FR2926091A1 - Device for isolating living cells e.g. fetal cells present in liquid including blood on filter, comprises filter support connected to filter, compartment having top and lower openings, unit for applying force on support, and piston - Google Patents
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Abstract
Description
10 La présente invention concerne un procédé et un dispositif pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur un filtre. Elle s'applique, en particulier à isoler et cultiver des cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang. Certaines cellules particulières du sang, par exemple les cellules 15 tumorale ou foetale, sont en très faible proportion et doivent être décomptées pour une analyse cytologique. Cependant, par rapport au principal des autres cellules présentes dans le sang, elles présentent une plus grande dimension. Il est connu d'appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillon sanguin pour fixer les cellules recherchées, puis 20 de faire passer le liquide résultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite utilisé pour y examiner les cellules recherchées sous microscope, en laboratoire. Cependant, cette procédure ne permet pas l'obtention de cellules vivantes. Or, l'inventeur a déterminé que l'obtention de cellules vivantes 25 permettrait d'envisager l'identification de marqueurs spécifiques et d'appliquer dans de bonnes conditions des techniques de biologie moléculaire, de cytogénétique et de FISH (acronyme de Fluorescence ln Situ Hybridization , pour hybridation fluorescente in situ) pour le diagnostic d'anomalies génétiques dans des cellules tumorales ou trophoblastiques. 30 La présente invention vise à remédier à ces inconvénients et à répondre à ce besoin en permettant de recueillir dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, des cellules vivantes 1 pouvant être subséquemment cultivées dans des milieux adaptés en présence de facteurs de croissance adéquates. A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un dispositif pour isoler des cellules vivantes sur un filtre, caractérisé en ce qu'il 5 comporte : - un support de filtre solidaire d'un filtre - un compartiment présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure adaptée à retenir ledit support et ledit filtre et - un moyen d'application d'une force sur le support depuis l'intérieur 10 du compartiment. Ce dispositif permet la récupération des cellules vivantes d'intérêt dans des conditions parfaitement compatibles avec leur mise en culture pour poursuivre des examens de génétique. Selon des caractéristiques particulières, le compartiment présente 15 une forme généralement cylindrique. Grâce à ces dispositions, on peut insérer un piston dans l'ouverture supérieure et fixer le filtre en amont de l'ouverture inférieure. Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus comporte un piston 20 adapté à coulisser dans le compartiment. Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus comporte, dans le compartiment, une pièce mobile adaptée à appuyer sur le support de filtre et à recevoir une force exercée par un piston inséré dans le compartiment. 25 Selon des caractéristiques particulières, le filtre comporte du polycarbonate. Grâce à ces dispositions, les pores du filtre se bouchent moins qu'avec d'autres types de filtre. Selon des caractéristiques particulières, le filtre présente des pores 30 dont la répartition de diamètre est centrée sur 6,5 microns. Selon des caractéristiques particulières, le filtre présente des pores dont la répartition de diamètre est centrée sur une valeur environ 1 micron inférieure au diamètre moyen des pores utilisés pour les mêmes cellules fixées par un tampon de fixation. Selon des caractéristiques particulières, le filtre présente des pores dont la densité est entre 50.000 et 200.000 pores cm-2. The present invention relates to a method and apparatus for isolating and culturing living cells on a filter. It applies, in particular to isolate and cultivate particular cells present in a liquid, including blood. Some particular blood cells, for example tumor or fetal cells, are in very small proportion and must be counted for cytological analysis. However, compared to the principal of the other cells present in the blood, they present a larger dimension. It is known to apply a formaldehyde-based fixation buffer to a blood sample to fix the desired cells, and then to pass the resulting liquid through a porous filter. This filter is then used to examine the cells sought under the microscope, in the laboratory. However, this procedure does not make it possible to obtain living cells. However, the inventor has determined that obtaining living cells 25 would make it possible to envisage the identification of specific markers and to apply in good conditions techniques of molecular biology, cytogenetics and FISH (acronym for Fluorescence In Situ). Hybridization, for in situ fluorescent hybridization) for the diagnosis of genetic abnormalities in tumor or trophoblastic cells. The present invention aims to remedy these drawbacks and to meet this need by making it possible to collect, under conditions compatible with routine laboratory tests, living cells which can be subsequently cultured in suitable media in the presence of growth factors. adequate. For this purpose, according to a first aspect, the present invention provides a device for isolating living cells on a filter, characterized in that it comprises: a filter support integral with a filter; a compartment having an upper opening; and a lower opening adapted to retain said support and said filter and a means for applying a force on the support from within the compartment. This device allows the recovery of living cells of interest under conditions perfectly compatible with their culture to continue genetic examinations. According to particular features, the compartment has a generally cylindrical shape. Thanks to these arrangements, one can insert a piston in the upper opening and fix the filter upstream of the lower opening. According to particular features, the device that is the subject of the present invention, as briefly described above, comprises a piston adapted to slide in the compartment. According to particular features, the device which is the subject of the present invention, as briefly described above, comprises, in the compartment, a moving part adapted to press on the filter support and to receive a force exerted by a piston inserted in the compartment. . According to particular features, the filter comprises polycarbonate. Thanks to these provisions, the pores of the filter clog less than with other types of filter. According to particular characteristics, the filter has pores 30 whose diameter distribution is centered on 6.5 microns. According to particular features, the filter has pores whose diameter distribution is centered on a value about 1 micron less than the average diameter of the pores used for the same cells fixed by a fixing buffer. According to particular characteristics, the filter has pores whose density is between 50,000 and 200,000 pores cm-2.
