FR2945747A1 - Composition pharmaceutique antitumorale comprenant un inhibiteur de cdks et un inhibiteur de la croissance cellulaire - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la thérapie cancéreuse et, plus particulièrement, une composition pharmaceutique dotée d'un pouvoir anti-tumoral comprenant au moins un inhibiteur de Cdks choisi parmi l'indirubine-3'-monoxime et certains dérivés de purine sélectionnés et au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire, ainsi qu'à l'association d'au moins un inhibiteur de Cdks choisi parmi l'indirubine-3'-monoxime et certains dérivés de purine sélectionnés et d'au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire exerçant des effets anti-tumoraux synergiques, pour une utilisation à titre de médicament pour le traitement des pathologies néoplasiques.

Description

B1872FR 1 La présente invention concerne le domaine de la thérapie cancéreuse et, plus particulièrement, une composition pharmaceutique dotée d'un pouvoir anti-tumoral comprenant au moins un inhibiteur de protéines kinases dépendantes des cyclines (en abrégé, Cdks) et au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire, ainsi qu'à l'association d'au moins un inhibiteur de Cdks et d'au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire exerçant des effets anti-tumoraux synergiques, pour une utilisation à titre de médicament pour le traitement des pathologies néoplasiques. L'objectif d'une thérapie cancéreuse est d'interrompre, voire d'inverser le processus de croissance tumorale, soit en induisant la mort des cellules tumorales par apoptose, soit en les dirigeant vers un état d'arrêt irréversible de prolifération (appelé état de sénescence), tout en épargnant, autant que faire se peut, les cellules normales. Les trois dernières décennies ont été les témoins d'une quête acharnée visant à décrypter les voies de signalisation qui contrôlent la vie et la mort des cellules ainsi que leur cycle de reproduction (ou cycle cellulaire) dans les cellules nonnales aussi bien que tumorales. Le cycle cellulaire se déroule selon une routine séquentielle rigoureuse qui requiert la coordination spatiale et temporelle d'une grande diversité de processus biochimiques : la cellule duplique ses chromosomes pendant une phase appelée S avant de se diviser pendant une phase appelée M (mitose) pour donner naissance à deux cellules filles ayant hérité chacune d'un jeu de chromosomes maternels. Dans les cellules embryonnaires dont le cytoplasme est saturé de ressources héritées des cellules mères, les phases S et M se succèdent à une vitesse étonnante. Les cellules commencent à répliquer leur matériel génétique (ADN) dès qu'elles sortent de mitose et un cycle ne dure pas plus d'une demi-heure. Toutefois, dans les cellules somatiques qui ont épuisé les ressources maternelles et doivent puiser dans leur environnement les ressources nécessaires pour survivre et proliférer, deux nouvelles phases apparaissent : (i) la phase Gl, qui s'interpose entre la sortie de mitose et l'entrée en phase S, au cours de laquelle la cellule est submergée par une flot de signaux de toute sorte (division, croissance, différenciation, adhésion, stress, ...), qu'elle doit interpréter et intégrer avant de décider d'entrer en phase S ou non et, éventuellement alors, de se différencier, d'entrer en sénescence ou de mourir ; (ii) la phase G2, qui succède à la phase S et pendant laquelle la cellule prépare son entrée en mitose, en accord avec son environnement.

Contrairement aux cellules embryonnaires et aux cellules tumorales, les cellules somatiques ont également la possibilité de se retirer dans un état de non B1872FR 2 prolifération réversible (appelé état de quiescence ou GO) dans lequel elles peuvent survivre pendant de longues périodes de temps quand elles se trouvent dans un environnement défavorable à leur propagation (surpopulation, manque de nutriments, ...).

La sortie de la phase GO et la progression ordonnée des cellules à travers les phases G1, S, G2 et M sont gouvernées par une famille d'enzymes, des protéines à activité sérine/thréonine kinase appelées Cdks, dont le timing d'activation est contrôlé de façon rigoureuse par divers mécanismes : (i) leur association à des sous-unités régulatrices appelées cyclines ; (ii) des phosphorylations activatrices ou inhibitrices ; (iii) leur association à des inhibiteurs peptidiques appelés CKIs ; (iv) des changements de localisation intracellulaire. Les protéines à activité kinase follnent une classe d'enzymes dont la fonction est de catalyser le transfert d'un groupement phosphate de la molécule d'ATP au groupement hydroxyle d'un résidu sérine, thréonine ou tyrosine présent sur une protéine cible accepteuse. La phosphorylation sur un seul ou plusieurs résidu(s) d'une protéine est capable de modifier sa structure et ses interactions avec d'autres protéines et de permettre ainsi à la cellule de basculer d'un état physiologique à un autre. C'est pourquoi les réactions de phosphorylation jouent un rôle important dans de nombreux aspects de la biologie cellulaire, notamment le métabolisme, la croissance, le mouvement, la différenciation et la division. La famille des Cdks est connue tout d'abord pour son implication dans le contrôle du cycle cellulaire bien que certains de ses membres jouent également un rôle dans d'autres processus physiologiques, comme la régulation de la transcription, et dans le système nerveux central. Leur activité est fréquemment dérégulée dans certaines maladies, en particulier, dans les cancers chez l'Homme, dans lesquels certaines cyclines (D et E) et/ou Cdks sont surexprimées. La sortie de phase GO dans les cellules somatiques dépend d'une stimulation mitogénique continue qui induit l'accumulation des cyclines de type D et la formation suivie de l'activation des complexes cycline D-Cdk4,6, dont la mission première est d'initier la phosphorylation de la protéine du rétinoblastome, Rb, déréprimant ainsi la transcription du gène de la cycline E. L'accumulation et l'activation des complexes cycline E-Cdk2 qui s'ensuivent jouent un rôle décisif dans le passage à travers le point de restriction (R) au delà duquel les cellules s'engagent de façon irréversible dans leur cycle de division, indépendamment de toute stimulation exogène. L'hyperphosphorylation de Rb par les complexes cycline E-Cdk2 permet ensuite la libération des facteurs de transcription E2Fs qui activent la transcription d'une cohorte de gènes impliqués dans la régulation du B1872FR 3 cycle. Une fois la phase S initiée, la cycline E est dégradée et les complexes cycline A-Cdk2 prennent le relais pour orchestrer les évènements irréversibles de réplication de l'ADN, suivis par les complexes cycline A-Cdkl puis par les complexes cycline B-Cdkl qui induisent la transition G2/M. Enfin, la destruction de la cycline B, catalysée par l'activité du complexe cycline B-Cdkl lui-même, conduit à la séparation des deux jeux de chromosomes, à la cytokinèse et à la naissance des deux cellules filles. La cancérogénèse est un processus évolutif qui apparaît quand des cellules somatiques acquièrent des mutations dites oncogéniques qui les incitent à proliférer de façon incontrôlée et à échapper à leur destin naturel qui serait de se différencier, ou de mourir. Les cellules ainsi mutées ont perdu la capacité d'interpréter et d'intégrer la multitude de signaux souvent contradictoires qu'elles reçoivent de leur environnement (division, croissance, différenciation, adhésion, stress, ...) pendant leur phase Gl et/ou de répondre à ces signaux en respectant les règles d'homéostasie mises en place par l'organisme hôte pour préserver son intégrité et sa survie. Les produits des gènes suppresseurs de tumeurs Rb et p53 jouent un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie tissulaire (T. David-Pfeuty, BBA-Rev Cancer, 2006, 1765, 38-66). La protéine Rb est le substrat favori des complexes cycline D-Cdk4,6 dont l'activité kinase est également régulée négativement par les CKIs de la famille Ink4 (Sherr et Roberts, Genes Dev., 1999, 13, 1501-1512). Sous ses formes non phosphorylée et hypophosphorylée, Rb est un puissant répresseur de la transcription en général et, des gènes régulateurs du cycle en particulier. Sa phosphorylation séquentielle par les complexes cycline D- et cycline E-Cdks est absolument requise pour la sortie de la phase GO. La voie de signalisation gouvernée par Rb est invariablement altérée dans tous les cancers humains, soit par délétion de Rb ou inactivation de p161nk4a ou amplification de Cdk4 ou surexpression de la cycline Dl (Shapiro et Harper, J Clin. Investig., 1999, 104, 1645-1653).

