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FR3083247A1 - Polypeptides et compositions a activite polysaccharide oxydase lytique - Google Patents

Polypeptides et compositions a activite polysaccharide oxydase lytique Download PDF

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FR3083247A1
FR3083247A1 FR1856094A FR1856094A FR3083247A1 FR 3083247 A1 FR3083247 A1 FR 3083247A1 FR 1856094 A FR1856094 A FR 1856094A FR 1856094 A FR1856094 A FR 1856094A FR 3083247 A1 FR3083247 A1 FR 3083247A1
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FR
France
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polypeptide
polysaccharide
oxidase activity
seq
blast
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Withdrawn
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FR1856094A
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English (en)
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Camille Filiatrault-Chastel
Antoine Margeot
Santa Blanquet
Jean-Guy Berrin
David Navarro
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Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Abstract

La présente invention concerne, de manière générale, les enzymes à activité polysaccharide oxydases. En particulier, l'invention concerne le domaine de la production d'éthanol de deuxième génération par oxydation et hydrolyse enzymatique de matériaux contenant des polysaccharides, et notamment la biomasse lignocellulosique. Aussi, l'invention concerne le domaine des celluloses, ainsi que des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défibrillation de substrats cellulosiques.

Description

TITRE DE L’INVENTION
Polypeptides et compositions à activité polysaccharide oxydase lytique.
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne, de manière générale, les enzymes à activité polysaccharide oxydases. En particulier, l’invention concerne le domaine de la production d’éthanol de deuxième génération par oxydation et hydrolyse enzymatique de matériaux contenant des polysaccharides, et notamment la biomasse lignocellulosique.
Aussi, l’invention concerne le domaine des celluloses, ainsi que des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défibrillation de substrats cellulosiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
La biomasse lignocellulosique est un substrat polysaccharidique et une source renouvelable pour la production de biocarburants et de molécules plateformes pour l’industrie. Sa conversion en produits d’intérêts, tels que les saccharides et les fibres de cellulose, requiert l’action combinée d’enzymes, pour la plupart d’origine fongique.
Compte tenu de la complexité et de la récalcitrance de la biomasse lignocellulosique, sa dégradation est un des verrous dans le développement d’un procédé de bioéthanol 2G économiquement viable.
Pour dégrader ce type de substrat polysaccharidique, composé essentiellement de cellulose, hémicelluloses et de lignine, les microorganismes cellulolytiques produisent généralement des mélanges enzymatiques contenant des cellulases, hémi cellulases, pectinases et des enzymes lignolytiques. Line action concertée des différentes enzymes est nécessaire pour une dégradation optimale de la lignocellulose. La dégradation de la cellulose nécessite notamment l'action coordonnée et synergique de différents types d’enzymes. Plus particulièrement, convertir efficacement de la cellulose en petites molécules nécessite Taction synergique des cellulases, c'est-à-dire des endoglucanases (EG), des cell obi o hydrolases (CBH) et des B-glucosidases. Les EG clivent les liaisons β1,4 au hasard dans les chaînes cellulosiques, libérant ainsi de nouvelles terminaisons pour l'action des cellobiohydrolases (CBH) qui à leur tour libèrent des unités de cellobiose. Les β-glucosidases produisent des molécules de glucose à partir du cellobiose, atténuant ainsi l'effet inhibiteur du cellobiose sur la CBH.
Toutes les enzymes avec activités sur carbohydrates sont répertoriées dans la base de données CAZy (Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al., 2014), en classes (en fonction de leur mode d’action) et en familles en fonction de leur séquence et de paramètres structuraux, qui déterminent aussi les propriétés enzymatiques.
Par exemple, les enzymes hydrolytiques se trouvent dans la classe des glycoside hydrolases (GH), et les cellulases notamment dans les familles GH5, GH6, GH7, GH12, GH45 et GH48.
Aussi, des effets synergiques ont été montrés pour des enzymes à activité oxydative agissant sur la cellulose. Les premiers représentants de cette famille, les « Lytic Polysaccharide Monooxygénases» (LPMO) ont été isolés des champignons filamenteux Thielavia terrestris et Thermoascus aurantiacus (Harris et al. ; « Stimulation of Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family 61 : Structure and Function of a large, Enigmatic Family ; Biochemistry (Mosel.) 49, 33053316 ; 2010). Elles oxydent les liaisons glycosidiques des chaînes de polysaccharides en libérant des acides aldoniques, et augmentent ainsi l’accessibilité du substrat pour les enzymes hydrolytiques.
Ces monooxygénases (LPMO) sont classées parmi les enzymes à activité auxiliaire (AA) (Levasseur et al., 2014) au sein des familles AA9, AA10, AA11, AA13, AA14 et AAI 5. Les LPMO avec activité sur cellulose appartiennent à la famille AA9. Mais d’autres familles de monooxygénases ont été découvertes : la famille AA10 regroupe des enzymes bactériennes analogues aux AA9, les membres de la famille AAI 1 ont une activité sur la chitine, ceux de la famille AA13 agissent sur l’amidon, ceux de la famille AA14 agissent sur le xylane et ceux de la famille AAI 5 sur celllulose et chitine.
Un producteur d’enzymes fréquemment employé en industrie est le champignon Trichoderma reesei qui est capable de produire des grandes quantités d’enzymes. Notamment, le cocktail d’enzymes dit «K975 » représente une faible diversité d’enzymes et n’est pas suffisamment efficace. En comparant le génome de T. reesei à d’autres génomes issus d’espèces proches, on constate effectivement que T. reesei possède à la fois moins de gènes impliqués dans la dégradation des carbohydrates de la paroi végétale et que les enzymes sont moins diversifiées.
Des nombreux travaux de recherche ont donc visé à supplémenter ce mélange par des enzymes ayant une plus importante activité spécifique ou une activité complémentaire au répertoire présent dans T. reesei, ce qui permettrait de diminuer la dose d’enzymes à mettre en œuvre.
Il a ainsi été montré qu’un cocktail enzymatique de T. reesei contenant 7 % de la protéine AA9 (LPMO) de T. aurantiacus était capable d’hydrolyser 90 % de la cellulose à 4 mg de protéine par gramme de cellulose, permettant de réduire la quantité d’enzymes nécessaire d’un facteur 2. D’autres membres de la famille AA9 ont été identifiés chez plusieurs espèces fongiques, notamment chez Podospora anserina, Myceliophihora thermophila ou Phanerochaete chrysosporium.
WO 2018/050300 enseigne l’identification de LPMOs, et leur mise en oeuvre dans un procédé de production de sucres à partir de biomasse lignocellulosique.
WO 2016/193617 enseigne des procédés de fabrication de nanocelluloses, comprenant une étape de traitement enzymatique du dit substrat par une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs), aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cel luloses.
Malgré les nouvelles stratégies de prétraitement, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les propriétés sont variables.
Il subsiste ainsi un besoin d’identifier de nouvelles familles enzymatiques pour le traitement de ces substrats polysaccharidiques, et notamment la biomasse lignocellulosique. En particulier, il subsiste un besoin d’identifier des familles d’enzymes capables, seules ou en combinaison avec le dit cocktail de T. reesei, d’améliorer le rendement d’hydrolyse enzymatique.
Par exemple, il subsiste un besoin de familles enzymatiques capables d’hydrolyser des biomasses récalcitrantes telles que le miscanthus et/ou le peuplier.
Il subsiste également un besoin de familles enzymatiques permettant d’améliorer les procédés existants d’obtention sucres et/ou de fibres de cellulose à partir de substrats polysaccharidiques tels que les biomasses lignocellulosiques.
L’invention a pour objet de répondre à ces besoins.
RESUME DE L’INVENTION
Selon un premier objet, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le’18 ou moins.
Tout particulièrement, le dit polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase peut être caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382.
Selon un second objet, l’invention concerne une composition à activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu’elle comprend un polypeptide à activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus.
En particulier, la dite composition peut être caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
La dite composition à. activité polysaccharide oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes de type champignon ou levure, notamment choisis parmi les genres : Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Pénicillium, IJyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora, tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora; préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
La dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase est obtenu de façon recombinante.
Selon un troisième mode de réalisation, l’invention concerne un kit comprenant au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini ci-dessus, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase;
- une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
Selon un quatrième mode de réalisation, l’invention concerne un hôte apte à exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini ci-dessus. Le dit hôte peut être notamment une levure, une bactérie ou un champignon.
Selon un cinquième mode de réalisation, l’invention concerne un acide nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini ci-dessus.
Selon un sixième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharideoxydase tel que défini ci-dessus, ou d’une composition à activité polysaccharide-oxydase comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase. De préférence, le dit substrat est un substrat lignocellulosique.
En particulier, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé d’obtention d’un sucre tel que défini ci-dessus, et la fermentation alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
Selon un septième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ,
b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un huitième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un neuvième mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ,
b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un dixième mode de réalisation, l’invention concerne des fibres de celluloses issues d’un procédé de défibrillation et/ou d’un procédé de fabrication de fibres de cel lulose tel(s) que défini (s) ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Suivi au cours du temps du rendement d’hydrolyse avec le cocktail de T. reesei; sur trois biomasses prétraitée. Les barres d’erreur représentent T écart-type calculé sur 3 réplicats. En ordonnée : rendement d’hydrolyse sur trois biomasses prétraitée A. Sur paille ; B. Sur miscanthus ; C. Sur peuplier (exprimées en pourcentage par rapport à la cellulose disponible dans le substrat initial). En abscisse : le temps en heure à partir du temps 0 d’hydrolyse. Courbe A. Sur paille : Augmentation du rendement d’hydrolyse jusqu’à une valeur de 90% à Temps (h) 140.Courbe B. Sur Peuplier : Augmentation du rendement d’hydrolyse jusqu’à une valeur de 60% à Temps (h) 140. Courbe C. Sur miscanthus : Augmentation du rendement d’hydrolyse jusqu’à une valeur de 50% à Temps (h) 140.
Figure 2A-2C: Modification du rendement d’hydrolyse en présence de sécrétomes issus de la souche CIRM-BRFM 1490 d’Aspergillus japonicus, par rapport au rendement d’hydrolyse en présence du cocktail de référence seul. A. Sur paille B. Sur miscanthus C. Sur peuplier. Les moyennes ont été calculées sur 7 à 15 réplicats par point (les * signalent les moyennes pour lesquelles le test de Student par rapport à la référence donne une p-value < 0.05). En ordonnée : Amélioration du rendement d’hydrolyse dont les valeurs sont caractérisées de -15% à 15%. En abscisse : les différents sécrétomes de la souche CIRM-BRMF 1490, selon les substrats sur lesquels ils ont été produit (ASM : autoclavat de son de maïs, SBP : pulpe de betterave, Avicel), testés en supplémentation du cocktail de réference sur une des trois biomasses à 24, 48 ou 96h d’hydrolyse. A. Sur paille : Les boites les plus claires illustrent les performances des sécrétomes sur la paille à 24h (à gauche de chaque entrée) et les boites les plus foncées les performances des sécrétomes sur la paille à 48h (à droite de chaque entrée). B. Sur miscanthus : Les boites les plus claires (à gauche) illustrent les performances des sécrétomes sur miscanthus à 24h et les boites les plus foncées (à droite) les performances des sécrétomes sur miscanthus à 96h. C. Sur peuplier : Les boites les plus claires (à gauche) illustrent les performances des sécrétomes sur peuplier à 24h et les boites les plus foncées (à droite) les performances des sécrétomes sur peuplier à 96h.
