FR2751663A1

FR2751663A1 - METHOD FOR EVIDENCE OF ENZYMATIC ACTIVITY OF MICROORGANISMS

Info

Publication number: FR2751663A1
Application number: FR9609523A
Authority: FR
Inventors: Sylvain Orenga
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1996-07-29
Publication date: 1998-01-30
Anticipated expiration: 2016-07-29
Also published as: FR2751663B1; ATE242817T1; US6046016A; DE69722771D1; EP0880599A1; ES2201311T3; DE69722771T2; JP3717945B2; EP0880599B1; JPH11512935A; CA2231067A1; WO1998004735A1

Abstract

The method consists in the use of one compound of formula: X-NH-R in which X represents one 5-bromoindole-3-yle group and R represents the acyl radical of one amino acid selected between leucine and alanine, as tracer for demonstrating, by the formation of a coloured product, a peptidase activity in a culture of micro-organisms.

Description

La présente invention concerne un procédé de mise en évidence d'une activité enzymatique de microorganismes. Un tel procédé peut être utilisé pour l'identification de microorganismes exprimant ou n'exprimant pas cette activité enzymatique. The present invention relates to a method for demonstrating an enzymatic activity of microorganisms. Such a method can be used for the identification of microorganisms that express or do not express this enzymatic activity.

La détection et l'identification des microorganismes sont très importantes notamment en médecine, dans l'industrie agroalimentaire, pour le contrôle de l'environnement (par exemple le contrôle de l'eau...). Les microorganismes peuvent être recherchés pour leur pathogénicité, comme indicateurs de contamination, ou encore pour le contrôle de procédés de fabrication. The detection and identification of microorganisms are very important, particularly in medicine, in the food industry, for the control of the environment (for example the control of water ...). Microorganisms can be searched for their pathogenicity, as indicators of contamination, or for the control of manufacturing processes.

Les techniques de détection et d'identification de microorganismes sont actuellement basées sur la recherche de séquence nucléotidiques caractéristiques, la recherche d'antigènes ou d'anticorps, la culture, en milieu sélectif ou non sélectif, ou encore sur la recherche d'activités métaboliques et notamment enzymatiques (par exemple activités d'osidases, d'estérases, de peptidases, d'oxydases, etc.). Microorganism detection and identification techniques are currently based on the search for characteristic nucleotide sequences, the search for antigens or antibodies, the cultivation, in a selective or non-selective medium, or on the search for metabolic activities. and in particular enzymatic (eg osidase, esterase, peptidase, oxidase activities, etc.).

Le plus souvent, les procédés de détection et d'identification des microorganismes associent plusieurs de ces techniques. La culture est ainsi utilisée pour multiplier et sélectionner les microorganismes recherchés. Afin de simplifier leur détection, il a été proposé de mettre en évidence des activités biochimiques en introduisant des molécules produisant une coloration ou une fluorescence, directement dans le milieu de culture. De tels milieux sont appelés milieux de détection. Les activités biochimiques peuvent être mises en évidence par diverses méthodes telles que
- la modification physico-chimique du milieu : changement de pH révélé à l'aide d'un indicateur coloré ou fluorescent (méthyl-umbelliférone),
- le changement du potentiel redox révélé à l'aide d'un indicateur coloré (sel de tétrazolium) ou fluorescent,
- la réaction d'une molécule produite par les microorganismes avec un composé présent dans le milieu, conduisant à une coloration,
- l'hydrolyse de molécules libérant un composé coloré ou fluorescent (naphtol, coumarine).Most often, methods for detecting and identifying microorganisms combine many of these techniques. The culture is thus used to multiply and select the desired microorganisms. In order to simplify their detection, it has been proposed to demonstrate biochemical activities by introducing molecules producing a coloration or a fluorescence directly into the culture medium. Such media are called detection media. Biochemical activities can be highlighted by various methods such as
- physicochemical modification of the medium: pH change revealed using a colored or fluorescent indicator (methyl umbelliferone),
the change in redox potential revealed using a colored indicator (tetrazolium salt) or a fluorescent indicator,
the reaction of a molecule produced by the microorganisms with a compound present in the medium, leading to a coloration,
the hydrolysis of molecules releasing a colored or fluorescent compound (naphthol, coumarin).

Les hydrolyses détectées sont en général le résultat de l'action d'une enzyme produite par le microorganisme sur un substrat enzymatique naturel ou synthétique. Ces activités enzymatiques sont par exemple celles des enzymes suivantes : estérases (par exemple lipases, phosphatases), osidases (B-galacto-sidase, P-glucuronidase, N-acétyl-hexosaminidase), peptidases (alanineaminopeptidase, trypsinase, gélatinase), DNAses, décarboxylases, désaminases, uréases, tryptophanases, oxydases, catalases, etc. The hydrolyses detected are generally the result of the action of an enzyme produced by the microorganism on a natural or synthetic enzymatic substrate. These enzymatic activities are for example those of the following enzymes: esterases (for example lipases, phosphatases), osidases (β-galactosidase, β-glucuronidase, N-acetyl-hexosaminidase), peptidases (alanineaminopeptidase, trypsinase, gelatinase), DNAses, decarboxylases, deaminases, ureas, tryptophanases, oxidases, catalases, etc.

On sait que les milieux gélifiés sont particulièrement bien adaptés à la culture et à l'isolement de microorganismes à partir d'un prélèvement, ainsi qu'à la détection de microorganismes "cibles" au sein d'un mélange de microorganismes. Sur ces milieux, les microorganismes forment des colonies détectables à l'oeil nu, et il est hautement souhaitable que les produits des activités biochimiques recherchées restent localisés sur leur site de production. Cela permet en effet de distinguer une colonie de ses voisines si elles n'expriment pas les mêmes activités. On peut ainsi utiliser diverses méthodes détectant par exemple des changements de pH (FR-A-2 671 100), des activités d'estérases (FR-2 457 323), des activités d'osidases (FR-A-2 684 110) etc. I1 est évidemment possible d'utiliser conjointement plusieurs de ces méthodes, afin de mettre en évidence plusieurs espèces ou souches, et/ou d'accroître la sensibilité et/ou la spécificité de la détection. It is known that gelled media are particularly well suited to the culture and isolation of microorganisms from a sample, as well as the detection of "target" microorganisms in a mixture of microorganisms. On these media, the microorganisms form colonies detectable to the naked eye, and it is highly desirable that the products of the biochemical activities sought remain localized at their production site. This makes it possible to distinguish a colony from its neighbors if they do not express the same activities. It is thus possible to use various methods detecting, for example, changes in pH (FR-A-2 671 100), esterase activities (FR-2 457 323), osidase activities (FR-A-2 684 110). etc. It is obviously possible to use several of these methods together, in order to highlight several species or strains, and / or to increase the sensitivity and / or the specificity of the detection.

