FR2708831A1 - Chimeric non-human mammal, and its use for the screening of pharmaceutical compositions against human pulmonary pathologies. - Google Patents
Chimeric non-human mammal, and its use for the screening of pharmaceutical compositions against human pulmonary pathologies. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention a pour objet un modèle animal expérimental représenté par un mammifère non humain chimérique, ainsi que l'utilisation de ce modèle animal pour le criblage de compositions susceptibles d'être actives dans le cadre de la prévention ou du traitement de pathologies pulmonaires humaines.The subject of the present invention is an experimental animal model represented by a chimeric non-human mammal, as well as the use of this animal model for the screening of compositions capable of being active in the context of the prevention or treatment of human pulmonary pathologies. .
Description
MAMMIFERE NON HUMAIN CHIMERIQUE, ET SON UTILISATION
POUR LE CRIBLAGE DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
CONTRE LES PATHOLOGIES PULMONAIRES HUMAINES. NON-HUMAN CHEMICAL MAMMAL, AND ITS USE
FOR SCREENING OF PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
AGAINST HUMAN PULMONARY PATHOLOGIES.
La présente invention a pour objet un modèle animal expérimental représenté par un mammifère non humain chimérique, ainsi que l'utilisation de ce modèle animal pour le criblage de compositions susceptibles d'être actives dans le cadre de la prévention ou du traitement de pathologies pulmonaires humaines. The subject of the present invention is an experimental animal model represented by a chimeric non-human mammal, as well as the use of this animal model for the screening of compositions capable of being active in the context of the prevention or treatment of human pulmonary pathologies. .
Parmi les différentes pathologies pulmonaires, la mucoviscidose est une maladie génétique que l'on rencontre fréquemment chez l'homme. Les signes cliniques de cette pathologie sont nombreux. On observe notamment des troubles intestinaux, pancréatiques, et surtout pulmonaires. Le poumon est envahi par un mucus très épais, ce qui entraîne une insuffisance respiratoire, et facilite le développement de foyers infectieux dans les poumons. Among the various pulmonary pathologies, cystic fibrosis is a genetic disease that is frequently encountered in humans. The clinical signs of this pathology are numerous. In particular, intestinal, pancreatic and especially pulmonary disorders are observed. The lung is invaded by very thick mucus, which leads to respiratory failure, and facilitates the development of infectious foci in the lungs.
Le transfert de gènes apparaît, de plus en plus, comme une approche thérapeutique privilégiée de la mucoviscidose. On connaît en effet la protéine déficiente dans cette pathologie, la C.F.T.R. (Cystic Fibrosis Transmembrane
Conductance Regulator), dont le gène humain a été cloné en 1989 (Rommens,
J.M. et al., Science (1989) 245: 1099-1065).Gene transfer is increasingly appearing as a preferred therapeutic approach to cystic fibrosis. We know indeed the protein deficient in this pathology, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane
Conductance Regulator), the human gene of which was cloned in 1989 (Rommens,
JM et al., Science (1989) 245: 1099-1065).
Environ 200 mutations responsables de sa dysfonction ont été localisées. About 200 mutations responsible for his dysfunction have been located.
La mutation la plus fréquente est la AF508 (délétion d'une phénylalanine en position 508 de la CFTR); cette unique délétion rend la protéine CFTR non fonctionnelle.The most frequent mutation is AF508 (deletion of a phenylalanine at position 508 of the CFTR); this unique deletion makes the CFTR protein non-functional.
Le problème qui se pose de façon aiguë est celui de la mise à l'épreuve expérimentale des compositions susceptibles d'être actives contre les pathologies pulmonaires d'une manière générale, et plus particulièrement contre la mucoviscidose. Dans le cas particulier de la mucoviscidose, le problème qui se pose est celui de l'expérimentation des constructions géniques incluant la protéine CFTR, avant leur utilisation thérapeutique, afin notamment de connaître leur tropisme, leur expression, et leur éventuelle toxicité. The problem which arises in an acute way is that of the experimental testing of the compositions likely to be active against pulmonary pathologies in general, and more particularly against cystic fibrosis. In the particular case of cystic fibrosis, the problem that arises is that of experimenting with gene constructs including the CFTR protein, before their therapeutic use, in particular in order to know their tropism, their expression, and their possible toxicity.
Les modèles expérimentaux actuellement disponibles pour tenter de répondre à ces questions sont les suivants:
- La culture in vitro de cellules épithéliales respiratoires humaines.The experimental models currently available to try to answer these questions are:
- In vitro culture of human respiratory epithelial cells.
Les résultats sont cependant difficilement extrapolables au fonctionnement du tissu pulmonaire in vivo. En outre, il a été montré récemment qu'un site majeur d'expression de la protéine CFTR chez l'homme est constitué par les glandes séreuses sous-épithéliales, que l'on ne sait pas cultiver sélectivement. However, the results are difficult to extrapolate to the functioning of lung tissue in vivo. In addition, it has recently been shown that a major site for expression of the CFTR protein in humans is constituted by the subepithelial serous glands, which are not known to be cultivated selectively.
- Les modèles animaux. - Animal models.
n n'existe pas de modèle animal spontané de la mucoviscidose. There is no spontaneous animal model of cystic fibrosis.
Une souche de souris "mucoviscidosique" a été créée en inactivant le gène
CFTR par recombinaison homologue (Snouwaert, J.N. et al., Science (1992) 257: 1083-1088). L'une des limitations du modèle est que les glandes séreuses, sites majeurs d'expression de la CFTR chez l'homme, sont extrêmement rares chez les rongeurs.A "cystic fibrosis" mouse strain was created by inactivating the gene
CFTR by homologous recombination (Snouwaert, JN et al., Science (1992) 257: 1083-1088). One of the limitations of the model is that the serous glands, major sites of expression of CFTR in humans, are extremely rare in rodents.
