FR2721032A1

FR2721032A1 - Protéines liant le complexe lipopolysaccharidique (LPS), et leurs utilisations.

Info

Publication number: FR2721032A1
Application number: FR9407083A
Authority: FR
Inventors: Lee Won-Jae; Paul T Brey
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1994-06-09
Publication date: 1995-12-15

Abstract

Protéines liant le complexe lipopolysaccharidique des bactéries et oligonucléotides codant pour ces protéines. Ces protéines peuvent être utilisées dans le traitement d'affections liées au complexe lipopolysaccharidique et en particulier pour traiter le choc septique. Elles peuvent être aussi mises en œuvre pour éliminer le complexe de préparations contenant ce dernier.

Description

i La présente invention a pour objet une protéine liant

le complexe lipopolysaccharidique (LPS).

Elle est en outre relative aux applications de cette protéine, en particulier dans une plante transgénique exprimant cette protéine. Les attaques mécaniques, par exemple des insectes phytopathogènes, et les infections par les champignons, les bactéries et les virus induisent dans les tissus des plantes atteintes la synthèse de protéines appelées "Pathogenis

related protein" (protéines PR).

Les P-1,3 glucanases sont parmi les plus connues et les mieux étudiées de ces protéines PR. Cette observation et le fait que les P-1,3 glucanes constituent les composants majoritaires des parois des cellules fongiques ont conduit à émettre l'hypothèse d'une implication des P- 1,3 glucanases

dans les défenses moléculaires des plantes.

Plusieurs auteurs ont suggéré que de tels enzymes constituaient des facteurs de résistance aux maladies et agissaient en attaquant les parois cellulaires des champignons

pathogènes induisant ainsi la lyse ou des effets inhibiteurs.

Si le mécanisme théorique de certaines P-1,3 glucanases a été étudié, aucune application pratique de ce type d'enzyme

n'a jusqu'à présent été proposée.

Ainsi, à la connaissance du demandeur, aucune plante transgénique codant pour des /-1,3 glucanases exogènes n'a été

décrite dans l'état de la technique.

On notera que si la présence de P-1,3 glucanase a été

remarquée dans des plantes et des bactéries, aucune 0-1,3-

glucanase, ni /-1,3-1,4 glucanase, n'est à la connaissance du

demandeur, synthétisée chez les animaux.

Chez l'homme et chez certains animaux, les infections par des bactéries gram-négatives peuvent provoquer de graves modifications pathologiques liées au choc septique. Par exemple, aux Etats-Unis le choc septique est responsable de

100.000 morts environ par an.

A la connaissance des demandeurs, aucun médicament efficace n'est actuellement disponible contre de telles affections. Des protéines d'un arthropède marin (Xiphosma) appelé communément crabe des Moluques (Horseshoe crab en anglais) ont

été proposées comme médicaments.

Les hémocytes de ces crustacés étaient connus pour

agréger les endotoxines bactériennes.

AKETAGAWA et al. ont mis en évidence en 1986, (The Journal of Biological Chemistry, 261, n'16, 7357-7365), la structure d'une protéine de l'espèce japonaise (Tachypleus

tridentatus) présentant une activité anti-

lipopolysaccharidique. Le séquençage d'une protéine, présentant une identité de séquence de 83% avec la précédente, a été effectué à partir de l'espèce américaine (Limulus Polyphemus) par Muta et al. (J. Biochem. 101, 1321-1330,

1987).

Dans la demande internationale PCT/JP 88/00823, une protéine ayant une forte affinité pour le complexe lipopolysaccharidique est en outre décrite, ainsi que son utilisation pour éliminer les endotoxines bactériennes et

comme agent thérapeutique contre les infections bactériennes.

Néanmoins, ces protéines présentent l'inconvénient notable d'être issues d'organismes très éloignés des

mammifères et en particulier de l'homme.

Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules permettant de prévenir et de combattre de manière efficace le choc septique du aux infections, notamment par des

bactéries gram-négatives.

Le complexe lipopolysaccharidique (LPS) des bactéries gram-négatives peut d'autre part constituer un contaminant de divers fluides tant biologiques que synthétiques, et en

particulier des liquides injectables dans le corps humain.

Les molécules connues pour lier le complexe lipopolysaccharidique (LPS), appelées LPSBP (en anglais LPS binding protein), et mentionnées ci-dessus pour leur effet thérapeutique ont déjà été proposées pour l'élimination du LPS

de préparations o elles pourraient être présentes.

Néanmoins, il est nécessaire de trouver des molécules présentant une plus grande spécificité et une plus grande sensibilité pour leurs liaisons vis-à-vis du complexe lipopolysaccharidique. Le demandeur s'est donc attaché à trouver un moyen permettant d'une part de combattre le choc septique chez les mammifères et en particulier chez l'homme et d'autre part de

combattre les bactéries phytopathogènes.

Le demandeur a mis en évidence que le ver à soie de l'espèce Bombyx mori produit une protéine répondant à ces deux exigences. Il a ainsi mis en évidence que cette protéine permet de combattre le choc septique induit par la présence de complexe lipopolysaccharidique (LPS) et d'autre part d'éliminer ce complexe des préparations destinées à être injectées en

particulier à l'homme.

Il a aussi montré que l'intégration dans le génome des plantes d'un gène codant pour cette protéine permet de

combattre les infections fongiques phytopathogènes.

La présente invention a pour objet une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend en totalité ou en partie la séquence SEQ ID N'1 suivante: Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe

Gln Gly Asn Leu.

Elle est en outre relative à une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend en partie ou en totalité la séquence SEQ ID N'2 suivante: Phe His Thr Tyr Ser Val Gln Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu

Ser Val Asp Gly.

De telles protéines présentent avantageusement un poids moléculaire de l'ordre de 50 kD. Elles comprennent préférentiellement la séquence SEQ ID N'3 ou une partie de la séquence SEQ ID N'3 suivante: Lys Ile Ser Tyr Ala Gln Met Pro Asp Val Lys Ile Gln Ala Phe Arg Pro Lys Gly Leu Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln Gly Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val Gly Thr Leu Ser Ala Glu Val Leu Asp Pro Val Asn Gly Arg Trp Val Tyr Glu Glu Pro Asp Leu Lys Leu Lys Val Lys Asp Val Val Tyr Tyr Asn Ala Val Phe Ser Ile Asn Lys Lys Ile Tyr Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu Asp Pro Asn Ala Ser Thr Asp Ser Gln Lys Pro Glu Cys Lys Pro Thr Lys Thr Arg Val Arg Gly Gly Lys Ala Cys Ala Gly Gln Thr Ile Phe Glu Glu Gln Phe Asp Ser Leu Asp Glu Asn Val Trp Gln Ile Glu Gln Tyr Ile Pro Ile Tyr His Pro Glu Tyr Pro Phe Val Ser Tyr Gln Arg Asn Asn Leu Thr Val Ser Thr Ala Asp Gly Asn Leu His Ile Asn Ala Lys Leu Gln Gln His Met Pro Gly Phe Leu Asp Asp Ser Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Asn Leu Phe Ser Gly Cys Thr Ser Ser Ala Glu Ala Cys Ile Lys Gln Ala Ser Gly Ala Asp Ile Leu Pro Pro Ile Val Ser Gly Arg Ile Thr Ser Ile Gly Phe Ala Phe Thr Tyr Gly Thr Val Glu Ile Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gly Asp Trp Leu Tyr Pro Glu Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Met Asn Tyr Ala Ser Gly Val Val Lys Ile Ala Cys Ala Arg Gly Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Gly Pro Asn Asp Tyr Ser Asn Thr Val Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Met Asp Leu Glu Cys Arg Glu Asn Phe Leu Ser Thr Lys Arg Arg Arg Asp Gly Thr Ser Trp Gly Asp Ser Phe His Thr Tyr Ser Val Gln Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu Ser Val Asp Gly Glu Glu Trp Ala Arg Val Glu Ala Pro Arg Asp Ala Leu Pro Ala Val Cys Ala His Ala Pro Arg His Leu Leu Gln Ala Gly Ser Gln Met Ala Pro Phe Asp Asp His Phe Tyr Ile Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Gly Ile Thr Glu Phe Arg Asp Gly Ser Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Lys Pro Trp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Ala Ser Val His Phe Trp Arg His Met Ser Asp Trp Phe Pro Arg Trp Ser Gln Pro Ser Leu Ile Val Asp Phe Val Lys Val Ile Ala Leu Les dites protéines peuvent aussi présenter la séquence ID N'5 ou une partie de la SEQ ID N'5 suivante: Met Gly Gly Arg Val Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ile Lys Ile Ser Tyr Ala Gln Met Pro Asp Val Lys Ile Gln Ala Phe Arg Pro Lys Gly Leu Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln Gly Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val Gly Thr Leu Ser Ala Glu Val Leu Asp Pro Val Asn Gly Arg Trp Val Tyr Glu Glu Pro Asp Leu Lys Leu Lys Val Lys Asp Val Val Tyr Tyr Asn Ala Val Phe Ser Ile Asn Lys Lys Ile Tyr Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu Asp Pro Asn Ala Ser Thr Asp Ser Gln Lys Pro Glu Cys Lys Pro Thr Lys Thr Arg Val Arg Gly Gly Lys Ala Cys Ala Gly Gln Thr Ile Phe Glu Glu Gln Phe Asp Ser Leu Asp Glu Asn Val Trp Gln Ile Glu Gln Tyr Ile Pro Ile Tyr His Pro Glu Tyr Pro Phe Val Ser Tyr Gln Arg Asn Asn Leu Thr Val Ser Thr Ala Asp Gly Asn Leu His Ile Asn Ala Lys Leu Gln Gln His Met Pro Gly Phe Leu Asp Asp Ser Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Asn Leu Phe Ser Gly Cys Thr Ser Ser Ala Glu Ala Cys Ile Lys Gln Ala Ser Gly Ala Asp Ile Leu Pro Pro Ile Val Ser Gly Arg Ile Thr Ser Ile Gly Phe Ala Phe Thr Tyr Gly Thr Val Glu Ile Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gly Asp Trp Leu Tyr Pro Glu Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Met Asn Tyr Ala Ser Gly Val Val Lys Ile Ala Cys Ala Arg Gly Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Gly Pro Asn Asp Tyr Ser Asn Thr Val Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Met Asp Leu Glu Cys Arg Glu Asn Phe Leu Ser Thr Lys Arg Arg Arg Asp Gly Thr Ser Trp Gly Asp Ser Phe His Thr Tyr Ser Val Gln Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu Ser Val Asp Gly Glu Glu Trp Ala Arg Val Glu Ala Pro Arg Asp Ala Leu Pro Ala Val Cys Ala His Ala Pro Arg His Leu Leu Gln Ala Gly Ser Gln Met Ala Pro Phe Asp Asp His Phe Tyr Ile Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Gly Ile Thr Glu Phe Arg Asp Gly Ser Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Lys Pro Trp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Ala Ser Val His Phe Trp Arg His Met Ser Asp Trp Phe Pro Arg Trp Ser Gln Pro Ser Leu Ile Val Asp Phe Val Lys Val Ile Ala Leu Cette dernière proteine présente avantageusement une glycosylation, en particulier en position 182 de sa séquence

d'acides aminés.

