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FR2815970A1 - Sequences polymorphes du gene humain abca1, leurs utilisations, les methodes et kits de detection - Google Patents

Sequences polymorphes du gene humain abca1, leurs utilisations, les methodes et kits de detection Download PDF

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FR2815970A1
FR2815970A1 FR0014037A FR0014037A FR2815970A1 FR 2815970 A1 FR2815970 A1 FR 2815970A1 FR 0014037 A FR0014037 A FR 0014037A FR 0014037 A FR0014037 A FR 0014037A FR 2815970 A1 FR2815970 A1 FR 2815970A1
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FR
France
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sep
nucleic acid
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nucleotide
polymorphism
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Patrice Denefle
Montus Marie Francoise Rosier
Reguigne Isabelle Arnould
Nicolas Duverger
Francois Cambien
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Aventis Pharma SA
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Aventis Pharma SA
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Abstract

La présente invention a pour objet des acides nucléiques isolés codant pour la protéine transporteur ABCA1 et comportant des variations polymorphes de séquence, ainsi que des polypeptides dérivés du transporteur humain ABCA1 et contenant des acides aminés polymorphes. L'invention a également pour objet des amorces et des sondes spécifiques d'allèle qui s'hybrident à des régions flanquant ou contenant ces sites ou positions polymorphes, des procédés et des kits ou nécessaires permettant d'analyser les écarts d'allélisme affectant le gène ABCA1, et enfin l'utilisation des polymorphismes du gène humain ABCA1 pour le diagnostic, d'une maladie ou d'une prédisposition à une maladie, en particulier liée à la concentration de HDL (High Density Lipoprotein) cholestérol plasmatique, comme par exemple c'est le cas des déficiences familiales en HDL comme la maladie de Tangier, de l'infarctus du myocarde, de l'athérosclérose, et d'autres affections cardiovasculaires.

Description

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Figure img00010001
La présente invention a pour objet des polymorphismes du gène ABCA1 humain et les nouveaux allèles polypeptidiques codés par les différentes séquences présentant les variations alléliques. L'invention concerne également des procédés ainsi que des kits destinés à l'analyse des variations alléliques dans le gène ABCAI humain, et l'utilisation du polymorphisme ABCAI pour le diagnostic et le traitement des affections cardiovasculaires telles que les risques d'infarctus du myocarde, l'athérosclérose, et la maladie deTangier.
ABC 1 est membre de la superfamille des protéines transporteurs ABC (ATP Binding Cassette) qui sont impliqués dans le transport des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdes. (Dean et al. Curr. Opin. Genet. 5 (1995) 779-785 ; Decocottignies et al. Nat. Genet. Dev., 15 (1997) 137-145 ; Allikmets et al., Hum. Mol. Genet., 5 (1996) 1649-1655).
Les membres de cette famille de transporteur qui sont d'une part extrêmement conservés au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme, présentent d'autre part une structure générale commune caractérisée par deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucléotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs Walker A et B ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de plusieurs hélices. La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées apparaît être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF.
Le transport du cholestérol du foie aux tissus et inversement est assuré par les deux complexes lipoprotéiques que sont les LDLs (Low Density Lipoprotein) et
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les HDLs (High Density Lipoprotein). Les LDLs alimentent les tissus en cholestérol alors qu'au contraire les HDL conduisent le cholestérol en excès formé dans les tissus jusqu'au foie. Au cours du transport, le cholestérol est acylé par transfert des acides gras des lécithines par l'action de l'enzyme phosphatidyl-stérol-acyltransférase (LCAT).
Il est maintenant clairement établi chez les patients présentant de faibles taux de HDLs plasmatiques, que les taux élevés de LDL conduisent à une accumulation de cholestérol au'niveau des vaisseaux et une probabilité d'apparition d'insuffisances coronariennes (Castelli et al., Jama (1986) 256 (20), 2835-8). En effet, une élimination plus lente du cholestérol en excès dans les tissus favorise la formation de plaques artérielles, et à terme le risque d'attaque cardiaque, d'une angine de poitrine, ou bien d'une affection du système artériel périphérique.
Ces complexes lipoprotéiques LDLs et HDLs, qui interviennent donc respectivement dans les mécanismes d'afflux et d'efflux du cholestérol, du foie aux tissus ou inversement, présentent une structure sphérique de densité différente, qui se compose essentiellement d'un noyau de lipides apolaires constitués de triacylglycérols et d'esters de cholestérol, et d'une couronne constituée d'apolipoprotéines et de lipides amphiphiles.
Il est généralement admis que l'efflux de cholestérol des tissus vers le foie, est réalisé par deux voies différentes. Une première voie dite passive favorise l'efflux de cholestérol de la membrane plasmique aux HDLs, alors que la deuxième voie est énergie-dépendante, et utilise notamment l'apolipoprotéine A-I (Apo-AI) des HDL naissants, qui est vraisemblablement reconnue et se lie à des récepteurs membranaires cellulaires afin de permettre la translocation du cholestérol en excès aux particules HDLs (Rothblat et al. J. Lipid. Res. (1999) 40 (5) 781-96). Il a été récemment
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démontré en particulier que les fibroblastes et les macrophages sont le siège d'une translocation active de cholestérol utilisant des apolipoprotéines pauvres en lipides telles que Apo-1, ApoA-II, et Apo-E (Yokoyama S., Biochim. Biophys. Acta (1998) 1392 (1), 1-15 ; Takahashi et al., PNAS (1999) 96 (20), 11358-63).
Diverses maladies liées à une déficience en HDL, et notamment de la voie active de translocation de cholestérol, ont été décrites. Il s'agit notamment de la
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maladie de Tangier et de la déficience familiale en HDL (FHD) (Remaley et al., Arterioscl. Thromb. Vase. Biol. (1997) 17 (9) 1813-21 ; Marcil et al., Arterioscl. Thromb. Vase. Biol (1999) 19 (1), 159-69 ; Francis et al. (1995) J Clin. Invest. 96 (1), 78-87).
La maladie de Tangier semble en effet liée à un déficit cellulaire dans la voie active de translocation du cholestérol cellulaire, qui conduit à une dégradation des HDLs et à une perturbation du métabolisme lipoprotéique. En effet, les particules n'incorporant pas de cholestérol à partir des cellules périphériques et ne pouvant pas être métabolisées correctement, sont éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL circulante de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDLs n'assurent donc plus le retour du cholestérol vers le foie. Le cholestérol en excès accumulé dans les cellules et tissus périphériques provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation des amygdales orangées (Serfaty-Lacrosniere et al. (1994) Athérosclerosis 107 (1) 85-98).
Les affections familiales liées au métabolisme du HDL se caractérisent également par une faible concentration des particules de HDL, et sont le plus souvent détectées chez les patients affectés de maladies coronariennes (Marcil et al., The Lancet (1999) 354 (9187), 1341-6). Cet effet cardioprotecteur du HDL s'explique
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probablement par son implication dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie (Bruce et al. Annu. Rev. Nutr. (1998) 18, 297-3130).
Le produit du gène ABC 1 est susceptible de jouer un rôle dans la régulation du métabolisme cellulaire du cholestérol et dans le transport inverse de cholestérol et de phospholipides. A cet égard, il a été récemment démontré que le gène ABC 1 est un gène clé dans la voie active de translocation du cholestérol des cellules aux HDL. En effet, il a été observé que le transporteur ABCAI était muté chez les patients affectés dans le transport inverse du cholestérol, et notamment chez
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les patients atteints à la fois de la maladie de Tangier et de la déficience familiale en HDL (Lawn et al., J Clin. Invest. (1999) 104 (8) 125-31 ; Bodzioch et al., Nat. Genet.
(1999) 22 (4), 347-51 ; Orso et al., Nat. Genet. (2000) 24 (2), 192-6).
Par conséquent, la présence de mutations ou polymorphismes dans la séquence nucléotidique de ABCAI semble constituer au même titre que la concentration plasmatique de HDL, un bon facteur de risque permettant de dépister une affection coronarienne.
La forte incidence des maladies coronariennes qui est une principale cause de mortalité dans les pays développés montre clairement la nécessité de disposer d'outils de détection d'une part des polymorphismes alléliques du gène ABC1, ainsi que de compositions, de procédés et des kits permettant de diagnostiquer les risques coronariens ou une prédisposition à une maladie, en particulier liée à un déficit en HDL circulant, qui serait susceptible de conduire à une angine de poitrine, un infarctus du myocarde, une athérosclérose, ou une déficience familiale en HDL comme la maladie de Tangier, dont les symptômes sont décrits ci-avant.
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Le gène ABCA1 humain a été récemment cloné et caractérisé et est décrit notamment dans les demandes PCT/FR00/01595, EP99402668, et par SantamarinaFojo et al., PNAS (2000) 97 (14), 7987-7992). Il a une taille totale de 149kb, et comprend une séquence promotrice de 1,453kb, des séquences codante et intronique de 146,581 kb, et une région 3'de lkb. Il est constitué de 50 exons et donc de 49 introns. L'exon 1 code pour l'extrémité 5'non traduite (5'UTR) est suivi d'un grand intron de 24,156 kb de long, et l'exon 2 contient la partie restante de l'extrémité 5'UTR, et code pour les 21 premiers acides aminés de l'extrémité N terminale de la protéine ABC1. Le gène ABCA1 code pour la protéine transporteur ABCA1 de 2261 acides aminés. L'analyse de la séquence régulatrice en amont du gène humain
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ABCA1 a permis d'identifier une boite TATA (TCTATAAAAG) 33 pb en amont du site d'initiation de la transcription, de nombreux sites de liaison de facteurs de transcription ubiquitaires tels que SPI, NF-kB, des protéines activatrices (AP-1,-2, et
Figure img00050002

-4), et trois motifs E-box (5'-CANNTG-3'), ainsi que plusieurs sites de fixation de facteur nucléaire hépatocytaire (HNF)-3 (3.
Les demandeurs ont découvert de manière surprenante et inattendue un certain nombre de polymorphismes dans le gène humain codant pour le transporteur ABC1. Les demandeurs ont par ailleurs découvert une corrélation statistiquement significative entre la présence de certains polymorphismes alléliques du gène ABCA1 et la prédisposition d'un sujet à développer une pathologie coronarienne, telle que notamment un risque d'infarctus du myocarde.
La présente invention a donc pour objet des acides nucléiques isolés codant pour des variants polymorphes du transporteur ABCA1 humain, susceptibles d'être liés avec un risque coronarien, tel qu'un risque d'infarctus du myocarde, d'affection cardiovasculaire ou plus généralement toute affection due à une déficience en HDL.
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La présente invention a également pour objet les séquences polypeptidiques polymorphes du transporteur ABCA1 humain produites par les formes alléliques de ABCA1. En outre, la présente invention a pour objet des vecteurs recombinants comprenant ces acides nucléiques, des cellules comprenant les vecteurs, et les méthodes de production de polypeptides variants obtenus par culture des cellules dans des conditions permettant l'expression de ces polypeptides.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet des moyens de détection appropriés, sondes ou amorces, spécifiques de certains de ces polymorphismes dans le gène humain ABCA1, susceptibles d'être associés à des risques coronariens, tels que par exemple un risque d'infarctus du myocarde, ou à une réponse pharmacologique particulière vis-à-vis d'une molécule thérapeutique. La présente invention concerne également un procédé et des kits permettant de détecter une séquence des polymorphismes au niveau de la séquence du transporteur ABCA1 d'un sujet humain, et consiste à (i) isoler un échantillon d'ADN dudit sujet, (ii)
Figure img00060001