Selon des caractéristiques particulières, le support de filtre présente des encoches. Grâce à ces dispositions, la saisie du support est facilitée. Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus comporte, sur son ouverture inférieure, un embout retenant le filtre et le support de filtre, ledit embout étant fixé de façon étanche et amovible au compartiment. Grâce à ces dispositions, on retient le filtre pendant la filtration puis on le libère, pour sa récupération, en retirant l'embout et en appliquant une force sur le support de filtre depuis l'intérieur du compartiment. According to particular features, the filter support has notches. Thanks to these provisions, the capture of the support is facilitated. According to particular features, the device which is the subject of the present invention, as briefly described above, comprises, on its lower opening, a nozzle holding the filter and the filter support, said end piece being fixed in a sealed and removable manner to the compartment. With these provisions, the filter is retained during filtration and then released for its recovery, removing the nozzle and applying a force on the filter support from inside the compartment.
Selon des caractéristiques particulières, ledit embout présente une ouverture inférieure qui s'adapte à une chambre de dépression. Grâce à ces dispositions, on peut filtrer, par aspiration dans la chambre de dépression, les cellules plus petites que les cellules d'intérêt et les éventuelles cellules lysées et le principal du liquide présent dans le compartiment. Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un procédé pour recueillir des cellules présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte : - une étape de solidarisation d'un support de filtre à un compartiment présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure adaptée à retenir à l'intérieur du dit compartiment ledit support et ledit filtre, - une étape de filtration d'un liquide comportant des cellules vivantes, à travers ledit filtre et - une étape d'application d'une force sur le support depuis l'intérieur du compartiment pour récupérer le filtre en dehors du compartiment. According to particular features, said nozzle has a lower opening that fits a vacuum chamber. Thanks to these arrangements, it is possible to filter, by suction in the depression chamber, the cells smaller than the cells of interest and the possible lysed cells and the principal of the liquid present in the compartment. According to a second aspect, the present invention provides a method for collecting cells present in a liquid, characterized in that it comprises: - a step of securing a filter support to a compartment having an upper opening and a lower opening adapted to retain inside said compartment said support and said filter, - a step of filtering a liquid comprising living cells, through said filter and - a step of applying a force on the support since the inside the compartment to collect the filter outside the compartment.
Les avantages, buts et caractéristiques de ce procédé étant similaires à ceux du dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, ils ne sont pas rappelés ici. D'autres avantages, buts et caractéristiques de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre, faite, dans un but explicatif et nullement limitatif en regard des dessins annexés, dans lesquels : - les figures 1A à 1 F représentent, schématiquement, en coupe, des pièces d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, mises en oeuvre dans une première phase d'un mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention, - les figures 2A à 2H représentent, schématiquement, en coupe, des pièces d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, mises en oeuvre dans une deuxième phase d'un mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention, - les figures 3A à 3C représentent, schématiquement, en coupe, des pièces d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, mises en oeuvre dans une troisième phase d'un mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention et - les figures 4A et 4B représentent, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en oeuvre dans un mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention. Comme on l'observe en regard des figures 1A à 1 F, dans le mode de réalisation illustrés dans les figures, le dispositif pour recueillir des cellules sur un filtre comporte un compartiment en forme de seringue 105 présentant une ouverture supérieure 106 et une ouverture inférieure 107. Une bague 104 est insérée dans l'ouverture inférieure 107 du compartiment 105 et serrée ou collée dans ce compartiment 105. Un support de filtre, ou cupule 108, en forme de rondelle ou bague est placée dans la bague 104 et retient le filtre 115. Le filtre 115 est micro perforé et soudé sous la cupule 108 puis inséré avec elle dans l'extrémité inférieure 107 du compartiment en forme de seringue 105. Préférentiellement, le filtre 115 est réalisé en polycarbonate avec un traitement de surface hydrophile. L'utilisation d'un tel filtre améliore le taux de retenu des cellules particulières et réduit l'adhérence des autres cellules ou de leur contenu, lorsqu'elles ont été spécifiquement lysées. Le filtre 115 présente, préférentiellement, un diamètre de pores centré sur une valeur inférieure, par exemple de 1 pm, à la valeur correspondante mise en oeuvre pour les mêmes cellules fixées, c'est-à-dire rendues rigides. Par exemple, si, pour les cellules fixées, le diamètre des pores aurait été centré sur 7,5 pm, il est ici centré sur une valeur inférieure, par exemple de 6,5 pm. Du fait de la dispersion des diamètres, pratiquement