On notera que la présente invention concerne non

seulement les protéines dont la séquence est indiquée ci-

dessus mais aussi leurs fragments ainsi que tous les variants de ces protéines qui consisteraient en des modifications dans la structure ne modifiant pas la fonction de ces protéines, que ce soit en particulier une fonction de protection des plantes contre les phytopathogènes, de traitement de choc

septique ou de liaison du LPS.

Notamment, de tels variants peuvent consister en des substitutions d'un acide aminé par un autre acide aminé présentant une formule différente mais une fonction

sensiblement identique.

L'ouvrage de Lehninger (Biochimie, Bases moléculaires de la structure et des fonctions cellulaires, seconde édition 1979, Flammarion Médecine Science Ed.) précise que les vingt acides aminés les plus fréquemment rencontrés peuvent être subdivisés en quatre groupes, en fonction de leurs structures chimiques. On notera que selon la présente invention, la

substitution d'un acide aminé d'une des protéines décrites ci-

dessus par un autre acide aminé appartenant au même groupe n'introduit pas un changement fonctionnel dans la structure de la protéine, et que les protéines dans lesquelles il existe une simple substitution de ce type, appelée aussi substitution

conservative, rentrent dans le cadre de la présente invention.

Ceci n'implique pas pour autant que des substitutions d'un acide aminé d'un groupe donné par un autre acide aminé appartenant à un autre groupe aient pour effet d'écarter de

telles protéines modifiées du cadre de la présente invention.

En effet, la présente invention concerne toute molécule présentant une structure similaire et dont la fonction telle

que définie ci-dessus est conservée.

La présente invention est en outre relative à des oligonucléotides, et en particulier des molécules d'ADN codant au moins pour l'une des protéines ou l'un de ses fragments décrits ci-dessus, et est relative en particulier à la molécule d'ADN comprenant la séquence SEQ ID N'4 suivante:

GAGGATCCGG GTACC ATG GGT GGA CGC GTG TTG TGT CTG ATT TTA TTT

ATA AAA ATA TCG TAC GCT CAA ATG CCC GAT GTG AAA ATA CAA GCT

TTT CGC CCG AAA GGA CTT CGA ATA TCC GTT CAA GAT GTC CCC AAA

ATG ACA CTG TTC GCG TTC CAA GGC AAC TTG AAC CAT AAA CTG GAC

AGC ACC AGC GTC GGG ACA CTG AGT GCA GAG GTA CTG GAT CCA GTC

AAC GGC CGA TGG GTG TAC GAA GAG CCC GAT CTT AAA CTA AAA GTC

AAG GAC GTC GTC TAT TAT AAC GCG GTC TTC TCA ATC AAC AAG AAA

ATA TAC GAG AAA ACA AAC CAA CAG TTC ACC GTA ACA GAG CTA GAA

GAT CCT AAT GCA AGC ACA GAT TCT CAG AAA CCA GAA TGT AAG CCA

ACA AAG ACG AGA GTG CGA GGC GGC AAA GCG TGT GCC GGA CAA ACA

ATA TTC GAG GAG CAA TTT GAT TCC CTG GAC GAA AAC GTT TGG CAA

ATC GAG CAG TAT ATA CCG ATT TAT CAC CCC GAA TAC CCC TTC GTG

TCC TAC CAG CGT AAT AAT TTA ACA GTA TCT ACC GCA GAT GGA AAC

CTA CAT ATT AAC GCC AAA CTT CAA CAA CAT ATG CCC GGC TTT CTG

GAC GAC TCT ATA TAT TCT GGC ACA CTT AAT TTG TTC AGT GGG TGT

ACT TCG TCA GCA GAG GCA TGC ATC AAA CAG GCT TCC GGT GCT GAT

ATT CTA CCA CCA ATC GTC AGC GGC AGA ATC ACA TCA ATA GGA TTT

GCA TTT ACG TAC GGA ACA GTC GAA ATC AGA GCG AAA TTA CCG CAA

GGG GAC TGG CTG TAT CCG GAA ATT CTA TTG GAG CCG TTC TTA AAG

AAG TAT GGA AGT ATG AAT TAT GCG TCC GGC GTA GTG AAG ATA GCG

TGT GCG CGC GGT AAT GCA GAA CTC TAT TCC GGA CCT AAT GAC TAC

AGC AAT ACG GTT TTG TAC GGA GGA CCG ATC ATG GAT CTG GAG TGC

CGC GAG AAC TTT CTC TCC ACA AAA AGA CGC AGA GAC GGC ACG TCG

TGG GGC GAC AGT TTT CAT ACA TAT TCC GTT CAA TGG ACA CCT GAT

TTC ATA GCC CTG TCT GTG GAC GGC GAG GAG TGG GCG CGA GTG GAG

GCG CCG CGG GAC GCC CTG CCG GCT GTC TGC GCG CAC GCC CCG CGG

CAC CTG CTG CAG GCC GGC TCG CAG ATG GCG CCA TTC GAT GAC CAC

TTC TAC ATA ACG CTA GGC GTG GCG GCA GGA GGC ATA ACG GAG TTC

CGC GAC GGG TCT ATA ACC TCC GGG GGA GTC ACC AAG CCC TGG AGA

GAC AGC GCT CGG AAG GCA TCC GTA CAT TTC TGG CGG CAC ATG TCC

GAT TGG TTC CCA CGG TGG AGT CAG CCA TCT TTA ATC GTG GAC TTT

GTC AAA GTT ATC GCC TTA TGATCTAGTC ATTTAGATTT TGTATAATTA

AGTTATTAGT ATAGTTTCTG CAGGCAAAAT TAATTGCATT CTGAGTTTTT

ATTGTCAAAC TACAATTTAA AATTTAATTC CTAAAAGATC TCTCTTCTTT

CTAAATCTGT AATTTAGCTA ATTTTATTTG TATCATTTTC TTTTTTTAAA

TTTTGATAGA GCGGCGAATG ACTAGAAGAT GTGATCTGCG AAAATAAAAC

TAAGTGACAT GCATGCAAAG GCATACACAC AACAGAGTTT TGCATTATTA

TTACCTTTCT TGAGCGAGAT GAGGACTACT GACGTGACCT GGAGTGATAT

TTTGGAGCAA GCCTAAGACA GGGTCAAGTG GAGACAGCTC TAAGGCCCCT

ATGTACCGGC GGGGTGTCTT AGGGCTGCAA TAACAACATT ACCTTTCTTA

ACCAAACAGC GATATTATCT GTAATATTAT AGTTAGAAAG CCTGCATCTT

ATACTCTTAT TGACACACGT ACCTGGATGA TTTTAACGAT GAAGAAATAA

CATCGTGTAA AAAATTTAGC TGGAAAAGAT TTTGAGGAAT CAAGAAATAC

CCTATGAACC AGCACAGGTA CGTGTCACCA CTCTGGCTAA TTCTGCCACG

TTGCGGTTGG TTTGAAGTTT GAGACAACCT TTGCACGATA CAATTGAGAC

TAAGACCTCA TGGCTCGGAG TGAGTGGAGT CATTCAAGTT GCGACTGGCT

CCAGTAACCA CTTATAACCA GGTAGATCGT GAGCCTATCA GCTCATTTAG

AGCAACAAAA AACAAAATAA TGTACTCTTG AAAAAATCAT TTTAATAAAA

GACCAGAGTG AAAAAAAAAA AAAAA

La présente invention a de plus pour objet des cellules eucaryotes ou procaryotes exprimant une des protéines décrites ci-dessus ou un de leurs fragments, ou portant au moins une

partie d'un oligonucléotide mentionné ci-dessus.

L'une des cellules est avantageusement une cellule bactérienne ou une cellule végétale, par exemple issue d'une plante appartenant à la famille de la vigne, du tabac, de la

tomate ou de la pomme de terre.

Un autre objet de la présente invention est un procédé d'obtention d'une des protéines décrites ci-dessus ou d'un de leurs fragments, caractérisé en ce qu'un oligonucléotide, tel qu'un de ceux mentionnés ci- dessus, est exprimé dans une

cellule procaryote ou eucaryote adaptée.

Les protéines, objets de la présente invention peuvent néanmoins être obtenues par toute autre méthode à la disposition de l'homme du métier, telle que la synthèse chimique, et en particulier celles répertoriées dans le manuel général: "Molecular cloning: A Laboratory manual" (Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY,

2ème édition) et dans ses rééditions récentes.

De manière générale, l'homme du métier se référera aussi à ce manuel pour la mise en oeuvre de la présente invention. Outre les objets mentionnés ci-dessus, la présente invention est relative à un médicament contenant une des protéines décrites ci-dessus ou un de leurs fragments et l'utilisation d'une telle protéine pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des affections liées au complexe lipopolysaccharidique, et en particulier pour traiter le choc septique. On notera que la distance génétique entre les mammifères et le ver à soie est plus faible que celle entre les mammifères et les Xiphosma. Les protéines objets de la présente invention, qui sont dérivées d'une protéine du ver à soie seront donc mieux acceptées par les mammifères, et en particulier l'homme, que les protéines extraites de Limulus, ou, d'espèces voisines, dont l'utilisation est proposée dans

PCT/JP88/00823.

L'administration des protéines selon l'invention pourra se faire par toute méthode appropriée, préférentiellement par injection afin de combattre rapidement les effets du choc septique. Un autre objet de la présente invention est un procédé d'élimination du complexe lipopolysaccharidique de préparations contenant ce dernier, ledit procédé consistant à lier ledit complexe à une des protéines décrites ci-dessus ou

à un de leurs fragments.

Un tel procédé peut notamment être mis en oeuvre en

fixant sur un support la protéine liant ledit complexe.

La présente invention a encore pour objet une plante portant au moins un gène codant pour une protéine exogène

ayant une activité (-1,3 glucanase.

Une telle protéine est avantageusement une des protéines définies ci-dessus ou un de ses fragments. Le gène porté par la plante peut quant à lui comprendre au moins une

partie d'un ADN défini ci-dessus.

Une telle plante appartient de manière préférentielle à la famille de la vigne, du tabac, de la tomate ou de la pomme

de terre.

Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation de fragments des oligonucléotides décrits ci- dessus pour l'amplification génique. Une telle amplification peut être mise en oeuvre selon la méthode décrite dans la

demande FR-92.13.562.