Les chimères xénogéniques. Xenogenic chimeras.
La souris SCID-hu (Science, 241, pp.1632-1639, 1988), permet de transposer directement in vivo le tissu respiratoire foetal humain dans sa structure tridimensionnelle naturelle (demande WO 93/02687 déposée le 30 juillet 1992). The SCID-hu mouse (Science, 241, pp. 1632-1639, 1988) makes it possible to directly transpose human fetal respiratory tissue in vivo into its natural three-dimensional structure (application WO 93/02687 filed on July 30, 1992).
Cependant il n'existe actuellement aucun modèle expérimental contenant un tissu respiratoire humain pathologique, notamment "mucoviscidosique", dans sa structure tridimensionnelle naturelle, et permettant donc d'effectuer un criblage des compositions susceptibles d'être actives contre une pathologie pulmonaire déterminée, notamment contre la mucoviscidose. However, there is currently no experimental model containing pathological human respiratory tissue, in particular "cystic fibrosis", in its natural three-dimensional structure, and therefore making it possible to screen the compositions capable of being active against a determined pulmonary pathology, in particular against Cystic fibrosis.
La présente invention a précisément pour but de fournir un modèle expérimental fiable pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage de compositions susceptibles d'être actives contre les différentes pathologies pulmonaires que l'on rencontre chez l'homme. The object of the present invention is precisely to provide a reliable experimental model for the implementation of a method of screening for compositions capable of being active against the various pulmonary pathologies encountered in humans.
La présente invention a pour objet tout mammifère non humain chimérique caractérisé en ce qu'il est transplanté par un greffon de tissu pulmonaire pathologique humain. The subject of the present invention is any chimeric non-human mammal characterized in that it is transplanted by a graft of human pathological pulmonary tissue.
Les pathologies caractéristiques du greffon de tissu pulmonaire humain susmentionné, sont d'origine génétique ou non. The pathologies characteristic of the aforementioned human lung tissue graft, are of genetic origin or not.
Par pathologie d'origine génétique, on entend toute pathologie causée par le dysfonctionnement d'un ou plusieurs gènes du génome d'un individu, et susceptible de se transmettre à travers les générations. A titre d'exemple de maladie pulmonaire génétique caractéristique d'un greffon selon l'invention, on peut citer la mucoviscidose. Genetic pathology means any pathology caused by the dysfunction of one or more genes in the genome of an individual, and capable of being transmitted through the generations. As an example of a genetic lung disease characteristic of a graft according to the invention, there may be mentioned cystic fibrosis.
Les pathologies n'étant pas d'origine génétique sont celles susceptibles d'être contractées par le biais de facteurs extérieurs, tels que les bactéries et les virus, ou encore certains produits chimiques ou autres composants de pollution. Pathologies not of genetic origin are those likely to be contracted through external factors, such as bacteria and viruses, or certain chemicals or other pollution components.
A titre d'exemple de maladie pulmonaire non génétique caractéristique d'un greffon selon l'invention, on peut citer les différentes formes de tumeurs du poumon.As an example of a non-genetic lung disease characteristic of a graft according to the invention, mention may be made of the various forms of lung tumors.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le tissu pulmonaire pathologique humain greffé sur le mammifère non humain chimérique, est constitué de tout ou partie d'une ébauche embryonnaire pulmonaire d'origine humaine. According to one embodiment of the invention, the human pathological lung tissue grafted on the chimeric non-human mammal, consists of all or part of an embryonic pulmonary blank of human origin.
Cette ébauche pulmonaire est constituée de tissu pulmonaire indifférencié, et est avantageusement prélevée sur des embryons ou foetus d'environ 7 à environ 15 semaines, provenant d'interruptions volontaires ou thérapeutiques de grossesse. This pulmonary outline is made up of undifferentiated pulmonary tissue, and is advantageously taken from embryos or fetuses of approximately 7 to approximately 15 weeks, originating from voluntary or therapeutic abortions of pregnancy.
Tout ou partie de l'ébauche pulmonaire peut être greffée sur l'animal. De préférence, la taille des fragments d'ébauche pulmonaire utilisés pour effectuer la greffe, varie d'environ 1 à environ 10 mm. All or part of the pulmonary outline can be grafted onto the animal. Preferably, the size of the fragments of pulmonary outline used to perform the graft, varies from approximately 1 to approximately 10 mm.
Avantageusement la partie de l'ébauche pulmonaire greffée, correspond à la fraction proximale de cette ébauche, c'est à dire la fraction située du côté de l'ouverture de cette ébauche pulmonaire (qui se présente sous la forme d'un sac), de manière à obtenir un greffon constitué de bronches et/ou bronchioles de forme tubulaire. Advantageously, the part of the grafted pulmonary blank corresponds to the proximal fraction of this blank, that is to say the fraction situated on the side of the opening of this pulmonary blank (which is in the form of a bag), so as to obtain a graft consisting of bronchi and / or bronchioles of tubular shape.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le tissu pulmonaire pathologique humain greffé sur le mammifere non humain, est un tissu différencié (provenant d'interventions chirurgicales, ou prélevé sur des cadavres). Avantageusement les fragments de tissu utilisés pour effectuer la greffe, sont choisis parmi le tissu constitutif des bronchioles, de manière à obtenir des greffons de forme tubulaire, ou le tissu constitutif des alvéoles. De préférence, la taille des fragments de tissu utilisés pour effectuer la greffe, varie d'environ 5 à environ 15 mm. According to another embodiment of the invention, the pathological human lung tissue grafted onto the non-human mammal, is a differentiated tissue (originating from surgical operations, or taken from corpses). Advantageously, the tissue fragments used to perform the graft are chosen from the tissue constituting the bronchioles, so as to obtain tubular grafts, or the tissue constituting the alveoli. Preferably, the size of the tissue fragments used to perform the graft varies from about 5 to about 15 mm.