On ne dispose pas actuellement de moyen, adapté aux milieux gélifiés, pour mettre en évidence des activités de L-Alanineaminopeptidases, D-Alanine-aminopeptidases et L-Leucine-aminopeptidases de microorganismes. En effet, les substrats enzymatiques utilisés jusqu'à présent libèrent des molécules colorées ou fluorescentes qui diffusent dans les milieux gélifiés et/ou qui ne sont révélées que par irradiation U.V. (cas de la naphtylamine ou de l'aminocoumarine) et/ou après action de réactifs (cas de la naphtylamine), ou dont la coloration est peu contrastée dans les milieux réactionnels utilisés en microbiologie (cas de la nitroaniline). There is currently no means, suitable for gelled media, to demonstrate activities of L-Alanineaminopeptidases, D-Alanine aminopeptidases and L-leucine aminopeptidases of microorganisms. Indeed, the enzymatic substrates used until now release colored or fluorescent molecules which diffuse in the gelled media and / or which are revealed only by UV irradiation (case of naphthylamine or aminocoumarin) and / or after action reagents (case of naphthylamine), or whose coloring is poorly contrasted in the reaction media used in microbiology (case of nitroaniline).

On sait que la L-Leucine-aminopeptidase a été mise en évidence dans des coupes histologiques de mammifères grâce à un substrat enzymatique, la L-Leucine-3-(5-Bromo-indolamine), par abréviation L-Leu-BIA, qui produit après hydrolyse un composé coloré ; voir Pearson et ai., 1963, Lab. Invest., 12 : 712. En 1967, Yarborough et al., J. Reticuloendoth. Soc., 4 : 390 ont repris la technique de Pearson et al. dans des applications similaires (coupes histologiques). Ils ont précisé que l'ajout d'un mélange de ferri- et ferrocyanure de potassium ou de sulfate de cuivre inhibe la réaction. L-Leucine aminopeptidase has been demonstrated in histological sections of mammals by means of an enzymatic substrate, L-Leucine-3- (5-Bromoindolamine), abbreviated L-Leu-BIA, which produced after hydrolysis a colored compound; see Pearson et al., 1963, Lab. Invest., 12: 712. In 1967, Yarborough et al., J. Reticuloendoth. Soc., 4: 390 have resumed the technique of Pearson et al. in similar applications (histological sections). They pointed out that the addition of a mixture of ferri- and potassium ferrocyanide or copper sulphate inhibits the reaction.

En 1975 Lojda et Havránková, Histochemistry, 43 : 355 proposèrent d'améliorer la méthode utilisant le substrat L-Leu-BIA par l'addition d'un mélange de sel de tétrazolium et de phénazine méthosulfate, la réaction colorée observée provenant alors de la réduction du sel de tétrazolium en formazan. In 1975 Lojda and Havránková, Histochemistry, 43: 355 proposed to improve the method using the L-Leu-BIA substrate by the addition of a mixture of tetrazolium salt and phenazine methosulphate, the observed color reaction then coming from the reduction of tetrazolium salt to formazan.

Lors des travaux ayant conduit à la présente invention, on a recherché s'il était possible d'utiliser ce substrat enzymatique dans la détection de microorganismes cultivés notamment sur milieux gélifiés. Lors d'essais préliminaires, on a ajouté de la L-Leu-BIA dans un milieu, couramment utilisé pour la recherche d'osidases, qui est décrit à l'exemple 1 ci-après. During the work leading to the present invention, it was investigated whether it was possible to use this enzyme substrate in the detection of microorganisms grown in particular on gelled media. In preliminary tests, L-Leu-BIA was added in a medium, commonly used for the search for osidases, which is described in Example 1 below.

Il n'a pas été possible de mettre en évidence une activité de peptidase, quel que soit le microorganisme cultivé dans ce milieu (Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter, Pseudomonas,
Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus).It has not been possible to demonstrate a peptidase activity, regardless of the microorganism cultivated in this medium (Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter, Pseudomonas,
Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus).

En revanche, si l'on ajoute dans ce même milieu de la L Leucine-7-amino-4-méthyl-coumarine (L-Leu-AMC), une fluorescence est détectée avec certains de ces mêmes microorganismes. De même dans ce milieu, avec des substrats d'osidases (5-Bromo-4-chloro-3 indolyl-ss-D-galactoside et 6-Chloro-3-indolyl-ss-D-glucuronide), on peut détecter les activités de ss-galactosidase et de ss-glucuro- nidase des microorganismes. L'ajout des réactifs proposés par Lojda et Havránková s'est traduit par une inhibition plus ou moins complète de la croissance des microorganismes sans permettre la révélation d'une activité de peptidase avec la L-Leu-BIA. On the other hand, if L Leucine-7-amino-4-methyl-coumarin (L-Leu-AMC) is added to the same medium, a fluorescence is detected with some of these same microorganisms. Similarly, in this medium, with osidase substrates (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-s-D-galactoside and 6-chloro-3-indolyl-s-D-glucuronide), the activities can be detected. of β-galactosidase and β-glucuronidase of microorganisms. The addition of the reagents proposed by Lojda and Havránková resulted in a more or less complete inhibition of the growth of the microorganisms without allowing the revelation of a peptidase activity with L-Leu-BIA.

De même, avec le milieu utilisé à l'exemple 2, on nta pas pu mettre en évidence une activité de peptidase avec L-Leu-BIA, alors que le substrat L-Leu-AMC permet de détecter cette activité dans le même milieu. Likewise, with the medium used in Example 2, it was not possible to demonstrate a peptidase activity with L-Leu-BIA, whereas the L-Leu-AMC substrate makes it possible to detect this activity in the same medium.

On a maintenant découvert que l'absence de résultats avec les dérivés de BIA n'était pas due à une incompatibilité avec les microorganismes ou à une inhibition de leur multiplication en culture, mais était due essentiellement à des conditions de milieu. On a en effet découvert qu'il était possible de révéler l'activité de peptidase de microorganismes avec la L-Leu-BIA, en utilisant d'autres milieux de culture. Les raisons pour lesquelles certains milieux sont utilisables, et d'autres non, ne sont pas connues. It has now been found that the lack of results with BIA derivatives is not due to incompatibility with or inhibition of microorganisms in culture, but was due mainly to environmental conditions. It has been discovered that it is possible to reveal the activity of peptidase of microorganisms with L-Leu-BIA, using other culture media. The reasons for which certain media are usable, and others not, are not known.

