FR3066118A1 - EDULATED SECUMUM EXTRACT TO FIGHT THE HARMFUL EFFECTS OF ULTRAVIOLET RADIATION - Google Patents
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Abstract
Extrait de Sechium edule et son utilisation dans une méthode de traitement pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau.Sechium edule extract and its use in a method of treatment to combat the harmful effects of ultraviolet radiation on the skin.
Description
EXTRAIT DE Sechium edule POUR LUTTER CONTRE LES EFFETS NOCIFS DES RAYONNEMENTS ULTRAVIOLETS L’invention concerne un extrait de Chayotte ou Sechium edule et son utilisation pour le traitement de la peau pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets. Elle vise également une composition cosmétique comprenant ledit extrait.The extract of Sechium edule TO FIGHT THE HARMFUL EFFECTS OF ULTRAVIOLET RADIATION The invention relates to an extract of Chayote or Sechium edule and its use for the treatment of the skin to combat the harmful effects of ultraviolet radiation. It also relates to a cosmetic composition comprising said extract.
Les rayonnements ultraviolets (UV) sont des rayonnements électromagnétiques dont la longueur d’onde est comprise entre 100 et 400 nm. Le spectre UV est sous-divisé en 3 catégories : les UVA (320-400 nm), les UVB (280-320 nm) et les UVC (100-280 nm). Les rayonnements ultraviolets représentent 5% du rayonnement solaire et constituent, d’un point de vue énergétique, la partie la plus active du rayonnement solaire auquel sont soumis les organismes vivants. La peau est exposée quotidiennement aux rayonnements du soleil et est bien entendu la première cible de ces rayonnements UV.Ultraviolet (UV) radiation is electromagnetic radiation with a wavelength between 100 and 400 nm. The UV spectrum is subdivided into 3 categories: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) and UVC (100-280 nm). Ultraviolet radiation accounts for 5% of solar radiation and is, from an energy point of view, the most active part of the solar radiation to which living organisms are subjected. The skin is exposed daily to the sun's rays and is of course the first target of these UV rays.
Alors que les UVC sont stoppés par la couche d'ozone, les UVB et les UVA pénètrent dans les couches profondes de l'épiderme pour atteindre les cellules responsables du renouvellement cellulaire et de la réparation tissulaire. Ils sont donc responsables de la grande majorité des effets délétères liés à l’exposition solaire. Même si les UV ont des effets bénéfiques dans la peau (synthèse de mélanine, synthèse de vitamine D3, production d'endorphines), ils sont responsables d'effets nocifs à court-terme, tel que l'érythème actinique (coup de soleil) et d'effet nocifs à long terme, tels que le photovieillissement et la photo-carcinogenèse. Dans ce contexte, les UVB sont déclarés cancérogènes de classe I dès 1992 alors que les UVA ont rejoint cette classification, plus récemment, en 2009. A court terme, les UV sont responsables de dommages cellulaires structuraux comme l'oxydation des lipides des membranes plasmiques, de dégâts fonctionnels comme l'altération des protéines et de dommages génomiques tels que des modifications chimiques et des lésions de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Les UVB sont directement absorbés par l'ADN et occasionnent des lésions volumineuses appelées « photo-produits » comme des CPDs (dimère cyclobutane de pyrimidines) et des 6-4PP (photoproduit pyrimidine(6-4)pyrimidone).While UVC is stopped by the ozone layer, UVB and UVA penetrate the deep layers of the epidermis to reach the cells responsible for cell renewal and tissue repair. They are therefore responsible for the vast majority of the deleterious effects associated with sun exposure. Even if UV rays have beneficial effects in the skin (melanin synthesis, vitamin D3 synthesis, production of endorphins), they are responsible for short-term harmful effects, such as actinic erythema (sunburn) and long-term harmful effects, such as photoaging and photo-carcinogenesis. In this context, UVBs were declared class I carcinogens in 1992 while UVAs joined this classification, more recently, in 2009. In the short term, UV rays are responsible for structural cellular damage such as the oxidation of lipids in plasma membranes. , functional damage such as protein alteration and genomic damage such as chemical changes and damage to deoxyribonucleic acid (DNA). UVB rays are directly absorbed by DNA and cause large lesions called "photo-products" such as CPDs (cyclobutane pyrimidine dimer) and 6-4PP (pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct).
Quant aux UVA qui sont faiblement absorbés par l'ADN, ils génèrent des espèces chimiques toxiques appelés ROS (espèces réactives oxygénées) qui oxydent les lipides, les protéines et l'ADN.As for the UVA which are weakly absorbed by DNA, they generate toxic chemical species called ROS (reactive oxygen species) which oxidize lipids, proteins and DNA.
En particulier, dans l'ADN, les UVA sont associés à des dommages oxydatifs, tels que la 8-oxoG (8-oxo-7,8-dihydroguanine), des pyrimidines glycols, des S SB (cassures simple brin ou « single strand break ») et à la formation de CPD. L'inhibition de la réparation des CPD après un stress génotoxique UVA rend finalement les UVA plus mutagènes que les UVB.In particular, in DNA, UVA is associated with oxidative damage, such as 8-oxoG (8-oxo-7,8-dihydroguanine), pyrimidines glycols, S SB (single strand breaks or "single strand" break ”) and CPD training. Inhibiting the repair of CPDs after UVA genotoxic stress ultimately makes UVA more mutagenic than UVB.
Pour se protéger du stress génotoxique UV-induit, l'organisme possède différents systèmes de protection naturelle : 1/ la pigmentation de l'épiderme pour former un écran absorbant les UV et protéger les noyaux des cellules ; 2/ les défenses anti-oxydantes pour neutraliser les radicaux libres ; 3/ les systèmes de réparation de l'ADN pour réparer l'ADN endommagé, tels que le BER (réparation par excision de base ou « bases excision repair »), le NER (réparation par excision de nucléotides, ou « nucléotides excision repair ») et le MMR (réparation de mésappariements ou « mismatch repair »).To protect itself from UV-induced genotoxic stress, the body has different natural protection systems: 1 / pigmentation of the epidermis to form a UV absorbing screen and protect the nuclei of cells; 2 / antioxidant defenses to neutralize free radicals; 3 / DNA repair systems to repair damaged DNA, such as BER (base excision repair), NER (nucleotide excision repair, or "nucleotide excision repair") ) and the MMR (mismatch repair).
Au cours des dernières années, les habitudes d'exposition au soleil ont fortement évolué avec la définition de la beauté (la mode du teint halé), en augmentant parallèlement le risque de cancers cutanés. Face à des durées d'exposition particulièrement longues, les systèmes naturels de protection ne sont plus suffisamment efficaces pour lutter contre les effets nocifs des UV. C'est pourquoi des protections externes ont été développées telles que des crèmes solaires à effet de filtre ou des compléments alimentaires antioxydants.In recent years, the habits of exposure to the sun have strongly evolved with the definition of beauty (the fashion of tanned complexion), while increasing the risk of skin cancer. Faced with particularly long exposure times, natural protection systems are no longer effective enough to combat the harmful effects of UV rays. This is why external protections have been developed such as sunscreens with a filtering effect or antioxidant food supplements.