amplifier les régions contenant le gène ABCA1, (iii) déterminer la présence ou l'absence d'un ou plusieurs polymorphismes au niveau de la région d'ADN amplifiée.
De tels polymorphismes peuvent être liés à d'autres polymorphismes dans un profil polymorphe, qui est associé avec une prédisposition à une maladie ou à un désordre métabolique.
Encore selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode permettant de diagnostiquer le risque d'une affection cardiovasculaire chez un patient.
La méthode consiste à comparer deux profils polymorphes. Le premier profil est celui du patient que l'on souhaite tester, et le deuxième est un profil polymorphe de référence qui est dérivé d'une population d'individus témoins ayant un risque cardiovasculaire ou coronarien prédéterminé tel que par exemple un risque d'infarctus
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du myocarde. La comparaison entre les séquences polymorphes test et témoin donne une bonne indication du facteur de risque du sujet présentant une séquence polymorphe ABCA 1.
DEFINITIONS GENERALES
Les termes acide nucléique ou polynucléotide font référence à des polymères contenant des bases puriques et pyrimidiques. Il s'agit de polyribonucléotides, de polydésoxyribonucléotides, ou de polynucléotides mixtes polyribo-polydésoxyribonucléotides. Les acides nucléiques comprennent les molécules simple et double brins, de type ADN-ADN, ADN-ARN, et ARN, ou les protein nucleic acid (PNA) formés par conjugaison de bases à un squelette amino acide. Les acides nucléiques incluent également les molécules comprenant des bases modifiées et des liaisons phosphodiester analogues synthétiques, telles que les phosphorothioates et les thioesters. Le terme acide nucléique, en particulier les molécules d'ADN, d'ARN, font référence seulement à une structure primaire ou secondaire de la molécule, et n'est pas limitée par une configuration tertiaire particulière. Par conséquent, le terme inclue l'ADN double brin, qui se trouve entre autres dans les molécules d'ADN linéaire ou circulaire (dans les fragments de restriction), les plasmides, et les chromosomes. La structure des molécules d'ADN double brin sont décrites en utilisant la direction conventionnelle, c'est à dire 5'- > 3' du brin non transcrit de l'ADN ou brin sens (ayant une séquence homologue de l'ARNm). Une molécule d'ADN recombinant est une molécule d'ADN qui a été soumise à des manipulations de biologie moléculaire.
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On entend par acide nucléique ou un polypeptide isolé au sens de la présente invention, un acide nucléique ou un polypeptide qui a été soustrait à son environnement d'origine naturel. Un acide nucléique ou polypeptide isolé contient moins d'environ 50%, de préférence moins de 75%, et encore plus préférentiellement moins de 90% de composants cellulaires.
Un acide nucléique ou une séquence polypeptidique dérivée correspond à une région d'une séquence désignée particulière, et inclut pour les acides nucléiques, les séquences qui sont identiques ou complémentaires.
Aux fins de la présente invention, l'expression séquence nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique, englobe le matériel génétique lui-même, et n'est donc pas restreinte à l'information contenant sa séquence.
Au sens de la présente invention, le terme oligonucléotide fait référence à un acide nucléique, comprenant généralement au moins 10, de préférence 15, et plus préférentiellement au moins 20 nucléotides, qui est capable de s'hybrider à une molécule d'ADN génomique, à une molécule d'ARNm codant pour un gène, à un cDNA, ou toute autre molécule d'intérêt. Les oligonucléotides peuvent être marqués, par exemple avec des nucléotides 3P, ou des nucléotides sur lesquels sont fixés par liaison covalente, un marqueur fluorescent, ou un marqueur tel que la biotine.
L'oligonucléotide peut être une sonde capable de détecter la présence d'un acide nucléique. Alternativement, l'oligonucléotide peut être une amorce PCR, et peut être utilisée pour cloner la séquence complète ou un fragment d'un gène d'intérêt. L'oligonucléotide peut former en outre une triple hélice avec une séquence double brin d'intérêt sur une molécule d'ADN. Enfin, une banque d'oligonucléotides peut être fixée sur un support solide afin de détecter différents polymorphismes d'intérêt.
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Généralement, les oligonucléotides sont synthétiques, et peuvent comprendre des liaisons phosphodiester ou des liaisons thioester.
Une sonde fait référence à un acide nucléique ou à un oligonucléotide capable de s'hybrider à une séquence sur un acide nucléique cible du fait de la complémentarité d'au moins une partie de la sonde avec une séquence de l'acide nucléique cible. Cette sonde est généralement marquée afin d'être détectable après hybridation.
Une molécule d'acide nucléique s'hybride à une molécule d'acide nucléique, tel qu'un cDNA, un ADN génomique, ou un ARN, lorsque la forme simple brin de la molécule d'acide nucléique peut se stabiliser avec une autre molécule d'acide nucléique simple brin selon les conditions appropriées de température et de force ionique de la solution d'hybridation (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, New-York). Les conditions de température et de force ionique déterminent la stringence de l'hybridation.
On utilise pour un criblage préliminaire des acides nucléiques homologues, des conditions de basse stringence (température égale à 55 C, 5XSSC à 0, 1% SDS, 0,25 % lait, sans formamide ; ou 30% formamide, 5XSSC à 0, 5% SDS).
Pour des conditions modérées d'hybridation, on utilise une température plus élevée, avec 50% de formamide, et 5X ou 6XSSC. Bien que la réaction d'hybridation nécessite la complémentarité des acides nucléiques, des mésappariements entre les bases sont acceptables. La stringence adaptée à l'hybridation d'un acide nucléique dépend de la longueur de l'acide nucléique et du degré de complémentarité, qui sont des variables bien connues en biologie moléculaire. Plus le degré de similarité et
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Figure img00100001

d'homologie entre deux séquences nucléotidique est élevé, plus une température d'hybridation élevée peut être utilisée. Pour les hybrides ayant une taille supérieure à 100 nucléotides, le calcul de la température d'hybridation se fait par les équations décrites dans Sambrook et al. Pour l'hybridation d'acides nucléiques de taille inférieure, tels que les oligonucléotides, la position des mésappariements est importante, et la longueur de l'oligonucléotide détermine sa spécificité. Celui-ci a en général une longueur minimale de 10 nucléotides, de préférence au moins 15 nucléotides, et encore plus préférentiellement 20 nucléotides.
Pour des conditions d'hybridation de forte stringence, on utilise les conditions suivantes : 1-Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION : - Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (10mglml)
Figure img00100002

+ 40 ul ADN placentaire humain (1 Omg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger le mélange dans la glace.
- Oter le tampon 2X SSC et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2-Compétition de la sonde marquée : - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 gel ADN Cot I, selon la quantité d'hybridations non spécifiques.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.
- Incuber à 65'C pendant 2 à 5 heures.
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Figure img00110001

3-Hvbridation : - Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 ul ADN sperme de saumon + 40 ul ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot 1 dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.
4-Lavases : - Un lavage à température ambiante dans du 2xSSC, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante 2xSSC et 0, 1% SDS - 2 fois 15 minutes 0, lxSSC et 0, 1% SDS à 65 C.
Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (Eds., (1985)
Figure img00110002

Nucleic Acid hybridization, a practical approach, IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y).
Un gène fait référence à une séquence d'acide nucléique correspondant à une séquence présente dans le génome qui comprend (i) la région codante, qui comprend des exons, des introns, et des séquences à la jonction entre les exons et les introns, et (ii) des séquences de régulation en 5'et 3'de la région codante.
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Figure img00120001
On entend par transporteur ABCA1 la protéine transporteur ABCA1 ayant l'ADNc de séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 (Figure 1), et la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 (Figure 2). En outre, plusieurs séquences nucléotidiques génomiques partielles du gène ABCA1 ont été isolées et caractérisées, ces séquences génomiques comprenant à la fois des séquences exoniques et des séquences introniques. Certaines de ces séquences génomiques partielles sont représentées dans le tableau 1 ci-après.
Tableau 1
Séquences génomiques partielles du gène ABC1 humain
Figure img00120002
<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> Désignation
<tb> 3 <SEP> Promoteur <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> la, <SEP> intron <SEP> 1 <SEP> a <SEP> (p)
<tb> 4 <SEP> Intron <SEP> la <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> lb, <SEP> intron <SEP> lb <SEP> (p)
<tb> 5 <SEP> Intron <SEP> Ib <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 2, <SEP> intron <SEP> 2, <SEP> exon <SEP> 3,
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<tb> 9 <SEP> Intron <SEP> 8 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 9, <SEP> intron <SEP> 9, <SEP> exon <SEP> 10,
<tb> intron <SEP> 10 <SEP> (p)
<tb> 10 <SEP> Intron <SEP> 11 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 12, <SEP> intron <SEP> 12, <SEP> exon <SEP> 13,
<tb> intron <SEP> 13, <SEP> exon <SEP> 14, <SEP> intron <SEP> 14, <SEP> exon <SEP> 15,
<tb> intron <SEP> 15, <SEP> exon <SEP> 16, <SEP> intron <SEP> 16, <SEP> exon <SEP> 17,
<tb> intron <SEP> 17 <SEP> (p)
<tb> 11 <SEP> Intron <SEP> 17 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 18, <SEP> intron <SEP> 18 <SEP> (p)
<tb> 12 <SEP> Intron <SEP> 18 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 19, <SEP> intron <SEP> 19 <SEP> (p)
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Figure img00130001
<tb>
<tb> 13 <SEP> Intron <SEP> 19 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 20, <SEP> intron <SEP> 20, <SEP> exon <SEP> 21,
<tb> intron <SEP> 21, <SEP> exon <SEP> 22, <SEP> intron <SEP> 22, <SEP> exon <SEP> 23,
<tb> intron <SEP> 23, <SEP> exon <SEP> 24, <SEP> intron <SEP> 24, <SEP> exon <SEP> 25,
<tb> intron <SEP> 25, <SEP> exon <SEP> 26, <SEP> intron <SEP> 26 <SEP> (p)
<tb> 14 <SEP> Intron <SEP> 26 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 27, <SEP> intron <SEP> 27, <SEP> exon <SEP> 28,
<tb> intron <SEP> 28, <SEP> exon <SEP> 29, <SEP> intron <SEP> 29, <SEP> exon <SEP> 30,
<tb> intron <SEP> 30 <SEP> (p)
<tb> 15 <SEP> Intron <SEP> 30 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 31, <SEP> intron <SEP> 31, <SEP> exon <SEP> 32,
<tb> intron <SEP> 32, <SEP> exon <SEP> 33, <SEP> intron <SEP> 33, <SEP> exon <SEP> 34,
<tb> intron <SEP> 34 <SEP> (p)
<tb> 16 <SEP> Intron <SEP> 35 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 36, <SEP> intron <SEP> 36 <SEP> (p)
<tb> 17 <SEP> Intron <SEP> 36 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 37, <SEP> intron <SEP> 37, <SEP> exon <SEP> 38,
<tb> intron <SEP> 38 <SEP> (p)
<tb> 18 <SEP> Intron <SEP> 38 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 39, <SEP> Intron <SEP> 39 <SEP> (p)
<tb> 19 <SEP> Intron <SEP> 39 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 40, <SEP> intron <SEP> 40, <SEP> exon <SEP> 41,
<tb> intron <SEP> 41 <SEP> (p)
<tb> 20 <SEP> Intron <SEP> 44 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 45, <SEP> intron <SEP> 45 <SEP> (p)
<tb> 21 <SEP> Intron <SEP> 45 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 46, <SEP> intron <SEP> 46, <SEP> exon <SEP> 47,
<tb> intron <SEP> 47 <SEP> (p)
<tb> 22 <SEP> Intron <SEP> 48 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 49, <SEP> séquence <SEP> en <SEP> 3'du
<tb> dernier <SEP> exon
<tb>
Par polymorphisme mononucléotide ou SNP , on entend la substitution, l'insertion ou la délétion d'un simple nucléotide dans la séquence nucléotidique d'un gène entre plusieurs individus. Lorsque le polymorphisme se présente sous la forme d'une insertion ou d'une délétion, il peut s'agir d'une insertion ou d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides à une position d'un gène. Les différentes séquences nucléotidiques d'un même gène du fait d'un polymorphisme, sont des allèles.
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Figure img00140001
Une position polymorphe est une position prédéterminée dans la séquence d'un gène qui comprend un SNP. Dans certains cas, les polymorphismes génétiques provoquent une variation dans la séquence d'acides aminés, et donc d'une position polymorphe peut résulter en un polymorphisme dans la séquence amino acide à une position prédéterminée de la séquence du polypeptide. Un individu homozygote pour un polymorphisme particulier, porte sur les deux copies du même gène, la même séquence polymorphe à la même position. Un individu hétérozygote pour un polymorphisme particulier porte sur les deux copies du gène, des séquences différentes au niveau de la position polymorphe.
On entend par profil polymorphe , un ou plusieurs polymorphismes simple nucléotide, qui peut être présent sur la séquence d'un seul gène ou d'une pluralité de gènes. Un profil polymorphe simple comprend un SNP dans une seule position d'un ou de deux allèles d'un individu (polymorphisme allélique). Un profil polymorphe test correspond au polymorphisme caractéristique d'un individu qui fait l'objet d'un diagnostic par exemple d'une prédisposition à une maladie associée à une déficience du gène ABC1, telle qu'une déficience métabolique du type FHD ou une affection cardiovasculaire, ou un risque d'infarctus du myocarde. Le profil polymorphe de référence ou témoin a été déterminé par corrélation statistiquement significative des profils dans une population d'individus qui présentent un risque coronarien. POLYMORPHISMES DU GENE ABCA1
La présente invention est basée sur la découverte de 90 polymorphismes dans la séquence du gène humain ABCA1 telle que représentée aux séquences SEQ ID
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Figure img00150001

