FR2967163A1

FR2967163A1 - Procede in vitro ou ex vivo pour la maintenance en survie et la generation ou reconstruction d'un epiderme

Info

Publication number: FR2967163A1
Application number: FR1059160A
Authority: FR
Inventors: Pascal Descargues; Guy Serre; Michel Simon
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2012-05-11
Also published as: WO2012059703A1

Abstract

La présente invention a pour objet sur un procédé in vitro ou ex vivo pour la maintenance en survie et, le cas échéant, la génération ou reconstruction d'un épiderme. Sous un autre aspect, la présente invention comprend le modèle d'épiderme ainsi obtenu et sur son utilisation dans un kit ou dans procédé pour le criblage ou la sélection de composés cosmétiques ou pharmaceutiques.

Description

L'épiderme est un épithélium pavimenteux pluristratifié et squameux. Il forme une barrière qui résiste aux ravages de la dessiccation, ainsi qu'aux agressions mécaniques, chimiques et microbiennes. Le type cellulaire principal constituant l'épiderme est le kératinocyte. Ce tissu comprend également d'autres populations cellulaires telles que les mélanocytes, les cellules de Langerhans, et les cellules de Merkel. L'épiderme est conventionnellement sous divisé en quatre strates distinctes comprenant des couches internes vers les couches les plus superficielles : la couche basale (une couche), la couche épineuse (4-15 couches), la couche granuleuse (1-3 couches) et la couche cornée (5-10 couches). L'épiderme repose sur le derme grâce une membrane basale constituée entre autres de molécules de collagène. Le derme contient des réseaux vasculaires et nerveux très denses ainsi que les annexes épidermiques, structures kératinisées prolongeant l'épiderme et incluant les follicules pileux, les glandes sébacées, et les glandes sudoripares.

Les techniques qui permettent d'obtenir des épidermes reconstruits in vitro sont dérivées de l'ingénierie cellulaire. Les découvertes réalisées par Rheinwald et Green (Rheinwald, J. G. et al., "Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells", Cell, 6 (1975), 331-344; Green, H. et al., "Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5665-5668) ont été le départ de l'établissement de protocoles de cultures de kératinocytes humains, et de leurs utilisations en médecine (grand brûlés) ainsi qu'en recherche dermatologique (modèles in vitro). De nombreux protocoles permettant le développement d'épidermes/peaux reconstruits on été établis. On peut citer par exemple ceux qui sont décrits dans les brevets ou dans les demandes de brevets EP 285471, EP 285474, EP 418035, WOA-90 02796, WO-A-9116010, EP 197090, EP 20753, FR 2665175, FR 2689904. De manière très générale, les modèles de peau ou d'épidermes reconstruits décrits dans ces documents sont constitués de kératinocytes humains déposés sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivés dans des conditions telles qu'ils entrent dans un programme de différenciation aboutissant à la formation d'un équivalent d'épiderme. Les modèles d'épidermes ou de peau reconstruits sont fréquemment utilisés pour des investigations en dermatologie dans le cadre des tests de substances, comme pour les candidats médicaments ou les actifs cosmétiques en développement. Les effets pharmacologiques de ces molécules, notamment leur potentiel corrosif ou l'irritant, sont également analysés grâce à ces systèmes. Les épidermes reconstruits sont aussi utiles pour répondre à des questions de type moléculaires, immunologiques ou encore histologiques. Ceci comprend les études de pénétration et d'absorption. En comparaison avec les études précliniques utilisant des animaux et les études cliniques chez l'Homme, les épidermes/peaux reconstruits permettent d'obtenir des résultats plus rapidement et de façon plus reproductible.