Le développement de produits dermo-cosmétiques (crème, spray, huile...) utilisent un ou plusieurs filtres UV dont le rôle est de réduire l'intensité et l'énergie des rayonnements UV. Les filtres organiques (ou chimiques) sont composés de molécules aromatiques qui absorbent les photons à des longueurs d’ondes définies ; par conséquent, il est souvent nécessaire d'associer plusieurs filtres pour couvrir le spectre UVA et UVB. Les filtres organiques sont souvent instables avec la génération de ROS et peuvent déclencher des réactions allergiques cutanées. Quant aux filtres inorganiques qui sont principalement des pigments (particules d'oxyde métalliques, oxyde de zinc, dioxyde de titane), ils diffusent la lumière. De nos jours, la taille des particules est de l'ordre du nanomètre pour des questions esthétiques (pas de coloration blanche des crèmes solaires) et d'efficacité ; ces filtres restent photo-réactifs.The development of dermo-cosmetic products (cream, spray, oil ...) use one or more UV filters whose role is to reduce the intensity and energy of UV radiation. Organic (or chemical) filters are made up of aromatic molecules which absorb photons at defined wavelengths; therefore, it is often necessary to combine several filters to cover the UVA and UVB spectrum. Organic filters are often unstable with the generation of ROS and can trigger allergic skin reactions. As for the inorganic filters which are mainly pigments (metal oxide particles, zinc oxide, titanium dioxide), they diffuse light. Nowadays, the size of the particles is of the order of a nanometer for aesthetic questions (no white coloring of sunscreens) and efficiency; these filters remain photo-reactive.
Aujourd'hui, la photo-protection consiste à utiliser des filtres solaires pour absorber et/ou diffuser les UV avant qu'ils n'atteignent les cellules de la peau. Des molécules naturelles ont très largement gagné du terrain dans le domaine de la photo-protection grâce à leurs propriétés absorbantes (effet « filtre »), comme les acides phénoliques, les flavonoïdes ou encore certains polyphénols.Today, photo-protection consists of using sun filters to absorb and / or diffuse UV rays before they reach the skin cells. Natural molecules have very widely gained ground in the field of photo-protection thanks to their absorbent properties ("filter" effect), such as phenolic acids, flavonoids or certain polyphenols.
En complément d'une protection exogène, la photo-protection peut également être d'ordre biologique avec l'utilisation de molécules présentant des effets anti-inflammatoires ou antioxydants. Par exemple, en neutralisant au préalable les ROS induits par les UV, des molécules anti-oxydantes peuvent diminuer les dommages oxydatifs à l'ADN induits par les UV. Egalement, des molécules peuvent stimuler des mécanismes antioxydants endogènes pour diminuer les dommages oxydatifs à l'ADN induits par les UV. De telles molécules peuvent être intégrées dans des formulations cosmétiques et des crèmes solaires pour compléter la photo-protection apportée par les filtres solaires. Parallèlement, une supplémentation alimentaire en antioxydants, tels que des caroténoïdes, peut encore apporter un niveau supplémentaire de photo-protection.In addition to exogenous protection, photo-protection can also be biological with the use of molecules with anti-inflammatory or antioxidant effects. For example, by neutralizing UV-induced ROS beforehand, antioxidant molecules can reduce the oxidative damage to DNA induced by UV. Also, molecules can stimulate endogenous antioxidant mechanisms to decrease oxidative damage to DNA induced by UV rays. Such molecules can be incorporated into cosmetic formulations and sun creams to supplement the photo-protection provided by sun filters. At the same time, dietary supplementation with antioxidants, such as carotenoids, can still provide an additional level of photo-protection.
La Chayotte ou Chouchou (Sechium edule (Jacq.) Sw.) est une liane vivace de la famille des Cucurbitaceae. Originaire d'Amérique du Sud, la plante s'est acclimatée dans la plupart des régions tropicales et subtropicales où elle est consommée à la fois pour ses fruits, ses jeunes pousses et ses tubercules. De 5-6 m de longueur, la plante émet de longues tiges grimpantes qui s'adaptent et s'accrochent sur un support grâce à des vrilles trifides. Le fruit à maturité, la tige et le tubercule, riche en amidon, sont comestibles.The Chayote or Chouchou (Sechium edule (Jacq.) Sw.) Is a perennial liana from the Cucurbitaceae family. Native to South America, the plant has acclimatized in most tropical and subtropical regions where it is eaten for its fruits, young shoots and tubers. 5-6 m in length, the plant emits long climbing stems which adapt and hang on a support thanks to trifid tendrils. The ripe fruit, stem and tuber, rich in starch, are edible.
En médecine traditionnelle, on attribuait au fruit de la Chayotte des vertus médicinales pour favoriser la lactation et guérir la coqueluche. Des extraits de jus de fruit sont décrits pour présenter des efficacités thérapeutiques et préventives pour lutter contre le stress oxydatif (Tiwari et al., 2013) via des propriétés inhibitrices de péroxydation lipidique (Firdous et al., 2012). Les feuilles de Chayotte auraient la propriété de modifier le rythme cardiovasculaire aussi bien que d'abaisser la pression sanguine et de dissoudre les calculs rénaux. Les tubercules sont considérés comme un diurétique puissant et sont aussi utilisés contre les troubles pulmonaires et pour soulager l'inflammation intestinale.In traditional medicine, the fruit of Chayote was attributed medicinal properties to promote lactation and heal whooping cough. Fruit juice extracts are described to present therapeutic and preventive efficiencies to fight against oxidative stress (Tiwari et al., 2013) via inhibitory properties of lipid peroxidation (Firdous et al., 2012). Chayote leaves have the property of modifying the cardiovascular rhythm as well as lowering blood pressure and dissolving kidney stones. Tubers are considered a potent diuretic and are also used against lung problems and to relieve intestinal inflammation.
Le Chouchou est peu connu en utilisation cosmétique. La pulpe crue du fruit, astringente, est utilisée en masque pour effacer les tâches sur le visage. Le document KR 984163B1 décrit une composition cosmétique hydratante contenant un extrait de fruit/feuille de Sechium edule. Des compositions cosmétiques contenant un extrait de Sechium edule seul et/ou en association avec d'autres ingrédients sont aussi décrites pour des propriétés antiâge, antiride, apaisante, anti-radicalaire et blanchissante, et pour inhiber la production d'endothéline-1, notamment dans le document JP 5124810B2. A la connaissance du Demandeur, aucune solution de photo-protection biologique, contre les effets nocifs des UV à court terme et à long terme n’a été décrite.The Scrunchie is little known in cosmetic use. The raw, astringent fruit pulp is used as a mask to remove stains from the face. Document KR 984163B1 describes a moisturizing cosmetic composition containing a fruit extract / Sechium edule leaf. Cosmetic compositions containing an extract of Sechium edule alone and / or in combination with other ingredients are also described for antiaging, anti-wrinkle, soothing, anti-radical and whitening properties, and for inhibiting the production of endothelin-1, in particular in document JP 5124810B2. To the knowledge of the Applicant, no solution of biological photo-protection against the harmful effects of UV in the short term and in the long term has been described.
En résumé, la photo-protection, apportée aujourd'hui par les solutions de l'Homme de l'Art, cible uniquement les dommages des UV à court terme. La photo-protection de demain doit être capable de protéger la peau de tous les effets nocifs des UV notamment les effets génotoxiques, à court terme mais aussi à long terme. De plus, une photo-protection à long terme permet de garantir un niveau de sécurité additionnel pour lutter contre le photovieillissement et la photo-carcinogenèse. En complément d'une photo-protection classique, il est nécessaire de protéger l'ADN des cellules de l'épiderme (notamment les kératinocytes) pour maintenir leur intégrité et leur capacité à renouveler un épiderme sain.In summary, photo-protection, brought today by those skilled in the art, only targets short-term UV damage. The photo-protection of tomorrow must be able to protect the skin from all the harmful effects of UV rays, in particular the genotoxic effects, in the short term but also in the long term. In addition, long-term photo-protection ensures an additional level of security to combat photoaging and photo-carcinogenesis. In addition to conventional photo-protection, it is necessary to protect the DNA of epidermal cells (especially keratinocytes) to maintain their integrity and their ability to renew healthy epidermis.