Quant au gène p53, il est perdu ou altéré dans plus de 50 % des cancers humains et sa réintroduction dans des tumeurs p53-négatives, de même que son activation en réponse à de nombreuses formes de stress, y compris les mutations oncogéniques, conduit à un arrêt du cycle ou à l'apoptose. La protéine p53 est un puissant activateur de la transcription de pas moins de 5000 gènes parmi lesquels deux ont été démontrés jouer un rôle important en tant que médiateurs de sa fonction dans la surveillance du cycle : les gènes codant pour la p2l une CKI de la famille Cip/Kip, et pour la protéine 14-3-3s. La p21c`p' possède une forte B1872FR 4 affinité pour les complexes cycline-Cdkl,2 et sa surexpression induit des arrêts du cycle en phase G1 et G2 (Sherr et Roberts, ibid). La protéine 14-3-3s bloque les cellules en phase G2 en empêchant l'activation du complexe mitotique cycline B-Cdkl. La p53 joue donc un rôle vital dans le maintien de l'intégrité de l'organisme puisqu'elle prévient la propagation de cellules endommagées en ralentissant leur vitesse de progression dans le cycle, leur laissant ainsi le temps de réparer leurs lésions avant d'entrer en phase S ou M. Toutefois, certains types de cellules entrent en apoptose en réponse à l'accumulation nucléaire et à l'activation de la p53 qui, dans ce cas, induit l'expression d'un (ou de plusieurs) de ses nombreux gènes cibles pro-apoptotiques. La p53 peut également être inactivée dans les cancers humains via la surexpression de la protéine Mdm2, le produit d'un de ses gènes cibles qui s'associe à elle pour inhiber son activité transcriptionnelle, l'exclure du noyau et favoriser sa dégradation, ou encore, via la perte de fonction de la petite protéine Arf qui active ses fonctions en s'opposant à celles de Mdm2.

La meilleure compréhension de la biologie des tumeurs a permis de disséquer avec plus de précision certains mécanismes moléculaires impliqués dans la transformation maligne (Hanahan et Weinberg, Cell, 2000, 100, 57-70) : sécrétion autocrine de facteurs de croissance (PDGF, EGF, ....) ou mutationlsurexpression de leurs récepteurs ; activation constitutive des voies de transduction des signaux mitogéniques (Ras, Src, Abl, ..) ; perte de fonction de protéines impliquées dans la régulation négative du cycle (p53, Rb, p27K`p', . . .) ou , au contraire, surexpression de protéines favorisant l'entrée dans le cycle (cyclines ou facteurs de transcription tels que Myc et E2F, ...). Ces découvertes ont ouvert le champ à un nouveau domaine de recherche centré sur l'identification rationnelle de cibles moléculaires critiques pour la survie des cellules tumorales et à l'élaboration d'outils adaptés visant à les inhiber. Des inhibiteurs ou des anticorps dirigés contre des protéines connues pour être spécifiquement altérées ou dérégulées dans certains cancers (e.g. les récepteurs de facteurs de croissance, Ras, Abl, p53, Cdks) ont ainsi atteint les phases d'essais cliniques. Cependant, à quelques exceptions près, les résultats obtenus ne correspondent pas encore aux espoirs fondés (Dancey et Sausville, Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 296-313 ; Sawyers, Nature, 2004, 432, 294-297). Un important effort de recherche a notamment été dévoué aux inhibiteurs chimiques de Cdks. Cet effort a abouti à l'identification de plusieurs classes d'inhibiteurs compétitifs de l'ATP présentant une bonne sélectivité pour les Cdks par rapport à d'autres kinases. Deux inhibiteurs de première génération, l'alvocidib (flavopiridol/HMR1275/L86-8275) et le seliciclib (CYC-202/R-roscovitine), ont B1872FR atteint les phases les plus avancées de développement clinique (phases II et III). Dans les différentes études cliniques réalisées sur des tumeurs solides, ils ont démontré en monothérapie une activité anti-tumorale modeste bien que quelques cas de stabilisation prolongée de la maladie aient été reportés. Le flavopiridol s'est

5 toutefois révélé d'une efficacité remarquable dans les leucémies lymphoïdes chroniques à haut risque (Byrd et al., Blood, 2007,109, 399-404). Cependant, leurs effets secondaires indésirables ne sont pas négligeables, en particulier dans le cas de l'alvocidib, les tissus normaux les plus vulnérables étant la moelle osseuse et l'appareil gastro-intestinal. Le nombre d'inhibiteurs de Cdks de seconde génération appartenant à de nombreuses classes chimiques qui atteint les premières phases d'essais cliniques ne cesse de croître. Ces molécules peuvent être classifiées selon leur profil d'activité vis-à-vis des différents complexes cycline-Cdks (Malumbres et al., TIPS, 2007, 29, 16-21 ; Shapiro G., J. Clin. Oncol., 2006, 24, 1770-1783). Leur possibilité d'utilisation en chimiothérapie cancéreuse fait encore l'objet d'études intensives. L'utilisation d'inhibiteurs chimiques de Cdks en combinaison avec d'autres principes actifs, incluant les chimiothérapies conventionnelles et les nouvelles thérapies ciblées, a également été envisagée. Concernant les chimiothérapies conventionnelles, dans plusieurs essais précliniques, des inhibiteurs de Cdks combinés à des agents cytotoxiques (e.g. le cisplatine, le 5-fluorouracile, la doxorubine, le paclitaxel), ont présenté des effets anti-tumoraux synergiques, en particulier quand l'agent cytotoxique était administré avant l'inhibiteur de Cdks (Malumbres et al., TIPS, 2007, 29, 16-21). Il est important de noter que ces chimiothérapies conventionnelles ciblent directement la molécule d'ADN (comme les agents alkylants ou les sels de platine) ou perturbent sa synthèse (comme les inhibiteurs de topo-isomérase) ou bien encore empêchent le fonctionnement noinial des microtubules pendant la mitose (comme les taxanes ou les alcaloïdes de la pervenche). Elles sont ainsi capables d'éradiquer les cellules en état de prolifération rapide pendant les phases S ou M.