Afin d'obtenir un épiderme comportant plusieurs types cellulaires, des mélanocytes ou des cellules immunitaires peuvent être ajoutées aux cultures de kératinocytes (Celine AUXENFANS et al., « Evolution of three dimensional skin equivalent models reconstructed in vitro by tissue engineering », Eur J Dermatol 2009; 19 (2): 107-13). Cependant, les technologies utilisées ne permettent pas encore une production d'épidermes contenant à la fois des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Langerhans et des cellules de Merkel. Enfin, de nombreux verrous technologiques persistent pour reconstruire in vitro des annexes épidermiques comme des follicules pileux, des glandes sébacées et des glandes sudoripares. En conclusion, les technologies de reconstruction disponibles jusqu'alors sont encore très limitantes pour permettre la production d'un épiderme contenant l'ensemble des annexes et types cellulaires qui le caractérise. Ainsi, depuis de nombreuses années, la mise au point de nouveau procédés visant à obtenir des modèles de peau reconstruite est recherchée. De tels modèles auraient comme avantages de pouvoir permettre la réalisation d'études nécessaires à une meilleure compréhension du rôle de la peau, notamment de son épiderme tant dans le domaine mécanique que dans le domaine physiologique. De tels modèles peuvent également être utilisés pour la prédiction par des tests in vitro ou ex vivo, de l'activité de principe actifs cosmétiques et/ou pharmaceutiques ou encore des effets secondaires de composé topiques. Ceci est justement l'objet de la présente invention. De façon surprenante, la demanderesse a mis en évidence que la mise en oeuvre du procédé de l'invention tel que décrit ci-après, notamment comprenant le dépôt de fragment de peau dans une première étape sur une phase liquide, puis, dans une seconde étape, sur une phase liquide dont on peut induire la solidification, permettait d'obtenir la maintenance en survie et, le cas échéant la reconstruction d'un épiderme artificiel pouvant conduire à un épiderme complet utilisable comme modèle in vitro ou ex vivo. La présente invention a donc pour objet un procédé in vitro ou ex vivo pour la maintenance en survie et, le cas échéant, la génération ou reconstruction de la peau, de préférence d'un épiderme. L'invention comprend en particulier un procédé permettant de faire 15 survivre ex vivo un explant entier d'épiderme avec ces annexes. De préférence, ledit fragment de peau est un fragment de peau de mammifère, de préférence humaine. La présente invention se rapporte également à une peau, notamment un épiderme pouvant comprendre ses annexes et son utilisation comme modèle pour 20 évaluer in vitro l'effet de produits cosmétique, pharmaceutique ou dermatologique à administration topique. Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé ex vivo ou in vitro de conservation ou de maintenance en survie d'un épiderme à partir d'un fragment de peau comprenant de l'épiderme et du derme, ce 25 fragment ayant été préalablement prélevé chez un mammifère, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'une matrice liquide dans un container, ladite matrice comprenant une solution enzymatique apte à dégrader les protéines de la membrane basale séparant l'épiderme du derme, le niveau de la matrice dans le container étant de 30 préférence supérieur à l'épaisseur du fragment prélevé ; b) le dépôt dudit fragment sur ladite matrice de façon à ce que l'épiderme contenu dans ledit fragment reste émergé et le derme sous-jacent dudit fragment soit immergé dans ladite matrice ; c) l'incubation dudit fragment ainsi disposé dans la matrice pendant une période suffisante pour aboutir au détachement du derme de l'épiderme, ce détachement étant induit par les enzymes contenus dans la matrice, le derme ainsi détaché plongeant progressivement dans le fond du container ; d) le cas échéant, l'élimination du derme ainsi détaché ; e) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide, de préférence nutritive, apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou d'un composé ou composition spécifique ; f) la solidification de la matrice augmentation de la température de ladite matrice et/ou par l'ajout dudit composé ou composition spécifique. Ce procédé se révèle avantageux par le fait qu'il permet d'obtenir un 15 modèle de peau comprenant un épiderme qui peut être maintenu en survie de manière prolongée sans dégradation notable. L'invention comprend par exemple un procédé permettant de faire survivre ex vivo un explant entier d'épiderme avec ces annexes. Un tel procédé comprendra en particulier : (i) la disposition d'une biopsie de peau cylindrique dans 20 une solution enzymatique de façon à ce que la ligne de flottaison sépare l'épiderme émergé du derme immergé ; (ii) la dégradation enzymatique de la membrane basale laissant l'épiderme flotter à la surface tandis que le derme se détache et plonge progressivement dans le fond ; (iii) le remplacement de la solution enzymatique par une matrice liquide (solution dérivée de plasma sanguin, solution de fibrinogène ou 25 de collagène) dont la solidification est induite par ajout de thrombine ou à la chaleur. (iiii) Après solidification, l'ensemble est maintenue en culture et peut être utilisé à des fins de modèle, en particulier pour des analyses toxicologiques (tels que des tests de corrosion, d'irritation) ou à des fins de recherche. Selon un mode de réalisation préféré, ledit procédé comprend : 30 i) le prélèvement de l'épiderme reposant sur la matrice contenant la solution enzymatique et son dépôt sur ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contenue dans un second container; ou ii) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide dans le container initial. Selon un mode de réalisation également préféré, ledit procédé comprend à l'étape e): i) le prélèvement de l'épiderme reposant sur la matrice contenant la solution enzymatique et son dépôt sur ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contenue dans un second container; et, en ce que ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient en outre des cellules autres que des cellules de l'épiderme, de préférence choisies dans le groupe de cellules constitué par les fibroblastes, des cellules endothéliales, des cellules nerveuses, des cellules constituant le derme et des cellules immunitaires. ii) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide dans le container initial, ladite matrice liquide de remplacement étant une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier, et, le cas échéant contenant en outre des cellules autres que des cellules de l'épiderme. A l'étape e), i) le fragment obtenu est ensuite placé sur une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier ladite matrice liquide pouvant apporter tous les ingrédients nutritifs ou de cultures, ainsi que toutes les cellules nécessaires à la préparation d'un équivalent de peau complet reproduisant les caractéristiques d'une peau in vivo. A l'étape e), ii) la matrice liquide de remplacement apte à pouvoir se solidifier est de préférence une matrice liquide pouvant apporter tous les ingrédients nutritifs ou de culture de l'épiderme ou de peau, ainsi que toutes les cellules nécessaires à la préparation d'un équivalent de peau complet reproduisant les caractéristiques d'une peau in vivo. De préférence, il est souhaitable que ladite matrice liquide ne recouvre pas la face supérieure de l'épiderme avant que cette matrice ne soit solidifiée. Sous un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé ex vivo ou in vitro de régénération ou reconstruction d'un épiderme à partir d'un fragment de peau, ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la conservation ou maintenance en survie d'un épiderme à partir d'un fragment de peau préalablement prélevé par un procédé selon la présente invention; et B) la culture de l'épiderme ainsi obtenue à l'étape A) dans des conditions de cultures adéquates, de préférence, ledit épiderme étant au contact de l'air. Plus spécifiquement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit fragment préalablement prélevé est un explant entier d'épiderme avec ces annexes comprenant notamment les follicules pileux, les glandes sébacées et sudoripares. Selon un mode de réalisation également préféré, ledit fragment préalablement prélevé est un fragment de forme cylindrique, de préférence dont la taille est comprise entre 1 à 10 mm de diamètre, de préférence encore de 1 à 8 mm et de 0,5 à 8 mm d'épaisseur, de préférence de 1 à 5 mm. Selon un mode de réalisation également préféré, la solution enzymatique apte à dégrader les protéines de la membrane basale séparant l'épiderme du derme et contenue dans la ladite matrice à l'étape a) est une solution contenant une protéase, de préférence de la dispase ou de la thermolysine.

Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou d'un composé ou composition spécifique est choisie parmi toute solution liquide, de préférence nutritive, capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture de cellules d'épiderme, de préférence choisie parmi : - du plasma sanguin ou une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène, une solution de collagène, de la gélatine, gel polymériques synthétiques, naturels tels que les gels d'agarose, d'amidon, de polysaccharides. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e) : - ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles, de préférence par du citrate de sodium ; et - la solidification de ladite matrice est obtenue en présence d'ions calcium, de 30 préférence également en présence de thrombine. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape c), ledit fragment ainsi disposé dans la matrice est incubé pendant une période d'au moins 10 heures, de préférence à 4°C, de préférence encore une nuit à 4 °C. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide est solidifiée après au maximum de 8 heures, de préférence moins de 2 heures ou moins d'une heure, une durée de moins de 30 min, de préférence de moins de 10 min étant la durée la plus préférée pour engager la phase de solidification de la matrice liquide. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin contenant de 25 % à 60 %, de préférence entre 35 % et 45 % (v/v) de plasma sanguin, de 70 % à 35 % d'une solution physiologique, telle qu'une solution de NaCl à 0,9 %, de 5 % à 12 %, de préférence 8 %, d'une solution saline de CaClz à 1 % et d'un agent antifibrinolytique en concentration suffisante pour obtenir l'activité anti-fribrinolytique recherchée, de préférence entre 5 % et 2 %, de préférence l'agent anti-fibrinolytique étant choisi parmi l'acide tranaxémique ou de l'aprotinine. Selon un mode de réalisation également préféré du procédé selon l'invention, à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide de fibrinogène et de thrombine, ou de collagène et pour laquelle l'incubation à 37 °C permet sa solidification. Sous un troisième aspect, la présente invention a pour objet un modèle d'épiderme susceptible d'être obtenu par le procédé selon la présente invention. Selon cet aspect de l'invention, a également pour objet un kit comprenant un tel modèle d'épiderme reposant notamment sur une matrice solide et, le cas échéant, nutritive, cette matrice solide étant adaptée par sa composition à la maintenance en survie dudit épiderme, le cas échéant à multiplication et à la différenciation des cellules pouvant être incluses dans cette matrice solide. Ainsi, selon cet aspect, l'invention a pour objet également un kit d'évaluation de composés cosmétique, dermatologique ou thérapeutique pour la peau comprenant un modèle de peau ou d'épiderme obtenu selon le procédé de l'invention.