L'ébauche embryonnaire pulmonaire pathologique ou le tissu pulmonaire pathologique différencié susmentionnés, proviennent respectivement d'un embryon ou d'un individu atteints de la pathologie pulmonaire en question. The pathological pulmonary embryonic draft or the differentiated pathological pulmonary tissue mentioned above respectively originate from an embryo or from an individual suffering from the pulmonary pathology in question.
Cette ébauche ou ce tissu pulmonaire peuvent également provenir d'un embryon ou d'un individu qui ne sont pas atteints de la pathologie déterminée que l'on souhaite retrouver dans le greffon. Dans ce dernier cas, l'ébauche ou le tissu différencié sont traités de manière à présenter les signes caractéristiques de cette pathologie. This draft or this lung tissue can also come from an embryo or from an individual who is not suffering from the determined pathology which it is desired to find in the graft. In the latter case, the blank or the differentiated tissue are treated so as to present the characteristic signs of this pathology.
Ce traitement de I'ébauche ou du tissu pulmonaire peut consister en une mise en contact de ces derniers avec un vecteur susceptible d'induire l'apparition de la pathologie déterminée. This treatment of the draft or of the pulmonary tissue may consist of bringing the latter into contact with a vector capable of inducing the appearance of the determined pathology.
Ce vecteur peut être le vecteur naturel de cette pathologie, par exemple la bactérie ou le virus directement responsable de la maladie en question. This vector can be the natural vector of this pathology, for example the bacteria or virus directly responsible for the disease in question.
Dans le cas de pathologies génétiques, ce vecteur peut être choisi parmi ceux susceptibles d'induire l'apparition de ladite pathologie, notamment soit par introduction d'une séquence nucléotidique antisens capable de bloquer
I'expression d'un gène déterminé par hybridation avec ce dernier, soit par introduction dans le génome des cellules de séquences nucléotidiques codant pour des protéines mutées dont la présence et/ou le caractère inactif sont responsables de la pathologie en question.In the case of genetic pathologies, this vector can be chosen from those capable of inducing the appearance of said pathology, in particular either by the introduction of an antisense nucleotide sequence capable of blocking
The expression of a gene determined by hybridization with the latter, or by introduction into the genome of cells of nucleotide sequences coding for mutated proteins whose presence and / or inactive character are responsible for the pathology in question.
A titre d'illustration, le tissu pulmonaire humain mucoviscidosique greffé sur Ie mammifère non humain peut également être obtenu à partir d'un tissu pulmonaire non mucoviscidosique humain embryonnaire ou différencié dont les cellules ont été transformées à l'aide d'un vecteur approprié de manière à obtenir des cellules pulmonaires dans lesquelles la protéine CFTR normale n'est plus produite, ou dans lesquelles est produite une protéine CFTR inactive. Cette transformation peut notamment être effectuée à l'aide d'un vecteur contenant une séquence nucléotidique antisens susceptible de s'hybrider avec la séquence codant la CFTR normale, bloquant ainsi l'expression de cette protéine, et/ou à l'aide d'un vecteur adénovirus dont le génome contient une séquence d'ADN codant pour une protéine CFTR inactive telle que la protéine CFTR comportant la mutation AF508. L'obtention de ce vecteur adénovirus - CFTR inactive, peut être réalisée selon la méthode illustrée dans l'article de Rosenfeld et al., Cell., 68, 143-155 (1992), en utilisant en lieu et place du gène codant pour la CFTR normale, un gène codant pour une CFTR inactive, notamment le gène codant pour la CFTR AF508. By way of illustration, the cystic fibrosis human lung tissue grafted on the non-human mammal can also be obtained from an embryonic or differentiated non-cystic fibrosis lung tissue whose cells have been transformed using an appropriate vector of so as to obtain lung cells in which the normal CFTR protein is no longer produced, or in which an inactive CFTR protein is produced. This transformation can in particular be carried out using a vector containing an antisense nucleotide sequence capable of hybridizing with the sequence coding for normal CFTR, thus blocking the expression of this protein, and / or using an adenovirus vector, the genome of which contains a DNA sequence coding for an inactive CFTR protein such as the CFTR protein comprising the AF508 mutation. Obtaining this inactive adenovirus - CFTR vector can be carried out according to the method illustrated in the article by Rosenfeld et al., Cell., 68, 143-155 (1992), using instead of the gene coding for normal CFTR, a gene coding for an inactive CFTR, in particular the gene coding for CFTR AF508.
Les mammifères non humains chimériques selon l'invention sont de préférence choisis parmi les rongeurs, et avantageusement parmi les souris xénotolérantes (c'est à dire capables d'être transplantées de façon stable par un greffon provenant d'une autre espèce, notamment par un greffon d'origine humaine). The chimeric non-human mammals according to the invention are preferably chosen from rodents, and advantageously from xenotolerant mice (that is to say capable of being transplanted stably by a graft from another species, in particular by a graft of human origin).
Les souris susmentionnées sont de préférence choisies parmi celles présentant un système immunitaire déficient, notamment parmi les souris SCID osma, G.C. et al., Nature (1983) 301: 527-532) ou NUDE disponibles notamment chez IFFA CREDO. The above-mentioned mice are preferably chosen from those with a deficient immune system, in particular from the SCID osma, G.C. et al., Nature (1983) 301: 527-532) or NUDE mice available in particular from IFFA CREDO.
Le tissu pulmonaire peut être greffé sous la capsule rénale, ou de préférence sous la peau des mammifères selon l'invention. The lung tissue can be grafted under the renal capsule, or preferably under the skin of mammals according to the invention.