La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent et en référence aux dessins annexés dans lesquels: La figure lA représente un gel SDS-PAGE d'extraits de bactéries gram-négatives. Le puits 1 correspond à un mélange de marqueurs protéiques (phosphorylase b, 92 kD; sérum albumine bovine 66,2 kD; ovalbumine 43 kD; anhydrase carbonique 30 kD). Le puits 2 est un témoin du test de liaison effectué sans hémolymphe (bactéries seules). Le puits 3 est un test de liaison effectué avec de l'hémolymphe immune (immunisation par injection de E. cloacae). Le puits 4 correspond à un test de liaison effectué avec de l'hémolymphe immune, l'immunisation ayant été effectuée par abrasion

procuticulaire et application topique de E. cloacae.

La figure lB est une cartographie peptidique effectuée en CHLP à la suite de la digestion in situ de la protéine P-50 par l'endopeptidase Lys-C. Les pics peptidiques indiqués par les flèches noires et blanches ont été soumis à une analyse de

leur séquence en acides aminés.

La figure 2 illustre un test de liaison effectué en utilisant de l'hémolymphe non-immune (puits 3) ou de l'hémolymphe immune (puits 1, 2, 4, 5 et 6). Les temps d'incubation du test de liaison sont d'une minute (puits 1); de 2,5 minutes (puits 2 et 3), de 5 minutes (puits 4), de 15 minutes (puits 5), et de 30 minutes (puits 6). Le puits 7 correspond à des marqueurs de poids moléculaire dont les

tailles sont indiquées en kD.

La figure 3A illustre la position des deux paires d'amorces dégénérées (P1 et P3 pour le brin sens et P2 et P4

pour le brin anti-sens).

La figure 3B représente l'analyse des produits MOPAC sur un gel d'agarose à 2%. Le puits 1 correspond à un aliquote de 10 pl du produit MOPAC obtenu en utilisant P1 et P4. Le puits 2 correspond à un aliquote de 10p1 du produit MOPAC obtenu en utilisant P3 et P2. Le puits 3 correspond au marqueur de poids moléculaire (100 pb Ladder Pharmacia). La

flèche indique la position du produit de 160 paires de base.

La figure 4 représente une carte de restriction utilisée pour l'analyse du cDNA P-50 lambdaBP5001. La région

de la protéine codante est indiquée en blanc.

La figure 5 illustre l'analyse de l'hydropathie de la protéine P-50. Les numéros des résidus aminoacides sont indiqués sur la ligne horizontale tandis que l'hydrophobie et

l'hydrophilie sont indiquées respectivement au-dessus et en-

dessous de la ligne horizontale.

La figure 6 illustre les similarités et les identités

de séquences entre la P-50 et diverses glucanases.

La signification des abréviations est comme suit: Bci: 13-1,3 glucanase de Bacillus circulans, Fsu:f-1,3-1,4 glucanase de Fibrobacter succinogenes; Cth: 0-1,3-1,4 glucanase de Clostridium thermocellum; Bsu: P-1,3-1,4 glucanase de Bacillus subtilis; Bam:3-1,3-1,4 glucanase de Bacillus amylofiquefaciens; Bma: P-1,3-1,4 glucanase de Bacillus macerans; Bli: 1-1,3-1,4 glucanase de Bacillus licheniformis. La figure 7 illustre les similarités et les identités de séquences entre P-50 et les domaines de liaison du LPS des protéines LBP et BPI humaines, telles que décrites par SCHUMANN et al. (1990, Science, 249, 1429) et HOESS et al.

(1993, EMBO J., 12, N'9, 3351-3356).

Dans ces deux dernières figures les similarités et les identités entre les acides aminés sont indiquées par des cadres. Les acides aminés identiques sont quant à eux indiqués par des points. Les nombres indiqués sur la gauche se réfèrent

à la position du résidu dans chaque protéine.

La figure 8 est une photographie d'un gel SDS-PAGE fluorographié de produits de traduction d'ARN messagers codant pour la protéine P-50 (puits 1). Le puits 2 correspond à un témoin sans ARN messagers. Les poids moléculaires de référence

sont indiqués sur la droite de la figure.

La figure 9A est un autoradiogramme d'un transfert d'ARN messagers hybridés avec le fragment Pst I/EcoRI de

lambdaBP5001 (1,2 kb).

Les puits 1,3 et 5 correspondent à 'ARN total extrait de corps gras de larves et les puits 2,4 et 6 correspondent à ARN total extrait de cellules épidermiques, avant abrasion procuticulaire (puits 1 et 2) et six heures après l'abrasion en présence de bactéries (puits 3 et 4) ou six heures après

l'abrasion sans bactéries (puits 5 et 6).

La taille de marqueur de poids moléculaire est indiquée

sur la gauche de l'autoradiogramme.

La figure 9B représente le même transfert déshybridé puis réhybridé avec une sonde correspondant à l'ADN complémentaire de l'a- tubuline (flèche blanche) et avec une

sonde correspondant au gène de la cécropine B2 (flèche noire).

EXEMPLE 1:

Détermination de la séquence de la protéine P-50

A) MATERIELS ET METHODES

1. Réactifs chimiques et instruments Les réactifs ont été fournis par Bio-Rad Labs

(Richmond, CA) pour l'acrylamide, la N,N'-

méthylènebisacrylamide, le persulfate d'ammonium, le N,N,N', N'-tétraméthyléthylènediamine, le Tris, la glycine et le Bleu de Bromophénol, par Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Tokyo, Japon) pour le 2-mercaptoéthanol, par Scharz/Mann Biotech (Cleveland, OH) pour la tricine, par Fluka Biochemika (Buchs, Allemagne), pour le sulfate de dodécyle sodique, par Perkin-Elmer Cetus pour la polymérase de Thermus aquaticus, par Sigma (St, Louis MO) pour Ponceau S, par Boehringer pour l'endopeptidase Lys-C, par Amersham pour le système ECL, par BRL pour la transcriptase inverse du MuLV, par Stratagène pour la trousse de clonage par PCR, par Amersham pour le système de marquage de l'ADN Mega Prime, par Stratagène pour le kit de transcription des ARN, par Pharmacia pour le kit de séquençage T7, par Promega pour la trousse de séquençage Taq Track, par Pharmacia-LKB (Uppsala, Suede) pour le mélange de marqueurs de poids moléculaire, et par Applied Biosystems (Foster City,

CA), pour la membrane à haute capacité Milli-ProBlott PVDF.

Tous les autres produits chimiques sont des produits

commerciaux de grande qualité.

2. Orqanismes, cellules, immunisation et récupération de l'hémolymphe Les vers à soie Bombyx mori (Asahi x Tokai) ont été

fournis par Toyo Sangyo Consulting, Inc., Tokyo, Japon.

Ils ont été cultivés sur un milieu artificiel (poudre

de mûrier) à 23'C avec une photopériode de 14 heures.

Des larves au cinquième stade de la mue sont cultivées jusqu'au 5ème jour de ce stade et immunisées par injection de pl d'Enterobacter cloacae (souche 57-9, Collection de l'Institut Pasteur) en fin de phase de croissance logarithmique. Les larves sont alors conservées 24 heures en

présence de nourriture puis l'hémolymphe est récupérée.

L'immunisation par abrasion cuticulaire et application de bactéries est effectuée comme décrite par Brey et al.

(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.90. 6275-6279).

Pour certaines expérimentations, les vers à soie sont aussi cultivés dans des conditions axéniques (Brey et al.,

1993, précédemment cités).

L'hémolymphe est récupérée en effectuant une incision du corps des larves dans des tubes contenant quelques cristaux de phénylthiourée puis est centrifugée à 4000 g durant 10

minutes à 4'C.

Le surnageant, constitué du plasma de l'hémolymphe, est

utilisé immédiatement ou stocké & - 80'C.

3. Test de liaison des bactéries in vitro Le test de liaison in vitro bactérie-plasma de l'hémolymphe a été effectué de manière substantielle comme

décrit par Sun et al. (1990, Science, 250: 1729-1732).

ml de bactéries gram-négatives E. cloacae ou gram-

positive Bacillus licheniformis en fin de phase de croissance logarithmique sont centrifugées, lavées et finalement resuspendues dans 200pl de Tris-HCl, 10 mM, pH 8 selon Sun et

al.(1990, précédemment cités).

La suspension bactérienne est ajoutée à 1 ml de plasma d'hémolymphe immune et incubée à température ambiante avec une

agitation modérée durant des périodes données.

Le mélange est centrifugé durant 2 minutes à 10.000 g, à 4' C, et le surnageant est éliminé avant d'effectuer un autre

test de liaison.

Le culot est lavé successivement avec 200 p1 d'une solution de NaCl dans laquelle la concentration en NaCl est augmentée de manière arithmétique après chaque lavage (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 et 0,5 M en NaCl) ou lavé deux fois dans 500 p1 d'une solution de NaCl 0,5 M et finalement élué avec 200 p1 d'une solution comprenant 0,5 M de NaCl et 0,1 M d'acétate

d'ammonium, pH 4,0.

L'éluant est utilisé pour effectuer un gel SDS/PAGE.

4. Electrophorèse et immobilisation des protéines L'électrophorèse sur le gel SDS-Polyacrylamide est effectuée par la méthode de Laemmli (1970, Nature 227:680) en utilisant un appareillage d'électrophorèse BioRad

miniprotéane.

Le séquençage de l'extrémité N-terminale de la protéine intacte ainsi que des fragments peptidiques obtenus par clivage enzymatique in situ a été effectué à l'aide du gel

Tricine SDS-PAGE (Ploug, 1989, Anal. Biochem. 181: 33-39).

Les protéines séparées par électrophorèse sont transférées sur une membrane mini-Problott PVDF selon les

instructions du fabricant.

5. Clivage enzymatique in situ et cartographie peptidique des séquences internes Après électrophorèse, le gel est fixé dans une solution contenant 50% de méthanol et 10% d'acide acétique et teint par

du noir amide durant 2 minutes.

Les bandes protéiques sont coupées et lavées dans de l'eau de qualité Milli Q puis remises dans le même tube et déshydratées à l'aide d'un Speed-Vac.

La digestion par l'Endopeptidase Lys-C (concentration finale: 2 pg/ml) est effectuée dans 300 pl de Tris-HCl, 0,1 M,

pH 8,8, contenant 0,03% de SDS à 30'C durant 18 heures.

Après digestion, le milieu total de réaction est centrifugé et le surnageant est immédiatement injecté sur une colonne de Chromatographie Liquide Haute Pression (CLHP) (Vydac, 2,1 x 250 mm). Les fragments peptidiques sont séparés sur un gradient linéaire d'acétonitrile (0-55%) contenant 0,1%

d'acide trifluoroacétique durant plus de 60 minutes.

Un flux de 200 pl/min. est appliqué et l'absorbance est mesurée à 214 et 280 nm. Chaque pic est récupéré manuellement

et stocké à -20'C pour une analyse ultérieure.

6. Analyse des séquences en acides aminés La protéine intacte immobilisée sur la membrane de PVDF ou les peptides issus de la digestion enzymatique sont séparés

par CHLP et sont ensuite soumis à un séquençage automatique.

