FR2699678A1 - Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. - Google Patents
Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. Download PDFInfo
- Publication number
- FR2699678A1 FR2699678A1 FR9215589A FR9215589A FR2699678A1 FR 2699678 A1 FR2699678 A1 FR 2699678A1 FR 9215589 A FR9215589 A FR 9215589A FR 9215589 A FR9215589 A FR 9215589A FR 2699678 A1 FR2699678 A1 FR 2699678A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sperm
- spermatozoa
- dna
- channel
- sex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000009027 insemination Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 3
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000004899 motility Effects 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 244000003363 Allium ursinum Species 0.000 claims description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 claims description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003744 In vitro fertilisation Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes mâles et femelles en fonction de leur contenu en ADN. Les spermatozoïdes sont colorés par un fluorochrome spécifique de l'ADN respectant la viabilité des cellules. Les spermatozoïdes sont analysés par un cytomètre en flux dont l'énergie d'excitation du fluorochrome est fournie par une lampe à vapeur de mercure et dont la cellule d'analyse est conçue de façon à ce que la mesure de fluorescence des spermatozoïdes ne soit pas influencée par l'orientation des cellules dans le flux. Les spermatozoïdes du sexe désiré sélectionnés sur les cytogrammes sont triés et récupérés de façon à être utilisés dans des techniques de procréation animale médicalement assistée.
Description
La présente invention concerne un procédé permettant de séparer des spermatozoïdes mâles et femelles en fonction de leur contenu en ADN, en vue de leur utilisation dans le domaine des biotechnologies animales de procréation médicalement assistée.
Les spermatozoïdes mâles et femelles se caractérisent par une différence de contenu en
ADN du simple fait que les spermatozoïdes mâles contiennent un chromosome Y et les femelles un chromosome X. Le chromosome Y est légèrement plus petit que le chromosome X avec une différence de l'ordre de 3,5 à 4,5% en ADN de l'ensemble du génome, et ceci chez la plupart des espèces de mammifères. L'utilisation de fluorochromes marquant de façon stoechiométrique l'ADN rend possible une analyse quantitative de l'ADN présent dans une population de spermatozoïdes par l'intermédiaire d'un appareil de cytométrie en flux, de manière à différencier les sous-populations de spermatozoïdes mâles et femelles. Les spermatozoïdes de sexe déterminé peuvent être récupérés par la partie trieur de l'appareil et utilisé pour des inséminations ou des fécondations in vitro.L'utilisation de la cytométrie en flux dans le but de séparer des spermatozoïdes X et Y a fait l'objet de deux prises de brevets WO 90/13303 et WO 90/13315. Dans ces brevets, la séparation des spermatozoïdes fait appel à l'utilisation d'un appareil de cytométrie en flux dont l'excitation en lumière ultraviolette est produite par un laser à argon ayant une puissance de 5 watt. Ce type de laser a l'inconvénient d'être encombrant, couteux, difficile à mettre en oeuvre, et nécessite de plus une infrastructure particulière pour permettre le refroidissement par eau. Ces appareils sont conçus pour analyser les spermatozoïdes dans un flux vertical dans un système ouvert vers l'extérieur où se fait l'excitation des fluorochromes par le laser.Ces appareils, dans leur conception première sont sensibles à l'orientation des spermatozoïdes par rapport à l'incidence du faisceau laser au moment de l'excitation. Ceci conduit à une représentation bimodale sur les cytogrammes avec une quantité de spermatozoïdes orientés la face plane perpendiculaire au laser de l'ordre de 20%. Ce phénomène est rencontré à chaque fois que l'on analyse des cellules non sphériques et en particulier des cellules planes telles que les spermatozoïdes [Gledhill et al, J. Cell.Physiol. 87: 367-376 (1976)1. Pour remédier 9 ce problème, il a été proposé une modification du cytomètre iJohnson et al, Cytometry 7: 268-273 (1986)]. Le système consiste à remplacer dans l'appareil conventionnel, le détecteur de diffraction aux grands angles par un deuxième photomultiplicateur situé à 900 par rapport au premier analyseur. Une deuxième modification consiste à utiliser une buse biseautée pour injecter les échantillons de façon à forcer les spermatozoïdes à s'orienter dans le plan du faisceau laser, ce qui permet d'enrichir la fraction de spermatozoïdes bien orientés de 20 à 80%.Ensuite le deuxième photomultiplicateur situé à 900 par rapport au premier permet de réanalyser immédiatement la partie des spermatozoïdes bien orientés et de visualiser sur les cytogrammes une séparation des spermatozoïdes en deux populations X et Y.