La présente invention a plus particulièrement pour objet tout mammifère non humain chimérique caractérisé en ce qu'il est transplanté par un greffon de tissu pulmonaire humain comprenant des cellules tumorales ou cancéreuses. The present invention relates more particularly to any chimeric non-human mammal characterized in that it is transplanted by a graft of human lung tissue comprising tumor or cancer cells.
La présente invention a également plus particulièrement pour objet tout mammifère non humain chimérique caractérisé en ce qu'il est transplanté par un greffon de tissu pulmonaire humain comprenant des cellules, notamment des cellules épithéliales et séreuses, ou les précurseurs de ces cellules, le génome de ces cellules étant tel:
- qu'il ne contient pas de gènes codant pour une protéine CFTR normale (active),
- ou qu'il contient un gène codant pour une protéine CFTR anormale (inactive),
- ou encore qu'il contient un gène codant pour une protéine CFTR active, ce gène ne pouvant être exprimé, notamment par blocage par une séquence antisens,
I'absence ou l'inactivité de cette protéine CFTR étant responsable de la mucoviscidose chez l'homme (on parlera encore, dans ce qui précède et ce qui suit, de tissu pulmonaire humain "mucoviscidosique").A more particular subject of the present invention is also any chimeric non-human mammal characterized in that it is transplanted by a graft of human pulmonary tissue comprising cells, in particular epithelial and serous cells, or the precursors of these cells, the genome of these cells being such:
- that it does not contain genes coding for a normal (active) CFTR protein,
- or that it contains a gene coding for an abnormal (inactive) CFTR protein,
- or that it contains a gene coding for an active CFTR protein, this gene being unable to be expressed, in particular by blocking by an antisense sequence,
The absence or inactivity of this CFTR protein being responsible for cystic fibrosis in humans (we will also speak, in what precedes and what follows, of "cystic fibrosis" human lung tissue).
L'invention vise plus particulièrement un mammifère non humain chimérique tel que décrit ci-dessus, dans lequel le tissu pulmonaire greffé est une ébauche embryonnaire pulmonaire d'origine humaine, qui comprend des cellules dont le génome contient un gène responsable de la mucoviscidose. The invention relates more particularly to a chimeric non-human mammal as described above, in which the grafted lung tissue is a pulmonary embryonic draft of human origin, which comprises cells whose genome contains a gene responsible for cystic fibrosis.
L'absence ou l'inactivité de la protéine CFTR dans les cellules susmentionnées se traduit notamment par une diminution sensible, voire l'arrêt du transport des ions chlorures (Cl-) à travers la membrane de ces cellules. The absence or inactivity of the CFTR protein in the aforementioned cells is reflected in particular by a significant reduction, or even the cessation of the transport of chloride ions (Cl-) across the membrane of these cells.
L'invention a également pour objet le procédé d'obtention d'un mammifère non humain chimérique tel que décrit ci-dessus, ce procédé comprenant:
- la transplantation, dans un site anatomique approprié dudit mammifère, d'un tissu pulmonaire pathologique humain tel que décrit ci-dessus, notamment sous la capsule rénale ou sous la peau du mammifère, sous anesthésie et dans des conditions stériles,
- - le cas échéant, notamment lorsque le tissu pulmonaire est une ébauche embryonnaire, ou un tissu différencié de taille insuffisante, le maintien en vie dans des conditions appropriées (notamment stériles) du mammifère chimérique afin de permettre au tissu pulmonaire d'atteindre un stade différencié ou une taille suffisante. The subject of the invention is also the process for obtaining a chimeric non-human mammal as described above, this process comprising:
the transplantation, into an appropriate anatomical site of said mammal, of a human pathological pulmonary tissue as described above, in particular under the renal capsule or under the skin of the mammal, under anesthesia and under sterile conditions,
- - if necessary, in particular when the lung tissue is an embryonic outline, or a differentiated tissue of insufficient size, keeping the chimeric mammal alive in appropriate conditions (in particular sterile) in order to allow the lung tissue to reach a stage differentiated or a sufficient size.
De préférence, la taille du greffon doit atteindre entre environ 5 mm et environ 20 mm, lorsqu'il s'agit d'une greffe d'ébauche embryonnaire, et entre environ 5 mm et environ 30 mm, lorsqu'il s'agit d'une greffe de tissu différencié. Preferably, the size of the graft must reach between approximately 5 mm and approximately 20 mm, in the case of an embryonic draft graft, and between approximately 5 mm and approximately 30 mm, in the case of an '' a differentiated tissue graft.
L'invention concerne également l'utilisation de mammifères non humains tels que décrits ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage de compositions susceptibles d'être actives dans le cadre de la prévention ou du traitement de pathologies pulmonaires chez l'homme, et plus particulièrement dans le cadre des pathologies pulmonaires décrites ci-dessus. The invention also relates to the use of non-human mammals as described above, for the implementation of a method for screening for compositions capable of being active in the context of the prevention or treatment of pulmonary pathologies in humans, and more particularly in the context of the pulmonary pathologies described above.
L'invention a également pour objet un procédé de criblage de compositions susceptibles d'êtres actives dans le cadre de la prévention ou du traitement de pathologies pulmonaires humaines susmentionnées, caractérisé en ce qu'il comprend:
- la mise en présence d'une au moins de ces compositions avec le greffon, présent chez un mammifère non humain chimérique tel que décrit ci-dessus, pendant un temps déterminé,
- la détection de l'éventuelle restauration du mécanisme de fonctionnement du tissu pulmonaire dans le greffon, correspondant au mécanisme normal de fonctionnement du tissu pulmonaire chez un individu non atteint de la pathologie en question, cette restauration étant le témoin de l'efficacité des compositions testées contre ladite pathologie.The subject of the invention is also a method for screening compositions capable of being active in the context of the prevention or treatment of the above-mentioned human pulmonary pathologies, characterized in that it comprises:
- bringing at least one of these compositions into contact with the graft, present in a chimeric non-human mammal as described above, for a determined time,
detection of the possible restoration of the functioning mechanism of the pulmonary tissue in the graft, corresponding to the normal functioning mechanism of the pulmonary tissue in an individual not suffering from the pathology in question, this restoration being the witness to the effectiveness of the compositions tested against said pathology.