La dégradation d'Edman automatique est effectuée sur un microséquenceur à phase gazeuse 477A (Applied Biosystems),

connecté à un analyseur à phénylthiohydantoïne (modèle 120A).

7. Analyse des ADN complémentaires obtenus par amplification dans un mélange d'oliqo-nucléotides

(analyse MOPAC).

Toutes les manipulations d'ADN et d'ARN ont été effectuées en utilisant des techniques standard décrites par Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 2nd Ed.). Deux paires d'amorces ont été synthétisées: P1 (brin sens) présentant la séquence suivante:

P1:5'-AA(A,G)ATGAC(A,C,G,T)(C,T)T(A,C,G,T)TT(T,C)GC(A,C,G,T)

TT-3 et P2 qui est l'anti-sens de Pi: Ces deux séquences comprennent des séquences internes complémentaires de tous les codons possibles pour la séquence

d'acides aminés Lys-Met-Thr-Leu-Phe-Ala-Phe.

Deux autres amorces P3 (brin sens) et P4 (brin anti-

sens) ont d'autre part été synthétisées. P3 présente la séquence suivante:

P3;5'-GT(A,C,G,T)TA(T,C)TA(T,C)AA(T,C)GC(A,C,G,T)GT(A,C,G,T)

TT-3'

P3 et P4 comprennent des séquences correspondant à toutes les possibilités de codons pour la séquence peptidique Val-Tyr-Tyr-Asn-Ala- Val-Phe. Pour la préparation de l'ARN matrice, une larve de ver à soie au 5ème stade (jour 5) a été immunisée avec 10 pl d'une

solution du complexe lipopolysaccharidique (2 mg/ml).

Après 6 heures le corps gras est récupéré et l'ARN total est extrait comme décrit par Auffray et Rougeon (1980,

Eur. J. Biochem. 107: 303-314).

L'ADN complémentaire simple brin est synthétisé à partir de l'ARN total en utilisant les amorces anti-sens (P2

ou P4) et la transcriptase inverse du MuLV (BRL).

L'ADN complémentaire simple brin est amplifié avec 1 mM des oligonucléotides assemblés en paires (P1 et P4, ou P2 et P3) dans une solution contenant 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 1,5 mM MgC12, 200 MM dNTP et 2,5 unités de polymérase de Thermus aquaticus (Lee et al. 1988, Science 239: 1288-1291, et

Lee et Caskey 1992, Methods in Enzymology 216: 69-72).

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est effectuée en dénaturant à une température de 94 C durant 30 secondes, un annelant à 52'C durant 1 minute, puis en effectuant l'extension à 72'C durant 2 minutes, durant 30

cycles en utilisant le Tempcycler II, Model 110P (Coy Corp.).

* Les aliquotes des mélanges amplifiés sont analysés sur des gels d'agarose à 2%. Les bandes teintes à l'aide de bromure d'éthidium sont découpées à partir du gel et l'ADN isolé est cloné dans le plasmide pCR-Script SK (+) en utilisant la trousse de clonage PCR commercialisée par Stratagene. 8. Criblaqe des ADN complémentaires Une librairie d'ADN complémentaires obtenue à partir du corps gras de Bombyx mori auquel on a injecté 10 heures avant des bactéries E. cloacae tuées par la chaleur, est préparée en

utilisant la trousse de synthèse d'ADN complémentaire lambda-

gt-10 commercialisée par Amersham.

Un produit de PCR d'une longueur de 160 paires de base obtenu par analyse MOPAC (combinaisons de P1 et de P4) a été marqué au phosphore 32 par marquage aléatoire (Mega Prime DNA Labeling System, Amersham) et utilisé afin de cribler la

banque d'ADN complémentaires.

Environ 75.000 colonies ont été étalées à une densité d'environ 2.500 colonies par boite de 90 mm de diamètre et

criblées en utilisant des filtres de Nylon (Amersham Hybond-

N). L'hybridation est effectuée en utilisant une solution comprenant 6 x SSC, 2 x solution de Denhardt, 0,1% SDS, 50%

formamide et de l'ADN de sperme de saumon soniqué à 100 mg/ml.

Elle est effectuée à 42'C durant 14 heures avec une sonde ayant une radioactivité de 106 cpm/Ml. (1 x SSC = 0,15M NaCl/0.015M citrate de sodium, pH 7; solution de Denhardt 0,02%, polyvinylpyrrolidone 0, 02%, Ficoll 0,02%, sérum

albumine bovine).

Les filtres sont lavés de manière brève dans une solution contenant 2 x SSC, SDS 0,1% à température ambiante puis sont lavés deux fois à 50 C dans une solution contenant 2 x SSC, SDS 0,1% durant 1 heure et autoradiographiés à -70 C en

utilisant des écrans intensifiants.

Les colonies sont hybridées avec la sonde puis

recriblées et sélectionnées par séquençage.

9. Sous-clonage et stratégies de séquençage Un des clones lambda gt 10 positif contenant 2,3 kb a

été sous-cloné dans des vecteurs pBluescript.

Deux fragments de digestion Pst I, de 0,8 kb et 0,3 kb respectivement, ont été à nouveau sous-clonés dans des

vecteurs pBluescript. Le fragment de 1,2 kb issu du sous-

clonage initial a été religaturé (figure 4).

Le séquençage des deux brins a été effectué avec une amorce universelle M13, une amorce T3 et des amorceurs synthétiques en utilisant le kit de séquençage T7 commercialisé par Pharmacia ou le kit de séquençage Taq Track

commercialisé par Promega.

10. Analyse par la technique de transfert de Northern L'ARN total a été extrait à partir du corps gras et & partir des cellules épidermiques par précipitation directe dans une solution contenant LiCl 3M et de l'urée 6M (Auffray

et Rougeon, 1980 précédemment cités).

L'ARN est séparé par électrophorèse dénaturante sur un gel d'agarose 1%formaldéhyde avec du tampon MOPS puis est

transféré sur des membranes de Nylon (Hybond-N, Amersham).

Le filtre est tout d'abord hybridé durant une nuit à 42'C avec de l'ADN complémentaire digéré par EcoRl/Pst 1 et est marqué d'une manière aléatoire par du phosphate 32 (fragment correspondant aux séquences de lecture ouvertes du fragment de 1,2 kb codant la majorité de la séquence de la protéine P-50) dans une solution contenant: 50% de formamide, 5 x SSC, 2x solution de Denhardt, 100 pg/ml d'ADN de sperme de

saumon dénaturé et 0,1% de SDS.

Le filtre est ensuite lavé de manière brève avec une solution contenant 4 x SSC et 0,1% SDS à température ambiante, deux fois à 50'C durant 20 minutes et finalement par une solution contenant 2 x SSC et 0,1% SDS durant 20 minutes à C. Apres autoradiographie le filtre est déshybridé selon les instructions du fabricant et réhybridé avec la sonde Cecropin B24 de Bombyx mori (Taniai et al. 1992, Biochem. Biophys. Acta, 1132: 203-206; Brey et al. 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6275- 6279) et la sonde d'a-tubuline comme

témoin interne (Kalfayan et Winsink, 1981, Cell 24: 97-106).

11. TranscriDtion in vitro, traduction in vitro et fluoroqraphie La synthèse d'ARN messagers synthétiques a été effectuée en utilisant un pBluescript linéarisé contenant l'insert P-50 et une ARN polymérase ADN dépendante codée par la bactériophage T7 polymérase et en utilisant la trousse de

transcription d'ARN commercialisée par Stratagene.

Le système de lysat de réticulocyte de lapin (Promega) a été utilisé pour la traduction d'ARN messagers synthétiques

en utilisant de la méthionine marquée au soufre 35S.

Les produits de traduction in vitro ont été séparés sur gel SDS-PAGE. Après électrophorèse le gel est traité avec

En3Hance (DuPont) et fluorographié à -70'C.

12. Analyse informatique des homologies de séquence Les logiciels FASTA, TFASTA et SwissProt ont été utilisés pour déterminer les homologies de séquences entre la P-50 et d'autres protéines connues (Argos, 1990, Methods in

Enzymol. 182: 751-776).

Le logiciel DNA strider 1.1 a été utilisé pour

l'analyse de l'hydrophobie.

B. RESULTATS

1. Test de liaison

Un test de liaison avec une bactérie gram-négative (E.

cloacae), ou gram-positive (B. licheniformis), suivi par un lavage avec NaCl (temps d'incubation de 2,5 minutes) et une extraction acide a été effectué afin de purifier de manière sélective les protéines de l'hémolymphe ayant une affinité

importante pour les surfaces bactériennes.

Les essais de bactéries ont été ensuite analysés sur

gel SDS-PAGE. Le gel SDS-PAGE d'extraits de bactéries gram-

négatives montre une bande prédominante correspondant à une

protéine de 50 kD (figure 1A).

En comparant la liaison des protéines d'hémolymphe immune (figure 2, puits 2) et d'hémolymphe non-immune (figure 2, puits 3), on observe un accroissement significatif de la

quantité de protéine de 50 kD (P-50) dans l'hémolymphe immune.

Quand on incube l'hémolymphe immune avec la bactérie testée durant différents temps d'incubation (1, 2, 5, 5, 15 et minutes), la quantité de P-50 augmente avec le temps jusqu'à un temps d'incubation de 15 minutes et devient ainsi la protéine la plus abondante liée à la surface bactérienne

(figure 2, colonnes 1, 2, 4, 5 et 6).

Dans ce test de liaison in vitro (figure 2), les bactéries sont lavées deux fois avec une solution de 0,5 M de NaCl, au lieu d'effectuer des lavages successifs, en raison du

nombre important d'échantillons.

Après la période d'incubation de 10 minutes, le surnageant du test de liaison est réincubé avec un nouveau lot de bactéries afin de déterminer s'il reste de la P-50 dans le surnageant. Seulement des quantités non significatives de P-50 peuvent être détectées au cours de la seconde incubation de 10 minutes. Ainsi, la P-50 est en grande partie éliminée de l'hémolymphe immune durant la première incubation de 10 minutes. Un P-1,3-glucane insoluble (curdlan) a été mis en oeuvre dans d'autres tests de liaison in vitro, à des concentrations finales de 3 mg/ml d'hémolymphe immune. Après une incubation de 10 minutes, le culot est lavé deux fois avec une solution de NaCl 0,5 M et l'extrait acide est analysé sur SDS-PAGE. La P-50 est détectée, avec des protéines

contaminantes mineures.

2. Purification et séquençaqe des acides aminés Les protéines éluées lors du test de liaison sont séparées sur Tricine-SDS-PAGE et la bande de protéine correspondant à un poids moléculaire de 50 kD est soumise à une digestion par une protéinase in situ afin d'effectuer une analyse de la séquence en aminoacides interne, car la protéine de 50 kD intacte n'est pas sensible à la dégradation d'Edman

en raison de ses groupes a-aminés bloqués.