L'inconvénient majeur de ces traitements est qu'ils ne font pas la différence entre les cellules de l'organisme à prolifération rapide normales et tumorales. Ils favorisent ainsi le processus de vieillissement dans les tissus épithéliaux et induisent la mort par apoptose des cellules normales en état de prolifération rapide comme les cellules lymphoïdes et les cellules souches épithéliales, favorisant l'émergence de cancers secondaires. Il a été reporté que les patients traités pour des tumeurs hématopoïétiques ou solides avec des inhibiteurs de topo-isomérase ou des agents alkylants de l'ADN développent des leucémies secondaires induites par les B1872FR 6 traitements (Leone et al., Haematologica, 1999, 94, 937-945). D'autre part, ces chimiothérapies conventionnelles se sont révélées totalement inefficaces dans le traitement des cancers du sein, du colon et du poumon et dans le cas des cancers avancés en général, bien qu'elles se soient révélées efficaces dans le cas des cancers des testicules et des leucémies (Johnstone et al., Cell, 2002, 108, 153-164). Les nouvelles thérapies ciblées qui ont été testées in vivo et/ou in vitro en association avec des inhibiteurs de Cdks visent à inhiber : (i) in vivo, des récepteurs de facteurs de croissance ou le système VEGF/R-VEGF dans divers modèles de tumeurs humaines solides et (ii) in vitro, la phosphatidylinositol-3-kinase dans des modèles de cellules humaines leucémiques : 1) Inhibition des récepteurs de facteurs de croissance de la famille du récepteur à l'EGF, R-EGF (HER1 et HER2) Il a été montré récemment que l'alvocidib/flavopiridol (tout comme le seliciclib/roscovitine) et le trastuzumab (qui est un anticorps dirigé contre le récepteur à activité tyrosine kinase HER2) exerçaient des effets cytotoxiques synergiques dans des lignées cellulaires de cancers du sein surexprimant HER2 (Nahta et al., Cancer Res., 2003, 63, 3626-3631). D'autre part, il a été montré que le seliciclib et l'AG1478 (un analogue de l'inhibiteur du R-EGF, erlotinib) exerçaient des effets cytotoxiques synergiques dans des lignées cellulaires de cancers bronchiques non à petites cellules exprimant un R-EGF sauvage (H358 et H292) ou muté (H1650) (Fleming et al., Clin. Cancer Res., 2008, 14, 4326-4335). 2) Inhibition du système VEGF/ R-VEGF La demande de brevet EP 1 568 368 propose l'association d'un inhibiteur de Cdks de la classe des thiazoles ou oxazoles et d'un inhibiteur du système VEGF/R- VEGF de la classe des phtalazines ou des dérivés aminés de l'acide anthranilique, pour le traitement de différentes maladies, dont le cancer. Le système VEGF/RVEGF réfère aux facteurs de croissance des cellules endothéliales et à leurs récepteurs situés à la surface des vaisseaux sanguins qui alimentent les tissus et dont il régule la biogénèse et la survie. Les cellules tumorales sont capables de stimuler le processus de néo-angiogénèse. L'inhibition du système VEGF/R-VEGF a pour objectif de déstabiliser les néo-vaissaux sanguins formés et à priver les cellules tumorales d'un apport en oxygène et en nutriments suffisant pour les maintenir en vie. Les thérapies anti-angiogéniques qui ciblent directement le système VEGF/R-VEGF ont été reportées produire des effets secondaires qui appellent à la prudence car ils provoquent des accidents hémorragiques graves.

B1872FR 7 3) Inhibition de la PI3K Yu et al. (Cancer Res., 2003, 63, 1822-1833,) ont étudié les effets de l'association de certains inhibiteurs de Cdks (flavopiridol, roscovitine ou CGP74514A) et d'un inhibiteur chimique de la phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), le 4-2-(4-morpholinyl)-8-phényl-4H-1-benzopyran-4-one (appelé LY294002) sur différentes lignées leucémiques humaines. La PI3K est un élément central de la voie de régulation de la croissance cellulaire, PI3K-Akt-mTOR, qui conduit à la synthèse des protéines ribosomales et des régulateurs du cycle en réponse à la réception de facteurs de croissance et de survie, relayée par les récepteurs à activité tyrosine kinase. Les résultats de cette étude montrent que LY294002 augmente de façon considérable les effets toxiques des trois inhibiteurs testés dans la lignée U937 et du flavopiridol en particulier dans les lignées Jurkat, CCRF, NB40 et HL-60. Plus précisément, le pourcentage de cellules U937 apoptotiques atteint 68,8 % après 6 h en présence de 75 nM de flavopiridol et de 15 M de LY294002 versus 1,1 % en présence de LY294002 seul. La rapamycine, qui un inhibiteur sélectif de la protéine kinase mTOR, activée à la fois par la voie PI3K et en réponse à l'apport en acides aminés et en glucose, est comparativement inefficace vis-à-vis des mêmes cellules : le pourcentage de cellules apoptotiques atteint 6,2 % après 6 h en présence de 75 nM de flavopiridol et de 10 nM de rapamycine versus 1,1 % en présence de rapamycine seule. Ainsi, l'association à un inhibiteur de Cdks d'un principe actif agissant en aval de la PI3K ne conduit pas à une amélioration de l'efficacité antitumorale des inhibiteurs de Cdks dans des cellules leucémiques en culture. Les auteurs concluaient que l'interruption combinée des voies reliées à la PI3K et aux Cdks pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique mais limitaient leur conclusion uniquement aux cancers hématologiques. Par ailleurs, le défaut majeur de cette étude est qu'elle ne présente aucun résultat d'études comparatives sur des cellules d'origine hématopoïétique noimales. Il n'est donc pas possible de déterminer si l'association d'un inhibiteur de Cdks et de LY294002 induit, ou non, l'apoptose des cellules saines du système sanguin aussi efficacement que celle des cellules leucémiques. En résumé, après plus d'une décennie d'investigation, la preuve incontestable de l'utilité des inhibiteurs de Cdks en thérapie cancéreuse, en monothérapie ou en association avec d'autres principes actifs, n'a pas encore été obtenue.

Le fait est qu'il est très difficile par essence d'obtenir des petites molécules organiques qui interagissent avec une cible désirée avec, à la fois, une forte affinité et une forte sélectivité. Ceci est d'autant plus vrai pour les inhibiteurs de Cdks qui B1872FR 8 interfèrent avec le site de liaison à l'ATP des Cdks, lequel est fortement conservé dans les 518 protéines kinases codées par le génome humain (Manning et al., Science, 2002, 298, 1912-1934). Aussi est-il très improbable qu'une molécule douée d'une forte affinité pour une Cdk n'interagisse pas également avec des affinités non négligeables avec d'autres substrats. Les effets toxiques d'un inhibiteur de Cdks potentiellement prometteur au plan thérapeutique pourraient ainsi être diminués du fait de son interaction avec des cibles secondaires indésirables dont l'éventail et la concentration devraient dépendre du type cellulaire. Il est probable également que les effets secondaires indésirables des inhibiteurs de Cdks de première et deuxième génération résultent de leur interaction avec des cibles cellulaires dont l'activité est vitale pour les cellules normales. Il existe donc toujours un besoin pressant de traitements anti-cancéreux améliorés tant du point de vue de leur efficacité et de leur sélectivité vis-à-vis de chaque type de cancer que de leur innocuité vis-à-vis des tissus sains de l'organisme. Le but de la présente invention est précisément de pourvoir à des traitements anti-cancéreux améliorés tant du point de vue de leur efficacité et de leur sélectivité vis-à-vis de chaque type de cancer que de leur innocuité vis-à-vis des tissus sains de l'organisme.