La mise en présence des compositions avec le greffon peut se faire par micro-injection de ces compositions dans le greffon. The compositions can be brought into contact with the graft by micro-injection of these compositions into the graft.
Avantageusement, notamment dans le cas de greffons correspondant à des bronchioles ou alvéoles, le contact entre le greffon et lesdites compositions peut être obtenu par pulvérisation de ces dernières dans la lumière de ces bronchioles ou alvéoles, notamment par utilisation d'aérosols. Advantageously, in particular in the case of grafts corresponding to bronchioles or alveoli, contact between the graft and said compositions can be obtained by spraying the latter in the lumen of these bronchioles or alveoli, in particular by using aerosols.
La détection de l'éventuelle restauration du mécanisme de fonctionnement du tissu pulmonaire, dans le cadre du procédé de criblage susmentionné, est avantageusement réalisée par prélèvement d'une partie du greffon que l'on met en culture in vitro dans un milieu approprié, puis on détecte l'éventuelle restauration du mécanisme de fonctionnement du tissu pulmonaire dans le greffon, correspondant au mécanisme normal de fonctionnement du tissu pulmonaire chez un individu non atteint de la pathologie en question. The detection of the possible restoration of the functioning mechanism of the pulmonary tissue, within the framework of the aforementioned screening method, is advantageously carried out by removal of a part of the graft which is placed in culture in vitro in an appropriate medium, then the possible restoration of the functioning mechanism of the lung tissue in the graft is detected, corresponding to the normal functioning mechanism of the lung tissue in an individual not suffering from the pathology in question.
Dans le cas de la mucoviscidose, on dédectera l'éventuelle restauration du mécanisme correspondant à celui contrôlé par la protéine CFTR dans le tissu pulmonaire d'un homme sain (c'est à dire non atteint de mucoviscidose). In the case of cystic fibrosis, the possible restoration of the mechanism corresponding to that controlled by the CFTR protein in the lung tissue of a healthy man (that is to say not suffering from cystic fibrosis) will be dedicated.
La détection de l'éventuelle restauration du mécanisme de fonctionnement pulmonaire susmentionné dans le cas de la mucoviscidose, peut être effectuée:
- par détection du fonctionnement normal du mécanisme de transport des ions Cl- (par mesure des courants transmembranires d'une cellule isolée ou d'un fragment de membrane ceIlulaire, notamment selon la technique décrite par
Hamill et al., (1981), Pflügers Arch 391: 85-100; ou à l'aide d'ions Cl-marqués de manière radioactive, notamment selon la technique décrite par Venglarik et al. (1990), Am. J. Physiol. 90: C358-C364), témoin de la présence de CFTR normale, ou d'un composé présentant une activité analogue à celle de la protéine
CFTR,
- ou encore par détection ou dosage de la quantité de protéine CFTR normale produite dans le greffon, notamment à l'aide d'anticorps dirigés contre cette protéine, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Rosenfeld et al., cité ci-dessus.Detection of the possible restoration of the aforementioned pulmonary functioning mechanism in the case of cystic fibrosis can be carried out:
- by detecting the normal functioning of the Cl- ion transport mechanism (by measuring the transmembrane currents of an isolated cell or of a fragment of cell membrane, in particular according to the technique described by
Hamill et al., (1981), Pflügers Arch 391: 85-100; or using radioactive Cl-labeled ions, in particular according to the technique described by Venglarik et al. (1990), Am. J. Physiol. 90: C358-C364), indicating the presence of normal CFTR, or of a compound exhibiting an activity analogous to that of the protein
CFTR,
- Or by detection or assay of the amount of normal CFTR protein produced in the graft, in particular using antibodies directed against this protein, in particular according to the method described in the article by Rosenfeld et al., cited above. above.
L'invention vise également l'utilisation d'un vecteur adénovirus recombinant comprenant, en l'un des sites de son génome non essentiels pour sa réplication, un gène codant pour la protéine CFTR normale chez l'homme, en tant que témoin de contrôle de la restauration du fonctionnement du tissu pulmonaire dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de criblage tel que décrit ci-dessus. The invention also relates to the use of a recombinant adenovirus vector comprising, at one of the sites of its genome which are not essential for its replication, a gene coding for the normal CFTR protein in humans, as a control control. of the restoration of the functioning of the pulmonary tissue within the framework of the implementation of a screening method as described above.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques telles qu'obtenues par mise en oeuvre d'un procédé de criblage susmentionné. A subject of the invention is also the pharmaceutical compositions as obtained by implementing a screening method mentioned above.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la préparation de souris chimériques SCID selon l'invention, transplantées par une ébauche embryonnaire pulmonaire humaine mucoviscidosique, et de la démonstration de leur aptitude en tant que modèle expérimental animal à l'aide d'un adénovirus dont le génome contient le gène codant pour la ss-galactosidase. The invention will be further illustrated with the aid of the following detailed description of the preparation of chimeric SCID mice according to the invention, transplanted with a human pulmonary cystic fibrosis blank, and the demonstration of their aptitude as an animal experimental model using an adenovirus whose genome contains the gene encoding ss-galactosidase.
animaux
Les souris de souche C.B.17 scid/scid (SCID) sont produites, élevées et manipulées dans une animalerie spéciale, à l'Institut d'Embryologie Cellulaire et
Moléculaires du CNRS et du Collège de France. Ces animaux sont élevés en isolateurs alimentés en air stérilisé et conditionné. Le matériel d'élevage est stérilisé par autoclavage, à l'exception de la nourriture qui l'est par irradiation r. Toutes les manipulations des souris sont effectuées sous hottes à flux laminaire, par un personnel spécialement formé et équipé. animals
CB17 scid / scid (SCID) mice are produced, bred and handled in a special animal facility, at the Institute of Cell Embryology and
Moleculars of the CNRS and the Collège de France. These animals are raised in isolators supplied with sterilized and conditioned air. The farming equipment is sterilized by autoclaving, with the exception of food which is by irradiation r. All mouse manipulations are carried out under laminar flow hoods, by specially trained and equipped personnel.