Le problème que se propose de résoudre l’invention est celui de mettre au point une composition susceptible d’apporter une photo-protection d’ordre biologique pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau à court terme et à long terme.The problem that the invention proposes to solve is that of developing a composition capable of providing a biological photo-protection to combat the harmful effects of ultraviolet radiation on the skin in the short term and in the long term.
En d’autres termes, le problème que se propose de résoudre l’invention est celui de maintenir l'intégrité de l'ADN, afin de lutter contre les effets génotoxiques à court terme et à long terme induits par les rayonnements UV, notamment les UVA.In other words, the problem which the invention proposes to solve is that of maintaining the integrity of DNA, in order to combat the short-term and long-term genotoxic effects induced by UV radiation, in particular the UVA.
De manière inattendue, le Demandeur a constaté qu’un extrait de Sechium edule est particulièrement efficace pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau, notamment des rayonnements ultraviolets A, à court terme et à long terme.Unexpectedly, the Applicant has found that an extract of Sechium edule is particularly effective in combating the harmful effects of ultraviolet radiation on the skin, in particular short-term and long-term ultraviolet A radiation.
Dans la suite de la description et dans les revendications, par l’expression « à court terme », on désigne la période de temps de 24h qui suit l’irradiation UVA.In the remainder of the description and in the claims, the expression “short term” denotes the 24 hour period following the UVA irradiation.
De même, par l’expression « à long terme », on désigne la période de temps de 14 jours qui suit l’irradiation UVA.Likewise, by the term "long term" is meant the period of time of 14 days following UVA irradiation.
Dans la suite de la description et dans les revendications, par l’expression « protection à court terme », on entend la période de temps de 24h qui suit l’irradiation UVA à l’issue de laquelle aucun dommage n’est constaté. Ainsi, les dommages à court terme induits par les UVA apparaissent dans les 24 h qui suivent l’irradiation UVA.In the following description and in the claims, by the expression "short-term protection" is meant the period of time of 24 hours following the UVA irradiation at the end of which no damage is observed. Thus, the short-term damage induced by UVA rays appears within 24 hours of the UVA irradiation.
Parallèlement, par l’expression « protection à long terme », on désigne la période de temps de 14 jours qui suit l’irradiation UVA à l’issue de laquelle aucun dommage n’est constaté. Ainsi, les dommages à long terme induits par les UVA apparaissent 14 jours après l’irradiation UVA.At the same time, the term "long-term protection" refers to the 14-day period after UVA irradiation after which no damage is found. Thus, the long-term damage induced by UVA rays appears 14 days after UVA irradiation.
Selon la première caractéristique de l’invention, le traitement pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau consiste à lutter contre les effets génotoxiques des UV, notamment des UVA, à court terme et à long terme.According to the first characteristic of the invention, the treatment for combating the harmful effects of ultraviolet radiation on the skin consists in combating the genotoxic effects of UV rays, in particular UVA rays, in the short term and in the long term.
Selon l’invention, toute ou partie de la plante Sechium edule peut être utilisée comme extrait pour lutter contre le stress génotoxique UV-induit à court terme et à long terme. En pratique, la partie de la plante utilisée comme extrait est choisie dans le groupe comprenant le fruit, la fleur, la graine, la feuille, la tige, la jeune pousse.According to the invention, all or part of the Sechium edule plant can be used as an extract to combat short-term and long-term UV-induced genotoxic stress. In practice, the part of the plant used as an extract is chosen from the group comprising the fruit, the flower, the seed, the leaf, the stem, the young shoot.
De manière particulièrement préférée, la partie de la plante mise en œuvre est le fruit. Il peut s’agir d’un fruit frais, congelé, séché, entier, coupé et/ou broyé. Avantageusement, il s’agit d’un fruit séché.Particularly preferably, the part of the plant used is the fruit. It can be a fresh, frozen, dried, whole, cut and / or crushed fruit. Advantageously, it is a dried fruit.
De manière particulière, la lutte contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau à court terme et/ou à long terme consiste en une protection de l’acide désoxyribonucléique, une réparation de l’acide désoxyribonucléique, une accélération de la réparation de l’acide désoxyribonucléique ce qui conduit à un maintien de la prolifération des kératinocytes à long terme pendant 14 jours. L’invention concerne également un extrait de Sechium edule susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction comprenant une étape d’extraction solide/liquide d’au moins une partie de la plante, suivie d’une seconde étape de séparation solide /liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide.In a particular way, the fight against the harmful effects of ultraviolet radiation on the skin in the short term and / or in the long term consists in a protection of the deoxyribonucleic acid, a repair of the deoxyribonucleic acid, an acceleration of the repair of the deoxyribonucleic acid, which leads to long-term maintenance of keratinocyte proliferation for 14 days. The invention also relates to an extract of Sechium edule capable of being obtained by an extraction process comprising a step of solid / liquid extraction of at least part of the plant, followed by a second step of solid / liquid and finally a third stage of recovery of the liquid phase.
Les extraits de plantes étant souvent destinés à être formulés dans des compositions cosmétiques, il importe d’éviter les solvants d’extraction comprenant des sels ou des acides, dont on retrouvera nécessairement au moins des traces dans l’extrait. En effet, il est bien connu que la formulation, en gel ou en émulsion, d’ingrédients à base de sels au-delà d’une dose de 0,1% est particulièrement complexe. En outre, les acides, en abaissant le pH des extraits obtenus, ont pour effet de rendre la formulation en gel ou en émulsion difficile. En particulier, les produits cosmétiques destinés à l’application cutanée doivent avoir un pH adapté, de préférence proche de celui de la peau (environ pH 6,5), ou neutre. Dans ces conditions, l’utilisation de solvants contenant des acides requiert par conséquent l’ajout d’excipients, notamment des régulateurs de pH.Plant extracts are often intended to be formulated in cosmetic compositions, it is important to avoid extraction solvents comprising salts or acids, of which there will necessarily be at least traces in the extract. In fact, it is well known that the formulation, in gel or in emulsion, of ingredients based on salts beyond a dose of 0.1% is particularly complex. In addition, the acids, by lowering the pH of the extracts obtained, have the effect of making the formulation in gel or in emulsion difficult. In particular, cosmetic products intended for skin application must have a suitable pH, preferably close to that of the skin (approximately pH 6.5), or neutral. Under these conditions, the use of solvents containing acids therefore requires the addition of excipients, in particular pH regulators.
Selon l’invention, le solvant utilisé consiste en un mélange de fructose et de glycérine.According to the invention, the solvent used consists of a mixture of fructose and glycerin.
Le solvant peut contenir de l’eau, ou en être dépourvu. La présence d’eau dans le solvant a toutefois pour avantage de fluidifier le solvant, et ainsi de faciliter l’extraction. En d’autres termes et selon un premier mode de réalisation avantageux, le solvant consiste en un mélange de fructose, de glycérine et d’eau.The solvent may contain or be free from water. However, the presence of water in the solvent has the advantage of making the solvent more fluid, and thus of facilitating the extraction. In other words and according to a first advantageous embodiment, the solvent consists of a mixture of fructose, glycerin and water.