Néanmoins, il est possible de déterminer et de mettre au point, par de simples expériences de routine, semblables à celles décrites dans la partie expérimentale ci-après, les milieux et/ou ingrédients qui conviennent ou qui ne conviennent pas. L'invention a donc d'abord consisté notamment à rechercher, et à montrer qu'il était possible de trouver, des milieux de culture dans lesquels les substrats de peptidases dérivés de la 5-bromoindolamine mentionnés ci-dessus sont utilisables pour mettre en évidence les activités enzymatiques correspondantes dans une culture de microorganismes.Nevertheless, it is possible to determine and to develop, by simple routine experiments, similar to those described in the experimental part below, the appropriate and unsuitable media and / or ingredients. The invention therefore firstly consisted in particular in researching and showing that it was possible to find culture media in which the 5-bromoindolamine-derived peptidase substrates mentioned above can be used to highlight the corresponding enzymatic activities in a culture of microorganisms.

On a ainsi découvert notamment que le milieu suivant est utilisable
- Extrait de levure O, 5-25 0,5-25 g/l
- Peptone de gélatine O, 5-25 0,5-25 g/l
- NaCl ...................................................... 0-50 g/l et éventuellement
- Agent régulateur de pH, quantité suffisante pour pH = 3 à 9 et/ou
- Agent gélifiant........................................ 5-35 g/l
Le pH choisi est un pH qui convient pour le microorganisme étudié. Dans le cas d'un milieu gélifié, le pH est de préférence de 5 à 9. On peut ajuster le pH, par exemple, avec de l'acide chlorhydrique ou du carbonate de sodium.In particular, it has been discovered that the following medium is usable
- Yeast extract O, 5-25 0.5-25 g / l
- Peptone gelatin O, 5-25 0.5-25 g / l
- NaCl ................................................ ...... 0-50 g / l and possibly
PH regulating agent, sufficient quantity for pH = 3 to 9 and / or
- Gelling agent ........................................ 5-35 g / l
The pH chosen is a pH which is suitable for the microorganism studied. In the case of a gelled medium, the pH is preferably 5 to 9. The pH can be adjusted, for example, with hydrochloric acid or sodium carbonate.

Si on ajoute à un tel milieu de la L-Leu-BIA, et si on ensemence avec des microorganismes, on obtient des colonies brunes ou incolores suivant que les microorganismes expriment ou non une activité de L-Leucine-aminopeptidase. If L-Leu-BIA is added to such a medium, and if it is seeded with microorganisms, brown or colorless colonies are obtained depending on whether or not the microorganisms express L-Leucine aminopeptidase activity.

Des résultats comparables ont été obtenus avec les substrats L-Ala-BIA et D-Ala-BIA. Comparable results were obtained with the L-Ala-BIA and D-Ala-BIA substrates.

L'invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un composé de formule
X-NH-R dans laquelle X représente un groupe 5-bromoindole-3-yle et R représente le reste acyle d'un acide aminé choisi parmi la leucine et l'alanine, comme agent révélateur permettant de mettre en évidence, par formation d'un produit coloré, une activité de peptidase dans une culture de microorganismes.The subject of the invention is therefore the use of at least one compound of formula
X-NH-R wherein X represents a 5-bromoindol-3-yl group and R represents the acyl residue of an amino acid selected from leucine and alanine, as a revealing agent to demonstrate, by formation of a colored product, a peptidase activity in a culture of microorganisms.

En particulier le groupe R représente un reste acyle de
L-Leu, L-Ala ou D-Ala.In particular the group R represents an acyl residue of
L-Leu, L-Ala or D-Ala.

Les substrats dont l'utilisation fait l'objet de la présente demande n'inhibent pas la multiplication des microorganismes dans les milieux de culture appropriés. On peut donc utiliser l'agent révélateur en l'ajoutant au milieu de culture des microorganismes, avant le début de la culture ou en début de culture. The substrates whose use is the subject of the present application do not inhibit the multiplication of microorganisms in the appropriate culture media. The developer can therefore be used by adding microorganisms to the culture medium before the start of the culture or at the beginning of the culture.

L'un des avantages importants des agents révélateurs utilisés selon l'invention est qu'en présence de l'activité de peptidase recherchée, ils donnent des produits colorés qui ne diffusent pas dans le milieu gélifié. One of the important advantages of the developer agents used according to the invention is that in the presence of the desired peptidase activity, they give colored products which do not diffuse into the gelled medium.

Ils peuvent donc être utilisés en milieu gélifié. Ils peuvent aussi, bien entendu, être utilisés en milieu liquide. They can therefore be used in a gelled medium. They can also, of course, be used in liquid medium.

Selon un mode de réalisation particulier, on peut ajouter à la culture, en outre, au moins un autre agent révélateur permettant de mettre en évidence par formation d'un produit coloré ou fluorescent, une activité enzymatique généralement différente de celle qui est mise en évidence à l'aide des composés de formule
X-NH-R tels que définis ci-dessus. Il peut s'agir par exemple d'une activité d'estérase, d'osidase ou de peptidase. On peut ainsi obtenir des informations supplémentaires, en liaison avec une absence de coloration (ou de fluorescence) ou en liaison avec une coloration modifiée par rapport à la coloration obtenue avec un seul substrat enzymatique. L'autre agent révélateur choisi aura des propriétés différentes de celles des dérivés de BIA : par exemple, on choisira un autre agent révélateur capable de donner un produit réactionnel ayant une couleur différente de la couleur brune obtenue avec les dérivés de BIA. L'autre agent révélateur (ou second agent révélateur) permettra donc de révéler, grâce à sa couleur propre, ou grâce à sa fluorescence, la présence d'une activité enzymatique dont il est spécifique. Si l'activité de peptidase révélable par les dérivés de BIA est également présente, on obtiendra une coloration modifiée, différente de ladite couleur brune et différente aussi de ladite couleur propre donnée par le second agent révélateur. Des exemples d'utilisation de plusieurs substrats, ainsi que les informations qui peuvent en ressortir, sont donnés ci-après dans la partie expérimentale. Bien entendu, les résultats peuvent varier avec chaque espèce ou souche de microorganisme étudié.According to a particular embodiment, it is possible to add to the culture, in addition, at least one other revealing agent making it possible to demonstrate, by formation of a colored or fluorescent product, an enzymatic activity generally different from that which is evidenced. using the compounds of formula
X-NH-R as defined above. It may be, for example, an esterase, osidase or peptidase activity. It is thus possible to obtain additional information, in connection with a lack of staining (or fluorescence) or in conjunction with a staining modified with respect to the staining obtained with a single enzyme substrate. The other developer chosen will have properties different from those of BIA derivatives: for example, we will choose another developer capable of giving a reaction product having a different color of the brown color obtained with the derivatives of BIA. The other revealing agent (or second revealing agent) will thus make it possible to reveal, thanks to its own color, or thanks to its fluorescence, the presence of an enzymatic activity of which it is specific. If the peptidase activity detectable by the BIA derivatives is also present, a modified coloration will be obtained, different from said brown color and also different from said natural color given by the second developer. Examples of the use of several substrates, as well as the information which may come out of them, are given below in the experimental part. Of course, the results may vary with each species or strain of microorganism studied.