Une série de bandes correspondant à la P-50 (environ 15 pg) est découpée à partir du gel, déshydratée et digérée in

situ en utilisant l'endopeptidase Lys-C.

Les fragments peptidiques résultant sont séparés par CHLP en phase inverse (figure lB) et leur structure primaire est déterminée par un séquençage automatique des acides aminés. Les séquences qui ont été déterminées sont les suivantes: - pic correspondant à la flèche noire: 2 bandes - bande majeure: DVVYYNAVFSINK - bande mineure: MTLFAFXGNLNXK - pic correspondant à la flèche blanche:

LDSTSVGTLSAEVLDPVNGRXVYEEPDLK

3. Analyse MOPAC et isolement de l'ADN complémentaire codant pour la PEn utilisant les données obtenues concernant la séquence interne en amino acides de la P-50, des amorces dégénérées ont été synthétisées (P 1 et P3 pour le brin sens,

P 2 et P 4 pour le brin anti-sens) (Figure 3A).

Une amplification PCR est effectuée comme décrit dans le chapitre Matériels et Méthodes en utilisant de l'ADN complémentaire simple brin de corps gras de vers à soie immuns (combinaison de P 1 et P 4 ou P3 et P2). Seule une combinaison d'amorces (P 1 et P 4) donne naissance à un produit de 160

paires de base (pb) comme le montre la figure 3B.

Le produit de 160 paires de base est cloné et séquencé.

La séquence en acides aminés déduite de la séquence de 160 paires de base contient les trois fragments peptidiques de la P-50, comme analysé par la dégradation d'Edman. La banque d'ADN complémentaire construite à partir de corps gras de ver à soie immunisé est criblée en utilisant le produit de 160 paires de base marqué d'une manière aléatoire par du phosphore 32, comme sonde. clones positifs sont isolés après criblage d'environ 75.000 clones indépendants. Parmi treize clones positifs choisis de manière aléatoire, tous ont le même insert de taille identique (2,3 kb) à l'exception d'un clone qui

présente un insert de 1,8 kb.

La séquence nucléotidique d'un de ces clones (lambda

BP5OO1) contenant un des inserts de 2,3 kb a été analysée ci-

dessous. 4. Séquence nucléotidique et séquence en acides aminés déduite

Le fragment EcoR I du clone lambdaBP5001 a été sous-

cloné dans le plasmide pBluescript.

Des sous-clonages ont été effectués comme décrits dans le chapitre Matériels et Méthodes. La carte de restriction

utilisée pour le sous-clonage est celle de la figure 4.

La séquence nucléotidique et la séquence en amino acides déduite sont celles répertoriées SEQ ID N' 1 et SEQ ID N'2. La séquence de lambdaPB5001 contient une région non codante à son extrémité 5' et une phase de lecture ouverte de 1401 nucleotides correspondant à 467 acides aminés. Une région non traduite de 1100 nucleotides est aussi présente entre le codon stop et le site de polyadénylation. Cette séquence contient deux signaux possibles de polyadénylation (AATAAA), ce qui pourrait correspondre à l'existence d'ARN messagers de

différentes tailles.

On a aussi trouvé six séquences ATTTA dans la région proche de l'extrémité 3' de la phase de lecture ouverte, ce qui suggère une certaine instabilité des ARN messagers de la

protéine P-50.

Le poids moléculaire calculé de la protéine déduite de

la séquence d'ADN complémentaire est de 52.225D.

L'analyse de l'hydrophobicité de la séquence montre que les dix huit premiers aminoacides correspondent à un profil typique de peptide signal (figure 5). La partie C-terminale de la protéine P-50 est aussi très hydrophobe ce qui suggère l'existence d'un ancrage membranaire. La protéine déduite contient aussi un site potentiel de N-glycosylation sur son acide aminé en position

182.

5. Comparaison de la séquence en acides aminés de la protéine P-50 et d'autres protéines L'ADN complémentaire de la protéine P-50 a une homologie de séquence significative avec certains domaines de quatre protéines différentes présentant une relation du point de vue immun: 3-1, 3 glucanase bactérienne, protéine liant le complexe lipopolysaccharidique humain (LBP), protéine

augmentant la perméabilité humaine (BPI) et CD14 humain.

a) B-1,3 glucanase L'homologie de séquence la plus importante est obtenue avec l'ADN complémentaire de la P-1,3 glucanase A1 de Bacillus circulans WL-12 (Yahata et al., 1990, Gene 86, 113-117). 34% d'identité et 56% de similarité sur un ensemble de 124 amino

acides (figure 6).

Cette région de 124 amino acides contient le site actif supposé hautement conservé (19 acides aminés) d'aussi bien les P-1,3-1,4 glucanases que les /-1,3-1,4 glucanases (Schimming et al., 1992,Eur. J. Biochem., 204, 13-19; Hofemeister et al.,

1986, Gene 49: 177-187) comme le montre la figure 6.

Dans cette région, la P-50 montre une identité de structure de 53% et une similarité de 63% avec la 3-1,3 glucanase de Bacillus circulans et une identité de 53% et une similarité de 90% avec la P-1,3- 1,4 glucanase de Fibrobacter

succinogenes (Teather et Erfle, 1990, J. Bacteriol. 172: 3837-

3841) incluant les résidus histidine et acide aspartique

strictement conservés du site actif supposé.

b) LBP/BPI On observe aussi une homologie de séquence significative avec le domaine de liaison du LPS des LBP et BPI humaines (Schumann et al., 1990, Science 249:1429; Hoess et al., 1993, EMBO J. Vol. 12 N 9 3351-3356) comme le montre la figure 7. Dans ce domaine de 19 acides aminés, on observe une identité de 21%, et une similarité de 47% avec la LBP et une

identité de 21% et une similarité de 53% avec la BPI.

Si le domaine de liaison consensus de la LBP ou de la BPI est comparé avec la P-50 on obtient une identité de 37% et

une similarité de 68%. (figure 7).

c) CD14 Une autre protéine humaine impliquée dans le complexe

de liaison LPS/LBP ou dans la liaison du LPS est le CD14.

Cette protéine montre une identité de 21% et une similarité de 46%. 6. Traduction in vitro Afin de confirmer l'identité du produit du gène clone, le lambdaBP5001 est linéarisé par digestion Bgl II et la

transcription est effectuée in vitro.

Les ARN messagers résultants sont traduits in vitro en utilisant le lysat de réticulocyte de lapin en présence de S-methionine.

Les mélanges réactionnels sont ensuite séparés par SDS-

PAGE et fluorographiés. La protéine traduite a un poids moléculaire estimé de l'ordre de 52 kD comme le montre la figure 8. Ceci est en accord avec le poids moléculaire calculé

à partir de la séquence en acides aminés déduite.

7. Induction d'ARN messaqers codant pour la P-50 en réponse à l'infection bactérienne en utilisant des larves de Bombyx mori axéniques La quantité de protéine P-50 dans l'hémolymphe augmente de manière importante après mise en contact avec des bactéries

comme le montre la figure 1.

L'induction des ARN messagers codant pour la P-50 suivant l'abrasion procuticulaire a été examinée avec des

larves de Bombyx mori axéniques.

Le lambdaBP5001 a été digéré par Pst 1/EcoR i et le fragment de 1, 2 kb en résultant, et contenant la majeure partie de la région codant pour la protéine P-50, a été purifié, marqué de manière aléatoire par du 32p et utilisé comme sonde pour un transfert de type Northern (Northern blot). L'ARN messager de la P-50 est exprimé de manière constitutive à faible taux dans le corps gras et dans les cellules épidermiques de larves n'ayant pas subi d'abrasion

procuticulaire (figure 9A).

Six heures après l'abrasion procuticulaire en présence de bactéries, les ARN messagers sont induits de manière forte dans le corps gras et, à un degré moindre, dans les cellules épidermiques. Même une abrasion stérile en l'absence stricte de bactéries est capable d'induire des ARN messagers dans les

deux tissus six heures après l'abrasion (figure 9A).

Afin d'avoir un témoin positif, l'ADN transfèré (blot) est déshybridé et réhybridé avec le gène exprimé de manière constitutive de l'a- tubuline et d'une autre protéine

intervenant dans l'immunité induite, la cecropine B2.

Les résultats de la figure 9B montrent que la P-50 est une protéine de phase aiguë qui joue un râle important dans la

réponse immune de Bombyx mori.

L'ensemble des résultats de cet exemple montre que la protéine P50 lie le LPS et joue un rôle important dans la

réponse immunitaire.

EXEMPLE 2:

1) - OBTENTION DES PLANTS DE TABAC TRANSGENIOUES ET

MISES EN EVIDENCE DE LA RESISTANCE A l'INFECTION

FONGIOUE

L'ADN complémentaire de la protéine P-50 obtenu dans l'exemple 1 est cloné dans les sites EcoRl des plasmides pMON530 et pBI 121 (Jaynes et al., 1993, Plant Science, 89, -53). L'ADN complémentaire inséré est placé sous le contrôle du promoteur de la protéinase II issue de la pomme de terre

(Jaynes et al. 1993, Science, 89, 43-53).

Des disques foliaires de 1 cm de diamètre environ sont découpés dans des feuilles de plants de tabac vieux de six semaines (Nicotiana tabacum var. xanthii et var. samsung) qui ont été cultivés de manière aseptique dans des boîtes de

Magenta.

Les disques foliaires sont obtenus en poinçonnant de jeunes feuilles en utilisant un poinçon stérilisé. Les explants sont précultivés durant 1 à 2 jours sur un milieu MS104 (MSO, 7 g/l de phytoagar, 1 mg/ml de benzyladenine et 0,1 mg/ml d'acide naphtalène acétique) pour stimuler la croissance. Le milieu MSO comprend 4,3 g/l de sel de Murashige

et Skoog et 30 g/l de saccharose.

Les explants sont inoculés en les immergeant durant 2 à secondes dans une culture effectuée durant une nuit d'Agrobacterium tumefaciens. L'eau des explants est ensuite absorbée et les explants sont mis en culture sur des boites de culture nourrice. Chaque boîte de culture nourrice est préparée en utilisant du milieu MS104 auquel a été ajouté 1, 5 ml de suspension de culture de tabac. Ces boîtes sont

couvertes avec un morceau de papier filtre Whatman 3mm.

Les explants sont ensuite laissés à incuber durant 2 jours puis transférés sur un milieu de sélection MS (MS104, 500 mg/ml de carbénicilline ou de céfatoxime, 300 mg/ml de kanamycine). Quand les tiges apparaissent, les explants sont transférés sur un milieu d'enracinage MS (MSO avec 0,6% d'agar, 500 mg/ml de carbénicilline et 100 mg/ml de kanamycine). Les pieds sortant des explants et présentant des tiges bien définies sont découpés et repiqués dans un nouveau milieu d'enracinage. Les plantules qui développent des racines d'environ 2 semaines dans les milieux d'enracinage sont alors transférées dans un sol stérile dans des pots Jiffy et mis dans des boites

de Magenta stérilisées.