En outre, lorsque les composants de ce solvant sont présents dans certains rapports molaires, le solvant possède les propriétés d’un solvant NaDES, c’est-à-dire un solvant eutectique composé de molécules d’origine végétale, et liées entre elles par des interactions intermoléculaires, en particulier des liaisons hydrogènes. Le solvant est notamment liquide à température ambiante, ce qui facilite la mise en œuvre du procédé conduisant à l’extrait de l’invention.In addition, when the components of this solvent are present in certain molar ratios, the solvent has the properties of a NaDES solvent, that is to say an eutectic solvent composed of molecules of plant origin, and linked together by intermolecular interactions, in particular hydrogen bonds. The solvent is in particular liquid at room temperature, which facilitates the implementation of the process leading to the extract of the invention.
Dans un mode de réalisation particulier, le solvant consiste en un mélange de fructose, de glycérine et d’eau dans des proportions molaires préférentiellement d’environ 1:1:5.In a particular embodiment, the solvent consists of a mixture of fructose, glycerin and water in molar proportions preferably of approximately 1: 1: 5.
En pratique, le solvant utilisé peut être produit en mélangeant le fructose et la glycérine, ou le fructose, la glycérine et l’eau, dans un réacteur agité, jusqu'à l'obtention d'un mélange limpide incolore. Ce mélange peut être réalisé à une température comprise entre 2°C et 100°C et pendant 30 minutes à 6 heures, préférentiellement 40°C à 70°C pendant 1 heure à 2 heures. L’extrait selon l’invention est susceptible d’être obtenu par un procédé mettant en œuvre une étape d’extraction solide/liquide. L’extraction solide/liquide peut être effectuée par différentes techniques bien connues de l’homme du métier, telles que macération, remacération, digestion, macération dynamique, décoction, extraction en lit fluide, extraction assistée par micro-ondes, extraction assistée par ultra-sons, extraction à contre-courant, percolation, re-percolation, lixiviation, extraction sous pression réduite, diacolation.In practice, the solvent used can be produced by mixing fructose and glycerin, or fructose, glycerin and water, in a stirred reactor, until a clear, colorless mixture is obtained. This mixing can be carried out at a temperature between 2 ° C and 100 ° C and for 30 minutes to 6 hours, preferably 40 ° C to 70 ° C for 1 hour to 2 hours. The extract according to the invention is capable of being obtained by a process implementing a solid / liquid extraction step. Solid / liquid extraction can be carried out by various techniques well known to those skilled in the art, such as maceration, remaceration, digestion, dynamic maceration, decoction, extraction in a fluid bed, extraction assisted by microwaves, extraction assisted by ultra -sons, counter-current extraction, percolation, re-percolation, leaching, extraction under reduced pressure, deacolation.
En pratique le rapport massique plante/solvant appliqué pour l’étape d’extraction est compris entre 1/99 et 50/50. L’étape d’extraction est effectuée de préférence à une température comprise entre 2°C et 100°C, plus préférentiellement entre 20°C et 80°C. L’étape d’extraction peut être maintenue pendant quelques minutes à plusieurs jours.In practice, the plant / solvent mass ratio applied for the extraction step is between 1/99 and 50/50. The extraction step is preferably carried out at a temperature between 2 ° C and 100 ° C, more preferably between 20 ° C and 80 ° C. The extraction stage can be maintained for a few minutes to several days.
De manière à optimiser l’extraction des composés actifs tout en protégeant ces composés de l’oxydation par l’oxygène de l’air, l’étape d’extraction solide/liquide est avantageusement réalisée sous agitation et/ou sous atmosphère d’azote.In order to optimize the extraction of the active compounds while protecting these compounds from oxidation by oxygen in the air, the solid / liquid extraction step is advantageously carried out with stirring and / or under a nitrogen atmosphere. .
Selon l’invention, l’étape d’extraction solide/liquide est suivie d’une étape de séparation solide/liquide, l’objectif étant de récupérer la phase liquide, aussi appelée filtrat de séparation solide/liquide, contenant la matière active. Cette séparation peut être effectuée par toute technique connue de l’homme du métier, en particulier l’égouttage, le pressage, l’essorage, la centrifugation ou la filtration.According to the invention, the solid / liquid extraction step is followed by a solid / liquid separation step, the objective being to recover the liquid phase, also called solid / liquid separation filtrate, containing the active material. This separation can be carried out by any technique known to a person skilled in the art, in particular draining, pressing, spinning, centrifugation or filtration.
De manière optionnelle l’étape de séparation solide/liquide peut aussi être suivie d’une étape de fractionnement de l’extrait brut, laquelle permet d’obtenir une fraction enrichie en une ou plusieurs familles de molécules extraites de la plante. En pratique, l’étape de fractionnement peut être effectuée par des techniques connues de l’Homme du métier, en particulier la chromatographie basse pression ou la filtration membranaire tangentielle.Optionally, the solid / liquid separation step can also be followed by a crude extract fractionation step, which makes it possible to obtain a fraction enriched in one or more families of molecules extracted from the plant. In practice, the fractionation step can be carried out by techniques known to those skilled in the art, in particular low pressure chromatography or tangential membrane filtration.
De manière optionnelle, l’étape de séparation liquide/solide ou l’étape de fractionnement peut être suivie d’une étape de concentration de l’extrait brut ou de la fraction, laquelle permet d’obtenir un concentré, sous forme liquide ou semi-solide selon le facteur de concentration. En pratique, l’étape de concentration peut être effectuée par évaporation sous pression réduite ou osmose inverse.Optionally, the liquid / solid separation step or the fractionation step can be followed by a step of concentrating the crude extract or of the fraction, which makes it possible to obtain a concentrate, in liquid or semi form. - solid according to the concentration factor. In practice, the concentration step can be carried out by evaporation under reduced pressure or reverse osmosis.
De préférence, le filtrat de séparation solide/liquide ou le concentré subissent en outre une ou plusieurs étapes de clarification. Pour réaliser cette étape de clarification, l’Homme du métier pourra utiliser tout type de filtration connue dans le domaine considéré.Preferably, the solid / liquid separation filtrate or the concentrate also undergoes one or more clarification steps. To carry out this clarification step, a person skilled in the art can use any type of filtration known in the field under consideration.
Enfin, en vue d’un conditionnement, le procédé permettant l’obtention de l’extrait selon l’invention peut comprendre une étape de stérilisation par filtration stérilisante ou pasteurisation par exemple. La filtration stérilisante est classiquement réalisée en filtrant le produit à travers un filtre comprenant des pores d’un diamètre d’environ 0,22 pm. De préférence, l’étape de filtration stérilisante est l’étape finale du procédé. En outre un conservateur microbiologique peut-être ajouté à l’extrait préalablement à l’étape de stérilisation, préférentiellement un mélange d’acide citrique et de sorbate de potassium. L’invention vise aussi des compositions comprenant l’extrait de l’invention, de préférence des compositions cosmétiques, c’est-à-dire adaptées à l’application topique sur la peau et/ou les muqueuses, et/ou les phanères.Finally, with a view to packaging, the process allowing the extract according to the invention to be obtained can comprise a stage of sterilization by sterilizing filtration or pasteurization for example. Sterilizing filtration is conventionally carried out by filtering the product through a filter comprising pores with a diameter of approximately 0.22 μm. Preferably, the sterilizing filtration step is the final step of the process. In addition, a microbiological preservative can be added to the extract before the sterilization step, preferably a mixture of citric acid and potassium sorbate. The invention also relates to compositions comprising the extract of the invention, preferably cosmetic compositions, that is to say suitable for topical application to the skin and / or mucous membranes, and / or the integuments.