Chaque cas susceptible d'intérêt doit donc faire l'objet d'études préalables selon des expériences de routine. Each case of interest should therefore be the subject of prior studies according to routine experiments.

Les dérivés servant à mettre en évidence des activités enzymatiques différentes, et utilisables comme autres agents révélateurs, sont notamment des dérivés d'indoxyle, de coumarine, de résorufine, de naphtol, de naphtylamine, de nitrophénol, de nitroanîline, de rhodamine, d'hydroxyquinoléine, de fluorescéine, etc. The derivatives used to demonstrate different enzymatic activities, and used as other revealing agents, include derivatives of indoxyl, coumarin, resorufin, naphthol, naphthylamine, nitrophenol, nitroaniline, rhodamine, hydroxyquinoline, fluorescein, etc.

Parmi ces dérivés qui peuvent être utilisés en association avec les dérivés de BIA, on peut citer notamment le 5-bromo-4 chloro-3-indolyl-ss-D-glucuronide, le 6-chloro-3-indolyl-B-D- glucoside, la L-alanine-7-amino-4-méthyl-coumarine, le 4-méthyl umbelliféryl-N-acétyl-ss-D-galactosaminide, le résorufine-ss-D-galac- toside, le sulfate de B-naphtyle, le naphtol AS-BI B-D-galactoside, le L-alanine ss-naphtylamide, l'o-nitrophénol-ss-D-galactoside, le carboxybenzoyle-L-arginine-p-nitroanilide, la rhodamine 110 bis-(Lleucine amide), l'hydroxyquinoléine-ss-D-glucoside, et le diacétate de fluorescéine. Among these derivatives which can be used in combination with the BIA derivatives, there may be mentioned 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-glucuronide, 6-chloro-3-indolyl-BD-glucoside, L-alanine-7-amino-4-methyl-coumarin, 4-methyl umbelliferyl-N-acetyl-ss-D-galactosaminide, resorufin-s-D-galactoside, β-naphthyl sulfate, naphthol AS-BI BD-galactoside, L-alanine s-naphthylamide, o-nitrophenol-ss-D-galactoside, carboxybenzoyl-L-arginine-p-nitroanilide, rhodamine 110 bis- (leucine amide), l hydroxyquinoline-ss-D-glucoside, and fluorescein diacetate.

L'invention a également pour objet un procédé de mise en évidence d'une activité de peptidase dans une culture de microorganisme, dans lequel on ajoute au milieu de culture desdits microorganismes un agent révélateur permettant de mettre en évidence ladite activité par formation d'un produit coloré, caractérisé par le fait que ledit agent révélateur comprend au moins un composé de formule
X-NH-R, dans laquelle X et R sont définis comme ci-dessus.The subject of the invention is also a method for demonstrating a peptidase activity in a microorganism culture, in which a microorganism is added to the culture medium a revealing agent making it possible to demonstrate said activity by forming a microorganism. colored product, characterized in that said developer agent comprises at least one compound of formula
X-NH-R, wherein X and R are defined as above.

On peut ajouter le composé X-NH-R avant le début de la culture, ou en cours de culture, ou même en fin de culture. Compound X-NH-R can be added before the start of the culture, or during culture, or even at the end of culture.

L'invention a également pour objet un milieu de culture de microorganismes contenant, outre les ingrédients nécessaires à la culture desdits microorganismes au moins un composé de formule
X-NH-R. The subject of the invention is also a microorganism culture medium containing, in addition to the ingredients necessary for the culture of said microorganisms, at least one compound of formula
X-NH-R.

Les dérivés de formule X-NH-R sont utilisés à des concentrations suffisantes pour donner des réactions colorées observables. Ces concentrations, qui peuvent être déterminées par expériences de routine, peuvent varier généralement de 25 à 2000 mg par litre de milieu de culture. The derivatives of formula X-NH-R are used at concentrations sufficient to give observable color reactions. These concentrations, which can be determined by routine experiments, can generally vary from 25 to 2000 mg per liter of culture medium.

Les caractéristiques et avantages de l'invention sont illustrés par les exemples suivants. The features and advantages of the invention are illustrated by the following examples.

EXEMPLES
Exemple 1
Le milieu de culture contient, outre de l'eau
- Peptone de viande * ..........................15 15 g/l
- Peptone de caséine ** ........................ 3 g/l
- NaCl ........................................ 5 g/l
- Tampon Tris ...................................... 0,5 g/l
- Na2HPO4 ........................................... 1 g/l
- Citrate de sodium............................ 1 g/l
- Glucose ....................................... 1 g/l
- Pyruvate de sodium............................. 2 g/l
- Agar ....................................... 13 g/l
* commercialisé par : D.I.F.C.O.EXAMPLES
Example 1
The culture medium contains, besides water
- Peptone of meat * .......................... 15 15 g / l
- Casein peptone ** ........................ 3 g / l
- NaCl ........................................ 5 g / l
- Tris buffer ...................................... 0,5 g / l
- Na2HPO4 ........................................... 1 g / l
- Sodium citrate ............................ 1 g / l
- Glucose ....................................... 1 g / l
- Sodium pyruvate ............................. 2 g / l
- Agar ....................................... 13 g / l
* marketed by: DIFCO

** commercialisé par : D.I.F.C.O. ** marketed by: D.I.F.C.O.

A ce milieu, on ajoute soit de la L-Ala-BIA, soit de la
L-Leu-BIA, soit de la L-Ala-AMC soit de la L-Leu-AMC, à des concentrations de 200 mg/l. On ensemence les différents milieux obtenus, répartis dans des boîtes de Petri, avec des microorganismes. Les boîtes ont été mises en incubation à 370C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement à la lumière ambiante et sous lampe U.V. (longueur d' nm) après 24 et 48 heures d'incubation. La couleur ou la présence de fluorescence ont été notées. Les microorganismes étudiés étaient : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium,
Streptococcus pyogenes, Staphyiococcus epidermidis et Candida albicans. Les résultats sont présentés dans le tableau I ci-après
TABLEAU I