NO : 3-22, dont 22 SNPs sont trouvés dans la séquence promotrice en amont du gène ABCA1 humain de SEQ ID NO : 23. Certains SNPs selon la présente invention conduisent à des altérations structurales dans la séquence polypeptidique de la
Figure img00150002

protéine transporteur ABCA1 humaine représentée à la SEQ ID NO : 2.
Pour l'identification et la caractérisation d'ADN polymorphe de ABCA1, des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) ont été réalisées pour amplifier les séquences de ABCA1 à partir d'ADN génomique humain provenant de trois groupes ethniques différents, à savoir une population caucasienne, une population japonaise, et/ou une population africaine. Les produits de PCR sont séquencés, et les séquences sont comparées entre elles et avec les séquences de référence SEQ ID NO : 3-23.
Le tableau 2 présente les polymorphismes alléliques dans les exons et les introns du gène ABCA1 humain selon la présente invention. Il indique notamment la position polymorphe dans chacun des exons par rapport au premier nucléotide de l'exon de référence, et dans chacun des introns par rapport à l'extrémité 3'ou en amont de l'extrémité 5'de l'exon le plus proche, les séquences 5'et 3'de part et d'autre de la position polymorphe, la fréquence d'apparition du polymorphisme dans les trois populations testées, africaine, caucasienne et japonaise. Dans les cas où ces fréquences n'ont pu être déterminées, il est indiqué n. d. . Certains polymorphismes se traduisent par des altérations structurales dans la séquence peptidique de la protéine transporteur ABCA1 humaine, et plus précisément par la substitution d'un acide aminé par un autre (MIS). D'autres polymorphismes dans les séquences exoniques
Figure img00150003

sont dits silencieux (SIL), la séquence protéique ABCA1 restant inchangée. Enfin, lorsque le polymorphisme est localisé dans un intron ou dans un exon non codant, la séquence polymorphe est dite non codante (NCD). Les polymorphismes identifiés dans les différents exons et introns du gène ABCA1 sont décrits en détails ci-après.
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Tableau 2 Polymorphismes alléliques dans les exons et les introns du gène ABCA1 humain
Figure img00160001
<tb>
<tb> Fréquence <SEP> dans <SEP> population
<tb> Nom <SEP> Intron/Position <SEP> Séquence <SEP> 5'Allèle <SEP> Allèle <SEP> Séquence <SEP> 3'Type <SEP> Changement <SEP> Codon <SEP> Africaine <SEP> Caucasienne <SEP> Japonaise
<tb> Exon <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> peptidique
<tb> s-35ela <SEP> Exon <SEP> la <SEP> 35 <SEP> GGCCGGGACC <SEP> C <SEP> G <SEP> GCAGAGCCGA <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 4,84% <SEP> 0,00%
<tb> s-16elb <SEP> Exonlb <SEP> 16 <SEP> GACCAGCCACG <SEP> GGCGTCCCTG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 10,94% <SEP> 27,42%
<tb> s-76elb <SEP> Exon <SEP> lb <SEP> 76 <SEP> ACACGCTGGG <SEP> G <SEP> C <SEP> GTGCTGGCTG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 370,00% <SEP> 15,00%
<tb> s-m39i3 <SEP> Intron <SEP> 3 <SEP> -39 <SEP> GGCAGTTGGC <SEP> C <SEP> A <SEP> TAGCTAAAGC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 21, <SEP> 67% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-25i4Intron <SEP> 425TCTCTGCATC <SEP> C <SEP> T <SEP> GTTGAGAATG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 6, <SEP> 90% <SEP> 0,00% <SEP> 0, <SEP> 00%
<tb> s-53e5Exon <SEP> 553CTGGGTTCCT <SEP> G <SEP> A <SEP> TATCACAACC <SEP> SIL <SEP> 0 <SEP> 36, <SEP> 67% <SEP> 26,56% <SEP> 62,90%
<tb> s-108e6 <SEP> Exon <SEP> 6 <SEP> 108 <SEP> TTTGTGGCCT <SEP> A <SEP> G <SEP> CCAAGGGAGA <SEP> SIL <SEP> 217 <SEP> 3,45% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-113e6 <SEP> Exon <SEP> 6 <SEP> 113 <SEP> GGCCTACCAA <SEP> G <SEP> A <SEP> GGAGAAACTG <SEP> MIS <SEP> R <SEP> > <SEP> K <SEP> 219 <SEP> 61,67% <SEP> 20,37% <SEP> 46,55%
<tb> s-ml4i7 <SEP> Intron <SEP> 7-14 <SEP> TTCTGTCCCC"A <SEP> ATCCCTGACG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 67% <SEP> 12,07% <SEP> 63,33%
<tb> s-123e8Exon <SEP> 8123GCGGGCATCC <SEP> C <SEP> T <SEP> GAGGGAGGGG <SEP> SIL <SEP> 312 <SEP> 12,07% <SEP> 6,67% <SEP> 10,34%
<tb> s-135e8 <SEP> Exon <SEP> 8 <SEP> 135 <SEP> AGGGAGGGGG <SEP> G <SEP> A <SEP> CTGAAGATCA <SEP> SIL <SEP> 316 <SEP> 32,76% <SEP> 15,00% <SEP> 6,90%
<tb> s-m89i8 <SEP> Intron <SEP> 8-89 <SEP> TGGGGTTTCA <SEP> A <SEP> G <SEP> CTAAGAACTC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 33% <SEP> 0,00% <SEP> 0, <SEP> 00%
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
Figure img00170001

Fréquence dans population Nom Intron/Position Séquence 5'Allèle Allèle Séquence 3'Type Changement Codon Africaine Caucasienne Japonaise Exon 1 2 peptidique s-ml04i9 Intron9-104 GAGGACTGGC A G CAGGGCTGCT NCD 0 n. d. 14, 81 % 28, 85% s-m61i9 Intron 9-61 AGGAGCCAAAG CGCTCATTGT NCD 0 n. d. 39, 58% 0, 00% s-m41 i9 Intron 9-41 GTCTGTGCTT CTC---CTCCTTTTTC NCD 0 n. d. 16, 00% 0, 00% s-ml3i9 Intron 9-13 CCTGGCTCCC C T ACCTGACTCC NCD 0 n. d. 8, 00% 42, 86% s-126el2 Exon 12 126 CTCCAGGCAG C T AATTGAGCTG SIL 545 9, 26% 0, 00% 0, 00% s-m29i 12 Intron 12-29 TTCTAAAGGA A G TGGTTGATTA NCD 0 6, 00% 0, 00% 0, 00% s-24i 13 Intron 13 24 AAGCCACTGT T A TTTAACCAGT NCD 0 5, 36% 26, 56% 12, 90% s-m59i 13 Intron 13-59 GGCCTTGGCC C T ATCACCCTGG NCD 0 0, 00% 7, 81% 34, 38% s-148el4 Exon 14 148 ACAACAGCAT C A CTCTGGTTTA SIL 680 50, 00% 13, 46% 71, 88% s-81i14 Intron 14 81 AAGAAGAAAA G A AAATCCAAGC NCD 0 0, 00% 0, 00% 32, 81% s-115il4Intron 141Ï5GGGGTCATAC C A TGTCATTTCC NCD 0 0, 00% 0, 00% 34, 38% s-196el5 Exon 15 196 GCAGGACTAC G A TGGGCTTCAC MIS V > M771 5, 36% 1, 72% 6, 67% s-136el6 Exon 16 136 CACCACTTCG G A TCTCCATGAT MIS V > I 825 0, 00% 6, 25% 37, 50% s-27el7Exon 1727CAGGCCCTGG T C ATTTTCCTTG MISY > P857 0, 00% 11, 11% 0, 00% o s-107el7 Exon 17 107 AGAAGAGAAT A G TCAGAAAGTA MISI > M883 45, 65% 12, 90% 71, 43% CD
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Figure img00180001
<tb>
<tb> Fréquence <SEP> dans <SEP> population
<tb> Nom <SEP> Intron <SEP> Position <SEP> Séquence <SEP> 5'Allèle <SEP> Allèle <SEP> Séquence <SEP> 3'Type <SEP> Changement <SEP> Codon <SEP> Africaine <SEP> Caucasienne <SEP> Japonaise
<tb> Exon <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> peptidique
<tb> s-60il7Intron <SEP> 1760CTGCTAACTG <SEP> T <SEP> C <SEP> TGGGGGCAAG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 10, <SEP> 87% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-m68il7 <SEP> Intron <SEP> 17 <SEP> -68 <SEP> AGCGCAGTGC <SEP> C <SEP> G <SEP> CTGTGTCCTT <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0,00% <SEP> 8,33% <SEP> 32, <SEP> 81%
<tb> s-4e18 <SEP> Exon <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> GTCACAGTCT <SEP> G <SEP> T <SEP> CATGGAGGAG <SEP> MIS0F <SEP> 887 <SEP> 0,00% <SEP> 0,00% <SEP> 3,13%
<tb> s-40e19 <SEP> Exon <SEP> 19 <SEP> 40 <SEP> CCTCGGGCAC <SEP> C <SEP> T <SEP> GCCTACATCC <SEP> SIL <SEP> 956 <SEP> 0,00% <SEP> 0,00% <SEP> 4,35%
<tb> s-18i19 <SEP> Intron <SEP> 19 <SEP> 18 <SEP> CCAGCAGCAC <SEP> G <SEP> A <SEP> TTAAGAATAG <SEP> NCD015, <SEP> 79% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-m <SEP> 10119 <SEP> Intron <SEP> 19-T <SEP> ACCTGCCTCC <SEP> C <SEP> T <SEP> TGTCCCCAGG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 55% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-123e22 <SEP> Exon <SEP> 22 <SEP> 123 <SEP> GAAGAACCAG <SEP> C <SEP> T <SEP> TGGGAACAGG <SEP> MIS <SEP> L <SEP> > <SEP> C <SEP> 1122 <SEP> 29, <SEP> 31% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-m65i22 <SEP> Intron <SEP> 22-65 <SEP> CCTCCCCGGC <SEP> G <SEP> A <SEP> AAGGTGCTGG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 6,45% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-54e23 <SEP> Exon <SEP> 23 <SEP> 54 <SEP> GCGACCATGA <SEP> G <SEP> C <SEP> AGTGACACGC <SEP> MIS <SEP> E <SEP> > <SEP> D <SEP> 1172 <SEP> 7,14% <SEP> 4,84% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-149i23 <SEP> Exon <SEP> 23 <SEP> 149 <SEP> GGTGTGGGAG <SEP> C <SEP> T <SEP> AGCTTGGTGG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 14% <SEP> 0,00% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-m50i23 <SEP> Intron <SEP> 23 <SEP> -50 <SEP> GCCCTCACTC <SEP> C <SEP> T <SEP> GAAGCCCCTC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 45% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-98e24 <SEP> Exon <SEP> 24 <SEP> 98 <SEP> TGCCATATGA <SEP> A <SEP> G <SEP> GCTGCTAAGG <SEP> SIL <SEP> 1211 <SEP> 3,45% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-149e24 <SEP> Exon <SEP> 24 <SEP> 149 <SEP> TTGATGACCG <SEP> G <SEP> A <SEP> CTCTCAGACC <SEP> SIL <SEP> 1228 <SEP> 18,97% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-44e27 <SEP> Exon <SEP> 27 <SEP> 44 <SEP> ATGGCAAAGG <SEP> G <SEP> A <SEP> TCCTACCAGG <SEP> SIL <SEP> 1315 <SEP> 11, <SEP> 54% <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-7e30 <SEP> Exon <SEP> 30 <SEP> 7 <SEP> GCAGAGACAC <SEP> G <SEP> A <SEP> CCCTGCCAGG <SEP> SIL <SEP> 1427 <SEP> 3,45% <SEP> 12,50% <SEP> 34, <SEP> 48%
<tb> @
<tb> c
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Figure img00190001
<tb>
<tb> Fréquence <SEP> dans <SEP> population
<tb> Nom <SEP> Intron/Position <SEP> Séquence <SEP> 5'Allèle <SEP> Allèle <SEP> Séquence <SEP> 3'Type <SEP> Changement <SEP> Codon <SEP> Africaine <SEP> Caucasienne <SEP> Japonaise
<tb> Exon <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> peptidique
<tb> s-166e30 <SEP> Exon <SEP> 30 <SEP> 166 <SEP> GTCCCCCAGG <SEP> G <SEP> T <SEP> GCAGGGGGGC <SEP> SIL <SEP> 1480 <SEP> 6,90% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-30i31 <SEP> Intron <SEP> 31 <SEP> 30 <SEP> GGCCCCTGCC <SEP> T <SEP> G <SEP> TATTATTACT <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 79% <SEP> 12,50% <SEP> 0,00%
<tb> s-m <SEP> 142132 <SEP> Intron <SEP> 32-142 <SEP> AGGAAGCTGA <SEP> C <SEP> T <SEP> GTGTAACTTC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 36% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-m130i32 <SEP> Intron <SEP> 32-130 <SEP> TGTAACTTCT--CT <SEP> GAGGCAAAAT <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 26,79% <SEP> 40,00%
<tb> s-m26i32 <SEP> Intron <SEP> 32-26 <SEP> CACTGTCTGG <SEP> G <SEP> C <SEP> TTTTAATGTC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 57% <SEP> 8,93% <SEP> 18,33%
<tb> s-m74i33 <SEP> Intron <SEP> 33-74 <SEP> CCTGTTGTCC <SEP> T <SEP> A <SEP> CAGGTTCCAG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 45% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-62e34 <SEP> Exon <SEP> 34 <SEP> 62 <SEP> CTGGACACCA <SEP> G <SEP> A <SEP> AAATAATGTC <SEP> MISR > K1587 <SEP> 93,10% <SEP> 26,67% <SEP> 57,14%
<tb> s-77e36Exon <SEP> 3677CAGCTTTGTC <SEP> G <SEP> A <SEP> TATTCCTGAT <SEP> MIS <SEP> V > I <SEP> 1674 <SEP> 0,00% <SEP> 0,00% <SEP> 3,33%
<tb> s-55i36Intron <SEP> 3655CATGGATTGA <SEP> T <SEP> C <SEP> ATGGATAAGA <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 24, <SEP> 14% <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 0,00%
<tb> s-64e38Exon <SEP> 3864GCACAGCCTA <SEP> T <SEP> C <SEP> GTGGTGCTCA <SEP> SIL <SEP> 1767 <SEP> 4,00% <SEP> 0,00% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-251i39Intron <SEP> 39251GAAAATAGTG <SEP> T <SEP> G <SEP> TATTTGCTTG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 24, <SEP> 14% <SEP> 46,55%
<tb> s-252i39 <SEP> Intron <SEP> 39 <SEP> 252 <SEP> AAAATAGTGT <SEP> T <SEP> C <SEP> ATTTGCTTGG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 24, <SEP> 14% <SEP> 44,83%
<tb> s-mll9i40 <SEP> Intron <SEP> 40-119 <SEP> ATCCCGCAGC <SEP> C <SEP> T <SEP> CCCTCCCTGC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 0,00% <SEP> 25,00%
<tb> s-m69i44 <SEP> n.d.
<tb> s-114e45 <SEP> n.d.
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
Figure img00200001
<tb>
<tb>
Fréquence <SEP> dans <SEP> population
<tb> Nom <SEP> Intron/Position <SEP> Séquence <SEP> 5'Allèle <SEP> Allèle <SEP> Séquence <SEP> 3'Type <SEP> Changement <SEP> Codon <SEP> Africaine <SEP> Caucasienne <SEP> Japonaise
<tb> Exon <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> peptidique
<tb> s-m34i45 <SEP> Intron <SEP> 45-34 <SEP> TTTTTTCCCC <SEP> C <SEP> T <SEP> CAGCAAATAA <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 5, <SEP> 17% <SEP> 0,00%
<tb> s-13i47 <SEP> Intron <SEP> 47 <SEP> 13 <SEP> AATAAAGATA <SEP> A <SEP> G <SEP> TTTCTTTGGG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 11, <SEP> 67% <SEP> 42,86%
<tb> s-86i47 <SEP> Intron <SEP> 47 <SEP> 86 <SEP> GTGCCTCTAA <SEP> A <SEP> C <SEP> ATAAAGGGAA <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 1,72% <SEP> 13,33% <SEP> 0,00%
<tb> s-377e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 377 <SEP> GACTTGAATT <SEP> T <SEP> C <SEP> AGTTTTTTAC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 33% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-833e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 833 <SEP> TGGGTGTCTC <SEP> C <SEP> T <SEP> AGGCACGGGA <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 54, <SEP> 55% <SEP> 35,00% <SEP> 18,97%
<tb> s-1580e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 1580 <SEP> TGTAACAATA <SEP> C <SEP> T <SEP> TGGGCAGCCT <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 00% <SEP> 30, <SEP> 65% <SEP> 0,00%
<tb> s-1791e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 1791 <SEP> AGTCTCAAAT <SEP> A <SEP> T <SEP> TTTCATCTCT <SEP> NCD0 <SEP> 15, <SEP> 79% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb> s-2034e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 2034 <SEP> ACTTTTTCCA <SEP> A <SEP> G <SEP> AATTTGAATA <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 33% <SEP> 12,90% <SEP> 22,22%
<tb> s-2049e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 2049 <SEP> TGAATATTAA <SEP> C <SEP> T <SEP> GCTAAAGGTG <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 30, <SEP> 00% <SEP> 0,00% <SEP> 24,14%
<tb> s-2449e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 2449 <SEP> AAGAAAACAC <SEP> A <SEP> G <SEP> ACATTTTAAT <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 67% <SEP> 20, <SEP> 00% <SEP> 23, <SEP> 33%
<tb> s-2843e49 <SEP> Exon <SEP> 49 <SEP> 2843 <SEP> TTCATTATCT <SEP> G <SEP> A <SEP> TACTGAAAGC <SEP> NCD <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 69% <SEP> 0,00% <SEP> 0,00%
<tb>
<Desc/Clms Page number 21>
Mutation dans l'exon la
La mutation s-35ela consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une guanine (G) en position 35 de l'exon la, soit à la position 2928 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 3. L'exon la portant ce polymorphisme a la séquence
Figure img00210001