Ce but est atteint par la composition pharmaceutique qui fait l'objet de la présente invention et qui est caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principes actifs : i) au moins un inhibiteur de protéines kinases cycline-dépendantes choisi parmi : a) l'indirubine-3'-monoxime et, b) les dérivés de purine choisis dans le groupe constitué par : - le (3R, S)-1-[6-(3,4-méthylènedioxo-benzylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-yl] -3-méthyl-pent-l-yn-3-ol (composé I-1), - le (2R)-[ 1 -(9-isopropyl-6-phénylamino-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-30 yl]-méthanol (composé I-2), - le (2S)-[ 1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-3), - le (2R)-[ 1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-4), B1872FR 9 - le (2R)- { 1-[9-isopropyl-6-(3-méthoxy-benzylamino)-9H-purin-2-yl]-pyrrolidin-2-yl} -méthanol (composé I-5), - le (2R)- { 1-[6-(3,5-diméthoxy-benzylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-yl] -pyrrolidin-2-yl}-méthanol (composé I-6), et leurs énantiomères ; et ii) au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire choisi parmi : a) les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance activant la voie PI3K-Akt-mTOR ; b) les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR ; 10 en présence ou non d'un milieu pharmaceutiquement acceptable. La présence d'un inhibiteur de la croissance cellulaire dans la composition pharmaceutique conforme à la présente invention permet de potentialiser les effets toxiques de l'inhibiteur de Cdks utilisé, préférentiellement dans un type de tumeurs donné, sans augmenter de façon sensible ses effets toxiques sur des cellules saines. 15 L'indirubine-3'-monoxime est un composé de la famille des oxindoles appartenant à une classe d'inhibiteurs bifonctionnels qui ciblent préférentiellement non seulement des Cdks (en l'occurrence, Cdk1,2,5) mais également d'autres kinases (en l'occurrence, la GSK-3) (Hoessel et al., Nat. Cell Biol., 1999, 1, 60-67). De nombreux dérivés bisindoliques d'indigoïdes, et en particulier des

20 dérivés d'indirubine tels que par exemple l'indirubine-3'-monoxime, ainsi que leur utilisation pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber les Cdks, pour le traitement du psoriasis, de maladies cardiovasculaires, de maladies infectieuses, de maladies néphrologiques, de troubles neurodégénératifs et d'infections virales, toutes ces maladies étant associées à un défaut de régulation de la prolifération

25 cellulaire, sont décrits dans le brevet EP 1 079 826. Les composés I-1 à I-6 sont des inhibiteurs de Cdks appartenant à la même classe que la roscovitine (seliciclib/CYC-202) dont ils diffèrent par différentes substitutions en positions 2 et 6 sur le noyau de purine. La roscovitine est un puissant inhibiteur des Cdk2,5,7,9 et des Cdkl,4 (à un degré moindre) (Fischer,

30 Cell Cycle 3, 2004,742-746). Les formules chimiques développées de l'indirubine-3'-monoxime et de chacun des composés (I-1) à (I-6) sont présentées sur la figure 1 annexée. Les composés de formule (I-1) à (I-6) sont connus en tant que tels et peuvent être préparés selon les méthodes de synthèse décrites dans les articles de B1872FR 10 Legraverend M. et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 1282-1292 ; Legraverend M. et al., J. Heterocyclic. Chem., 2001, 37, 1-5 et Ducrot P. et al., J. Med. Chem., 2003, 43, 4098-4108. Les récepteurs de facteurs de croissance sont des protéines membranaires ancrées à la surface des cellules qui activent la voie PI3K-Akt-mTOR en réponse à la liaison de leurs ligands spécifiques pourvus par l'environnement cellulaire (par exemple, le sérum présent dans le milieu de culture in vitro ou les vaisseaux sanguins qui parcourent les tissus in vivo). Dans une grande variété de tumeurs solides, les récepteurs de facteurs de croissance (en particulier, les récepteurs à l'EGF Epidermal Growth Factor : R-EGF) sont activés de façon aberrante soit par mutation soit par surexpression. Les membres de la famille du R-EGF dérégulés peuvent différer d'un type de tumeur à l'autre : par exemple, HER2 est surexprimé dans plus de 30 % des cancers du sein ; HER1 est surexprimé dans 35-60 % des cancers ovariens, dans 70-100 % des cancers de la tête et du cou et dans 50-90% des cancers du poumon non à petites cellules. Les tumeurs gastro-intestinales, par contre, semblent être induites par des mutations ponctuelles dans le gène du récepteur du PDGF ( Platelet-Derived Growth Factor ), R-PDGF. Parmi les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance activant la voie PI3K-Akt-mTOR, on peut notamment citer : - L'imitanib (STI-571), qui a la capacité d'inhiber c-Kit, R-PDGF et la protéine de fusion Bcr-Abl. De par ses propriétés, l'imitanib s'est révélé particulièrement efficace contre les leucémies chroniques myéloïdes (CMML) et les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) ; - Le trastuzumab, qui est un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur 25 HER2 qui joue un rôle majeur dans la dérégulation de la prolifération de certains modèles de cancers du sein (représentés par la lignée MCF-7) ; - Le gefitinib et l'erlotinib, qui sont des inhibiteurs de l'activité kinase du REGF, HER1 ; - Le cetuximab, le panitunumab et le matuzumab, qui sont des anticorps 30 monoclonaux dirigés contre le récepteur HER1 ; - Les molécules et anticorps de seconde génération inhibant l'activité des récepteurs de facteurs de croissance mutés ou dérégulés dans les cellules tumorales, tels que par exemple le lapatinib et le vandetanib (ce dernier étant également dénommé ZD6474 ou XL647).

B1872FR 11 Palini ces inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance activant la voie PI3K-Akt-mTOR (c'est-à-dire en amont de la voie PI3K-Akt-mTOR), les inhibiteurs préférés sont ceux ciblant de façon préférentielle les récepteurs de facteurs de croissance présents et dérégulés dans la tumeur à traiter (par exemple, HER2 ou HER1, respectivement dans les cancers du sein ou du poumon). Parmi les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR utilisables dans la composition pharmaceutique conforme à l'invention, on peut notamment citer : - les inhibiteurs sélectifs de mTOR, tels que la rapamycine et l'everolimus, ce dernier étant préféré ; - des inhibiteurs sélectifs de Akt tels que GSK690693 et PTR 6164 (également connu sous le nom cholestéryl-O-CO-arginyl-prolyl-arginyl-norvalyltyrosyl-diaminopimélyl-Hol -NH) ; - des inhibiteurs sélectifs de PI3K tels que SF1126 et PX-866 ; - des inhibiteurs indirects de la voie PI3-Akt-mTOR agissant via l'inhibition du récepteur de type 1 du facteur de croissance insuline-like (R1-IGF) tels que par exemple NVP-ADW742 et NVP-AEW541, qui agissent en entrant en compétition avec l'ATP et qui inhibent la voie PI3K-Akt-mTOR respectivement au niveau de PI3K-Akt et de Akt-mTOR. Le rapport en poids du ou des inhibiteurs de Cdks tels que définis précédemment à l'inhibiteur de croissance cellulaire peut varier dans une très large proportion selon le génotype de la tumeur visée (en particulier selon le statut des gènes Rb/p53, Ink4a/Arf PI3K/PTEN et de ses récepteurs de facteurs de croissance et de survie). La composition pharmaceutique conforme à l'invention est destinée à être 25 administrée de préférence par voie systémique, telle que les voies sous-cutanée, intraveineuse et orale. Ladite composition phar rnaceutique peut donc se présenter sous des formes diverses telles que sous la forme de gélules, de capsules, de comprimés, de suspensions buvables, de tablettes, de solutions injectables ou sous toute autre

30 forme appropriée au mode d'administration par voie orale ou injectable. La nature du milieu pharmaceutiquement acceptable, éventuellement présent au sein de la composition pharmaceutique conforme à l'invention, variera bien entendu en fonction du mode d'administration et de la présentation galénique de ladite composition.