In this environment, either L-Ala-BIA or
L-Leu-BIA, either L-Ala-AMC or L-Leu-AMC, at concentrations of 200 mg / l. The various media obtained, distributed in petri dishes, are seeded with microorganisms. The dishes were incubated at 370C for 48 hours. The colonies formed were examined visually in ambient light and UV lamp (wavelength = 365 nm) after 24 and 48 hours of incubation. The color or presence of fluorescence was noted. The microorganisms studied were: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium,
Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis and Candida albicans. The results are shown in Table I below
TABLE I

<tb> Souches <SEP> L-Ala-AMC <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Leu-AMC <SEP> L-Leu-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> -2 <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> C. <SEP> albicans <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> NT3 <SEP> NT
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> NT <SEP> NT
<tb>
1 : Fluo = Fluorescence
2 : - = absence de fluorescence et/ou absence de coloration
3 : NT = non testé
Le milieu utilisé dans cet exemple permet de mettre en évidence les activités L-Alanine-aminopeptidase et L-Leucineaminopeptidase avec les réactifs L-Ala-AMC et L-Leu-AMC, respectivement, mais lorsqu'on utilise la L-Ala-BIA, et la L-Leu-BIA aucune hydrolyse n'est détectée.<tb> Strains <SEP> L-Ala-AMC <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Leu-AMC <SEP> L-Leu-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> -2 <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> C. <SEP> albicans <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> NT3 <SEP> NT
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> - <SEP> NT <SEP> NT
<Tb>
1: Fluo = Fluorescence
2: - = absence of fluorescence and / or absence of coloration
3: NT = not tested
The medium used in this example makes it possible to demonstrate the L-Alanine-aminopeptidase and L-Leucineaminopeptidase activities with the L-Ala-AMC and L-Leu-AMC reagents, respectively, but when L-Ala-BIA is used. and L-Leu-BIA no hydrolysis is detected.

Exemple 2
Dans un tampon phosphate 0,1 M pH 7,3 à 25 C on ajoute soit de la L-Leu-BIA soit de la L-Leu-AMC, à des concentrations de 400 mg/l. Les milieux obtenus ont été répartis dans les puits de plaques de microtitration et ensemencés avec des suspensions de microorganismes. Les plaques ont été mises en incubation 24 heures à 37 C. Les puits ont été examinés visuellement à la lumière ambiante et sous lampe U.V., comme précédemment. Après 24 et 48 heures d'incubation, la couleur ou la présence de fluorescence ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci après
TABLEAU II

Example 2
In 0.1 M phosphate buffer pH 7.3 at 25 ° C., L-Leu-BIA or L-Leu-AMC is added at concentrations of 400 mg / l. The media obtained were distributed in the wells of microtiter plates and inoculated with suspensions of microorganisms. The plates were incubated for 24 hours at 37 ° C. The wells were examined visually in ambient light and under a UV lamp, as before. After 24 and 48 hours of incubation, the color or presence of fluorescence was noted. The results are shown in Table II below
TABLE II

<tb> Souches <SEP> L-Leu-AMC <SEP> L-Leu-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> -2
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP>
1 : Fluo = Fluorescence
2 : - = absence de fluorescence et/ou
absence de coloration
Ainsi, avec le milieu utilisé dans cet exemple, il est possible de mettre en évidence l'activité de L-Leucine-aminopeptidase avec L-Leu-AMC, mais lorsqu'on utilise la L-Leu-BIA aucune hydrolyse n'est détectée.<tb> Strains <SEP> L-Leu-AMC <SEP> L-Leu-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> -2
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP>
1: Fluo = Fluorescence
2: - = absence of fluorescence and / or
no color
Thus, with the medium used in this example, it is possible to demonstrate the activity of L-Leucine aminopeptidase with L-Leu-AMC, but when using L-Leu-BIA no hydrolysis is detected. .

Exemple 3
Le milieu de culture contient, outre de l'eau
- Extrait de levure * .. ...... .............. .. 6 g/l
- Peptone de gélatine ** ... ................... 5 g/l - NaCl ........... ................... 8 g/l
- Na2CO3............................................... 0,1 g/l
- Agar ..................... .....................13 g/l
* commercialisé par BIO MERIEUX
** BIO-GELYTONE commercialisé par BIO MERIEUX
A ce milieu on ajoute soit de la L-Ala-BIA, soit de la
L-Leu-BIA, soit de la L-Ala-AMC, soit de la L-Leu-AMC, à des concentrations de 200 mg/l. On ensemence les différents milieux obtenus, répartis en boîtes de Petri, avec les mêmes microorganismes que ceux utilisés dans l'exemple 1. Les boîtes sont mises en incubation à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement à la lumière ambiante et sous lampe U.V.Example 3
The culture medium contains, besides water
- Yeast extract * .. ...... .............. .. 6 g / l
- Gelatin peptone ** ... ................... 5 g / l - NaCl ........... ..... .............. 8 g / l
- Na2CO3 ............................................... 0 , 1 g / l
- Agar ..................... ..................... 13 g / l
* marketed by BIO MERIEUX
** BIO-GELYTONE marketed by BIO MERIEUX
To this medium we add either L-Ala-BIA or
L-Leu-BIA, either L-Ala-AMC or L-Leu-AMC, at concentrations of 200 mg / l. The various media obtained, distributed in petri dishes, are inoculated with the same microorganisms as those used in Example 1. The dishes are incubated at 37 ° C. for 48 hours. The colonies formed were examined visually in ambient light and UV light

(longueur d' nm) après 24 et 48 heures d'incubation. La couleur ou la présence de fluorescence ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-après
TABLEAU III

(wavelength = 365 nm) after 24 and 48 hours of incubation. The color or presence of fluorescence was noted. The results are shown in Table III below.
TABLE III