nucléotidique SEQ ID NO : 24. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon la du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 92.
Mutation dans l'exon 7b Une première mutation est désignée s-16elb et consiste en l'insertion d'une guanine (G) en position 16 de l'exon lb, soit à la position 115 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 4. L'exon lb portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 25. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 1 b du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 93.
Une deuxième mutation désignée s-76elb consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 76 de l'exon lb, soit à la position 175 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 4. L'exon Ib portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 26. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon Ib du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 94.
Mutation dans l'intron 3
La mutation s-m39i3 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en en une
Figure img00210002

adénine (A) position-39 de l'extrémité 3'de l'intron 3, soit à la position 10646 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 5. La séquence nucléotidique de l'intron 3 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 27.
<Desc/Clms Page number 22>
Figure img00220001

Mutation dans l'intron 4
Figure img00220002

La mutation s-25i4 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymidine (T) position 25 de l'extrémité 5'de l'intron 4, soit à la position 10828 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 5. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 4 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 28.
Mutation dans l'exon 5
La mutation s-53e5 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) position 53 de l'exon 5, soit à la position 306 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 6. L'exon 5 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 29. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 5 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 95.
Mutation dans l'exon 6
La mutation désignée s-108e6 consiste en la substitution d'une adénine (A) en une guanine (G) en position 108 de l'exon 6, soit à la position 268 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 7. L'exon 6 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 6 du
Figure img00220003

gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 96.
La mutation s-113e6 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) en position 113 de l'exon 6, soit à la position 273 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 7. La séquence de l'exon 6 du gène ABCA1 portant ce polymorphisme est le polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 31. L'ADNc muté portant le polymorphisme dans l'exon 6 est représenté dans la séquence nucléotidique
<Desc/Clms Page number 23>
Figure img00230001

SEQ ID NO : 97, code pour un polypeptide ABCA1 variant d'une longueur de 2261 acides aminés, de séquence SEQ ID NO : 127.
Mutation dans l'intron 7
La mutation s-ml4i7 consiste en l'insertion d'une adénine (A) en position- 14 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 7, soit à la position 589 par rapport à la
Figure img00230002

séquence SEQ ID NO : 8. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 7 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 32.
Mutation dans l'exon 8
La mutation s-123e8 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 123 de l'exon 8, soit à la position 726 par rapport à la
Figure img00230003

séquence SEQ ID NO : 8. L'exon 8 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 33. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 8 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 98.
La mutation s-135e8 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 135 de l'exon 8, soit à la position 738 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 8. L'exon 8 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 34. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 8 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 99.
Mutation dans l'intron 8
La mutation s-m89i8 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une
Figure img00230004

guanine (G) en position-89 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 8, soit à la position 525 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 9. La séquence nucléotidique partielle de
<Desc/Clms Page number 24>
Figure img00240001

l'intron 8 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 35.
Mutation dans l'intron 9
La mutation s-m 104i9 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position-104 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 9, soit à la
Figure img00240002

position 981 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 36.
La mutation s-m6li9 consiste en une insertion d'une guanine (G) en position - 61 en amont de l'extrémité 3'de intron 9, soit à la position 1023 par rapport à la
Figure img00240003

séquence SEQ ID NO : 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 37.
La mutation s-m41i9 consiste en une délétion d'un fragment de trois nucléotides CTC du nucléotide en position-41 au nucléotide-43 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 9, soit à la position 1042-4044 par rapport à la séquence
Figure img00240004

SEQ ID NO : 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 38.
La mutation s-ml3i9 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position-13 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 9, soit à la position 1072 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 39.
<Desc/Clms Page number 25>
Figure img00250001

Mutation dans l'exon 12
Figure img00250002

La mutation s-126el2 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymine (T) en position 126 de l'exon 12, soit à la position 765 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. L'exon 12 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 40. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 12 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 100.
Mutation dans l'intron 12
La mutation s-m29il2 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une
Figure img00250003

guanine (G) en position-29 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 12, soit à la position 1337 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. La séquence nucléotidique de l'intron 12 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 41.
Mutations dans l'intron 13 La mutation s-24il3 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une adénine (A) en position 24 de l'extrémité 5'de l'intron 13, soit à la position 1566 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. La séquence nucléotidique de l'intron 13 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 42.
La mutation s-m59il3 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position-59 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 13, soit à la position 3270 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. La séquence nucléotidique de l'intron 13 portant ce polymorphisme a la séquence SEQ ID NO : 43.
Mutation dans l'exon 14
<Desc/Clms Page number 26>
Figure img00260001

La mutation s-148e14 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une adénine (A) en position 148 de l'exon 14, soit à la position 3476 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. L'exon 14 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 44. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 14 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 101.
Mutation dans l'intron 14
La mutation s-81il4 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 81 de l'extrémité 5'de l'intron 14, soit à la position 3632 par
Figure img00260002

rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. La séquence nucléotidique de l'intron 14 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 45.
La mutation s-115i14 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une adénine (A) en position 115 de l'extrémité 5'de l'intron 14, soit à la position 3666 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. L'intron 14 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 46.
Mutation dans l'exon 15
La mutation s-196el5 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 196 de l'exon 15, soit à la position 5492 par rapport à la
Figure img00260003

séquence SEQ ID NO : 10. L'exon 15 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 47. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 15 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 102, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 128 dans laquelle une valine (V) est substituée par une méthionine (M) en position 771.
Mutation dans l'exon 16
<Desc/Clms Page number 27>
La mutation s-136el6 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 136 de l'exon 16, soit à la position 6714 par rapport à la
Figure img00270001

séquence SEQ ID NO : 10. L'exon 16 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 48. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 16 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 103, et code pour une protéine ABCA1 mutée de séquence SEQ ID NO : 129, qui comprend la substitution d'une valine (V) en isoleucine (I) en position 825.
Mutations dans l'exon 17
La mutation s-27el7 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 27 de l'exon 17, soit à la position 7914 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. L'exon 17 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 49. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 17 du
Figure img00270002

gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 104, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 130 dans laquelle une tyrosine (Y) est substituée par une proline (P) en position 857.
La mutation s-107e17 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 107 de l'exon 17, soit à la position 7994 par rapport à la
Figure img00270003

séquence SEQ ID NO : 10. L'exon 17 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 50. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 17 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 105, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 131 dans laquelle une isoleucine (I) est substituée par une méthionine (M) en position 883.
<Desc/Clms Page number 28>
Figure img00280001