Un autre objet de la présente invention se rapporte à une méthode de screening in vitro de composés candidats pour le traitement cosmétique ou thérapeutique de la peau, de préférence de l'épiderme, de préférence de l'épiderme associée au derme comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un modèle d'épiderme selon la présente invention; b) la mise en contact dudit modèle avec le composé candidat ; et c) la mise en évidence d'une modification physiologique, en particulier la perméabilité, ou morphogénique des cellules de l'épiderme dudit modèle; et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. Ainsi le modèle de peau et/ou d'épiderme selon l'invention peut aussi être utilisé dans tout procédé, notamment automatisé, pour le criblage ou l'identification de nouveaux composés cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques. Les procédés de criblage en vue d'identifier de nouveaux composés efficace comprennent en général une de mise en contact dudit composé à tester avec un modèle de peau et/ou d'épiderme obtenu selon l'invention puis une étape de lecture de l'effet du composé sur ledit modèle, notamment en comparant cet effet avec un modèle contrôle ou témoin selon l'invention n'ayant pas été mis en contact avec le composé à tester. Cette dernière étape de lecture pourra également être réalisée par la détermination ou l'analyse de marqueurs épidermiques et/ou de cellules associées et incluses dans la matrice solidifiée, tels que des protéines associées à ces structures. Par exemple si ces cellules associées sont des cellules du système immunitaire, ledit procédé de criblage sera par exemple destiné à identifier ou sélectionner des composés tests susceptibles d'induire des effets secondaires non recherchés tels que des réactions allergiques. Les produits testés pourront également être des vecteurs d'expression de gènes, ou encore des acides nucléiques, tels que des acides nucléiques antisens, microRNA, siRNA aptes à modifier l'expression d'un gène constitutif de cellules présentes dans ledit modèle de l'invention.

D'autres effets tels que l'expression de certains médiateurs ou la cytotoxicité intrinsèque des composés tests vis à vis de certaines cellules pourront être également recherchés comme effet secondaire selon les cellules associées également présentes dans la matrice solidifiée. Ces modèles témoins seront bien entendus mis en oeuvre dans les mêmes conditions que le modèle de l'invention ayant reçu le produit à tester.

Sous un cinquième aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la peau, notamment de l'épiderme, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) à partir d'un fragment de peau prélevé chez ledit patient, l'obtention d'un modèle 10 selon la présente invention; b) la mise en contact dudit modèle avec un composé candidat pour ledit traitement ; c) la mise en évidence de modification physiologique ou morphogénique associée à l'efficacité du traitement des cellules de l'épiderme pour ledit désordre de l'épiderme; et 15 d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. Sous un sixième aspect, la présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la peau, notamment de l'épiderme, selon la présente invention, 20 caractérisé en ce qu'à l'étape a), le fragment de peau utilisé est un fragment issu d'une collection ou de culture de peau. Sous un septième aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un modèle selon la présente invention, pour déterminer pour un produit les effets secondaires sur l'épiderme, tels que par exemple ; 25 - sa toxicité ; - son adsorption ou absorption; - sa distribution, son métabolisme, son excrétion ; - l'irritation ou encore la corrosion. Un tel modèle pourra être en effet selon la présente invention être utilisé 30 ou mis en oeuvre dans tout procédé ou test in vitro ou ex vivo nécessitant des expérimentations animales ou humaines, comme par exemple l'étude de libération ou de pénétration de principes actifs, et/ou de leur biodisponibilité cutanée, l'étude de leur efficacité, ou encore de leur tolérance, de leur compatibilité, ces principes actifs étant à visée cosmétiques, dermatologiques et/pharmaceutiques. Selon un mode de réalisation préféré, ledit produit est un produit cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique.