aucun pore ne possède alors un diamètre supérieur à 7 pm. Pour une application de l'invention à des cellules sanguines, le filtre présente des pores dont la densité est 50.000 et 200.000 pores/cm- 2 et, préférentiellement d'environ 105 pores/cm-2. Since the advantages, aims and characteristics of this method are similar to those of the device which is the subject of the present invention, as briefly described above, they are not mentioned here. Other advantages, aims and features of the present invention will emerge from the description which follows, made for an explanatory and non-limiting purpose with reference to the accompanying drawings, in which: FIGS. 1A to 1F show, schematically, in section, parts of a particular embodiment of the device object of the present invention, implemented in a first phase of a particular embodiment of the method object of the present invention, - Figures 2A to 2H show, schematically , in section, parts of a particular embodiment of the device that is the subject of the present invention, implemented in a second phase of a particular embodiment of the method that is the subject of the present invention; FIGS. 3A to 3C represent , schematically, in section, parts of a particular embodiment of the device object of the present invention, implemented in a third phase of a particular embodiment of the method which is the subject of the present invention and - FIGS. 4A and 4B represent, in the form of a logic diagram, steps implemented in a particular embodiment of the method which is the subject of the present invention. As seen from FIGS. 1A-1F, in the embodiment illustrated in the figures, the device for collecting cells on a filter comprises a syringe-shaped compartment 105 having an upper opening 106 and a lower opening 107. A ring 104 is inserted into the lower opening 107 of the compartment 105 and clamped or glued in this compartment 105. A filter support, or cup 108, in the form of a washer or ring is placed in the ring 104 and holds the filter 115. The filter 115 is micro perforated and welded under the cup 108 and then inserted with it into the lower end 107 of the syringe-shaped compartment 105. Preferably, the filter 115 is made of polycarbonate with a hydrophilic surface treatment. The use of such a filter improves the retention rate of the particular cells and reduces the adhesion of other cells or their contents, when they have been specifically lysed. The filter 115 preferably has a pore diameter centered on a lower value, for example 1 μm, at the corresponding value used for the same fixed cells, that is to say made rigid. For example, if, for the fixed cells, the pore diameter would have been centered on 7.5 μm, it is here centered on a lower value, for example 6.5 μm. Due to the dispersion of the diameters, virtually no pore then has a diameter greater than 7 μm. For an application of the invention to blood cells, the filter has pores whose density is 50,000 and 200,000 pores / cm -2 and preferably about 105 pores / cm -2.
A l'intérieur de la partie inférieure du compartiment 105 est positionnée une pièce 118 de forme intérieure conique orientée vers le bas. La pièce 118 est : - sur sa moitié supérieure, d'une forme cylindrique présentant un diamètre sensiblement égal au diamètre intérieur du compartiment 105 et - sur sa moitié inférieure, d'une forme cylindrique présentant un diamètre sensiblement égal à celui du support 108 du filtre 115. Cette pièce 118 est en appui sur la surface supérieure du support 108 du filtre 115. La moitié inférieure de la pièce 118 possède une longueur supérieure ou égale à celle de la bague 104. La liaison entre le compartiment 105 et la pièce 118 présente ainsi un jeu 109 le long de l'axe du compartiment 105 au moins égal à la distance séparant le haut du support 108 de l'ouverture inférieure de la bague 104. De cette manière, comme exposé plus bas, lorsque la pièce 118 est mise en mouvement axial par un piston inséré dans le compartiment 105, elle pousse le support 108 jusqu'à ce qu'il soit libéré de la bague 104 et, par conséquent, du compartiment 105. A l'ouverture inférieure 107 du compartiment 105 est placé, de façon étanche, stérile et amovible, un embout, ou adaptateur, 119 qui enserre la paroi extérieure du compartiment 105 et présente une ouverture inférieure effilée de plus petit diamètre que celui du compartiment 105. Comme illustré en figure 1 D, cette ouverture inférieure effilée de l'adaptateur 119 présente une longueur suffisante pour éviter de potentielles contaminations de l'extrémité du compartiment 105 par des éclaboussures provenant d'un réservoir 112 dans lequel est réalisée la dépression. Grâce à l'usage d'un filtre 115 en polycarbonate, la dépression en question est beaucoup plus limitée que dans les systèmes de l'art antérieur, jusqu'à être quatre fois moindre, ce qui évite de détériorer les cellules que l'on vise à recueillir sur le filtre 115. Préférentiellement, une aspiration par dépression inférieure ou égale à 25 mBar est réalisée en dessous du filtre. Dans la première phase du procédé pour recueillir du matériel cellulaire, le compartiment 105, muni de l'adaptateur 119, est supporté par une platine 110 insérée dans un porte-tiroir (non représenté) comportant un compartiment relié à un réservoir 112 sous la surface inférieure de la platine 110 par laquelle une aspiration peut être effectuée. Un joint torique (non représenté) assure l'étanchéité de la liaison entre l'adaptateur ou embout 119 et la platine 110. Un joint torique (non représenté) assure l'étanchéité de la liaison entre la platine 110 et le porte tiroir. L'étanchéité offerte par ces joints toriques permet