- Matériel expérimental
Les ébauches pulmonaires ont été prélevées sur des embryons et foetus provenant d'interruptions volontaires ou thérapeutiques de grossesse. Le gène transféré dans ces expériences est la construction adénovirus-pgalactosidase, décrite ci-après.- Experimental equipment
The lung sketches were taken from embryos and fetuses from voluntary or therapeutic termination of pregnancy. The gene transferred into these experiments is the adenovirus-pgalactosidase construction, described below.
- Transplantation de l'ébauche pulmonaire dans la souris SCID
L'ébauche pulmonaire est transplantée, sous la loupe binoculaire et à l'aide d'instruments de microchirurgie, sous la capsule rénale ou sous la peau de souris SCID (4 à 8 semaines) anesthésiées. L'ensemble de la manipulation est réalisée en conditions stériles.- Transplantation of the pulmonary outline in the SCID mouse
The pulmonary outline is transplanted, under a binocular microscope and using microsurgical instruments, under the renal capsule or under the skin of anesthetized SCID mice (4 to 8 weeks). All handling is carried out under sterile conditions.
- Transfert de gènes vers le tissu pulmonaire greffé dans la souris SCID. - Transfer of genes to the lung tissue grafted in the SCID mouse.
Le gène en solution dans du PBS est injecté directement dans le tissu greffé, mis à nu après anesthésie de l'animal. L'injection a été réalisée soit avec une seringue Hamilton de 20,u1, soit avec une seringue usuelle de lml équipée d'une aiguille flne (27G). En fonction de la taille de la greffe, des volumes de 20 à 100,ut ont été injectés. The gene in solution in PBS is injected directly into the grafted tissue, exposed after anesthesia of the animal. The injection was carried out either with a Hamilton syringe of 20, u1, or with a usual syringe of lml equipped with a flne needle (27G). Depending on the size of the graft, volumes of 20 to 100, ut were injected.
La peau des animaux porte-greffes est ensuite refermée à l'aide d'agrafes chirurgicales, et ils sont replacés dans l'élevage. The skin of the rootstock animals is then closed using surgical staples, and they are replaced in the breeding.
- Analyse histoenz:ymatique des tissus pulmonaires humains trans du its in vivo dans la souris SCID. - Histoenz analysis: ymatic of human lung tissue trans its in vivo in SCID mice.
Une ou deux semaines après l'injection de la construction génique, I'animal porte-greffe est sacrifié par dislocation cervicale. Le greffon est prélevé, débarrassé de ses adhérences et fixé pendant 2/3 heures dans une solution de formaldéhyde à 10% dans le PBS, puis après rinçages, placé dans du
PBS contenant 10% de sucrose, après quoi le tissu est congelé dans l'azote liquide dans le milieu d'inclusion Tissue-Tek. Des coupes au cryostat de 10,um d'épaisseur sont montées sur lames de verre et incubées pendant la nuit, à 30"C, avec la solution de substrat de l'enzyme p-galactosidase:
20cul ferrocyanure de K 200 mM
20,u1 ferricyanure de K 200 mM 14 MgC12
9504 PBS
lop X-gal
Les coupes sont ensuite rincées au PBS, contre-colorées à l'hématoxyline ou à l'éosine, puis montées pour l'observation.One or two weeks after the injection of the gene construct, the rootstock animal is sacrificed by cervical dislocation. The graft is removed, stripped of its adhesions and fixed for 2/3 hours in a 10% formaldehyde solution in PBS, then after rinsing, placed in
PBS containing 10% sucrose, after which the tissue is frozen in liquid nitrogen in the Tissue-Tek inclusion medium. 10 μm thick cryostat sections are mounted on glass slides and incubated overnight, at 30 ° C., with the substrate solution of the enzyme p-galactosidase:
20cul ferrocyanide of K 200 mM
20, u1 K ferricyanide 200 mM 14 MgC12
9504 PBS
lop X-gal
The sections are then rinsed with PBS, counterstained with hematoxylin or eosin, then mounted for observation.
- Résultats: modification génique du tissu pulmonaire humain greffé dans la souris SCID. - Results: gene modification of human lung tissue grafted in SCID mice.
Après transfert du gène 13-galactosidase, véhiculé par un vecteur adénoviral, vers le tissu respiratoire foetal humain greffé dans la souris SCID a été observée la transduction de nombreuses cellules pulmonaires, une ou deux semaines après le transfert génique. La réaction enzymatique apparaît sous la forme d'une coloration nucléaire bleue foncée intense. Les cellules transduites sont, dans leur grande majorité, des cellules épithéliales bordant la lumière des conduits bronchiolaires. Plus rarement, on observe des cellules transduites de type uniforme dans la greffe, et que les cellules transduites apparaissent plutôt en foyers correspondant vraisemblablement aux sites d'injections de la construction adénovirale. After transfer of the 13-galactosidase gene, carried by an adenoviral vector, to the human fetal respiratory tissue grafted in the SCID mouse, the transduction of numerous lung cells was observed one or two weeks after gene transfer. The enzymatic reaction appears in the form of an intense dark blue nuclear coloration. The majority of transduced cells are epithelial cells lining the lumen of the bronchiolar ducts. More rarely, cells of the uniform type are observed in the graft, and the transduced cells appear rather in foci corresponding probably to the injection sites of the adenoviral construction.