Mutation dans l'intron 17
Figure img00280002

La mutation s-60il7 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 60 de l'extrémité 5'de l'intron 17, soit à la position 8061 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 10. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 17 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 51.
La mutation s-m68il7 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une guanine (G) en position-68 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 17, soit à la position 319 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 11. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 17 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 52.
Mutation dans l'exon 18
La mutation s-4el8 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 4 de l'exon 18, soit à la position 390 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 11. L'exon 18 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 53. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 18 du gène ABCA1
Figure img00280003

est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 106, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 132 dans laquelle une cystéine (C) est substituée par une phénylalanine (F) en position 887.
La mutation s-40el9 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 40 de l'exon 19, soit à la position 943 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 12. L'exon 19 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 54. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 19 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 107.
<Desc/Clms Page number 29>
Figure img00290001

Mutation dans l'intron 19
Figure img00290002

La mutation s-18il9 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 18 de l'extrémité 5'de l'intron 19, soit à la position 1053 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 12. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 19 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 55.
La mutation s-m 10i19 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position-10 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 19, soit à la position 274 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 13. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 19 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ IDNO : 56.
Mutation dans l'exon 22
La mutation s-123e22 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 123 de l'exon 22, soit à la position 1592 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 13. L'exon 22 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 57. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 22 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 108, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 133 dans laquelle une leucine (L) est substituée par une cystéine (C) en position 1122.
Mutation dans l'intron 22
Figure img00290003

La mutation s-m65i22 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position-65 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 22, soit à la position 2884 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 13. La séquence nucléotidique
<Desc/Clms Page number 30>
Figure img00300001

de l'intron 22 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 58.
Mutation dans l'exon 23
La mutation s-54e23 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une
Figure img00300002

cytosine (C) en position 54 de l'exon 23, soit à la position 3002 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 13. L'exon 23 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 59. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 23 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 109, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 134 dans laquelle un acide glutamique (E) est substitué par un acide aspartique (D) en position 1172.
Mutation dans l'intron 23
La mutation s-149i23 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 149 de l'extrémité 5'de l'intron 23, soit à la position 3170 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 13. La séquence nucléotidique de l'intron 23 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 60.
La mutation s-m50i23 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une
Figure img00300003

thymine (T) en position-50 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 23, soit à la position 3958 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 13. La séquence de l'intron 23 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 61.
Mutations dans l'exon 24
La mutation s-98e24 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 98 de l'exon 24, soit à la position 4105 par rapport à la
<Desc/Clms Page number 31>
Figure img00310001

séquence SEQ ID NO : 13. L'exon 24 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 62. L'ADNc correspondant à la mutation dans l'exon 24 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 110.
La mutation s-149e24 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 149 de l'exon 24, soit à la position 4156 par rapport à la
Figure img00310002

séquence SEQ ID NO : 13. L'exon 24 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 63. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 24 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 111.
Mutation dans l'exon 27
La mutation s-44e27 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 44 de l'exon 27, soit à la position 604 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 14. L'exon 27 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 64. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 27 du
Figure img00310003

gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 112.
Mutations dans l'exon 30 La mutation s-7e30 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 7 de l'exon 30, soit à la position 6854 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 14. L'exon 30 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 65. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 30 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 113.
La mutation s-166e30 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 166 de l'exon 30, soit à la position 7013 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 14. L'exon 30 portant ce polymorphisme a la séquence
<Desc/Clms Page number 32>
Figure img00320001

nucléotidique SEQ ID NO : 66. L'ADNc correspondant à la mutation dans l'exon 30 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 114.
Mutation dans l'intron 31 La mutation s-30i31 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une guanine (G) en position 30 de l'extrémité 5'de l'intron 31, soit à la position 1307 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15. La séquence nucléotidique de l'intron 31 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 67.
Mutation dans l'intron 32 La mutation s-ml42i32 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position-142 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 32, soit à la position 3600 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 68.
La mutation s-ml30i32 consiste en une insertion de deux nucléotides en position-130 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 32, soit à la position 3611 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 69.
La mutation s-m26i32 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position-26 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 32, soit à la position 3716 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 70.
<Desc/Clms Page number 33>
Figure img00330001

Mutation dans l'intron 33
Figure img00330002

La mutation s-m74i33 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une adénine (A) en position-74 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 33, soit à la position 5247 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15. La séquence nucléotidique de l'intron 33 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 71.
Mutation dans. l'exon 34 La mutation s-62e34 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 62 de l'exon 34, soit à la position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15. L'exon 34 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 72. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 34 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 115, et code pour une protéine ABCA1 mutée de SEQ ID NO : 135, dans laquelle une arginine (R) a été remplacée par une lysine (K) en position 1587.
L'analyse de ce polymorphisme dans une population ECTIM (étude castémoin de l'infarctus du myocarde), qui comprend une étude de patients ayant survécu à un infarctus du myocarde et de sujets contrôles de type caucasien (Parra et al., Arteriosclerosis and Thrombosis, (1992) 12 (6), 701-707), montre que ce polymorphisme est associé de façon significative à un risque élevé d'infarctus du myocarde (F=18, 6 p < 0, 0001).
Ce polymorphisme semble par ailleurs associé à des taux moyens plus bas de HDL cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et A-II. En particulier, la présence de l'allèle A du type s-62e34 est associée à une diminution d'environ 5mg/dl du taux d'apolipoprotéine A-I.
<Desc/Clms Page number 34>
Figure img00340001
Le polymorphisme s-62e34 selon l'invention, qui entraîne le remplacement d'une arginine (R) par une lysine (K) en position 1587 de la protéine ABC1, constitue une mutation fonctionnelle qui affecte les taux de cholestérol HDL, d' d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II et prédispose à un risque cardiovasculaire.
Mutation dans l'exon 36
La mutation s-77e36 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) en position 77 de l'exon 36, soit à la position 1064 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 16. L'exon 36 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 73. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 36 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 116, et code
Figure img00340002

pour une protéine ABCA1 mutée de SEQ ID NO 136, dans laquelle une valine (V) est substituée par une isoleucine (I) en position 1674.
Mutation dans l'intron 36
La mutation s-55i36 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 55 de l'extrémité 5'de l'intron 36, soit à la position 1220 par
Figure img00340003

rapport à la séquence SEQ ID NO : 16. L'intron 36 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique partielle SEQ ID NO : 74.
Mutation dans l'exon 38
La mutation s-64e38 consiste en la substitution d'une thymine (T) en une cytosine (C) en position 64 de l'exon 38, soit à la position 835 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 17. L'exon 38 portant ce polymorphisme a la séquence
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Figure img00350001

nucléotidique SEQ ID NO : 75. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 38 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 117.
Mutations dans l'intron 39
La mutation s-251i39 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une guanine (G) en position 251 de l'extrémité 5'de l'intron 39, soit à la position 375 par
Figure img00350002

rapport à la séquence SEQ ID NO : 18. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 39 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 76.
La mutation s-252i39 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 252 de l'extrémité 5'de l'intron 39, soit à la position 376 par
Figure img00350003

rapport à la séquence SEQ ID NO : 18. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 39 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 77.
Mutation dans l'intron 40 La mutation s-ml l9i40 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymine (T) en position-119 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 40, soit à la position 710 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 19. La séquence nucléotidique de l'intron 40 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 78.
Mutation dans l'intron 44
La mutation s-m69i44 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position-69 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 44, soit à la position 108 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 20. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 44 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 79.
<Desc/Clms Page number 36>
Figure img00360001

Mutation dans l'exon 45
Figure img00360002

La mutation s-114e45 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 114 de l'exon 45, soit à la position 290 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 20. L'exon 45 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 80. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 45 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 118.
Mutation dans l'intron 45 La mutation s-m34i45 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position-34 en amont de l'extrémité 3'de l'intron 45, soit à la position 343 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 45 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ IDNO : 81.
Mutations dans l'intron 47 La mutation s-13i47 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 13 de l'extrémité 5'de l'intron 47, soit à la position 1068 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 47 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 82.
La mutation s-86i47 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une cytosine (C) en position 86 de l'extrémité 5'de l'intron 47, soit à la position 1141 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 47 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 83.
<Desc/Clms Page number 37>
Figure img00370001

Mutations dans l'exon 49
Figure img00370002

La mutation s-377e49 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 377 de l'exon 49, soit à la position 571 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 84. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 119.
La mutation s-833e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 833 de l'exon 49, soit à la position 1027 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 85. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du
Figure img00370003

gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 120.
La mutation s-1580e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1580 de l'exon 49, soit à la position 1773 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 86. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 121.
La mutation s-1791e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une thymine (T) en position 1791 de l'exon 49, soit à la position 1985 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 87. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du
Figure img00370004

gène ABC 1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 122.
La mutation s-2034e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 2034 de l'exon 49, soit à la position 2228 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence
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Figure img00380001

nucléotidique SEQ ID NO : 88. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 123.
La mutation s-2049e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2049 de l'exon 49, soit à la position 2243 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 89. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 124.
La mutation s-2449e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 2449 de l'exon 49, soit à la position 2643 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 90. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 125.
La mutation s-2843e49 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 2843 de l'exon 49, soit à la position 3037 par rapport à la
Figure img00380002

séquence SEQ ID NO : 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 91. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 126.
Certains polymorphismes retrouvés au sein des régions codantes, qui correspondent essentiellement à des substitutions d'un seul nucléotide localisé sur la troisième base des codons du cadre ouvert de lecture de ABCA1, n'entraînent pas de modifications quant à la nature de l'acide aminé codé, compte tenu des règles de dégénérescence génétique chez l'homme, bien connues de l'homme du métier. Les polymorphismes qui n'altèrent pas la séquence d'acide aminé peuvent toutefois avoir une fonction biologique importante, qui peuvent avoir un effet sur la concentration de
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HDL circulante, et donc d'apolipoprotéine A-I ou A-II. De tels polymorphismes peuvent par exemple affecter la régulation de la transcription ou la traduction, par exemple en agissant sur la stabilité de l'ARNm, l'épissage, le taux de transcription, de traduction et la fidélité de la traduction.
AUTRES POLYMORPHISMES
Selon l'invention, d'autres polymorphismes ont été découverts dans la région promotrice en amont du gène ABCA1 humain. Les positions polymorphes sont représentées à la figure 3 par des nucléotides marqués en gras (et soulignés lorsqu'il s'agit des bases encadrant une insertion) sur la séquence du promoteur du gène ABC 1 humain sauvage de séquence SEQ ID NO : 23.
Le tableau 3 présente par ailleurs les polymorphismes alléliques dans la séquence promotrice du gène ABCA1 humain selon la présente invention. Il est indiqué le nom, les allèles sauvage et mutant, les positions polymorphes, et la fréquence d'apparition des polymorphismes alléliques dans deux groupes de population, la population caucasienne et la population japonaise.
<Desc/Clms Page number 40>
Tableau 3 Polymorphismes alléliques dans le promoteur du gène ABCA1 humain
Figure img00400001
<tb>
<tb> Fréquence <SEP> dans
<tb> population
<tb> Nom <SEP> Localisation <SEP> Position <SEP> Séquence <SEP> 5'Allèle <SEP> 1 <SEP> Allèle <SEP> 2 <SEP> Séquence <SEP> 3'Caucasienne <SEP> Japonaise
<tb> s-2389p <SEP> Promoteur-2389 <SEP> AAAAAAATAC <SEP> G <SEP> A <SEP> AAAATTAGAT <SEP> 29, <SEP> 60% <SEP> 33, <SEP> 30%
<tb> sins-2176-2177p <SEP> Promoteur-2176 <SEP> TGAGGGGAGG <SEP> GGAGGGGAGG <SEP> AGGGAGGGGG <SEP> 33,30% <SEP> 33,30%
<tb> s-1814pPromoteur-1814 <SEP> CAGCCTCCTG <SEP> A <SEP> G <SEP> GATAACAGGC <SEP> 38,70% <SEP> 21,00%
<tb> s-1801p <SEP> Promoteur <SEP> -1801 <SEP> TAACAGGCGC <SEP> C <SEP> T <SEP> CGCCACCACA <SEP> 41,90% <SEP> 66,10%
<tb> s-1652p <SEP> Promoteur <SEP> -1652 <SEP> CACTGCGCCC <SEP> A <SEP> G <SEP> GCTCAGATCC <SEP> 38,70% <SEP> 21,00%
<tb> s-1506p <SEP> Promoteur <SEP> -1506 <SEP> CTCTTCTATG <SEP> G <SEP> C <SEP> GTCTGTCCTG <SEP> 17,70% <SEP> 17,70%
<tb> s-1395p <SEP> Promoteur <SEP> -1395 <SEP> TGAATGTCTG <SEP> C <SEP> T <SEP> ATGCAGGTGG <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 46,80%
<tb> s-1252p <SEP> Promoteur <SEP> -1252 <SEP> TGCCCTTCAA <SEP> G <SEP> A <SEP> GTGGCTACAA <SEP> 27,30% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-1217pPromoteur-1217 <SEP> AGGTAGGAGA <SEP> C <SEP> T <SEP> CTTGTGGCCT <SEP> 6,80% <SEP> 31,30%
<tb> s-1099p <SEP> Promoteur <SEP> -1099 <SEP> AGTTTGACCT <SEP> G <SEP> T <SEP> AGTTTTGGCC <SEP> 9, <SEP> 10% <SEP> n. <SEP> d.
<tb> s-1034-1035p <SEP> Promoteur-1034 <SEP> ATATTTAGAC <SEP> AT <SEP> ATGGTGTGTA <SEP> 25,00% <SEP> 19,40%
<tb> s-940pPromoteur-940 <SEP> GGCAAACAGA <SEP> T <SEP> G <SEP> AAGTTGGAGG <SEP> 45,00% <SEP> 51,60%
<tb> s-803pPromoteur-805 <SEP> AAATTAAAAG <SEP> G <SEP> A <SEP> GGGCTGGTCC <SEP> 14,60% <SEP> 51,90%
<tb> sA-777-774p <SEP> Promoteur-777 <SEP> GTTCTGTGTT <SEP> TTTG-TTTGTTTGTT <SEP> 11, <SEP> 50% <SEP> 5,00%
<tb> sA-773-765p <SEP> Promoteur-773 <SEP> TGTGTTTTTG <SEP> TTTGTTTGT <SEP> TTTGTTTGTT <SEP> 23,10% <SEP> 16,70%
<tb> s-564p <SEP> Promoteur <SEP> -564 <SEP> GAGGACTGTC <SEP> C <SEP> T <SEP> GCCTTCCCCT <SEP> 21,40% <SEP> 32,80%
<tb>
<Desc/Clms Page number 41>
Figure img00410001
<tb>
<tb> Fréquence <SEP> dans
<tb> population
<tb> Nom <SEP> Localisation <SEP> Position <SEP> Séquence <SEP> 5'Allèle <SEP> 1 <SEP> Allèle <SEP> 2 <SEP> Séquence <SEP> 3'Caucasienne <SEP> Japonaise
<tb> s-407p <SEP> Promoteur'-407 <SEP> GCGGAAAGCA <SEP> G <SEP> C <SEP> GATTTAGAGG <SEP> 26,60% <SEP> 18,30%
<tb> s-302p <SEP> Promoteur-302 <SEP> CGTCTTAGGC <SEP> C <SEP> T <SEP> GGCGGGCCCG <SEP> 10, <SEP> 90% <SEP> 13,30%
<tb> s-278p <SEP> Promoteur <SEP> -278 <SEP> GGGGGAAGGG <SEP> G <SEP> C <SEP> ACGCAGACCG <SEP> 34,40% <SEP> 33, <SEP> 30%
<tb> sA-223-219p <SEP> Promoteur-223 <SEP> CACCCCACCC <SEP> CACCC <SEP> ACCTCCCCCC <SEP> 10,90% <SEP> 13,30%
<tb> s-99pPromoteur-99 <SEP> AGGCCGGGAA <SEP> G <SEP> C <SEP> GGGGCGGGGA <SEP> 41,70% <SEP> 35,00%
<tb> s-14p <SEP> promoteur <SEP> -14 <SEP> GGAACTAGTC <SEP> C <SEP> T <SEP> CGGCAAAAAC <SEP> 20, <SEP> 00% <SEP> 4,20%
<tb>
<Desc/Clms Page number 42>
Figure img00420001