La composition selon l’invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique sur la peau et/ou les muqueuses, et/ou les phanères, par exemple sous forme anhydre, sous forme d’une émulsion huile-dans-eau, d’une émulsion eau-dans-huile, d’une émulsion multiple, d’une émulsion siliconée, d’une microémulsion, d’une nanoémulsion, d’un gel, d’une solution aqueuse ou d’une solution hydro-alcoolique.The composition according to the invention can be presented in all the galenical forms normally used for a topical application on the skin and / or the mucous membranes, and / or the integuments, for example in anhydrous form, in the form of an oil-in emulsion. -water, a water-in-oil emulsion, a multiple emulsion, a silicone emulsion, a microemulsion, a nanoemulsion, a gel, an aqueous solution or a solution hydro-alcoholic.
Cette composition peut être plus ou moins fluide et se présenter sous forme d’une crème blanche ou colorée, d’une pommade, d’un lait, d’une lotion, d’un sérum, ou d’un gel.This composition may be more or less fluid and may be in the form of a white or colored cream, an ointment, a milk, a lotion, a serum, or a gel.
La composition cosmétique et/ou dermatologique peut contenir les excipients habituellement utilisés dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les matières grasses, les tensioactifs détergents et/ou conditionnants, les émulsionnants et coémulsionnants, les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les agents exfoliants, les parfums, les charges, les filtres hydrophiles et lipophiles, les matières colorantes, les neutralisants, les agents pro-pénétrants, et les polymères. Ces types d’excipients sont tous bien connus de l’Homme du métier.The cosmetic and / or dermatological composition may contain the excipients usually used in the cosmetic and dermatological fields, such as fats, detergent and / or conditioning surfactants, emulsifiers and coemulsifiers, hydrophilic or lipophilic gelling agents, preservatives, antioxidants , solvents, exfoliating agents, perfumes, fillers, hydrophilic and lipophilic filters, coloring matters, neutralizers, pro-penetrating agents, and polymers. These types of excipients are all well known to those skilled in the art.
En pratique, les quantités de ces différents excipients sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et la somme des excipients représente de préférence 0,01% à 30% du poids total de la composition.In practice, the amounts of these various excipients are those conventionally used in the fields under consideration, and the sum of the excipients preferably represents 0.01% to 30% of the total weight of the composition.
Comme matières grasses appropriées, on peut citer les huiles minérales, les huiles d’origine animale (telle la lanoline), les huiles végétales, les huiles de synthèse (comme par exemple l’isopropyl le myristate, l’octyldodecyl, l’isostearyl isostearate, le decyl oleate, l’isopropyl le palmitate), les huiles siliconées (la cyclomethicone, la diméthicone) et les huiles fluorées. On peut utiliser comme matières grasses des alcools gras, des acides gras, des cires et des gommes, et en particulier des élastomères de silicone.As suitable fats, there may be mentioned mineral oils, oils of animal origin (such as lanolin), vegetable oils, synthetic oils (such as isopropyl myristate, octyldodecyl, isostearyl isostearate , decyl oleate, isopropyl palmitate), silicone oils (cyclomethicone, dimethicone) and fluorinated oils. Fatty alcohols, fatty acids, waxes and gums, and in particular silicone elastomers, can be used as fats.
Comme tensioactifs détergents et/ou conditionnants appropriés, on peut citer les tensioactifs non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, et leurs mélanges, tels que par exemple les alkyl sulfates, les alkyléthersulfates tels que le lauryl éther sulfate de sodium, les alkyl bétaïnes telles que la cocamidopropylbetaïne, ou les sels d’ammonium quaternaires.As suitable detergent and / or conditioning surfactants, non-ionic, anionic, cationic or amphoteric surfactants may be mentioned, and their mixtures, such as for example alkyl sulfates, alkyl ether sulfates such as sodium lauryl ether sulfate, alkyl betaines such than cocamidopropylbetaine, or quaternary ammonium salts.
Comme émulsionnants et co-émulsionnants appropriés, on peut citer par exemple les esters de polyglycérols et d’acide gras, les esters de sucrose et d’acide gras, les esters de sorbitane et d’acide gras, les esters d’acide gras et de sorbitane oxyéthylénés, les ethers d’alcool gras et de PEG, les esters de glycérol et d’acide gras, les alkyl sulfates, les alkyl ether sulfates, les alkyl phosphates, les alkyl polyglucosides, les diméthicone copolyols.Examples of suitable emulsifiers and co-emulsifiers include polyglycerol and fatty acid esters, sucrose and fatty acid esters, sorbitan and fatty acid esters, fatty acid esters and of oxyethylenated sorbitan, the ethers of fatty alcohol and of PEG, the esters of glycerol and of fatty acid, the alkyl sulfates, the alkyl ether sulfates, the alkyl phosphates, the alkyl polyglucosides, the dimethicone copolyols.
Comme gélifiants hydrophiles appropriés, on peut citer par exemple les polymères carboxyvinyliques (carbomers), les copolymères acryliques tels que les copolymères d’acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que la gomme xanthane, la gomme guar, les gommes naturelles telles que la gomme de cellulose et dérivés, les amidons et leurs dérivés, les argiles et les copolymères d’acide 2-acrylamido-2-méthylpropane.As suitable hydrophilic gelling agents, mention may, for example, be made of carboxyvinyl polymers (carbomers), acrylic copolymers such as acrylate / alkylacrylate copolymers, polyacrylamides, polysaccharides such as xanthan gum, guar gum, natural gums such as cellulose gum and derivatives, starches and their derivatives, clays and copolymers of 2-acrylamido-2-methylpropane acid.
Comme gélifiants lipophiles appropriés, on peut citer par exemple les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d’acides gras, la silice hydrophobe et l’éthylcellulose.As suitable lipophilic gelling agents, mention may, for example, be made of modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids, hydrophobic silica and ethylcellulose.
Comme conservateurs appropriés, on peut citer par exemple les acides benzoïque, sorbique, propionique, salicylique, dehydroacétique et leurs sels, l’alcool benzylique, l’éthylhexylglycérine, les parabens, leurs sels et esters, le triclosan, l’imidazolidinyl urée, le 5 phénoxyéthanol, la DMDM hydantoïne, le diazolidinyl urée, la chlorphenesine.Suitable preservatives include, for example, benzoic, sorbic, propionic, salicylic, dehydroacetic acids and their salts, benzyl alcohol, ethylhexylglycerin, parabens, their salts and esters, triclosan, imidazolidinyl urea, 5 phenoxyethanol, DMDM hydantoin, diazolidinyl urea, chlorphenesin.
Comme antioxydants appropriés, on peut citer par exemple les agents chelatants tels que l’EDTA et ses sels, le metabisulfite de sodium, les acides salicylique, ascorbique et citrique et leurs sels, le tartrate de sodium, le gluconate de sodium, les caroténoïdes et les tocophérols.As suitable antioxidants, there may be mentioned for example chelating agents such as EDTA and its salts, sodium metabisulfite, salicylic, ascorbic and citric acids and their salts, sodium tartrate, sodium gluconate, carotenoids and tocopherols.
Comme solvants utilisables dans la composition cosmétique (distinct du solvant d’extraction), on peut citer l’eau, l’éthanol, la glycérine, le propylène glycol, le propanediol, le butylène glycol, le sorbitol.As solvents which can be used in the cosmetic composition (separate from the extraction solvent), mention may be made of water, ethanol, glycerin, propylene glycol, propanediol, butylene glycol, sorbitol.
Comme agents exfoliants appropriés, on peut citer par exemple les exfoliants chimiques tels que les AHA, et les exfoliants physiques tels que les poudres naturelles ou synthétiques.As suitable exfoliating agents, mention may be made, for example, of chemical exfoliants such as AHAs, and physical exfoliants such as natural or synthetic powders.