ADN du simple fait que les spermatozoïdes mâles contiennent un chromosome Y et les femelles un chromosome X. Le chromosome Y est légèrement plus petit que le chromosome X avec une différence de l'ordre de 3,5 à 4,5% en ADN de l'ensemble du génome, et ceci chez la plupart des espèces de mammifères. L'utilisation de fluorochromes marquant de façon stoechiométrique l'ADN rend possible une analyse quantitative de l'ADN présent dans une population de spermatozoïdes par l'intermédiaire d'un appareil de cytométrie en flux, de manière à différencier les sous-populations de spermatozoïdes mâles et femelles. Les spermatozoïdes de sexe déterminé peuvent être récupérés par la partie trieur de l'appareil et utilisé pour des inséminations ou des fécondations in vitro.L'utilisation de la cytométrie en flux dans le but de séparer des spermatozoïdes X et Y a fait l'objet de deux prises de brevets WO 90/13303 et WO 90/13315. Dans ces brevets, la séparation des spermatozoïdes fait appel à l'utilisation d'un appareil de cytométrie en flux dont l'excitation en lumière ultraviolette est produite par un laser à argon ayant une puissance de 5 watt. Ce type de laser a l'inconvénient d'être encombrant, couteux, difficile à mettre en oeuvre, et nécessite de plus une infrastructure particulière pour permettre le refroidissement par eau. Ces appareils sont conçus pour analyser les spermatozoïdes dans un flux vertical dans un système ouvert vers l'extérieur où se fait l'excitation des fluorochromes par le laser.Ces appareils, dans leur conception première sont sensibles à l'orientation des spermatozoïdes par rapport à l'incidence du faisceau laser au moment de l'excitation. Ceci conduit à une représentation bimodale sur les cytogrammes avec une quantité de spermatozoïdes orientés la face plane perpendiculaire au laser de l'ordre de 20%. Ce phénomène est rencontré à chaque fois que l'on analyse des cellules non sphériques et en particulier des cellules planes telles que les spermatozoïdes [Gledhill et al, J. Cell.Physiol. 87: 367-376 (1976)1. Pour remédier 9 ce problème, il a été proposé une modification du cytomètre iJohnson et al, Cytometry 7: 268-273 (1986)]. Le système consiste à remplacer dans l'appareil conventionnel, le détecteur de diffraction aux grands angles par un deuxième photomultiplicateur situé à 900 par rapport au premier analyseur. Une deuxième modification consiste à utiliser une buse biseautée pour injecter les échantillons de façon à forcer les spermatozoïdes à s'orienter dans le plan du faisceau laser, ce qui permet d'enrichir la fraction de spermatozoïdes bien orientés de 20 à 80%.Ensuite le deuxième photomultiplicateur situé à 900 par rapport au premier permet de réanalyser immédiatement la partie des spermatozoïdes bien orientés et de visualiser sur les cytogrammes une séparation des spermatozoïdes en deux populations X et Y.
Malheureusement, le système d'orientation par la buse biseautée n'est applicable que pour les spermatozoïdes morts [Johnson et al, Biol. Reprod. 41: 199-203 (1989)1. Une analyse reste néanmoins possible sur des cellules vivantes à partir des 20% de spermatozoïdes naturellement bien orientés, mais le rendement du tri devient alors trés faible. Une autre méthode a été proposée [Métézeau et al, Mol. Reprod. Dev. 30: 250-257 (1991)], consiste en une orientation optique des spermatozoïdes en utilisant deux lasers couplés sur le même appareil. Les résultats donnent une mauvaise résolution de la séparation des spermatozoïdes X et Y ainsi que de trés mauvais rendements de l'ordre de 2%.Un autre inconvénient important rencontré lors de l'utilisation de ce type d'appareil est que le tri se fait dans un champ électrique après avoir chargé électriquement les cellules que l'on veut séparer alors que la charge électrique nuit à la motilité des spermatozoïdes.