Après 7 à 10 jours, les couvercles des boîtes de Magenta sont réouvertes afin d'acclimater les plantes. Les plantes sont ensuite transférées dans des pots durant deux semaines puis dans des pots plus gros et mises en croissance dans une serre sous une lumière naturelle. Elles sont arrosées quotidiennement avec une solution 20:20:20 (N/K/P). La température moyenne est d'environ 32 C. Des cultures nourrice de cellules de tabac (Nicotiana tabacum var. xanthii) sont utilisées durant la co-culture des explants avec les bactéries Agrobacterium afin d'améliorer l'efficacité de transformation. Des suspensions de culture sont maintenues dans des flasques d'Erlenmeyer contenant 50 ml de suspension de culture (4,3 g/l de sel MS, 30 g/1 de saccharose, 5 ml/l de vitamine B5, 1 mg/l de 2,4-D). Les cultures sont conservées à température ambiante avec une agitation constante de 150 révolutions/minute. Les suspensions cellulaires sont maintenues en faisant des sous-cultures de 10

ml de culture, filtrées et lavées, dans 50 ml de milieu.

L'expression du gène codant pour la P-50 est mise en évidence en dosant le taux d'ARN par une analyse de transfert

de type Northern (Northern blot).

L'expression de la P-50 dans les plants de tabac est analysée en utilisant la méthode décrite par Sanchez-Serrano

et al. (1987, EMBO J. 6, 303-306).

Des pinces de dialyse sont posées sur des feuilles de plants de tabac hauts de 60 à 80 cm. Les ARN sont isolés à partir de feuilles des plants sur lesquelles ont été posées les pinces de dialyse, 6, 12 et 24 heures après la pose. Les ARN Poly(A) sont isolés en utilisant la trousse FastTrackTM oligo dT cellulose (commercialisée par Invitrogen). 10 pg par échantillon sont chargés sur le gel. L'insert d'ADN

complémentaire de la P-50 de 1200 pb est utilisé comme sonde.

Les protéines totales sont extraites des feuilles de tabac par une solution contenant tris-HCl (pH 6,8) 80 mM, SDS 2%, glycérol 10% et sont séparées sur des gels de polyacrylamide dénaturant à 13%, à raison de 20 Mg de protéines totales par échantillon. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane Immobilon-P commercialisée par Millipore. La membrane est incubée avec un antisérum dirigé contre la P- 50 en

utilisant les techniques d'analyse Western conventionnelles.

La détection des protéines immunoréactives est effectuée en

utilisant la technique de luminescence Amersham ECL.

2) - RESISTANCE DES PLANTS OBTENUS A L'ENCONTRE D'UNE

INFECTION FONGIQUE

Phytophtera syringae, qui est très virulent à

l'encontre du tabac est utilisé dans les tests d'inoculation.

Des zoospores suspendus dans de l'eau à différentes densités cellulaires sont utilisés comme inoculum. Des jeunes plants de tabac résistants à la kanamycine sont obtenus à partir de graines de la génération R1, soit témoins soit issues de plantes transgéniques pour la P50, et transplantés directement dans des pots contenant un sol artificiel (Pro- Mix) puis mis en culture dans une serre. Les plants témoins sont transgéniques pour le vecteur de transfert ne contenant pas

l'insert P-50.

Les plantes utilisées dans le test vis-à-vis de l'infection fongique sont mises à croître dans des petits pots jusqu'à ce qu'elles atteignent une hauteur d'environ 10 cm, puis la bordure de 4 à 5 feuilles est entaillée. Toutes les racines du même côté du plant, à mi- chemin entre le pied et la paroi du pot, sont coupées. Les pots sont placés dans des soucoupes et 5 ml de zoospores suspendus dans de l'eau à raison de 107 cellules par ml sont versées dans le sol. Les

plants témoins ne reçoivent que de l'eau.

Les plants sont disposés de manière aléatoire et codés afin d'obtenir des conditions de simple aveugle. Les plants sont incubés à 30'C dans des chambres de croissance et le sol est conservé humide par trempage dans des soucoupes. Le pourcentage des feuilles entaillées qui dépérissent est noté pour chaque plante, chaque jour, et le pourcentage moyen de feuilles ayant dépéri en fonction de chaque traitement est calculé. Quant toutes les feuilles entaillées

ont dépéri, le plant est considéré comme ayant dépéri lui-

même. Les nouvelles feuilles qui apparaissent durant le test ne sont pas comptées même si elles semblent dépérir de manière considérable. Les résultats sont analysés en utilisant le test des deux échantillons de Wilcoxon en comparant les valeurs

moyennes entre témoins et plantes transgéniques.

Un autre test consiste à mettre les plantes du test d'inoculation en croissance dans des pots jusqu'à ce qu'elles atteignent une hauteur de 15 cm et les bords de 8 à 10 feuilles sont échancrés comme décrit ci- dessus. Chacun des plants reçoit 20 Mm d'un inoculum contenant 106 cellules/ml ou Ml d'eau appliqué par l'intermédiaire d'une blessure au couteau faite à la base. Les feuilles échancrées sur chaque plante sont estimées chaque jour pour leur degré de dépérissement. Le pourcentage de feuilles et de plantes ayant dépéri est calculé comme dans le cas de la méthode

d'inoculation par les racines.

Le procédé décrit dans cet exemple permet d'obtenir des

plantes résistantes aux infections fongiques.

EXEMPLE 3:

NEUTRALISATION DES ENDOTOXINES

L'ADN complémentaire de la protéine P-50 est exprimé dans un système eucaryote ou bactérien selon les techniques

décrites par Sambrook et al. (1989, précédemment cités). La P-

est purifiée selon les techniques décrites par Das, (1990, Methods in Enzymology 182, 93-112) et Bradley (1990, Methods in Enzymology 182, 112-132). La P-50 purifiée obtenue de cette manière est utilisée dans des tests d'activité biologique.

TEST DE NEUTRALISATION DE L'ENDOTOXINE

pg d'endotoxine d'Escherichia coli 0113 sont

ajoutés à des dilutions en série de la protéine P-50.

L'activité de l'endotoxine est quantifiée par le test turbidimetrique décrit par Novisky et al., (1985, J. Clin.

Micro, 20, 211-216) pour le facteur anti-LPS de Limulus.

D'autres échantillons de LPS sont testés tels que ceux de Klebsiella pneumoniae, Serratia marcesens et Serratia minnesota. La neutralisation de ces différentes espèces est effectuée avec un excès cinq fois plus important de P-50 par

rapport au LPS.

TEST DE NEUTRALISATION DU SERUM

Afin de tester l'efficacité potentielle de la P-50 in vivo, la protéine a été testée pour sa capacité à inactiver

l'endotoxine en présence d'un sérum de rat total.

Un test est effectué dans des plaques de 96 puits comme

décrit par Novitsky et al. (précédemment cités).

A chaque puits on ajoute dans l'ordre 0,05 ml de sérum ou 0,5 ml de sérum avec 25 mg/ml de P-50, puis 0,5 ml

d'endotoxine d'Escherichia coli 0113.

Les plaques sont couvertes avec un film de Parafilm afin d'éviter l'évaporation, agitées sur une plateforme d'agitation mécanique durant 15 minutes et incubées à 37'C

durant 1 heure.

Le film plastique couvrant les plaques est retiré puis 0,1 ml de LAL est ajouté à chaque puits qui est testé comme

décrit ci-dessus.

Le LR50 est défini comme étant la moitié de la croissance maximale de la densité optique par rapport au

témoin.

EXEMPLE 4:

Protection des animaux par la protéine P-50 Des rats mâles Sprague-Dawley (230-450g) sont anesthésiés légèrement avec de l'Halothane. On leur injecte alors une solution à tester par l'intermédiaire de la veine

dorsale du pénis.

Les rats témoins reçoivent une solution contenant un tampon phosphatesalin (0,15 NaCl) tamponné à pH 7,4 et contenant 0,02 M de phosphate de sodium. Un second groupe de rats reçoit du LPS (E. coli 0111: B4, Sigma Chemical Company)

dans du tampon.

Un troisième groupe de rats est testé avec une suspension de protéine P50 et de LPS mélangés dans des quantités égales en poids dans du tampon et incubé durant 1

heure à 37 C avant injection.

Un quatrième groupe de rats reçoit de l'albumine mélangée avec du LPS dans des quantités égales en poids et

incubée d'une manière similaire.

Le dernier groupe de rats est traité par injection avec

seulement la P-50 incubée dans du tampon.

Le volume injecté (1,7 - 2,9 ml) dépend du poids du rat qui est ajusté de façon à fournir une dose de 15 mg de LPS par

kilo corporel.

La survie des rats est suivie durant 24 heures.

Le procédé décrit ci-dessus permet de mettre en évidence l'activité thérapeutique de la protéine P50, sur un

modèle animal représentatif.

Conclusion Les résultats de ces quatre exemples mettent en évidence les propriétés remarquables de la protéine P50 et ses

applications thérapeutiques pharmaceutiques et agronomiques.

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: INSTITUT PASTEUR

(B) RUE: 28, rue du Docteur Roux

(C) VILLE: PARIS

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75724

(G) TELEPHONE: 45688097

(H) TELECOPIE: 40613017

(ii) TITRE DE L' INVENTION: Protéines liant le complexe lipopolysaccharidique (LPS),et leurs utilisations (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: PatentIn Release $1.0, Version X1.25 (OEB)

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Bombyx mori

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln

1 5 10 15

Gly Asn Leu

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Phe His Thr Tyr Ser Val Gln ?rp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu Ser

1 5 10 15

Val Asp Gly

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 455 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Bombyx mori

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Lys Ile Ser Tyr Ala Gln Met Pro Asp Vai Lys Ile Gln Ala Phe Arg

1 5 10 15

Pro Lys Gly Leu Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu

25 30

Phe Ala Phe Gln Glv Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val

40 45

Gly Thr Leu Ser Ala Glu Val Leu AsD Pro Val Asn Gly Arg Trp Val

55 50

Tyr Glu Glu Pro Asp Leu Lys Leu ys Val Lys Asp Val Val Tyr Tyr

70 75 80

08ú SLE OLE

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S99ú 098 SSú

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00ú 96Z 06Z

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98Z 08Z 9LZ

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061 581 081

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SLI OLI 991

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SZI 0Z1 9S1

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011 901 001

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96 06 98

UlD US at1L SAT nlO aAa 2li sAz SAT USV ali.aS a64d leA 21V USV Pro Phe Asp Asp His Phe Tyr Ile Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Gly

385 390 395 400

Ile Thr Glu Phe Arg Asp Gly Ser Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Lys

405 410 415

Pro Trp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Ala Ser Val His Phe Trp Arg His

