

acg

ett

t:gt

cca

gca

gta

Z 6 <*!

Aia

Lys

Ser

Asp

Ser

Ser

Ser

Lys

G.ls

GI n

Thr

Len

'Cys

Pre

Alá

Val

85

90

95

&&c

GG

act

et g

aat

gtg

cts

aga

Ccg

tgc

3.3 CJ

aag

330

Ο O 3

ttt

ctg

33 6

ASn

Gly

Thr

Le a

.Áss

Vai

Le e.

Arg

Sor

Cys

Lys

Lys

Asn.

Pro

.Phe·

Let

100

105

ne

SS 3.

agg

gtt

gtt

ett

acg

tet

tea

tea

tet

gca

gtg

agg

att

agg

gat

384

Lys

Arg

Val

Vai

Let

Thr

Sár

Ser

Ser

Ser

Aia

Vaí

Arg

Iie

Arg

Asp

115

120

125

gat

gat

eag

cet

aat

atc

tea

ctg

gat

033

3.03

3C3

tgc

agc

tet

gtg

•i: O Z

Asp

Asp

Gin

Pre

Asn

iie

Ser

Let

Asp

Git

Thr

Thr

Trp

Ser

Ser

Vai

130

135

140

CCS

ctc

tgt

gaa

aag

atg

eag

cts

tgg

tat

gee

cts

gcg

aag

gta

ttt

480

Pre

LSU

Cys

Git

Lys

Tet

Gin

Lee

Trp

Tyr

A.r.3

Let

Al.a

Lys

Val

The

145

150

155

160

go&

gog

aaa

gtg

gee

tgg

gaa

ttc

gee

aag

eag

aac

aac

atc

aac

ett

528

.Alá

G.ls

Lys

Als

Aia

Trp

G.ls

Phe

Als

T-:V O

Gl.:

Asn

Asn

He

Asp

Let

165

170

·· '*· c *. ; O

gtg

act

gtc

ctc

cca

tea

ttt

gtg

atc

egg

ccc

agt

tta

tcc

eat

gaa

st, s ' \·

VS 1

Thr

Vs 1

Let

Pre

Ser

Phe

Vs 1

He

Gly

Pro

Ser

Len

Ser

Kis

Gin

18 Q

185

190

cta

tgt

gtt

&ce

get

tea

gat

gtc

cta

GGC

tta

t te

O síd

GG

gae

acg

624

Lsu

Cys

Vai

Thr

Aia

Ser

Asp

Vai

Len

Gly

Len

Phe

Gin

Gly

Asp

Thr

195

200

205

CCS

agg

ttc

agt

tet

tac

gga

aga

atg

gga

tac

gtt

CSC

atc

g a c

gat

67 2.

A.Is

Arg

The

Ser

Ser

Tyr

Gly

Arg

Est

tr y

Tyr

Vai

Kis^

He

Asp

Asp

210

215

220

gtt

gvg

sec

agc

cac

atc

ctg

G tg

t

637

Vai

Aia

Thr

Ser

Kis

ne

Lee

Val

225

230

: ί ί *

<210> 3 <2'Π.> 232 <212> ΡΕΤ <213> Sorgham hiaoiot <4Q0> 8

Vai 1

T Ár-

Giy

Aia

Ser 5

Giy

Phe

il®:

Aia

Ser 10

Trp

Lee

Ile

Lys

Arg 15

Lee

Lea

tói a

Ser

Giy 241

Tyr

His

Val.

Vai

Giy 2.5

Thr

Vai

Arg

Asp

Pro 30

Giy

Asn

His

G in

Lys 35

Thr

ALa

His

Len

Trp 40

Lys

Lea

Pro

Giy

Aia 45

Lys

Gia

Arg

Leu

Gin 50

lie

Vai

Arg

Aia

Asp Sa'

Lea

Lee

Gia

Gin

Giy 60-

Ser

Phe

Asp

Asa

Aia 55

Vai

Met.

Asp

Cys

Asp H

Giy

Vai

Phe

8 is

Thr 75

Aia

Ser

Pro

Val

Lea 8Ö

.Aia

Lys

Cser

Asp

Ser 35

Ser

Ser

Lys

Gia

Gli): 90

Tar

Lea

Cys

Pro

Aia 95

Vei

Ase

Giy

Thr

Len 100

Asn

Val

Lea

Arg

Ser 105

Cys

Lys

Lys

Asn

Pre 110

Phe

Lee

Lys

Arg

Vai US

Val

Len

Thr

Ser-

Ser 120

Ser

Ser-

Aia

Vei

Arg 125

lie

Arg

Asp

Asp

Asp 130

Gin

Pro

Aaa

lie

Ser 135

Lea

Asp

tó.i a

Thr

Thr 14 0

Trp

Ser

Ser

Val

Pro 145

Lea

Cys

Gin

Lys

Aet 150

Gin

Laa

Trp

Tyr

Als 155

Lea

Aia

Lys

Vai

Phe ICO

Aia

Gis

Lys

Aia

Aia 165

Trp

GTa

Phe

Alá

Lys 170

Gia

Asn

Asn

Ha

Asp 175

Lea

Vai

Thr

Val

Len 180

Pro

Ser

Phe

Vai

lie 185

Giy

Pro

Ser

Lea

Ser 190

Kis

Gia

Lea

Cys

Vai 135

Thr

Aia

Ser

ASp:

Val 200:

Lea

Giy

Lea

Phe

Gin 205

Giy

Asp

Thr

A.La Val 225

Arg 210 Aia

The Thr

Ser Ser

Ser His

Tyr lie 230

Giy 215 Lea

Arg Vai

Met

Giy

Tyr

Val 220

His

lie

Asp

Asp

Claims (5)

1. Izolált nukleinsav-szekvenoia, amely az 5. számú szekvenciát (SEQ ID NO: 5} tartalmazza, vagy amely nagyon szigorú körülmények között hi.bridizál az 5. számú szekvenciával, és egy hámszövet preferáló szabályozó régió funkciójával rendelkezik,

2. Transzformációs vektor, amely az I. igénypont szerinti szekvenciát egy heterolőg nukleotid-szekvenoiához működőképesen kapcsolódva egy expressziős kazettában tartalmazza.

Izolált nukleinsav, amely -egy, a 6, számú nukleotid-szekvenciát ÍSE-Q ID NO; 6) tartalmazó hímszövet preferáló szabályozó régió, vagy amely a 6, számú szekvenciával nagyon szigorú körülmények között hibridizál.

4, Eljárás gazdasejt transzformálására vagy transzfektálására egy 2, igénypont szerinti vektorral végzett transzformációval vagy transzfekciöval.

5, A 4, igénypont szerinti eljárás, amelyben a gazdasejt egy növényi gazdasejt,

6, Az 5, igénypont szerinti eljárás, amelyben a növény alacsony erukasav-tarfalmü olajrepce tcanola), kukorica, búza, cirok vagy szója.