L'utilisation comme modèle concernera également sa mis en oeuvre pour l'étude de toute pathologie se traduisant par des anomalies de la peau, notamment de l'épiderme mais également pour toutes les cellules situées sous l'épiderme pour lesquelles l'épiderme constitue une barrière naturelle et pour lesquelles une thérapie par voie topique est envisageable.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec l'exemple et la figure. La figure dont les légendes sont ci-après, ainsi que l'exemple qui suit sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée.

LEGENDES DE LA FIGURE Figure : Schéma décrivant les différentes étapes du procédé - Etape 1 : Une biopsie cylindrique de peau est réalisée ; - Etape 2 : La biopsie est placée dans un container contenant une solution 20 enzymatique dégradant la membrane basale; - Etape 3 : La biopsie est incubée à 4 °C jusqu'à ce que le derme se détache de l' épiderme; - Etape 4 : L'épiderme est disposé sur une solution de plasma sanguin (liquide); - Etape 5 : La solution de plasma sanguin est solidifiée par coagulation; et 25 - Etape 6 : L'épiderme disposé sur le plasma coagulé est maintenu en culture;

EXEMPLE : Différentes étapes du procédé (voir figure)

1. Une biopsie cylindrique est tout d'abord réalisée sur un fragment de peau 30 fraîchement prélevé pour permettre sa survie ex vivo. 2. La biopsie cutanée est délicatement déposée dans une solution enzymatique de dispase ou de thermolysine, qui dégrade spécifiquement les protéines de la membrane basale, de façon à ce que la partie superficielle (l'épiderme) reste émergée alors que le derme sous-jacent est immergé. 3. L'ensemble est laissé à incuber (généralement au moins 10 heures à 4 °C) jusqu'à ce que le derme s'enfonce progressivement dans la solution après s'être détaché de l'épiderme resté , quand à lui, étalé, flottant à la surface de la solution, et toujours associées à ses annexes. La séparation entre l'épiderme et le derme peut être achevée à l'aide de pinces en veillant à préserver l'intégrité des tissus. 4. La solution enzymatique est ensuite remplacée par une solution dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anti-coagulant aux propriétés réversibles en présence d'ions calcium (citrate de sodium). Cette solution contient 42 % de plasma sanguin, 50 % d'une solution de NaCl à 0,9 %, 8 % d'une solution saline de CaC12 à 1% et un agent anti-fibrinolytique (acide tranaxémique ou aprotinine). 5. En coagulant, le plasma fait office de support dermique sur lequel adhère l'expiant d'épiderme. La coagulation consiste essentiellement en la transformation, en présence d'ions calcium et de thrombine, du fibrinogène présent dans le plasma en un échafaudage de molécules de fibrine reliées entre elles par des liaisons covalentes. L'agent anti-fibrinolytique a pour fonction d'inhiber les enzymes suceptibles de dégrader la matrice de plasma sécrétées par l'expiant d'épiderme, et ainsi de maintenir l'intégrité du support dermique. De la même façon la solution de plasma peut être substituée par une solution de fibrinogène ou de collagène. Pour cette dernière, l'incubation à 37 °C seule permet la solidification. 6. L'ensemble constitué par l'expiant d'épiderme est maintenue en culture avec l'épiderme au contact de l'air.