Comme charges appropriées, on peut citer par exemple le talc, le kaolin, le mica, la serecite, le magnésium carbonate, l’aluminium silicate, le magnésium silicate, les poudres organiques telles que le nylon.As suitable fillers, mention may be made, for example, of talc, kaolin, mica, serecite, magnesium carbonate, aluminum silicate, magnesium silicate, organic powders such as nylon.
Comme colorants appropriés, on peut citer par exemple les colorants lipophiles, les colorants hydrophiles, les pigments et les nacres habituellement utilisés dans les compositions cosmétiques ou dermatologiques, et leurs mélanges.As suitable dyes, mention may, for example, be made of lipophilic dyes, hydrophilic dyes, pigments and nacres usually used in cosmetic or dermatological compositions, and their mixtures.
Comme neutralisants appropriés, on peut citer par exemple la soude, la triethanolamine, l’aminomethyl propanol, l’hydroxyde de potassium.As suitable neutralizers, there may be mentioned for example sodium hydroxide, triethanolamine, aminomethyl propanol, potassium hydroxide.
Comme agents pro-pénétrants appropriés, on peut citer par exemple les alcools et glycols (éthanol, propylène glycol), l’éthoxydiglycol, les alcools et acides gras (acide oléique), les esters d’acides gras, le diméthyl isosorbide.As suitable pro-penetrating agents, there may be mentioned, for example, alcohols and glycols (ethanol, propylene glycol), ethoxydiglycol, alcohols and fatty acids (oleic acid), fatty acid esters, dimethyl isosorbide.
La composition de l’invention peut également contenir en outre d’autres actifs que l’extrait selon l’invention. Comme actifs appropriés, on peut citer par exemple les anti-radicalaires ou plus généralement les antioxydants, les blanchissants, les pigmentants, les émollients, les hydratants, les anti-séborrhéiques, les anti-inflammatoires, les anti-acnéiques, les agents kératolytiques et/ou desquamants, les agents anti-rides et tenseurs, les agents drainants, les agents anti-irritants, les agents apaisants, les vitamines et leurs mélanges, les agents matifiants, les actifs anti-âge tel que le rétinol, les cicatrisants, les antiseptiques et les huiles essentielles. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples de réalisation suivants.The composition of the invention may also contain other active ingredients than the extract according to the invention. As suitable active agents, there may be mentioned, for example, anti-radicals or more generally antioxidants, whiteners, pigments, emollients, moisturizers, anti-seborrheics, anti-inflammatories, anti-acne, keratolytic agents and / or desquamating agents, anti-wrinkle and tensing agents, draining agents, anti-irritant agents, soothing agents, vitamins and their mixtures, matting agents, anti-aging active agents such as retinol, healing agents, antiseptics and essential oils. The invention and the advantages which result therefrom will emerge clearly from the following exemplary embodiments.
FIGURESFIGURES
Figure 1 : Visualisation des noyaux des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.Figure 1: Visualization of the nuclei of normal human keratinocytes treated (or not) with an NaDES extract of Sechium edule (fruit) at 0.5% then irradiated with a dose of 50 J / cm2 of UVA.
Figure 2 : Test de clonogénicité de kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/crn2 d'UVA.Figure 2: Clonogenicity test of normal human keratinocytes treated (or not) with an NaDES extract of Sechium edule (fruit) at 0.5% then irradiated with a dose of 50 J / crn2 of UVA.
Figure 3 : Quantification des holoclones/méroclones (test de clonogénicité) dans une culture clonale de kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.Figure 3: Quantification of holoclones / meroclones (clonogenicity test) in a clonal culture of normal human keratinocytes treated (or not) with an NaDES extract of Sechium edule (fruit) at 0.5% then irradiated with a dose of 50 J / cm2 of UVA.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple n°l : Fabrication de l'extrait NaDES fruit de Sechium eduleExample No. 1: Making the NaDES extract from Sechium edule
On mélange 1 partie de fruits séchés et broyés de Sechium edule et 19 parties d'un mélange fructose/glycérine/eau en ratio molaire 1:1:5 (solvant NaDES). Le mélange est extrait à 70°C pendant 3h dans un réacteur agité. La séparation solide/liquide est réalisée par centrifugation (centrifugeuse à godets 4600 rpm - 20min). Le jus brut est ensuite filtré dans un filtre frontal sous pression (2 bars) sur membrane en acétate de cellulose jusqu’au seuil final de 0,22 pm.1 part of dried and crushed fruit of Sechium edule and 19 parts of a fructose / glycerin / water mixture are mixed in molar ratio 1: 1: 5 (NaDES solvent). The mixture is extracted at 70 ° C for 3 h in a stirred reactor. The solid / liquid separation is carried out by centrifugation (centrifuge with cups 4600 rpm - 20 min). The raw juice is then filtered in a pressure front filter (2 bars) on a cellulose acetate membrane until the final threshold of 0.22 pm.
On obtient ainsi un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) qui est limpide et de couleur jaune orangé.A NaDES extract of Sechium edule (fruit) is thus obtained which is clear and orange-yellow in color.
Exemple n°2 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur les activités enzymatiques de réparation à court terme de l'ADN dans des kératinocytes humains normauxExample 2: Effect of an NaDES extract of Sechium edule (fruit) according to the invention on the enzymatic activities of short-term DNA repair in normal human keratinocytes
Les activités enzymatiques de réparation de l'ADN ont été mesurées à l’aide de la biopuce plasmide LX-Repair. L'activité de réparation (ou excision resynthèse) se traduit par l'incorporation de nucléotides fluorescents (dCTP-Cya3) au niveau du site où se situe la lésion.Enzymatic DNA repair activities were measured using the LX-Repair plasmid biochip. The repair activity (or excision resynthesis) results in the incorporation of fluorescent nucleotides (dCTP-Cya3) at the site where the lesion is located.
La quantification de la réparation de l’ADN est mesurée pour 3 plasmides (CPD-64 plasmid, AbaS plasmid, glycol plasmid) déposés sur la biopuce et portant chacun une classe spécifique de dommages. Parmi les dommages, on retrouve des lésions CPD, des sites abasiques et des thymines glycols.The quantification of DNA repair is measured for 3 plasmids (CPD-64 plasmid, AbaS plasmid, glycol plasmid) deposited on the biochip and each carrying a specific class of damage. Damage includes CPD lesions, abasic sites and thymines glycols.
Protocole :Protocol:
Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite lavés avec un tampon phosphate salin et les lysats nucléaires sont préparés selon la méthode décrites par Millau et al. 2008.Normal human keratinocytes are treated for 24 hours with the NaDES extract of Sechium edule (fruit), obtained in Example 1, at the final concentration of 0.5%. Untreated keratinocytes are used as a control. The keratinocytes are then washed with a phosphate buffered saline and the nuclear lysates are prepared according to the method described by Millau et al. 2008.
Les lysats nucléaires (0,15 mg/ml) sont déposés en présence de nucléotides fluorescents sur la biopuce contenant les 3 plasmides. Le système est incubé pendant lh à 60°C.The nuclear lysates (0.15 mg / ml) are deposited in the presence of fluorescent nucleotides on the biochip containing the 3 plasmids. The system is incubated for 1 hour at 60 ° C.
La biopuce est scannée à 532 nm avec le scanner InnoScan710AL (Innopsy) et l'intensité de fluorescence est quantifiée avec le logiciel Mapix (Innopsys). Les données sont normalisées en utilisant le logiciel Normatizelt. L'expérience est réalisée 3 fois (n=3).The biochip is scanned at 532 nm with the InnoScan710AL scanner (Innopsy) and the fluorescence intensity is quantified with Mapix software (Innopsys). Data are normalized using Normatizelt software. The experiment is carried out 3 times (n = 3).