Figure 3 : conservation du module catalytique et séquence consensus. Représentation graphique des acides aminés consensus lors de l’alignement de 378 modules X273, générée en utilisant l’application WebLogo (Crooks et al., 2004). En ordonnée, unité de conservation de séquence exprimée en bits. En abscisse, position dans la séquence consensus référence du module. La taille des acides aminés est représentée en fonction de la fréquence observée, telle que défini selon l’algorithme précisé dans Crooks et al. (2004).
Figure 4: Synergie des X273 avec CBHI pour la libération de cellobiose à partir de nanofibrilles de cellulose. Les enzymes AaX273 et PaX273 (8 pg) ont réagi avec un mélange de nanofibrilles de cellulose (NFC) à 0,1% pendant 16h en présence d’ascorbate (ImM), puis les NFC ont été lavées et hydrolysées par la cellulase CBHI de T. reesei (0,8 pg) pendant 30 minutes. En ordonnée : Aire des pics de cellobiose (en nC.min). En abscisse : (à gauche) cellulase CBHI en présence de NFC, contrôle, (au centre) cellulase CBHI supplémentée d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Aspergillus aculeatus (référencée AaX273). (à droite) cellulase CBHI supplémentée d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Podospora anserina (référencée PaX273). La marge d’erreur représente l’écart type.
Figure 5: Concentration de glucose libéré après 24h d’hydrolyse du miscanthus par le cocktail de référence, avec ou sans ajout de X273. Le test séquentiel : les X273 (2,2 μΜ) ont agi pendant 24h, puis le cocktail K975+SP188 (Img/g MS) a été ajouté pendant 24h. Le test simultané : les X273 et le cocktail K975+SP188 ont été ajouté ensemble pour 24h. Les barres d’erreur représentent l’écart-type calculé sur 3 réplicas. En ordonnée : concentration de glucose libéré (en g/L). En abscisse : (à gauche) substrat miscanthus en présence de cocktail T. reesei, contrôle, {au centre) en présence de cocktail T. reesei supplémenté d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Aspergillus aculeatus (référencée AaX273). (à droite) en présence de cocktail T. reesei supplémenté d’enzyme à activité polysaccharide-oxydase issue de Podospora anserina (référencée PaX273). Pour chacune des trois expériences, deux types d’hydrolyse sont effectuées, séquentiel (à gauche) ou simultanée (à droite).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Afin de remédier aux inconvénients précités de l’état de la technique, les inventeurs ont cherché à identifier des sécrétomes d’Aspergillus capables de supplémenter un cocktail cellulolytique référence issu de T. reesei sur une série de biomasses lignocellulosiques dites récalcitrantes, telles que la paille, le peuplier ou le miscanthus.
Pour ce faire, les inventeurs ont produit des sécrétomes à partir de cultures dans différentes conditions et de plusieurs souches d’Aspergill us, sélectionnées dans la collection CIRM-CF (Centre International de Ressources Microbiennes - Champignons Filamenteux) de l’INRA.
Notamment, des sécrétomes apportant les plus fortes améliorations de rendement d’hydrolyse du miscanthus ont été sélectionnés.
Une protéine d’intérêt est apparue durant l’exploration du contenu des sécrétomes, laquelle est présente uniquement dans les sécrétomes capables d’améliorer l’hydrolyse du miscanthus. Celle-ci n’avait pas été reconnue lors de l’annotation CAZy. Cependant, en comparant sa séquence à la base de données de l’outil NCBI BLAST, et en utilisant un serveur de prédiction de structure 3D, il est apparu que cette protéine contient un module présentant des similitudes avec ceux retrouvés dans la famille AA10, suivi d’une extension C-terminale prédite comme région désordonnée. Après vérification en utilisant les outils CAZy, il a alors été établi que cette protéine n’appartient pas à la famille AA10, mais à une famille encore non caractérisée nommée X273 (référencement interne à CAZy).
De manière surprenante, il a été montré que cette famille d’enzymes présente un comportement de type polysaccharide oxydase (LPMO), lequel se matérialise notamment par la présence d’un ion cuivre au sein de son centre actif et la production dThCh en présence d’un donneur d’électrons tels que l’acide ascorbique.
Il a aussi été montré que cette famille enzymatique présente, en présence de cellulases, une activité synergique sur la cellulose et tout particulièrement sur les nanofibrilles de celluloses (NCF).
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs sont d’avis que la famille X273 (aussi mentionnée dans la description comme polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention), présente dans les génomes fongiques, est caractérisée par un module catalytique appartenant à une nouvelle famille de LPMO.
Selon l’invention, cette nouvelle famille de LPMOs est donc caractérisée par un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acides aminés d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Les deux séquences références SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 correspondent chacune à la forme entière du polypeptide, incluant (i) un peptide signal en position Nterminale, tel que prédit par le logiciel Signal P 4.1, (ii) le module catalytique incluant une lere histidine en N-terminal, et (iii) une extension C-terminale.
Le module catalytique est responsable de l’activité polysaccharide-oxydase, et est caractérisé par la présence d’un centre actif de type « Histidine brace » également retrouvé dans les enzymes de type LPMO connues, et capable de fixer le cuivre.
Les polypeptides à activité polysaccharide oxydase selon l’invention sont en particulier caractérisés par la présence d’un site actif formé par deux résidus Histidine conservés, l’un des deux résidus Histidine étant généralement à l’extrémité N-terminale du module catalytique.
A ce titre, la présence du peptide signal et de l’extension C-terminale sont optionnelles pour l’obtention d’une activité polysaccharide oxydase.
Pour référence, les séquences SEQ ID N°3 et SEQ II) N°4 correspondent respectivement aux peptides signal des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Pour référence, les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 correspondent respectivement aux modules catalytiques des séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Pour référence, les deux séquences de référence SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2 partagent entre elles 45% d’identité de séquence, avec une E-value de 2e'53.
Pour référence, les deux séquences de référence SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 partagent entre elles 45% d’identité de séquence, avec une E-value de 6e'52.
En particulier, 378 séquences polypeptidiques, toutes d’origine fongique ont été identifiées (recherche réalisée en mai 2018 sur la base de données nr de l'outil NCBI BLAST-P): soit 334 séquences provenant d’ascomycètes, 41 séquences provenant de basidiomycètes et 3 de champignons non classifiés (répertoriées SEQ ID N°7 à 382).
Ainsi, selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382.
Des modes de réalisation particuliers, mettant en œuvre un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention, sont développés ci-après.
Definitions générales
De manière générale, et tout au long du présent texte, les termes de type comprendre ou inclure, ainsi que leurs variations, sont susceptibles d’englober d’autres éléments que ceux explicitement mentionnés. Ces termes peuvent, le cas échéant, être remplacés par “consister en. Les articles “un et “une englobent également “plus d’un” ou “plus d'une, ce qui englobe “une pluralité, ou encore “deux ou plus.
Par « méthode BLAST-P » (appelée aussi Protein Basic Local Alignement Search Tool method), on entend une méthode d’analyse bien connue pour l’homme du métier. La méthode BLAST-P a notamment été décrite dans Altschul et al. (1990, J Mol Biol, Vol. 215 (n°3) :403-410), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. Vol. 25:33893402) et Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol. 272:5101-5109). La méthode BLAST-P peut être réalisée en utilisant l’outil de NCBI disponible en ligne (adresse internet : http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE= Proteins). Quand la méthode BLAST-P est utilisée dans la présente demande, elle est utilisée de préférence selon les paramètres suivants: (i) Expected threshold : 10; (ii) Word Size : 6; (iii) Max Matches in a Query range : 0; (iv) Matrix : BLOSSUM62; (v) Gap costs : Existence 11, Extension 1; (vi)
Compositional Adjustments : Conditional compositional score matrix adjustment, (vii) No filter; (viii ) No mask.
Comme cela est bien connu, le score d’un alignement, S, est calculé comme la somme des scores de substitution et de gap. Les scores de substitution sont donnés dans une table (voir P AM, BLOSUM ci-dessous). Les scores de gap sont généralement calculés comme la somme des G, la pénalité d’ouverture d’un gap et L, la pénalité d’extension d’un gap. Pour un gap d’une longueur n, le coût d’un gap serait de G+Ln. Le choix des coûts des gaps, G et L sont empiriques, mais il est habituel de choisir une valeur élevée pour G (10-15) et une faible valeur pour L (1-2). Un alignement optimal signifie l’alignement de deux séquences avec le score le plus haut possible.
Dans le cadre de la présente invention, le « pourcentage d’identité » entre deux polypeptides signifie que le pourcentage d’acides aminés identiques entre les deux séquences polypeptidiques à comparer, obtenu après un alignement optimal, ce pourcentage étant entièrement statistique et les différences entre les deux séquences polypeptidiques étant distribués aléatoirement sur leur longueur. La comparaison de deux séquences polypeptidiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison doit pouvoir être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d’alignement ». L’alignement optimal des séquences pour leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-P.
Dans son principe, le pourcentage d’identité entre deux séquences d’acides aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale au sein desquelles les séquences d’acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou délétions par rapport à la séquence de référence de l’alignement optimal entre les deux séquences polypeptidiques. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions dans lesquelles un acide aminé est identique entre les deux séquences, de préférence entre deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d’alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d’obtenir le pourcentage d’identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu dans la présente demande, des séquences polypeptidiques ayant au moins 20% d’identité en acides aminés avec une séquence de référence comprennent celles qui ont au moins 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,
43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,
28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% d’identité en acides aminés avec ladite séquence de référence.
De manière similaire, le « pourcentage d’identité » entre deux séquences d’acides nucléiques représente le pourcentage de résidus nucléotidique identiques entre les deux séquences d’acides nucléiques à comparer, obtenus après un alignement optimal, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant distribuées de façon aléatoire sur la longueur des séquences. La comparaison de deux séquences d’acides nucléiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison pouvant être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d’alignement ». L’alignement optimal des séquences en vue de leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-N.
En principe, le pourcentage d’identité entre deux séquences d’acides nucléiques est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale dans lesquelles les séquences d’acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence de l’alignement optimal entre les deux séquences Le pourcentage d’identité est calculé selon le nombre de positions auxquels les résidus nucléotidiques sont identiques entre les deux séquences, de préférence entre les deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d’alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d’obtenir le pourcentage d’identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu ici, les séquences nucléotidiques ayant au moins 20% d’identité avec la séquence de référence incluent celles ayant au moins least 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%,
38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%,
53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% d’identité en nucléotides avec la séquence de référence.
Les matrices BLOSUM (Blocks Substitution Matrix) sont des matrices de score de substitution dans lesquelles les scores pour chaque position sont dérivés de l’observation de la fréquence de substitution des blocks dans des alignements locaux pour des protéines apparentées. Chaque matrice est dessinée pour une distance d’évolution particulière. Dans la matrice BLOSUM62, par exemple, l’alignement à partir duquel les scores ont été dérivés a été créé à partir de séquences ne partageant pas plus de 62% d’identité. Les séquences qui possèdent plus de 62% d’identité sont représentées par une séquence unique dans l’alignement afin de ne pas surreprésenter des membres proches d’une même famille.
Comme utilisé ici, une E-valeur (aussi appelé Expect Value ou e-value) est un paramètre calculé quand la méthode BLAST-P est utilisée, le dit paramètre représentant le nombre d’alignements différents avec des scores équivalents ou avec meilleur que S dont l’apparition est attendue lors d’une recherche dans la base de données par hasard. Ainsi, plus la E-valeur (ou « E-value ») sera basse, et plus le score et l’alignement seront significatifs.