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo ou in vitro de conservation ou de maintenance en survie d'un épiderme à partir d'un fragment de peau comprenant de l'épiderme et du derme, ce fragment ayant été préalablement prélevé chez un mammifère, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) la préparation d'une matrice liquide dans un container, ladite matrice comprenant une solution enzymatique apte à dégrader les protéines de la membrane basale séparant l'épiderme du derme, le niveau de la matrice dans le container étant de préférence supérieur à l'épaisseur du fragment prélevé ; b) le dépôt dudit fragment sur ladite matrice de façon à ce que l'épiderme contenu dans ledit fragment reste émergé et le derme sous-jacent dudit fragment soit immergé dans ladite matrice ; c) l'incubation dudit fragment ainsi disposé dans la matrice pendant une période suffisante pour aboutir au détachement du derme de l'épiderme, ce détachement étant induit par les enzymes contenus dans la matrice, le derme ainsi détaché plongeant progressivement dans le fond du container ; d) le cas échéant, l'élimination du derme ainsi détaché ; e) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide, de préférence nutritive, apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou d'un composé ou composition spécifique ; et f) la solidification de la matrice augmentation de la température de ladite matrice et/ou par l'ajout dudit composé ou composition spécifique.
2. Procédé ex vivo ou in vitro selon la revendication 1, caractérisé en ce que à l'étape e), ledit procédé comprend : i) le prélèvement de l'épiderme reposant sur la matrice contenant la solution enzymatique et son dépôt sur ladite matrice liquide apte à pouvoir se 30 solidifier contenue dans un second container; ou ii) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice liquide dans le container initial.
3. Procédé ex vivo ou in vitro selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que à l'étape e), ledit procédé comprend : i) le prélèvement de l'épiderme reposant sur la matrice contenant la solution 5 enzymatique et son dépôt sur ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contenue dans un second container, et, le cas échéant en ce que ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient en outre des cellules autres que des cellules de l'épiderme ; ou ii) le remplacement de la matrice contenant la solution enzymatique par une matrice 10 liquide dans le container initial, ladite matrice liquide de remplacement étant une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier, et, le cas échéant contenant en outre des cellules autres que des cellules de l'épiderme.
4. Procédé ex vivo ou in vitro de régénération ou reconstruction d'un épiderme à 15 partir d'un fragment de peau, ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la conservation ou maintenance en survie d'un épiderme à partir d'un fragment de peau préalablement prélevé par un procédé selon l'une des revendications 1 à 3; et B) la culture de l'épiderme ainsi obtenue à l'étape A) dans des conditions de 20 cultures adéquates.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit fragment préalablement prélevé est un explant entier d'épiderme avec ces annexes comprenant les follicules pileux, les glandes sébacées et sudoripares.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit fragment préalablement prélevé est un fragment de forme cylindrique, de préférence dont la taille est comprise entre 1 à 10 mm de diamètre et de 1 à 5 mm d'épaisseur. 30
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution enzymatique apte à dégrader les protéines de la membrane basale séparant 25 l'épiderme du derme et contenue dans la ladite matrice à l'étape a) est une solution contenant une protéase.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation de la température ou d'un composé ou composition spécifique est choisie parmi toute solution liquide, de préférence nutritive, capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture de cellules d'épiderme.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'à l'étape e) : - ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles; et - la solidification de ladite matrice est obtenue en présence d'ions calcium.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'à l'étape c), ledit fragment ainsi disposé dans la matrice est incubé pendant une période d'au moins 10 heures. 20
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'à l'étape e), ladite matrice liquide est solidifiée après au maximum 8 heures.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'à l'étape e), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de 25 plasma sanguin contenant de 25 % à 60 %, de 70 % à 35 % d'une solution physiologique, de 5 % à 12 %, d'une solution saline de CaClz à 1 % et d'un agent anti-fibrino lytique en concentration suffisante.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à1 l, caractérisé en ce qu'à l'étape e), 30 ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide de fibrinogène et de thrombine, ou de collagène.15
14. Modèle d'épiderme susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 13.
15. Méthode de screening in vitro de composés candidats pour le traitement 5 cosmétique ou thérapeutique de la peau, de préférence de l'épiderme, de préférence de l'épiderme associée au derme comprenant les étapes suivantes: a) l'obtention d'un modèle d'épiderme ou de peau selon la revendication 14; b) la mise en contact dudit modèle avec le composé candidat ; et c) la mise en évidence d'une modification physiologique, en particulier la 10 perméabilité, ou morphogénique des cellules de l'épiderme dudit modèle; et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement.
16. Procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu 15 souffrant d'un désordre de la peau, notamment de l'épiderme, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) à partir d'un fragment de peau prélevé chez ledit patient, l'obtention d'un modèle selon la revendication 14; b) la mise en contact dudit modèle avec un composé candidat pour ledit traitement ; 20 c) la mise en évidence de modification physiologique ou morphogénique associée à l'efficacité du traitement des cellules de l'épiderme pour ledit désordre de l'épiderme; et d) la sélection dudit composé si les modifications obtenues sont celles souhaitées pour le traitement. 25
17. Procédé pour déterminer le traitement thérapeutique adapté pour un individu souffrant d'un désordre de la peau, notamment de l'épiderme, selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le fragment de peau utilisé est un fragment issu d'une collection ou de culture de peau. 30
18. Utilisation d'un modèle selon la revendication 14, pour déterminer pour un produit les effets secondaires sur la peau ou l'épiderme, ou sur des cellules associées incluses dans ledit modèle.
19. Utilisation d'un modèle selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit produit est un produit cosmétique ou pharmaceutique.