Les résultats sont exprimés en activité de réparation (tableau 1). Les valeurs représentent les rapports de fluorescence entre les kératinocytes traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) et les kératinocytes non traités (contrôle). Le contrôle est rapporté à 1. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.The results are expressed in repair activity (Table 1). The values represent the fluorescence ratios between the keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and the untreated keratinocytes (control). The control is reported at 1. The values are expressed as an average ± EC (standard deviation) of 3 experiments.
Tableau 1 : Activités enzymatiques de réparation des lésions ADN dans des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5%.Table 1: Enzymatic activities to repair DNA damage in normal human keratinocytes treated (or not) with an NaDES extract of Sechium edule (fruit) at 0.5%.
Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention augmente significativement les activités enzymatiques de réparation des lésions à L'ADN à court terme. Les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) présentent donc un phénotype de réparation augmenté pour les dommages CPD (+ 93%), sites abasiques (+31%) et thymines glycols (+66%). Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à court terme des effets génotoxiques des UVA.Conclusion: The NaDES extract of Sechium edule (fruit) obtained according to the invention significantly increases the enzymatic activities of repairing DNA damage in the short term. Normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) therefore exhibit an increased repair phenotype for CPD damage (+ 93%), abasic sites (+ 31%) and thymine glycols (+ 66%). Consequently, normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and then irradiated with UVA are protected in the short term from the genotoxic effects of UVA.
Exemple n°3 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur la protection à court terme de l'ADN contre les CPP induits par les UVA dans des kératinocytes humains normauxExample No. 3: Effect of an NaDES extract of Sechium edule (fruit) according to the invention on the short-term protection of DNA against UVA-induced PPC in normal human keratinocytes
La quantification du taux de lésions CPD dans un extrait d’ADN est obtenue par la technique de chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (MS-MS).The quantification of the rate of CPD lesions in a DNA extract is obtained by the high performance liquid chromatography (HPLC) technique coupled with tandem mass spectrometry (MS-MS).
Protocole :Protocol:
Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite irradiés (ou non) à la dose de 50 J/cm2 d'UVA avec le système UVA 700L (Waldmann). Les kératinocytes sont ensuite lavés avec un tampon phosphate salin. Des lysats d'ADN hydrolysé sont préparés selon la méthode décrite par Genies et al., 2013, puis injectés dans le système HPLC-MS/MS (Agitent sériés 1100). L'expérience est réalisée 3 fois (n=3).Normal human keratinocytes are treated for 24 hours with the NaDES extract of Sechium edule (fruit), obtained in Example 1, at the final concentration of 0.5%. Untreated keratinocytes are used as a control. The keratinocytes are then irradiated (or not) at a dose of 50 J / cm 2 of UVA with the UVA 700L system (Waldmann). The keratinocytes are then washed with a phosphate buffered saline. Hydrolyzed DNA lysates are prepared according to the method described by Genies et al., 2013, then injected into the HPLC-MS / MS system (Agitate series 1100). The experiment is carried out 3 times (n = 3).
Les résultats sont exprimés en nombre de CPD/106 bases (tableau 2). L'induction de CPD est exprimée en pourcentage (%) d'augmentation du nombre de lésions avant et après irradiation UVA. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.The results are expressed in number of CPD / 106 bases (Table 2). The induction of CPD is expressed as a percentage (%) of increase in the number of lesions before and after UVA irradiation. The values are expressed as an average ± EC (standard deviation) of 3 experiments.
Tableau 2 : Nombre de CPD/106 bases et taux d'induction des lésions dans des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.Table 2: Number of CPD / 106 bases and rate of induction of lesions in normal human keratinocytes treated (or not) with an NaDES extract of Sechium edule (fruit) at 0.5% then irradiated with a dose of 50 J / cm2 of UVA.
Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention diminue significativement le nombre de lésions CPD dans des kératinocytes humains normaux irradiés aux UVA. Les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA présentent donc un génotype moinsConclusion: The NaDES extract of Sechium edule (fruit) obtained according to the invention significantly reduces the number of CPD lesions in normal human keratinocytes irradiated with UVA. Normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and then irradiated with UVA therefore exhibit a less genotype.
endommagé. Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à court terme des effets génotoxiques des UVA.damaged. Consequently, normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and then irradiated with UVA are protected in the short term from the genotoxic effects of UVA.
Exemple n°4 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur la protection à court terme de l'ADN contre les lésions 8-oxoG induites par les UVA dans des kératinocytes humains normauxExample 4: Effect of an NaDES extract of Sechium edule (fruit) according to the invention on the short-term protection of DNA against UVA-induced 8-oxoG lesions in normal human keratinocytes
Pour révéler les dommages oxydatifs tels que la 8- oxoG le test de Comètes a été utilisé, en condition alcaline après traitement enzymatique avec la Fpg (formamidopyrimidine-ADN glycosylase). Cette technique micro-électrophorétique sensible permet de visualiser les fragments d'ADN endommagé qui migrent sous l'effet d'un champ électrique. Les fragments, encore appelés « queue de la comète » sont alors mesurés quantitativement par fluorescence couplée à de l'analyse d'image.To reveal oxidative damage such as 8-oxoG, the Comets test was used in alkaline condition after enzymatic treatment with Fpg (formamidopyrimidine-DNA glycosylase). This sensitive micro-electrophoretic technique makes it possible to visualize the fragments of damaged DNA which migrate under the effect of an electric field. The fragments, also called "comet tail" are then quantitatively measured by fluorescence coupled with image analysis.
Protocole :Protocol:
Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite irradiés (ou non) à la dose de 50 J/cm2 d'UVA avec le système UVA 700L (Waldmann). Les kératinocytes sont ensuite lavés avec un tampon phosphate salin.Normal human keratinocytes are treated for 24 hours with the NaDES extract of Sechium edule (fruit), obtained in Example 1, at the final concentration of 0.5%. Untreated keratinocytes are used as a control. The keratinocytes are then irradiated (or not) at a dose of 50 J / cm 2 of UVA with the UVA 700L system (Waldmann). The keratinocytes are then washed with a phosphate buffered saline.
Une suspension de kératinocytes (2.105 cellules/50pl) est injectée dans un gel d'agarose qui, ensuite, est coulé sur une lame en verre. Des étapes de lyse cellulaire et de dénaturation de l'ADN sont effectuées avant de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Enfin, un colorant fluorescent des acides nucléiques (Gel Red) est incorporé dans le gel.A suspension of keratinocytes (2 × 10 5 cells / 50 μl) is injected into an agarose gel which is then poured onto a glass slide. Cell lysis and DNA denaturation steps are carried out before migrating the DNA by electrophoresis. Finally, a fluorescent dye for nucleic acids (Gel Red) is incorporated into the gel.
La fluorescence est observée avec le microscope Axioskop 2 plus (Zeiss) puis quantifiée par analyse d'image avec le logiciel Komet six software.The fluorescence is observed with the Axioskop 2 plus microscope (Zeiss) and then quantified by image analysis with the Komet six software.