Techniquement, I'avantage de la présente invention réside dans le fait que la construction génique que l'on veut tester est transférée dans un tissu pulmonaire humain intact, développé dans sa structure tridimensionnelle normale. En outre, de telles cultures in vivo peuvent être maintenues à très long terme (la durée de la greffe la plus longue est actuellement de 11 mois). Technically, the advantage of the present invention resides in the fact that the gene construction which it is desired to test is transferred into intact human lung tissue, developed in its normal three-dimensional structure. In addition, such in vivo cultures can be maintained for the very long term (the longest transplant period is currently 11 months).
- Construction de t'adénovirus recombinant, Ad-RSV-ssgal, par recombinaison in vivo. - Construction of the recombinant adenovirus, Ad-RSV-ssgal, by in vivo recombination.
Cette construction est décrite en détail dans l'article de Leslie D. Stratford - Perricaudet et al., paru dans J. Clin. Invest., 90, 626-630, 1992. This construction is described in detail in the article by Leslie D. Stratford - Perricaudet et al., Published in J. Clin. Invest., 90, 626-630, 1992.
En résumé, cet adénovirus recombinant a été construit par recombinaison homologue entre un plasmide approprié et le génome de l'adénovirus de type 5 (AdS). Dans cette construction, le gène de la ss-galactosidase est placé sous le contrôle du promoteur RSV (Rous Sarcoma Virus). Le plasmide pAdRSVssgal utilisé contient le segment PvuII de l'extrémité gauche de l'Ad5 (segment situé entre les positions 0 et 1,3 du plasmide sur la figure 1) comprenant la répétition terminale intervertie, L'origine de réplication, des signaux d'encapsidation, et l'amplificateur Ela. Ce fragment est suivi par un gène nlslacZ (décrit dans
Bonnerot, c. et al., Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 6795-6799) codant pour la 13-galactosidase, et par un fragment de l'adénovhus Ad5 situé entre les positions 9,4 et 17 du plasmide de la figure 1. In summary, this recombinant adenovirus was constructed by homologous recombination between an appropriate plasmid and the genome of the adenovirus type 5 (AdS). In this construction, the ss-galactosidase gene is placed under the control of the promoter RSV (Rous Sarcoma Virus). The plasmid pAdRSVssgal used contains the PvuII segment of the left end of Ad5 (segment located between positions 0 and 1.3 of the plasmid in FIG. 1) comprising the inverted terminal repetition, The origin of replication, signals packaging, and the Ela amplifier. This fragment is followed by an nlslacZ gene (described in
Bonnerot, c. et al., Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 6795-6799) coding for 13-galactosidase, and with a fragment of the adenovhus Ad5 located between positions 9,4 and 17 of the plasmid of FIG. 1.
Les valeurs des positions 1,3, 9,4 et 17 indiquées ci-dessus sont des unités indiquant le nombre de paires de base comprises à l'intérieur de ces fragments, une unité représentant 360 paires de base. The values of positions 1,3, 9,4 and 17 indicated above are units indicating the number of base pairs included inside these fragments, one unit representing 360 base pairs.
La séquence d'AdS située entre les positions 9,4 et 17 susmentionnées permet la recombinaison avec l'adénovirus dl324 traité par l'enzyme de restriction ClaI (correspondant à un mutant de délétion E3; la délétion étant effectuée entre les positions 78,4 et 84,3 du génome de l'adénovirus représenté sur la figure 1), après transfection de cellules 293 (cellules embryonnaires humaines de rein transformées par l'adénovirus et mentionnées ci-dessus) afin de générer le vecteur recombinant Ad-RSV-ssgal. Le gène nlslacZ est contrôlé par le promoteur RSV LTR et possède le signal de polyadénylation du virus
SV40. Le virus recombinant ainsi obtenu est incapable de se répliquer en raison de la délétion des gènes El.The AdS sequence located between positions 9.4 and 17 above allows recombination with the adenovirus dl324 treated with the restriction enzyme ClaI (corresponding to an E3 deletion mutant; the deletion being carried out between positions 78.4 and 84.3 of the adenovirus genome represented in FIG. 1), after transfection of 293 cells (human embryonic kidney cells transformed by the adenovirus and mentioned above) in order to generate the recombinant vector Ad-RSV-ssgal . The nlslacZ gene is controlled by the RSV LTR promoter and has the polyadenylation signal of the virus.
SV40. The recombinant virus thus obtained is incapable of replicating due to the deletion of the E1 genes.
- Méthodologie des tests fonctionnels de détection de la restauration du mécanisme de fonctionnement des cellules pulmonaires correspondant à celui contrôlé par la protéine CFYR dans les cellules pulmonaires d'un homme sain. - Methodology of functional tests to detect the restoration of the functioning mechanism of lung cells corresponding to that controlled by the CFYR protein in the lung cells of a healthy man.
Ces méthodes d'étude sont le patch-clamp membranaire et la mesure des efflux de 36C1- sur cellules isolées. La restauration fonctionnelle de la protéinecanal CFTR est testée par l'application d'agonistes de la sécrétion de Cl- qui utilisent la voie de l'AMPc intracellulaire. These study methods are the membrane patch clamp and the measurement of 36C1- efflux on isolated cells. The functional restoration of the CFTR channel protein is tested by the application of Cl- secretion agonists which use the intracellular cAMP pathway.
. Isolement cellulaire
Les cellules épithéliales sont isolées à partir des prélèvements de tout ou partie des greffons par digestion enzymatique à l'aide de protéase et agitation mécanique d'après le protocole d'isolement des cellules épithéliales de polypes (Chevillard et al. (1991), Cell. Tissue. Res. 264:49-55). Elles sont maintenues en culture primaire.. Cell isolation
The epithelial cells are isolated from samples of all or part of the grafts by enzymatic digestion using protease and mechanical agitation according to the protocol for the isolation of epithelial cells from polyps (Chevillard et al. (1991), Cell Tissue. Res. 264: 49-55). They are kept in primary culture.