Le procédé de la présente invention permet de remédier à ces inconvénients. Le cytomètre en flux utilisé dans ce procédé est basé sur un concept différent de ceux décrits précédemment. La première différence remarquable est la substitution du laser UV par une lampe à vapeur de mercure identique à celles utilisées dans les microscopes à épifluorescence. Ce système est peu encombrant, peu couteux et ne nécessite aucune infrastructure tel que le refroidissement par eau dans le cas des lasers précités. En outre, l'analyse des spermatozoïdes est effectuée dans une cellule d'analyse métallique, dont le centre est creusé par un canal dans lequel se crée le flux laminaire entraîné par un liquide de gaine qui entoure l'échantillon, luimême injecté par une buse située à l'entrée du canal.Le canal est recouvert d'une lamelle en verre au niveau de laquelle se situe un objectif qui analyse la fluorescence émise par les spermatozoïdes. De part sa conception, cette cellule d'analyse reflète la lumière fluorescente émise par le spermatozoïde dans toutes les directions et envoie à l'objectif une quantité de fluorescence indépendante de l'orientation des spermatozoïdes dans le flux laminaire. L'analyse porte donc sur la quasi totalité des spermatozoïdes et non sur 20% des spermatozoïdes dans les autres méthodes, d'où un rendement supérieur au moment du tri des spermatozoïdes. La population de spermatozoïdes X ou Y est repérée sur le cytogramme et séparée directement au niveau de la cellule d'analyse par une valve dirigée par un quartz piezo-électrique situé à l'intérieur du canal d'analyse.Celle-ci provoque une perturbation hydrodynamique du flux et oriente le spermatozoïde repéré vers un canal adjacent aboutissant à un tube de récupération. Le tri n'est limité que par la vitesse de mouvement de la valve qui est en général de l'ordre de 1000 spermatozoïdes par seconde. Ce tri a l'avantage de conduire à des spermatozoïdes n'ayant pas eu à subir le traumatisme d'une charge électrique comme c'est le cas dans les autres appareils, et conduit à la récupération de spermatozoïdes ayant une bonne motilité. La majeure partie de ces caractéristiques se retrouvent dans le cytomètre en flux PAS III (PARTEC GmbH, Münster,
Allemagne).L'utilisation de cet appareil n'est en aucun cas limitatif du procédé de cette invention et l'emploi de tout appareil ayant des caractéristiques similaires peut convenir à la mise en oeuvre de ce procédé sans en altérer le caractère inventif.
Allemagne).L'utilisation de cet appareil n'est en aucun cas limitatif du procédé de cette invention et l'emploi de tout appareil ayant des caractéristiques similaires peut convenir à la mise en oeuvre de ce procédé sans en altérer le caractère inventif.
Le tri des spermatozoïdes se fait dans le but d'aboutir à des procréations animales médicalement assistées telles que l'insémination artificielle, I'insémination chirurgicale ou la fécondation in vitro. Il est donc fondamental que l'ensemble des étapes de ce procédé se déroule dans des colorants et des milieux permettant de garder les spermatozoïdes vivants, motiles et fécondants. Pour cela nous avons choisi comme colorant de fluorescence le Hoechst 33342 (Calbiochem, San Diego, CA, Etats-Unis) qui est un agent intercalant des bases A et T de l'ADN, excitable dans l'UV, qui ne nuit ni à la viabilité cellulaire, ni au pouvoir fécondant des spermatozoïdes, et qui n'a pas d'effet tératogène sur la descendance aux concentrations généralement utilisées en cytométrie en flux [Morrell et al, Mut. Res. 224:177-183 (1989)].Le tampon de coloration des spermatozoïdes et le liquide de gaine sont des solutions isotoniques respectant la motilité des spermatozoïdes.