Ainsi, une e-value de le’18 ou moins englobe les e-values de le’20 ou moins, le 25 ou moins, le’30 ou moins, le'40 ou moins, 1 e'30 ou moins, 1 e’b0 ou moins, 1 e'/0 ou moins, 1 e’80 ou moins, 1 e'90 ou moins et 1 e’1G0 ou moins.
Par « substrat cellulosique » ou « substrat lignocellulosique », on entend en toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d’origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) et contenant de la cellulose, notamment sous forme de fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).
Par « biomasse lignocellulosique », on entend toute biomasse susceptible d’être mise en œuvre en tant que substrat lignocellulosique. La biomasse lignocellulosique peut notamment être classée en fonction de son origine :
- résidus agricoles produits lors de la culture de différentes plantes destinées à l’alimentation ;
- déchets forestiers de bois dur ou de bois tendre, issus de l’industrie du bois ou des pâtes et papiers ;
- plantes énergétiques issues de cultures dédiées (i.e. herbes vivaces et taillis à courte rotation) ;
- déchets solides municipaux et industriels.
Par exemple, un substrat lignocellulosique peut être obtenu à partir d’une biomasse lignocellulosique englobant: le peuplier, le pin, le miscanthus, le saule, le panic érigé (ou « switchgrass »), le maïs, la canne à sucre, le blé, le riz, l’avoine, Forge, la betterave, l’olivier, la vigne, le coton, l’eucalyptus, les arbres fruitiers.
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d’animaux marins (comme le tunicier par exemple), d’algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de type Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le matériel contenant la lignocellulose est généralement présent, par exemple, dans les tiges, les feuilles, le son, les enveloppes et les rachis des plantes ou feuilles, branches, et le bois des arbres. De manière non-limitative, le matériel contenant la lignocellulose peut aussi être du matériel herbacé, des restes de l’agriculture et de la sylviculture, des déchets municipaux solides, des déchets papier, et des restes de broyage de pulpe et de papier. Il faut comprendre ici que le matériel contenant la lignocellulose peut se trouver sous la forme de matériel de la paroi cellulaire de la plante contenant de ia lignine, cellulose, et hémicellulose dans une matrice mixte.
Selon certains modes de réalisation particuliers, notamment ceux visant la production de fibres de cellulose, le matériel contenant de la lignocellulose est une biomasse lignocellulosique choisie dans le groupe consistant en : l'herbe, le switchgrass, la spartine, l’ivraie, la baldingère faux-roseau, le miscanthus, les résidus de transformation du sucre, la bagasse de canne à sucre, les déchets agricoles, la paille de riz, la balle de riz, la paille d'orge, l’épi de maïs, la paille de céréales, la paille de blé, la paille de canola, la paille d'avoine, la coque d’avoine, la canne de maïs, la farine de soja, la farine de maïs, les déchets forestiers, la fibre de pâte de bois recyclée, la boue de papier, la sciure de bois, le bois dur, le bois résineux, l'agave et ses combinaisons. Dans un mode de réalisation préféré, le matériel contenant de la lignocellulose est choisi dans un groupe comprenant : la farine de maïs, la fibre de maïs, la paille de riz, le bois de pin, les copeaux de bois, le peuplier, la bagasse, le papier et les déchets de traitement de la pâte.
Par « cellulose », on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d’origine animale ainsi que la cellulose d’origine bactérienne) et constitué d’unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU pour « Anhydro glucose unit») reliées entre elles par des liaisons glycosidiques β-(1 -4). Le motif de répétition est un dimère de glucose également appelé cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des chaînes formées de dimères de cellobiose forme une nanofibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d’environ 5 nm). L'association de nanofibrilles élémentaires forme une nanofibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm). L’agencement de plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé une fibre de cellulose.
Le terme c,fibre de cellulose» désigne l’ensemble des formes de cellulose susceptibles d’être obtenues à l’issue d’un procédé de défibrillation, ou délamination d’un substrat cellulosique ; ce qui inclut les formes de cellulose ayant une dimension de l’ordre du nanomètre, ainsi que les formes de cellulose ayant une dimension supérieure.
Le terme « nanocelluloses » désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanometre. Ce terme englobe en particulier selon l’invention, deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.
Les termes « fibrilles de cellulose », « nanofibrilles (de cellulose) », « nanofibres (de cellulose) », « cellulose nanofibrillée », « microfibrilles (de cellulose) », « cellulose microfibrillée », « microfibrillated cellulose », « cellulose nanofibrils » sont synonymes.
Chaque nanofibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.
L’élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet d’obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à environ 1 pm, de préférence allant de 40 nm à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm.
Les termes « nanocristatix de cellulose », « cellulose nanocristalline », « cellulose whiskers », « microcristaux » ou « cellulose nanocrystal » sont synonymes. Dans la suite de la présente demande, le terme « nanocristaux de cellulose » (NCCs) sera utilisé de manière générique.
Comme utilisé ici, un « matériel contenant des polysaccharides » englobe une substance ou une composition comprenant des polysaccharides.
Le terme « polysaccharide » est utilisé dans son sens conventionnel et désigne des carbohydrates polymériques composés de longues chaînes de monosaccharides maintenus ensemble par des liaisons glycosidiques. Lors de leur hydrolyse, les polysaccharides libèrent les monosaccharides ou oligosaccharides solubles les constituant.
Les polysaccharides qui sont préférentiellement considérés sont les polysaccharides dérivés de plantes, et tout particulièrement la cellulose, telle que celle retrouvée dans la lignocellulose.
Ce terme englobe ainsi tout matériel (ou substrat ou biomasse) comprenant au moins un (ou une pluralité de) polysaccharide(s) choisis parmi : la cellulose, l’hémicellulose et la pectine; ce qui inclut notamment les substrats polysaccharidiques comprenant au moins 30 % en poids de cellulose et d’hémicellulose.
Le ternie « matériel contenant de la lignocellulose » utilisé ici fait référence à un matériel constitué principalement de cellulose, d’hémicellulose et de lignine. Ce terme est synonyme de « matériel lignocellulosique ». Un tel matériel est aussi référencé comme « biomasse ». Selon cette définition, un matériel contenant de la lignocellulose est un exemple de substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose.
Ce terme englobe ainsi tout matériel (ou substrat ou biomasse) lignocellulosique contenant au moins 30 % en poids (wt), de préférence au moins 50% en poids, de préférence au moins 70% en poids, de préférence au moins 90% en poids de lignocellulose. A cet égard, un matériel lignocellulosique est susceptible de comprendre d’autres composés tels que des polypeptides et sucres, ce qui inclut des sucres fermentables et/ou non-fermentables.
Ainsi, un matériel contenant de la lignocellulose particulièrement considéré selon l’invention peut être choisi parmi le pin, le peuplier, la paille et le miscanthus.
Comme utilisé dans la présente demande, une « enzyme oxydant les polysaccharides » ou un « polypeptide à activité polysaccharide oxydase » englobent les polypeptides avec les propriétés suivantes :
- le dit polypeptide produit du peroxyde d’hydrogène en présence d’oxygène et d’un composé donneur d’électrons, tel que les ascorbates,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l’absence ou en présence d’un composé donneur d’électrons, la dégradation d’un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causée par des cellulases et/ou des hémicellulases telles que, par exemple, les xylanases,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l’absence ou en présence d’un composé donneur d’électrons, la dégradation d’un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causé par des cellulases.
Le terme « composé donneur d’électron » est utilisé ici dans son sens habituel pour un homme du métier. Ainsi, un composé donneur d’électron est une entité chimique capable de donner des électrons à un autre composé. Un composé donneur d’électron est un agent réducteur grâce à sa capacité à donner des électrons et est lui-même oxydé quand il donne des électrons à une autre entité chimique. Un composé donneur d’électrons comme spécifié plus haut pour les propriétés d’oxydation des polysaccharides, englobe, de manière non exhaustive, des ascorbates et des cellobiose déshydrogénases (CDH). En l’absence d’un réducteur, tel que 1’ascorbate, l’agent réducteur peut de façon avantageuse être fourni par la biomasse (la lignine) qui peut agir en tant que donneur d’électron.
Le terme “LPM0'\ ou “Lytic Polysaccharide Monooxygenase, désigne dans son sens le plus large, et sauf indication contraire, l’ensemble des familles répertoriées dans la base de données CAZy (Carbohydrate Active enzymes, Lombard et al., 2014) et aptes à oxyder des polysaccharides. Ce terme inclut donc en particulier l’ensemble des polypeptides à activité polysaccharide oxydase appartenant aux familles AA9, AA10, AAH, AA13, AA14 et AA15. Ce ternie inclut aussi les LPMO de type I (capables d’oxyder les liaisons glycosidiques sur le carbone Cl), de type II (capables d’oxyder les liaisons glycosidiques sur le carbone C4) et de type III (capables d’oxyder les liaisons glycosidiques à la fois en Cl et en C4).
Le terme « enzyme dégradant les polysaccharides » ou un « polypeptide à activité polysaccharide dégradase » englobe les polypeptides qui, outre les polysaccharides oxydases, contribuent à la dégradation des substrats polysaccharidiques tels que les biomasses lignocellulosiques. Ainsi, des polypeptides à activité polysaccharide dégradase peuvent être choisis parmi les cellulases, hémicellulases, ligninases et carbohydrate oxydases.
Les cellulases englobent les endoglucanases, cellobiohydrolases et betaglucosidases. Les hemicellulases englobent les xylanases, mannanases, xylosidases, mannosidases, arabinofuranosidaes et esterases. Ainsi le terme « cellulase » est susceptible d’inclure les exo-glucanases, endo-glucanases, cellobiohydrolases, cellulose phosphorylases, pectinases, pectate lyases, polygalacturonase, pectin esterases, cellobiose dehydrogenases, mannanases, arabinofuranosidases, feruoyl esterases, arabinofuranosidases, fructofuranosidases, galactosidases, galactosidases, amylases, acetylxylan esterases, chitin deacetylases, chitinases, et glucosidases.
Les ligninases englobent les peroxydases, copper radical oxydases (i.e. laccases). Les carbohydrate oxydases englobent les lytic polysaccharide monooxygenases (LPMO) et les GMC oxydoreductases (i.e. glucose dehydrogenases, cellobiose dehydrogenases).
Le ternie ‘tircutemem chimique'” fait référence à tous les prétraitements chimiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine. Des exemples de ces prétraitements chimiques adéquats incluent, par exemple des acides dilués, de la chaux, des bases, des solvants organiques, de l’ammoniaque, du dioxyde de soufre, du dioxyde de carbone. De plus l’oxydation humide et l’hydrothermolyse à pH contrôlé sont aussi considérées comme des prétraitements chimiques. Les méthodes de prétraitements utilisant de l’ammoniaque sont notamment décrites dans les demandes PCT WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, etWO 2006/110901.
D’autres exemples de prétraitement adéquat sont décrits par Schell et al., 2003, Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108: 69-85, et Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, et U.S. Publication No. 2002/0164730.
Le terme « prétraitement mécanique » fait réference à tous les traitements mécaniques (ou physiques) qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, de l’hémicellulose et/ou de la lignine à partir d’un matériel contenant de la lignocellulose. Par exemple, les prétraitements mécaniques incluent différents types de broyage, irradiation, explosion à la vapeur et l’hydrothermolyse. Le prétraitement mécanique inclut la fragmentation d’un solide (comminution ou réduction mécanique de la taille). La fragmentation d’un solide inclut les techniques de broyages en milieu sec, de broyage en milieu humide et de broyage par balles vibrantes. Le prétraitement mécanique peut aussi inclure des fortes pressions et/ou des températures élevées (explosion à la vapeur). Dans certaines représentations de l’étape de prétraitement, la dite étape peut combiner un prétraitement mécanique et chimique.