420 425 430

Met Ser Asp Trp Phe Pro Arg Trp Ser Gln Pro Ser Leu Ile Val Asp

435 440 445

Phe Val Lys Val Ile Ala Leu

450 455

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2271 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNmi (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Bombyx mori (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT: 16..1415

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

GAGGATCCGG GTACC ATG GGT GGA CGC GTG.TG TGT CTG ATT TTA TTT ATA 51

Met Gly Gly Arg Val Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ile

1 5 10

AAA ATA TCG TAC GCT CAA ATG CCC GAT GTG.AkA ATA CAA GCT TTT CGC 99 Lys Ile Ser Tyr Ala Gln Met Pro Asp Val Lys Ile Gln Ala Phe Arg

20 25

CCG AAA GGA CTT CGA ATA TCC GTT CAA GAT GTC CCC AAA ATG ACA CTG 147

Pro Lys Gly Leu Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu

35 40

TTC GCG TTC CAA GGC AAC TTG AAC CAT AAA CTG GAC AGC ACC AGC GTC 195

Phe Ala Phe Gln Gly Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val

50 55 60

GGG ACA CTG AGT GCA GAG GTA CTG GAT CCA GTC AAC GGC CGA TGG GTG 243

Gly Thr Leu Ser Ala Glu Val Leu Aso Pro Val Asn Gly Arg Trp Val

70 75

00ú 55Z 06Z 58Z

AID 52V PIV sXD Pi a I s.; l:. LeA AID ias eP' 2AI us We ias 516 LDD DDD DDD ID- DDD VI D -D'D VED DDD DDl DDD LVI IVV DIEV iD 0OL AID 7Aî sAX sA- nea, ae ca f hi nath na aTI nID oid iAI nae dil

L98 VDD LVI DV DV' I DI 9E D'D D LS D D L VD L V VVD DDD IV DID DDL

59Z O9Z 5

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OZZ 51 Z 0 1 Z SO

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0 961 061

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981 081 SLI

PIV qLI îaS T/ 2li4 ne- us us , 52V UiD 1Aî -'S TeA 8a4d Od îAI 6L9 VDD DDV LDL VID VDV ILI IVL ' Il ILDD DVD DVIL DDI DID DIL DDD DVI

OLI 991 091

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551 05 5 L 1

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501 001 96

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06 98 08

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AAT GCA GAA CTC TAT TCC GGA CCT AAT GAC TAC AGC AAT ACG GTT TTG 963

Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Gly Pro Asn Asp Tyr Ser Asn Thr Val Leu

305 310 315

TAC GGA GGA CCG ATC ATG GAT CTG GAG TGC CGC GAG AAC TTT CTC TCC 1011

Tyr Gly Gly Pro Ile Met Asp Leu Glu Cys Arg Glu Asn Phe Leu Ser

320 325 330

ACA AAA AGA CGC AGA GAC GGC ACG TCG TGG GGC GAC AGT TTT CAT ACA 1059

Thr Lys Arg Arg Arg Asp Gly Thr Ser Trp Gly Asp Ser Phe His Thr

335 340 345

TAT TCC GTT CAA TGG ACA CCT GAT TTC ATA GCC CTG TCT GTG GAC GGC 1107

Tyr Ser Val Gin Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu Ser Val Asp Gly

350 355 360

GAG GAG TGG GCG CGA GTG GAG GCG CCG CGG GAC GCC CTG CCG GCT GTC 1155

Glu Glu Trp Ala Arg Val Glu Ala Pro Arg Asp Ala Leu Pro Ala Val

365 370 375 380

TGC GCG CAC GCC CCG CGG CAC CTG CTG CAG GCC GGC TCG CAG ATG GCG 1203

Cys Ala His Ala Pro Arg His Leu Leu Gln Ala Gly Ser Gln Met Ala

385 390 395

CCA TTC GAT GAC CAC TTC TAC ATA ACG CTA GGC GTG GCG GCA GGA GGC 1251

Pro Phe Asp Asp His Phe Tyr Ile Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Gly

400 405 410

ATA ACG GAG TTC CGC GAC GGG TCT ATA ACC TCC GGG GGA GTC ACC AAG 1299

Ile Thr Glu Phe Arg Asp Gly Ser Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Lys

415 420 425

CCC TGG AGA GAC AGC GCT CGG AAG GCA TCC GTA CAT TTC TGG CGG CAC 1347

Pro Trp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Ala Ser Val His Phe Trp Arg His

430 435 440

ATG TCC GAT TGG TTC CCA CGG TGG AGT CAG CCA TCT TTA ATC GTG GAC 1395

Met Ser Asp Trp Phe Pro Arg Trp Ser Gln Pro Ser Leu Ile Val Asp

445 450 455 460

TTT GTC AAA GTT ATC GCC TTA TGATCTAG7C ATTTAGATTT TGTATAATTA 1446

Phe Val Lys Val Ile Ala Leu

AGTTATTAGT ATAGTTTCTG CAGGCAAAAT TAATTGCATT CTGAGTTTTT ATTGTCAAAC 1506

TACAATTTAA AATTTAATTC CTAAAAGATC TCTCTTCT-TT CTAAATCTGT AATTTAGCTA 1566

ATTTTATTTG TATCATTTTC TTTTTTTAAA TTTTGATAGA GCGGCGAATG ACTAGAAGAT 1626

GTGATCTGCG.AAATAAAAC TAAGTGACAT GC-CATLGC.AAG GCATACACAC AACAGAGTTT 1686

TGCATTATTA TACCTTTCT TGAGCGAGAT GAGGACTACT GACGTGACCT GGAGTGATAT 1746

TTTGGAGCAA GCCTAAGACA GGGTCAAGTG GAGACAGCTC TAAGGCCCCT ATGTACCGGC 1806

GGGGTGTCTT AGGGCTGCAA TAACAACATT ACC-TTCTA ACCAAACAGC GATATTATCT 1866

GTAATATTAT AGTTAGAAAG CCTGCATCTT ATACTCTTAT TGACACACGT ACCTGGATGA 1926

TTTTAACGAT GAAGAAATAA CATCGTGTAA AAAATTTAGC TGGAAAAGAT TTTGAGGAAT 1986

CAAGAAATAC CCTATGAACC AGCACAGGTA CGTGTCACCA CTCTGGCTAA TTCTGCCACG 2046

TTGCGGTTGG TTTGAAGTTT GAGACAACCT TTGCACGATA CAATTGAGAC TAAGACCTCA 2106

TGGCTCGGAG TGAGTGGAGT CATTCAAGTT GCGACTGGCT CCAGTAACCA CTTATAACCA 2166

GGTAGATCGT GAGCCTATCA GCTCATTTAG AGCAACAAAA AACAAAATAA TGTACTCTTG 2226

AAAAAATCAT TTTAATAAAA GACCAGAGTG AAAAAAAAAA AAAAA 2271

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 467 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Met Gly Giy Arg Val Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ile Lys Ile Ser Tyr

1 5 10 15

Ala Gln Met Pro Asp Val Lys Ile Gln Ala Phe Arg Pro Lys Gly Leu

25 30

Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln

40 45

Gly Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val Gly Thr Leu Ser

55 60

Ala Glu Val Leu Asp Pro Val Asn Gly Arg Trp Val Tyr Glu Glu Pro

70 75 80

Asp Leu Lys Leu Lys Val Lys Asp Val Val Tyr Tyr Asn Ala Val Phe

90 95

Ser Ile Asn Lys Lys Ile Tyr Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Thr Val

105 110

Thr Glu Leu Glu Asp Pro Asn Ala Ser Thr Asp Ser Gin Lys Pro Glu

120 125

Cys Lys Pro Thr Lys Thr Arg Val Arg Gly Gly Lys Ala Cys Ala Gly

135 140

Gln Thr Ile Phe Glu Glu Gin Phe Asp Ser Leu Asp Glu Asn Val Trp

150 155 160

dsV 6z dili od SÀ7 ji _7. ff I7D jaS.WL alI u as AID dsv 6z Su'0 aqd nhid. alI a11 D TD P- T ilA TD narIa zI all zIL aUd sTH

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08E SLE OLE

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Claims

REVENDICATIONS

1. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend en totalité ou en partie la séquence SEQ ID N'1 suivante: Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln Gly Asn Leu.

2. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend en totalité ou en partie la séquence SEQ ID N'2 suivante: Phe His Thr Tyr Ser Val Gln Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu

Ser Val Asp Gly.

3. Protéine selon l'une des revendications 1 ou 2

caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire de

l'ordre de 50 kD.

4. Proteine selon l'une des revendications 1 à 3,

caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID N 3, ou une partie de la séquence SEQ ID N 3 suivante Lys Ile Ser Tyr Ala Gln Met Pro Asp Val Lys Ile Gln Ala Phe Arg Pro Lys Gly Leu Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln Gly Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val Gly Thr Leu Ser Ala Glu Val Leu Asp Pro Val Asn Gly Arg Trp Val Tyr Glu Glu Pro Asp Leu Lys Leu Lys Val Lys Asp Val Val Tyr Tyr Asn Ala Val Phe Ser Ile Asn Lys Lys Ile Tyr Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu Asp Pro Asn Ala Ser Thr Asp Ser Gln Lys Pro Glu Cys Lys Pro Thr Lys Thr Arg Val Arg Gly Gly Lys Ala Cys Ala Gly Gln Thr Ile Phe Glu Glu Gln Phe Asp Ser Leu Asp Glu Asn Val Trp Gln Ile Glu Gln Tyr Ile Pro Ile Tyr His Pro Glu Tyr Pro Phe Val Ser Tyr Gln Arg Asn Asn Leu Thr Val Ser Thr Ala Asp Gly Asn Leu His Ile Asn Ala Lys Leu Gln Gln His Met Pro Gly Phe Leu Asp Asp Ser Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Asn Leu Phe Ser Gly Cys Thr Ser Ser Ala Glu Ala Cys Ile Lys Gln Ala Ser Gly Ala Asp Ile Leu Pro Pro Ile Val Ser Gly Arg Ile Thr Ser Ile Gly Phe Ala Phe Thr Tyr Gly Thr Val Glu Ile Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gly Asp Trp Leu Tyr Pro Glu Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Met Asn Tyr Ala Ser Gly Val Val Lys Ile Ala Cys Ala Arg Gly Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Gly Pro Asn Asp Tyr Ser Asn Thr Val Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Met Asp Leu Glu Cys Arg Glu Asn Phe Leu Ser Thr Lys Arg Arg Arg Asp Gly Thr Ser Trp Gly Asp Ser Phe His Thr Tyr Ser Val Gln Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu Ser Val Asp Gly Glu Glu Trp Ala Arg Val Glu Ala Pro Arg Asp Ala Leu Pro Ala Val Cys Ala His Ala Pro Arg His Leu Leu Gln Ala Gly Ser Gln Met Ala Pro Phe Asp Asp His Phe Tyr Ile Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Gly Ile Thr Glu Phe Arg Asp Gly Ser Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Lys Pro Trp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Ala Ser Val His Phe Trp Arg His Met Ser Asp Trp Phe Pro Arg Trp Ser Gln Pro Ser Leu Ile Val Asp Phe Val Lys Val Ile Ala Leu