l'aspiration, dans le réservoir 112, d'une partie du contenu des compartiments 105. Lors de l'aspiration par le réservoir 112, certaines cellules particulières du liquide présent dans le compartiment 105, de plus fort diamètre, sont retenues par le filtre 115 alors que le principal du liquide, du contenu et de la paroi des cellules lysées et les cellules de plus petites dimensions que les cellules à recueillir sont aspirés en dehors du compartiment 105, à travers le filtre 115. A la fin de la première phase du procédé pour recueillir des cellules, on retire l'embout 119 de l'ouverture inférieure du compartiment 105, comme illustré en figure 1 F. On observe que ce qui a été exposé ci-dessus pour un seul compartiment 105 est, préférentiellement, effectuée simultanément pour un grand nombre de compartiments retenus ensemble par un support commun (non représenté). Lors de la deuxième phase du procédé, on insère la partie inférieure du compartiment 105 dans un adaptateur mécanique 130, puis la partie inférieure de l'adaptateur 130 dans un puits de plaque et/ou un flacon de culture 131 standard. La seule fonction de l'adaptateur 130 est d'adapter les diamètres différents de la partie inférieure du compartiment 105 et du puits de plaque et/ou du flacon de culture 131. En variante, on met en oeuvre un puits de plaque et/ou un flacon de culture dont le diamètre intérieur est supérieur ou égal au diamètre extérieur de la partie inférieure du compartiment 105 et on ne met pas en oeuvre d'adaptateur 130. Puis, comme illustré en figures 2C à 2E, on insère un piston 132 dans l'ouverture supérieure 106 du compartiment 105 et on appuie sur la partie haute du piston 132 jusqu'à ce qu'il vienne en appui sur la pièce conique 118. Inside the lower part of the compartment 105 is positioned a part 118 of conical inner shape oriented downwards. The piece 118 is: - on its upper half, a cylindrical shape having a diameter substantially equal to the inner diameter of the compartment 105 and - on its lower half, a cylindrical shape having a diameter substantially equal to that of the support 108 of the 115. This piece 118 bears on the upper surface of the support 108 of the filter 115. The lower half of the piece 118 has a length greater than or equal to that of the ring 104. The connection between the compartment 105 and the piece 118 thus has a clearance 109 along the axis of the compartment 105 at least equal to the distance separating the top of the support 108 from the lower opening of the ring 104. In this way, as explained below, when the piece 118 is moved axially by a piston inserted in the compartment 105, it pushes the support 108 until it is released from the ring 104 and, therefore, the compartment 105. At the opening inf The upper portion 107 of the compartment 105 is sealed, sterile and removable, a tip, or adapter, 119 which encloses the outer wall of the compartment 105 and has a tapered lower opening smaller in diameter than the compartment 105. As illustrated in FIG. 1D, this tapered lower opening of the adapter 119 has a sufficient length to avoid potential contamination of the end of the compartment 105 by splashing from a tank 112 in which the depression is made. Thanks to the use of a polycarbonate filter 115, the depression in question is much more limited than in the systems of the prior art, up to four times less, which avoids damaging the cells that one is intended to collect on the filter 115. Preferably, a vacuum suction less than or equal to 25 mBar is performed below the filter. In the first phase of the process for collecting cellular material, the compartment 105, provided with the adapter 119, is supported by a plate 110 inserted in a drawer holder (not shown) having a compartment connected to a tank 112 under the surface. bottom of the plate 110 through which an aspiration can be performed. An O-ring (not shown) seals the connection between the adapter or nozzle 119 and the plate 110. An O-ring (not shown) seals the connection between the plate 110 and the drawer door. The tightness afforded by these O-rings allows the suction, in the reservoir 112, of a portion of the contents of the compartments 105. During the aspiration by the reservoir 112, certain particular cells of the liquid present in the compartment 105, larger diameter, are retained by the filter 115 while the main liquid, the content and the wall of the lysed cells and the cells of smaller dimensions than the cells to be collected are sucked out of the compartment 105, through the filter 115. At the end of the first phase of the method for collecting cells, the tip 119 is removed from the lower opening of the compartment 105, as illustrated in FIG. 1 F. It is observed that what has been explained above for a single compartment 105 is, preferably, carried out simultaneously for a large number of compartments held together by a common support (not shown). In the second phase of the method, the lower part of the compartment 105 is inserted into a mechanical adapter 130, then the lower part of the adapter 130 into a plate well and / or a standard culture flask 131. The sole function of the adapter 130 is to adapt the different diameters of the lower part of the compartment 105 and the plate well and / or the culture flask 131. In a variant, a plate well and / or a culture flask whose inner diameter is greater than or equal to the outside diameter of the lower part of the compartment 105 and no adapter 130 is used. Then, as illustrated in FIGS. 2C to 2E, a piston 132 is inserted in the upper opening 106 of the compartment 105 and is pressed on the upper part of the piston 132 until it bears on the conical part 118.