B1872FR 12 Le milieu pharmaceutiquement acceptable est généralement constitué d'un ou de plusieurs excipients classiquement utilisés pour la préparation de compositions pharmaceutiques, tels que des agents diluants et/ou liants, des agents de désintégration, des antiaggiomérants, des agents mouillants, des tampons, des antioxydants, des charges, des pigments, des colorants, des vitamines, des sels minéraux, des agents modifiants du goût, des agents de lissage, de montage, d'isolation, leurs mélanges, et de manière générale, tout excipient classiquement utilisé dans l'industrie pharmaceutique. Bien entendu, l'homme de l'art veillera à cette occasion à ce que le ou les 10 additifs éventuellement utilisés soient compatibles avec les propriétés intrinsèques attachées à la composition phalruaceutique conforme à l'invention. La composition pharmaceutique conforme à l'invention peut en outre renfermer un ou plusieurs principes actifs additionnels. La posologie est déterminée par le praticien en fonction de l'état du patient.

15 Ainsi, les doses efficaces globales du ou des inhibiteurs de Cdks tels que définis précédemment, associés à au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire, pourront varier dans de larges proportions allant par exemple de 10 à 150 mg par kilo et par jour pour chaque type d'inhibiteur. Selon une forme particulière de réalisation de l'invention, le traitement peut

20 comprendre une phase préalable d'administration d'une composition pharmaceutique contenant uniquement un inhibiteur de la croissance cellulaire choisi parmi les inhibiteurs de la croissance cellulaire utilisables dans les compositions pharmaceutiques conformes à l'invention, par exemple pendant une période variable (5-15 jours) précédant une phase d'administration d'au moins 5

25 jours consécutifs de la composition pharmaceutique conforme à l'invention, c'est-à-dire contenant l'association d'au moins un inhibiteurs de la croissance cellulaire tel que défini précédemment et d'au moins inhibiteur de Cdks tel que défini précédemment. Après une période de récupération de plusieurs jours (visant essentiellement à laisser récupérer les tissus sains) le même protocole pourra être

30 répété à plusieurs reprises. Etant donné les résultats spectaculaires et inattendus obtenus in vitro avec les compositions pharmaceutiques conformes à l'invention, lesdites compositions pharmaceutiques apparaissent donc comme des traitements anti-cancéreux particulièrement actifs et sélectifs non seulement d'un type de tumeurs donné par

35 rapport à un autre, mais également des cellules tumorales en général par rapport aux cellules normales de l'organisme.

B1872FR 13 Les cibles visées par ladite composition pharmaceutique ne sont pas spécifiques d'une localisation tumorale. En ce qui concerne les inhibiteurs de la croissance cellulaire, ils ciblent des points clés de la voie PI3K-Akt-mTOR qui conduit à la synthèse des protéines ribosomales et des régulateurs du cycle en réponse à la réception de facteurs de croissance, de division et de survie, relayée par les récepteurs à activité tyrosine kinase ancrés à la surface des cellules. En ce qui concerne les inhibiteurs de Cdks, ils ciblent les complexes cycline-Cdks qui régulent la progression dans le cycle de toutes les cellules de l'organisme. C'est pourquoi ladite composition phannaceutique peut être efficace dans plusieurs types

lo de cancers constitués de cellules porteuses d'un ensemble de dérégulations similaires dans la voie PI3K-Akt-mTOR et dans leur cycle de division. Ainsi, l'invention a également pour objet l'association d'au moins i) un inhibiteur de protéines kinases cycline-dépendantes tel que défini précédemment et d'au moins ii) un inhibiteur de la croissance cellulaire choisi parmi : 15 ii-a) les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance, activant la voie PI3K-Akt-mTOR ; ii-b) les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR ; pour une utilisation à titre de médicament anti-cancéreux. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins i) un inhibiteur de 20 protéines kinases cycline-dépendantes tel que défini précédemment et d'au moins ii) un inhibiteur de la croissance cellulaire choisi parmi : ii-a) les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance, activant la voie PI3K-Akt-mTOR ; ii-b) les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR ; 25 pour la préparation d'un médicament anti-cancéreux. Selon une forme de réalisation particulière de cette utilisation, lorsque le médicament est destiné au traitement des tumeurs dont le génotype, relatif au statut des gènes Rb/p53, Ink4a/Arf, PI3K/PTEN et de leurs récepteurs de facteurs de croissance et de survie, ressemble à celui des cellules tumorales témoins

30 MCF-7(Rb+/p53+), l'inhibiteur de Cdks est choisi parmi les composés I-1 à I-6. Dans ce cas, l'inhibiteur de la croissance cellulaire est préférentiellement choisi parmi : - les inhibiteurs des récepteurs à l'EGF présents et dérégulés dans la tumeur à traiter (par exemple, HER2 ou HER1, respectivement dans les cancers du sein ou 35 du poumon), B1872FR 14 - la rapamycine ou l'everolimus, - les inhibiteurs directs ou indirects des protéines kinases PI3K et/ou Akt. Selon cette forme de réalisation particulière, l'inhibiteur de Cdks est préférentiellement le (3R, 5)-1-[6-(3,4-méthylènedioxo-benzylamino)-9-isopropyl-5 9H-purin-2-yl]-3-méthyl-pent-l-yn-3-ol (composé I-1). Selon une autre forme de réalisation particulière de cette utilisation, lorsque le médicament est destiné au traitement des tumeurs dont le génotype, relatif au statut des gènes Rb/p53, Ink4a/Arf, PI3K/PTEN et de leurs récepteurs de facteurs de croissance et de survie, ressemble à celui des cellules tumorales témoins

10 Saos-2(Rb-/p53-), l'inhibiteur de Cdks préféré est l'indirubine-3'-monoxime. Dans ce cas, l'inhibiteur de la croissance cellulaire est préférentiellement choisi parmi les inhibiteurs directs ou indirects des protéines kinases PI3K et/ou Akt. Selon l'invention, l'expression tumeurs dont le génotype, relatif au statut des gènes Rb/p53, Ink4a/Arf PI3K/PTEN et de leurs récepteurs de facteurs de

15 croissance et de survie, ressemble à celui des cellules témoins ... signifie que, dans ces tumeurs, les voies Rb, p53, et PI3K sont altérées au même niveau (ou à des niveaux voisins) que dans les cellules tumorales témoins (MCF-7 ou Saos-2). Ainsi, les tumeurs ressemblant aux MCF-7 sont porteuses de gènes Rb et p53 intacts et les voies Rb et p53 sont altérées à des niveaux variables en aval des

20 gènes ; elles sont également porteuses de dérégulations au niveau de leurs récepteurs de facteurs de croissance. Au contraire, dans les Saos-2, les gènes Rb et p53 sont détruits ce qui résulte en une dérégulation extrême non seulement des voies Rb et p53 mais également de la voie PI3K puisque Rb est un puissant répresseur de la transcription non seulement des gènes impliqués dans la régulation

25 du cycle mais aussi des gènes ribosomaux. La présente invention est illustrée par l'exemple de réalisation suivant, auquel elle n'est cependant pas limitée.