<tb> Souches <SEP> L-Ala-AMC <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Leu-AMC <SEP> L-Leu-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP> -2
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48H <SEP> Fluo <SEP> "'Bj;n <SEP> | <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> positif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> F"'tjo"" <SEP> Brun <SEP> n <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> positif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> positif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> positif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> C. <SEP> albicans <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> NT3 <SEP> NT
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> NT <SEP> NT
<tb>
1 : Fluo = Fluorescence
2 : - = absence de fluorescence et/ou absence de coloration
3 : NT = non testé
Le milieu utilisé dans cet exemple permet de mettre en évidence les activités de L-Alanine-aminopeptidase et de L-Leucineaminopeptidase avec la L-Ala-AMC et la L-Leu-AMC, respectivement, ainsi qu'avec la L-Ala-BIA et la L-Leu-BIA. Ces deux derniers substrats donnent cependant des réactions parfois plus tardives. En revanche, ils permettent de distinguer les bactéries à Gram négatif des bactéries à Gram positif. En effet
- après 24 heures d'incubation avec L-Ala-BIA, les bactéries Gram positif ne donnent pas de coloration, alors que les bactéries Gram négatif donnent une coloration brune
- et après 48 heures avec la L-Leu-BIA : les bactéries Gram positif ne donnent pas de coloration, alors que les bactéries Gram négatif donnent une coloration brune.<tb> Strains <SEP> L-Ala-AMC <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Leu-AMC <SEP> L-Leu-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> Brown <SEP> Fluo <SEP> -2
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluorescence <SEP> Brown <SEP> Fluorescence <SEP> Brown
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48H <SEP> Fluorescence <SEP>"'Bj; n <SEP> | <SEP> Fluorescence <SEP> Brown
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluorescence <SEP> Brown <SEP> Fluorescence <SEP> Brown
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluorescence <SEP> Brown <SEP> Fluorescence <SEP> Brown
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> positive <SEP> 48 <SEP> H <SEP> F "'tjo""<SEP> Brown <SEP> n <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> positive <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Fluo <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> positive <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP> Fluo <SEP>
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> positive <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> C. <SEP> albicans <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> NT3 <SEP> NT
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown <SEP> NT <SEP> NT
<Tb>
1: Fluo = Fluorescence
2: - = absence of fluorescence and / or absence of coloration
3: NT = not tested
The medium used in this example makes it possible to demonstrate the activities of L-Alanine aminopeptidase and L-Leucineaminopeptidase with L-Ala-AMC and L-Leu-AMC, respectively, as well as with L-Ala BIA and L-Leu-BIA. These last two substrates however give reactions sometimes later. On the other hand, they distinguish Gram-negative bacteria from Gram-positive bacteria. Indeed
- after 24 hours of incubation with L-Ala-BIA, Gram-positive bacteria do not give coloring, whereas Gram-negative bacteria give a brown coloring
- and after 48 hours with L-Leu-BIA: Gram-positive bacteria do not give coloring, while Gram-negative bacteria give a brown coloring.

Exemple 4
Dans le milieu de l'exemple 3, on a ajouté soit de la
L-Leu-BIA soit de la L-Ala-BIA, seules ou en combinaison avec soit du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-glucoside (X-Glu), soit du 6-chloro-3-indolyl-ss-D-glucoside (Z-Glu), soit du 4-méthylumbel liféryl-ss-D-glucoside (MUGl) soit du 5-Bromo-4-chloro-3-indolylacétate (X-Ac).Example 4
In the middle of Example 3, either the
L-Leu-BIA is L-Ala-BIA, alone or in combination with either 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-glucoside (X-Glu), or 6-chloro 3-indolyl-ss-D-glucoside (Z-Glu), either 4-methylumbel-leryl-ss-D-glucoside (MUG1) or 5-Bromo-4-chloro-3-indolylacetate (X-Ac).

Les concentrations de ces différents substrats sont les suivantes
- L-Leu-BIA : 200 mg/l
- L-Ala-BIA : 200 mg/l
- X-Glu : 200 mg/l
- Z-Glu : 200 mg/l
- MuGl : 200 mg/l
On ensemence ces différents milieux répartis dans des boîtes de Petri avec des microorganismes. Les souches étudiées sont les mêmes qu'aux exemples précédents. Les boîtes ont été mises en incubation à 37"C pendant 48 heures, et les colonies formées ont été examinées visuellement à la lumière ambiante et sous lampe U.V.The concentrations of these different substrates are as follows
- L-Leu-BIA: 200 mg / l
- L-Ala-BIA: 200 mg / l
- X-Glu: 200 mg / l
- Z-Glu: 200 mg / l
- MuGl: 200 mg / l
These different media are seeded in petri dishes with microorganisms. The strains studied are the same as in the previous examples. The dishes were incubated at 37 ° C for 48 hours, and the colonies formed were examined visually in ambient light and UV light.

(longueur d' nm). Les résultats d'observation des couleurs des colonies obtenues après 24 et 48 heures d'incubation sont présentés dans le tableau IV
TABLEAU IV

(wavelength = 365 nm). Colony observation results obtained after 24 and 48 hours of incubation are shown in Table IV
TABLE IV

<tb> <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Leu-BIA
<tb> <SEP> - <SEP> X-Glu <SEP> Z-Glu <SEP> MUGI <SEP> X-Ac <SEP> - <SEP> X-Glu <SEP> Z-Glu <SEP> MUGI <SEP> X-Ac
<tb> <SEP> Souches <SEP> N0du <SEP> <SEP> 1 <SEP> <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> <SEP> milieu <SEP> .
<tb><tb><SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Leu-BIA
<tb><SEP> - <SEP> X-Glu <SEP> Z-Glu <SEP> MUGI <SEP> X-Ac <SEP> - <SEP> X-Glu <SEP> Z-Glu <SEP> MUGI <SEP> X-Ac
<tb><SEP> Strains <SEP> N0du <SEP><SEP> 1 <SEP><SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb><SEP> middle <SEP>.
<Tb>