Mesures des efflux de 36C1-
L'utilisation de Cl- radioactif (36C1-) permet de suivre l'efflux de Cl- au cours du temps dans des cellules préalablement chargées (Venglarik et al., déjà cité) Les cellules ayant atteint un taux de confluence d'environ 90% sont incubées dans du tampon d'efflux contenant le 36Cl-. Après rinçage, des aliquots du surnageant sont prélevés régulièrement et la radioactivité de chaque échantillon est mesurée. L'addition de différentes substances actives au cours de
I'expérience permet de mesurer la fonctionnalité des mécanismes de régulation de l'efflux de Cl- dans un épithélium reconstitué.36C1 efflux measurements
The use of radioactive Cl- (36C1-) makes it possible to follow the efflux of Cl- over time in previously charged cells (Venglarik et al., Already cited) Cells having reached a confluence rate of approximately 90 % are incubated in efflux buffer containing 36Cl-. After rinsing, aliquots of the supernatant are removed regularly and the radioactivity of each sample is measured. The addition of different active substances during
The experiment makes it possible to measure the functionality of the mechanisms for regulating the efflux of Cl- in a reconstituted epithelium.
Patch-clamp membranaire
La technique du patch-clamp permet la mesure des courants transmembranaires d'une cellule isolée ou d'un fragment de membrane.Membrane patch clamp
The patch-clamp technique allows the measurement of the transmembrane currents of an isolated cell or a fragment of membrane.
Plusieurs configurations de la technique du patch-clamp sont utilisées (Hamill et al., déjà cité).Several configurations of the patch-clamp technique are used (Hamill et al., Already cited).
* Configuration patch perméabilisé
Dans la configuration cellule-attachée, I'ensemble des courants sont enregistrés. La membrane située sous la pipette est perméabilisée permettant une continuité électrique entre la pipette et l'intérieur de la cellule (Horn et Marty (1988), J. Gen. Physiol. 92: 145-159). L'addition de différentes substances actives au cours de l'expérience permet de mesurer la fonctionnalité des canaux responsables de la sortie de CI- dans une cellule.* Permeabilized patch configuration
In the cell-attached configuration, all of the currents are recorded. The membrane located under the pipette is permeabilized allowing electrical continuity between the pipette and the interior of the cell (Horn and Marty (1988), J. Gen. Physiol. 92: 145-159). The addition of different active substances during the experiment makes it possible to measure the functionality of the channels responsible for the output of CI- in a cell.
* Configuration cellule-attachée
Lorsque la pipette est collée sur la cellule, on peut enregistrer directement l'activité des canaux CFTR présents dans le fragment de membrane.* Cell-attached configuration
When the pipette is stuck on the cell, the activity of the CFTR channels present in the membrane fragment can be recorded directly.
* Configuration "inside-out"
Quand le fragment de membrane situé sous la pipette est isolé de la cellule, sa face externe est en contact avec le milieu intrapipette et sa face interne avec le milieu du bain. Dans ces conditions, l'expérimentateur a accès à la face intracellulaire des canaux présents dans le fragment de membrane.* "Inside-out" configuration
When the fragment of membrane situated under the pipette is isolated from the cell, its external face is in contact with the intrapipette medium and its internal face with the medium of the bath. Under these conditions, the experimenter has access to the intracellular side of the channels present in the membrane fragment.
Ces deux dernières configurations permettent de tester la fonctionnalité d'un nombre réduit de protéine-canal CFTR. These last two configurations make it possible to test the functionality of a reduced number of CFTR protein-channel.
La figure I représente une construction d'un vecteur recombinant correspondant à l'adénovirus de type Ad5 dans le génome duquel est inséré le gène de la p-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV. FIG. I represents a construction of a recombinant vector corresponding to the adenovirus of the Ad5 type in the genome of which the p-galactosidase gene is inserted under the control of the RSV promoter.
Claims (16)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9309984A FR2708831A1 (en) | 1993-08-13 | 1993-08-13 | Chimeric non-human mammal, and its use for the screening of pharmaceutical compositions against human pulmonary pathologies. |
| AU75018/94A AU7501894A (en) | 1993-08-13 | 1994-08-12 | Non-human chimeric mammalian model for human pulmonary diseases |
| PCT/FR1994/001002 WO1995005473A1 (en) | 1993-08-13 | 1994-08-12 | Non-human chimeric mammalian model for human pulmonary diseases |
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| FR9309984A FR2708831A1 (en) | 1993-08-13 | 1993-08-13 | Chimeric non-human mammal, and its use for the screening of pharmaceutical compositions against human pulmonary pathologies. |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2876246A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-14 | Univ Reims Champagne Ardenne | Producing regenerated human bronchiolar epithelium uses cells implanted as xenograft in non-human mammal, e.g. rat |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1990004017A1 (en) * | 1988-10-05 | 1990-04-19 | Anticancer Inc. | Animal model for human disease |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9217885D0 (en) * | 1992-08-21 | 1992-10-07 | Medical Res Council | Mutant mice |
| JP2801085B2 (en) * | 1992-09-11 | 1998-09-21 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | Non-human animal with xenograft on airway implanted with human cells |
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1993
- 1993-08-13 FR FR9309984A patent/FR2708831A1/en not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-08-12 AU AU75018/94A patent/AU7501894A/en not_active Abandoned
- 1994-08-12 WO PCT/FR1994/001002 patent/WO1995005473A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| FR2876246A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-14 | Univ Reims Champagne Ardenne | Producing regenerated human bronchiolar epithelium uses cells implanted as xenograft in non-human mammal, e.g. rat |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995005473A1 (en) | 1995-02-23 |
| AU7501894A (en) | 1995-03-14 |
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