Les résultats sont présentés sur la figure 1. Les kératinocytes non traités et non irradiés ou « Contrôle-Non irradié » présentent un ADN intact qui est sous la forme d'une sphère avec des contours bien marqués. Les kératinocytes non traités et irradiés avec les UVA ou « Contrôle-UVA » ont un ADN fortement endommagé qui se visualise avec de nombreux fragments qui migrent à côté du noyau pour former une traînée assimilable à la queue d'une comète. Les kératinocytes traités avec l'extrait NaDES Sechium edule (fruit) et irradiés avec les UVA ont un ADN peu endommagé avec une ébauche de queue. L'ADN dégradé ou queue de la comète est quantifié par fluorescence. Les résultats sont exprimés en intensité moyenne de fluorescence de l'ADN dégradé (tableau 3). L'induction de 8-oxoG est exprimée en pourcentage (%) d'augmentation du nombre de lésions avant et après l'irradiation UVA. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.The results are presented in FIG. 1. The untreated and non-irradiated or "Control-Non-irradiated" keratinocytes present intact DNA which is in the form of a sphere with well-marked contours. Keratinocytes that are not treated and irradiated with UVA or "Control-UVA" have highly damaged DNA which is visualized with numerous fragments which migrate near the nucleus to form a trail similar to the tail of a comet. The keratinocytes treated with the NaDES Sechium edule extract (fruit) and irradiated with UVA have little damaged DNA with a tail blank. The degraded DNA or tail of the comet is quantified by fluorescence. The results are expressed as the average intensity of fluorescence of the degraded DNA (Table 3). The induction of 8-oxoG is expressed as a percentage (%) of increase in the number of lesions before and after UVA irradiation. The values are expressed as an average ± EC (standard deviation) of 3 experiments.
Tableau 3 : Quantification de l'ADN endommagé (queue de la comète) et taux d'induction de 8-oxoG dans des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.Table 3: Quantification of damaged DNA (comet tail) and induction rate of 8-oxoG in normal human keratinocytes treated (or not) with an NaDES extract of Sechium edule (fruit) at 0.5% then irradiated with a dose of 50 J / cm2 of UVA.
Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention protège l'ADN des noyaux des kératinocytes humains normaux et diminue significativement la dégradation de l'ADN et le nombre de lésions 8-oxoG après une irradiation UVA. Les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA présentent donc un génotype moins endommagé. Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à court terme des effets génotoxiques des UVA.Conclusion: The NaDES extract of Sechium edule (fruit) obtained according to the invention protects the DNA of the nuclei of normal human keratinocytes and significantly reduces DNA degradation and the number of 8-oxoG lesions after UVA irradiation. Normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and then irradiated with UVA therefore exhibit a less damaged genotype. Consequently, normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and then irradiated with UVA are protected in the short term from the genotoxic effects of UVA.
Exemple n°5 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur la protection à long terme de l'ADN contre les dommages induits par les UVAExample 5: Effect of an NaDES extract of Sechium edule (fruit) according to the invention on the long-term protection of DNA against damage induced by UVA rays
La survie cellulaire à long terme a été étudiée par le test de clonogénicité. Cette technique de culture cellulaire met en évidence la capacité des kératinocytes à former des clones (ou des colonies) en culture, et permet de distinguer les 3 types de clones : les holoctones (à fort potentiel prolifératif), les méroclones (à potentiel prolifératif intermédiaire) et les paraclones (à faible potentiel prolifératif). Ainsi, une population de kératinocytes, riche en cellules souches, produira un nombre très important de colonies à grande taille.Long-term cell survival was studied by the clonogenicity test. This cell culture technique highlights the capacity of keratinocytes to form clones (or colonies) in culture, and makes it possible to distinguish the 3 types of clones: holoctones (with high proliferative potential), meroclones (with intermediate proliferative potential). ) and paraclones (with low proliferative potential). Thus, a population of keratinocytes, rich in stem cells, will produce a very large number of large colonies.
Protocole :Protocol:
Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite irradiés (ou non) à la dose de 50 J/cm2 d'UVA avec le système UVA 700L (Waldmann). Après irradiation, les kératinocytes sont, à nouveau, traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à la concentration finale de 0,5%. Enfin, les kératinocytes sont lavés avec un tampon phosphate salin.Normal human keratinocytes are treated for 24 hours with the NaDES extract of Sechium edule (fruit), obtained in Example 1, at the final concentration of 0.5%. Untreated keratinocytes are used as a control. The keratinocytes are then irradiated (or not) at a dose of 50 J / cm 2 of UVA with the UVA 700L system (Waldmann). After irradiation, the keratinocytes are again treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) at a final concentration of 0.5%. Finally, the keratinocytes are washed with a phosphate buffered saline.
Une suspension de kératinocytes (60 cellules/cm2) est ensemencée à densité clonale sur une couche nourricière de fibroblastes humains normaux inactivés. La culture est maintenue pendant 14 jours avec un changement de milieux 3 fois par semaine.A suspension of keratinocytes (60 cells / cm2) is seeded at clonal density on a feeder layer of normal inactivated human fibroblasts. The culture is maintained for 14 days with a change of media 3 times a week.
Les clones cellulaires sont ensuite fixés et colorés avec de la rhodamine (Sigma). Les 3 types de clones (holoclones, méroclones et paraclones) sont comptés en utilisant le stéréomicroscope SZX9 (Olympus).The cell clones are then fixed and stained with rhodamine (Sigma). The 3 types of clones (holoclones, meroclones and paraclones) are counted using the SZX9 stereomicroscope (Olympus).
Les résultats sont présentés sur les figures 2 et 3. La culture clonale de kératinocytes non traités et non irradiés « Contrôle-Non irradié » présente des clones avec des caractéristiques d'holoclones (colonie de grande taille, à bord net, bien colorée) et de méroclones (colonie de taille moyenne) (figure 2). La culture clonale de kératinocytes non traités et irradiés avec les UVA ou « Contrôle-UVA » présente peu/pas d'holoclones mais majoritairement des clones de type méroclone. La culture clonale de kératinocytes traités avec l'extrait NaDES Sechium edule (fruit) et irradiés aux UVA présente des clones avec des caractéristiques d'holoclones et de méroclones.The results are presented in FIGS. 2 and 3. The clonal culture of untreated and non-irradiated "Control-Non-irradiated" keratinocytes presents clones with characteristics of holoclones (large colony, with sharp edge, well colored) and of meroclones (medium-sized colony) (Figure 2). The clonal culture of keratinocytes not treated and irradiated with UVA or "Control-UVA" has few / no holoclones but mainly clones of the meroclone type. The clonal culture of keratinocytes treated with the NaDES Sechium edule extract (fruit) and irradiated with UVA presents clones with characteristics of holoclones and meroclones.
Le nombre de colonies est quantifié par visualisation en stéréomicroscopie (figure 3). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.The number of colonies is quantified by visualization in stereomicroscopy (FIG. 3). The values are expressed as an average ± EC (standard deviation) of 3 experiments.
Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention protège le pouvoir clonogénique des kératinocytes humains normaux après une irradiation UVA. Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à long terme des effets génotoxiques des UVA.Conclusion: The NaDES extract of Sechium edule (fruit) obtained according to the invention protects the clonogenic power of normal human keratinocytes after UVA irradiation. Consequently, normal human keratinocytes treated with the NaDES extract of Sechium edule (fruit) and then irradiated with UVA are protected in the long term from the genotoxic effects of UVA.
Exemple n°6 :Example 6:
Crème de jourDay cream
Gel crème naturel hydratantHydrating natural cream gel
Spray nourrissantNourishing spray
Emulsion eau dans huileWater in oil emulsion
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| FR3133539A1 (en) | 2022-03-21 | 2023-09-22 | Gattefosse Sas | Plant extract obtained by a process using a supramolecular solvent, the extract comprising at least one exogenous polysaccharide |
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