Comme il a été utilisé dans la présente invention, le terme « prétraitement biologique » fait référence à tous les traitements biologiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine à partir d’un matériel contenant de la lignocellulose. Les prétraitements biologiques peuvent impliquer
Γapplication de microorganismes capables de solubiliser la lignine (voir, par exemple, Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, dans le Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh et Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: une revue, dans Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, Cao, Du, et Tsao, 1999, Ethanol production from renewable resources, dans Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241 , Olsson et Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; et Vallander et Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng J Biotechnol. 42: 63-95).
Polypeptides et compositions à activité polysaccharide-oxydase
Selon un mode de réalisation principal, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserind) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 40% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le’18 ou moins.
Par exemple, un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 45% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une evalue de le’18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 60% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
En particulier, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 90% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un des dits polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ H) N°382, ce qui inclut SEQ ÏD N°7 à 382.
Selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un des dits polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382, ce qui inclut SEQ ID N°7 à 382.
Selon certains modes de réalisation, l’invention concerne un des dits polypeptides isolés à activité polysaccharide oxydase, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 90% avec une séquence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382, ce qui inclut SEQ ID N°7 à 382.
Par exemple, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 40% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Par exemple, un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention peut être caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 45% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une evalue de le’18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 60% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le48 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 90% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le’18 ou moins.
Selon un mode de réalisation alternatif, l’invention concerne une composition à activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu’elle comprend un polypeptide à activité polysaccharide oxydase tel que défini ci-dessus.
En particulier, l’invention concerne une composition à activité polysaccharideoxydase telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
A titre non exhaustif, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes choisis parmi : Agaricus bisporus, Alternaria alternata, Amanita thiersii, Armillaria ostoyae, Armillaria solidipes, Ascochyta rabiei, Aspergillus arachidicola, Aspergillus bombycis, Aspergillus brasiliensis, Aspergillus campestris, Aspergillus candi dus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus clavatus, Aspergillus cri stat its. Aspergillus fischeri, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus kawachii, Aspergillus lentulus, Aspergillus luchuensis, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus nomius, Aspergillus novqfumigatus, Aspergillus ochraceoroseus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ruber, Aspergillus steynii, Aspergillus sydowii, Aspergillus taichungensis, Aspergillus terreus, Aspergillus thermomutatus, Aspergillus tubingensis, Aspergillus turcosus, Aspergillus udagawae, Aspergillus versicolor, Aspergillus wentii, Aureobasidium melanogenum, Aureobasidium namibiae, Aureobasidium pullulans, Aureobasidium subglaciale, Aurtcularia subglabra, Bipolaris maydis, Bipolaris oryzae, Bipolaris sorokiniana, Bipolaris victoriae, Bipolaris zeicola, Botryobasidium botryosum, Botrytis cinerea, Ceratocystis fimbriata, Ceratocystis platani, Cercospora berteroae, Cercospora beticola, Cercospora zeina, Chaetomium globosum, Chaetomium globosum, Clohesyomyces aquations, Colletotrichum chlorophyll, Colletotrichum fioriniae, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum. incanum, Colletotrichum nymphaeae, Colletotrichum orbiculare, Colleiotrichum orchidophilum, Colletotrichum salicis, Colletotrichum simmondsii, Colletotrichum sublineola, Colletotrichum. tofieldiae, Coniella lustricola, Coniochaeta ligniaria, Corynespora cassiicola, Cylindrobasidium. torrendii, Daldinia sp., Diaporthe ampelina, Diaporthe he Hum hi. Diplocarpon rosae, Diplodia corticola, Diplodia seriata, Dothistroma septosporum, Elsinoe, Elsinoe australis, Emergomyces pasteuriana, Epicoccum nigrum, Euiypa lata, Exidia glanclulosa, Fungi, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium fujikuroi, Fusarium graminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium mangiferae, Fusarium nygamai, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium proliferatum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium venenatum, Fusarium verticillioid.es, Gaeumannomyces tritici, Glarea lozoyensis, Glonium stellatum, Grosmannia clavigera, Helicocarpus griseus, Heterobasidion irregulare, Hirsutella minnesotensis, Histoplasma capsulatum, Hortaea werneekii, Hydnomerulius pinas tri, Hypoxy Ion sp., Jaapia argil.la.ee a, Leptosphaeria maculans, Leucoagaricus, Lomentospora prolificans, Magnaporthe oryzae, Magnaporthiopsis poae, Marssonina brunnea, Marssonina coronariae, Meliniomyces bicolor, Meliniomyces variabilis, Microdochium bolleyi, Moniliophthora roreri, Mycosphaerella eumusae, Neofusicoccum parvum, Neonectria ditissima, Ophiocordyceps australis, Ophiocordyceps camponotirufipedis, Ophiocordyceps unilateralis, Panaeolus cyanescens, Paraphaeosphaeria sporulosa, Parastagonospora nodorum, Penicilliopsis zonata, Pénicillium arizonense, Pénicillium hrasilianum, Pénicillium camemherti, Pénicillium coprophilum, Pénicillium digitatum, Pénicillium expansum, Pénicillium flavigenum, Pénicillium freii, Pénicillium griseofulvum, Pénicillium Hah cum, Pénicillium nordicum,Pénicillium oxalicum, Pénicillium polonicum,Pénicillium roqueforti, Pénicillium rubens, Pénicillium solitum, Pénicillium subrubescens, Pénicillium vulpinum, Peniophora, Pestalotiopsis fici,Phellinus noxius, Phialocephala, scopiformis, Phialocephala. subalpina, Pleurotus oslreatus,Plicaturopsis crispa, Pseudogymnoascus verrucosus,Pseudomassariella vexata,Punetularia strigosozonata, Pyrenochaeta,Pyrenophora teres,Pyrenophora triticirepentis, Rhizoctonia solani, Rhynchosporium commune, Rosellinia necatrix, Rutstroemia, Scedosporium apiospermum, Schizophyllum commune, Sclerotinia borealis, Sclerotinia sclerotiorum,Serpula lacrymans,Setosphaeria turcica,Sordaria macrospora,Sphaerulina musiva, Sporothrix brasiliensis, Sporothrix insectorum, Sporothrix schenckii, Stachybotrys chartarum, Stachybotrys chlorohalonata, Stagonospora, Stemphylium lycopersici, Thermothelomyces thermophila, Thielavia terre str is, Thielaviopsis punctulata, Valsa mail, Verruconis gallopava, Vertieillium alfalfae, Verticillium dahliae, Verticillium longisporum.
En particulier, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes de type bactérie, champignon (par exemples champignons filamenteux) ou levure, choisis parmi les genres : Escherichia, Lactococcus, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Phanerochaete, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Pénicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, 1richoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora; tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora; préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
En particulier, la dite composition à activité polysaccharide-oxydase peut être caractérisée en ce qu’elle est susceptible d’être obtenue à partir d’un ou plusieurs organismes de type champignon ou levure, choisis parmi les genres : Achlya, Acremonium, Aspergillus, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Endothia, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Pénicillium, Pyricularia, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Podospora, Pycnoporus, Fusarium, Thermonospora; tout particulièrement Aspergillus ou Trichoderma ou Podospora; préférentiellement Aspergillus ou Podospora.
Un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut également être obtenu de façon recombinante.
Ainsi, une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut être caractérisée en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase est obtenu de façon recombinante.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharideoxydase selon l’invention comprend seulement un polypeptide (ou « enzyme ») à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention, soit un polypeptide ayant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le’18 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharideoxydase selon l’invention comprend une pluralité de polypeptides à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention, soit plus d’un polypeptide ayant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserind) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, ia dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'!8 ou moins.
Selon certains de ces modes de réalisation, une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polypeptides à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharideoxydase selon l’invention comprend en outre au moins un autre polypeptide à activité polysaccharide oxydase ; en particulier choisi(s) parmi les lytic polysaccharide monooxygenases, ce qui inclut les polypeptides appartenant aux groupes de LPMO AA9, AA10, AAI 1, AA13 et AA14.
Selon certains modes de réalisation, une composition à activité polysaccharideoxydase selon l’invention peut être mise en œuvre en tant que composition pour dégrader un substrat polysaccharidique, tel que les biomasses lignocellulosiques.
Selon certains autres modes de réalisation, composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut être mise en œuvre en tant que composition auxiliaire en combinaison avec un ou plusieurs polypeptides à activité polysaccharidedégradase.
Aussi, selon un mode de réalisation alternatif un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention peut être mis en œuvre sous forme de kit.
Avantageusement, un tel kit peut comprendre un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase ou une composition à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention ; et d’autre part un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
Ainsi, l’invention concerne également un kit comprenant au moins :
- une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharideoxydase selon l’invention, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase;
- une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharidedégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharidedégradase.
De tels kits peuvent, notamment, correspondre à des kits pour :
- l’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique ;
- la préparation d’un produit de fermentation d’un substrat polysaccharidique ;
- la production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique ;
- la préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose ;
- la défibrillation d’un substrat cellulosique ;
- la fabrication de fibres de cellulose.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un hôte apte à exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention. Le dit hôte peut être notamment une cellule procaryote ou eucaryote. Selon un mode particulier de réalisation, le dit hôte est une levure ou une bactérie ou un champignon, par exemple un champignon filamenteux.
Selon l’invention, un « hôte » peut notamment être une levure choisie dans un groupe comprenant : Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, et Yarrowia.
En particulier, les levures peuvent être choisies parmi: S. cerevisiae, S. bulderi, S. barneiti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus, or K. fragilis.
Selon certains modes de réalisation, la levure est choisie parmi: Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Issatchenkia orientalis, Candida albicans, Candida mexicana, Pichia pastoris, Pichia mississippiensis, Pichia mexicana, Pichia stipiiis, Pichia Jarinosa, Clavispora opuntiae, Clavispora lusitaniae, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans,
Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphes, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha, et Schwanniomyces occidentalis.
Selon d’autres modes de réalisation un « hôte » peut notamment être une bactérie choisie dans un groupe comprenant : Escherichia, Lactococcus, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas.
Selon d’autres modes de réalisation un « hôte » peut notamment être un champignon choisi dans un groupe comprenant : Aspergillus, Trichoderma, Podospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Neurospora, .Fusarium, Phanerochaete, Pénicillium.
Selon un mode de réalisation préféré, le dit hôte est une levure.
L’invention concerne également un acide nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Ainsi, un acide nucléique permettant l’expression d’un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention peut être introduit dans le génome d’un hôte (i.e. levure) d’intérêt, ou encore introduit en tant que vecteur non-intégré selon des techniques d’ingénierie génétique connues dans le domaine.
L’invention concerne également un procédé de production d’un polypeptide à activité polysaccharide oxydase; comprenant une étape de mise en culture d’un hôte apte à exprimer un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Aussi, l’invention concerne des vecteurs incluant un acide nucléique codant pour un polypeptide à activité polysaccharide oxydase selon l’invention. Les dits vecteurs (i.e. plasmides ou YAC) sont en particulier des vecteurs d’expression capable de diriger l’expression d’un gène donné, et associés à un opéron.
L’invention concerne donc également un procédé de production d’un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, consistant à:
(a) cultiver un hôte apte à la production d’un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le’18 ou moins ; et (b) récupérer le dit polypeptide du dit hôte.
Procédés d’obtention de sucres à partir de substrats polysaccharidiques
Les polypeptides à activité polysaccharide-oxydases selon l’invention peuvent être mis en œuvre à la fois dans des procédés d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, des procédés de fermentation et de production d’alcool à partir d’un sub strat lignocel luiosi que.