Le piston 132 laisse passer l'air entre sa paroi externe et la paroi interne du compartiment 105. Son déplacement n'augmente donc pas la pression à l'intérieur du compartiment 105. On évite ainsi le risque d'endommager les cellules vivantes portées par le filtre 115. On observe que, grâce à la forme conique de la pièce 118, le piston 132 n'appui pas sur le filtre 115 et ne risque donc pas d'endommager les cellules retenues sur ce filtre 115. De même, la pièce 118 n'appuie que sur le support 108 du filtre 115 et ne risque pas, non plus, d'endommager ces cellules. Ensuite, comme illustré en figures 2F et 2G, on poursuit l'appui sur la partie haute du piston 132 afin qu'il déplace la pièce 108 vers le bas, en mettant en oeuvre le jeu 109, et que la pièce 118 fasse sortir le support 108 de la bague 104 et du compartiment 105. Ce support 108 et le filtre 115 tombent alors dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131. Préférentiellement la course du piston 132 dans le compartiment 105, qui est limitée par un épaulement supérieur du piston 132, est telle qu'en fin de course, lorsque cet épaulement est en appui sur l'ouverture supérieure 106 du compartiment 105, le jeu 109 a entièrement été utilisé par le déplacement de la pièce 118. On évite ainsi un risque d'arrachement de la bague 104 qui risquerait de tomber sur le filtre 115, dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131. Enfin, on retire le compartiment 105 et l'adaptateur 130 du puits de plaque et/ou du flacon de culture 131, comme illustré en figure 2H. The piston 132 lets air pass between its outer wall and the inner wall of the compartment 105. Its displacement does not increase the pressure inside the compartment 105. This avoids the risk of damaging the living cells carried by the filter 115. It is observed that, thanks to the conical shape of the piece 118, the piston 132 does not press on the filter 115 and therefore does not risk damaging the cells retained on the filter 115. Similarly, the piece 118 only presses on the support 108 of the filter 115 and does not risk, either, to damage these cells. Then, as illustrated in FIGS. 2F and 2G, the support on the upper part of the piston 132 is continued so that it moves the workpiece 108 downwards, using the set 109, and that the workpiece 118 causes the workpiece to move out. support 108 of the ring 104 and the compartment 105. This support 108 and the filter 115 then fall into the plate well and / or the culture bottle 131. Preferably the stroke of the piston 132 in the compartment 105, which is limited by a upper shoulder of the piston 132, is such that at the end of the stroke, when this shoulder bears on the upper opening 106 of the compartment 105, the play 109 has been entirely used by the displacement of the piece 118. This avoids a risk of tearing of the ring 104 which might fall on the filter 115, in the plate well and / or the culture bottle 131. Finally, the compartment 105 and the adapter 130 are removed from the plate well and / or of the culture flask 131, as illustrated in Figure 2H.
La culture est réalisée, de manière connue, dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131. On observe que la présence du support 108 autour de la face supérieure du filtre 115, face qui porte les cellules en culture, permet d'éviter que ces cellules ne quittent le filtre 115. Lors de l'étape de mise en culture des cellules vivantes d'intérêt sur le filtre, le filtre est, par exemple, recouvert d'une mince couche de Matrigel (ou mis en contact avec une couche de Matrigel, marque déposée, préalablement mis au fond du puits de plaque et/ou du flacon de culture et sur laquelle il repose) contenant des facteurs adaptés à la croissance des cellules d'intérêt. Comme illustré en figures 3A à 3C, lorsque l'on souhaite observer les cellules, ou leur matériel génétique, on attrape le support 108, dont la saisie avec une brucelle est facilitée par la présence de trous cylindriques latéraux, ou encoches, 133 dans la face supérieure du support 108. Puis, on peut poser le support 108 et le filtre 115 sur une lame de verre 134 et on applique, sur le filtre 115, une lame de verre 135, en forme de disque de diamètre adapté à la surface supérieure libre du filtre 115. L'analyse des cellules ou de leur matériel génétique est, ensuite, effectuée de manière connue en soi. On observe que, dans une variante, l'ouverture inférieure effilée de l'adaptateur 119 reçoit, pendant une phase de mise en dépression de cette ouverture, un embout (en anglais tip ) afin d'éviter de potentielles contaminations de l'extrémité du compartiment 105 par des éclaboussures provenant d'un réservoir 112 dans lequel est réalisée la dépression. Dans une autre variante, la pièce 118 et le support 108 ne forment qu'une seule pièce qui est destinée à être déposée dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture. Dans ce cas, la course du piston est allongée de manière à pousser cette pièce unique jusqu'à ce qu'elle soit entièrement en dehors de l'ouverture inférieure 107 du compartiment 105. The culture is carried out, in a known manner, in the plate well and / or the culture flask 131. It is observed that the presence of the support 108 around the upper face of the filter 115, the face which carries the cells in culture, makes it possible to to prevent these cells from leaving the filter 115. During the step of culturing the living cells of interest on the filter, the filter is, for example, covered with a thin layer of Matrigel (or placed in contact with each other). with a layer of Matrigel, registered trademark, previously placed at the bottom of the plate well and / or the culture flask and on which it rests) containing factors adapted to the growth of the cells of interest. As illustrated in FIGS. 3A to 3C, when it is desired to observe the cells, or their genetic material, the support 108 is grabbed, the capture of which with a tweezer is facilitated by the presence of lateral cylindrical holes, or notches, 133 in the upper face of the support 108. Then, the support 108 and the filter 115 can be placed on a glass slide 134 and a glass disk 135, disk-shaped with a diameter adapted to the upper surface, is applied to the filter 115. The analysis of the cells or of their genetic material is then carried out in a manner known per se. It is observed that, in a variant, the tapered lower opening of the adapter 119 receives, during a phase of depression of this opening, a tip (English tip) to avoid potential contamination of the end of the compartment 105 by splashing from a tank 112 in which the depression is made. In another variant, the piece 118 and the support 108 form only one piece which is intended to be deposited in the plate well and / or the culture flask. In this case, the piston stroke is elongated so as to push this single piece until it is entirely outside the lower opening 107 of the compartment 105.