5. Protéines selon l'une des revendications 1 à 3,

présentant la séquence ID N 5 ou une partie de la séquence SEQ ID N'5 suivante: Met Gly Gly Arg Val Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ile Lys Ile Ser Tyr Ala Gln Met Pro Asp Val Lys Ile Gln Ala Phe Arg Pro Lys Gly Leu Arg Ile Ser Val Gln Asp Val Pro Lys Met Thr Leu Phe Ala Phe Gln Gly Asn Leu Asn His Lys Leu Asp Ser Thr Ser Val Gly Thr Leu Ser Ala Glu Val Leu Asp Pro Val Asn Gly Arg Trp Val Tyr Glu Glu Pro Asp Leu Lys Leu Lys Val Lys Asp Val Val Tyr Tyr Asn Ala Val Phe Ser Ile Asn Lys Lys Ile Tyr Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu Asp Pro Asn Ala Ser Thr Asp Ser Gln Lys Pro Glu Cys Lys Pro Thr Lys Thr Arg Val Arg Gly Gly Lys Ala Cys Ala Gly Gln Thr Ile Phe Glu Glu Gln Phe Asp Ser Leu Asp Glu Asn Val Trp Gln Ile Glu Gln Tyr Ile Pro Ile Tyr His Pro Glu Tyr Pro Phe Val Ser Tyr Gln Arg Asn Asn Leu Thr Val Ser Thr Ala Asp Gly Asn Leu His Ile Asn Ala Lys Leu Gin Gln His Met Pro Gly Phe Leu Asp Asp Ser Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Asn Leu Phe Ser Gly Cys Thr Ser Ser Ala Glu Ala Cys Ile Lys Gln Ala Ser Gly Ala Asp Ile Leu Pro Pro Ile Val Ser Gly Arg Ile Thr Ser Ile Gly Phe Ala Phe Thr Tyr Gly Thr Val Glu Ile Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gly Asp Trp Leu Tyr Pro Glu Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Met Asn Tyr Ala Ser Gly Val Val Lys Ile Ala Cys Ala Arg Gly Asn Ala Glu Leu Tyr Ser Gly Pro Asn Asp Tyr Ser Asn Thr Val Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Met Asp Leu Glu Cys Arg Glu Asn Phe Leu Ser Thr Lys Arg Arg Arg Asp Gly Thr Ser Trp Gly Asp Ser Phe His Thr Tyr Ser Val Gln Trp Thr Pro Asp Phe Ile Ala Leu Ser Val Asp Gly Glu Glu Trp Ala Arg Val Glu Ala Pro Arg Asp Ala Leu Pro Ala Val Cys Ala His Ala Pro Arg His Leu Leu Gln Ala Gly Ser Gln Met Ala Pro Phe Asp Asp His Phe Tyr Ile Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Gly Ile Thr Glu Phe Arg Asp Gly Ser Ile Thr Ser Gly Gly Val Thr Lys Pro Trp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Ala Ser Val His Phe Trp Arg His Met Ser Asp Trp Phe Pro Arg Trp Ser Gln Pro Ser Leu Ile Val Asp Phe Val Lys Val Ile Ala Leu

6. Protéine selon la revendication 5, caractérisée en

ce qu'elle présente une glycosylation en position 182.

7. Fragment d'une protéine selon l'une des

revendications 1 à 6.

8. Oligonucléotide codant au moins pour la protéine ou

l'un de ses fragments selon l'une des revendications i & 7.

9. ADN selon la revendication 8 comprenant la séquence SEQ ID N'4 suivante:

GAGGATCCGG GTACC ATG GGT GGA CGC GTG TTG TGT CTG ATT TTA TTT

ATA AAA ATA TCG TAC GCT CAA ATG CCC GAT GTG AAA ATA CAA GCT

TTT CGC CCG AAA GGA CTT CGA ATA TCC GTT CAA GAT GTC CCC AAA

ATG ACA CTG TTC GCG TTC CAA GGC AAC TTG AAC CAT AAA CTG GAC

AGC ACC AGC GTC GGG ACA CTG AGT GCA GAG GTA CTG GAT CCA GTC

AAC GGC CGA TGG GTG TAC GAA GAG CCC GAT CTT AAA CTA AAA GTC

AAG GAC GTC GTC TAT TAT AAC GCG GTC TTC TCA ATC AAC AAG AAA

ATA TAC GAG AAA ACA AAC CAA CAG TTC ACC GTA ACA GAG CTA GAA

GAT CCT AAT GCA AGC ACA GAT TCT CAG AAA CCA GAA TGT AAG CCA

ACA AAG ACG AGA GTG CGA GGC GGC AAA GCG TGT GCC GGA CAA ACA

ATA TTC GAG GAG CAA TTT GAT TCC CTG GAC GAA AAC GTT TGG CAA

ATC GAG CAG TAT ATA CCG ATT TAT CAC CCC GAA TAC CCC TTC GTG

TCC TAC CAG CGT AAT AAT TTA ACA GTA TCT ACC GCA GAT GGA AAC

CTA CAT ATT AAC GCC AAA CTT CAA CAA CAT ATG CCC GGC TTT CTG

GAC GAC TCT ATA TAT TCT GGC ACA CTT AAT TTG TTC AGT GGG TGT

ACT TCG TCA GCA GAG GCA TGC ATC AAA CAG GCT TCC GGT GCT GAT

ATT CTA CCA CCA ATC GTC AGC GGC AGA ATC ACA TCA ATA GGA TTT

GCA TTT ACG TAC GGA ACA GTC GAA ATC AGA GCG AAA TTA CCG CAA

GGG GAC TGG CTG TAT CCG GAA ATT CTA TTG GAG CCG TTC TTA AAG

AAG TAT GGA AGT ATG AAT TAT GCG TCC GGC GTA GTG AAG ATA GCG

TGT GCG CGC GGT AAT GCA GAA CTC TAT TCC GGA CCT AAT GAC TAC

AGC AAT ACG GTT TTG TAC GGA GGA CCG ATC ATG GAT CTG GAG TGC

CGC GAG AAC TTT CTC TCC ACA AAA AGA CGC AGA GAC GGC ACG TCG

TGG GGC GAC AGT TTT CAT ACA TAT TCC GTT CAA TGG ACA CCT GAT

TTC ATA GCC CTG TCT GTG GAC GGC GAG GAG TGG GCG CGA GTG GAG

GCG CCG CGG GAC GCC CTG CCG GCT GTC TGC GCG CAC GCC CCG CGG

CAC CTG CTG CAG GCC GGC TCG CAG ATG GCG CCA TTC GAT GAC CAC

TTC TAC ATA ACG CTA GGC GTG GCG GCA GGA GGC ATA ACG GAG TTC

CGC GAC GGG TCT ATA ACC TCC GGG GGA GTC ACC AAG CCC TGG AGA

GAC AGC GCT CGG AAG GCA TCC GTA CAT TTC TGG CGG CAC ATG TCC

GAT TGG TTC CCA CGG TGG AGT CAG CCA TCT TTA ATC GTG GAC TTT

GTC AAA GTT ATC GCC TTA TGATCTAGTC ATTTAGATTT TGTATAATTA

AGTTATTAGT ATAGTTTCTG CAGGCAAAAT TAATTGCATT CTGAGTTTTT

ATTGTCAAAC TACAATTTAA AATTTAATTC CTAAAAGATC TCTCTTCTTT

CTAAATCTGT AATTTAGCTA ATTTTATTTG TATCATTTTC TTTTTTTAAA

TTTTGATAGA GCGGCGAATG ACTAGAAGAT GTGATCTGCG AAAATAAAAC

TAAGTGACAT GCATGCAAAG GCATACACAC AACAGAGTTT TGCATTATTA

TTACCTTTCT TGAGCGAGAT GAGGACTACT GACGTGACCT GGAGTGATAT

TTTGGAGCAA GCCTAAGACA GGGTCAAGTG GAGACAGCTC TAAGGCCCCT

ATGTACCGGC GGGGTGTCTT AGGGCTGCAA TAACAACATT ACCTTTCTTA

ACCAAACAGC GATATTATCT GTAATATTAT AGTTAGAAAG CCTGCATCTT

ATACTCTTAT TGACACACGT ACCTGGATGA TTTTAACGAT GAAGAAATAA

CATCGTGTAA AAAATTTAGC TGGAAAAGAT TTTGAGGAAT CAAGAAATAC

CCTATGAACC AGCACAGGTA CGTGTCACCA CTCTGGCTAA TTCTGCCACG

TTGCGGTTGG TTTGAAGTTT GAGACAACCT TTGCACGATA CAATTGAGAC

TAAGACCTCA TGGCTCGGAG TGAGTGGAGT CATTCAAGTT GCGACTGGCT

CCAGTAACCA CTTATAACCA GGTAGATCGT GAGCCTATCA GCTCATTTAG

AGCAACAAAA AACAAAATAA TGTACTCTTG AAAAAATCAT TTTAATAAAA

GACCAGAGTG AAAAAAAAAA AAAAA

10. Cellule eucaryote ou procaryote exprimant une protéine ou l'un de ses fragments selon l'une des

revendications 1 à 7.

11. Cellule eucaryote ou procaryote portant au moins

une partie d'un oligonucléotide selon l'une des revendications

8 et 9.

12. Cellule végétale ou bactérienne selon l'une des

revendications 10 et 11.

13. Cellule végétale selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une plante appartenant aux familles de la vigne, du tabac, de la tomate ou de la

pomme de terre.

14. Procédé d'obtention d'une protéine ou d'un de ses

fragments selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en

ce qu'un oligonucléotide selon l'une des revendications 8 et 9

est exprimé dans une cellule procaryote ou eucaryote adaptée.

15. Médicament contenant une protéine ou l'un de ses

fragments selon l'une des revendications 1 à 7 ou obtenue

selon la revendication 14.

16. Utilisation d'une protéine ou de l'un de ses

fragments selon l'une des revendications 1 à 7 pour la

fabrication d'un médicament pour le traitement des affections

liées au complexe lipopolysaccharidique.

17. Utilisation selon la revendication 16 pour traiter

le choc septique.

18. Procédé d'élimination du complexe lipopoly-

saccharidique de préparations contenant celui-ci, ledit procédé consistant à lier le complexe lipopolysaccharidique à une protéine ou à l'un de ses fragments selon l'une des

revendications 1 à 7.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la protéine liant le complexe lipopolysaccharidique est

fixée sur un support.

20. Utilisation de fragments d'un des oligonucléotides

selon la revendication 8 pour l'amplification génique.