<SEP> E. <SEP> coll <SEP> 24H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> . <SEP> Brun <SEP> Brun. <SEP> Brun <SEP> - <SEP> - <SEP> -- <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> <SEP> Brun
<tb> <SEP> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Gris <SEP> Brun+ <SEP> Gris <SEP> - <SEP> Bleu <SEP> Gris- <SEP> Fluo <SEP> Gris
<tb> <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Rose <SEP> Brun
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Gris- <SEP> Brun+ <SEP> Gris- <SEP> Brun <SEP> Bleu- <SEP> Gris- <SEP> Brun+ <SEP> Gris
<tb> <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> <SEP> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Gris- <SEP> Brun+ <SEP> Gris <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Gris- <SEP> Brun+ <SEP> Gris
<tb> <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatii <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Gris- <SEP> Brun+ <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> Gris- <SEP> Brun+ <SEP> Gris
<tb> <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> <SEP> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Gris
<tb> <SEP> Brun
<tb> <SEP> Gram <SEP> négatif <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris- <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> t: <SEP> Gris
<tb> <SEP> Brun <SEP> Brun
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> Bleu <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Bleu <SEP> - <SEP> Bleu <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Bleu
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Gris- <SEP> Rose- <SEP> Brun+ <SEP> Gris- <SEP> - <SEP> Bleu <SEP> Rose <SEP> Fluo <SEP> Gris
<tb> <SEP> Bleu <SEP> Gris <SEP> Fluo <SEP> Bleu <SEP> Bleu
<tb> <SEP> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> Bleu
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Tur- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> quoise
<tb>
Sur les milieux 2, 3 et 4 il est possible de distinguer après 24 heures d'incubation les Enterococcus (E. faecium) qui seuls donnent une coloration autre que brune ou grise. Les milieux 2, 3 et 4 permettent aussi, après 24 heures de culture, de distinguer les bactéries Gram positif, qui présentent soit une absence de coloration soit une coloration autre que brune ou grise. Les milieux 7, 8 et 9 permettent des distinctions similaires, mais après 48 heures d'incubation. Sur le milieu 5 après 48 heures d'incubation seul S. epidermidis donne des colonies de couleur turquoise, les autres bactéries donnant des colonies brunes à grisbleu.<SEP> E. <SEP><SEP> 24H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP>. <SEP> Brown <SEP> Brown. <SEP> Brown <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb><SEP> Brown
<tb><SEP> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Gray <SEP> Brown + <SEP> Gray <SEP> - <SEP> Blue <SEP > Griss <SEP> Fluo <SEP> Gray
<tb><SEP> Rose <SEP> Neon <SEP> Pink <SEP> Brown
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Gray- <SEP> Brown + <SEP> Gray- <SEP> Brown <SEP> Blue- <SEP> Gray <SEP> Brown + <SEP> Gray
<tb><SEP> Pink <SEP> Fluorescence <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Pink <SEP> Fluorescent <SEP> Brown
<tb><SEP> C <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Gray <SEP> Brown + <SEP> Gray <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Gray <SEP> Brown + <SEP> Gray
<tb><SEP> Pink <SEP> Fluorescent <SEP> Pink <SEP> Fluorescent <SEP> Brown
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Gray <SEP> Brown + <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP > GRAY <SEP> Brown + <SEP> Gray
<tb><SEP> Pink <SEP> Fluorescent <SEP> Pink <SEP> Fluorescent <SEP> Brown
<tb><SEP> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Gray
<tb><SEP> Brown
<tb><SEP> Gram <SEP> Negative <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP > Brown <SEP> Brown <SEP> t: <SEP> Gray
<tb><SEP> Brown <SEP> Brown
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> E. <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> Blue <SEP> Pink <SEP> Fluorescence <SEP> Blue <SEP> - <SEP> Blue <SEP > Pink <SEP> Fluo <SEP> Blue
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Gray- <SEP> Pink- <SEP> Brown + <SEP> Gray- <SEP> - <SEP> Blue <SEP> Pink <SEP> Neon <SEP> Gray
<tb><SEP> Blue <SEP> Gray <SEP> Fluorescence <SEP> Blue <SEP> Blue
<tb><SEP> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP > - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP >
<tb><SEP> Blue
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Tur- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP >
<tb><SEP> quoise
<Tb>
On media 2, 3 and 4 it is possible to distinguish after 24 hours of incubation Enterococcus (E. faecium) which alone give a color other than brown or gray. The media 2, 3 and 4 also allow, after 24 hours of culture, to distinguish Gram-positive bacteria, which have either no color or a color other than brown or gray. Media 7, 8 and 9 allow similar distinctions, but after 48 hours of incubation. On medium 5 after 48 hours of incubation only S. epidermidis gives colonies of turquoise color, the other bacteria giving brown to gray-blue colonies.

On précise que lorsque les substrats ci-après sont présents seuls dans le milieu réactionnel, la présence d'une osidase et l'hydrolyse résultante du 5-bromo-4-chlororo-3-indolyl--D-gluco- side (X-Glu) entraîne l'apparition d'une couleur bleu turquoise, l'hydrolyse du 6-chloro-3-indolyl--D-glucoside (Z-Glu) entraîne l'apparition dwune couleur rose-pourpre. L'hydrolyse du 4-méthyl umbelliféryl-ss-D-glucoside (MUGl) entraîne l'apparition d'une fluorescence bleue sous lampe U.V. (longueur d' nm) ; et que, en présence d'une estérase, lthydrolyse résultante du 5-bromo4-chloro-3-indolyl-acétate (X-Ac) entraîne l'apparition d'une couleur bleu turquoise. It is specified that when the following substrates are present alone in the reaction medium, the presence of an osidase and the resulting hydrolysis of 5-bromo-4-chlororo-3-indolyl-D-glucoside (X- Glu) causes the appearance of a turquoise blue color, the hydrolysis of 6-chloro-3-indolyl-D-glucoside (Z-Glu) causes the appearance of a pink-purple color. Hydrolysis of 4-methyl umbelliferyl-s-D-glucoside (MUG1) causes the appearance of blue fluorescence under U.V lamp (wavelength = 365 nm); and that, in the presence of an esterase, the resulting hydrolysis of 5-bromo4-chloro-3-indolyl-acetate (X-Ac) results in the appearance of a turquoise blue color.

Exemple 5
Le milieu de culture contient, outre de l'eau
- Extrait de levure * ........................... 6 g/l
- Peptone de gélatine ** ....................... 5 g/l
- NaCl ........................................ 8 g/l
- Na2CO3.............................................. 0,1 g/l
* commercialisé par BIO MERIEUX
** BIO-GELYTONE commercialisé par BIO MERIEUX
A ce milieu, on ajoute soit de la L-Leu-BIA soit de la
L-Ala-BIA, seules, ou en combinaison entre elles, ou en combinaison avec du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-acétate (X-Ac).Example 5
The culture medium contains, besides water
- Yeast extract * ........................... 6 g / l
- Gelatin peptone ** ....................... 5 g / l
- NaCl ........................................ 8 g / l
- Na2CO3 .............................................. 0, 1 g / l
* marketed by BIO MERIEUX
** BIO-GELYTONE marketed by BIO MERIEUX
In this environment, either L-Leu-BIA or
L-Ala-BIA, alone, or in combination with each other, or in combination with 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl acetate (X-Ac).

Les concentrations de ces différents substrats sont les suivantes
- L-Leu-BIA : 300 mg/l
- L-Ala-BIA : 300 mg/l
- X-Ac : 200 mg/l
Les milieux obtenus ont été répartis dans des plaques de microtitration et ensemencés avec des suspensions de microorganismes, comme précédemment. Les plaques ont été mises en incubation 48 heures à 37 C. Les couleurs des puits obtenues après 24 et 48 heures d'incubation sont présentées dans le tableau V
TABLEAU V

The concentrations of these different substrates are as follows
- L-Leu-BIA: 300 mg / l
- L-Ala-BIA: 300 mg / l
- X-Ac: 200 mg / l
The media obtained were distributed in microtiter plates and inoculated with suspensions of microorganisms, as before. The plates were incubated for 48 hours at 37 ° C. The colors of the wells obtained after 24 and 48 hours of incubation are shown in Table V.
TABLE V