Dans des modes de réalisation, la présentation du dispositif objet de la présente invention prend la forme d'un kit comportant, dans un sachet externe, deux sachets internes : - le premier comporte le compartiment 105 dans lequel se trouvent déjà montés, la bague 104, la pièce 118, le support 108, le filtre 115 et l'embout 119 et - le second comporte le piston 132 et, éventuellement, le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131, l'adaptateur 130 et une lame circulaire. Comme on l'observe en regard des figures 4A et 4B, dans un mode de réalisation particulier, le procédé pour recueillir des cellules sur un filtre comporte, d'abord, une étape 405 d'insertion, dans un compartiment en forme de seringue, d'une bague inférieure 104, d'une pièce 118 de forme intérieure conique orientée vers le bas et, dans la bague inférieure 104, d'un support de filtre 108 portant un filtre 115. Préférentiellement, on prévoit, en bas du compartiment 105, une butée latérale qui retient la bague 104 et on introduit, par le haut du compartiment 105, la bague 104 dans laquelle est déjà insérée le support 108, puis la pièce mobile 108. Cette pièce 118 est : - sur sa moitié supérieure, d'une forme cylindrique présentant un diamètre sensiblement égal au diamètre intérieur du compartiment 105 et -sur sa moitié inférieure, d'une forme cylindrique présentant un diamètre sensiblement égal à celui du support 108 du filtre 115. Cette pièce 118 est en appui sur la surface supérieure du support 108 du filtre 115. La moitié inférieure de la pièce 118 possède une longueur supérieure ou égale à celle de la bague 104. La liaison entre le compartiment 105 et la pièce 118 présente ainsi un jeu 109 le long de l'axe du compartiment 105 au moins égal à la distance séparant le haut du support 108 de l'ouverture inférieure de la bague 104. De cette manière, comme exposé plus bas, lorsque la pièce 118 est mise en mouvement axial par un piston inséré dans le compartiment 105, elle pousse le support 108 jusqu'à ce qu'il soit libéré de la bague 104 et, par conséquent, du compartiment 105. In embodiments, the presentation of the device which is the subject of the present invention takes the form of a kit comprising, in an outer bag, two inner bags: the first comprises the compartment 105 in which the ring 104 is already mounted; , the piece 118, the support 108, the filter 115 and the nozzle 119 and the second comprises the piston 132 and, optionally, the plate well and / or the culture bottle 131, the adapter 130 and a circular blade . As seen with reference to FIGS. 4A and 4B, in a particular embodiment, the method for collecting cells on a filter comprises, firstly, an insertion step 405, in a syringe-shaped compartment, a lower ring 104, a part 118 of conical inner shape oriented downwards, and in the lower ring 104, a filter support 108 carrying a filter 115. Preferably, it is provided at the bottom of the compartment 105 , a lateral abutment which retains the ring 104 and is introduced, through the top of the compartment 105, the ring 104 in which is already inserted the support 108, then the moving part 108. This piece 118 is: - on its upper half, d a cylindrical shape having a diameter substantially equal to the inner diameter of the compartment 105 and on its lower half, of a cylindrical shape having a diameter substantially equal to that of the support 108 of the filter 115. ppui on the upper surface of the support 108 of the filter 115. The lower half of the part 118 has a length greater than or equal to that of the ring 104. The connection between the compartment 105 and the part 118 thus has a clearance 109 along the axis of the compartment 105 at least equal to the distance separating the top of the support 108 from the lower opening of the ring 104. In this way, as explained below, when the part 118 is moved axially by an inserted piston in the compartment 105, it pushes the support 108 until it is released from the ring 104 and, consequently, the compartment 105.