Des procédés d’obtention d’éthanol à partir de substrats polysaccharidiques, tels que les biomasses lignocellulosique, sont ainsi décrit dans Margeot et al. (“New improvements for lignocellulosic ethanol”; Current Opinion in Biotechnology; 20:372-380, 2009). Ainsi, un procédé complet de production d’éthanol à partir de biomasse lignocellulosique comprend généralement quatre étapes principales:
1. un pré-traitement du substrat polysaccharidique (i.e. biomasse lignocellulosique); pour casser la structure de la paroi lignocellulosique, en liquéfiant certains composants et en diminuant la cristallinité de la cellulose.
Il existe des pré-traitements physiques (mécaniques ou hydrothermaux) qui permettent la réduction de la taille des particules et la solubilisation d’une partie des hémicelluloses, des pré-traitements chimiques qui utilisent des acides, bases ou agents oxydants pour solubiliser les hémicelluloses et retirer la lignine, et des prétraitements biologiques qui utilisent des espèces fongiques capables de dégrader la lignine. Certains pré-traitements combinent des méthodes physiques et chimiques comme par exemple l’explosion à la vapeur en présence d’acide dilué ou l’explosion à froid à l’ammoniaque.
2. une hydrolyse enzymatique du dit substrat, consistant à dépolymériser la cellulose et les hémicelluloses restantes en monomères, à l’aide d’enzymes spécifiques.
Ces enzymes sont secrétées par une variété d’organismes cellulolytiques, aérobies ou anaérobies, niésophiles ou thermophiles, appartenant notamment aux genres Clostiidium, Thermomonospora, Cellulomonas, Bacteriodes ou Sîrepîomyces pour les bactéries, et Phanerochaete, Trichoderma, Aspergillus ou Pénicillium pour les champignons filamenteux.
3. une fermentation du dit substrat pour obtenir le dit éthanol à partir des sucres (i.e. pentoses et hexoses) issus de l’étape d’hydrolyse.
Cette étape de fermentation est notamment mise en œuvre par des microorganismes tels que la levure Saccharomyces cerevisiae, qui est le microorganisme le plus utilisé dans l’industrie grâce à ses forts rendements et sa faible sensibilité aux inhibiteurs. Cependant, elle n’est naturellement pas capable d’utiliser les pentoses produits lors de l’hydrolyse enzymatique. Aussi, afin d’améliorer les rendements, des souches modifiées capables de fermenter des sucres tels que le xylose ou l’arabinose ont été développés.
4. une purification du dit éthanol, généralement en vue de son utilisation en tant que carburant, qui doit répondre à un certain nombre de spécifications. Cette purification consiste donc généralement en une distillation, une rectification et une déshydratation.
Selon un mode de réalisation, ces étape peuvent être réalisées séparément, ou encore simultanément. Par exemple, ces différentes étapes peuvent être réalisées séparément, comme c’est le cas dans un procédé noté SHF (^Separate Hydrolysis and Fermentation'') où les enzymes et les levures peuvent être utilisés chacun dans leurs conditions optimales. Il est aussi possible de réaliser ces étapes simultanément, par un procédé que n’on nomme SSCF (“Simultaneous Saccharification and Co~Fermeniation”). Enfin, le concept de bioprocédé consolidé ^Consolidated Bioprocessing’ ou CBP) propose d’effectuer la production de cellulases, l’hydrolyse enzymatique et. la fermentation à l’aide d’un seul microorganisme.
Afin de rendre le bioéthanol lignocellulosique rentable, il est généralement nécessaire d’optimiser chacune des étapes de sa production. Il est notamment essentiel de bien choisir le pré-traitement adapté au type de biomasse traitée, afin de maximiser son effet, tout en limitant la formation d’inhibiteurs et en réduisant les coûts et la consommation d’énergie. L’hydrolyse enzymatique est souvent considérée comme l’étape la. plus critique et termes de rendements et de coût.
Les polypeptides à activité polyssaccharide oxydases selon l’invention sont particulièrement avantageux dans le cadre d’une étape d’hydrolyse de substrats polysaccharidiques.
Ainsi, selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharideoxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora. anserina) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une evalue de le’38 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide.
En particulier, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le38 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide.
Ainsi, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant les étapes de :
a) disposer d’un substrat polysaccharidique ,
b) mettre en contact le dit substrat polysaccharidique avec un un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide ;
c) collecter le dit sucre obtenu à l’issue de l’étape b).
En particulier, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant les étapes de :
a) disposer d’un substrat polysaccharidique ;
b) mettre en contact le dit substrat polysaccharidique avec un un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserind) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le48 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide ;
c) collecter le dit sucre obtenu à l’issue de l’étape b).
En particulier, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un sucre tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que le dit substrat est un substrat lignocellulosique, et tout particulièrement une biomasse lignocellulosique.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit de fermentation à partir d’un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé tel que défini cidessus, et la fermentation dudit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
Ainsi, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit de fermentation à partir d’un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserind) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le48 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
En particulier, l’invention concerne un procédé de préparation d’un produit de fermentation à partir d’un substrat polysaccharidique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserind) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeaius), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'iS ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre de sorte à obtenir un produit de fermentation.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé tel que défini ci-dessus, et la fermentation alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
Le produit de la fermentation est préférentiellement le butanol, d’éthanol, d’isopropanol ou d’un de leurs mélanges.
Ainsi, dans le cadre de la fermentation ethanolique, le produit de fermentation alcoolique considéré est l’éthanol.
Aussi, de manière préférée, un procédé de fermentation et/ou production d’alcool selon l’invention est un procédé de production de butanol, d’éthanol, d’isopropanol ou d’un de leurs mélanges.
Ainsi, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 (provenant de Podospora anserind) ou SEQ ID N°2 (provenant de Aspergillus aculeaius), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P dormant une e-value de le'18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ,
b) fermenter le dit sucre par un microorganisme alcooligène de sorte à produire le dit alcool.
En particulier, l’invention concerne un procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
a) mettre en contact le dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, comprenant une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 (provenant de Podospora anserina) ou SEQ ID N°6 (provenant de Aspergillus aculeatus), en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins, ou d’une composition à activité polysaccharide oxydase comprenant le dit polypeptide, de sorte à obtenir un sucre ;
b) fermenter le dit sucre par un microorganisme alcooligène de sorte à produire le dit alcool.
Fibres de cellulose, procédés de préparation de substrats et de défibrillation (repris de Série 22 INRA)
Différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de « nanocelluloses ». Les propriétés notamment mécaniques des fibres de cellulose, dont ces nanocelluloses, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent également un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels. Plusieurs stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d’énergie requise pour leur délamination mécanique.
Les procédés définis ci-après concernent l’obtention de fibres de celluloses à partir d’un substrat cellulosique. Ils impliquent la mise en œuvre d’un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ,
b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, en uti lisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le48 ou moins.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à. former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cel lulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en uti lisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le’18 ou moins.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6, en uti lisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
Le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase selon l’invention est mélangé avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre le dit polypeptide et les fibres de cellulose.
L’étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres. Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en œuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l’étape de traitement enzymatique est mise en œuvre à une température allant de 30 à 50 °C, notamment de 30 à 45 °C.
Le pH des conditions réactionnelles de l’enzyme au contact du substrat cellulosique est généralement compris entre 3 et 7, ce qui inclut entre 4 et 7, et notamment entre 4 et 6.
Selon l’invention le dit polypeptide peut être ajouté au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 :1000 à 1 :50, notamment de 1 :500 à 1 :50 ou de 1 :100 à 1 :50 ou encore de 1 :1000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 : 100.
De préférence, le dit polypeptide est utilisé à une concentration allant de 0,001 à 10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
Le, ou les, polypeptide(s) mis en œuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
De manière non-exclusive, des tests de clivage de la cellulose par un polypeptide selon l’invention peuvent être menés selon le protocole suivant :
Par exemple un test de clivage peut être réalisé dans un volume de 300 μΐ de liquide contenant 4,4 μΜ d’enzyme LPMO et 1 mM d’ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l’acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 :19-25) dans 50 mM d’un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 μΜ de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique peut être mise en œuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50°C et 580 rpm (rotation par minute).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration comprise entre 1 et 5 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 :100, 1 :500 et 1 :1000) et d’ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 °C.
Après 16 h d’incubation, l’échantillon est porté à 100°C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4°C afin de séparer la fraction solution de la fraction insoluble restante.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d’un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que les fibres de cellulose obtenues à l’issue du procédé sont des nanofibrilles de cellulose.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le donneur d’électron est choisi parmi 1’ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques ; et de préférence Γ ascorbate.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d’un végétai fibreux riche en cellulose, de betterave, d’agrumes, de plantes annuelles à paille, d’animaux marins, d’algues, de champignons ou de bactéries.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l’une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite, les pâtes au sulfate, les pâtes à la soude, les pâtes kraft.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est une pâte papetiére dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l’un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d’homogénéisation,
- un traitement de microfluidisation,
- un traitement d’abrasion, et/ou
- un traitement de cryobroyage.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que, suite à ladite étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de posttraitement choisie parmi : un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de groupements chimiques portés par les dites fibres de cellulose.
Selon un autre objet, l’invention concerne des fibres de celluloses issues d’un procédé de défibrillation et/ou d’un procédé de fabrication de fibres de cellulose tels que définis ci-dessus.
Les dites fibres de celluloses peuvent être caractérisées en ce que lesdites fibres de cellulose, de préférence de nanocellulose, comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également Ce.
Selon un mode de réalisation préféré, les fibres de celluloses sont des nanofibrilles de cellulose.
Etape (s) de traitement(s) mécanique(s)
Le substrat cellulosique mis en contact avec la dite enzyme est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l’obtention des nanocelluloses.
La délamination (dite encore « fibrillation » ou « défibrillation ») consiste à séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose au sein du substrat cellulosique, notamment pour la fabrication de nanocelluloses.
Comme démontré, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l’étape de traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l’homme du métier et peuvent être mis en œuvre dans le(s) procédé(s) de l’invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d’Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à 744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose microfibrillée (par exemple des nanofibrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d’homogénéisation, de microfluidisation, d’abrasion, ou de cryobroyage.
Le traitement d’homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d’un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).
Ce traitement d’homogénéisation est de préférence effectué au moyen d’un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité, typiquement sous forme d’une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d’une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d’ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d’au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à vitesse élevée suivie d’un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l’orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu’à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80°C durant le traitement d’homogénéisation, de l’eau de refroidissement est généralement utilisée.
Ce traitement d’homogénéisation peut également être mis en œuvre à l’aide d’un dispositif de type microfluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d’une fine chambre typiquement en forme de « z » (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 pm) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à lOfs’1) permet d’obtenir des nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fibrillation.
Le traitement d’abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al., 2007 Applied Physics A89(2) :461-66) est basé sur l’utilisation d’un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.
Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d’une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l’ordre de 1500 rotations par minute (rpm). Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al., Biomacromolécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à partir d’une suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64(6) :1185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l’azote liquide. Les cristaux de glace formés à l’intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l’agriculture.
Etape (s) de post-traitement du substrat cellulosique
Dans certains modes de réalisation, le procédé de défibrillation et/ou de fabrication de fibres de cellulose comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en œuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fibrillation des celluloses (notamment des nanocelluloses) obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les microfibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses.