B1872FR 15 EXEMPLE Mise en évidence de la potentialisation des effets cytotoxiques d'un inhibiteur de Cdks conforme à l'invention par un inhibiteur de la croissance cellulaire

1) Matériel et méthodes

a Cellules et molécules testées Ont été utilisés dans cet exemple les trois types cellulaires suivants :

- la lignée MCF-7(Rb+/p53+) issue d'un carcinome mammaire humain, dans laquelle les gènes suppresseurs de tumeurs Rb et p53 sont intacts,

- la lignée Saos-2(Rb-/p53-) issue d'un ostéosarcome humain, dans laquelle 10 les gènes suppresseurs de tumeurs Rb et p53 sont détruits,

- les fibroblastes humains IMR-90(Rb+/p53+) non immortalisés et non transformés (cellules normales), Les différentes cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) (Invitrogen, France) additionné d'antibiotiques et de 10% 15 de sérum de veau foetal (SVF) dans un incubateur à 37°C sous atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. Les différents dérivés de purine conformes à l'invention (composés de formules (I-1), (I-2) et (I-3) et les dérivés de purine utilisés à titre comparatif (composés C-1 à C-4, C-6 à C-11 et C-13 à C-16) ont été synthétisés selon les 20 méthodes décrites dans les articles de Legraverend M. et al., 2000 et 2001 (ibid) et de Ducrot et al., 2003 (ibid).

La roscovitine (composé C-5), le purvalanol A (composé C-12), l'indirubine-3'-monoxime ont été obtenus chez Calbiochem (VWR International S.A.S., France).

25 La mitomycine C a été obtenue chez Sigma (L'Isle d'Abeau Chesnes, France). Le tableau 1 ci-après regroupe les formules chimiques des composés testés dans cet exemple : composés conformes à l'invention de formules (I-1), (I-2) et (I-3) et indirubine-3'-monoxime, et composés comparatifs C-1 à C-17.

B1872FR 16 Tableau 1 CI N

NH N ~(\ C-5 (Roscovitine) H3C HO (R) CI (R) N OH OH (R) N N OH NH H,CO C-8 NH N/~N (R,S) .I \% C N N H, CH, H,C H3C OH N N/N / ~CH3 --OH H3C OH N OH Il / C.14 NH N (R.S) N N '''-- 55--N H,C III H,C OH H,C CI CI C-10 NH

(R) N N N~N )--CH, OH H3C N CI OH O C-17 (mitomicyne C) ~ Etude de la viabilité cellulaire --------------------------- En routine, la viabilité cellulaire a été mesurée par le test d'exclusion du bleu Trypan. Au temps désiré (avant ou après l'ajout du composé à tester), le milieu contenant les cellules flottantes était collecté et les cellules adhérentes étaient été détachées par trypsinisation et mélangées au milieu contenant les cellules flottantes. Un volume égal d'une solution de bleu de Trypan à 0,125 % (Sigma) a été ensuite ajouté à un aliquote de l'ensemble des cellules en suspension. La viabilité cellulaire était mesurée en comptant, sous un microscope, le io pourcentage de cellules non colorées (vivantes) par rapport au nombre total de B1872FR 17 cellules déposées dans l'hémacytomètre. Pour chaque point, une valeur moyenne de la viabilité a été obtenue à partir d'au moins cinq comptages effectués sur différentes zones de l'hémacytomètre contenant environ 100 cellules. c.) Etude de l'action_des composés sur la viabilité cellulaire L'effet des composés listés ci-dessus dans le tableau 1 sur la viabilité cellulaire dans les trois types cellulaires sélectionnés a été étudié en suivant un protocole expérimental rigoureux : les cellules étaient collectées après trypsinisation et transférées dans les puits d'une plaque à 24 puits (de 2 cm de diamètre chacun) à deux densités différentes, à savoir 6000 cellules et 8000 cellules par puits dans un milieu DMEM additionné de 5 % de SVF à 37°C. Après 24 h, le milieu était enlevé des puits et remplacé par des milieux DMEM à 10 % SVF (DMEM 10 % SVF) dans les puits contenant initialement 6000 cellules et DMEM à 0,5 % de SVF (DMEM 0,5 % SVF) dans les puits contenant initialement 8000 cellules. En opérant de cette façon, la densité moyenne de cellules dans chaque puits au moment de l'application du composé à tester, deux jours plus tard, atteignait 30 000 à 35 000 cellules. En culture, le taux d'approvisionnement des cellules en facteurs de croissance et de survie dépend de la teneur du milieu en SVF. La baisse de 10 % à 0,5 % de la teneur en SVF du milieu de culture permet donc de mimer les conditions de culture qui seraient réunies si l'on exposait les cellules à un inhibiteur de la croissance cellulaire. Les effets toxiques des composés sur les trois types cellulaires sélectionnés et dans les deux conditions expérimentales (DMEM 10 % SVF versus DMEM 0,5 % SVF) ont été étudiés à deux concentrations différentes (20 et 40 M).