Les spermatozoïdes provenant de paillettes congelées dans l'azote liquide ou provenant d'éjaculats frais, sont dilués dans un tampon Tris isotonique pour obtenir une concentration finale de 106 spermatozoides/ml. La coloration des spermatozoïdes se fait par l'adjonction d'une quantité de Hoechst 33342 conduisant à une concentration finale de 1,ug/ml. La coloration est de 1 heure à 37"C. Les spermatozoïdes sont alors injectés dans le cytométre à la vitesse de 600 spermatozoldes/sec. La population de spermatozoïdes du sexe désiré est sélectionné sur le cytogramme sur lequel on visualise les deux sous-pics de fluorescence correspondant aux spermatozoïdes mâles et femelles par ordre de quantité d'ADN croissant. Les spermatozoïdes sont récupérés dans des tubes par fraction de 2 ml, puis concentrés par gravité, centrifugation ou filtration. Les spermatozoïdes sont ensuite soumis à une étape d'enrichissement en spermatozoïdes motiles par migration ascendante, tamis moléculaire ou gradient de densité. Les spermatozoïdes motiles sont utilisés immédiatement pour des insémination chirurgicales ou des fécondations in vitro.
Des séparations de spermatozoïdes motiles de sexe déterminé ont étés obtenus à partir de sperme de taureaux, de verrats, de béliers, de boucs, d'étalons, de chiens, mais ne constitue pas un caractère limitatif de l'invention quant à l'utilisation de ce procédé avec du sperme provenant d'autres espèces de mammifères.
Cette invention est destinée à produire une progéniture d'un sexe déterminé soit en particulier chez les bovins, la production de femelles dans les races à lait et la production de mâles dans les races à viande. De même le contrôle du sexe dans les techniques de biotechnologies liées à la reproduction conduit à une accélération de la sélection au sein d'une même race.
Claims (8)
1. Un procédé permettant de séparer des spermatozoïdes mâles et femelles de mammifères selon leur contenu en ADN comprenant les étapes suivantes
a) marquer les spermatozoïdes avec un fluorochrome se fixant de façon stoechiométrique sur l'ADN et n'affectant pas la viabilité des cellules;
b) faire passer les spermatozoïdes dans un cytomètre en flux, dont le flux laminaire est réalisé à l'intérieur d'un canal métallique dont les surfaces réfléchissent la lumière dans toutes les directions;
c) analyser les spermatozoïdes par un objectif directement situé au niveau de la surface supérieure du canal qui permet à la fois l'excitation de l'ADN par l'intermédiaire d'une lampe à vapeur de mercure, ainsi que la quantification de l'ADN de chaque spermatozoïde par l'intermédiaire d'un photomultiplicateur;;
d) diriger les spermatozoïdes ayant la quantité de fluorescence correspondant au sexe désiré vers un canal adjacent à l'aide d'une valve présente sur la cellule d'analyse;
e) récupérer les spermatozoïdes en vue de les utiliser pour des inséminations artificielles, des fécondations in vitro ou tout autre procédé de procréation.
2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluorochrome est un agent intercalant de l'ADN.
3. Un procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le fluorochrome se fixe sur les bases A et T de l'ADN et est excitable par la lumière ultraviolette.
4. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les spermatozoïdes proviennent de taureaux, de verrats, de béliers, de boucs, d'étalons, de chiens, de lapins.
5. Un procédé selon les revendications 1, caractérisé en ce que le canal métallique de la cellule d'analyse permet de réfléchir la fluorescence dans toutes les directions de façon à ce que la valeur globale de la quantité d'ADN analysée ne soit pas influencée par l'orientation du spermatozoïde dans le flux.
6. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valve animée par un quartz piezo-électrique situé dans le canal de la cellule d'analyse produit une perturbation hydrodynamique permettant de diriger les spermatozoïdes du sexe déterminé vers un canal adjacent.
7. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les spermatozoïdes sont analysés et recueillis dans un tampon assurant la viabilité et la motilité des spermatozoïdes.
8. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les spermatozoïdes triés sont concentrés avant d'être utilisés pour des fécondations in vitro du sexe désiré.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9215589A FR2699678A1 (fr) | 1992-12-23 | 1992-12-23 | Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9215589A FR2699678A1 (fr) | 1992-12-23 | 1992-12-23 | Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2699678A1 true FR2699678A1 (fr) | 1994-06-24 |
| FR2699678B1 FR2699678B1 (fr) | 1997-02-14 |
Family
ID=9437012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9215589A Granted FR2699678A1 (fr) | 1992-12-23 | 1992-12-23 | Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2699678A1 (fr) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6248590B1 (en) | 1998-02-27 | 2001-06-19 | Cytomation, Inc. | Method and apparatus for flow cytometry |
| US6819411B1 (en) | 1997-01-31 | 2004-11-16 | Xy, Inc. | Optical apparatus |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US7723116B2 (en) | 2003-05-15 | 2010-05-25 | Xy, Inc. | Apparatus, methods and processes for sorting particles and for providing sex-sorted animal sperm |
| US7772005B1 (en) | 1998-07-30 | 2010-08-10 | Xy, Llc | Method of establishing an equine artificial insemination sample |
| US7820425B2 (en) | 1999-11-24 | 2010-10-26 | Xy, Llc | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| US7855078B2 (en) | 2002-08-15 | 2010-12-21 | Xy, Llc | High resolution flow cytometer |
| US8137967B2 (en) | 2000-11-29 | 2012-03-20 | Xy, Llc | In-vitro fertilization systems with spermatozoa separated into X-chromosome and Y-chromosome bearing populations |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| US8497063B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-30 | Xy, Llc | Sex selected equine embryo production system |
| US9134220B2 (en) | 2004-07-27 | 2015-09-15 | Beckman Coulter, Inc. | Enhancing flow cytometry discrimination with geometric transformation |
| US9145590B2 (en) | 2000-05-09 | 2015-09-29 | Xy, Llc | Methods and apparatus for high purity X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| US9365822B2 (en) | 1997-12-31 | 2016-06-14 | Xy, Llc | System and method for sorting cells |
| US11230695B2 (en) | 2002-09-13 | 2022-01-25 | Xy, Llc | Sperm cell processing and preservation systems |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITTO20100651A1 (it) | 2010-07-28 | 2012-01-29 | Ist Sperimentale It Lazzaro Spallanza | Procedimento ed apparecchiatura per la caratterizzazione e la separazione di spermatozoi con sensori micrometrici a leva sospesa |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3788744A (en) * | 1970-01-14 | 1974-01-29 | Bio Physics Systems Inc | Method and apparatus for photoanalysis |
| US4348107A (en) * | 1980-07-18 | 1982-09-07 | Coulter Electronics, Inc. | Orifice inside optical element |
| JPS60260830A (ja) * | 1984-06-07 | 1985-12-24 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | 細胞自動分析装置における細胞照射光源装置 |
| GB2206707A (en) * | 1987-07-10 | 1989-01-11 | Medical Res Council | Light collecting device for flow cytometry |
| US5135759A (en) * | 1989-05-10 | 1992-08-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method to preselect the sex of offspring |
-
1992
- 1992-12-23 FR FR9215589A patent/FR2699678A1/fr active Granted
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3788744A (en) * | 1970-01-14 | 1974-01-29 | Bio Physics Systems Inc | Method and apparatus for photoanalysis |
| US4348107A (en) * | 1980-07-18 | 1982-09-07 | Coulter Electronics, Inc. | Orifice inside optical element |
| JPS60260830A (ja) * | 1984-06-07 | 1985-12-24 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | 細胞自動分析装置における細胞照射光源装置 |
| GB2206707A (en) * | 1987-07-10 | 1989-01-11 | Medical Res Council | Light collecting device for flow cytometry |
| US5135759A (en) * | 1989-05-10 | 1992-08-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method to preselect the sex of offspring |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CYTOMETRY vol. 7, 1 Décembre 1986, pages 268 - 273 JOHNSON ET AL. 'MODIFICATION OF A LASER BASED FLOW CYTOMETER,ETC.' * |
| JOURNAL OF CELL PHYSIOLOGY vol. 87, 1 Mars 1976, pages 367 - 375 GLEDHILL ET AL. 'FLOW MICROFLUOROMETRIC ANALYSIS OF SPERM DNA CONTENT,ETC.' * |
| MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVALOPMENT vol. 30, no. 3, 1 Novembre 1991, pages 250 - 257 METEZEAU ET AL. 'IMPROVEMENT OF FLOW CYTOMETRY ANALYSIS AND SORTING,ETC.' * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 10, no. 140 (P-458)(2197) 23 Mai 1986 & JP-A-60 260 830 ( FUJISAWA YAKUHIN ) 24 Décembre 1985 * |
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7929137B2 (en) | 1997-01-31 | 2011-04-19 | Xy, Llc | Optical apparatus |
| US6819411B1 (en) | 1997-01-31 | 2004-11-16 | Xy, Inc. | Optical apparatus |
| US9422523B2 (en) | 1997-12-31 | 2016-08-23 | Xy, Llc | System and method for sorting cells |
| US9365822B2 (en) | 1997-12-31 | 2016-06-14 | Xy, Llc | System and method for sorting cells |
| US6589792B1 (en) | 1998-02-27 | 2003-07-08 | Dakocytomation Denmark A/S | Method and apparatus for flow cytometry |
| US6248590B1 (en) | 1998-02-27 | 2001-06-19 | Cytomation, Inc. | Method and apparatus for flow cytometry |
| US7772005B1 (en) | 1998-07-30 | 2010-08-10 | Xy, Llc | Method of establishing an equine artificial insemination sample |
| US7820425B2 (en) | 1999-11-24 | 2010-10-26 | Xy, Llc | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| US9145590B2 (en) | 2000-05-09 | 2015-09-29 | Xy, Llc | Methods and apparatus for high purity X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| US7771921B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-08-10 | Xy, Llc | Separation systems of frozen-thawed spermatozoa into X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations |
| US9879221B2 (en) | 2000-11-29 | 2018-01-30 | Xy, Llc | Method of in-vitro fertilization with spermatozoa separated into X-chromosome and Y-chromosome bearing populations |
| US8137967B2 (en) | 2000-11-29 | 2012-03-20 | Xy, Llc | In-vitro fertilization systems with spermatozoa separated into X-chromosome and Y-chromosome bearing populations |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US8652769B2 (en) | 2000-11-29 | 2014-02-18 | Xy, Llc | Methods for separating frozen-thawed spermatozoa into X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations |
| US8497063B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-30 | Xy, Llc | Sex selected equine embryo production system |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| US7855078B2 (en) | 2002-08-15 | 2010-12-21 | Xy, Llc | High resolution flow cytometer |
| US11230695B2 (en) | 2002-09-13 | 2022-01-25 | Xy, Llc | Sperm cell processing and preservation systems |
| US11261424B2 (en) | 2002-09-13 | 2022-03-01 | Xy, Llc | Sperm cell processing systems |
| US7723116B2 (en) | 2003-05-15 | 2010-05-25 | Xy, Inc. | Apparatus, methods and processes for sorting particles and for providing sex-sorted animal sperm |
| US9134220B2 (en) | 2004-07-27 | 2015-09-15 | Beckman Coulter, Inc. | Enhancing flow cytometry discrimination with geometric transformation |
| USRE46559E1 (en) | 2004-07-27 | 2017-09-26 | Beckman Coulter, Inc. | Enhancing flow cytometry discrimination with geometric transformation |
| US11408813B2 (en) | 2004-07-27 | 2022-08-09 | Beckman Coulter, Inc. | Enhancing flow cytometry discrimination with geometric transformation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2699678B1 (fr) | 1997-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11982610B2 (en) | System and method for sperm sorting | |
| FR2699678A1 (fr) | Procédé cytométrique de séparation de spermatozoïdes X et Y en fonction de leur contenu en ADN. | |
| ES2910439T3 (es) | Método para proporcionar esperma animal clasificado por sexo | |
| KR100849948B1 (ko) | Ｘ－염색체 또는 ｙ－염색체를 가진 고순도 정자 개체군 | |
| WO2001051612A1 (fr) | Procede de production d'embryons non humains presentant une valeur genetique elevee et un sexe predetermine | |
| US8123924B2 (en) | Sperm cell separation by electrophoresis | |
| Johnson | Successful gender preselection in farm animals | |
| Sharma et al. | Technologies for separation of'X'and'Y'spermatozoa in bovines: an overview. | |
| US20120308998A1 (en) | Methods and systems for reducing dna fragmentation in a population of sperm cells | |
| US11629330B2 (en) | Method for improved sperm cell populations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20110831 |