EXEMPLES
Exemple 1 : Souches fongiques et conditions de culture
La souche A'Aspergillus japonicus utilisée dans cette étude est maintenue dans la collection du Centre International de Ressources Microbiennes - Champignons Filamenteux (CIRM-CF, INRA, Marseille, France) sous le numéro d’accession CIRM BRFM. Elle a été cultivée sur milieu gélosé MYA2, contenant 20 g/1 d'extrait de malt, 20 g/1 d'agar et 1 g/1 d'extrait de levure. Les spores ont été récoltées et conservées à -80°C dans 20% de glycérol et 80% d'eau.
Les milieux de culture liquides contenant une fraction autoclavée de son de maïs ou de la pulpe de betterave (fournis par ARD, Pomade, France) en tant que source de carbone et inducteur de sécrétion de protéines ont été préparés da la manière suivante : 15 g/1 d'inducteur , 2,5 g/1 de maltose; 1,84 g/1 de tartrate diammonium comme source d'azote; 0,5 g/1 d'extrait de levure; 0,2 g/L de KH2PO4; 0,0132 g/L de CaC12.2H2O et 0,5 g/L de MgSO4.7H2O. Un autre milieu inducteur a été préparé en utilisant 4 g/1 d'Avicel (SigmaAldrich, USA); 10 g/1 de xylose; 1,8 g/1 de tartrate diammonium; 0,5 g/1 d'extrait de levure; 0,2 g/1 de KH2PO4; 0,0132 g/L de CaC12.2H2O et 0,5 g/L de MgSO4.7H2O.
Les trois milieux de culture ont été inoculés par 2xl05spores/mL des cinq souches, et incubés dans des fioles bafflées dans l'obscurité à 30°C sous agitation rotative à 105 rpm (Infors HT, Suisse).
Exemple 2 : Préparation des sécrétomes
Après 7 jours d'incubation, les cultures ont été arrêtées et le milieu liquide a été séparé du mycélium à. l'aide de Miracloth (Calbiochem, USA). 40 mL ont été filtrés sur des membranes de polyéthersulfone 0,22 μηι (Merck-Millipore, Allemagne) puis diafiltrés et concentrés sur des membranes de polyéthersulfone avec un seuil de coupure de lOkDa (Vivaspin, Sartorius, Allemagne) dans du tampon acétate de sodium 50mM pH5 jusqu'à un volume final de 2 mL. Les sécrétomes ont été conservés à -20°C, et leur concentration totale de protéines a été évaluée par les méthodes de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Ivry, France) et du BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay, Sigma-Aldrich) en utilisant une gamme standard d'albumine sérique bovine (BSA).
Exemple 3 : Clonage de gènes et expression recombinante chez Pichia pastoris :
Les séquences protéiques sélectionnées, desquelles on a ôté les séquences prédites des peptides signaux natifs, ont été utilisées pour générer des séquences nucléotidiques codantes optimisées pour une expression chez P. pastoris. La synthèse totale des gènes a été réalisée (Genewiz, USA) et ils ont été clonés dans le vecteur d’expression pPICZaA (Invitrogen), de manière à être en phase avec la séquence signal utilisée (celle du facteur a de la levure) et avec la séquence codant pour l'étiquette polyhistidine C-terminale.
Les plasmides ont été amplifiés via une transformation de cellules compétentes DH5a à'Escherichia coli, puis purifiés à l'aide d'un kit Hi Speed Plasmid Midi (Qiagen, Pays-Bas), linéarisés par l'enzyme de restriction Pmel et transformés dans des cellules X33 de Pichiapastoris (Invitrogen) par électroporation. Les transformants ont été isolés sur un milieu gélosé contenant de la zéocine (100 et 500 mgZL).
Pour tester l'expression de chaque vecteur, plusieurs transformants résistants à la zéocine ont été cultivés en plaque de 24 puits, dans 5 mL de milieu de croissance BMGY contenant 0,2 gZL de biotine, à 30°C et 250 rpm pendant environ 16h, jusqu'à atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 2 et 6. Après centrifugation, les cellules ont été reprises dans 1 mL de milieu BMMY et incubées à 20°C et 200 rpm pendant 3 jours afin d'induire l'expression des protéines, le milieu a été supplémenté chaque jour par du méthanol à 3% (vol/vol). Les surnageants de culture ont été purifiés par chromatographie d'affinité avec des billes Ni-NTA selon une procédure automatisée décrite par il ami et al. (« Recombinant protein production facility for fungal biomass-degrading enzymes using the yeast Pichia pastoris». Front. Microbiol. 6. 2015), et les protéines purifiées ont été déposées sur un gel SDS-PAGE sans coloration avec révélation par photoactivation et fluorescence (BioRad, France) pour vérifier leur production.
Afin de produire les protéines en quantités suffisantes, les transformants ayant le meilleur taux de sécrétion ont été cultivés dans 2 L, de milieu BMGY contenant 1 mLZL de sels PTM4 (Pichia Trace Minerais 4), 0,2 g/L de biotine dans des fioles à 30°C et 250 rpm pendant environ 16h, jusqu'à atteindre une densité optique à 600 nm comprise entre 2 et 6. L’expression des protéines a été induite en incubant les cellules dans 400 mL de milieu BMMY contenant 1 mL/L de sels PTM4 à 20°C et 200 rpm pendant 3 jours, durant lesquels le milieu a été supplémenté par du méthanol à 3% (vol/vol) chaque jour. Les surnageants ont été récupérés par centrifugation (4000xg, 4°C, 10 min) et filtrés sur des membranes de 0,45 pm (Millipore) pour éliminer les cellules restantes. Une colonne de nickel chélaté His-Bind Resin (1,9 cm3 ; GE Healthcare, UK) a été connectée à un appareil de FPLC Àkta (GE Healthcare) et équilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), de NaCl 50 mM et de l’imidazole 10 mM. Après avoir ajusté le pH à 7,8, les surnageants ont été chargés sur la colonne à 4°C. La colonne a été lavée avec le tampon d’équilibrage (TrisHCl 50 mM pH 7,8, NaCl 50 mM, imidazole 10 mM) et les enzymes ont été éluées avec le même tampon contenant 150 mM d’imidazole. Les éluats ont été concentrés à l’aide d’unités de centrifugation Amicon (seuil de coupure 10 kDa ; Millipore) à 4000xg et lavés à plusieurs reprises avec du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 5).
Une fraction de chaque éluat a été chargée sur un gel SDS-PAGE sans coloration avec révélation par photo-activation et fluorescence (Bio Rad, France) pour vérifier leur pureté. La concentration en protéines a été déterminée par absorption à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) et des masses et coefficients molaires théoriques calculés à partir des séquences protéiques.
Exemple 4 : Tests de dégradation de la cellulose en présence de polypeptides selon
Γ invention :
Les tests de dégradation de la cellulose par les polypeptides à activité polysaccharide oxydase ont été effectués en triplicats, dans un volume de 300 pL contenant 1% (m/v) d'Avicel (Sigma-Aldrich) ou de P ASC (Phosphoric Acid Swollen Cellulose), préparée à partir d’Avicel selon la méthode décrite par Wood (« Preparation of crystalline, amorphous, and dyed cellulase substrates. In Methods in Enzymology, (Academic Press), pp. 19-25) dans du tampon phosphate 50 mM pH 6. Les LPMO (0,5 à 5 μΜ) et le donneur d'électrons (L-cystéine ou ascorbate, 10 μΜ à 1 mM) ont été ajoutés, en présence ou non d'HîCh (100 μΜ), et les tubes ont été incubés dans un thermo mixer (Eppendorf, Montessori, France) à 50°C et 850 rpm, pendant 4 à 16h. La réaction a été arrêtée en ébouillantant les échantillons à 100°C pendant au moins 10 min, puis ils ont été centrifugés à 15000xg pendant 5 min pour séparer les produits solubles de la fraction insoluble.
Afin de tester la synergie des polypeptides d’intérêt avec la CBHI de T. reesei, un mélange réactionnel d’un volume total de 800 pL contenant 1% (m/v) de nanofibrilles de cellulose dans du tampon acétate 50 mM pH 5,2, ainsi que 8 pg de LPMO et 1 mM d’ascorbate a été incubé dans un thermomixer (Eppendorf) à 50°C et 850 rprn, pendant 16h. Les échantillons (en triplicats) ont été ébouillantés à 100°C pendant au moins 10 min, puis centrifugés à 15000xg pendant 5 min. La fraction insoluble restante du substrat a été lavée deux fois dans le tampon, et l'hydrolyse par la CBHI de T. reesei (0,8 pg; fournie par IFPEN) a été réalisée dans un volume de 800 pL contenant du tampon acétate 50 mM pH
5,2, pendant 30 min à 50°C et 850 rpm. La réaction a été arrêtée comme décrit plus haut, et les fractions solubles et insolubles ont été séparées.
Les mono et oligosaccharides issus de la dégradation des substrats cellulosiques ont été détectés par HPAEC-PAD (Dionex, Thermo Fisher Scientific), selon la méthode décrite par Westereng et al. (2013), en utilisant des cello-oligosaccharides (DP2 à DP6) non oxydés comme standards (Megazyme, Irlande).
Exemple 5 : Substrats et cocktails enzymatiques :
La paille de blé, le miscanthus et le peuplier prétraités ont été obtenus auprès d’IFP Energies Nouvelles (Rueil-Malmaison, France). Les biomasses ont été prétraitées par explosion à la vapeur en conditions acides, lavées à l'eau chaude pour éliminer les produits libres, et séchées à 55°C. Après une semaine à température ambiante, elles ont été broyées et tamisées afin de ne retenir que les particules de taille inférieure à 0,8 mm, et leur teneur en eau (% m/m) a été déterminée par séchage à 105°C en étuve à convection naturelle (VWR, USA).
Le cocktail dit « K975 », est constitué du sécrétome de la souche CL847 de Trichoderma reesei, produit en présence de lactose selon le protocole détaillé dans Herpoël-Gimbert et al. (Comparative secretome analyses of two Trichoderma reesei RUTC30 and CL847 hypersecretory' strains. Biotechnology for Biofuels 2008, 1 :18), et dont l'activité β-glucosidase spécifique est de 0,8 Ul/mg. ) Il a été complété par un cocktail commercial de β-glucosidases $ Aspergillus niger SP 188 (Novozyme, Danemark).
Exemple 6 : Hydrolyses enzymatiques :
Les hydrolyses enzymatiques en tubes de 2 mL ont été réalisées en triplicats dans un volume réactionnel de 1 mL, en présence de paille de blé, de miscanthus ou de peuplier (50 mg de biomasse sèche), dans du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 4,8) auquel a été ajouté du chloramphénicol (0,1 g/L) pour éviter les contaminations microbiennes. Ce mélange a été incubé pendant au moins Ih à 45°C sous agitation rotative à 850 rpm (Infors) afin d'imprégner la biomasse, puis le cocktail K975 a été ajouté à raison de 5 mg/g de matière sèche (MS), et le cocktail SP 188 dans des quantités permettant d’obtenir une activité β-glucosidase totale de 80 Ul/g MS.
Pour les tests de supplémentation, 10 pL de sécrétomes ont été ajoutés (ou 10 pl de tampon dans les conditions de référence). L'hydrolyse a été réalisée à 45°C sous agitation rotative à 850 rpm (Infors). A chaque temps de prélèvement, les triplicats ont été ébouillantés à 100°C pendant au moins 5 min pour inactiver les enzymes, puis refroidis et centrifugés à 1,5000xg pendant 5 min, et le surnageant a été prélevé et conservé à -20°C.
Les hydrolyses enzymatiques miniaturisées ont été réalisées en microplaques de 96 puits, dans lesquelles ont été distribués 100 pL de suspension de biomasse à 6,3% (m/v) dans du tampon acétate de sodium 50 mM (pH 4,8) en présence de chloramphénicol (0,1 g/L). Pendant la distribution, la suspension de biomasse a été prélevée à l'aide d'une pipette multicanaux dans un bêcher sous agitation magnétique constante, puis les plaques ont été scellées et conservées à -20°C.