La viabilité des cellules a été mesurée par le test d'exclusion du bleu trypan, décrit précédemment, tous les jours après l'addition des composés à tester et sur une période de 2 ou 3 jours pour chaque type cellulaire. 2) Résultats Les résultats des expériences sont présentés sous forme de diagrammes dans 30 les figures 2 et 3 annexées. Chaque diagramme correspond aux résultats obtenus pour un composé testé (à 20 ou 40 M) sur les trois types cellulaires sélectionnés (MCF-7, Saos-2 et IMR- 90). Sur chaque diagramme et pour chaque type cellulaire, le pourcentage de cellules survivantes à deux temps différents (24 h et 48 h) dans le milieu DMEM 35 10 % SVF correspond aux barres hachurées et le pourcentage de cellules B1872FR 18 survivantes aux mêmes temps dans le milieu DMEM 0,5 % SVF correspond aux barres pleines. L' observation de ces diagrammes révèle de façon frappante et inattendue que le degré d'amplification des effets toxiques d'un dérivé de la famille des purines obtenu dans des conditions mimant l'exposition à un inhibiteur de la croissance cellulaire dépend à la fois du type cellulaire et de différences de structure subtiles entre les dérivés de cette famille. Ainsi, le composé I-3 (figure 2, diagrammes de gauche, 1 eT rang) qui porte sur le noyau purine un groupement pyrrolidine-méthanol en position 2 et un noyau benzylamine en position 6 et qui présente un profil de toxicité proche de celui de la roscovitine/seliciclib (figure 2, diagrammes de gauche, 6ème rang) en milieu DMEM 10 % SVF vis-à-vis des trois types cellulaires testés, est quasiment inerte sur les les Saos-2 et les IMR-90 à la concentration de 20 M, alors qu'il éradique environ 50 % d'une population de cellules MCF-7 en 48 h (versus 40 % pour la roscovitine). En milieu DMEM 0,5 % SVF, ses effets toxiques à 20 M sont fortement augmentés sur les MCF-7 (dont la viabilité chute de 50 % à environ 5 % après 48 h de traitement) alors que les effets toxiques de la roscovitine (composé C-5) sur les mêmes cellules et dans le même milieu sont à peine accrus (la viabilité chute de 60 % à environ 55 % après 48 h de traitement). Par contre, les effets toxiques du composé I-3 à 20 M sur les Saos-2 et les IMR-90, comme ceux de la roscovitine, restent négligeables dans ces conditions. Si l'on double la concentration du composé I-3 (40 M), ses effets toxiques sont fortement accrus sur les MCF-7 en milieu DMEM 10 % SVF et encore plus en milieu DMEM 0,5 % SVF alors que doubler la concentration de roscovitine n'augmente que de façon assez modeste ses effets toxiques sur les MCF-7 dans les deux conditions. A 40 M, des effets toxiques significatifs du composé I-3 apparaissent en milieu DMEM 0,5 % SVF sur les Saos-2 (viabilité d'environ 20 % après 48 h de traitement) alors qu'ils restent très faibles en milieu DMEM 10 % SVF ; les effets toxiques de la roscovitine (composé C-5) sur les mêmes cellules restent modestes même en milieu DMEM 0,5 % SVF (viabilité d'environ 80 % après 48 h de traitement). A 40 M toutefois, les effets toxiques du composé I-3 restent négligeables sur les cellules normales témoins IMR-90 en milieu DMEM 10 % SVF et ils sont relativement peu amplifiés en milieu DMEM 0,5 % SVF (viabilité d'environ 75 % B1872FR 19 après 48 h de traitement) ; des effets toxiques comparativement plus importants apparaissent en milieu DMEM 0,5 % SVF en présence de 40 M de roscovitine (viabilité d'environ 60 % après 48 h de traitement). Les composés comparatifs C-1 et C-2 (figure 2, diagrammes de gauche, 2ème et 3ème rangs) diffèrent du composé I-3, respectivement par la présence de deux atomes de chlore en méta et para et d'un chlore en para sur le noyau benzylamine en position 6. En milieu DMEM 10 % SVF, à 40 M comme à 20 M, leurs effets toxiques vis-à-vis des trois types cellulaires testés sont relativement modestes et comparables à ceux du composé I-3, mis à part qu'ils sont nettement plus toxiques dès 20 M sur les cellules MCF-7 (viabilité d'environ 10 % en présence des composés C-1 ou C-2 versus environ 50 % en présence du composé I-3 après 48 h de traitement). Toutefois, en milieu DMEM 0,5 % SVF, les effets toxiques des composés C-1 et C-2 sont amplifiés de façon spectaculaire, indistinctement sur les trois types 15 cellulaires testés, dès 20 M. Des résultats analogues ont été obtenus avec des dérivés portant, à la place d'atomes de chlore, un groupement trifluorométhyle en méta ou en para sur le noyau benzylamine en position 6. Le remplacement des atomes ou substituants halogénés sur le noyau benzylamine en position 6 par un groupe dioxol (composé C-3 ; figure 2, 20 diagrammes de gauche, 4ème rang) ou par un méthoxy en para (composé C-4 ; figure 2, diagrammes de gauche, Sème rang) ou deux méthoxy, donne des composés dont le profil de toxicité vis-à-vis des cellules MCF-7 est assez similaire à celui des composés C-1 et C-2 mais qui, à 20 M en milieu DMEM 0,5 % SVF, sont sensiblement moins toxiques sur les Saos-2 et encore moins sur les IMR-90. A 25 40 M toutefois, leurs effets toxiques en milieu DMEM 0,5 % SVF rejoignent ceux des composés C-1 et C-2. De façon tout aussi remarquable, le remplacement en position 2 du groupement pyrrolidine-méthanol dans les composés précédents par un groupement pyrrolidine-alcool donne des composés en général moins toxiques. Ainsi, les profils 30 de toxicité des composés I-1 (figure 2, diagrammes de droite, 4eme rang) et C-3 vis-à-vis des trois types cellulaires testés sont très voisins à 20 M, mis à part que C-3 est nettement plus toxique en milieu DMEM 0,5 % SVF sur les cellules MCF-7 (viabilité < 5 % en présence de C-3 versus environ 25 % en présence du composé I-1 après 48 h de traitement). 35 Toutefois, à 40 M en milieu DMEM 0,5 % SVF, les effets toxiques du composé I-1 sont accrus sélectivement dans les cellules tumorales MCF-7 et Saos-2 B1872FR 20 mais absolument pas dans les fibroblastes normaux IMR-90 alors que ceux du composé C-3 sont accrus sans distinction et de façon spectaculaire dans les trois types cellulaires. Si l'on compare les composés I-1 et I-3 à la roscovitine (composé C-5), on constate que le degré d'amplification des effets toxiques des deux premiers, obtenu en milieu DMEM 0,5 % SVF dans les deux types tumoraux testés (MCF-7 et Saos-2), est nettement supérieur à celui de la roscovitine alors qu'il est moindre dans les fibroblastes normaux IMR-90. Enfin, les diagrammes obtenus pour l'indirubine-3'-monoxime (figure 3, 10 diagrammes de gauche, 5ème rang) montrent deux résultats particulièrement frappants : • la potentialisation de ses effets toxiques obtenue en milieu DMEM 0,5 % SVF est nettement plus importante dans les cellules tumorales Saos-2 (Rb7p53) que dans les MCF-7 (Rb+/p53+) alors que la réciproque est vraie

15 dans le cas des dérivés de purine sélectionnés I-1, I-2 (figure 3, diagrammes de gauche, 1" rang) et I-3. • d'autre part, à 40 M en milieu DMEM 0,5 % SVF, ses effets toxiques sur les fibroblastes normaux IMR-90 sont insignifiants alors que, sur les Saos-2, ils sont déjà très importants (viabilité d'environ 15 % après 24 h de

20 traitement). Ces résultats démontrent que les deux types d'inhibiteurs de Cdks utilisables conformément à la présente invention, présentent une activité anti-tumorale sélectivement accrue vis-à-vis d'un type de cellules tumorales donné lorsqu'ils sont utilisés dans des conditions mimant l'exposition à un inhibiteur de la croissance

25 cellulaire. Non seulement, ils sont capables d'induire l'apoptose d'un type de cellules tumorales donné préférentiellement à un autre (MCF-7 (Rb+/p53+) pour les premiers versus Saos-2 (Rb7p53-) pour l'indirubine-3'-monoxime), mais leurs effets toxiques vis-à-vis des fibroblastes normaux IMR-90 sont négligeables à des concentrations où ils sont déjà très importants vis-à-vis des cellules tumorales. 30 A titre comparatif, les composés C-1 à C-17, dont la structure chimique est extrêmement proche de celle des inhibiteurs de Cdks utilisables conformément à l'invention, ne sont pas aussi performants dans les mêmes conditions, soit parce qu'ils ne sont pas assez toxiques vis-à-vis des cellules tumorales (par exemple, les composés C-6, C-9 et C-13), soit parce qu'ils ne sont pas assez sélectifs des

35 cellules tumorales et qu'ils sont tout aussi toxiques pour les cellules saines témoins que pour les cellules tumorales.

B1872FR 21 A titre comparatif également, la roscovitine (composé C-5) qui appartient aussi à la famille des purines, est nettement inférieure aux inhibiteurs de Cdks utilisables conformément à la présente invention dans des conditions mimant l'exposition des cellules à un inhibiteur de la croissance cellulaire, à la fois en termes d'efficacité vis-à-vis des deux types tumoraux testés et en termes de différentiel de toxicité vis-à-vis des cellules tumorales et vis-à-vis des cellules saines testées. Enfin, il a été vérifié avec l'indirubine-3'-monoxime et le composé I-2 que leurs effets toxiques synergiques obtenus en baissant la teneur en SVF du milieu de culture de 10 % à 0,5 % étaient également obtenus lors de l'exposition concomitante des cellules en milieu DMEM 10 % SVF à un inhibiteur de la croissance cellulaire, en l'occurrence LY294002 à 20 M (le 4-2-(4-morpholinyl)-8-phényl-4H-l-benzopyran-4-one) qui est un inhibiteur direct de la PI3K.