Le polymorphisme S-2389p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 505 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23, ou en position-2389 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-2389p dans la séquence régulatrice du gène ABC 1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 137.
Le polymorphisme Sins-2176-2177p consiste en une insertion de la séquence GGAGGGGAGG en 717 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-2176 par rapport au site d'initiation de la transcription. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme Sins-2176-2177p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 138.
Le polymorphisme S-1814p consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 1080 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1814 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1814p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 139.
Le polymorphisme S-1801p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1093 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1801 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1801p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 140.
Le polymorphisme S-1652p consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 1242 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1652 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide
<Desc/Clms Page number 43>
Figure img00430001

nucléique comprenant le polymorphisme S-1652p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 141.
Le polymorphisme S-1506p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 1388 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1506 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1506p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 142.
Le polymorphisme S-1395p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par
Figure img00430002

une thymine (T) en position 1499 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1395 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1395p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 143.
Le polymorphisme S-1252p consiste en la substitution d'une guanine (G) par
Figure img00430003

une adénine (A) en position 1642 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1252 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1252p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 144.
Figure img00430004
Le polymorphisme S-1217p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1677 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1217 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1217p dans la séquence régulatrice du
Figure img00430005

gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 145.
Le polymorphisme S-1099p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 1795 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
<Desc/Clms Page number 44>
Figure img00440001

23 ou en position-1099 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1099p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 146.
Le polymorphisme Sins-1034-1035p consiste en une insertion d'une adénine et d'une thymine (AT) en position 1859 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-1034 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme Sins-1034-1035p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 147.
Le polymorphisme S-940p consiste en la substitution d'une thymine (T) en une guanine (G) en position 1954 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-940 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-940p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 148.
Le polymorphisme S-803p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 2091 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-803 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-803p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 149.
Le polymorphisme SA-777-774p consiste en une délétion d'un fragment de quatre nucléotides TTTG en position 2117 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-774 par rapport au site d'initiation de la transcription +1.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme SA-777-774p dans la séquence
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Figure img00450001

régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 150.
Le polymorphisme SA-773-765p consiste en une délétion d'un fragment de neuf nucléotides TTTGTTTGT en position 2121 du premier nucléotide de la
Figure img00450002

séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-765 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme SA-773-765p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 151.
Le polymorphisme S-564p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2330 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-564 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-564p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 152.
Le polymorphisme S-407p consiste en la substitution d'une guanine (G) par
Figure img00450003

une cytosine (C) en position 2487 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-407 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-407p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 153.
Le polymorphisme S-302p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2592 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-302 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-302p dans la séquence régulatrice du gène ABC 1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 154.
<Desc/Clms Page number 46>
Figure img00460001
Le polymorphisme S-278p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2616 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-278 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-278p dans la séquence régulatrice du gène ABC 1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 155.
Le polymorphisme SA-223-219p consiste en une délétion d'un fragment de cinq nucléotides CACCC en position 2671 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-219 par rapport au site d'initiation de la transcription +1.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme SA-223-219p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 156.
Le polymorphisme S-99p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2795 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-99 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-99p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 157.
Le polymorphisme S-14p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2880 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position-14 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-14p dans la séquence régulatrice du gène ABC 1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 158.
Selon un premier aspect, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques du gène ABCA1 comprenant au moins un polymorphisme biallélique tel que décrit ci-dessus.
<Desc/Clms Page number 47>
Figure img00470001

Ainsi, l'invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant la base polymorphe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant la base polymorphe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également pour objet un acide nucléique ayant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, la base polymorphe étant localisée au centre du fragment nucléotidique de 21 bases.
L'invention concerne en outre un acide nucléique dérivé d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 comprenant la séquence polymorphe, et au moins deux nucléotides situés de part et d'autre de la position polymorphe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
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Figure img00480001

Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 127-136.
L'invention concerne également un polypeptide comprenant une séquence
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d'acide aminé choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 127-136.
Elle a également pour objet un anticorps dirigé contre un polypeptide ABCA1 polymorphe comprenant une séquence d'acide aminé choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 127-136, ou un fragment peptidique de ce dernier. De préférence, l'anticorps selon la présente invention comprend un composé détectable.
L'invention a également pour objet un acide nucléique contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt lié de manière fonctionnelle à un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N0 : 137-158.
La présente invention a pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant qui porte un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymorphismes tels que précédemment décrits. Elle concerne également une cellule hôte transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymorphismes tels que précédemment décrits ou par le vecteur recombinant décrit ci-dessus. Elle concerne en outre un mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymorphismes tels que précédemment décrits ou par un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus.
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Selon un second aspect, l'invention a pour objet des sondes ou des amorces nucléotidiques capables de s'hybrider aux acides nucléiques de séquences SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 et comprenant au moins une position polymorphe ou aux acides nucléiques de séquence complémentaire.
Les sondes et amorces nucléotidiques comprennent un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, ou d'une séquence complémentaire, contenant une des bases polymorphes selon l'invention.
De préférence, une sonde nucléotidique selon l'invention a une longueur de 15,16, 19 à 25,35, 40,50, 70,80, 100,200, 500,1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant au moins une base polymorphe, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière encore plus préférentielle, les sondes nucléotidiques sont constituées d'un acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158. De préférence, la base polymorphe est localisée au centre du fragment nucléotidique de 21 bases.
De préférence, une amorce nucléotidique selon l'invention a une longueur de 8,9, 10,11, 12,13, 14,15, 16,17, 18,19, 20,21, 22,23, 24,25 à 40 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant au moins une base polymorphe, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
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Figure img00500001
De préférence, la base de l'extrémité 3'de ces amorces est complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 3'de la position du polymorphisme selon l'invention, présent dans l'une des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158 et/ou de leurs séquences complémentaires.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, comprenant au moins un des polymorphismes définis précédemment, ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABCA1 sont représentés ci-dessous.
Il s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de
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séquence SEQ ID NO : 159 (ACCGAAGTAAGGAGTTGCTC) et l'amorce de séquence SEQ IN NU : 160 (ACTGTTTCACTAATACTTACTG).
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (Methods Enzymol (1979) 68,90-98) ou de Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68,109- 151), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. (1981) 22,1859-1862), ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N EP 0 707 592.
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Figure img00510001
A titre illustratif, des amorces nucléotidiques appropriées selon la présente invention sont par exemple des amorces dont la base à l'extrémité 3'hybride avec la base localisée immédiatement du coté 3'de la base polymorphe du fragment comprenant le polymorphisme. Après une étape d'hybridation spécifique de l'amorce, une étape d'élongation avec un mélange de deux didéoxynucléotides complémentaires de la base polymorphe dudit polymorphisme, par exemple marqués par deux fluorophores distincts, puis une étape de détection du signal de fluorescence obtenu permet de déterminer lequel des deux didéoxynucléotides fluorescents différemment marqués a été incorporé, et de déduire la nature de la base polymorphe.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodeoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5'ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (Nucl. Ac. Res. (1988) 11,4937-4957) ou Sanchez-pescador et al. (J. Clin. Microbiol. (1988) 26 (10) 1934-1938).
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D'autres approches peuvent être utilisées pour le marquage et la détection des didéoxynucléotides. Une méthode en phase homogène basée sur le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a été décrite entre autres par Chen et Kwok (Nucl Ac Res, 25 (1997) 347-353). Selon cette méthode, des fragments amplifiés d'ADN génomique susceptibles de contenir des polymorphismes sont incubés avec une amorce marquée à la fluorescéine à l'extrémité 5', en présence de didéoxynucléotides triphosphate fluorescents et d'une polymérase Taq modifiée.
L'amorce marquée est allongée d'une base par incorporation du didéoxynucléotide marqué spécifique de l'allèle présent dans la séquence d'ADN génomique complémentaire. A la fin de cette réaction d'élongation, les intensités de fluorescence pour les deux composés marqueurs des didéoxynucléotides marqués sont analysées directement sans séparation ni purification. Le ratio pour ces deux fluorescences permet de déterminer le nucléotide utilisé par la polymérase lors de l'élongation, et de déduire la nature de la base polymorphe L'ensemble de ces étapes peut être réalisé dans le même tube et les modifications de fluorescence suivies en temps réel.
Alternativement, l'amorce d'extension peut être analysée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. La base située en position polymorphe est identifiée en mesurant la
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masse ajoutée à l'amorce de microséquençage. (Haff et al., Gen Res, 7 (1997) 378- 388).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention permettent une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (Nucl. Acid. SympSer. (1991) 24,197-200) ou encore dans le brevet européen n EP-0 225 807 (CHIRON).
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Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southem à l'ADN génomique ou Northern àl'ARN.
Les caractéristiques structurales permettant de différencier les séquences normales des séquences mutées d'ABCAI (génomiques, ARNs messagers, ADNc) sont ainsi mises à profit afin de réaliser des moyens de détection des séquences mutées d'ABCAl dans un échantillon, en particulier sous la forme de sondes hybridant spécifiquement avec les séquences mutées d'ABCA1 ou encore des couples d'amorces permettant d'amplifier sélectivement les régions du gène ABCA1 portant les polymorphismes décrits ci-dessus. La détection de la présence de ces mutations pouvant notamment être effectuée par discrimination de la longueur des fragments d'acide nucléique amplifiés, par hybridation des fragments amplifiés à l'aide des sondes spécifiques décrites ci-dessus ou encore par séquençage direct de ces fragments amplifiés.
De telles amorces nucléotidiques peuvent par exemple être immobilisées sur un support. De plus, il est possible d'immobiliser sur un support, par exemple de manière ordonnée, de multiples amorces spécifiques telles que décrites ci-dessus, chacune de ces amorces étant adaptée à la détection de l'un des polymorphismes du gène ABCA1 selon l'invention.
Selon un troisième aspect de la présente invention, les polymorphismes du gène ABCA1 selon l'invention sont utiles notamment comme marqueurs génétiques dans des études d'association entre la présence d'un allèle donné chez un sujet et la prédisposition de ce sujet à une pathologie donnée et/ou à une réponse donnée à une molécule thérapeutique dans le cadre d'études pharmacogénétiques.
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La présente invention a donc pour objet des marqueurs génétiques comprenant tout ou partie d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un des polymorphismes selon l'invention.
Les marqueurs génétiques de l'invention sont avantageusement utilisés pour les études d'association d'un allèle donné des polymorphismes selon l'invention, avec les taux de cholestérol HDL, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II plasmatiques chez les patients.
De préférence, les marqueurs génétiques sont utilisés pour les études d'association des polymorphismes s-35ela, s-16elb, s-76elb, s-53e5, s-108e6, s-
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113e6, s-123e8, s-153e8, s-126el2, s-148el4, s-196el5, s-136el6, s27el7, sl07el7, s-4el8, s-40el9, s-123e22, s-54e23, s-98e24, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-166e30, s- 62e34, s-77e36, s-64e38, s-114e45, s-377e49, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s- 2034e49, s-2049e49, s-2449e49, et s-2843e49 avec les taux d'HDL cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II plasmatiques chez les patients.
De manière encore plus préférentielle, les marqueurs génétiques sont utilisés pour les études d'association des polymorphismes s-113e6, s-196el5, s-136el6, s27el7, sl07el7, s-4el8, s-123e22, s-54e23, s-62e34, et s-77e36 avec les taux d'HDL cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II plasmatiques chez les patients.
En particulier, la présente invention concerne des marqueurs génétiques comprenant tout ou partie d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, pour les études d'association des polymorphismes tels que
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décrits précédemment avec un risque cardiovasculaire chez les patients et plus particulièrement un risque d'infarctus du myocarde.
Les méthodes pour l'analyse génétique de caractères (phénotypes) complexes sont de différents types (Lander et al., Science, 265 (1994) 2037-2048). En général, les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utiles dans l'un quelconque des procédés décrits dans l'état de la technique destiné à démontrer une corrélation statistiquement significative entre un génotype et un phénotype. Les polymorphismes bialléliques peuvent être utilisés dans des analyses de liaison ("linkage analysis") et dans des procédés de partage d'allèles ("allele sharing"). De préférence, les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utilisés pour identifier des gènes associés à des caractères (phénotypes) détectables en utilisant des études d'association, une approche qui ne nécessite pas le recours à des familles affectées par le caractère, et qui permet en outre l'identification de gènes associés à des caractères complexes et sporadiques.
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D'autres méthodes statistiques mettant en ouvre des polymorphismes bialléliques selon l'invention sont par exemple celles décrites par Forsell et al. (Biol Psychiatry 42 (1997) 898-903) Xiong et al. (Ann J Hum Genet 64 (1999) 629-640), Horvath et al. (Am J Hum Genet 63 (1998) 1886-1897), Sham et al. (Ann Hum Genet 59 (1995) 323-336) ou encore Nickerson et al. (Genomics, 12 (1992) 377-387). De préférence, les polymorphismes biallèliques sont utilisés pour identifier les gènes associés avec un phénotype.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détection d'un des polymorphismes décrits précédemment dans la séquence nucléotidique du gène ABCA1 d'un sujet.
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Le procédé selon l'invention consiste à déterminer la séquence nucléotidique de tout ou partie du gène ABCA1 chez ledit sujet à une des positions polymorphes de l'invention, et identifier la présence ou l'absence du SNP (polymorphisme simple nucleotide) à la position analysée.
De préférence, le procédé de détection selon l'invention consiste à déterminer la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 113 de l'exon 6, la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 196 de l'exon 15, la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 136 de l'exon 16, la présence d'un A ou d'un G à la position polymorphe 107de l'exon 17, la présence d'un T ou d'un C à la position polymorphe 27 de l'exon 17, la présence d'un G ou d'un T à la position polymorphe 4 de l'exon 18, la présence d'un C ou d'un T à la position polymorphe 123 de l'exon 22, la présence d'un G ou d'un C à la position polymorphe 54 de l'exon 23, la présence d'un C ou d'un T à la position polymorphe 62 de l'exon 34, la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 77 de l'exon 36.
De manière encore plus préférentielle, le procédé de détection selon la présente invention, consiste à déterminer la séquence nucléotidique du gène ABCA1 au niveau de la position 62 de l'exon 34 et le SNP correspondant à la présence d'un C ou d'un T.
Selon un premier mode de réalisation du procédé de l'invention, la présence d'au moins un des SNP décrits précédemment est identifiée par séquençage de tout ou partie du gène ABCA1 du sujet au niveau des positions polymorphes.
Des amorces d'amplification et de séquençage peuvent être construites afin d'hybrider avec une région déterminée d'une séquence choisie dans le groupe de séquence constitué par les séquences SEQ ID NO : 24-126 et SEQ ID NO : 137-158,
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Figure img00570001

ou de séquence complémentaire, et comprenant au moins une position polymorphe. De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à amplifier des fragments d'environ 250 à environ 500 nucléotides, comprenant au moins une des positions polymorphes selon l'invention.
Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensuite séquencés et la séquence obtenue est comparée aux séquences de référence SEQ ID NO : 24-91 et 137 à 158 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à partir de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique provenant du sujet testé.
Le procédé de l'invention permet l'amplification d'un acide nucléique contenant au moins un des polymorphismes de l'invention, et comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique ABCA1 est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'sur un brin et du côté 3' sur le brin complémentaire de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détecter les acides nucléiques amplifiés.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques définies selon les critères mentionnés ci-avant.
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Figure img00580001
L'invention concerne donc selon ce premier mode de réalisation un procédé de détection d'un des polymorphismes selon l'invention dans le gène ABCA1 chez un sujet, comportant les étapes suivantes : a) séquençage, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, d'un fragment d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 24-91 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158 selon l'invention ; b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence correspondante à la séquence amplifiée choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 24-91 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158 ; c) déterminer la présence d'un polymorphisme dans la séquence du fragment d'acide nucléique par rapport aux séquences SEQ ID NO : 24-91 ou aux séquences SEQ ID NO : 137-158 de référence.
Le procédé de détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, comprend également les étapes consistant à : a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, tout ou une partie du gène ABCA1, à l'aide d'une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 24-91 ou les séquences SEQ ID NO : 137- 158 ; b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID ? 1 et 3-23 ; c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquencé provenant du matériel biologique du sujet à tester et les séquences SEQ ID NO : 1 et 3-23 de référence.
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Figure img00590001
Selon un deuxième mode de réalisation du procédé selon la présente invention, celui-ci utilise les sondes oligonucléotidiques telles que décrites précédemment, qui sont capables d'hybrider spécifiquement avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID NO : 24-91 ou avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID Nu 137-158, et comprenant au moins une des bases polymorphes selon l'invention telles que décrites précédemment, en vue de détecter la présence d'un ou plusieurs des polymorphismes selon l'invention dans un échantillon provenant d'un sujet.
De manière préférentielle, les sondes nucléotidiques sont constituées d'un acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, la base polymorphe étant localisée au centre du fragment nucléotidique de 21 bases.
De préférence les sondes nucléotidiques selon ce mode de réalisation de l'invention sont immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration recouvert de lits de polystyrène, de lits magnétiques, de bandes de nitrocellulose, ou encore de microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
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2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
De préférence, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support, et encore plus préférentiellement, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un cinquième aspect de la présente invention, les procédés de détection des polymorphismes décrits précédemment sont utilisés pour diagnostiquer chez un sujet une prédisposition à développer une certaine pathologie, après une étude d'association, ou pour prédire la réponse pharmacologique d'un patient à une molécule donnée, après une étude pharmacogénétique.
Plus particulièrement, les procédés permettent de diagnostiquer chez un sujet qui a été détecté comme portant un allèle donné d'au moins un des polymorphismes selon l'invention, un risque pathologique lié à une déficience du transporteur ABCA1, ou une réponse nulle ou indésirable à une molécule thérapeutique donnée.
Les procédés selon l'invention sont particulièrement utiles pour diagnostiquer la prédisposition d'un individu à présenter un risque coronarien ou cardiovasculaire, tel qu'un risque d'infarctus du myocarde, ou d'athérosclérose.
Le procédé selon l'invention permet de déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme du cholestérol, notamment dans le transport inverse de cholestérol, un risque de développement d'une déficience HDL familiale telle que la maladie de Tangier ou plus généralement d'une maladie cardiovasculaire ou une affection coronarienne, telle qu'un risque d'infarctus du myocarde ou d'athérosclérose.
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Figure img00610001
De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'un allèle donné d'un des polymorphismes selon l'invention tel que décrit dans le tableau 2, dans la séquence du gène ABCA1 humain de séquence SEQ ID NO : 3-22.
Les méthodes selon l'invention permettent également de détecter dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, la présence ou l'absence d'un allèle donné d'un des polymorphismes selon l'invention tel que décrit
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dans le tableau 3, dans la séquence régulatrice SEQ ID NO : 23 en amont du gène ABCA1 caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABCA1.
La présente invention a pour objet le procédé de diagnostic d'une pathologie liée à une déficience du transporteur ABCA1 qui consiste à détecter chez un sujet, la présence d'un allèle donné d'un des polymorphismes de l'invention selon une des méthodes de détection décrites précédemment.
De préférence, le procédé de l'invention permet de diagnostiquer la prédisposition d'un sujet à développer une maladie cardiovasculaire telle qu'un infarctus du myocarde.
De manière encore plus préférentielle, la présente invention a pour objet un procédé et un kit de diagnostic d'un risque d'infarctus du myocarde ou d'un risque d'affection cardiovasculaire chez un sujet, consistant à détecter chez ledit sujet, la présence d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymorphe A en position 62 de l'exon 34, soit à la position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15.
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La présente invention a pour objet le procédé de diagnostic d'une réponse pharmacologique liée à une variation du transporteur ABCA1 ou de sa régulation qui consiste à détecter chez un sujet, la présence d'un allèle donné d'au moins un des polymorphismes de l'invention selon une des méthodes de détection décrites précédemment.
A titre illustratif, de tels polymorphismes SNPs peuvent être détectés afin de déterminer l'existence d'une substitution d'un nucléotide dans la séquence d'un acide nucléique correspondant au gène ABCA1 de séquence SEQ ID NO : 3-22 et/ou dans
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la séquence régulatrice en amont du gène ABCA1 de séquence SEQ ID NO : 23, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans lesdites séquences SEQ ID Nu 3-22 ou SEQ ID Nu 23.
* La présente invention a en outre pour objet l'utilisation des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante d'une
Figure img00620003

des séquences SEQ ID NO : 24-126 ou avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID N 137-158, comprenant au moins une des bases polymorphes selon l'invention telles que décrites précédemment, en vue de diagnostiquer chez un sujet une prédisposition au développement d'une pathologie liée à une déficience dans le transport inverse du cholestérol, tel que l'infarctus du myocarde, l'athérosclérose ou encore la maladie de Tangier, ou plus généralement une affection cardiovasculaire, ou de prédire la réponse pharmacologique d'un sujet à une molécule thérapeutique donnée.
Les méthodes de diagnostic selon la présente invention peuvent avantageusement être utilisées afin d'évaluer l'efficacité de produits thérapeutiques dans le traitement des affections liées à une déficience du transporteur ABCA1.
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Figure img00630001
Les sujets porteurs d'un polymorphisme allèlique du gène ABCA1 peuvent présenter par exemple des différences de concentration des différentes variables lipidiques qui sont couramment mesurées telles que les taux de HDL cholestérol, de triglycérides, d'apolipoprotéines A-I et A-II, des particules lipoprotéiques A-I et A-II, ou encore des différences au niveau de la régulation de la biosynthèse de la protéine.
Les différences observées du fait de la présence d'une variant allélique chez un sujet peuvent être modifiées lorsque l'on administre audit sujet un agent thérapeutique particulier. Les procédés selon la présente invention peuvent donc être utiles pour déterminer l'effet clinique d'une substance thérapeutique et déterminer les doses thérapeutiques à administrer.
Selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet un kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'un des polymorphismes tels que précédemment décrits, dans le gène ABCA1 chez un sujet, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 24-126 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification d'au moins une position polymorphe de la présente invention.
L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'un des polymorphismes de la présente invention dans le gène ABC1, chez un sujet, comprenant : a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus ;
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Figure img00640001