Pour les tests de supplémentation, les enzymes ont été distribuées à l'aide d'un robot Tecan Genesis Evo 200 (Tecan, Lyon, France) : les cocktails K975 et SP188 ont été distribués dans les quantités indiquées plus haut, dans un volume de 15 pL, puis 10 pL de sécrétomes dilués lOx ont été ajoutés (ou 10 pL de tampon dans les conditions de référence, présentes sur chaque plaque). Chaque essai a été réalisé en septuplicats, auquel s'ajoute un puits contrôle contenant les enzymes seuls (sans biomasse) ; une colonne de chaque plaque a été consacrée aux conditions contrôles contenant la biomasse seule (sans enzymes). Pendant l'hydrolyse, les plaques scellées ont été incubées à 45°C sous agitation rotative à 850 rpm (Infors), pendant 24 à 96h. A chaque temps de prélèvement, les plaques correspondantes ont été centrifugées après ajout de 120 pL de tampon, puis le surnageant a été filtré et conservé à -20°C.
Pour les deux types d’hydrolyses (« séquentiel » ou « simultané »), la concentration de glucose dans les échantillons a été mesurée à l'aide du réactif Glucose GOD-PAP (Biolabo, Maizy, France) à l'aide d'une gamme standard de glucose, et les rendements ont été calculés en tenant compte de la quantité de glucose cellulosique initialement présent.
Plusieurs hydrolyses ont été réalisées pour chaque condition, et afin de pouvoir combiner les résultats, les rendements obtenus en présence de sécrétomes ont été traduits en pourcentage d'amélioration par rapport à la référence interne de chaque hydrolyse. Un test t de Student a été réalisé pour chaque condition afin de déterminer si la moyenne des résultats était statistiquement différente de la moyenne des références, en utilisant la valeur de la p-value comme critère.
Exemple 7 : Tests de saccharification de biomasses en supplémentation de T reesei
Afin de déterminer si les sécrétomes produits peuvent présenter un intérêt pour l’amélioration des rendements d’hydrolyse enzymatique, ils ont été testés dans des conditions se rapprochant de celles envisagées dans les procédés industriels de bioconversion de la biomasse lignocellulosique. Trois biomasses modèles, d’origine et de compositions différentes, ont été choisies pour cette étude : la paille de blé, le miscanthus et le peuplier. Ces substrats, issus de déchets agricoles et de cultures énergétiques dédiées, sont fréquemment envisagés comme matières premières pour la production de bioéthanol en Europe. Ils ont été prétraités par explosion à la vapeur en présence d’acide sulfurique dilué (voir Tableau 1). Après lavage et séchage, leur composition en sucres a été déterminée par CPG après hydrolyse acide
Tableau 1: Conditions de prétraitement et composition des trois substrats modèles de cette étude
Peuplier Miscanthus Paille
Température vapeur (°C) 195 180/190 195
Pression (bar) 15 10.5/13 15
Durée prétraitement (min) 7.5 7.5 2
[H2SO4] 0.7% 0.4% 0.7%
Composition (% de poids sec)
Rhamnose 0.27 0.44 0.15
Arabinose 0.11 0.39 0.52
Xylose 0.63 2.09 1.58
Mannose 0.18 0 0.16
Glucose total 53.28 59.43 53.92
Glucose cellulosique 50.85 57.01 51.30
Teneur en eau (%m/m ) 6.26% 5.66% 6.97%
Le cocktail cellulolytique de T. reesei utilisé (noté K975) est issu de la souche CL847, cultivée en présence de lactose , celle-ci ayant une activité β-glucosidase assez faible, une préparation commerciale de β-glucosidases d’A. niger (SP188, Novozyme) y a été ajoutée en excès, afin de s’assurer que les potentielles améliorations de performances lors de la supplémentation ne soient pas dues à une simple augmentation de l’activité βglucosidase. Ce cocktail de référence a été utilisé pour réaliser l’hydrolyse des trois biomasses choisies, avec une concentration en biomasse relativement élevée (5% m/v) afin de se rapprocher de conditions réalistes du point de vue du procédé, et une dose d’enzyme faible (5 mg/g de matière sèche), correspondant pour l’industrie à des conditions permettant de réduire les coûts, et pour laquelle la marge d’amélioration des rendements d’hydrolyse est élevée.
La cinétique de cette hydrolyse sur 5 jours est présentée sur la Figure 1. Dans les conditions choisies, le rendement final d’hydrolyse de la paille de blé est proche de 100%, ce qui signifie que la quasi-totalité de la cellulose a été transformée en monomères de glucose. Le miscanthus et le peuplier sont plus récalcitrants, puisque dans les mêmes conditions ils ne sont hydrolysés qu’à 50 et 60% respectivement. Les objectifs d’amélioration sont multiples : dans le cas de la paille, il s’agira d’augmenter les rendements au début de l’hydrolyse (à 24 et 48h) et donc d'accélérer la réaction, tandis que pour le miscanthus et le peuplier il sera possible d’améliorer à la fois la cinétique initiale et le rendement après une période plus longue (96h par exemple).
Dans les mêmes conditions, le cocktail de référence a ensuite été supplémenté par les différents sécrétomes d'Aspergillus. Dans un souci de simplification expérimentale, à une quantité fixe de cocktail, des volumes égaux de chacun des sécrétomes concentrés ont été ajoutés, selon le protocole établi dans Berrin et al. (« Exploring the Natural Fungal Biodiversity of Tropical and Temperate Forests toward improvement of Biomass Conversion. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6483-6490, 2012). La quantité de protéines ajoutées n’est pas la même dans tous les échantillons, mais elle reflète les proportions initiales de protéines sécrétées par les souches fongiques sur chaque milieu de culture. Ces essais ont initialement été réalisés en tubes, en triplicats, mais les biomasses utilisées étant hétérogènes, il est apparu que la variabilité des résultats était importante. Les tests de saccharification ont été miniaturisés en microplaques et automatisés à l’aide d’un robot Tecan, selon une méthode déjà développée dans Navarro et al. (« Automated assay for screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass. Microb. Cell Factories 9, 58, 2010).
Ainsi, la biomasse est broyée finement et une suspension suffisamment homogène est réalisée pour pouvoir être pipetée en microplaques, avant ajout d’un cocktail de référence et différents sécrétomes. Chaque test compte 7 réplicats. Les données issues de trois séries d’hydrolyse (une en tubes et deux en microplaques) ont été traitées statistiquement à l’aide d’un test de Student.
Grâce aux données issues du test de saccharification mis au point, l’influence sur le rendement d’hydrolyse des sécrétomes peut être comparée pour chaque biomasse (Figure 2A-C). Les différences de performance sur les trois biomasses sont importantes : plusieurs sécrétomes permettent d’améliorer à la fois l’hydrolyse de la paille et celle du miscanthus, dès 24h.
Exemple 8 : Tests de saccharification de biomasse eu présence de polypeptides à activité polysaccharide oxydase :
Les tests de supplémentation du cocktail de T. reesei par les polypeptides pour la saccharification du miscanthus ont été réalisés en triplicats selon la méthode d'hydrolyse enzymatique décrite plus haut, en utilisant 5 mg de biomasse, 1 mg/g MS du cocktail K975 et 80 Ul/g MS de β-glucosidase apporté par le cocktail SP188, pendant 24h à 45°C et 850 rpm. Dans une partie des échantillons, un traitement par les LPMO (2,2 μΜ) en présence d'ascorbate 1 mM a été effectué pendant 24h avant le début de l’hydrolyse ; dans l'autre partie, les LPMO et l'ascorbate ont été ajoutés au début de l'hydrolyse, en même temps que le cocktail cellulolytique.
Dans les échantillons de référence, les polypeptides n'ont pas été ajoutés. Après 24h, la réaction a été arrêtée et la concentration de glucose dans les échantillons a été mesurée à l'aide du réactif Glucose GOD-POD (Biolabo).
Exempte 9 : Sélection et production de protéines fongiques d'intérêt
Afin de pouvoir étudier la fonction des polypeptides d’intérêt, il a été décidé de les produire de manière hétérologue dans la levure Pichia pastoris, à l’aide de gènes synthétiques placés dans un vecteur. Plusieurs versions de la séquence d’Aspergillus aculeatus ont été exprimées (avec le module X273 N-terminal seul, avec une extension Cterminale tronquée, et avec l’extension C-terminale complète), ainsi qu’une protéine similaire comportant une extension C-terminale très courte, retrouvée chez Podospora anserina (PaX273).
Chacune des constructions testées débute par un peptide signal, suivi de l’histidine n-terminale impliquée dans la triade catalytique, et se termine à une position terminale variable. Pour les clones issus d’Aspergillus aculeatus, la séquence polypeptidique de référence est SEQ ID N°2. Pour le clone issu de Podospora anserina, la séquence polypeptidique de référence est SEQ ID N°l.
Tableau 2: Séquences polypeptidiques choisies pour l’expression chez
Pichia pastoris.
Organisme source Taille (kDa) Position terminale
AaX273 complète Aspergillus aculeatus 30.2 314
AaX273_tronquée Aspergillus aculeatus 19.6 200
AaX273_Nter Aspergillus aculeatus 19.0 193
PaX273 Podospora anserina 20.7 209
Au total, 4 gènes ont donc été synthétisés et transformés chez Pichia pastoris (voir Tableau 2). Les transformants correspondants ont été cultivés en petits volumes, selon la procédure accélérée mise en place au laboratoire (Haon et al., « Recombinant protein production facility for fungal biomass-degrading enzymes using the yeast Pichia pastoris. Front Microbiol. 6, 2015) afin de vérifier la bonne expression des protéines.
Exemple 10 : Etude d’une nouvelle famille de LPMO fongiques
Analyse bio-informatique de la famille X273
Afin de mesurer l’étendue de la famille X273 dans les génomes fongiques, une recherche d'homologies basée sur la séquence du module X273 de Podospora anserina, d'une longueur de 165 acides aminés, a été effectuée, à l’aide de l’outil NCBI Blast, et en ne gardant que les séquences les plus proches (e-value égale ou inférieure à le18).
Dans un second temps, en vue d’optimiser la sélection des séquences polypeptidiques d’intérêt, on se base sur un alignement de séquences réalisé à l’aide de Clustal Omega (EMBL-EBI), puis on réalise une curation manuelle afin d'écarter les séquences suivantes :
- Fragments N-ter ou C-ter ne correspondant pas à des protéines entières (notamment celles ne comportant pas la lere histidine, caractéristique des LPMOs) ;
- Séquences dont l’extrémité N-ter ne correspond pas à un peptide signal selon le logiciel SignalP 4.1. ;
Séquences comportant des insertions ou des délétions importantes, possiblement dues à de mauvais modèles d’épissage. ;
- Séquences ayant une extension C-ter'minaie très longue.
Outre SEQ ID N°1 et 2, on parvient ainsi à une liste affinée de prêt de 378 séquences polypeptidiques (SEQ ID N°7 à 382), provenant d’organismes fongiques, et principalement d'ascomycètes : 334 séquences, contre 41 provenant de basidiomycètes et 3 de champignons non classifiés.
Les acides aminés consensus sont représentés graphiquement en figure 3, après alignement des 378 modules catalytiques correspondant aux séquences protéiques SEQ ID N°l, 2 et 7 à 382. La figure est générée par l’application WebLogo, selon Crooks et al. (WebLogo : A Sequence Logo Generator. Genome Res. 14, 1188-1190 ; 2004).