Puis, au cours d'une étape 410, on solidarise un embout amovible 119, ou adaptateur, à l'extrémité distale du compartiment 105. L'embout 119, placé de façon étanche, stérile et amovible, enserre la paroi extérieure du compartiment 105 et présente une ouverture inférieure effilée de plus petit diamètre que celui du compartiment 105. Cette ouverture inférieure effilée de l'adaptateur 119 présente une longueur suffisante pour éviter de potentielles contaminations de l'extrémité du compartiment 105 par des éclaboussures provenant d'un réservoir 112 dans lequel est réalisée la dépression. Au cours d'une étape 415, on positionne l'extrémité inférieure de l'embout 119 dans une chambre de dépression. Puis, au cours d'une étape 420, on insère, dans le compartiment en forme de seringue, du liquide comportant les cellules recherchées. Ce liquide est, par exemple, du sang. Les cellules recherchées sont, par exemple, des cellules foetales ou tumorales. Then, during a step 410, a removable tip 119, or adapter, is secured to the distal end of the compartment 105. The tip 119, placed in leaktight, sterile and removable manner, encloses the outer wall of the compartment 105 and has a tapered lower opening smaller in diameter than that of the compartment 105. This tapered lower opening of the adapter 119 is of sufficient length to avoid potential contamination of the end of the compartment 105 by splashing from a reservoir 112. in which depression is achieved. During a step 415, the lower end of the nozzle 119 is positioned in a vacuum chamber. Then, during a step 420, the liquid containing the desired cells is inserted into the syringe-shaped compartment. This liquid is, for example, blood. The desired cells are, for example, fetal or tumor cells.
Au cours d'une étape 425, on insère un liquide tampon de filtration sans fixateur et un agent lytique dans le compartiment 105. Ce liquide tampon est, par exemple, un milieu de culture des cellules recherchées. Par exemple, ce tampon comporte, pour 200 ml de RPMI 1640 (marque déposée), 220 mg de saponine et 100 mg de BSA (acronyme de Bovine Sang Albumine ). During a step 425, a non-fixative filtering buffer liquid and a lytic agent are inserted into compartment 105. This buffer liquid is, for example, a culture medium for the desired cells. For example, this buffer comprises, for 200 ml of RPMI 1640 (registered trademark), 220 mg of saponin and 100 mg of BSA (acronym for Bovine Blood Albumin).
Au cours d'une étape 430, on effectue une lyse de cellules non recherchées, par exemple des globules rouges, dans le cas du sang. Au cours d'une étape 435, on met en dépression la chambre de dépression. Grâce à l'usage d'un filtre 115 en polycarbonate, la dépression en question est beaucoup plus limitée que dans les systèmes de l'art antérieur, jusqu'à être quatre fois moindre, ce qui évite de détériorer les cellules que l'on vise à recueillir sur le filtre 115. Préférentiellement, une aspiration par dépression inférieure ou égale à 25 mBar est réalisée en dessous du filtre, pour une application au sang avec des pores de filtre ayant un diamètre centré sur 6,5 pm et une densité de pores de l'ordre de 105 pores/cm2. During a step 430, lysis of undesired cells, for example red blood cells, is performed in the case of blood. During a step 435, the vacuum chamber is depressed. Thanks to the use of a polycarbonate filter 115, the depression in question is much more limited than in the systems of the prior art, up to four times less, which avoids damaging the cells that one is intended to collect on the filter 115. Preferably, a suction vacuum of less than or equal to 25 mBar is made below the filter, for application to blood with filter pores having a diameter centered on 6.5 microns and a density of pores of the order of 105 pores / cm2.
Lors de l'aspiration par le réservoir 112, certaines cellules particulières du liquide présent dans le compartiment 105, de plus fort diamètre, sont retenues par le filtre 115 alors que le principal du liquide, du contenu et de la paroi des cellules lysées et les cellules de plus petites dimensions que les cellules à recueillir sont aspirés en dehors du compartiment 105, à travers le filtre 115. Au cours d'une étape 440, on retire l'embout 119 de l'ouverture inférieure du compartiment 105. Puis, au cours d'une étape 445, on insère la partie inférieure du compartiment 105 dans un adaptateur mécanique 130, puis la partie inférieure de l'adaptateur 130 dans un puits de plaque et/ou un flacon de culture cellulaire 131 standard. During aspiration by the reservoir 112, certain particular cells of the liquid present in the compartment 105, of greater diameter, are retained by the filter 115 while the main liquid, the content and the wall of the lysed cells and the cells of smaller dimensions than the cells to be collected are sucked out of the compartment 105, through the filter 115. During a step 440, the nozzle 119 is removed from the lower opening of the compartment 105. During a step 445, the lower portion of the compartment 105 is inserted into a mechanical adapter 130, then the lower portion of the adapter 130 into a plate well and / or a standard cell culture flask 131.