b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 comprenant un des polymorphismes de l'invention sont donc utiles pour la détection de la présence d'au moins un allèle polymorphe du gène ABCA1 dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
De préférence, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second mode de réalisation, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1, et 3-23 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les"puces à ADN". De telles matrices ordonnées
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Figure img00650001

ont été en particulier décrites dans le brevet US Nu 5, 143, 854, dans les demandes WO 90/15070 et WO 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N'5, 412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995. Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification
Figure img00650002

d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1, et 3-23 ledit nécessaire ou. kit comprenant a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification. Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé destiné à la détection de la présence d'une protéine ABCA1 polymorphe dans un échantillon, comprenant les étapes de a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps tel que précédemment décrit ; et b) détection du complexe antigène/anticorps formé.
La présente invention a également pour objet un nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide ABCA1 polymorphe dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant a) un anticorps tel que précédemment décrit ; et b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticorps formés.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.
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Figure img00660001
La figure 1 illustre la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence nucléotidique du transcrit du gène humain ABC 1 ; La figure 2 illustre la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 correspondant à la séquence peptidique de la protéine transporteur ABCA1 ; La figure 3 illustre la séquence régulatrice SEQ ID NO : 23 en amont du gène humain ABCA1 ; la position des différents polymorphismes est indiquée en gras.
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DES POLYMORPHISMES DE ABCA1 La détection de polymorphismes dans les séquences des transcrits ou dans les séquences génomiques du gène ABCA1 peut être réalisée selon différents protocoles.
La méthode de choix est le séquençage direct.
Dans le cas d'un transcrit où la structure du gène correspondant est inconnue ou partiellement connue, il est nécessaire de déterminer précisément sa structure intronexon ainsi que la séquence génomique du gène correspondant. Il s'agit donc dans un premier temps d'isoler le ou les clones de BAC d'ADN génomique correspondant au transcrit étudié, de séquencer l'insert du ou des clones correspondants et de déterminer la structure intron-exon en comparant la séquence de l'ADNc à celle de l'ADN génomique obtenu.
La technique de détection de polymorphismes par séquençage direct consiste à comparer les séquences génomiques du gène ABCA1 obtenues à partir d'au moins 32 individus de chaque population testée, caucasienne, africaine et japonaise. Les divergences de séquence constituent des polymorphismes. Tous ceux modifiant la séquence en acides aminés de la protéine sauvage sont des mutations susceptibles d'affecter la fonction de ladite protéine qu'il est intéressant de considérer plus particulièrement dans les études d'association cas/témoin décrites dans l'Exemple 2.
Des amorces pour l'amplification de l'ADN des individus ont été conçues à partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène ABC1, de telle manière à ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la
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formation de la structure secondaire durant l'étape d'épissage de l'ARN soit incluses dans les fragments amplifiés.
L'ADN génomique des individus a été amplifié à l'aide des amorces décrites cidessus en utilisant le kit Qiagen's Star Taq&commat; (Qiagen, Valencia, CA) ou encore le kit Supertaq) (Ambion, Austin, TX) en utilisant les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur.
Les produits PCR amplifiés ont été purifiés en utilisant un kit commercialisé par la société Qiagen, puis séquencés par la méthode Big Dye Terminator sur un séquenceur ABI 3700 (Apllied Biosystems, Foster City, CA).
EXEMPLE 2 : ANALYSE DES POLYMORPHISMES DU GENE ABCAI L'étude Cas-Témoins de l'Infarctus du Myocarde (ECTIM) est une étude de patients victimes d'un infarctus du myocarde et de sujets contrôles provenant d'Irlande du Nord, d'Angleterre et de France (tous du type Caucasien).
L'étude a été réalisée afin d'identifier une éventuelle association des polymorphismes exoniques tels que par exemple s-16elb, s-113e6, s-135e8, s-148el4, s-136el6, s- 101el7, s-54e23, s-7e30, s-62e34, s-833e49 et s-2034e49, avec les taux d'HDL cholestérol, Apo-1 et ApoA-II plasmatiques chez les témoins et les patients.
L'ADN génomique des individus a été amplifié à l'aide des amorces décrites cidessus permettant d'amplifier spécifiquement l'exon d'intérêt et les jonctions intronexon correspondantes en utilisant par exemple le kit Qiagen's Star Taq e (Qiagen, Valencia, CA) ou encore le kit Supertaq (S) (Ambion, Austin, TX) dans les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur. Sur ces amplifiats des réactions de mini-séquençage ont été réalisées pour chacun des polymorphismes sélectionnés. Le génotype de chacun des témoins et des patients a ainsi pu être déterminé pour chacun des polymorphismes.
Ces données ont été analysées avec le logiciel SAS. L'équilibre Hardy-Weinberg a été
Figure img00670001

testé par un test de X2 avec 1 df Les fréquences génotypiques et alléliques ont été comparées entre les groupes par tests de y, 2. Les différents paramètres phénotypiques ont été comparé entre les génotypes par analyse de variance ANOVA.

Claims (38)

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID Nu 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique dérivé d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID Nu 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique comprenant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID Nu 24-126, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5,
Figure img00680002
s-113e6, s-135e8, s-24il3, s-148el4, s-81il4, s-115i14, s-196el5, s-136el6, s-18il9, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-ml3i9, s-126el2, s-m59il3, s-4el8, s-40el9, s-mlOil9, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-ml42i32, s-mll9i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35ela, s-108e6, sm89i8, s-mlO4i9, s-m29il2, s-107el7, s-m68il7, s-98e24, s-30i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76elb, s-27el7, s-60il7, s-54e23, sm26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16elb, s-ml4i7, s-m61i9, s- ml30i32.
4. Acide nucléique comprenant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
Figure img00680003
NO : 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCA1 SEQ ID NO : 23, un
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polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642, 2091, ii) un T en positions 1093,1499, 1677,1795, 2330,2592, 2880, iii) un G en positions 1080,1242, 1954, iv) un C en positions 1388,2487, 2616,2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, et vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, et une délétion de CACCC en position 2671.
Figure img00690001
5. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynuléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
Figure img00690002
NO : 24-126 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24il3, s-148el4, s-81il4, s-115i14, s-196el5, s-136el6, s-18il9, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-ml3i9, s-126el2, s-m59il3, s-4el8, s-40el9, s-mlOil9, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-ml42i32, s-ml 19i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35ela, s-108e6, sm89i8, s-ml04i9, s-m29il2, s-107el7, s-m68il7, s-98e24, s-30i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76elb, s-27el7, s-60il7, s-54e23, sm26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16elb, s-ml4i7, s-m61i9, s- ml30i32.
6. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
Figure img00690003
NO : 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire et comprenant, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCA1 SEQ ID NO : 23, un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A en positions 505,1642, 2091, ii) un T en positions 1093,1499, 1677,1795, 2330,2592, 2880, iii) un G en
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positions 1080, 1242, 1954, iv) un C en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, et vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, une délétion de CACCC en position 2671.
Figure img00700001
7. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un base polymorphe localisée au centre du fragment de 21 nucleotides et choisie dans
Figure img00700002
groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24il3, s- 148el4, s-81il4, s-115il4, s-196el5, s-136el6, s-18il9, s-m65i22, s-149e24, s- 44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s- 123e8, s-ml3i9, s-126el2, s-m59il3, s-4el8, s-40el9, s-m10i19, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-ml42i32, s-ml 19i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s- 1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35ela, s-108e6, s-m89i8, sml04i9, s-m29il2, s-107el7, s-m68il7, s-98e24, s-10i31, s-251i39, s-13i47, s- 2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76elb, s-27el7, s-60il7, s-54e23, s-m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée sm41i9, et vi) une insertion nommées s-16elb, s-ml4i7, s-m61i9, s-ml30i32.
8. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant une base polymorphe localisée au centre dudit fragment de 21 nucleotides et choisie dans groupe constitué par i) un A en positions 505,1642, 2091, ii) un T en positions 1093, 1499,1677, 1795,2330, 2592,2880, iii) un G en positions 1080,1242, 1954, iv) un C en positions 1388,2487, 2616,2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, vi) une délétion de TTTG en
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9. Acide nucléique hybridant dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, et une délétion de CACCC en position 2671, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCA1 SEQ ID NO : 23
Figure img00710001
10. Acide nucléique codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué des séquences peptidiques SEQ ID NO : 127-136.
11. Acide nucléique comprenant : a) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158 ; et b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.
12. Polypeptide ABCA1 polymorphe, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi dans le groupe des polypeptides de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 127-136.
13. Sonde ou amorce nucléotidique spécifique du gène ABCA1 comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
14. Sonde ou amorce selon la revendication 13, utile pour la détection d'un polymorphisme dans le gène ABCA1, d'une longueur d'au moins 15 nucléotides.
15. Sonde ou amorce nucléotidique amorce selon la revendication 13, utile pour la détection d'un polymorphisme dans le gène ABCA1, d'une longueur d'au moins 21 nucléotides.
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Figure img00720001
16. Sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé marqueur dont la présence est détectable.
17. Amorce nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15, la base de l'extrémité 3'de la dite amorce étant complémentaire du nucléotide localisé immédiatement du côté 3'de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158 ou de leurs séquences complémentaires.
18. Amorce nucléotidique selon la revendication 17, la base de l'extrémité 3' de la dite amorce étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2,3, 4,5, 6,7, 8,9, 10, 11,12, 13,14, 15,16, 17,18, 19,20 nucléotides ou plus du côté 3'de la position du polymorphisme de l'une des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158 ou de leurs séquences complémentaires.
19. Marqueur génétique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
20. Procédé pour la détection d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de la position polymorphe cible à amplifier de l'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
21. Procédé de détection selon la revendication 20, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les amorces selon l'une des revendications 13 à 15,17 ou 18.
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Figure img00730001
22. Nécessaire pour la détection d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de la position polymorphe cible à amplifier de l'acide nucléique la revendication 1 ou 2 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
23. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies dans le groupe constitué des amorces selon l'une des revendications 13 à 15,17 ou 18.
24. Procédé de détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, tout
Figure img00730002
ou une partie du gène ABCA1, à l'aide d'une amorce nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15, 17 ou 18 ; b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID ? 1 et 3-23 ; c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquencé provenant du matériel biologique du sujet à tester et les séquences SEQ ID NO : 1 et 3-23 de référence.
25. Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, comprenant a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région choisie parmi les
Figure img00730003
séquences SEQ ID NO : 24-126 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158 ; et b) les moyens nécessaires au séquençage de tout ou partie de l'acide nucléique correspondant au gène ABCA1 aux positions polymorphes de l'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.
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26. Procédé de détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléiques selon l'une des revendications 13 à 16 avec l'échantillon provenant du sujet à tester ; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Figure img00740001
27. Procédé de détection selon la revendication 26, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
28. Nécessaire pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
29. Nécessaire de détection selon la revendication 28, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
30. Procédé de diagnostic d'un risque d'infarctus du myocarde chez un sujet, consistant à détecter par un procédé selon l'une des revendications 24,26 ou 27, la présence chez ledit sujet d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de
Figure img00740002
séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymorphe A en position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15.
31. Procédé de diagnostic d'un risque d'affection cardiovasculaire chez un sujet, consistant à détecter par un procédé selon l'une des revendications 24,26 ou 27, la présence chez ledit sujet d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymorphe A en position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 15.
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Figure img00750001
32. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11.
33. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 32.
34. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon la revendication 1 à 11 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 32.
35. Anticorps dirigé contre un polypeptide ABCA1 polymorphe selon la revendication 12, ou un fragment peptidique de ce dernier.
36. Anticorps selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend un composé détectable.
37. Procédé pour détecter la présence d'un protéine ABCA1 polymorphe selon la revendication 12 dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon l'une des revendications 35 ou 36 ; b) détection du complexe antigène/anticorps formé.
38. Nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon la revendication 12 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps selon l'une des revendications 35 ou 36 ; b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticorps formés.
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