L'alignement des séquences correspondant au module X273 révèle plusieurs régions bien conservées au sein de la famille. Toutes les séquences comportent notamment une histidine N-terminale, ainsi qu'une deuxième histidine strictement conservée, ce qui est une caractéristique du centre actif («Histidine brace») de toutes les LPMO caractérisées jusqu'à présent. On compte une vingtaine d’autres résidus strictement conservés, dont 6 cystéines potentiellement impliquées dans la formation de ponts disulfures. En plus du module X273, la plupart des protéines de la liste possèdent une extension C-terminale, plus ou moins longue selon les espèces. Pour 7 d'entre elles, trouvées chez 4 organismes différents, cette extension comporte un module de liaison à la cellulose (CBM1).
Dans le tableau 3, les positions relatives de ces acides aminés conservés sont déterminées par rapport aux séquences références SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.
Tableau 3: Positions conservées dans le module catalytique X273
Acides aminés conservés Position dans SEQ ID I Position dans SEQ ID 2
Histidine (H) 19, 105 20, 109 |
Glycine (G) 31, 107 | 32,111
Proline (P) 25 |26 |
Arginine (R) 28 |29 |
Cystéine (C) 38, 69, 74, 157, 163, 179 | 39, 73,78, 162, 168, 186 |
Asparagine (N) 110 1114 1
Glutamine (Q) 166, 174 | 171, 181 1
Tryptophane (W) 169 i 174 1
Glycine (D) ou Alanine (A) 20, 76 1 21, 80 1
Glycine (D) ou Asparagine (N) 161 i 166 |
Acide aspartique (D) ou Asparagine (N) 49 | 50
Proline (P) ou Alanine (A) 151 155 |
Thréonine (T) ou Asparagine (N) 175 1 182 i
Tyrosyne (Y) ou Phénylalanine (F) 176 i 183 1
Acide aspartique (D) ou Leucine (L) 181 1188 1
Production hétérologue et test d’activité
Les clones de P. pastoris exprimant les X273 d'A. aculeaius et de P. anserina ont été utilisés pour produire les protéines en fioles de IL. La version de la protéine d'A. aculeaius retenue est celle ayant été la plus produite en petits volumes, c'est à dire celle qui a été tronquée en laissant une dizaine d'acides aminés de l'extension C-terminale. Après 15 purification, on obtient une quantité totale de 47,5 mg pour AaX273 et 61 mg pour
PaX273. Les protéines purifiées ont ensuite été chargées en cuivre, afin que leur centre actif soit fonctionnel, et l'excédent de cuivre éliminé par diafiltration. Une analyse par spectrométrie de masse avec plasma à couplage inductif (ICP-MS) a permis de confirmer la présence d’environ un atome de cuivre par molécule de X273.
Grâce à un essai fluorimétrique en présence d'Amplex Red, la production d'EhCh par les enzymes X273 en présence d’un donneur d'électron (acide ascorbique) et en l'absence de substrat a pu être établie, ce qui indique que ces enzymes ont une activité d’oxydation et se comportent comme les autres familles de LPMO.
Caractérisation des produits de dégradation de la cellulose
Afin de déterminer si les LPMO ont une activité sur la cellulose, on peut observer indirectement leur effet en utilisant leur synergie avec les cellulases. Ainsi, après avoir laissé agir les protéines X273 sur des nanofibrilles de celluloses (NCF), celles-ci ont été hydrolysées par la CBHI (Cel7A) de T. reesei. La quantité de cellobiose mesurée par chromatographie d’échange d'ions (HPAEC-PAD) à la suite de cette hydrolyse est plus importante dans les échantillons ayant été traités par les X273 que dans l'échantillon témoin (voir Figure 4).
Cela indique que les X273 semblent introduire dans les chaînes de cellulose des coupures servant de nouvelles extrémités d'attaque à la cellobiohydrolase, qui libère donc plus de cellobiose que lorsqu’elle agit seule.
La visualisation de l’action directe des LPMO sur les fibres de cellulose est plus difficile, étant donné que seuls les polysaccharides solubles (dont le degré de polymérisation est généralement inférieur à 6) sont détectés par les méthodes de chromatographie. On peut toutefois quantifier les courtes chaînes de cellulose libérées par l’accumulation de ces clivages, et déterminer s’il s’agit d’oligosaccharides natifs, ou oxydés (notamment en Ci et/ou en C4).
Ainsi, des tests ont menés sur PASC (Phosphoric Acid Swollen Cellulose) et Avicel (cellulose microcristalline), en présence de H2O2, et en diminuant la quantité de donneur d’électrons selon les conditions proposées par Bissaro et al. (« Oxidative cleavage of polysaccharides by monocopper enzymes depends on H2O?». Nat. Chera. Biol. 13, 11231128 ; 2017). En augmentant les quantités d’enzyme AaX273, des produits ont pu être observés sur les deux substrats. Les deux enzymes libèrent du cellobiose, du cellotriose, du cellotetraose et du cellopentaose.
Saccharification de biomasse prétraitée
Après aperçu de l’activité des X273 sur ia cellulose, leur activité sur des substrats plus complexes a été évaluée.
Les deux sécrétomes contenant des X273 ayant montré une amélioration de l'hydrolyse sur le miscanthus prétraité, c'est cette biomasse qui a été choisie pour réaliser les tests de saccharification. Afin de faciliter l'homogénéisation, une proportion plus faible de biomasse a été utilisée que précédemment (0,5% m/v), et la dose d'enzyme du cocktail de référence a également été diminuée (1 mg/g de matière sèche). Une dose de X273 de 0,2 mg/g de matière sèche a été ajoutée. Deux types d'hydrolyse ont été effectués :
- en mettant en contact les protéines X273 avec la biomasse pendant 24h puis en ajoutant le cocktail de référence ; et
- en faisant agir simultanément les dites protéines et le cocktail de référence.
Les données obtenues après 24h d’hydrolyse du miscanthus par le cocktail de référence, avec ou sans ajout de AaX273 ou PaX273, sont illustrées en Figure 5.
Ainsi, après 24h d'hydrolyse, on observe une augmentation de la quantité de glucose en présence des LPMO, principalement lorsque l’ajout des protéines s'est fait de manière simultanée. Il existe donc une synergie entre les X273 et le cocktail cellulolytique de T. reesei.
LISTAGE DE SEQUENCES
SEQ ID Description Générale
1 Séquence Polypeptidique référence d’enzyme à activité polysaccharideoxydase issue de Podospora anserina (référencée PaX273/
2 Séquence Polypeptidique référence d’enzyme à activité polysaccharideoxydase issue de Aspergillus aculeatus (référencée AaX273)
3 Peptide signal de PaX273
4 Peptide signal de AaX273
5 Module catalytique de PaX273
6 Module catalytique de AaX273
7-382 Autres Séquences polypeptidiques apparentées à la famille X273
SEQ ID NO. 1
MHFSTVSSALGLASLVSAHGVVLKPASRKPGDATTEACGRAMVNFYKQDETSYP EAFLRSNPLPDRNKCNLFLCKGYQFADNAANVQSYKPGDSVEYEVYIRIPHSGYA NVSIVDTTTNKVLGSPLVSWASGYAAS SKPPADQTKF S VKIPELGAQC AAAGVC V LQWHVVFGAGQTYQSCTDFTVAAPVAPAEPAPEHGHGHRIRGQSRW
SEP ID NO. 2
MKQTGSII >ALAGLVSMANAHGFVTSPQPRMPGSAMEKACGQQ VYNNQE ADNYG
NIQGELQIASGQSDYDAEACDIWLCKGYKYADNTANVQSYKPGEVIDFTVDIRAP HTGTANVSVVDTATNTMLSQPLIYWSVYASTATGVTANETSFSVTMPTDLGDKC NEAGACVLQWWWDARSIDQTYESCVDFTLSGSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSAA
AAVATSAASSSTSSAAETTTAASAAVTSPAAANNIAPVSSSGPTTLATSVKQTATA AAVSSATSTSVSLPTDGTAEEQLTWVASVFKALLNYAN
SEQ IP NO. 3
MHFSTVSSALGLASLVSA
SEQ IP NO. 4
MKQTGSIL ALAGL VSMANA
SEQ IP NO. 5
HGWLKPASRKPGDATTEACGRAMVNFYKQDETSYPEAFLRSNPLPDRNKCNLFL CKGYQFADNAANVQSYKPGDSVEYEVYIRIPHSGYANVSIVDTTTNKVLGSPLVS WASGYAASSKPPADQTKFSVKIPELGAQCAAAGVCVLQWHWFGAGQTYQSCTD FT hgfvtspqpiwpgsamekacgqqvynnqeadnygniqgelqiasgqsdydaeac
DIWLCKGYKYADNTANVQSYKPGEVIDFTWIRAPHTGlAXYSYVDTATXTXH.S
QPLIYWSVYASTATGVTANETSFSVTMPTDLGDKCNEAGACVLQWWWDARSIDQ
TYESCVDFT

Claims (14)

  1. REVENDICATIONS
    1. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
  2. 2. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence présentant une identité d’acide aminé d’au moins 80% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
  3. 3. Polypeptide isolé à activité polysaccharide oxydase selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une séquence polypeptidique de référence choisie parmi SEQ ID N°5 à SEQ ID N°382.
  4. 4. Composition à activité polysaccharide-oxydase, caractérisée en ce qu’elle comprend un polypeptide à activité polysaccharide oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3.
  5. 5. Composition à activité polysaccharide-oxydase selon la revendication 4, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un polypeptide à activité polysaccharide-degradase choisi parmi : une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase.
  6. 6. Kit comprenant au moins :
    - une première partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase;
    - une seconde partie comprenant un polypeptide à activité polysaccharide-dégradase choisi parmi une cellulase, une hémicellulase, une ligninase et une carbohydrate oxydase, ou une composition comprenant le dit polypeptide à activité polysaccharide-dégradase.
  7. 7. Un hôte apte à exprimer de manière recombinante un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3 ;
  8. 8. Acide nucléique isolé codant pour un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3.
  9. 9. Procédé d’obtention d’un sucre à partir d’un substrat polysaccharidique, comprenant au moins une étape de mise en contact du dit substrat avec un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase tel que défini selon la revendication 1 ou 2 ou 3, ou d’une composition à activité polysaccharide-oxydase telle que définie selon la revendication 4 ou 5.
  10. 10. Procédé de production d’alcool à partir d’un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu’il comprend l’obtention d’un sucre par un procédé tel que défini selon la revendication 9, et la fermentation alcoolique dudit sucre par un microorganisme alcooligène.
  11. 11. Procédé de préparation d’un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
    a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
    b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, le dit substrat avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
    caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
  12. 12. Procédé de défibrillation d’un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
    a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d’électrons et un polypeptide à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d’un donneur d’électron; et
    b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence
    SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
  13. 13. Procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
    5 a) disposer d’un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ;
    b) mettre en contact, en présence d’un donneur d’électron, ledit substrat cellulosique avec au moins un polypeptide à activité polysaccharide oxydase dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
    c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites 10 fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique, caractérisé en ce que le dit polypeptide à activité polysaccharide-oxydase présente une identité d’acide aminé d’au moins 20% avec une séquence polypeptidique de référence SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2, en utilisant une méthode de comparaison BLAST-P, la dite méthode de comparaison BLAST-P donnant une e-value de le'18 ou moins.
  14. 15 14. Fibres de celluloses issues d’un procédé de défibrillation selon la revendication 12, et/ou d’un procédé de fabrication de fibres de cellulose selon la revendication 13.
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