<tb> <SEP> L-Leu-BIA <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Ala-BIA+ <SEP> L-Ala-BIA
<tb> <SEP> L-Leu-BIA <SEP> + <SEP> X-Ac
<tb> Souches <SEP> N <SEP> du <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> <SEP> milieu
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> . <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> <SEP> Brun <SEP> Gris-Bleu
<tb> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris-Bleu
<tb> E <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Brun <SEP> Gris-Bleu
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Brun <SEP> Gris-Bleu
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> <SEP> Brun <SEP> Gris-Bleu
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Brun <SEP> Gris-Brun
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Turquoise
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Turquoise
<tb>
On voit qu'avec les milieux 3 et 4 il est possible de distinguer S. epidermidis des autres bactéries. Avec le milieu 1 il est possible de différencier des bactéries à Gram négatif de celles à Gram positif (sauf S. pyogenes) après 48 heures d'incubation. Le milieu 2 permet la différenciation des bactéries Gram positif et
Gram négatif après 24 heures d'incubation.<tb><SEP> L-Leu-BIA <SEP> L-Ala-BIA <SEP> L-Ala-BIA + <SEP> L-Ala-BIA
<tb><SEP> L-Leu-BIA <SEP> + <SEP> X-Ac
<tb><SEP> N <SEP> Strains of <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb><SEP> middle
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brown <SEP>. <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> 24H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP><SEP> Brown <SEP> Gray-Blue
<tb> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray-Blue
<tb> E <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Brown <SEP> Gray-Blue
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> Brown <SEP> Gray-Blue
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP><SEP> Brown <SEP> Gray-Blue
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Brown <SEP> Gray-Brown
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Turquoise
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Turquoise
<Tb>
It can be seen that with media 3 and 4 it is possible to distinguish S. epidermidis from other bacteria. With medium 1, it is possible to differentiate between Gram-negative and Gram-positive bacteria (except S. pyogenes) after 48 hours of incubation. Medium 2 allows the differentiation of Gram positive bacteria and
Gram negative after 24 hours of incubation.

Exemple 6
Le milieu de culture contient, outre de l'eau :
- Extrait de viande de boeuf * ...... 3 g/l
- Peptone de gélatine **... ... 5 g/l
- NaCl .......... 8 g/l
- Agar .......... 15 g/l
* commercialisé par BIO MERIEUX
** BIO-GELYTONE (BIO MERIEUX)
On ajoute à ce milieu soit de la L-Ala-BIA, soit de la
L-Ala-AMC, à des concentrations de 300 mg/l et de 200 mg/l, respectivement. On ensemence les différents milieux obtenus répartis en boîtes de Petri, avec des microorganismes. Les boîtes sont mises à incubation à 37 C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement à la lumière ambiante et sous lampe U.V. comme précédemment, après 24 et 48 heures dtincuba- tion. La couleur ou la présence de fluorescence ont été notées. Les résultats sont présentés dans le tableau VI ci-après.Example 6
The culture medium contains, besides water:
- Beef Extract * ...... 3 g / l
- Gelatin peptone ** ... ... 5 g / l
- NaCl .......... 8 g / l
- Agar .......... 15 g / l
* marketed by BIO MERIEUX
** BIO-GELYTONE (BIO MERIOUS)
To this medium is added either L-Ala-BIA or
L-Ala-AMC, at concentrations of 300 mg / l and 200 mg / l, respectively. The various media obtained, distributed in petri dishes, with microorganisms are inoculated. The dishes are incubated at 37 ° C. for 48 hours. The colonies formed were visually examined under ambient light and under a UV lamp as before, after 24 and 48 hours of incubation. The color or presence of fluorescence was noted. The results are shown in Table VI below.

TABLEAU VI

TABLE VI

<tb> Souches <SEP> L-Ala-AMC <SEP> L-Ala-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> Brun
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> <SEP> C. <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> -2 <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 48H <SEP> - <SEP>
<tb> C. <SEP> albicans <SEP> 24 <SEP> H <SEP>
<tb> <SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brun
<tb>
1 : Fluo = Fluorescence
2 : - = absence de fluorescence et/ou
absence de coloration
Avec le milieu utilisé dans cet exemple, il est donc possible de mettre en évidence l'activité de L-alanineaminopeptidase avec L-Ala-AMC ainsi qu'avec L-Ala-BIA. <tb> Strains <SEP> L-Ala-AMC <SEP> L-Ala-BIA
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo1 <SEP> Brown
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> Brown
<tb> K. <SEP> Pneumoniae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> Brown
<tb><SEP> C <SEP> freundii <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown
<tb> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP> Brown
<tb> P. <SEP> aeruginosa <SEP> 24 <SEP> H <SEP> Fluorescence
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> Brown
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 24 <SEP> H <SEP> -2 <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo <SEP>
<tb> E <SEP> faecium <SEP> 24 <SEP> H <SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluo
<tb> S. <SEP> pyogenes <SEP> 24 <SEP> H
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> Brown
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> 24 <SEP> H <SEP><SEP> - <SEP>
<tb><SEP> 48H <SEP> - <SEP>
<tb> C. <SEP> albicans <SEP> 24 <SEP> H <SEP>
<tb><SEP> 48 <SEP> H <SEP> Fluke <SEP> Brown
<Tb>
1: Fluo = Fluorescence
2: - = absence of fluorescence and / or
no color
With the medium used in this example, it is therefore possible to demonstrate the activity of L-alanineaminopeptidase with L-Ala-AMC as well as with L-Ala-BIA.

Claims

1. Use of at least one compound of formula

X-NH-R wherein X represents a 5-bromoindol-3-yl group and R represents the acyl residue of an amino acid selected from leucine and alanine, as a revealing agent to demonstrate, by formation of a colored product, a peptidase activity in a culture of microorganisms.

The use according to claim 1, wherein R represents an acyl residue of L-Leu, L-Ala or D-Ala.

3. Use according to any one of the preceding claims, wherein said culture is carried out in a gelled medium.

4. Use according to any one of claims 1 and 2, wherein said culture is carried out in a liquid medium.

5. Use according to any one of the preceding claims, wherein in addition is added to said culture at least one other developer to demonstrate, by formation of a colored or fluorescent product, enzymatic activity different from that put highlighted in accordance with claim 1.

6. A method for demonstrating a peptidase activity in a microorganism culture, in which a microorganism is added to the culture medium of said microorganism to reveal said activity by forming a colored product, characterized by the said developer agent comprises at least one compound of formula

X-NH-R wherein X is 5-bromoindol-3-yl and R is the acyl residue of an amino acid selected from leucine and alanine.

7. A microorganism culture medium containing, besides the ingredients necessary for the culture of said microorganisms, at least one compound of formula

8. Culture medium according to claim 7, containing from 25 to 2000 mg / l of said compound.

9. Culture medium according to claim 7 or 8, characterized in that it is a gelled medium.