Claims (17)

1. REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principes actifs : i) au moins un inhibiteur de protéines kinases cycline-dépendantes choisi parmi : i-a) l'indirubine-3'-monoxime et, i-b) les dérivés de purine choisis dans le groupe constitué par : - le (3R, S)-1-[6-(3,4-méthylènedioxo-benzylamino)-9-isopropyl-9H-10 purin-2-yl]-3-méthyl-pent-1-yn-3-ol (composé I-1), - le (2R)-[ 1-(9-isopropyl-6-phénylamino-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-2), - le (2S)-[ 1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-3), 15 - le (2R)-[1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl] -méthanol (composé I-4), - le (2R)- { 1-[9-isopropyl-6-(3-méthoxy-benzylamino)-9H-purin-2-yl]-pyrrolidin-2-yl} -méthanol (composé I-5), - le (2R)- { 1-[6-(3,5-diméthoxy-benzylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-20 yl]-pyrrolidin-2-yl}-méthanol (composé I-6), et leurs énantiomères ; et ii) au moins un inhibiteur de la croissance cellulaire choisi parmi : ii-a) les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance, activant la voie PI3K-Akt-mTOR, et 25 ii-b) les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR ; en présence ou non d'un milieu pharmaceutiquement acceptable.
2. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance activant la voie PI3K-AktmTOR, sont choisis parmi l'imitanib, R-PDGF et la protéine de fusion Bcr-Abl ; le 30 trastuzumab ; le gefitinib et l'erlotinib ; le cetuximab, le panitunumab et le matuzumab ; le lapatinib et le vandetanib.B1872FR 23
3. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR sont choisis parmi les inhibiteurs sélectifs de mTOR, les inhibiteurs sélectifs de Akt, les inhibiteurs sélectifs de PI3K et les inhibiteurs indirects de la voie PI3-Akt-mTOR agissant via l'inhibition du récepteur de type 1 du facteur de croissance insuline-like .
4. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que les inhibiteurs sélectifs de mTOR sont choisis parmi la rapamycine et l'everolimus.
5. 5. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que les inhibiteurs sélectifs de Akt sont choisis parmi GSK690693 et PTR 6164.
6. 6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que les inhibiteurs sélectifs de PI3K sont choisis parmi SF1126 et PX-866.
7. 7. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdits inhibiteurs indirects de la voie PI3-Akt-mTOR sont choisis parmi NVP-ADW742 et NVP-AEW541.
8. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la foune de gélules, de capsules, de comprimés, de suspensions buvables, de tablettes, de solutions injectables ou sous toute autre forme appropriée au mode d'administration par voie orale ou injectable.
9. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'un ou plusieurs excipients choisis pari les agents diluants et/ou liants, les agents de désintégration, les antiagglomérants, les agents mouillants, les tampons, les antioxydants, les charges, les pigments, les colorants, les vitamines, les sels minéraux, les agents modifiants du goût, les agents de lissage, de montage, d'isolation, et leurs mélanges.
10. 10. Association d'au moins i) un inhibiteur de protéines kinases cyclinedépendantes choisi parmi : i-a) l'indirubine-3'-monoxime et, i-b) les dérivés de purine choisis dans le groupe constitué par : - le (3R,5)-1-[6-(3,4-méthylènedioxo-benzylamino)-9-isopropyl-9H- purin-2-yl]-3-méthyl-pent-l-yn-3-ol (composé I-1), - le (2R)-[ 1-(9-isopropyl-6-phénylamino-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2- yl]-méthanol (composé I-2),B1872FR 24 - le (2S)-[ 1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-3), - le (2R)-[ 1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-4), - le (2R)- { 1 - [9-isopropyl- 6-(3-méthoxy-benzylamino)-9H-purin-2-yl]- pyrrolidin-2-yl}-méthanol (composé I-5), - le (2R)- { 1 - [6-(3,5-diméthoxy-benzylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-yl]-pyrrolidin-2-yl} -méthanol (composé I-6), et leurs énantiomères ; et d'au moins ii) un inhibiteur de la croissance cellulaire 10 choisi parmi : ii-a) les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance activant la voie PI3K-Akt-mTOR, et ii-b) les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR, pour une utilisation à titre de médicament anti-cancéreux. 15
11. 11. Utilisation d'au moins i) un inhibiteur de protéines kinases cycline- dépendantes choisi parmi : i-a) l'indirubine-3'-monoxime et, i-b) les dérivés de purine choisis dans le groupe constitué par : - le (3R, S)-1-[6-(3,4-méthylènedioxo-benzylamino)-9-isopropyl-9H-20 purin-2-yl]-3-méthyl-pent-l-yn-3-ol (composé I-1), - le (2R)-[ 1-(9-isopropyl-6-phénylamino-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-2), - le (2S)-[ 1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2-yl]-méthanol (composé I-3), 25 - le (2R)-[1-(6-benzylamino-9-isopropyl-9H-purin-2-yl)-pyrrolidin-2- yl]-méthanol (composé I-4), - le (2R)- { 1-[9-isopropyl-6-(3-méthoxy-benzylamino)-9H-purin-2-yl]-pyrrolidin-2-yl} -méthanol (composé I-5), - le (2R)- { 1-[6-(3,5-diméthoxy-benzylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-30 yl]-pyrrolidin-2-yl}-méthanol (composé I-6), et leurs énantiomères ; et d'au moins ii) un inhibiteur de la croissance cellulaire choisi parmi :B1872FR 25 ii-a) les inhibiteurs des récepteurs de facteurs de croissance activant la voie PI3K-Akt-mTOR, et ii-b) les inhibiteurs de la voie PI3K-Akt-mTOR, pour la préparation d'un médicament anti-cancéreux.
12. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement des tumeurs dont le génotype, relatif au statut des gènes Rb/p53, Ink4a/Arf PI3K/PTEN et de leurs récepteurs de facteurs de croissance et de survie, ressemble à celui des cellules tumorales témoins MCF-7(Rb+/p53+), et en ce que l'inhibiteur de Cdks est choisi parmi les composés I-1 à I-6.
13. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la croissance cellulaire est choisi parmi les inhibiteurs des récepteurs à l'EGF présents et dérégulés dans la tumeur à traiter ; la rapamycine ou l'everolimus ; et les inhibiteurs directs ou indirects des protéines kinases PI3K et/ou Akt.
14. 14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que l'inhibiteur de Cdks est le (3R,5)-1-[6-(3,4-méthylènedioxo-benzylamino)-9-isopropyl-9H-purin-2-yl] -3-méthyl-pent-l-yn-3-ol (composé I-1).
15. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que les inhibiteurs des récepteurs à l'EGF présents et dérégulés dans la tumeur à traiter sont choisis parmi les inhibiteurs de HER2 et les inhibiteurs de HER1.
16. 16. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement des tumeurs dont le génotype, relatif au statut des gènes Rb/p53, Ink4a/Arf, PI3K/PTEN et de leurs récepteurs de facteurs de croissance et de survie, ressemble à celui des cellules tumorales témoins Saos-2(Rb-/p53-) et en ce que l'inhibiteur de Cdks est l'indirubine-3'-monoxime.
17. 17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la croissance cellulaire est choisi parmi les inhibiteurs directs ou 30 indirects des protéines kinases PI3K et/ou Akt.