Au cours d'une étape 450, on insère un piston 132 dans l'ouverture supérieure 106 du compartiment 105 et on appuie sur la partie haute du piston 132 jusqu'à ce qu'il vienne en appui sur la pièce conique 118. On observe que ni le piston 132 ni la pièce 108 n'appuient sur le filtre 115 et ne risquent donc pas d'endommager les cellules retenues sur ce filtre 115. On poursuit l'appui sur la partie haute du piston 132 afin qu'il déplace la pièce 108 vers le bas, en mettant en oeuvre le jeu 109, et la pièce 118 fait sortir le support 108 de la bague 104 et du compartiment 105. Ce support 108 et le filtre 115 tombent alors dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131 au cours d'une étape 455. Préférentiellement la course du piston 132 dans le compartiment 105, qui est limitée par un épaulement supérieur du piston 132, est telle qu'en fin de course, lorsque cet épaulement est en appui sur l'ouverture supérieure 106 du compartiment 105, le jeu 109 a entièrement été utilisé par le déplacement de la pièce 118. On évite ainsi un risque d'arrachement de la bague 104 qui risquerait de tomber sur le filtre 115, dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131. Au cours d'une étape 460, on retire le compartiment 105 et l'adaptateur 130 du puits de plaque et/ou du flacon de culture 131. Au cours d'une étape 465, la culture est réalisée, de manière connue, dans le puits de plaque et/ou le flacon de culture 131. On observe que la présence du support 108 autour de la face supérieure du filtre 115, face qui porte les cellules en culture, permet d'éviter que ces cellules ne quittent le filtre 115. Lors de l'étape de mise en culture des cellules vivantes d'intérêt sur le filtre, le filtre est, par exemple, recouvert d'une mince couche de Matrigel (ou mis en contact avec une couche de Matrigel préalablement mis au fond du puits de plaque et/ou du flacon de culture et sur laquelle il repose) contenant des facteurs adaptés à la croissance des cellules d'intérêt. During a step 450, a piston 132 is inserted into the upper opening 106 of the compartment 105 and the upper part of the piston 132 is pressed until it bears on the conical part 118. It is observed that that neither the piston 132 nor the part 108 bears on the filter 115 and therefore does not risk damaging the cells retained on the filter 115. The support is continued on the upper part of the piston 132 so that it moves the piece 108 downwards, using the set 109, and the piece 118 pulls the support 108 out of the ring 104 and the compartment 105. This support 108 and the filter 115 then fall into the plate well and / or the culture vial 131 during a step 455. Preferably the stroke of the piston 132 in the compartment 105, which is limited by an upper shoulder of the piston 132, is such that at the end of the stroke, when this shoulder bears on the upper opening 106 of the compartment 105, the game 109 has been entirely used by the movement of the piece 118. This avoids a risk of tearing of the ring 104 which may fall on the filter 115, in the plate well and / or the culture bottle 131. During a step 460, the compartment 105 and the adapter 130 are removed from the plate well and / or the culture bottle 131. In a step 465, the culture is carried out, in known manner, in the plate well and / or the culture flask 131. It is observed that the presence of the support 108 around the upper face of the filter 115, the face which carries the cells in culture, makes it possible to prevent these cells from leaving the filter 115. During the step of culturing living cells of interest on the filter, the filter is, for example, covered with a thin layer of Matrigel (or brought into contact with a layer of Matrigel previously placed at the bottom of the plate well and / or the vial of culture and on which it rests) containing factors adapted to growth cells of interest.
Au cours d'une étape 470, on attrape le support 108, avec une brucelle, par le biais des encoches 133. Au cours d'une étape 475, on poser le support 108 et le filtre 115 sur une lame de verre 134. Au cours d'une étape 480, on applique, sur le filtre 115, une lame de verre 135 (ou un gel de protection) /un milieu de montage aqueux de protection en forme de disque de diamètre adapté à la surface supérieure libre du filtre 115. L'analyse des cellules ou de leur matériel génétique est, ensuite, effectuée de manière connue en soi, au cours d'une étape 485. La mise en oeuvre de la présente invention permet d'éviter des prélèvements risqués de cellules, par exemple de cellules du liquide amniotiques tout en permettant des cultures, par exemple pour une amniocentèse. De plus, du fait de la forme en réservoir du support 108 du filtre 115, on peut réaliser directement dans ce support des réactions d'immunocytochimie ou d'hybridation fluorescente in situ ( FISH ).20 During a step 470, the support 108 is grabbed with a tweezer through the notches 133. During a step 475, the support 108 and the filter 115 are placed on a glass slide 134. At During a step 480, a glass slide 135 (or a protective gel) / a disk-shaped disk-shaped protective mounting medium adapted to the free top surface of the filter 115 is applied to the filter 115. The analysis of the cells or of their genetic material is then carried out in a manner known per se, during a step 485. The implementation of the present invention makes it possible to avoid risky sampling of cells, for example of amniotic fluid cells while allowing cultures, for example for amniocentesis. Moreover, because of the reservoir shape of the support 108 of the filter 115, it is possible to carry out directly in this support of immunocytochemistry or fluorescent in situ hybridization (FISH) reactions.
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